ΣΗΡΚΑ ΣΔΦΑΝΟ ΑΔΜ:12001

ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΣΜΖΜΑ ΦΤΗΚΖ ΣΟΜΔΑ ΦΤΗΚΖ ΣΔΡΔΑ ΚΑΣΑΣΑΖ ΠΣΤΥΗΑΚΖ ΔΡΓΑΗΑ ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΔΛΔΓΥΟ ΚΑΗ ΚΡΤΣΑΛΛΧΖ ΠΡΧΣΔΗΝΧΝ ΣΗΡΚΑ ΣΔΦΑΝΟ ΑΔΜ:12001 ΔΠΗΒΛΔΠΧΝ ΚΑΘΖΓΖΣΖ: ΚΧΝΣΑΝΣΗΝΟ ΚΑΒΟΤΝΖ ΑΝΑΠΛΖΡΧΣΖ ΚΑΘΖΓΖΣΖ ΣΜΖΜΑΣΟ ΦΤΗΚΖ ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΗΟΤΝΗΟ 2011 1

ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΣΜΖΜΑ ΦΤΗΚΖ ΣΟΜΔΑ ΦΤΗΚΖ ΣΔΡΔΑ ΚΑΣΑΣΑΖ ΠΣΤΥΗΑΚΖ ΔΡΓΑΗΑ ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΔΛΔΓΥΟ ΚΑΗ ΚΡΤΣΑΛΛΧΖ ΠΡΧΣΔΗΝΧΝ ΣΗΡΚΑ ΣΔΦΑΝΟ ΑΔΜ:12001 ΔΠΗΒΛΔΠΧΝ ΚΑΘΖΓΖΣΖ: ΚΧΝΣΑΝΣΗΝΟ ΚΑΒΟΤΝΖ ΑΝΑΠΛΖΡΧΣΖ ΚΑΘΖΓΖΣΖ ΣΜΖΜΑΣΟ ΦΤΗΚΖ ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΗΟΤΝΗΟ 2011 2

ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ ΔΛΗΓΑ ΠΔΡΗΛΖΦΖ...6 ABSTRACT...8 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 1 ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΠΡΧΣΔΗΝΧΝ....10 1.1 Κξηηήξηα θαζαξηζκνχ θαη απνκφλσζεο ησλ πξσηετλψλ...10 1.2 Δθινγή κεζφδνπ πξνζδηνξηζκνχ ηεο δξάζεο ησλ ελδχκσλ....11 1.3 Πεγή ελδχκνπ.....12 1.4.1 Δθρχιηζε ησλ πξσηετλψλ....13 1.4.2 Φπζηθέοκέζνδνη.....14 Α. Πάγσκα Ξεπάγσκα....14 Β.Λπνηξίβεζε.....14 Γ.Τγξή ξήμε θπηηάξσλ......14 Γ.Απνκάθξπλζε ησλ λνπθιετληθψλ νμέσλ...... 14 1.4.3 Υεκηθέο κέζνδνη.....15 Α. Γηαιπηνπνίεζε κε δηαιχκαηα ρακειήο ηνληθήο ηζρχνο...15 Β. Γηαιπηνπνίεζε κε ππθλά δηαιχκαηα αιάησλ θαη νπξίαο...15 Γ. Γηαιπηνπνίεζε κε άιθαιη θαη ρειηθνχο παξάγνληεο....15 Γ. Γηαιπηνπνίεζε κε νξγαληθνχο δηαιχηεο......15 Δ. Γηαιπηνπνίεζε κε απνξξππαληηθά......15 η.γηαιπηνπνίεζε κε ρεκηθή ηξνπνπνίεζε ηεο δνκήο.....16 Ε. Λπζνδχκε......16 1.4.4 Δλδπκηθέο κέζνδνη.... 17 1.5 Μέζνδνη θαζαξηζκνχ ησλ ελδχκσλ...17 1.6.1 Φπγνθέληξεζε.....18 1.6.2 Κιαζκαηηθή θαζίδεζε.....19 Α) Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε άιαηα 19 Β) Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε νξγαληθνχο δηαιχηεο. 20 Γ) Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε κεηαβνιή ηνπ ph...21 Γ) Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε ζέξκαλζε...21 1.7 Πξνζξφθεζε 22 3

1.8 Γηήζεζε κε κεκβξάλεο...22 1.9.1 Υξσκαηνγξαθία ζηήιεο...22 Α. Υξσκαηνγξαθία ηνληθήο αληαιιαγήο.....23 Β. Υξσκαηνγξαθία πξνζξφθεζεο...24 Γ. Υξσκαηνγξαθία κνξηαθήο δηήζεζεο....24 Γ. Υξσκαηνγξαθία αγρηζηείαο..24 1.9.2 Υξσκαηνγξαθία ηνληθήο αληαιιαγήο...25 1.9.3 Τδξφθνβε Υξσκαηνγξαθία. 28 1.9.4 Τγξή Υξσκαηνγξαθία Τςειήο Πίεζεο (HPLC). 29 1.9.5 Υξσκαηνγξαθία Αλάζηξνθεο Φάζεο..30 1.9.6 Υξσκαηνγξαθία Αγρηζηείαο. 30 1.9.7 Αλνζνπξνζξνθεηέο θαη Πξσηεΐλε A/G...31 1.9.8 Υξσκαηνγξαθία Μνξηαθήο Γηήζεζεο.....31 1.10 Καζαξηζκφο αλαζπλδπαζκέλσλ πξσηετλψλ....34 1.11.1 Ζιεθηξνθφξεζε......36 1.11.2 Με ζπλερήο ειεθηξνθφξεζε......37 Πξνζδηνξηζκφο ελδπκηθήο δξάζεο κεηά ηελ ειεθηξνθφξεζε 39 Ζιεθηξνθφξεζε θάησ απφ κεηνπζησηηθέο ζπλζήθεο- Ζιεθηξνθφξεζε κε SDS...39 Ηζνειεθηξηθή εζηίαζε πξσηετλψλ 40 1.12 Πξσηφθνιιν θαζαξηζκνχ. 42 ΚΔΦΑΛΑΗΟ 2 ΚΡΤΣΑΛΛΧΖ ΠΡΧΣΔΗΝΧΝ...43 2.1 Ζ γεληθή ζηξαηεγηθή θξπζηάιισζεο..44 2.1.1 Δπηινγή ζηφρνπ θαη δηακνξθψζεηο.44 2.1.2 Πξνεηνηκαζία ζηφρσλ.45 2.1.3 Έιεγρνο...47 2.1.4 Βειηηζηνπνίεζε.. 50 2.2 Ζ δηαδηθαζία ηεο θξπζηάιισζεο...54 2.3.1 Κξπζηάιισζε ζπκπιφθσλ πξσηετλψλ..59 2.3.2 χκπινθα πξσηετλψλ DNA.....60 2.4.1 Κξπζηάιισζε κεκβξαληθψλ πξσηετλψλ 61 2.4.2 Γείγκαηα κε κηθξή ζπγθέληξσζε πξσηεΐλεο...63 4

2.4.3 High-throughput θξπζηάιισζε: ζκίθξπλζε δεηγκάησλ θαη απηνκαηνπνίεζε.....64 2.4.4 Ζ κέζνδνο bicelle..64 2.5.1 Κξπζηαιινγξαθία.65 2.5.2 Απνκφλσζε ελδηάκεζσλ δνκψλ ησλ αληηδξάζεσλ κε ςχμε, ζπκπεξηιακβαλνκέλνπ δηαιπηνπνηεκέλσλ αέξησλ ππνζηξσκάησλ....66 2.5.3 Απνκφλσζε κε ςχμε γηα ηε κειέηε ησλ ελδηάκεζσλ ζηε δέζκεπζε ππνζηξψκαηνο..67 2.6 Παξαγσγή πξσηετλψλ ζην κηθξννξγαληζκφ Escherichia coli γηα δνκηθέο κειέηεο κε θξπζηαιινγξαθία αθηηλψλ Υ...68 2.7 Kξπζηάιισζε...69 ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ....70 5

ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΧΝ ΔΠΗΣΖΜΧΝ ΣΜΖΜΑ ΦΤΗΚΖ ΣΗΡΚΑ ΣΔΦΑΝΟ Α.Δ.Μ:12001 ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΔΛΔΓΥΟ ΚΑΗ ΚΡΤΣΑΛΛΧΖ ΠΡΧΣΔΗΝΧΝ ΠΔΡΗΛΖΦΖ ηελ παξνχζα πηπρηαθή εξγαζία κειεηάηαη, ν θαζαξηζκφο θαη ε απνκφλσζε πξσηετλψλ θαη ελδχκσλ. Αλαθέξεηαη ε γεληθή ζηξαηεγηθή πνπ αθνινπζείηαη, αξρηθά, γηα ην ζρεδηαζκφ ηεο δηαδηθαζίαο θαζαξηζκνχ θαη ηα θξηηήξηα πνπ ειέγρνληαη πξηλ ηνλ θαζαξηζκφ ηνπ ελδχκνπ. Παξαηίζεληαη κέζνδνη εθρχιηζεο ησλ πξσηετλψλ απφ ηηο δηάθνξεο πεγέο έθθξαζεο ηνπο. Αλαιχνληαη νη θαηεγνξίεο κεζφδσλ θαζαξηζκνχ θαη απνκφλσζεο ησλ πξσηετλψλ, φπσο νη κέζνδνη θιαζκαηηθήο θαζίδεζεο κε δηάθνξνπο ηξφπνπο, ε κέζνδνο πξνζξφθεζεο, δηήζεζεο θαη ε πεξηζζφηεξν ρξεζηκνπνηνχκελε κέζνδνο ρξσκαηνγξαθίαο ζηήιεο. Παξνπζηάδνληαη νη βαζηθέο αξρέο ηεο ειεθηξνθφξεζεο, κηαο κεζφδνπ δηαρσξηζκνχ θαη ηαπηνπνίεζεο φισο ησλ βηνινγηθψλ κνξίσλ ην δεχηεξν κέξνο ηεο εξγαζίαο κειεηάηαη, ε θξπζηάιισζε ησλ πξσηετλψλ. Αλαιχεηαη αξρηθά ε γεληθή ζηξαηεγηθή πνπ αθνινπζείηαη θαη ζπκπεξηιακβάλεη ηελ επηινγή ηεο πξσηεΐλεο ζηφρνπ θαη ησλ δηακνξθψζεσλ ηνπ, ηελ πξνεηνηκαζία ηνπ, ηε δηαδηθαζία θξπζηάιισζεο θαη ηνλ έιεγρν γηα ηε βειηηζηνπνίεζε ησλ ζπλζεθψλ θαη κεηαβιεηψλ θαη θαη επέθηαζε ησλ θξπζηάιισλ πνπ ζρεκαηίδνληαη. Αλαιχνληαη νη βαζηθέο κέζνδνη θξπζηάιισζε πνπ αθνινπζνχληαη ζηηο πεξηζζφηεξεο πεξηπηψζεηο. Παξαηίζεληαη νη βαζηθέο αξρέο γηα ηελ θξπζηάιισζε νξηζκέλσλ νκάδσλ πξσηετλψλ, φπσο νη κεκβξαληθέο πξσηεΐλεο. Αλαθέξεηαη, επίζεο, ε ζηξαηεγηθή παξαγσγήο θαη θξπζηάιισζεο πξσηετλψλ ζην βαθηήξην Escherichia coli. Ζ δνκηθή βηνινγία βξίζθεη ηδηαίηεξε εθαξκνγή ηα ηειεπηαία ρξφληα, φρη κφλν σο έλα ελδηάκεζν ζηάδην ζε πξνγξάκκαηα ζχλζεζεο θαη κειέηεο θαξκάθσλ, αιιά θαη θαηά ηε δηάξθεηα παλεπηζηεκηαθψλ πξνγξακκάησλ, θαζψο θαη δνκηθψλ. Οη κειέηεο ηνπ γελψκαηνο έρνπλ αλαθαιχςεη πνιιά λέα γνλίδηα πνπ πηζηεχεηαη φηη ζπκκεηέρνπλ ζε πνιιέο βαζηθέο βηνρεκηθέο θαη βηνινγηθέο δηαδηθαζίεο ζην θχηηαξν, φπσο επίζεο ζπκκεηέρνπλ θαη ζε νξηζκέλεο δηαδηθαζίεο αζζελεηψλ. 6

Χζηφζν, δελ είλαη ηα γνλίδηα απηά πνπ ζπκκεηέρνπλ ζηηο παξαπάλσ δηαδηθαζίεο, αιιά νη πξσηεΐλεο πνπ θσδηθνπνηνχληαη απφ ηα γνλίδηα. Πνιιέο πξνζεγγίζεηο γίλνληαη σο πξνο ηε κειέηε ηεο ιεηηνπξγίαο ησλ δηάθνξσλ πξσηετλψλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ ζπζηεκάησλ αλελεξγνπνίεζεο γνληδίσλ, κνληέισλ ππεξέθθξαζεο πξσηετλψλ θαη ζπζηήκαηα δχν πβξηδίσλ δηαγνληδηαθψλ δψσλ θαη δχκεο. Απφ ηε ζηηγκή πνπ ε ιεηηνπξγία ηεο πξσηεΐλεο ζρεηίδεηαη κε ηελ ηξηζδηάζηαηε δνκή ηεο, είλαη απαξαίηεηε ε αλάιπζε ηεο αθξηβνχο ηξηζδηάζηαηεο, αηνκηθήο δηαθξηηηθήο ηθαλφηεηαο δνκήο ηνπ πξσηετληθνχ πξντφληνο θάζε γνληδίνπ. εκαληηθή πξφνδνο έρεη επηηεπρζεί ζηε βηνπιεξνθνξηθή, ζηελ έθθξαζε θαη θαζαξηζκφ ή απνκφλσζε πξσηετλψλ, ζηελ θξπζηάιισζε θαη ηελ θξπζηαιινγξαθία αθηηλψλ Υ, γεγνλφο πνπ έρεη νδεγήζεη ζε ζεκαληηθά ζπκπεξάζκαηα ζρεηηθά κε ηνλ ζπλδπαζκφ δηάθνξσλ βηνρεκηθψλ δηαδηθαζηψλ ζην ρεκηθφ επίπεδν θαη ηελ θαηαλφεζε ηεο ζπκβνιήο ηεο δνκήο θπηηαξηθψλ ζπζηαηηθψλ ζηηο αληίζηνηρεο βηνρεκηθέο θαη βηνινγηθέο ιεηηνπξγίεο ηνπο. 7

ARISTOTELES UNIVERSITY THESSALONIKI SCHOOL OF SCIENCE PHYSICS DEPARTMENT TIRKAS STEFANOS Α.Δ.Μ:12001 PURIFICATION CONTROL AND CRYSTALLIZATION OF PROTEINS ABSTRACT In the present diploma thesis is studied the cleaning and the isolation of the proteins and the enzymes. It is referred the general strategy being followed, at the first stages, for the planning of the cleaning process and the criteria that must be controlled before the cleaning of the enzyme. There are presented the methods for the protein extraction, based on their various expressions. There are analyzed the categories for the cleaning methods and the protein isolation, for example the methods for the fractional precipitation in a variety of ways, the method of adsorption, filtration and the most used method of the chromatography column. There are presented the basic principles of electrophoresis, a method for the separation and identification of the biological molecules. In the second part of the diploma thesis is studied the crystallization of proteins. Initially,there is a presentation of an analysis over the general strategies implemented, which includes the selection of the protein, the process of crystallization and the control over the optimization of the conditions and the variables and, as a result, the crystals are being formed. There are also analyzed the basic methods of crystallization followed in the majority of situations. There are presented the principles applied for the crystallization of certain groups of proteins, like the membrane proteins. There is also a reference at the strategy of production and crystallization of the proteins in the bacterium Escherichia coli During the last years, structural biology is highly implemented, not only as an intermediate stage in programs for the composition and study of medicine, but also the duration of university programs, as well as the tests being done. Studies over the subject of genome have revealed a number of new genes, which are believed to participate in basic biochemical and biological processes in the cell, but also in the progress of certain diseases. However, it is not for the genes that participate in the 8

above processes, but the proteins themselves that are codified by the genes. There are many approaches as far as the study of the operation of the various proteins are concerned, including the systems that set the genes inactive, the models of overexpression of the proteins and the systems of two hybrid transgenic animals and yeast. From the very moment the operation of the protein is related to its threedimensional structure, it is necessary to analyze the exact three-dimensional atomic resolution capability of the structure of the protein for every gene. Special progress has been made in the field of biocomputing in the expression and the cleaning or isolation of proteins, in the crystallization and the crystallography of X-rays, which has led to vital conclusions over the combination of various biochemical processes in a chemical level and the understanding of the role of the cell structures in their following biochemical and biological functions. 9

