ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΚΛΩΣΤΟΫΦΑΝΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΙΑΣ ΚΟΥΤΙΝΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΜΥΚΗΤΑ FUSARIUM OXYSPORUM

ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΚΛΩΣΤΟΫΦΑΝΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΙΑΣ ΚΟΥΤΙΝΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΜΥΚΗΤΑ FUSARIUM OXYSPORUM Μ.Χ. Κανελλή, Ε. Νικολάιβιτς, Π. Χριστακόπουλος, Ε. Τόπακας Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 157 80 Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η μελέτη και ανακάλυψη καινοτόμων ενζύμων έχει σημειώσει σημαντική πρόοδο στο σύγχρονο τεχνολογικό κόσμο, καθώς οδήγησε στην παραγωγή πολλών ενζύμων βιομηχανικού ενδιαφέροντος με διάφορες εφαρμογές, όπως στην περίπτωση της Κλωστοϋφαντουργίας. Μια από τις πιο σημαντικές προκλήσεις στο τομέα αυτό, είναι η δυνατότητα της επιφανειακής τροποποίησης συνθετικών κλωστοϋφαντουργικών προϊόντων με στόχο την αύξηση της υδροφιλικότητας των συνθετικών πολυμερών για τη βελτίωση των χαρακτηριστικών και των ιδιοτήτων τους. Το ενδιαφέρον των ερευνητών συγκεντρώνεται γύρω από την οικογένεια των υδρολασών σερίνης με κυριότερα ένζυμα την κατηγορία των κουτινασών. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η αύξηση της υδροφιλικότητας πολυεστερικών και πολυαμιδικών ινών και υφασμάτων μέσω της ελεγχόμενης ενζυμικής υδρόλυσης των εστερικών τους δεσμών. Τα ένζυμα αυτά, λόγω του μεγέθους τους δρουν μόνο επιφανειακά, με αποτέλεσμα τα χαρακτηριστικά της κύριας μάζας των συνθετικών ινών να παραμένουν αμετάβλητα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε μία κουτινάση από τον μικροοργανισμό Fusarium oxysporum, η οποία υπερεκφράστηκε ετερόλογα σε δυο διαφορετικού ξενιστές, στη μεθυλότροφη ζύμη Pichia pastoris Χ-33 και το βακτήριο Escherichia coli BL21. Το ένζυμο αυτό απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε με στόχο τη Βιοτεχνολογική του αξιολόγηση ως βιοκαταλύτης τροποποίησης συνθετικών ινών στην Κλωστοϋφαντουργία. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στη σύγχρονη εποχή η πρόοδος της τεχνολογίας και της επιστήμης έχει επιφέρει σημαντικές αλλαγές και έχει συμβάλει στην εξέλιξη διάφορων βιομηχανικών τομέων, όπως είναι η βιομηχανία της κλωστοϋφαντουργίας. Πλέον οι κλωστοϋφαντουργικές ίνες που παρασκευάζονται, από τις οποίες προκύπτουν τα νήματα και τα υφάσματα, διαχωρίζονται σε φυσικές (μαλλί, βαμβάκι, λινάρι, κυτταρίνη), τεχνητές (όπως αναγεννημένη φυτική κυτταρίνη και καζεΐνη του γάλακτος) και συνθετικές (πολυαμίδια, πολυεστέρες, πολυολεφίνες, ακρυλικές) [1]. Η πλέον γνωστή συνθετική ίνα είναι το πολυαμίδιο Nylon 6,6, το οποίο προκύπτει από ένα μόνο μονομερές με 6 άτομα C και περιέχει στο ένα άκρο του την καρβοξυλομάδα COOH και στο άλλο την αμινομάδα ΝΗ 2. Μετά τα πολυαμίδια η έρευνα οδήγησε στην παρασκευή ινών από πολυεστέρες και ακρυλικά. Από τους πολυεστέρες κυριότερος εκπρόσωπος είναι ο παραγόμενος από τη συμπύκνωση τερεφθαλικού οξέος (TPA) με την αιθυλενογλυκόλη. Οι συνθετικές ίνες χαρακτηρίζονται από πληθώρα πλεονεκτημάτων που τα καθιστούν κατάλληλα για πολλές εφαρμογές. Ενδεικτικά, παρουσιάζουν άριστες φυσικές ιδιότητες (π.χ. αντοχή και ελαστικότητα ινών πολυαμιδίου (PA) και τερεφθαλικού πολυεστέρα (PET) και υψηλότερη ανθεκτικότητα σε επιθέσεις εντόμων και παράσιτων, όπως ο σκώρος. Επιπλέον, ζαρώνουν λιγότερο, στεγνώνουν πιο γρήγορα, μπορούν να παραχθούν σε μαζικές ποσότητες σε ελάχιστο χρόνο και έχουν χαμηλότερο κόστος παραγωγής. Ειδικότερα, οι ίνες ΡΑ και ΡΕΤ έχουν άριστες φυσικές

