Σχολή Επιστημών υγείας-τμήμα Ιατρικής Μ.Π.Σ στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Μεταπτυχιακή Εργασία Είναι η διαμεσολαβούμενη από υποδοχέα κάθαρση της απολιποπρωτεΐνης Ε σημαντική για την εμφάνιση διατροφικά επαγόμενης παχυσαρκίας και δυσανεξίας στη γλυκόζη; Χριστίνα Κ. Καλογεροπούλου Βιολόγος Επιβλέπων καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Πάτρα, 2014
Τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής: Κυριάκος Η. Κυπραίος, Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη, Καθηγήτρια Παιδιατρικής, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Νικόλαος Ε. Τσοπάνογλου, Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών 2
Στον παππού μου, Σωτήρη 3
ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά την περίοδο 2012-2014, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Πρόκειται για μια μελέτη με στόχο να διερευνήσει κατά πόσο η διαμεσολαβούμενη από υποδοχέα κάθαρση της απολιποπρωτεΐνης Ε είναι σημαντική για την εμφάνιση διατροφικά επαγόμενης παχυσαρκίας και δυσανεξίας στη γλυκόζη. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά, τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Κυριάκο Κυπραίο, για την ευκαιρία που μου έδωσε να δουλέψω ερευνητικά στο εργαστήριο του αλλά και για την πολύτιμη καθοδήγηση και τις συμβουλές που μου προσέφερε κατά την εκπόνηση αυτής της εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την κυρία Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη, Καθηγήτρια Παιδιατρικής και τον κύριο Νικόλαο Ε. Τσοπάνογλου, Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακολογίας τόσο για την τιμή που μου έκαναν να συμμετάσχουν ως μέλη στην τριμελή μου επιτροπή, όσο και για τις γόνιμες παρατηρήσεις τους. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους μεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες του εργαστηρίου Φαρμακολογίας για τη συνεργασία και το ευχάριστο κλίμα. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την Κατερίνα Χατζίρη για την πολύτιμη συμμετοχή της στα πειράματα και την Ελένη Καραβία για τις συμβουλές στο πειραματικό και συγγραφικό μέρος αυτής της μελέτης, αλλά και για τη βοήθεια και στήριξη που μου προσέφεραν αυτά τα δυο χρόνια. Ευχαριστώ τους γονείς μου και τον αδερφό μου που με στηρίζουν ηθικά, ψυχολογικά και οικονομικά καθ'όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Τους ευχαριστώ γιατί είναι πάντα δίπλα μου, πιστεύουν στις δυνατότητες μου και μου δίνουν δύναμη να συνεχίζω παρά τις δυσκολίες. 4
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) είναι κύριο συστατικό των VLDL λιποπρωτεϊνών και των υπολειμμάτων χυλομικρών και είναι υπεύθυνη για την απομάκρυνση των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών από την κυκλοφορία. In vivo και in vitro μελέτες έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις στην apoε που εμποδίζουν την πρόσδεση των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν την apoε στον υποδοχέα της LDL (LDLr), συνδέονται με υψηλά επίπεδα χοληστερόλης στο πλάσμα και προκαλούν πρώιμη αθηροσκλήρωση σε ανθρώπους και πειραματόζωα. Στον άνθρωπο υπάρχουν τρεις κύριες φυσικές ισομορφές της apoe που ονομάζονται E2, E3, E4 και είναι αποτέλεσμα μεταλλάξεων στα αμινοξικά κατάλοιπα 112 και 158. Προηγούμενες μελέτες σε πειραματόζωα έχουν δείξει πως η apoe διαμεσολαβεί στην εμφάνιση διατροφικά επαγόμενης παχυσαρκίας. Σκοπός της εργασίας είναι να αξιολογήσουμε το ρόλο της κάθαρσης των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν apoe μέσω του υποδοχέα LDLr στην εμφάνιση παχυσαρκίας, καθώς οι ισομορφές Ε3, Ε4 έχουν πολύ μεγαλύτερη συγγένεια για τον LDLr από την Ε2 ισομορφή. Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πειραματικά ποντίκια αγρίου τύπου C57BL/6, ποντίκια με καθολική έλλειψη στην apoe (apoe -/- ) και ποντίκια που εκφράζουν την ανθρώπινη E2, E3, E4 ισομορφή αντίστοιχα. Τα πειραματόζωα τρέφονταν με δίαιτα δυτικού τύπου για ένα χρονικό διάστημα 24 εβδομάδων ενώ παράλληλα πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές και μεταβολικές μελέτες. Παρατηρήσαμε πως τα ποντίκια που εκφράζουν την apoe2, παρά την χαμηλή συγγένεια που έχουν ως προς τον LDLr, αύξησαν το βάρος τους περισσότερο και εμφάνισαν υψηλότερες τιμές χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων στο αίμα σε σχέση με τις υπόλοιπες ισομορφές. Γεγονός που αποδεικνύει πως η κάθαρση των λιπιδίων του αίματος δεν σχετίζεται με την εμφάνιση παχυσαρκίας στα πειραματικά μοντέλα ποντικών. Αντίθετα οι δοκιμασίες ανοχής στη γλυκόζη που πραγματοποιήθηκαν έδειξαν πως τα apoe3 +/+ ποντίκια εμφάνισαν τη χειρότερη ανοχή στη γλυκόζη, ενώ οι apoe2 +/+, apoe4 +/+ ομάδες ποντικών είχαν στατιστικά παρόμοιες καμπύλες. Σύμφωνα με τα παραπάνω προκύπτει πως εμφάνιση διαβήτη και διατροφικά επαγόμενης παχυσαρκίας είναι ανεξάρτητα πεδία που πρέπει να μελετηθούν ξεχωριστά. 5
ABSTRACT Apolipoprotein E (apoe) is a major component of VLDL and chylomicron remnants and is responsible for the removal of atherogenic lipoproteins from the circulation. In vivo and in vitro studies have shown that apoe mutations that prevent the binding of apoe-containing lipoproteins to LDLr, are associated with high plasma cholesterol levels and cause premature atherosclerosis in humans and animals. In humans, there are three main natural isoforms of apoe called E2, E3, E4 and is the result of mutations in amino acid residues 112 and 158. Given that previous animal studies have shown that apoe mediates the development of diet-induced obesity, the aim of this study was the evaluation of the role of apoe-containing lipoprotein's clearance by the LDLr in the development of obesity. Taking into account that the E3, E4 isoforms have higher LDLr affinity compared to the E2 isoform, we focused on the role of different apoe isoforms in these metabolic diseases. The animals we used in this study were apoe-deficient mice (apoe -/- ), mice expressing human E2 (apoe2 +/+ ), E3 (apoe3 +/+ ), E4 (apoe4 +/+ ) isoform and wild type C57BL/6 mice as a control group. The animals were fed western type diet for a 24-week period while biochemical and metabolic studies were performed. We observed that mice expressing apoe2, despite having low LDLr affinity, had higher body weight compared to C57BL/6 and exhibited higher plasma cholesterol and triglyceride levels compared to the other isoforms. This observation demonstrates that the clearance of blood lipids is not associated with obesity in experimental mouse models. Conversely, the glucose tolerance tests carried out showed that the apoe3 +/+ mice had the worst glucose tolerance, followed by apoe4 +/+ and the apoe2 +/+ mice groups (apoe3 +/+ >>apoe4 +/+ apoe2 +/+ ) suggesting that in case of glucose tolerance the clearance of apoe-containing lipoproteins may be a factor. Based on the above, dietinduced obesity and diabetes are, probably, independent fields that should be studied separately. 6