1 ΚΑΘΑΡΗΜΟ ΠΡΧΣΔΗΝΧΝ 1. 1 Κξηηήξηα Καζαξηζκνύ θαη Απνκόλσζεο ησλ πξσηετλώλ Με ηνλ φξν «θαζαξηζκό» ελλνείηαη ν εκπινπηηζκφο ηνπ παξαζθεπάζκαηνο σο πξνο κηα ζπγθεθξηκέλε πξσηεΐλε, κε ηνλ φξν δε «απνκόλσζε» ελλνείηαη ν θαζαξηζκφο κηαο πξσηεΐλεο κέρξη ην ζεκείν πνπ ζην παξαζθεχαζκα ππάξρεη απηή ε πξσηεΐλε κφλν. Πξνθεηκέλνπ λα θαζαξηζηεί κηα πξσηεΐλε ή έλα έλδπκν, απαηηείηαη ε θαηάιιειε ζηξαηεγηθή, ε νπνία θαζνξίδεηαη κε βάζε ηα επφκελα θξηηήξηα. Πνηα είλαη ε θαιύηεξε πεγή: Τπάξρνπλ θάπνηεο παξάκεηξνη πνπ ιακβάλνληαη ππ φςηλ πξνθεηκέλνπ λα γίλεη ε επηινγή ηεο πην θαηάιιειεο πεγήο γηα ηελ απνκφλσζε ηεο πξσηεΐλεο απφ ην θπζηθφ πεξηβάιινλ. Σψξα πηα, έρνπλ αλαπηπρζεί κέζνδνη γελεηηθήο κεραληθήο κε ηηο νπνίεο θισλνπνηείηαη ην γνλίδην ηεο πξσηεΐλεο ζε έλα κηθξννξγαληζκφ (βαθηήξην ή δχκε), κε απνηέιεζκα λα παξάγεηαη ζε κεγάια ζπγθξηηηθά πνζά ζηηο θαιιηέξγεηεο ησλ κηθξννξγαληζκψλ, απφ ηηο νπνίεο απνκνλψλεηαη είηε κε ηηο ίδηεο κεζφδνπο θαζαξηζκνχ πξσηετλψλ απφ ηηο θπζηθέο πεγέο, είηε κε εηδηθέο κεζφδνπο γηα ηνλ θαζαξηζκφ αλαζπλδπαζκέλσλ πξσηετλψλ. Ση είλαη γλσζηό γηα ηελ πξσηεΐλε: Αλ κηα πξσηεΐλε ή έλδπκν έρεη πξνεγνπκέλσο θαζαξηζηεί απφ άιιε πεγή, ιακβάλνληαη πνιιέο πιεξνθνξίεο γηα ηηο ηδηφηεηεο ηεο νπνίεο κπνξνχλ λα εθαξκνζζνχλ ζην λέν θαζαξηζκφ, φπσο ην κέγεζνο ηεο, ε εληφπηζε ηεο κέζα ζην θχηηαξν, ην ηζνειεθηξηθφ ηεο ζεκείν (pl), ε πδξνθνβηθφηεηα, νη κεηακεηαθξαζηηθέο ηξνπνπνηήζεηο θιπ. Βαζκόο επηζπκεηνύ θαζαξηζκνύ ηνπ παξαζθεπάζκαηνο: Ζ έθηαζε θαζαξηζκνχ ζπλήζσο εμαξηάηαη απφ ηελ ηειηθή ρξήζε ηεο πξσηεΐλεο. Αλ πξφθεηηαη λα ρξεζηκνπνηεζεί γηα εξεπλεηηθνχο ζθνπνχο, πξέπεη ην παξαζθεχαζκα ζπλήζσο λα πεξηέρεη απνθιεηζηηθά ηελ πξσηεΐλε ηνπ ελδηαθέξνληνο θαη λα ιείπνπλ απφ ην παξαζθεχαζκα ζπγγελείο ελδπκηθέο δξάζεηο ή ηπρφλ παξάγνληεο πνπ επεξεάδνπλ ηε δξάζε ηεο πξσηεΐλεο. Αληίζεηα, αλ έλα έλδπκν θαη γεληθφηεξα κηα πξσηεΐλε, πξφθεηηαη λα ρξεζηκνπνηεζεί ζηε βηνκεραλία ν κεξηθφο θαζαξηζκφο είλαη επαξθήο θαη δελ ρξεηάδεηαη θαηαλάισζε επηπξφζζεηεο εξγαζίαο θαη πιηθψλ γηα ηνλ πιήξε θαζαξηζκφ ηεο 10

Πόζε από ηελ θαζαξηζκέλε πξσηεΐλε απαηηείηαη: Γηα κειέηεο δξαζηηθφηεηαο θαη γεληθά θαηαιπηηθψλ παξακέηξσλ απαηηνχληαη ζρεηηθά κηθξέο πνζφηεηεο ηνπ δξαζηηθνχ ελδχκνπ, ελψ γηα δνκηθέο κειέηεο ρξεηάδνληαη κεγαιχηεξεο πνζφηεηεο πνιχ θαζαξήο πξσηεΐλεο. Πόζν πξέπεη λα δηαξθεί ε δηαδηθαζία θαζαξηζκνύ: Ζ δηαδηθαζία θαζαξηζκνχ πξέπεη λα είλαη θαηά ην δπλαηφ ηαρεία, ψζηε λα ειαρηζηνπνηεζνχλ νη απψιεηεο δξαζηηθφηεηαο, ε απνηθνδφκεζε ηεο πξσηεΐλεο θηι πνπ νθείινληαη θπξίσο ζηε δξάζε ησλ πξσηενιπηηθψλ ελδχκσλ πνπ βξίζθνληαη ζρεδφλ παληνχ θαη ζηε ζηαδηαθή κεηνπζίσζε ησλ πξσηετλψλ ζε δηάιπκα ηδηαίηεξα ζε απμεκέλεο ζεξκνθξαζίεο. Πξνθεηκέλνπ λα κεγηζηνπνηεζεί ε απφδνζε ηνπ ηειηθνχ παξαζθεπάζκαηνο, πξέπεη λα ειαρηζηνπνηεζεί ν αξηζκφο ησλ ζηαδίσλ, κηα θαη ζε θάζε ζηάδην πάληα ράλεηαη θάπνην πνζνζηφ δξαζηηθήο πξσηεΐλεο. Πνην είλαη ην θόζηνο: Σν θφζηνο θαη ν ρξφλνο είλαη πνιχ ζεκαληηθά γηα ηηο πξσηεΐλεο εκπνξηθήο ρξήζεο. Μνινλφηη είλαη δπλαηφ λα κειεηεζνχλ κεξηθέο ηδηφηεηεο κηαο πξσηεΐλεο, πξηλ απνκνλσζεί ζε θαζαξή θαηάζηαζε, γηα νξηζκέλεο πεξηπηψζεηο, απαηηείηαη απνκφλσζε ή ηνπιάρηζηνλ θαζαξηζκφο κεγάιεο έθηαζεο. Ο ηέιεηνο θαζαξηζκφο, βέβαηα, είλαη απαξαίηεηνο ζηελ πεξίπησζε ηεο κειέηεο ηεο δνκήο ηεο πξσηεΐλεο. Γηα ηε κειέηε ησλ θαηαιπηηθψλ ηδηνηήησλ, είλαη επαξθήο ε απνκάθξπλζεο θάπνησλ ελδχκσλ κε παξφκνηα δξάζε θαη εμεηδίθεπζε, επαηζζεζίεο ζε αλαζηνιείο θιπ. πνπ θαη πάιη φκσο απαηηεί εθηεηακέλν θαζαξηζκφ. 1.2 Δθινγή κεζόδνπ πξνζδηνξηζκνύ ηεο δξάζεο ησλ ελδύκσλ Πξνθεηκέλνπ λα θαζαξηζζεί έλα έλδπκν, είλαη απαξαίηεην λα είλαη γλσζηή ε απφδνζε θάζε ζηαδίνπ θαζαξηζκνχ θαη ν βαζκφο εκπινπηηζκνχ ή θαζαξηζκνχ θάζε ζηαδίνπ, σο πξνο ην έλδπκν. Καη ζηηο δχν πεξηπηψζεηο πξνζδηνξίδνληαη νη κνλάδεο ελδπκηθήο δξάζεο πνπ πεξηέρεη θάζε θνξά ην παξαζθεχαζκα. Γηα ην ζθνπφ απηφ επηιέγεηαη κηα κέζνδνο πξνζδηνξηζκνχ πνπ ηθαλνπνηεί φζν είλαη δπλαηφ ηα παξαθάησ θξηηήξηα: 1. Να είλαη εηδηθή γηα ηελ αληίδξαζε πνπ θαηαιχεη ην έλδπκν. 2. Να εθηειείηαη γξήγνξα. Σν πξψην θξηηήξην εμεηδίθεπζεο είλαη απαξαίηεην, θαζψο ζηελ πεξίπησζε πνπ ε κέζνδνο κπνξεί λα παξαθνινπζεί δχν αληηδξάζεηο, έζησ ηελ Α θαη ηε Β, θαη ην έλδπκν ηνπ ελδηαθέξνληνο θαηαιχεη ηελ αληίδξαζε Α, είλαη δπλαηφ ζε θάπνην 11