ιδιότητες, όπως αντοχή, ελαστικότητα και υψηλή κρυσταλλικότητα. Ωστόσο οι συνθετικές ίνες παρουσιάζουν ένα σημαντικό μειονέκτημα: έχουν χαμηλή υδροφιλικότητα που δυσχεραίνει τις διεργασίες του φινιρίσματος και της βαφής, εμποδίζει την ενσωμάτωση προσθέτων, όπως επιβραδυντικά καύσης, ενώ δεν είναι άνετα στην ένδυση, καθώς εμποδίζει την εξάτμιση λόγω εφίδρωσης δημιουργώντας ασφυκτικές συνθήκες για το δέρμα και δυσοσμία. Σε αυτό το πλαίσιο μία καινοτόμος προσέγγιση είναι η ενζυμική τροποποίηση της επιφάνειας των ινών για τη βελτίωση της ποιότητας και των ιδιοτήτων των συνθετικών ινών, κατά την οποία πραγματοποιείται ενζυμική υδρόλυση της επιφάνειας των ινών/υφασμάτων προστατεύοντας και διατηρώντας την αντοχή των τροποποιημένων υλικών. Επεξηγηματικά, τα ένζυμα εμφανίζουν εξειδίκευση και δρουν μόνο στην επιφάνεια των ινών και όχι στο εσωτερικό τους, λόγω του μεγάλου μεγέθους τους, το οποίο δεν τους επιτρέπει τη διάχυση προς το εσωτερικό των ινών. Ως εκ τούτου δεν πραγματοποιείται υποβάθμιση άλλων ιδιοτήτων [2,3,4]. Επιπρόσθετο πλεονέκτημα της ενζυμικής τροποποίησης είναι βέβαια ότι πρόκειται για βιοκαταλυτική και όχι χημική μέθοδο και δεν είναι απαραίτητη η χρήση πολύπλοκων μηχανημάτων, όπως π.χ. στην περίπτωση τροποποίησης με χρήση πλάσματος. Πρόσφατα χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές Γενετικής Μηχανικής με σκοπό τη μεγέθυνση του ενεργού κέντρου των ενζύμων τροποποίησης πολυεστέρων, ώστε να μπορεί να φιλοξενήσει καλύτερα τα μεγαλομόρια των πολυμερών [5]. Νέες μοντέρνες τεχνικές Μοριακής Βιολογίας και Βιοπληροφορικής γίνονται ολοένα πιο απαραίτητες ως εργαλεία για την αναβάθμιση συνθετικών πολυμερών μέσω της μετατροπής των καταλυτικών ιδιοτήτων των ενζύμων προς πιο λειτουργικούς βιοκαταλύτες. Παρ όλα αυτά, η αλληλεπίδραση μεταξύ ενζύμουπολυμερούς δεν είναι διευκρινισμένη, δυσκολεύοντας έτσι το έργο της αναζήτησης του σωστού βιοκαταλύτη, ο οποίος θα προσφέρει τα επιθυμητά αποτελέσματα στην τροποποιούμενη συνθετική ίνα. Η βιβλιογραφική ανασκόπηση αποτελεί προς το παρόν το σημαντικότερο εργαλείο για το σχεδιασμό μιας τέτοιας βιοτεχνολογικής διεργασίας, η οποία τα τελευταία χρόνια αυξάνεται εκρηκτικά στο πεδίο της επιφανειακής ενζυμικής τροποποίησης συνθετικών πολυμερών. Ωστόσο, στην πρόσφατη βιβλιογραφία έχει παρατηρηθεί ότι δεν υπάρχει καμία σχέση μεταξύ της τάξης των ενζύμων ή της πηγής προέλευσής τους και της δραστικότητας που εμφανίζουν αυτά για την τροποποίηση ινών ΡΑ ή ΡΕΤ. Για το λόγο αυτό είναι αναγκαία η μελέτη πολλών και διαφορετικών ενζύμων, τα οποία ανήκουν σε διαφορετικές οικογένειες πρωτεϊνών για τη δυνατότητα επιφανειακής τροποποίησης ινών. Η τροποποίηση του ΡΑ εστιάζεται στην επιφανειακή υδρόλυση των αμιδικών δεσμών, δημιουργώντας ελεύθερες καρβοξυλο- και αμινο-ομάδες στην επιφάνεια των ινών [3] και τα ένζυμα που έχουν χρησιμοποιηθεί στη διεθνή βιβλιογραφία για την τροποποίηση ινών πολυαμιδίου, είναι εστεράσες, κουτινάσες και πρωτεάσες [6]. Για τη στοχευμένη επιφανειακή υδρόλυση υφασμάτων από ΡΕΤ, με σκοπό την αποφυγή χνουδιάσματος κατά τη διαδικασία πλύσης, έχουν χρησιμοποιηθεί κουτινάσες, λιπάσες και εστεράσες. Το ΡΕΤ έχει υδρολυθεί από κουτινάσες από τους μύκητες Fusarium solani, Fusarium οxysporum και Penicillium citrinum [7]. Οι κουτινάσες ανήκουν στην οικογένεια των υδρολασών σερίνης που, όπως είναι γνωστό, υδρολύουν π-νιτροφαινυλο-εστέρες όπως και διαλυτά και αδιάλυτα τριγλυκερίδια [3]. Κατά καιρούς έχουν γίνει έρευνες όσον αφορά στη δυνατότητα των κουτινασών να καταλύουν την επιφανειακή τροποποίηση συνθετικών ινών. Η κουτινάση από το μεσόφιλο μύκητα F. oxysporum που παρουσιάζει μεγάλη ομολογία (78%) με την κουτινάση από το F. solani pisi, η οποία είναι ευρέως διαδεδομένη στη βιβλιογραφία τόσο τα προηγούμενα χρόνια ως εμπορικό προϊόν όσο και ως παρασκεύασμα εργαστηριακής