Περιεχόμενα 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 9 1.1 ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ... 9 1.1.2 Τα αίτια της παχυσαρκίας... 11 1.2 ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΕΣ... 13 1.2.1 Χυλομικρά... 14 1.2.2 VLDL - λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας... 15 1.2.3 IDL - λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας... 15 1.2.4 LDL - λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας... 15 1.2.5 HDL - λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας... 16 1.2.6 Λιποπρωτεΐνη Lp (a)... 17 1.2.7 Διατροφικά λιπίδια... 17 1.3 ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΕΣ... 20 1.3.1 Απολιποπρωτεΐνη Ε... 21 1.3.2 Ισομορφές της απολιποπρωτεΐνης Ε... 22 1.3.3 Υποδοχείς απολιποπρωτεΐνης Ε... 23 1.4 ΚΑΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΧΥΛΟΜΙΚΡΩΝ... 25 ΣΚΟΠΟΣ... 27 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 28 2.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΙ... 28 2.1.1 Λήψη αίματος από την ουρά ποντικών... 28 2.1.2 Μέτρηση σωματικού βάρους ποντικών... 29 2.1.4 Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη... 30 2.1.5 Έμμεσες θερμιδομετρικές μελέτες... 30 2.2 ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ... 31 2.2.1 Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα... 31 2.2.2 Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα... 33 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 35 7
3.1 Επίδραση των ισομορφών της απολιποπρωτεΐνης Ε στην εμφάνιση παχυσαρκίας... 35 3.1.1 Μετρήσεις σωματικού βάρους και ημερήσιας κατανάλωσης τροφής... 35 3.1.2 Μετρήσεις λιπιδίων του πλάσματος... 36 3.1.3 Έμμεση θερμιδομετρική ανάλυση... 37 3.2 Ο ρόλος των ισομορφών της απολιποπρωτεΐνης Ε στην εμφάνιση διαβήτη... 39 3.2.1 Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη... 39 4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ... 41 4.1 Παχυσαρκία... 41 4.2 Διαβήτης... 44 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 46 8
1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ), η παχυσαρκία είναι μια κατάσταση στην οποία παρατηρείται υπερβολική αύξηση του λίπους στον οργανισμό σε τέτοιο βαθμό που να επηρεάζεται η υγεία και η ευεξία του ατόμου. Οι παράγοντες που αποτελούν τα αίτια της παχυσαρκίας είναι κυρίως η αυξημένη πρόσληψη θερμίδων και ο καθιστικός τρόπος ζωής. Φυσιολογικά, το ποσοστό λίπους στους άνδρες είναι 15-20% και στις γυναίκες 20-25% ενώ στα παχύσαρκα άτομα το ποσοστό αυτό μπορεί να φτάσει το 40% ή σε σπάνιες περιπτώσεις και το 70% (κακοήθης παχυσαρκία) [1;2]. Υπάρχουν δυο τύποι παχυσαρκίας η περιφερική και η κεντρικού τύπου. Η περιφερική παχυσαρκία αφορά την εναπόθεση λίπους στους μηρούς και στους γλουτούς ή συνδυασμό και των δύο. Από τις δύο αυτές μορφές, η κεντρική παχυσαρκία αποτελεί τη νοσογόνο παχυσαρκία καθώς κύριο χαρακτηριστικό της είναι η συσσώρευση λίπους στην κοιλιά και στα σπλάχνα (σπλαχνική παχυσαρκία) και τα άτομα που πάσχουν από αυτό τον τύπο παχυσαρκίας διατρέχουν τον κίνδυνο εμφάνισης υπέρτασης, υψηλών επιπέδων ινσουλίνης, αντίστασης στην ινσουλίνη, σακχαρώδη διαβήτη και υπερλιπιδαιμίας δηλαδή παθήσεις που αποτελούν τις συνιστώσες του μεταβολικού συνδρόμου. Προκειμένου να αξιολογηθεί κατά πόσο το σωματικό βάρος ενός ατόμου αποκλίνει από αυτό που είναι φυσιολογικό ή επιθυμητό για ένα άτομο ανάλογα με το ύψος του, χρησιμοποιείται ο Δείκτης Μάζας Σώματος (Body Mass Index, ΒΜΙ) ο οποίος ορίζεται ως το πηλίκο του σωματικού βάρους σε kg προς το τετράγωνο του ύψους σε μέτρα (kg/m 2 ). Ανάλογα με το ΔΜΣ προκύπτουν οι κατηγορίες όπως αναφέρονται στο παρακάτω πίνακα: 9
Πίνακας 1.1. Ταξινόμηση σωματικού βάρους ανάλογα με το Δείκτη Μάζας Σώματος BMI Classification 18.5 to 24.9 Normal weight 25 to 29.9 Overweight 30 + Obesity 40 + Morbid Η κατανομή του λίπους εκφράζεται από τον λόγο της περιμέτρου της μέσης (cm) ως προς την περίμετρο των ισχύων (cm) (Waist to Hip Ratio, Δείκτης Κεντρικής Παχυσαρκίας) και αποτελεί έναν απλό τρόπο αναγνώρισης των ατόμων που έχουν αυξημένη πιθανότητα να εμφανίσουν κάποια από τις 38 παθήσεις που σχετίζονται με την παχυσαρκία. Ο κίνδυνος εμφάνισης διαφόρων παθήσεων με μέτρηση της αναλογίας μέσης/ισχύων έχει ως εξής: Waist to Hip Ratio <0,88 : μικρός κίνδυνος, Waist to Hip Ratio 0,88-0,95 : μέσος κίνδυνος, Waist to Hip Ratiο 0,96-1 : υψηλός κίνδυνος, Waist to Hip Ratiο >1 : πολύ υψηλός κίνδυνος για την υγεία. Σύμφωνα με μελέτες, έχει δειχθεί ότι όσο μεγαλύτερος είναι ο Δείκτης Μάζας Σώματος (ΔΜΣ) και ο Δείκτης Κεντρικής Παχυσαρκίας (ΔΚΠ) τόσο αυξάνεται ο κίνδυνος για την εμφάνιση σακχαρώδη διαβήτη τύπου II καθώς και παθήσεων του καρδιαγγειακού και των νεφρών [3];[4]. Επίσης, μελέτες έχουν δείξει ότι με την αύξηση της ηλικίας αυξάνονται και οι τιμές των δεικτών αυτών. Το βασικότερο όμως συμπέρασμα που εξάγεται από αυτές τις μελέτες είναι ότι ο κύριος παράγοντας που σχετίζεται άμεσα με τους δείκτες αυτούς είναι η διατροφή [5]. Σύμφωνα με πρόσφατα στατιστικά δεδομένα που προέκυψαν από την National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) η οποία διεξήχθη από το Center for Disease Control and Prevention (CDC) και αφορά την επικράτηση της παχυσαρκίας στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής το διάστημα 2009-2010, 10
περισσότεροι από 2 στους 3 (68.8%) ενήλικες θεωρούνται υπέρβαροι ή παχύσαρκοι καθώς επίσης 1 στους 20 (6.3%) ενήλικες πάσχουν από extreme obesity (BMI> 40). Συγκεκριμένα, ένα ποσοστό 74% των ανδρών και 64% των γυναικών θεωρούνται υπέρβαροι ή παχύσαρκοι. Επίσης, τα υψηλότερα ποσοστά υπέρβαρων ή παχύσαρκων 78.8% και 76.7% παρατηρούνται στους Ισπανόφωνους και στους μαύρους, αντίστοιχα. Το φαινόμενο της παχυσαρκίας παίρνει ανησυχητικές διαστάσεις και στις νεαρότερες ηλικίες καθώς φαίνεται από τα στατιστικά δεδομένα ότι σχεδόν 1 στα 3 παιδιά 6-19 ετών (33.3%) θεωρούνται υπέρβαρα ή παχύσαρκα ενώ το 18.2% είναι παχύσαρκα. Είναι πραγματικά εντυπωσιακό το γεγονός ότι από το 1960 έως το 2010, η παχυσαρκία έχει σχεδόν τριπλασιαστεί από το 13.4% στο 35.7% στους ενήλικες των ΗΠΑ. Σύμφωνα με μια αναφορά του ΠΟΥ σχετικά με την παιδική παχυσαρκία στην Ευρώπη, η Ελλάδα κατέχει τα υψηλότερα ποσοστά (33%) υπέρβαρων παιδιών ενώ η Ελβετία τα χαμηλότερα (11%). 