ζηάδην λα ραζεί ην επηζπκεηφ έλδπκν θαη λα αθνινπζήζεη ε παξαθνινχζεζε ηνπ ελδχκνπ πνπ θαηαιχεη ηελ αληίδξαζε Β. Αλαθνξηθά κε ηελ ηαρχηεηα ηεο κεζφδνπ πξέπεη λα ζεκεησζεί φηη πξνθεηκέλνπ λα κε ζπαηαιείηαη πνιχο ρξφλνο εθαξκφδνληαο κηα πνιχ αθξηβή κέζνδν, είλαη δπλαηφ αιιά κφλν γηα ην ζθνπφ θαζαξηζκνχ ηνπ ελδχκνπ, λα επηιεγεί κηα γξήγνξε αιιά φρη θαη ηφζν αθξηβήο κέζνδνο πξνζδηνξηζκνχ. Ζ κέηξεζε ηνπ πνζνχ ηεο πξσηεΐλεο θαηά ηα δηάθνξα ζηάδηα θαζαξηζκνχ κπνξεί λα πξαγκαηνπνηεζεί κε κηα απφ ηηο αθφινπζεο κεζφδνπο: 1. Biuret alkaline copper regent (Itzhaki and Gill,1964) 2. Lowry- Folin- Ciocalteau reagent (Lowry 1951) 3. UV απνξξφθεζε ζηα 280nm (αξσκαηηθφο δεζκφο) ή 205-220nm (πεπηηθφο δεζκφο) (Goldfarb 1951) 4. Γέζκεπζε ρξσζηηθήο Μέζνδνο Bradford, 1976) 5. Αληηδξαζηήξην BCA (Smith 1986) Οη πεξηζζφηεξν ρξεζηκνπνηνχκελεο κέζνδνη είλαη ε απνξξφθεζε ζηα 280nm θαη ε κέζνδνο Bradford. 1.3 Πεγή ελδύκνπ Όηαλ πξφθεηηαη λα κειεηεζεί έλα έλδπκν πνπ βξίζθεηαη ζε έλα ζπγθεθξηκέλν ηζηφ, π.ρ. ε αιθαιηθή θσζθαηάζε ηνπ ήπαηνο πνληηθνχ δελ ππάξρεη δπλαηφηεηα επηινγήο ηεο πεγήο. Όηαλ φκσο, κηα νπνηαδήπνηε θσζθαηάζε, είλαη ην αληηθείκελν κειέηεο, ηφηε ππάξρεη δπλαηφηεηα επηινγήο. ηηο πεξηζζφηεξεο πεξηπηψζεηο ηζρχνπλ ηα εμήο θξηηήξηα: Σν δηαζέζηκν ηεο πεγήο ηελ πεξίπησζε ηεο θσζθαηάζεο π.ρ. δελ ρξεηάδεηαη λα επηιεγεί ην ήπαξ πνληηθψλ, κηα θαη ζα ρξεηαζηνχλ εθαηφκβεο απφ ηα πεηξακαηφδσα απηά, πξνθεηκέλνπ, λα ζπιιερζνχλ κεξηθέο εθαηνληάδεο γξακκαξίσλ πξψηεο χιεο. Δίλαη δπλαηή θαη εμίζνπ απνδνηηθή ε πξνκήζεηα βνδηλνχ ήπαηνο απφ ηα ζθαγεία, πνπ δπγίδεη νξηζκέλα θηιά ή ε αλάπηπμε θαιιηεξγεηψλ βαθηεξίσλ Δ. coli ζε πνζφηεηεο ηεο ηάμεο ησλ ιίηξσλ. Ζ πεγή πξέπεη λα είλαη δηαζέζηκε ζε φιε ηε δηάξθεηα ηνπ ρξφλνπ, γηα λα κε ρξεηαζζεί λα ζηακαηήζνπλ νη κειέηεο, φπσο αλ επηιεγεί κηα επνρηαθή πεγή. Σελ πεξηεθηηθόηεηα ηεο πεγήο ζε έλδπκν. Πξνηηκάηαη κηα πεγή πνπ ε εηδηθή δξαζηηθφηεηα ηνπ ελδχκνπ πνπ κειεηάηαη είλαη φζν ην δπλαηφ κεγαιχηεξε. Δπίζεο, ζηελ πεξίπησζε πνπ επηιέγνληαη δψα, πξέπεη λα είλαη επαλαιήςηκε ε πνζφηεηα ηεο πξσηεΐλεο θαη δελ θπκαίλεηαη ζε κεγάια φξηα. 12