κλίμακας, αναμένεται να έχει τη δυνατότητα ενζυμικής τροποποίησης πολυμερών τόσο πολυεστέρων όσο και πολυαμιδίων. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Για την κλωνοποίηση της κουτινάσης του F. oxysporum χρησιμοποιήθηκε η πολυμεράση VentR DNA (New England Biolabs, Beverly MA) και περιοριστικά ένζυμα ClaI, XbaI και SacI (TAKARA, Japan). Για την παραγωγή της κουτινάσης από την Escherichia coli BL21 χρησιμοποιήθηκε η πολυμεράση KOD Hot Start (Novagen) και τα περιοριστικά ένζυμα NdeI και NotI (TAKARA, Japan). Για την απομόνωση DNA από πήκτωμα αγαρόζης και για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιήθηκαν τυποποιημένα εμπορικά σκευάσματα Perfectprep Gel Cleanup και Nucleospin Plasmid Kits, αντίστοιχα. Για την κλωνοποίηση στους πλασμιδιακούς φορείς pcr-blunt, ppiczαc και pet22b χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη E. coli TOP10, TOP10F, ενώ για την ετερόλογη έκφραση της ανασυνδυασμένης κουτινάσης χρησιμοποιήθηκε η μεθυλότροφη ζύμη P. pastoris X-33 (Wild Type, Mut+) και το E. coli BL21. Για την επιλογή τους, τα ανασυνδυασμένα στελέχη E. coli αναπτύχθηκαν στους 37 o C σε θρεπτικό υλικό LB (Luria-Bertani) που περιέχει 50 μg/ml καναμυκίνη (pcr-blunt ) ή 100μg/mL αμπικιλλίνη (pet22b) ή LS-LB (Low salt LB) με 25 μg/ml Ζεοσίνη (ppiczαc). Για την επιλογή των ανασυνδυασμένων κλώνων της P. pastoris χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία YPDS με τελική συγκέντρωση Zεοσίνης 100μg/mL. Για την ενζυμική επιφανειακή τροποποίηση των πολυεστερικών και πολυαμιδικών υφασμάτων τα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι διβασικό φωσφορικό νάτριο, κιτρικό οξύ, υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), τριχλωρικό οξύ (TCA), βορικό οξύ, δεκαένυδρο τετροβορικό νάτριο, τρινιτροβενζολοσουλφονικό οξύ (TNBS), υδροξείδιο του νατρίου (ΝαΟΗ), τα οποία προέρχονται από τη Sigma (Ελβετία), όπως επίσης και τα ανθρακικό νάτριο (NaCO 3 ), χλωριούχο νάτριο (NaCl), εξαμεθυλοδιαμίνη και TPA που προέρχονται από τη Merck (Γερμανία). Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν για την επιφανειακή τροποποίηση των υφασμάτων είναι η ανασυνδυασμένη κουτινάση του F. oxysporum (FoCut16606) η οποία παρήχθη στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, όπως επίσης και τα εμπορικά ένζυμα Lipolase και Alcalase τα οποία προέρχονται από τη Novozymes (Δανία). Τα υφάσματα από PET και από PA είναι ευγενική χορηγεία της Εταιρίας ΚΟΛΟΡΑ Α.Ε. (Θέρμη, Θεσσαλονίκη). Τα υφάσματα αυτά έχουν επεξεργασθεί με ειδικούς διαβρέκτες προκειμένου να απομακρυνθούν υπολείμματα παραφινών που χρησιμοποιούνται για λίπανση στην πλεκτομηχανή. Για την ετερόλογη παραγωγή της κουτινάσης του F. oxysporum στο μεθυλοτροφικό μύκητα P. pastoris Χ-33 χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας για E. coli/p. pastoris, ppiczαc, ο οποίος περιέχει τον αυστηρώς ελεγχόμενο προαγωγό της αλκοολικής οξειδάσης AOX1 και τον α-παράγοντα εξωκυτταρικής έκκρισης του S. cerevisiae πριν την περιοχή κλωνοποίησης. Το γονίδιο της κουτινάσης, foxg16606.2, ενισχύθηκε με τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) από το γενωμικό DNA του F. oxysporum με τη χρήση εκκινητών που σχεδιάστηκαν με βάση τη διαθέσιμη αλληλουχία που είναι ελεύθερα διαθέσιμη στη βάση δεδομένων γενωμικής του γένους Fusarium στο BROAD Institute του MIT (http://www.broadinstitute.org). Οι συγκεκριμένοι εκκινητές σχεδιάστηκαν ως εξής: 5 - CGATCGATGCTTCCCGCTGGTCAGGATGC-3 με την περιοχή του ClaI (υπογραμμισμένη) και 5 -CGTCTAGAGCGGCTCCAGCAGCATCAGC-3 με την περιοχή του XbaI (υπογραμμισμένη). Για την ενίσχυση του γονιδίου χρησιμοποιήθηκε η πολυμεράση VentR που λειτούργησε σε 40 κύκλους αποδιάταξης του DNA (denaturation) (20 s, 95 ο C), προσαρμογής των εκκινητών (annealing) (10 s, 56 o C) και επιμήκυνσης των εκκινητών (extension) (20 s, 70 ο C) και 2 min περαιτέρω επιμήκυνση στους 70 ο C. Για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας DNA του προϊόντος της PCR, αυτό κλωνοποιήθηκε στον