1.1.2 Τα αίτια της παχυσαρκίας Οι παράγοντες που επιδρούν στην εμφάνιση της παχυσαρκίας είναι περιβαλλοντικοί, συμπεριφορικοί και γενετικοί. Ωστόσο εκτός από την κακή διατροφή και την μειωμένη φυσική άσκηση, πρόσθετοι γενετικοί, μεταβολικοί, ενδοκρινολογικοί, οικογενειακοί, κοινωνικοί και ψυχολογικοί παράγοντες οδηγούν στην εμφάνιση της παχυσαρκίας [1;2]. Το σωματικό βάρος εξαρτάται από το ισοζύγιο ενέργειας, δηλαδή την πρόσληψη θερμίδων μέσω της τροφής και την κατανάλωση τους με τη σωματική δραστηριότητα. Όταν η πρόσληψη ενέργειας (θερμίδες) είναι μεγαλύτερη από την κατανάλωσή της, αυξάνεται το σωματικό βάρος καθώς ο οργανισμός αποθηκεύει την περίσσεια ενέργειας σαν λίπος. Ωστόσο, όταν συμβαίνει το αντίθετο, υπάρχει απώλεια σωματικού βάρους και η ενεργειακή δαπάνη χωρίζεται σε τρία μέρη: 1) Στον βασικό μεταβολισμό, δηλαδή την ενέργεια που απαιτείται για να επιτελεστούν βασικές λειτουργίες του οργανισμού, 2) στην ενέργεια που καταναλώνεται λόγω της φυσικής δραστηριότητας και 3) στην θερμογένεση, δηλαδή την ενέργεια που καταναλώνεται για την πέψη και απορρόφηση των τροφών αλλά και τη διατήρηση της φυσιολογικής θερμοκρασίας του σώματος [1;2]. Στους περιβαλλοντικούς παράγοντες που σχετίζονται με την εμφάνιση της παχυσαρκίας συγκαταλέγονται ο σύγχρονος τρόπος ζωής, η μειωμένη φυσική δραστηριότητα, οι κακές διατροφικές συνήθειες αλλά και ψυχολογικά προβλήματα. Όλοι αυτοί οι παράγοντες πυροδοτούν την γενετική προδιάθεση για αύξηση του 11
σωματικού βάρους. Επίσης, το χαμηλό κοινωνικό και οικονομικό επίπεδο ωθούν τα άτομα σε διαιτητικές επιλογές χαμηλού κόστους και σε μη ισορροπημένες διατροφικές συνήθειες. Επιπλέον, τα άτομα χαμηλού μορφωτικού επιπέδου δεν αντιλαμβάνονται τους λόγους για τους οποίους πρέπει να ακολουθείται μια σωστή διατροφή [6];[7];[8]. Ένα παράδειγμα που αποδεικνύει πως το σωματικό βάρος μπορεί να επηρεαστεί και από γενετικούς παράγοντες, είναι η περίπτωση της λεπτίνης. Συγκεκριμένα, η λεπτίνη είναι μια πρωτεΐνη που παράγεται στα λιποκύτταρα από το γονίδιο «ob» (obesity gene, γονίδιο παχυσαρκίας) και φαίνεται να επιδρά στον καθορισμό του σωματικού βάρους. Τα λιποκύτταρα εκκρίνουν τη λεπτίνη είτε ελεύθερη είτε δεσμευμένη σε ένα διαλυτό σύμπλοκο με τον υποδοχέα της (Ob-R). Αφού περάσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, δεσμεύεται στους υποδοχείς του υποθαλάμου, αναστέλλοντας την όρεξη, ενεργοποιώντας τη θερμογένεση και αυξάνοντας την ενεργειακή δαπάνη, μέσω της δράσης της στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Επιπλέον, επηρεάζει το μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπιδίων. Τα επίπεδα λεπτίνης στο αίμα αποτελούν δείκτη των ενεργειακών αποθεμάτων στο λιπώδη ιστό. Σε περίπτωση απώλειας βάρους και λιπώδους μάζας, η έκκριση της λεπτίνης μειώνεται και στους αντίστοιχους υποθαλαμικούς υποδοχείς επικρατεί το ορεξιογόνο νευροπεπτίδιο Υ, που αυξάνει την ενεργειακή πρόσληψη και το σωματικό βάρος και μειώνει την ενεργειακή δαπάνη. Υψηλά επίπεδα λεπτίνης οδηγούν σε μείωση της πρόσληψης της τροφής και της κατανάλωσης ενέργειας [2;[9];[10] Στα παχύσαρκα άτομα φαίνεται να μην λειτουργεί ο μηχανισμός της λεπτίνης διότι αν και έχουν αυξημένη παραγωγή και συγκέντρωση λεπτίνης στο αίμα ωστόσο δεν καταφέρνουν να ελέγξουν το σωματικό τους βάρος κυρίως λόγω της αντίστασης στην λεπτίνη. Οι διαταραχές που σχετίζονται με την λεπτίνη είναι οι εξής: 1) η λεπτινοπενία όπου δεν παράγονται κανονικές ποσότητες λεπτίνης από τα λιποκύτταρα, 2) η πλήρης έλλειψη υποδοχέων της λεπτίνης στον εγκέφαλο και 3) η αντίσταση στην λεπτίνη, δηλαδή η απευαισθητοποίηση του μηχανισμού αναγνώρισης της λεπτίνης από τον εγκέφαλο ή η μη φυσιολογική μεταγωγή του σήματος στον εγκέφαλο έπειτα από το ερέθισμα που προκαλεί η λεπτίνη όταν έρχεται σε επαφή με τους λεπτινοϋποδοχείς ή συνδυασμός των δύο αυτών προβλημάτων [1; 2;[9];[10] 12
Επιπροσθέτως επισημαίνεται πως ο σύγχρονος τρόπος ζωής και η ελλιπής ενημέρωση των πληθυσμών καθιστούν την ακολούθηση της μεσογειακής διατροφής σε καθημερινή βάση αρκετά δύσκολη παρά τα ευεργετικά πλεονεκτήματα της. Αυτή η απομάκρυνση από τη μεσογειακή διατροφή και η αυξημένη πρόσληψη λίπους μέσω των τροφών συνεπάγεται την αύξηση του σωματικού βάρους και τη μείωση του προσδόκιμου ζωής. [1;[11];[12]. 1.2 ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Οι λιποπρωτεΐνες είναι υδατοδιαλυτά σφαιρικά συμπλέγματα τα οποία αποτελούνται από λιπίδια (χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια) και πρωτεΐνες που καθορίζουν το ρόλο τους, τις απολιποπρωτεΐνες Α, Β, C, E, J, M και a. Στο εσωτερικό τμήμα των λιποπρωτεϊνών υπάρχει ο πυρήνας, ο οποίος αποτελείται από λιπίδια, εστεροποιημένη χοληστερόλη και τριγλυκερίδια. Ο πυρήνας περιβάλλεται από ελεύθερη χοληστερόλη και ένα στρώμα φωσφολιπιδίων διατεταγμένα έτσι ώστε τα λιπόφιλα άκρα να βρίσκονται προς τον πυρήνα και τα υδρόφιλα άκρα προς το πλάσμα. Στο εξωτερικό τμήμα των λιποπρωτεϊνών υπάρχουν οι απολιποπρωτεΐνες οι οποίες διαθέτουν ένα άκρο πλούσιο σε μη πολικά αμινοξέα που έχει κατεύθυνση προς τον πυρήνα των λιποπρωτεϊνών και ένα άλλο άκρο πλούσιο σε πολικά αμινοξέα που βρίσκεται σε επαφή με το υδατικό περιβάλλον [13] (Εικόνα 1.1). Εικόνα 1.1. Σχηματική αναπαράσταση της τυπικής δομής των λιποπρωτεϊνών. 13
Η βασική λειτουργία των λιποπρωτεϊνών είναι η μεταφορά των λιπιδίων και συγκεκριμένα των τριγλυκεριδίων που αποτελούν την κύρια πηγή ενέργειας του λιπώδους και μυϊκού ιστού και της χοληστερόλης που χρησιμοποιείται για την βιοσύνθεση των στεροειδών ορμονών αλλά αποτελεί και δομικό συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών όλου του σώματος. Οι απολιποπρωτεΐνες δρουν σαν τροποποιητές της δράσης των ενζύμων του πλάσματος ή σαν σύνδεσμοι για τους υποδοχείς των κυττάρων κάνοντας το ρόλο τους στο μεταβολισμό των λιπιδίων πολύ σημαντικό. Οι λιποπρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος, την σύσταση σε απολιποπρωτεΐνες και λιπίδια και συνεπώς και την πυκνότητα. Οι μεγαλύτερες σε μέγεθος που είναι τα χυλομικρά (CM) και οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) είναι πλούσιες σε τριγλυκερίδια ενώ οι μικρότερες όπως οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) και οι υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) είναι πλούσιες σε εστεροποιημένη χοληστερόλη. Σύμφωνα με την πυκνότητα τους και ξεκινώντας από αυτές με την χαμηλότερη πυκνότητα, οι λιποπρωτεΐνες ταξινομούνται ως εξής: χυλομικρά, λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL), λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL), λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL) [13]. 