Σε γελεηηθή νκνηνγέλεηα ηεο πεγήο Πξέπεη λα ρξεζηκνπνηείηαη πάληα ην ίδην θπηηθφ ή δσηθφ είδνο ή ην ίδην κηθξνβηαθφ ή ητθφ ζηέιερνο, γηα ηελ ίδηα κειεηνχκελε πξσηεΐλε. Ο ιφγνο είλαη φηη κηθξέο δηαθνξέο ζηε δνκή ηνπ ελδχκνπ πνπ έρνπλ γελεηηθή πξνέιεπζε, κπνξεί λα νδεγήζνπλ ζε απνηπρία ελφο ή πεξηζζφηεξσλ ζηαδίσλ θαζαξηζκνχ. Σελ ππνθπηηαξηθή εληόπηζε ησλ πξσηετλώλ Δίλαη δπλαηφ λα απνθεπρζνχλ αξθεηά ζηάδηα θαζαξηζκνχ, αλ ε πξσηεΐλε πνπ κειεηάηαη είλαη εληνπηζκέλε ζε θάπνην ππνθπηηαξηθφ κφξθσκα (ππξήλα, κηηνρφλδξηα, ιπζζνζσκάηηα, κηθξνζσκάηηα, θπηηαξφπιαζκα.) Κη απηφ γηαηί είλαη δπλαηφ λα θιαζκαησζεί ν ηζηφο ζηα ππνθπηηαξηθά ηνπ ζηνηρεία θαη λα ρξεζηκνπνηεζεί κφλν ην θιάζκα πνπ πεξηέρεη ηελ πεγή. 1.4.1 Δθρύιηζε ησλ πξσηετλώλ Ζ εθρχιηζε θαη ν παξαπέξα θαζαξηζκφο ησλ πξσηετλψλ πξαγκαηνπνηείηαη ζηνπο 0-4 ν C, θαζψο ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ ππάξρεη θίλδπλνο λα αλαπηπρζνχλ κηθξννξγαληζκνί ζην παξαζθεχαζκα, φπσο επίζεο νη πξσηεΐλεο είλαη πην ζηαζεξέο ζε ρακειέο ζεξκνθξαζίεο. Όηαλ ε πξσηεΐλε πνπ κειεηάηαη βξίζθεηαη ζε θάπνην βηνινγηθφ πγξφ, φπσο αίκα, γαζηξηθφ πγξφ θηι, δελ ππάξρεη ζέκα εθρχιηζεο ηεο. ηηο πεξηζζφηεξεο φκσο πεξηπηψζεηο πξφθεηηαη γηα ελδνθπηηάξηεο πξσηεΐλεο θαη έλδπκα επθαξπσηηθψλ ή πξνθαξπσηηθψλ νξγαληζκψλ. Σν πξψην πξφβιεκα πνπ εκθαλίδεηαη είλαη ε ιχζε ηνπ πεξηβιήκαηνο ησλ θπηηάξσλ είηε απηά είλαη κεκβξάλεο είηε ηνηρψκαηα. Γηα ηνπο ζπλεζηζκέλνπο δσηθνχο ηζηνχο νκνγελνπνίεζε γηα έλα έσο ηξία ιεπηά ζε εηδηθνχο πνιχζηξνθνπο νκνγελνπνηεηέο, είλαη ζπλήζσο αξθεηή λα ζπάζεη ηηο κεκβξάλεο. Γηα πην αλζεθηηθνχο ηζηνχο θαη εηδηθά γηα απηνχο πνπ ηα θχηηαξα πεξηβάιινληαη απφ ηνηρψκαηα (θπηά, κηθξννξγαληζκνχο θιπ) κηα ηέηνηα νκνγελνπνίεζε δελ είλαη αξθεηή λα θαηαζηξέςεη ηελ αξρηηεθηνληθή ησλ θπηηάξσλ. ηηο πεξηπηψζεηο απηέο ρξεηάδνληαη πην δξαζηηθέο κέζνδνη, φπσο ε ιπνηξίβεζε κε θαζαξή άκκν, ππέξερνη, πέςε κε εηδηθά έλδπκα θηι. Οη νκνγελνπνηήζεηο γεληθά πξέπεη λα γίλνληαη ζε αξαηά ξπζκηζηηθά δηαιχκαηα ζπγθεθξηκέλνπ ph, γηα λα είλαη επαλαιήςηκε ε εθρχιηζε. Σν ph ηνπ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο είλαη θξίζηκν θαη δελ επηιέγεηαη απζαίξεηα. Σν θαηάιιειν ph θπκαίλεηαη ζπλήζσο γχξσ απφ ην 5, θη απηφ γηαηί ζε ρακειφηεξεο ηηκέο απφ 4, ππάξρεη ν θίλδπλνο λα θαηαζηξαθεί ε δηακφξθσζε ηεο πξσηεΐλεο, παξαηεξείηαη δηαζπνξά ιηπνπξσηετλψλ θαη ζρεκαηηζκφο κεκβξαλσδψλ ζσκαηηδίσλ πνπ δελ θαζηδάλνπλ κε θπγνθέληξεζε, κε απνηέιεζκα λα δίλνπλ ηελ εληχπσζε φηη είλαη δηαιπηά, ελψ ζηελ νπζία δελ είλαη. Σα έλδπκα πνπ δεκηνπξγνχλ πξνβιήκαηα ζηελ εθρχιηζε ηνπο είλαη εθείλα πνπ απνηεινχλ δνκηθφ κέξνο κεκβξαλψλ ή γεληθά είλαη ζηελά ζπλδεδεκέλα κε 13

πεξίπησζε πνπ ε πξσηετλε βξίζθεηαη ζηελ πεξηπιαζκηθή κεκβξάλε ην σζκσηηθφ ζνθ δίλεη 14-20 θνξέο θαιχηεξα απνηειέζκαηα ζε ζρέζε κε ηηο ππφινηπεο κεζφδνπο. 1.4.2 Φπζηθέο κεζόδνη: A) Πάγσκα Ξεπάγσκα: Ζ ηερληθή είλαη παξφκνηα κε εθείλε ηνπ σζκσηηθνχ ζνθ. Ζ δπλαηφηεηα γηα απειεπζέξσζε πξσηετλψλ είλαη πεξηνξηζκέλε θαη ιηγφηεξν απφ 10% ησλ ζπλνιηθψλ πξσηετλψλ απειεπζεξψλνληαη. Αλ θαη ε ηερληθή απηή έρεη ην πιενλέθηεκα φηη είλαη απιή θαη γίλεηαη ζε ρακειή ζεξκνθξαζία δε ρξεζηκνπνηείηαη επξέσο γηαηί απαηηεί πνιχ ρξφλν. Β) Λπνηξίβεζε: Αξρηθά ε κέζνδνο απηή ρξεζηκνπνηήζεθε γηα ην ζπάζηκν θπηηάξσλ ζε γνπδί παξνπζία ζθαηξηδίσλ πάινπ ή αινπκίλαο. ήκεξα γίλνληαη πξνζπάζεηεο λα ρξεζηκνπνηεζνχλ κεγάιεο ζπζθεπέο (κχινη) κε εηδηθά ιηπαληηθά ζσκαηίδηα. Λφγσ ηεο καθξάο παξακνλήο ηνπ εθρπιίζκαηνο ζηε ζπζθεπή θαη ησλ πςειψλ ζεξκνθξαζηψλ πνπ αλαπηχζζνληαη θαηά ηε δηαδηθαζία παξ φιν πνπ ππάξρνπλ εμσηεξηθνί καλδχεο γηα ηε ζπλερή ςχμε ηεο ζπζθεπήο, ε κέζνδνο πξνηηκάηαη κφλν ζε πεξηπηψζεηο λεκαηνεηδψλ θπηηάξσλ ή κηθξννξγαληζκψλ πνιχ αλζεθηηθψλ ζε ζεξκνθξαζίεο. Γ) Τγξή ξήμε θπηηάξσλ: Δίλαη ε κεραληζηηθή κέζνδνο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηε ιχζε κεγάιεο θιίκαθαο θπηηάξσλ. Ζ αξρή ηεο ηερληθήο ζηεξίδεηαη ζηε δηαβίβαζε ηνπ αησξήκαηνο θπηηάξσλ κε κεγάιε πίεζε κέζσ κηθξνχ αλνίγκαηνο. Γ) Απνκάθξπλζε ησλ λνπθιετληθώλ νμέσλ: Σα λνπθιετληθά νμέα απνκαθξχλνληαη κε θαηαθξήκληζε κε δηάθνξεο ζεηηθά θνξηηζκέλεο ελψζεηο, φπσο ε ζεηηθή ζηξεπηνκπθίλε, ζεηηθή πξσηακίλε, πνιπαηζπιελακίλε, πνιπιπζίλε ή MgCl 2. Σειεπηαία, ε κέζνδνο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη πεξηζζφηεξν είλαη ε θαηεξγαζία κε λνπθιεάζεο. Πξνζζήθε παγθξεαηηθήο δενμπξηβνλνπθιεάζεο πξνθαιεί ζεκαληηθή ειάηησζε ηνπ ημψδνπο ηνπ εθρπιίζκαηνο. Όιεο νη δπζθνιίεο κε ηε ιχζε ησλ θπηηάξσλ πνπ πξναλαθέξζεθαλ, δελ ζπλαληψληαη ζηελ πεξίπησζε πνπ ην θχηηαξν εθθξίλεη εθιεθηηθά ηελ επηζπκεηή πξσηεΐλε. Απηφ γίλεηαη αλ ζηελ αθνινπζία ηνπ DNA πνπ θσδηθνπνηεί ηελ 14