φορέα pcr-blunt, σύμφωνα με τη μέθοδο του Zero Blunt PCR Cloning Kit. Ο φορέας που περιείχε το γονίδιο foxg16606.2 υπέστη πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα XbaI και ClaI και το προκύπτον τμήμα DNA κλωνοποιήθηκε στο φορέα ppiczαc, ύστερα από απομόνωσή του από πήκτωμα αγαρόζης, δημιουργώντας ένα ανασυνδιασμένο ppiczαc-foxg16606.2 πλασμίδιο, το οποίο πολλαπλασιάστηκε στα E. coli TOP10F που επιλέχθηκαν με την ιδιότητα της ανθεκτικότητας σε Ζεοσίνη (25 μg/ml). Ο ανασυνδυασμός του φορέα επιβεβαιώθηκε με πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα ClaI και XbaI και με αλληλούχηση DNA και έπειτα έγινε ο μετασχηματισμός της P. pastoris Χ-33. Για τον μετασχηματισμό των κυττάρων της P. pastoris έγινε πρώτα η γραμμικοποίηση του πλασμιδίου ppiczαc-foxg16606.2, με το περιοριστικό ένζυμο SacI, και έπειτα πραγματοποιήθηκε ο μετασχηματισμός της P. pastoris Χ-33 και η καλλιέργεια σε αναδευόμενες φιάλες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του EasySelect Pichia Expression Kit. Για την έκφραση της κουτινάσης FoCut16606 εσωκυτταρικά στον ξενιστή E. coli BL21, χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pet22b, ο οποίος περιέχει ως προαγωγό το οπερόνιο lac το οποίο μεταβολίζει τη λακτόζη. Το γονίδιο της κουτινάσης ενισχύθηκε με τη μέθοδο PCR από το πλασμιδιακό DNA pcr-bluntfoxg16606.2, που είχε χρησιμοποιηθεί για την ετερόλογη έκφραση στην P. pastoris και είχε ήδη αλληλουχηθεί. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν ως εξής: 5 - GCCATATGCTTCCCGCTGGTCAGGATGC-3 με την περιοχή του NdeI (υπογραμμισμένη) και 5 -CGGCGGCCGCTCCAGCAGCATCAGCCTTCTG-3 με την περιοχή του NotI (υπογραμμισμένη). Χρησιμοποιήθηκε η πολυμεράση KOD Hot Start, η οποία λειτούργησε σε 35 κύκλους αποδιάταξης του DNA (denaturation) (20s, 95 ο C), προσαρμογής των εκκινητών (annealing) (10 s, 55 ο C) και επιμήκυνσης των εκκινητών (extension) (20 s, 72 ο C) και 90 sec περαιτέρω επιμήκυνση στους 72 ο C. Ακολουθώντας την ίδια μεθοδολογία με παραπάνω, το προκύπτον τμήμα DNA κλωνοποιήθηκε στο φορέα pet22b και ακολούθησε ο μετασχηματισμός κυττάρων E.coli BL21 και επιλογή των ανασυνδυασμένων, τα οποία εμφάνισαν ανθεκτικότητα σε αμπικιλλίνη (100 μg/ml). Τα μετασχηματισμένα στελέχη P. pastoris που φέρουν το γονίδιο foxg16606.2 αναπτύχθηκαν στους 30 ο C σε φιάλες με 50 ml θρεπτικό BMGY, σε ανακινούμενους επωαστήρες (200 rpm) για 20-24 h. Από τον όγκο αυτόν ελήφθη ασηπτικά με φυγοκέντρηση ποσότητα κυττάρων τέτοια ώστε επαναιωρούμενη σε 200 ml θρεπτικό BMMY να προκύψει OD 600 1 και τότε να ξεκινήσει η επαγωγή. Η καλλιέργεια παρέμεινε σε ανακινούμενο επωαστήρα (30 ο C, 200 rpm) για 5 ημέρες, με την προσθήκη μεθανόλης 0.5 % (v/v) τελική συγκέντρωση κάθε ημέρα, έτσι ώστε να διατηρηθεί η επαγωγή. Η ανασυνδυασμένη κουτινάση FoCut16606 χρησιμοποιήθηκε ύστερα από συμπύκνωσή της σε συσκευή συμπύκνωσης Amicon: Amicon chamber 8400 με μεμβράνη Diaflo PM-10, μεγέθους αποκλεισμού 10 kda (Millipore, Billerica, USA). Τα αντίστοιχα ανασυνδυασμένα στελέχη Ε. coli BL21 αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε θρεπτικό υλικό LB παρουσία αμπικιλλίνης (5 ml), σε ανακινούμενους επωαστήρες (180 rpm) για 16-20 h. Από την προκαλλιέργεια