1.2.1 Χυλομικρά Τα χυλομικρά είναι μεγαλομοριακά συμπλέγματα που αποτελούνται κατά 98% από λιπίδια. Περιέχουν κυρίως τριακυλογλυκερόλες (τριγλυκερίδια) και μικρές ποσότητες χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων. Η πυκνότητα τους είναι μικρότερη από 0.94g/mL διότι οι τριακυλογλυκερόλες απαρτίζουν το ~99% του περιεχομένου τους. Η απολιποπρωτεΐνη Β-48 (apob-48), μια μεγάλη πρωτεΐνη μοριακού βάρους 240 kda, σχηματίζει ένα αμφίφιλο σφαιρικό κέλυφος, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη, γύρω από το λιποσφαίριο. Τα χυλομικρά διαμεσολαβούν στη μεταφορά των διατροφικών λιπιδίων από το έντερο προς τους περιφερικούς ιστούς. Στην κυκλοφορία μεταβολίζονται μερικώς από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL), που βρίσκεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών και ακολούθως καταβολίζονται από ηπατικές λιπάσες (HL) σε υπολείμματα χυλομικρών. Μετά τη λυπόλυση τους προσλαμβάνουν apoe στο πλάσμα, η οποία τα παρουσιάζει στον LDLr, προσλαμβάνονται από το ήπαρ και καταβολίζονται. Εάν ο μηχανισμός ηπατικής κάθαρσης είναι ανεπαρκής τότε τα κατάλοιπα αθροίζονται στο αίμα και 14
εκδηλώνεται μια μορφή λιπιδικής διαταραχής, γνωστή ως Υπερλιποπρωτεϊναιμία Τύπου ΙΙΙ [13]. 1.2.2 VLDL - λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας Οι VLDL είναι μεγάλα σωμάτια με διάμετρο 30-80 nm και πυκνότητα που κυμαίνεται στα επίπεδα 0.94-1.006 g/ml. Η λιπιδική τους σύσταση είναι: 45-65% τριγλυκερίδια, 15-20% φωσφολιπίδια και 20-30% χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιημένη) [14]. Τα σωμάτια αυτά συντίθενται και εκκρίνονται από το ήπαρ κυρίως κατά την περίοδο νηστείας και η σύνθεσή τους εξαρτάται από τις ανάγκες των περιφερικών ιστών, στους οποίους και ανακατανέμονται [14]. Τα σωμάτια αυτά σταθεροποιούνται από δύο απολιποπρωτεΐνες: την απολιποπρωτεΐνη Β-100 (apob100) και την apoε. Όπως και στην περίπτωση των υπολειμμάτων χυλομικρών, η apoe των VLDL προσδένεται στον υποδοχέα LDLr και διαμεσολαβεί τον καταβολισμό τους. 1.2.3 IDL - λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας Οι λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας προκύπτουν από τον καταβολισμό των VLDL. Η πυκνότητά τους κυμαίνεται στα επίπεδα 1.006-1.019 g/ml. Η αύξηση της πυκνότητας οφείλεται στην υδρόλυση των τριγλυκεριδίων που υπάρχουν σε αφθονία στα VLDL. Τα σωμάτια αυτά που είναι πλούσια σε εστέρες χοληστερόλης, έχουν δύο προορισμούς: Τα μισά από αυτά μεταφέρουν τα λιπίδια στο ήπαρ και σε άλλους περιφερικούς ιστούς για περαιτέρω επεξεργασία και τα άλλα μισά μετατρέπονται με την αφαίρεση περισσότερων τριακυλογλυκερολών στις LDL λιποπρωτεΐνες [14]. 1.2.4 LDL - λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας Οι LDL προκύπτουν από τον περαιτέρω καταβολισμό των IDL και αποτελούν τον κύριο φορέα χοληστερόλης στο αίμα. Αυτό το σωμάτιο λιποπρωτεΐνης έχει διάμετρο 22 nm και πυκνότητα που κυμαίνεται στα επίπεδα 1.019-1.063 g/ml. Περιέχει έναν πυρήνα περίπου 1500 εστεροποιημένων μορίων χοληστερόλης. Αυτός ο εξαιρετικά υδρόφοβος πυρήνας περιβάλλεται από ένα κέλυφος από φωσφολιπίδια και μη εστεροποιημένη χοληστερόλη. Το κέλυφος περιέχει επίσης ένα μοναδικό αντίγραφο της apoβ-100, το οποίο αναγνωρίζεται από τα κύτταρα-στόχους. Κύριος ρόλος των LDL είναι να μεταφέρουν χοληστερόλη από το ήπαρ στα κύτταρα των περιφερικών ιστών για την εξυπηρέτηση των βιοσυνθετικών αναγκών τους και να 15
ρυθμίζουν τη de novo σύνθεση της χοληστερόλης αλλά και των στεροειδών ορμονών σε αυτούς τους ιστούς. 1.2.5 HDL - λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας Η HDL είναι ένα μείγμα λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων, των οποίων οι πυκνότητες ποικίλουν από 1,063 ως 1,21 g/ml [15]. Η λιπιδική σύστασή της είναι αυτή που καθορίζει το σχήμα της, το οποίο είναι σφαιρικό ή δισκοειδές και ενδεχομένως επηρεάζει τη λειτουργικότητα του μορίου [16]. Η ώριμη σφαιρική HDL περιέχει 45-55% απολιποπρωτεΐνες, 26-32% φωσφολιπίδια (PL), 15-20% εστεροποιημένη χοληστερόλη (CE), 3-5% ελεύθερη χοληστερόλη (CHOL), και περίπου 5% τριγλυκερίδια (TGs). Η κύρια απολιποπρωτεΐνη της HDL είναι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i), η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση και στη λειτουργικότητα της HDL. Απουσία της apoa-i η κλασσική HDL δεν σχηματίζεται [17]. Η απολιποπρωτεΐνη A- II (apoa-ii) είναι η δεύτερη σε αφθονία απολιποπρωτεΐνη της HDL [18], αλλά ο φυσιολογικός της ρόλος δεν έχει ακόμα εξακριβωθεί. Ωστόσο, μαζί με την apoa-i είναι απαραίτητες για τη βιοσύνθεση της κλασσικής HDL. Η HDL περιέχει επίσης μια ποικιλία άλλων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των απολιποπρωτεϊνών A-IV (apoa-iv), C-I (apoc-i), C-II (apoc-ii), C-III (apoc-iii), D (apod), E (apoe), J (apoj), L-I (apol-i), M (apom) καθώς επίσης τρανσφερίνη, σερουλοπλασμίνη και ένζυμα [19]. Ποσοτικές και ποιοτικές διαφορές των λιπιδίων, των πρωτεϊνών και των ενζύμων των HDL έχουν ως αποτέλεσμα την ύπαρξη διαφόρων κλασμάτων που διαφέρουν στο σχήμα, την πυκνότητα, στο μέγεθος και το φορτίο. Με υπερφυγοκέντρηση διακρίνονται δύο κλάσματα HDL: οι HDL2 με πυκνότητα 1,063 1,125 g/ml και οι HDL3 με πυκνότητα 1,125 1,210 g/ml [20], (Πίνακας 1.2). 16
Πίνακας 1.2. Ποιοτική και ποσοτική σύσταση των HDL σωματιδίων. HDL3 HDL2 Ονομασία (αριθμός μορίων (αριθμός μορίων ανά σωματίδιο) ανά σωματίδιο) Φωσφολιπίδια 93 189 Ελεύθερη Χοληστερόλη 11 32 Εστέρες Χοληστερόλης 44 109 Τριγλυκερίδια 9 18 apoa-i 3 4 apoa-ii 1 1 1.2.6 Λιποπρωτεΐνη Lp (a) Στην τελευταία κατηγορία ανήκουν οι λιποπρωτεΐνες a, Lp(a). Πρόκειται για σωμάτια τύπου LDL που συνδέονται ομοιοπολικά με την απολιποπρωτεΐνη a. Ο μηχανισμός καταβολισμού τους δεν είναι πλήρως εξακριβωμένος, αλλά έχει αποδειχτεί ότι συμμετέχει ο νεφρικός ιστός [21],[22]. Έχουν επιπλέον, χαρακτηριστεί ως μόρια που προάγουν την αθηρωμάτωση, όταν τα επίπεδά τους υπερβαίνουν τα φυσιολογικά όρια [23]. 1.2.7 Διατροφικά λιπίδια Τα περισσότερα λιπίδια προσλαμβάνονται με τη μορφή τριγλυκεριδίων και χοληστερόλης μέσω της διατροφής. Τα τριγλυκερίδια απορροφώνται από το εντερικό επιθήλιο, αφού αποικοδομηθούν σε λιπαρά οξέα και η πέψη τους ξεκινά στο στόμαχο με τις γαστρικές λιπάσες (GL). Στον αυλό του λεπτού εντέρου ενσωματώνονται σε μικκύλια με τη βοήθεια των χολικών αλάτων, τα οποία είναι αμφιπαθή μόρια που συντίθενται στο ήπαρ και εκκρίνονται από τη χοληδόχο κύστη. Η διάταξη των τριγλυκεριδίων στην επιφάνεια των μικκυλίων διευκολύνει την πρόσβαση των παγκρεατικών λιπασών (HL), ώστε αυτές να υδρολύσουν τους εστερικούς δεσμούς τους. Η πέψη τους σε ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA) και σε 2-μονοακυλογλυκερόλη επιτυγχάνεται με τη βοήθεια λιπασών και τα οποία στη συνέχεια μεταφέρονται στα εντερικά κύτταρα. Στα κύτταρα αυτά τα τριγλυκερίδια ανασυντίθενται και συσκευάζονται σε λιποπρωτεϊνικά σωματίδια μεταφοράς, τα χυλομικρά. 17