επηζπκεηή πξσηεΐλε πξνζηεζεί κηα αθνινπζία ππεχζπλε γηα ηελ έθθξαζε θάπνηνπ νιηγνπεπηηδίνπ νδεγνχ, πνπ έρεη ηε δπλαηφηεηα λα δηαπεξλά ηελ θπηηαξηθή κεκβξάλε θαη λα κεηαθέξεη ηελ πξσηεΐλε ζην πγξφ ηεο θαιιηέξγεηαο. 1.4.3 Υεκηθέο κέζνδνη Α) Γηαιπηνπνίεζε κε δηαιύκαηα ρακειήο ηνληθήο ηζρύνο: Έλαο ζεκαληηθφο αξηζκφο πξσηετλψλ έρεη δηαιπηνπνηεζεί κε δηαπίδπζε ζε απνζηαγκέλν λεξφ. ηηο πεξηπηψζεηο απηέο βνεζά ε ξχζκηζε ηνπ ph ζε ειαθξψο αιθαιηθέο πεξηνρέο κε ιίγε ακκσλία. Β) Γηαιπηνπνίεζε κε ππθλά δηαιύκαηα αιάησλ θαη νπξίαο: Παξαηεξήζεθε φηη πξνθχπηεη κηα ζεηξά Hofmeister, φηαλ αληφληα πνπ απνδηνξγαλψλνπλ ηε δνκή ησλ πξσηετλψλ ή πξνθαινχλ απψιεηα ελδπκηθήο δξάζεο, θαηαηάζζνληαη κε ζεηξά ζρεηηθήο δξάζεο ζηα παξαπάλσ θαηλφκελα. Ζ ζεηξά έρεη σο εμήο: SCN> ClO 4 > NO 3 >I>Br>SO 4 >CH 3 COO Π.ρ κε 2 Μ NaClO 4 κπνξεί λα δηαιπηνπνηεζεί πάλσ απφ ην 27% ησλ πξσηετλψλ ηεο κεκβξάλεο Bacillus subtilis. Τςειέο ζπγθεληξψζεηο ρισξηνχρνπ γνπαληδίνπ είλαη επίζεο, ηθαλέο λα δηαιπηνπνηήζνπλ νξηζκέλεο πξσηεΐλεο. Ζ νπξία ζε ζπγθέληξσζε 6 Μ θαη πάλσ πξνθαιεί δηαιπηνπνίεζε πνιιψλ πξσηετλψλ. Όιεο νη παξαπάλσ νπζίεο πνπ ζε κεγάιεο ζπγθεληξψζεηο πξνθαινχλ δηαιπηνπνίεζε, απνδηνξγαλψλνπλ ηε δνκή ηνπο. Πξέπεη λα είλαη ζίγνπξν φηη ε πξσηεΐλε πξνο δηαιπηνπνίεζε απνθηά μαλά απηφκαηα ηε θπζηθή ηεο δηακφξθσζε κεηά ηελ αθαίξεζε ηνπ άιαηνο, ηεο νπξίαο θηι. Γ) Γηαιπηνπνίεζε κε άιθαιη θαη ρειηθνύο παξάγνληεο: Μηα παξάκεηξν πνπ ζπκβάιεη ζηε ζηαζεξνπνίεζε ηεο δνκήο ησλ κεκβξαλψλ είλαη νη ηνληθέο αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ ζπζηαηηθψλ ησλ κεκβξαλψλ θαη ηδηαίηεξα ησλ πξσηετλψλ, ησλ ιηπνεηδψλ θαη ησλ κεηαιιηθψλ ηφλησλ. Ζ εμνπδεηέξσζε θνξηηζκέλσλ νκάδσλ ζηηο κεκβξάλεο έρεη σο απνηέιεζκα ηελ αλάπηπμε απσζεηηθψλ δπλάκεσλ, πνπ πξνθαλψο είλαη θαη ππεχζπλεο γηα ηελ θαηάξξεπζε ηεο δνκήο ησλ κεκβξαλψλ θαη ηε δηαιπηνπνίεζε ησλ πξσηετλψλ πνπ ηελ απνηεινχλ. Με αλάινγν ηξφπν θαηά ηελ επεμεξγαζία ηνπ θπηηαξηθνχ παξαζθεπάζκαηνο κε ρειηθφ παξάγνληα, γηα ηε δέζκεπζε ησλ δηζζελψλ θαηηφλησλ, φπσο ην Ca 2+ θαη ην Mg 2+, επηηπγράλνληαη δηαιπηνπνηήζεηο εθεί πνπ απιά πδαηηθά δηαιχκαηα απνηπγράλνπλ. 15

Γ) Γηαιπηνπνίεζε κε νξγαληθνύο δηαιύηεο: Καηάιιειεο ζπγθεληξψζεηο νξγαληθψλ δηαιπηψλ πνπ δηαιπηνπνηνχλ ηα ιηπνεηδή ησλ κεκβξαλψλ ή απνδηαηάζνπλ ηελ θαηαλνκή ησλ ιηπνεηδψλ, πξνθαινχλ ζπρλά δηαιπηνπνίεζε θαη εθρχιηζε ησλ πξσηετλψλ. Σέηνηνη δηαιχηεο είλαη ε αθεηφλε, ε αηζαλφιε, ε πξνπαλφιε, ε βνπηαλφιε, ε ππξηδίλε θ.α. Μηα πνιχ ζπλεζηζκέλε ηερληθή ζηελ απνκφλσζε ησλ ελδχκσλ είλαη ε κεηαηξνπή ηνπ αξρηθνχ νκνγελνπνηήκαηνο ζε «ζθφλε αθεηφλεο». Πξνζηίζεηαη ην νκνγελνπνίεκα ζηαγφλα- ζηαγφλα ζε πνιιαπιάζην φγθν ςπρξήο αθεηφλεο, θαη ην ίδεκα πνπ θαηαθξεκλίδεηαη θαη πεξηιακβάλεη ζπλήζσο φιεο ηηο πξσηεΐλεο, ζπιιέγεηαη κε δηήζεζε ή θπγνθέληξεζε θαη αθήλεηαη λα μεξαλζεί. ηελ αθεηφλε θπζηθά παξακέλνπλ δηαιπηνπνηεκέλα ηα πεξηζζφηεξα ιηπνεηδή. Δ) Γηαιπηνπνίεζε κε απνξξππαληηθά: Σα απνξξππαληηθά ρξεζηκνπνηνχληαη επξχηαηα ζηε δηαιπηνπνίεζε θαη ηνλ θαζαξηζκφ ησλ πξσηετλψλ. Δλψ κε ηηο πδξφθηιεο πνιηθέο νκάδεο ηνπο ηα απνξξππαληηθά κπνξνχλ λα παξακείλνπλ ζε δηάιπκα, κε ηηο πδξφθνβεο νκάδεο ηνπο κπνξνχλ θαη δηαιπηνπνηνχλ ηα ιηπνεηδή, απνδηνξγαλψλνληαο κε ηνλ ηξφπν απηφ ηηο κεκβξάλεο. Σέηνηα απνξξππαληηθά είλαη ηα κε λάηξην άιαηα ηνπ ρνιηθνχ θαη δενμπρνιηθνχ νμένο, ηνπ ζεηηθνχ δσδεθπιίνπ θαη ηα βηνκεραληθά ζθεπάζκαηα, Triton X-100, Tween, Lubrol, Nonidet, θ.α. Σα παξαπάλσ απνξξππαληηθά είλαη δξαζηηθά ζε πνιχ αξαηέο ζπγθεληξψζεηο ηεο ηάμεο ηνπ 1% πεξίπνπ ή θαη ιηγφηεξν. Θεσξείηαη, βεβαίσο, φηη κηα πξσηεΐλε είλαη δηαιπηή ζε έλα απνξξππαληηθφ, αλ παξακέλεη δηαιπηή θαη κεηά ηελ απνκάθξπλζε ηνπ απνξξππαληηθνχ. η) Γηαιπηνπνίεζε κε ρεκηθή ηξνπνπνίεζε ηεο δνκήο: χκθσλα κε ηε κέζνδν απηή εηζάγνληαη λέεο ρεκηθέο νκάδεο ζην κφξην ηεο πξσηεΐλεο. Σα δχν αληηδξαζηήξηα πνπ έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί πην εθηεηακέλα γηα ην ζθνπφ απηφ είλαη ν ειεθηξηθφο θαη ν κειετθφο αλπδξίηεο. Οη ελψζεηο απηέο αληηδξνχλ κε ηηο ε-ακηλνκάδεο ηεο ιπζίλεο (ν κειετθφο αλπδξίηεο θαη κε ηε ζεξίλε) θαη εηζάγνπλ ηε κειευιν- θαη ειεθηξπιν- νκάδα αληίζηνηρα, ζην πξσηετληθφ κφξην. ηελ πεξίπησζε πνπ ε αληίδξαζε απηή θαηαζηξέθεη ηε δνκή ηνπ ελδχκνπ πξέπεη λα αθαηξνχληαη νη λέεο νκάδεο κεηά ηε δηαιπηνπνίεζε. Ο κειετθφο αλπδξίηεο πξνζθέξεηαη πεξηζζφηεξν, θαζψο ε κειευινκάδα πδξνιχεηαη κε επηφηεξα κέζα απ φηη ε ειεθηξπινκάδα. Ε) Λπζνδύκε: Δίλαη έλα έλδπκν πνπ παξάγεηαη απφ ην ιεπθφ ηνπ απγνχ ηεο θφηαο θαη θαηαιχεη ηελ πδξφιπζε ησλ β(1 4) γιπθνζηδηθψλ δεζκψλ ησλ βαθηεξηαθψλ 16