ελήφθη ποσότητα 1 ml για τον εμβολιασμό φιάλης με 100 ml LB, η οποία επωάσθηκε στους 37 ο C με ανάδευση 180 rpm έως ότου η οπτική πυκνότητα OD600 αγγίξει την τιμή 0.6. Ύστερα ξεκίνησε η επαγωγή με την προσθήκη 0.1 % Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1M. Τα κύτταρα ύστερα από επώαση 16-20 h συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (4000xg για 15 min) και επαναιωρήθηκαν σε 40 ml ρυθμιστικού διαλύματος 20 mm Tris-HCl ph 8.0, 300 mm NaCl. Στη συνέχεια υπέστησαν ρήξη με υπερήχους (120 s, Duty Cycle 50%, micro-tip limit 4) και τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση (10000xg, 20 min). Έπειτα ακολούθησε χρωματογραφία συγγένειας μεταλλικού ιόντων (IMAC) Co 2+, εκμεταλλευόμενοι τα 6 συνεχόμενα κατάλοιπα ιστιδίνης (His-tag) που είχαν προστεθεί κατά τη διαδικασία κλωνοποίησης στο καρβοξυτελικό άκρο της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης.

Για τη μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας της κουτινάσης FoCut16606, χρησιμοποιήθηκε ο εστέρας του π-νιτροφαίνυλο βουτυρικού οξέος (pnpb) (1.14 mm) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ph 6, χρησιμοποιώντας φωτομετρία ορατού για την ανίχνευση της απελευθερούμενης π-νιτροφαινόλης με μέγιστο απορρόφησης στα 410 nm. Ενζυμική επιφανειακή τροποποίηση πολυεστερικών υφασμάτων: 1 g υφάσματος ΡΕΤ, αφήνεται να αντιδράσει με 23 U FoCut16606 σε 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών φωσφορικών ph 6 για 72 ώρες, υπό έντονη ανάδευση (180 rpm). Δείγματα λαμβάνονταν ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα (3, 6, 24, 48, 72 ώρες). Παράλληλα 1 g υφάσματος ΡΕΤ αφήνεται να αντιδράση υπό τις ίδιες ακριβώς συνθήκες με 70 U λιπασης Lipolase. Μετά το πέρας της αντίδρασης τα υφάσματα ξεπλύθηκαν με 2 g/l NaCO 3 στους 60 o C για μισή ώρα και έπειτα δυο φορές με απιονισμένο νερό από μισή ώρα στην ίδια θερμοκρασία. Η εκτίμηση της επιφανειακής ενζυμικής τροποποίησης των πολυεστερικών υφασμάτων γίνεται μέσω της ποσοτικοποίησης της απελευθέρωσης TPA μέσω φθορισμομετρίας. Αρχικά σε 1 ml δείγματος υπερκείμενου υγρού της αντίδρασης του πολυεστερικού υφάσματος με την κουτινάση και τη λιπάση αντίστοιχα, προστίθενται 110 μl TCA 4.7 M, ώστε να απομακρυνθεί το πρωτεϊνικό φορτίο μέσω φυγοκέντρησης. Έπειτα σε 1 ml απαλλαγμένου από την πρωτεΐνη δείγματος προστίθενται 2 ml Η 2 Ο 2 και ύστερα από επώαση 30 λεπτών στους 90 o C και αφού αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου, μετράται η απορρόφηση των ιόντων υδροξυ-τερεφθαλικού (HTA) που έχουν παραχθεί από την αντίδραση του ΤΡΑ που προέκυψε από τη δράση του ενζύμου με το Η 2 Ο 2. Η μέτρηση γίνεται στο φθορισμόμετρο Jasco FP-1520 με μήκος κύματος διέγερσης 315 nm και μήκος κύματος εκπομπής 425 nm [8]. Η απορρόφηση μετατρέπεται σε συγκέντρωση βάσει της καμπύλης αναφοράς η οποία καθορίστηκε με χρήση διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης TPA 0.05, 0.1, 0.3, 0.8, 1, 3 και 5 mm. Ενζυμική επιφανειακή τροποποίηση πολυαμιδικών υφασμάτων: 1.5 g υφάσματος ΡΑ, αφήνεται να αντιδράσει με 34 U της FoCut16606 σε 75 ml ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών φωσφορικών ph 6 για 72 ώρες, υπό έντονη ανάδευση (180 rpm). Δείγματα λαμβάνονταν ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα (3, 6, 24, 48, 72 ώρες). Παράλληλα 1.5 g υφάσματος ΡΑ αφήνεται να αντιδράση υπό τις ίδιες ακριβώς συνθήκες με 104 U πρωτεάσης (Alcalase). Μετά το πέρας της αντίδρασης τα υφάσματα ξεπλένονται με 2 g/l NaCO 3, όπως και στην περίπτωση των πολυεστερικών υφασμάτων. Η εκτίμηση της επιφανειακής ενζυμικής τροποποίησης των πολυαμιδικών υφασμάτων γίνεται με ποσοτικό προσδιορισμό