Η χοληστερόλη στους ανθρώπους προέρχεται από δύο πηγές, είτε προσλαμβάνεται με τη διατροφή είτε συντίθεται de novo στο ήπαρ. Το μεγαλύτερο ποσοστό προέρχεται κυρίως από τη de novo σύνθεση της, αλλά γενικά διαφέρει από άνθρωπο σε άνθρωπο ανάλογα με τους γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες [24]. Μόνο το 50% της προσλαμβανόμενης χοληστερόλης απορροφάται από το έντερο, ενώ το υπόλοιπο αποβάλλεται από τον οργανισμό μέσω κοπράνων. Ομοίως με τα τριγλυκερίδια, η εξωγενής χοληστερόλη συνδέεται με τα μικκύλια στον εντερικό αυλό. Απαραίτητη προϋπόθεση για τη μικκυλιοποίησή της είναι να βρίσκεται σε μη εστεροποιημένη μορφή καθώς οι εστέρες χοληστερόλης απορροφώνται ελάχιστα. Έπεται η πρόσληψή της από τα κύτταρα του εντέρου με άγνωστο μηχανισμό ακόμη. Στη διαδικασία αυτή φαίνεται πως συμμετέχει ένας ενεργητικός μεταφορέας, καθώς και η παθητική διάχυση και μεταφορά [25]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι στην ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης διαμεσολαβούν ο μεταφορέας Niemann- Pick C1 like 1 (NPC1-L1) και οι ATPbinding cassette ABC- πρωτεΐνες (ABCG5 και ABCG8). Στο εσωτερικό πλέον των κυττάρων του εντέρου η χοληστερόλη μετατρέπεται σε εστέρες με τη βοήθεια του ενζύμου Acyl CoA cholesterol acyltransferase isoform- 2 (ACAT2) και με τη δομή αυτή μπορεί να εισέλθει στα νεοσυντιθέμενα χυλομικρά και να εκκριθεί στη λεμφική κυκλοφορία με τα υπόλοιπα λιπίδια [26], (Εικόνα 1.2). Όταν υπάρχει ανάγκη για ενέργεια από τους περιφερικούς ιστούς τότε κινητοποιούνται οι αποθήκες λιπιδίων μέσα από μια διαδικασία τριών σταδίων. Αρχικά, τα τριγλυκερίδια μετά από ενδοκυττάρια σηματοδότηση αποικοδομούνται και μεταφέρονται στους ιστούς που τις έχουν ανάγκη με τη μορφή λιπαρών οξέων και γλυκερόλης. Στη συνέχεια, τα λιπαρά οξέα ενεργοποιούνται και μεταφέρονται στα μιτοχόνδρια για οξείδωση [27]. Τέλος, τα λιπαρά οξέα καταβολίζονται σε μόρια του ακετυλο-συνενζύμου Α (acetyl-coa), που εισέρχονται στον κύκλο του κιτρικού οξέος. Σε περίοδο νηστείας τα επίπεδα των ελεύθερων λιπαρών οξέων αυξάνουν λόγω των εκκρινόμενων ορμονών - επινεφρίνη και γλυκαγόνη - που προάγουν τη λιπόλυση. Αντίθετα, η ινσουλίνη δρα ανασταλτικά στο μονοπάτι της λιπόλυσης [28]. 18
Αυλός του εντέρου Μικρολάχνες Διατροφικά λιπίδια Μικύλλια Στεγανή σύνδεση Πυρήνας COPII κυστίδιο Λεμφαγγείο Χυλομικρά Εικόνα 1.2. Ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης από τα μικκύλια στο εντερικό κύτταρο και ο μηχανισμός απέκκρισής της με τη μορφή χυλομικρών[26]. Τα παραπάνω λιποπρωτεϊνικά σωματίδια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και η δράση τους συνοψίζεται σε τρία κυρίως μεταβολικά μονοπάτια: α) τη σύνθεση των χυλομικρών η οποία ξεκινάει από το έντερο, β) τη βιογένεση της LDL και γ) τη βιογένεση της HDL, με τις δυο τελευταίες να λαμβάνουν χώρα στο πλάσμα. Διάφορες πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένου των απολιποπρωτεϊνών, των ενζύμων του πλάσματος, των υποδοχέων των λιποπρωτεϊνών, των λιπιδικών πρωτεϊνικών μεταφορέων και των λιπιδικών μεταφορέων συμμετέχουν στα παραπάνω μεταβολικά μονοπάτια και συμβάλλουν στη λιπιδική ομοιόσταση. 19
1.3 ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Οι απολιποπρωτεΐνες είναι τα πρωτεϊνικά συστατικά των λιποπρωτεϊνών, συγκεκριμένα αποτελούν το περίβλημα τους, συντίθενται κυρίως στο ήπαρ καθώς και στο επιθήλιο του λεπτού εντέρου. Διακρίνονται στις εξής κατηγορίες Α, Β, C, Ε και a. Εκτός από τη σύνδεσή τους με τα λιπίδια επιτελούν και περαιτέρω λειτουργίες. Η ικανότητά τους να δεσμεύουν λιπίδια οφείλεται στις αμφιπαθείς α-έλικες και στις β- επιφάνειες [29],[30]. Στη συνέχεια αναφέρονται ορισμένες από τις πιο σημαντικές απολιποπρωτεΐνες καθώς και οι ιδιότητες τους. Η apoa-i αποτελεί δομική μονάδα της HDL και είναι υπεύθυνη για τη βιοσύνθεση της HDL, την ενεργοποίηση της LCAT και την αλληλεπίδραση των λιποπρωτεϊνών HDL με τους υποδοχείς SR-B1 [31],[32]. Λόγω των παραπάνω λειτουργιών θεωρείται ότι έχει αθηροπροστατευτική δράση. Στην οικογένεια των apoβ, οι πιο σημαντικές απολιποπρωτεΐνες είναι οι Β-48 και Β-100. Συμμετέχουν στον καταβολισμό των λιποπρωτεϊνών LDL, VLDL και Lp(a). Ειδικότερα, η apob-48 συντίθεται στα κύτταρα του εντέρου και είναι απαραίτητη για τη δόμηση των χυλομικρών κατά την απορρόφηση των διατροφικών λιπιδίων μετά από κάθε γεύμα. Ενώ η apob-100 συντίθεται στο ήπαρ και είναι απαραίτητη για τη σύνθεση και την απέκκριση των VLDL και αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη των LDL λιποπρωτεϊνών [33]. Η υποκατηγορία των ApoC συμβάλλει τόσο στη διαμόρφωση των LDL και VLDL όσο και των HDL. Η apoc-i ενεργοποιεί την LCAT και αναστέλλει το ένζυμο CETP [34] ενώ η apoc-iι ενεργοποιεί την LPL (Lipoprotein Lipase). Η δράση της προσφέρει μερική προστασία έναντι της αθηρωμάτωσης. Η apoc-iιι και η apoc-iv προκαλούν σε περίπτωση υπερέκφρασής τους αύξηση των τριγλυκεριδίων του πλάσματος, ενώ πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η apoc-iii προάγει και τον de novo σχηματισμό HDL μέσω του ABCA1 [35]. Η λιποπρωτεΐνη Lp(a) σχηματίζεται με την απολιποπρωτεΐνη apo(a). H apo(a) εντοπίζεται στο ενδοθήλιο των αγγείων και προκαλεί φλεγμονώδη και πολλαπλασιαστικά φαινόμενα. Τα υψηλά επίπεδά της στο πλάσμα έχουν συσχετιστεί με καρδιαγγειακά και θρομβωτικά νοσήματα [36]. Η απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) είναι ο κύριος προσδέτης των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών με τον LDLr και επάγει την ενεργή απομάκρυνσή τους από το πλάσμα. Αν και η μη λιπιδιωμένη μορφή έχει ελάχιστη συγγένεια ως προς τον LDLr, 20