θπηηαξηθψλ ηνηρσκάησλ. ηα Gram- ζεηηθά βαθηήξηα, ηα νπνία παξνπζηάδνπλ θπηηαξηθά ηνηρψκαηα, παξ φιν πνπ είλαη ηα πεξηζζφηεξν επαίζζεηα ζηε ιπζνδχκε βαθηήξηα, ην ηειηθφ ζπάζηκν ηνπ θπηηαξηθνχ ηνηρψκαηνο, γίλεηαη κε σζκσηηθή πίεζε. ηα Gram- αξλεηηθά βαθηήξηα, ε ιχζε ηνπ θπηηαξηθνχ ηνηρψκαηνο, ζπάληα πξαγκαηνπνηείηαη κφλν κε ιπζνδχκε, ρξεζηκνπνηείηαη ζπλήζσο, EDTA πνπ ζρεκαηίδεη ρεκηθά ζχκπινθα κε ηα κεηαιιηθά ηφληα, κε απνηέιεζκα ηε ιχζε ηνπ θπηηάξνπ. Ζ ηερληθή απηή ζπαλίσο εθαξκφδεηαη γηα κεγάιε θιίκαθα εθρχιηζεο βαθηεξηαθψλ ελδχκσλ, ιφγσ ηνπ πςεινχ θφζηνπο ηεο ιπζνδχκεο. 1.4.4 Δλδπκηθέο κέζνδνη: Υξεζηκνπνηνχληαη έλδπκα πνπ πδξνιχνπλ ιηπνεηδή θαη πξσηεΐλεο θαζηζηψληαο κε ηνλ ηξφπν απηφ δπλαηή ηελ απειεπζέξσζε ελδχκσλ απφ ηηο κεκβξάλεο. Σέηνηα έλδπκα είλαη νη ιηπάζεο θαη νη θσζθνιηπάζεο, θαζψο θαη πξσηνιπηηθά έλδπκα, φπσο ε ηξπςίλε. ηελ πεξίπησζε ηεο ηξπςίλεο δίδεηαη ηδηαίηεξε πξνζνρή κε ηηο ζπλζήθεο επψαζεο, θαζψο ην έλδπκν είλαη δπλαηφ λα πξσηενιχζεη θαη ηελ επηζπκεηή πξσηεΐλε. 1.5 Μέζνδνη θαζαξηζκνύ ελδύκσλ: Γελ είλαη ππεξβνιή λα εηπσζεί φηη γηα φζα έλδπκα έρνπλ απνκνλσζεί κέρξη ζήκεξα, ηφζεο δηαδηθαζίεο έρνπλ αθνινπζεζεί, θαζψο δελ είλαη δπλαηφ λα απνκνλσζνχλ δηαθνξεηηθά έλδπκα απφ ηελ ίδηα ή άιιε πεγή κε ηελ ίδηα αθξηβψο δηαδηθαζία. Δπίζεο, δελ είλαη δπλαηφ ην ίδην έλδπκν λα απνκνλσζεί απφ δηαθνξεηηθέο πεγέο κε ηελ ίδηα δηαδηθαζία. Οη ηδηνκνξθίεο ζηε δνκή θαη ηε ζηαζεξφηεηα ηνπ ελδχκνπ, θαζψο θαη ε θχζε ηνπ πεξηβάιινληνο πνπ βξίζθεηαη ην έλδπκν, ππνρξεψλνπλ λα ηξνπνπνηνχληαη νη ήδε γλσζηέο κέζνδνη ή λα ρξεζηκνπνηνχληαη λέεο. Τπάξρνπλ φκσο θαη θαηεγνξίεο θιαζηθψλ κεζφδσλ πνπ κπνξνχλ λα αθνινπζεζνχλ κέρξηο φηνπ είλαη απαξαίηεηε ε αιιαγή ηεο πνξείαο ηνπ θαζαξηζκνχ. Οξηζκέλεο απφ ηηο θαηεγνξίεο κεζφδσλ θαζαξηζκνχ πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη επξέσο είλαη: 17

1.6.1 Φπγνθέληξεζε Γηα κηθξήο θιίκαθαο θαζαξηζκνχ πξσηετλψλ ε θπγνθέληξεζε είλαη ε πην αμηφινγε κέζνδνο δηαρσξηζκνχ γηαηί ππάξρνπλ δηαθνξεηηθνί ηχπνη θπγνθέληξσλ πνπ κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ απφ ηνπο εξεπλεηέο. Με ηε θπγνθέληξεζε αλαπηχζζνληαη δπλάκεηο, φπνηε ηα δηάθνξα ζηεξεά θηλνχληαη αλάινγα κε ην κέγεζνο ηνπο, ηε δηαθνξά ππθλφηεηαο θαη ην ημψδεο ηνπ εθρπιίζκαηνο, πξνο ηελ θαηεχζπλζε εθαξκνγήο ηεο δχλακεο. Υξεζηκνπνηείηαη κε δχν ηξφπνπο: Ζ κέζνδνο ηεο ηαρύηεηαο θαζίδεζεο, ζηελ νπνία ε θαζίδεζε θαη ε δηάρπζε θαζνξίδνληαη θαηά ηε δηάξθεηα ηεο θπγνθέληξεζεο ζε πςειέο ηηκέο θπγνθέληξνπ ζε ζρέζε κε ην ρξφλν. Πξαγκαηνπνηείηαη δηαρσξηζκφο αλάινγα κε ην κέγεζνο ησλ ζπζηαηηθψλ. Ζ κέζνδνο ηνπ ηζόππθλεο θπγνθέληξηζεο, φπνπ ε θαζίδεζε θαη ε δηάρπζε θηάλνπλ ζε κηα ηζνξξνπία. Οη ηηκέο ηεο θπγνθέληξνπ δχλακεο είλαη πνιχ κηθξφηεξεο ζε ζρέζε κε ηελ πξψηε κέζνδν. Γηαρσξίδνληαη ζπζηαηηθά ίδηνπ κεγέζνπο αιιά δηαθνξεηηθήο ππθλφηεηαο. Γεληθά, ε εθαξκνγή ηεο θπγνθέληξνπ δχλακεο ζε έλα εηεξνγελέο δηάιπκα πξνθαιεί δηαρσξηζκφ ησλ δηαθφξσλ ζπζηαηηθψλ ηνπο, ζχκθσλα κε ην ξπζκφ ηεο θαζίδεζεο ηνπο. Σα ζπζηαηηθά κε κεγαιχηεξν ΜΒ έρνπλ κεγαιχηεξν ξπζκφ θαζίδεζεο. Σν θαηλφκελν εμαξηάηαη επίζεο, απφ ηε δηάρπζε, ηε ζπγθέληξσζε θαη ηελ πίεζε. Ηζρχεη: ρεηηθή Φπγφθεληξνο δχλακε: Φ = σ² r/980 γσληαθή ηαρχηεηα: σ=π (rpm)/30 }Φ=(1.11x10-5 )(rpm)²r Ζ έθθξαζε πνπ έρεη επηθξαηήζεη είλαη «πφζεο θνξέο ε δχλακε ηεο βαξχηεηαο» ή «πφζεο θνξέο ην g». 18