της απελευθέρωσης αμινομάδων μέσω φωτομέτρησης. Ο προσδιορισμός των αμινομάδων βασίζεται στην αντίδραση τους με το TNBS κατά την οποία δημιουργούνται σύμπλοκα που μπορούν να μετρηθούν φασματοφωτομετρικά στο μήκος κύματος 420 nm. Αρχικά σε 1 ml δείγματος υπερκείμενου υγρού της αντίδρασης του πολυαμιδικού υφάσματος με την κουτινάση και την πρωτεάση αντίστοιχα, γίνεται η απομάκρυνση των πρωτεϊνών με TCA 4.7 M, όπως περιγράφεται παραπάνω. Στη συνέχεια σε 500 μl απαλλαγμένου από την πρωτεΐνη δείγματος προστίθενται 20.5 μl NaOH 10 M και 750 μl ρυθμιστικού διαλύματος βορικού οξέος 200 mm προκειμένου να ρυθμιστεί το ph στο 8.5. Σε 1 ml τελικού δείγματος προστίθενται 25 μl υδατικού TNBS 30 mm και αφήνεται να αντιδράσει για 30 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Έπειτα μετράται η απορρόφηση στο φασματοφωτόμετρο BOECO S-20 στα 420 nm και μετατρέπεται σε συγκέντρωση βάσει της καμπύλης αναφοράς [9]. H καμπύλη αναφοράς καθορίστηκε με χρήση διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης εξαμεθυλοδιαμίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που έχει υποστεί την όλη διαδικασία που προαναφέρθηκε (0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15 και 0.2 mm).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Για το βιοτεχνολογικό χαρακτηρισμό της ανασυνδυασμένης κουτινάσης FoCut16606, αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στην καταλυτική ενεργότητα του ενζύμου. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δυο διαφορετικές μορφές του ενζύμου, μία παραγόμενη από το μεθυλοτροφικό μύκητα P. pastoris και μία από το E. coli. Η βέλτιστη θερμοκρασία προσδιορίστηκε πραγματοποιώντας ενζυμικές αντιδράσεις υδρόλυσης του εστέρα pnpb σε ένα εύρος θερμοκρασιών (25-70 ο C) για 10 min σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών φωσφορικών ph 6.0. Όπως προέκυψε από τις μετρήσεις που παρατίθενται στο Σχήμα 1, οι βέλτιστες θερμοκρασίες ενεργότητας στις δυο διαφορετικές ανασυνδυασμένες κουτινάσες διαφέρουν σημαντικά, επιδεικνύοντας μέγιστη ενεργότητα στους 40 και 50 o C για το προϊόν του E. coli και P. pastoris, αντίστοιχα. Σχήμα 1. Επίδραση της θερμοκρασίας στην ενεργότητα της ανασυνδυασμένης κουτινάσης FoCut16606 από τo Ε. coli BL21 ( ) και P. pastoris X-33 ( ). Η θερμική αστάθεια που παρουσιάζει η κουτινάση παραγόμενη από τον E. coli, ίσως οφείλεται στην αδυναμία του βακτηρίου να σχηματίσει δισουλφιδικούς δεσμούς στο κυτταρόπλασμα έναντι της δυνατότητας των ευκαριωτικών ξενιστών, όπως η P. pastoris, οι οποίοι διαθέτουν το απαραίτητο οξειδωτικό περιβάλλον στο ενδοπλασματικό δίκτυο κατά τη διαδικασία έκκρισης της πρωτεΐνης [10]. Η τριτοταγής δομή της κουτινάσης FoCut16606, όπως αυτή διαμορφώθηκε από την ομόλογη μοντελοποίηση που πραγματοποιήθηκε στο διακομιστή Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/, [11]) χρησιμοποιώντας ως πρότυπο την κουτινάση από το F. solani (1CEX), παρουσιάζει δύο δισουλφιδικούς δεσμούς (Σχήμα 2). Εξαιτίας της σχετικής αστάθειας που παρουσίασε το προϊόν του ετερόλογου ανασυνδυασμού του E. coli, για τη συνέχεια των πειραμάτων της επιφανειακής τροποποίησης συνθετικών υφασμάτων χρησιμοποιήθηκε η κουτινάση παραγόμενη από την P. pastoris. Λόγω της μεγάλης υδροφοβικότητας που παρουσιάζει το ένζυμο αυτό στην επιφάνεια του, δεν ήταν εφικτός ο χρωματογραφικός διαχωρισμός του από το εξωκυτταρικό περιεχόμενο της ζύμης. Επομένως, για τη μελέτη της επιφανειακής τροποποίησης συνθετικών υφασμάτων, χρησιμοποιήθηκε το συμπυκνωμένο υπερκείμενο υγρό της καλλιέργειας (crude), όπως αυτό προέκυψε από την καλλιέργεια και επαγωγή της ανασυνδυασμένης κουτινάσης μετά από πέντε μέρες επώαση.