η λιπιδιωμένη apoe αποτελεί πρόσδεμα αυτού του υποδοχέα. Ενεργοποιεί την LCAT και είναι απαραίτητη για την κάθαρση των λιποπρωτεϊνικών υπολειμμάτων. Έχει χαρακτηριστική αθηροπροστατευτική δράση. Στους ανθρώπους η apoe εκφράζεται σε τρείς φυσικές ισομορφές οι οποίες είναι οι εξής: apoe2, apoe3 και apoe4. Επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν ότι η apoe4 έχει συσχετιστεί με την πρώιμη εκδήλωση της νόσου Alzheimer [37] ενώ η apoe2 με υπερλιπιδαιμία τύπου ΙΙΙ [38]. Γενικά, η υπερέκφραση της προκαλεί υπερτριγλυκεριδαιμία καθώς μελέτες έδειξαν ότι υπάρχει ευθεία συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης τριγλυκεριδίων και apoe του πλάσματος [39]. Πρόκειται για μια ευρέως μελετηθείσα απολιποπρωτεΐνη με τελικό στόχο την θεραπεία διαταραχών των λιπιδίων στο αίμα [13]. 1.3.1 Απολιποπρωτεΐνη Ε Η απολιποπρωτεΐνη Ε (ΑpoE) έχει μοριακό βάρος 34 kda και είναι κύριο συστατικό των μορίων VLDL και των υπολειμμάτων των χυλομικρών. Αποτελείται από 299 αμινοξέα και το γονίδιο της το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 19, έχει την συνήθη δομή των απολιποπρωτεϊνικών γονιδίων με 4 εξώνια και 3 εσώνια. Παράγεται στο ήπαρ και ρυθμίζει την πρόσδεση των LDL σωματιδίων και των υπολειμμάτων χυλομικρών με τους υποδοχείς τους. Με αυτόν τον τρόπο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιπρωτεϊνών και της χοληστερόλης. Μέσα από μελέτες κρυσταλλογραφίας αλλά και μοριακής προσομοίωσης έχει αποδειχτεί ότι η apoε αποτελείται από αλληλουχίες 11 και 22 αμινοξέων που σχηματίζουν αμφιπαθείς α-έλικες [29]. Η δομή αυτή επιτρέπει την πρόσδεση της σε λιπίδια και τον μετέπειτα σχηματισμό λιποπρωτεϊνών. Η κρυσταλλογραφία με ακτίνες- Χ του αμινοτελικού κομματιού 22 kda της apoe έδειξε ότι αυτή η περιοχή σχηματίζει ένα τετραελικοειδές δέμα (bundle) το οποίο σταθεροποιείται από υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και γέφυρες αλάτων [40]. 21
Εικόνα 1.3. Η δομή της απολιποπρωτεΐνης Ε με τις κύριες λειτουργικές περιοχές της. 1.3.2 Ισομορφές της απολιποπρωτεΐνης Ε Υπάρχουν τρεις κοινές ισομορφές της ΑpoE: E2, E3 και E4 οι οποίες κωδικοποιούνται από τα αλληλόμορφα e2, e3 και e4 αντίστοιχα, που προκύπτουν από τους πολυμορφισμούς του γονιδίου (C αντί για T στα κωδικόνια 112 και 158) στη χρωμοσωμική θέση 19q13.2. Η πιο κοινή από αυτές τις ισομορφές είναι η apoe3 η οποία σχετίζεται με το μεταβολισμό των χυλομικρών και των VLDL. Υπάρχει ένα μόνο γονίδιο σε κάθε χρωμόσωμα και έτσι ένα άτομο μπορεί να έχει δύο όμοιους (ομοζυγώτης) ή δυο διαφορετικούς (ετεροζυγώτης) γονιδιακούς πολυμορφισμούς. Οι δυνατοί γονότυποι είναι οι ακόλουθοι: ε2/ε2, ε2/ε3,ε3/ε3, ε3/ε4, ε2/ε4, και ε4/ε4. Οι αντίστοιχοι λιποπρωτεϊνικοί φαινότυποι είναι οι εξής: Ε2/Ε2, Ε2/Ε3, Ε3/Ε3, Ε3/Ε4, Ε2/Ε4 και Ε4/Ε4. Το πιο συχνά απαντώμενο γονίδιο είναι όπως προαναφέρθηκε, το Ε3 και οι περισσότεροι άνθρωποι είναι ομόζυγοι με Ε3/Ε3 ή ετερόζυγοι με Ε2/Ε3. Το ποσοστό των ομοζυγωτών Ε2/Ε2 είναι λιγότερο από 1% και στην ομάδα αυτή ανήκουν οι περισσότεροι ασθενείς με υπερλιποπρωτεϊναιμία τύπου ΙΙΙ. Ο φαινότυπος Ε2/E2 σχετίζεται με καρδιαγγειακά νοσήματα [41] και ο φαινότυπος Ε4/E4 αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της νόσου Alzheimer [42]. Οι προαναφερόμενοι πολυμορφισμοί της apoe είναι αποτέλεσμα στην αλλαγή της αμινοξικής αλληλουχίας της σε δύο αμινοξέα την αργινίνη (Arg) και την κυστεΐνη (Cys). Η apoe3 έχει Cys στη θέση 114 και Arg στη θέση 158, στην apoe2 η Arg στην θέση 158 έχει ανταλλαγεί με Cys και στην apoe4 έχει διατηρηθεί η Arg στη θέση 158 αλλά στην θέση 114 υπάρχει Arg αντί για Cys [43]. 22
1.3.3 Υποδοχείς απολιποπρωτεΐνης Ε Η δράση της apoe διαμεσολαβείται μέσω πολλαπλών υποδοχέων όπως είναι οι LDLr, LRP- 1, ApoER2, VLDLr, SR-BI. Ο LDLr είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη 839 αμινοξέων ο οποίος αποτελεί τον βασικό υποδοχέα των LDL σωματιδίων και είναι υπεύθυνος για την απομάκρυνση τους από την κυκλοφορία του αίματος. Μετά την πρόσδεσή τους γίνεται ενδοκυττάρωση του συμπλόκου υποδοχέα-ldl και στη συνέχεια ο υποδοχέας ανακυκλώνεται και επανέρχεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Η παραπάνω ενδοκυττάρωση προάγεται από τις apoβ και apoε. Μεταλλάξεις στο γονίδιο του υποδοχέα οδηγούν σε διαταραχή των επιπέδων χοληστερόλης γνωστή ως Οικογενής Υπερχοληστερολαιμία Τύπου III. Ανάλογα με την μη έκφραση ή την έκφραση μη λειτουργικής πρωτεΐνης διαχωρίζεται η νόσος σε πέντε διαφορετικούς τύπους με την αντίστοιχη βαρύτητα. Ακόμη, διακρίνεται σε ομόζυγη ή ετερόζυγη ανάλογα με τον αριθμό των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων γονιδίων. Ο αριθμός των μεταλλάξεων που έχουν ως τώρα ταυτοποιηθεί ανέρχονται στις 1000 [44]. Μελέτες έχουν αποδείξει πως οι ισομορφές της apoe έχουν διαφορετικά επίπεδα συγγένειας ως προς τον υποδοχέα LDLr (apoe3 apoe4>>>apoe2) [45;46]. Την μικρότερη συγγένεια από όλες τις ισομορφές την έχει η E2, γεγονός που αρχικά αποδόθηκε στην διαφορά μεταξύ της Ε2 και των Ε3 και Ε4 ισομορφών, στην περιοχή σύνδεσης της apoε με τον LDLr, που έχει μια κυστεΐνη στη θέση 158. Ωστόσο μελέτες έδειξαν πως η μειωμένη συγγένεια δεν προκαλείται από την κυστεΐνη 158 αλλά απαιτεί την παρουσία του καρβοξυτελικού άκρου 203-299 της E2 ισομορφής. Πιθανώς ο συνδυασμός του καρβοξυτελικού άκρου της apoe2 σε συνδυασμό με την κυστεΐνη στη θέση 158, προσδίδει στην apoe2 μια τεταρτοταγή δομή που λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης αποτρέπει τη σύνδεση της Ε2 με τον υποδοχέα LDLr [47]. Ο LDLr Related Protein 1 (LRP-1) είναι μια πρωτεΐνη-υποδοχέας με ποικίλες λειτουργίες. Ανήκει στην οικογένεια των LDLr υποδοχέων λόγω της εκτεταμένης ομολογίας του με τον LDLr. Αποτελείται από 4525 αμινοξέα και εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, τον εγκέφαλο και τους πνεύμονες. Έχει διαπιστωθεί ότι είναι απαραίτητη κατά την εμβρυογένεση, καθώς πειραματόζωα με γενετική έλλειψη του αντίστοιχου γονιδίου είναι θνησιγενή. Γενικά αποτελεί τον μεσολαβητή για την ενδοκυττάρωση 23
ετερογενών ενώσεων όπως διάφορες πρωτεϊνάσες, αναστολείς πρωτεϊνασών ακόμη και βακτηριακές τοξίνες. Αναφορικά με τη δράση του στον καταβολισμό των λιπιδίων έχει σχεδόν επιβεβαιωθεί ότι έχει ελάχιστη συμμετοχή στην κάθαρση των υπολειμμάτων χυλομικρών καθώς και των LDL απουσία των LDLr [48]. Επιπλέον είναι γνωστό ότι η δράση του επάγεται με τη σύνδεση της apoε και όπως και ο LDLr δείχνει εκλεκτικότητα ως προς τις ισομορφές apoe3 και apoe4, ενώ η apoe2 συνδέεται ελάχιστα. Με την παραπάνω σύνδεση διαμεσολαβείται εμμέσως και η εστεροποίηση της χοληστερόλης στα β-vldl σωμάτια [49]. Τέλος, η απολιποπρωτεΐνη C δρα ανασταλτικά στη δράση του LRP-1 [50]. Ένας άλλος γνωστός συναγωνιστικός αναστολέας του υποδοχέα LRP-1 είναι η υποδοχεο-σχετιζόμενη πρωτεΐνη Receptor Related Protein (RAP). Ο VLDLr, ο οποίος ανήκει επίσης στην οικογένεια των LDL υποδοχέων, παρουσιάζει ακόμη μεγαλύτερου βαθμού ομολογία με τον LDLr σε σχέση με τον LRP-1. Επιπρόσθετα, έχει χαρακτηριστικά μεγάλη ομοιότητα με τα αντίστοιχα γονίδια άλλων ειδών. Αποτελείται από πέντε υπομονάδες όπως και ο LDLr, αλλά εκφράζεται σε διαφορετικούς ιστούς. Συγκεκριμένα, εκφράζεται κυρίως στους ιστούς που συμμετέχουν στον ενεργό μεταβολισμό των λιπαρών οξέων όπως είναι η καρδιά, οι μύες, ο λιπώδης ιστός και ελάχιστα στο ήπαρ [51]. Έχει συνεργική δράση στην κάθαρση των VLDL και β-vldl, οι οποίοι περιέχουν την apoe. Αντίθετα, δε συνδέεται με λιποπρωτεΐνες που αποτελούνται από την apob-100. Σε πειραματικά μοντέλα με έλλειψη του γονιδίου που ήταν σε τυπική δίαιτα (chow diet) καθώς και σε δίαιτα πλούσια σε λιπαρά παρατηρήθηκαν φυσιολογικά επίπεδα λιπιδίων στο πλάσμα, γεγονός που αποδεικνύει ότι δεν είναι απολύτως απαραίτητος στον μεταβολισμό της χοληστερόλης. Παρατηρήθηκε, όμως, μείωση του ΒΜΙ καθώς και του λιπώδη ιστού, εγείροντας την πιθανότητα να εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της κάθαρσης των τριγλυκεριδίων. [52]. Νεότερες μελέτες έδειξαν ότι, σε δίαιτα πλούσια σε λιπαρά, τα πειραματόζωα με έλλειψη στον υποδοχέα VLDLr (VLDLr -/- ) εκδήλωσαν υπερτριγλυκεριδαιμία και παχυσαρκία [53]. Ο υποδοχέας apoer2 ανήκει επίσης στην ίδια οικογένεια με τους παραπάνω υποδοχείς, εμφανίζοντας παρόμοιες δομικές ιδιότητες. Αντίστοιχα έχει υψηλή συγγένεια σύνδεσης με τις λιποπρωτεΐνες που περιέχουν την apoe, δηλαδή τα VLDL 24
και β-vldl σωμάτια αλλά δε συνδέεται με την LDL. Εκφράζεται κυρίως στον εγκέφαλο και σε μικρότερο βαθμό στους όρχεις και στις ωοθήκες. Εικάζεται ότι συμμετέχει στην ομοιόσταση των λιπιδίων στον εγκέφαλο καθώς και στην ανάπτυξή του [13]. Μια επιπλέον σημαντική κατηγορία υποδοχέων στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν την apoe είναι οι υποδοχείς-περισυλλέκτες της Β υποκατηγορίας. Σε αυτήν ανήκουν ο CD36 και ο SR-BI. O CD36 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη και εκφράζεται σε ποικίλους ιστούς και κύτταρα, όπως σε μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα μικρών αγγείων, λιποκύτταρα, αιμοπετάλια και στους λείους μύες και στην καρδιά. Έχει σημαντική αθηροπροστατευτική δράση καθώς προσλαμβάνει τα οξειδωμένα LDL σωμάτια και ρυθμίζει τη φλεγμονώδη απάντηση. Συνδέεται επίσης και με τα HDL σωμάτια [54]. Ο SR-BI είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, που αποτελείται από 509 αμινοξέα. Εκφράζεται σε διάφορες θέσεις, αλλά ιδιαίτερη σημασία έχει η έκφραση του στα ηπατοκύτταρα επηρεάζοντας σημαντικά τον καταβολισμό της HDL. Αποτελεί θέση πρόσδεσης εκτός από τις λιποπρωτεΐνες και για διάφορα βιολογικά μόρια, όπως γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες, ιονισμένα μόρια αλλά και για ιϊκές πρωτεΐνες. Ο υποδοχέας αυτός παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια προς τα α-hdl σωμάτια, τα οποία είναι ιδιαίτερα πλούσια σε λιπίδια. 6στόσο συνδέεται ελάχιστα με τα μικρότερα HDL με μικρότερο λιπιδικό φορτίο. Είναι προφανής η συμβολή του στην κάθαρση του πλάσματος από την HDL χοληστερόλη. Ειδικότερα η σύνδεση των παραπάνω λιποπρωτεϊνών οδηγεί σε εκλεκτική πρόσληψη από το κύτταρο μόνο του λιπιδικού περιεχομένου τους. Εκτός από την πρόσληψη λιπιδίων προάγει και την εκροή χοληστερόλης προς ιστούς που έχουν ανάγκες σε χοληστερόλη [55],[56]. 1.4 ΚΑΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΧΥΛΟΜΙΚΡΩΝ Τα τριγλυκερίδια κατά την απορρόφησή τους από το εντερικό επιθήλιο υδρολύονται σε λιπαρά οξέα και γλυκερόλη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα του εντέρου επανεστεροποιούν τα λιπαρά οξέα και τα μονογλυκερίδια προς σχηματισμό τριγλυκεριδίων και φωσφολιπιδίων. Ομοίως, η απορροφηθείσα χοληστερόλη εστεροποιείται δηλαδή μετατρέπεται σε εστέρες χοληστερόλης. Συνήθως, ο πυρήνας των χυλομικρών είναι πλούσιος σε τριγλυκερίδια, ενώ μετά από ένα γεύμα πλούσιο σε χοληστερόλη αυξάνουν τα επίπεδα εστεροποιημένης χοληστερόλης σε αυτά. Στη συνέχεια, τα χυλομικρά εκκρίνονται στο λεμφικό σύστημα και εισάγονται στην 25
κεντρική κυκλοφορία μέσω του θωρακικού πόρου. Ο κύκλος αυτός επιτρέπει στο ήπαρ, το λιπώδη ιστό και τους μύες να προσλάβουν διατροφικά λιπίδια από τα χυλομικρά [57]. Η πρόσληψη αυτή γίνεται χάρη στην υδρόλυση η οποία καταλύεται από την LpL των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών στα όργανα αυτά. Απαραίτητος συνεργικός παράγοντας για την υδρόλυση είναι η απολιποπρωτεΐνη C-II (ApoC-II) [58]. Η LPL δρα στα τριγλυκερίδια των χυλομικρών, τα οποία μετατρέπονται, ακολούθως σε υπολείμματα χυλομικρών, τα οποία προσλαμβάνουν ApoE, είναι πλέον πλούσια σε χοληστερόλη και περιέχουν λιγότερα τριγλυκερίδια. Αυτά απομακρύνονται στη συνέχεια από την κυκλοφορία μέσω της πρόσληψής τους από το ήπαρ μέσω των υποδοχέων χαμηλής πυκνότητας (LDLr). MTP apocii LPL Κατάλοιπο χυλομικρού Λ. έντερο apob48 Χυλομικρά Κατάλοιπα χυλομικρών apoe Κάθαρση στο ήπαρ μέσω LDLr φωσφολιπίδια εστέρες χοληστερόλης τριγλυκερίδια Χυλομικρό Εικόνα 1.4. Μονοπάτι καταβολισμού των χυλομικρών. Για την ταχεία αυτή απομάκρυνση είναι απαραίτητη η παρουσία της ApoE, ενώ αντίθετη δράση έχει η apoc-i, η οποία αναστέλλει την πρόσληψη των υπολειμμάτων από το ήπαρ. Ο υποδοχέας LDLr είναι ο διαμεσολαβητής αυτής της πρόσληψης. Καθοριστικό ρόλο στο μεταβολισμό των χυλομικρών αλλά και των VLDL διαδραματίζει η πρωτεΐνη μικροσωμιακής μεταφοράς (MTP), η οποία επάγει την ταχεία ανταλλαγή τριγλυκεριδίων μεταξύ των διάφορων μεμβρανικών συστημάτων και εκφράζεται τόσο στο ήπαρ όσο και στα εντερικά κύτταρα. Η έλλειψή της συνδέεται με τη εκδήλωση της λιπιδαιμικής διαταραχής αβηταλιποπρωτεϊναιμία και συνοδεύεται από διαταραγμένη απορρόφηση των λιπιδίων από το έντερο και ελαττωματική μεταφορά των τριγλυκεριδίων μεταξύ των κυττάρων [59]. 26
ΣΚΟΠΟΣ Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας, η apoe, η οποία είναι υπεύθυνη για την απομάκρυνση των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών από την κυκλοφορία του αίματος μέσω του LDLr, παίζει σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση της διατροφικά επαγόμενης παχυσαρκίας και στην ανοχή της γλυκόζης [60]. Καθώς η λιπιδιωμένη apoe είναι το φυσικό πρόσδεμα του υποδοχέα LDLr, βασιζόμενοι στο παραπάνω δεδομένο αξιολογούμε στην παρούσα εργασία τον ρόλο της κάθαρσης των λιποπρωτεϊνών στην εμφάνιση των προαναφερθέντων μεταβολικών διαταραχών. Γνωρίζοντας την διαφορετική συγγένεια που έχουν οι ανθρώπινες ισομορφές της apoe ως προς τον LDLr, θέσαμε ως στόχο την διερεύνηση του ρόλου της κάθε ισομορφής (Ε2, Ε3, Ε4) στην εμφάνιση της παχυσαρκίας και του διαβήτη. Σε αυτό το κομμάτι της έρευνας χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια με έλλειψη στην apoe (apoe -/- ), φυσιολογικά ποντίκια που εξέφραζαν το πλήρες γονιδίωμα (C57BL/6) καθώς επίσης και ποντίκια που εκφράζουν την ανθρώπινη ισομορφή E2 (apoe2 +/+ ), E3 (apoe3 +/+ ) και E4 (apoe4 +/+ ) αντίστοιχα και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές αναλύσεις. Επιπλέον, όλες οι ομάδες των πειραματόζωων υποβλήθηκαν σε δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη, προκειμένου να αξιολογηθεί η απόκριση τους στην ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση της γλυκόζης. 27