Σχήμα 2. Η τριτοταγής δομή της κουτινάσης FoCut16606, όπως διαμορφώθηκε από ομόλογη μοντελοποίηση στο διακομιστή Swiss-Model. Με μαύρο χρώμα διακρίνονται οι δυο δισουλφιδικές γέφυρες που προσφέρουν σταθερότητα στη τριτοταγή δομή της πρωτεΐνης. Για την επιφανειακή τροποποίηση υφασμάτων από PA και PET χρησιμοποιήθηκαν εκτός από την ανασυνδυασμένη κουτινάση του F. oxysporum και εμπορικά ενζυμικά σκευάσματα λιπάσης και πρωτεάσης. Μέτρο της επιφανειακής τροποποίησης αποτελεί η περιορισμένη απελευθέρωση μονομερών που είναι το TPA και η εξαμεθυλοδιαμίνη για τα υφάσματα αποτελούμενα από PET και Nylon 6,6, αντίστοιχα. Στο Σχήμα 3 παρουσιάζονται οι μέγιστες συγκεντρώσεις TPA που απελευθερώθηκαν στα υπερκείμενα υγρά των πολυεστερικών υφασμάτων που επεξεργάστηκαν με λιπάση Lipolase ή κουτινάση FoCut16606 στις θερμοκρασίες 30, 40 και 50 o C. Παρατηρούμε ότι η λιπάση πραγματοποίησε τη μέγιστη απελευθέρωση TPA (3.981 mm), ενώ ικανοποιητική ήταν και η απελευθέρωση TPA με τη δράση της κουτινάσης (2.545 mm) για θερμοκρασίες επώασης 40 και 50 o C, αντίστοιχα. Η σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης TPA σε όλα τα δείγματα σημειώνεται στις πρώτες 3 με 6 ώρες. TPA (mm) 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 25 30 35 40 45 50 55 Θερμοκρασία ( o C) Σχήμα 3. Συγκέντρωση του TPA στα υπερκείμενα υγρά των ενζυμικά τροποποιημένων πολυεστερικών δειγμάτων στις αντίστοιχες θερμοκρασίες. Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν Lipolase ( ) και FoCut16606 ( ). Στο Σχήμα 4 παρατίθενται οι μέγιστες συγκεντρώσεις αμινομάδων που απελευθερώθηκαν στα υπερκείμενα υγρά των πολυαμιδικών υφασμάτων που επεξεργάστηκαν με την πρωτεάση (Alcalase) ή την κουτινάση FoCut16606 στις θερμοκρασίες 30, 40 και 50 o C. Παρατηρούμε ότι η πρωτεάση πραγματοποίησε τη μέγιστη απελευθέρωση αμινομάδων (0.811 mm), ενώ αρκετά χαμηλή ήταν η απελευθέρωση αμινομάδων με τη δράση της κουτινάσης (0.139 mm) για θερμοκρασίες επώασης 50 o C. Για τα δείγματα που επεξεργάστηκαν με πρωτεάσες

(Alcalase) η αύξηση της συγκέντρωσης των αμινομάδων ήταν ταχεία τις πρώτες 6 ώρες και έπειτα η αύξηση συχεχίστηκε με αργό ρυθμό με τη μέγιστη συγκέντρωση να σημειώνεται στις 72 ώρες. Αντιθέτως τα δείγματα που επεξεργάστηκαν με κουτινάση παρουσίασαν μέγιστη συγκέντρωση στο διάστημα μεταξύ 6 και 24 ωρών και στη συνέχεια η συγκέντρωση των αμινομάδων δε μεταβλήθηκε περαιτέρω. Σχήμα 4. Συγκέντρωση των ελεύθερων αμινομάδων στα υπερκείμενα υγρά των ενζυμικά τροποποιημένων πολυαμιδικών δειγμάτων στις αντίστοιχες θερμοκρασίες. Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν Alcalase ( ) και FoCut16606 ( ). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ανασυνδυασμένη κουτινάση FoCut16606 του F. oxysporum υπερεκφράστηκε ετερόλογα χρησιμοποιώντας δυο διαφορετικά συστήματα πρωτεϊνικής έκφρασης, το μεθυλοτροφικό μύκητα P. pastoris X-33 και το βακτήριο E. coli BL21. Το προϊόν της ενζυμικής παραγωγής από το ευκαριωτικό σύστημα της P. pastoris βρέθηκε σταθερότερο έναντι του προϊόντος από το προκαρυωτικό σύστημα του E. coli, αποδεικνύοντας τη σπουδαιότητα των μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων που είναι αναγκαίες για τη σωστή αναδίπλωση και λειτουργία της κουτινάσης από το μύκητα F. oxysporum. Παρόλα αυτά, η ανασυνδυασμένη κουτινάση από το E. coli, μπορεί να μας δώσει τη δυνατότητα δομικών μελετών μέσω κρυσταλλογραφίας εξαιτίας της απουσίας γλυκοζυλίωσης η οποία λαμβάνει χώρα ετερογενώς