2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΙ Στο πείραμα συμπεριλήφθησαν πέντε ομάδες πειραματόζωων. Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πειραματικά μοντέλα ποντικών που εκφράζουν την ανθρώπινη ισομορφή E2 (apoe2 +/+ ), E3 (apoe3 +/+ ) και E4 (apoe4 +/+ ) αντίστοιχα. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν πειραματικά μοντέλα ποντικών με καθολική έλλειψη της απολιποπρωτεϊνης Ε (apoe -/- ) [61] καθώς επίσης και φυσιολογικά ποντίκια που εξέφραζαν το πλήρες γονιδίωμα, τα C57BL/6. Η προμήθεια των πειραματόζωων έγινε από την εταιρεία Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, www.jax.org). Σε αυτή τη μελέτη, τα ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αρσενικού φύλου και ηλικίας 8-10 εβδομάδων. Κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων, κάθε πειραματόζωο φυλασσόταν σε ξεχωριστό κλουβί. Η δίαιτα που λάμβαναν πριν την έναρξη της μελέτης ήταν η τυπική, χωρίς λιπαρά (standard chow diet 1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG) και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε δίαιτα πλούσια σε λιπαρά (δίαιτα δυτικού τύπου, 17.3% πρωτεΐνες, 48.5% υδατάνθρακες, 21.2% λίπος, 0.2% χοληστερόλη, 4.5 Kcal/g) για 24 εβδομάδες. Κάθε ομάδα περιείχε πέντε ποντίκια. Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν στην 8η, 12η, 18η και 24η εβδομάδα, ωστόσο έγιναν μετρήσεις αναφοράς πριν την έκθεση των ποντικών στη δίαιτα δυτικού τύπου (μηδενική εβδομάδα). Οι 0πειραματικές μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης, τη συνθήκη του Ελσίνκι και το πρωτόκολλο προστασίας και ορθής μεταχείρισης των ζώων το οποίο έχει λάβει την έγκριση της επιτροπής πειραματόζωων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών και της κτηνιατρικής υπηρεσίας της περιφέρειας δυτικής Ελλάδος. 2.1.1 Λήψη αίματος από την ουρά ποντικών Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D-51588 Numbrecht, Germany) 28
Εικόνα 2.1 Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος. Πειραματική πορεία Πριν από την έναρξη κάθε αιμοληψίας τα πειραματόζωα έμπαιναν σε νηστεία για 16 ώρες. Τα ποντίκια ακινητοποιούνταν στις ειδικές θήκες και με ένα νυστέρι γινόταν μια μικρή τομή στο άκρο της ουράς. Προκειμένου να συλλεχθεί η απαραίτητη ποσότητα αίματος (περίπου 30-50 μl) γίνονταν μαλάξεις στην ουρά των ποντικών. Μετά την λήψη αίματος, ακολουθούσε ο καυτηριασμός της ουράς των ποντικών για να αποφευχθεί περαιτέρω αιμορραγία. Το αίμα συλλέγονταν σε ειδικά τριχοειδή σωληνάκια CB300 που περιείχαν EDTA ως αντιπηκτικό παράγοντα. Το αίμα αμέσως μετά τη λήψη ανακινούνταν ελαφρώς για να αναμιχθεί με το EDTA και διατηρούνταν σε πάγο ώσπου να φυγοκεντρηθεί στους 4 o C στις 4000 rpm για 10 λεπτά και να απομονωθεί το πλάσμα για τη διενέργεια περεταίρω αναλύσεων. 2.1.2 Μέτρηση σωματικού βάρους ποντικών Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) Πειραματική πορεία Μετά το πέρας 16 ωρών νηστείας, τα ποντίκια τοποθετούνταν στις ειδικές παγίδες και ζυγίζονταν. Ο ζυγός είχε μηδενιστεί αρχικά με το βάρος των ειδικών παγίδων ώστε να δοθεί το καθαρό σωματικό βάρος των ποντικών. 2.1.3 Μέτρηση ημερήσιας κατανάλωσης τροφής των ποντικών 29
Υλικά Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) Δίαιτα δυτικού τύπου (Diet Special, Sotto Vuoto, 221755, Mucedola, Italy) Πειραματική πορεία Κατά την έναρξη της διαδικασίας, μια ποσότητα τροφής 20g τοποθετήθηκε σε κάθε κλωβό. Στη συνέχεια, κάθε 24 ώρες για μια περίοδο εφτά ημερών ζυγιζόταν η τροφή που απέμεινε στον κλωβό και αφαιρώντας την τιμή αυτή από αυτή της προηγούμενης ημέρας, προσδιορίστηκε η ημερήσια κατανάλωση της τροφής των ποντικών. Η μέση κατανάλωση τροφής ήταν ο μέσος όρος για την διάρκεια των εφτά ημερών εκφρασμένη ως μέση κατανάλωση τροφής ± S.E.M. 2.1.4 Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη Υλικά Γλυκόμετρο (Accu-Chek Aviva, Roche) Ταινίες μέτρησης σακχάρου (Accu-Chek Aviva, Roche) Γλυκόζη (Glucose, G-7021, Sigma, USA) 10X PBS ph7.4 (800 ml dd H2O + 80 g NaCl + 2 g KCl + 14.4 g Na2HPO4 + 2.4 g KH2PO4) 1X PBS ph7.4 ( 50 ml PBS 10X + 450 ml dd H2O) Πειραματική πορεία Αρχικά, παρασκευάστηκε διάλυμα δεξτρόζης συγκέντρωσης 12.5mg/50ml 1Χ PBS. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε 16 ώρες νηστείας και ακολούθως μετρήθηκαν τα βασικά επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Η μέτρηση των επιπέδων της γλυκόζης έγινε σε μια σταγόνα αίματος από την ουρά του ποντικού χρησιμοποιώντας ένα γλυκόμετρο. Στη συνέχεια, 200 μl γλυκόζης ανά 25 g σωματικού βάρους του ποντικού, ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά στα ποντίκια και μετρήθηκαν τα επίπεδα της γλυκόζης στα 15, 30, 60, 120 λεπτά μετά την χορήγηση. 2.1.5 Έμμεσες θερμιδομετρικές μελέτες Υλικά 30
Phenomaster small animal colorimetry system (TSE Systems, Germany) Πειραματική πορεία Σε όλες τις ομάδες της μελέτης E2 (apoe2 +/+ ), E3 (apoe3 +/+ ), E4 (apoe4 +/+ ), Ε (apoe -/- ) και C57BL/6 πραγματοποιήθηκαν έμμεσες θερμιδομετρικές μελέτες χρησιμοποιώντας το σύστημα Phenomaster small animal colorimetry system (TSE Systems, Germany). Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στους ειδικούς κλωβούς για 48 ώρες ώστε να εγκλιματιστούν και στην συνέχεια προσδιορίστηκε η κατανάλωση ενέργειας (energy expenditure, ΕΕ) με βάσει την παραγωγή του όγκου του CO2 (VCO2, ml/h) και της κατανάλωσης του όγκου του O2 (VO2, ml/h) για ένα χρονικό διάστημα 24ων ωρών. Συλλέχθηκαν συνολικά 72 μετρήσεις του VCO2 και του VO. Η κατανάλωση ενέργειας (EE) ανά ποντίκι (εκφρασμένη σε Joules/h) για κάθε μέτρηση υπολογίστηκε από το τύπο: EE = (15.818 x VO2) + (5.176 x VCO2) [62] Στην συνέχεια, προσδιορίστηκε ο μέσος όρος της κατανάλωσης ενέργεια από τις 72 μετρήσεις σε συναρτήσει του σωματικού βάρους των ποντικών (g) και πραγματοποιήθηκε ανάλυση συνδιακύμανσης (ANCOVA) μεταξύ των ομάδων των ποντικών [63]. 2.2 ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ Μετά από κάθε αιμοληψία ακολουθούσε φυγοκέντρηση στις 4.000 rpm για 10 λεπτά προκειμένου να ληφθεί το πλάσμα. Το πλάσμα του αίματος χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και της ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα των ποντικών σε διαφορετικές χρονικές στιγμές κατά τη διάρκεια των 24 εβδομάδων της πειραματικής μελέτης. 2.2.1 Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα Για τη μέτρηση των τριγλυκεριδίων χρησιμοποιήθηκε το Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100). Με το κιτ αυτό μπορούμε να προσδιορίσουμε τα επίπεδα γλυκερόλης, πραγματικών τριγλυκεριδίων και ολικών τριγλυκεριδίων σε πλάσμα ή ορό. Τα τριγλυκερίδια, οι εστέρες λιπαρών οξέων και η γλυκερόλη είναι υδρόφοβα μόρια και η κυκλοφορία τους στο πλάσμα είναι εφικτή μόνο όταν 31