σε ευκαρυωτικούς ξενιστές ιδιαίτερα στη ζύμη P. pastoris. Συνοπτικά η επιφανειακή τροποποίηση των πολυεστερικών και πολυαμιδικών υφασμάτων δια της ενζυμικής οδού ήταν επιτυχής με χρήση μίας ανασυνδυασμένης κουτινάσης από τον μικροοργανισμό F. oxysporum, αλλά και των εμπορικών ενζυμικών παρασκευασμάτων λιπάσης (Lipolase) και πρωτεάσης (Alcalase) της Novozymes. Όσον αφορά τα πολυεστερικά υφάσματα, η επιφανειακή υδρόλυση που πραγματοποιήθηκε εξαιτίας της ενζυμικής δράσης ήταν εντονότερη απ ότι στα πολυαμιδικά υφάσματα. Τόσο η Lipolase όσο και η κουτινάση τροποποιούν σημαντικά τα υφάσματα από ΡΕΤ κρίνοντας από τις συγκεντρώσεις TPA που απελευθερώνεται. Η λιπάση Lipolase φαίνεται να δρα εντονότερα στους 40 o C, ενώ η κουτινάση παρουσιάζει μεγαλύτερη ενεργότητα στους 50 o C με ενδεχομένως καλύτερα αποτελέσματα σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Στα πολυαμιδικά υφάσματα το εμπορικό παρασκεύασμα της πρωτεάσης (Alcalase) προκαλεί καλύτερη επιφανειακή τροποποίηση του δείγματος, ωστόσο και η κουτινάση επιδρά με πολύ χαμηλές αποδόσεις στους 50 o C και για τα δύο ένζυμα. Συμπερασματικά, η ανασυνδυασμένη κουτινάση που παρήχθη ετερόλογα στην παρούσα μελέτη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της ενζυμικής τροποποίησης πολυεστερικών αντί πολυαμιδικών υφασμάτων, με απώτερο σκοπό της αύξηση της υδροφιλικότητας και τη βελτίωση των ιδιοτήτων τους, όπως επίσης και σε πληθώρα άλλων εφαρμογών. Τα παραπάνω δεδομένα απoτελούν αποτελέσματα προκαταρκτικών πειραμάτων τα οποία συνεχίζονται στο Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας της Σχολής Χημικών Μηχανικών του

ΕΜΠ στα πλαίσια του Ερευνητικού Προγράμματος «Συνεργασία» με τίτλο «TEXT-ENZ». Η μελέτη περισσοτέρων μεταβλητών για την αριστοποίηση των συνθηκών της ενζυμικής τροποποίησης συνθετικών υφασμάτων βρίσκεται σε εξέλιξη. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μελέτη χρηματοδοτήθηκε από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας (ΓΓΕΤ) Ελλάδα-ΕΣΠΑ 2007-2013 (πρόγραμμα TEXT-ENZ, 09ΣΥΝ-81-601). Επίσης ευχαριστούμε την εταιρεία Novo Nordisk-A/S για την γενναιόδωρη δωρεά των εμπορικών της ενζύμων Lipolase και Alcalase. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] C.D. Papaspyrides, S Pavlidou, S.N. Vouyiouka, Journal of Materials: Design and Applications 223 (2): 91-102 (2009) [2] Α. O Neill, Α. Cavaco-Paulo, Biocatalysis and Biotransformation 22 (5/6): 353-356 ( 2004) [3] C.M. Silva, F. Carneiro, A. O Neill, L.P. Fonseca, J.S.M. Cabral, G. Guebitz, A. Cavaco-Paulo, Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry 43: 2448-2450 (2005) [4] T. Matama, F. Vaz, G.M. Gubitz, A. Cavaco-Paulo, Biotechnology Journal 1 (7/8): 842-849 (2006) [5] R. Araujo, C. Silva, A. O Neill, N. Micaelo, G. Guebitz, C.M. Soares, M. Casal, A. Cavaco-Paulo, Journal of Biotechnology 128: 849-857 (2007) [6] S. Heumann, A. Eberl, H. Pobeheim,S. Liebminger, G. Fischer-Colbrie, E. Almansa, A. Cavaco- Paulo, G.M. Guebitz, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 39: 89-99 (2006) [7] G.M. Guebitz, A. Cavaco-Paulo, Trends in Biotechnology 26 (1): 32-38 (2008) [8] A. O Neill, A. Cavaco-Paulo, Biocatalysis and Biotransformation 22 (5/6): 353-356 (2004) [9] C. Silva, Α. Cavaco-Paulo, Biocatalysis and Biotransformation 22 (5/6): 357-360 (2004) [10] A. de Marco, Microbial Cell Factories 8:26 (2009) [11] K. Arnold, L. Bordoli, J. Kopp, T. Schwede, Bioinformatics 22: 195-201 (2006)