1.6.2 Κιαζκαηηθή Καζίδεζε Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε άιαηα Μηα απφ ηηο πην ηθαλνπνηεηηθέο κεζφδνπο γηα ηνλ θαζαξηζκφ θαη ηε ζπκπχθλσζε ελδπκηθψλ παξαζθεπαζκάησλ είλαη ε θιαζκάησζε ηνπ παξαζθεπάζκαηνο κε έλα αλφξγαλν ζπλήζσο άιαο. Σν άιαο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη θαηά θφξνλ είλαη ην ζεηηθφ ακκψλην, αιιά θαηά θαηξνχο έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί θαη άιια, φπσο ην ζεηηθφ λάηξην, ζεηηθφ καγλήζην, ζεηηθή ζηξεπηνκπθίλε, θ.α. χκθσλα κε ηελ ηερληθή απηή ην ζηεξεφ άιαο πξνζηίζεηαη ζηγά ζηγά ζην ελδπκηθφ εθρχιηζκα κέρξη λα επηηεπρζεί ν επηζπκεηφο θνξεζκφο. Μεηά απφ 15 ιεπηά ηνπιάρηζηνλ, ην κίγκα θπγνθεληξείηαη ή δηεζείηαη, ην ίδεκα δηαιπηνπνηείηαη ζε κηθξφ φγθν λεξνχ ή ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο, θαη ζην ππεξθείκελν ή δηήζεκα πξνζηίζεηαη λέα πνζφηεηα άιαηνο γηα λα επηηεπρζεί κεγαιχηεξνο θνξεζκφο. Σν ίδεκα ζπιιέγεηαη μαλά κε θπγνθέληξεζε ή δηήζεζε, δηαιπηνπνηείηαη φπσο θαη πξηλ θαη ε φιε δηαδηθαζία επαλαιακβάλεηαη. ηα δηαιπκέλα πιένλ, ηδήκαηα πξνζδηνξίδεηαη ε θαζαξφηεηα θαη ε απφδνζε ηεο πξσηεΐλεο. Ο ηχπνο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα ην πνζφ ηνπ ζεηηθνχ ακκσλίνπ πνπ πξέπεη λα πξνζηεζεί θάζε θνξά γηα λα επηηεπρζεί ν επηζπκεηφο θνξεζκφο ζηνπο 0 C, είλαη ν εμήο: 0,515x (V 1 )x(s 2 -S 1 ) W= 1-0,272x(S 2 ) Όπνπ W= βάξνο ηνπ ζεηηθνχ ακκσλίνπ ζε gr V 1 = φγθνο ηνπ δηαιχκαηνο S 1 = θνξεζκφο ζε φγθν V 1 S 2 = επηζπκεηφο θνξεζκφο Σα S εθθξάδνληαη ζε εθαηνζηά ηεο κνλάδαο. Έηζη 100% θνξεζκφο αληηζηνηρεί ζε 1, ελψ 50% ζε 0.5. Αληί γηα ζηεξεφ άιαο κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί θνξεζκέλν δηάιπκα ζε λεξφ ηνπ άιαηνο. ηελ πεξίπησζε απηή ρξεζηκνπνηείηαη ν παξαθάησ ηχπνο, γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηνπ φγθνπ, V, ηνπ θνξεζκέλνπ δηαιχκαηνο ζεηηθνχ ακκσλίνπ πνπ ζα ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηνλ επηζπκεηφ θνξεζκφ: V 1 (S 2 -S 1 ) V= 1-S 2 19

Σν κεηνλέθηεκα ησλ θνξεζκέλσλ δηαιπκάησλ είλαη φηη απμάλεηαη ν φγθνο ηνπ παξαζθεπάζκαηνο. Ζ θιαζκάησζε κε άιαηα είλαη επαλαιήςηκε κφλν φηαλ νη ζπλζήθεο ph, ζεξκνθξαζία, ζπγθέληξσζε πξσηεΐλεο, θηι. παξακέλνπλ ζηαζεξέο. Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε νξγαληθνύο δηαιύηεο: Οη νξγαληθνί δηαιχηεο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζπλήζσο είλαη ε αηζπιηθή αιθνφιε θαη ε αθεηφλε. Ζ ηειεπηαία δίλεη θαιχηεξα απνηειέζκαηα ζε φηη αθνξά ηε ζπγθέληξσζε ηνπ ελδχκνπ ζ έλα θιάζκα, αιιά πην επηθίλδπλε γηα ηε δνκηθή αθεξαηφηεηα ησλ ελδχκσλ κηαο θαη είλαη πην ηζρπξφο αθπδαηηθφο παξάγνληαο απφ ηελ αηζαλφιε. Όζν αλεβαίλνπκε ζηελ νκφινγε ζεηξά ησλ πξσηνηαγψλ αιθννιψλ, ηφζν κηθξαίλεη ε δπλαηφηεηα θαηαθξήκληζεο πξσηετλψλ κε ηνλ ίδην θνξεζκφ, αιιά κηθξαίλεη επίζεο θαη ν θίλδπλνο κεηνπζίσζεο ησλ ελδχκσλ. ην ζρήκα 6.2.1 παξνπζηάδεηαη ζρεκαηηθή ε ζπζζσκάησζε ησλ πξσηετλψλ θαηά ηελ πξνζζήθε νξγαληθψλ δηαιπηψλ ζηα πδαηηθά ηνπο δηαιχκαηα. ρήκα 6.2.1 πζζσκάησζε πξσηετλψλ θαηά ηελ πξνζζήθε νξγαληθψλ δηαιπηψλ ζηα πδαηηθά δηαιχκαηα. Ζ ρξήζε ησλ νξγαληθψλ δηαιπηψλ γηα ηελ θιαζκαηηθή θαζίδεζε ησλ πξσηετλψλ παξνπζηάδεη νξηζκέλα πιενλεθηήκαηα αιιά θαη κεηνλεθηήκαηα ζε ζρέζε κε ηε ρξήζε αιάησλ. ηελ πεξίπησζε ησλ κεηνλεθηεκάησλ πξέπεη λα ζεκεησζεί ε αχμεζε ηνπ φγθνπ ηνπ παξαζθεπάζκαηνο, φπσο ζπκβαίλεη θαη κε ηελ πξνζζήθε θνξεζκέλσλ δηαιπκάησλ αιάησλ. Γεχηεξνλ, κε ηελ πξνζζήθε ηνπ δηαιχηε ζην πδαηηθφ δηάιπκα παξαηεξείηαη αχμεζε ηεο ζεξκνθξαζίαο πνπ ζπκβάιεη θαη απηή ζηε κεηνπζίσζε ησλ πξσηετλψλ. Γη απηφ θαη νη θιαζκαηψζεηο κε νξγαληθνχο δηαιχηεο πξαγκαηνπνηνχληαη ζε ζεξκνθξαζίεο ππφ ηνπ κεδελφο (- 20 C). Σα πιενλεθηήκαηα είλαη ηα παξαθάησ: Σν πξψην είλαη πξαθηηθφ. Καζψο ηα κίγκαηα λεξνχ- νξγαληθψλ δηαιπηψλ έρνπλ ρακειφηεξε ππθλφηεηα απφ ππθλά αιαηνχρα δηαιχκαηα, απαηηνχληαη ρακειφηεξεο ηαρχηεηεο ή κηθξφηεξνη ρξφλνη θπγνθέληξεζεο γηα ηε ζπιινγή ηνπ ηδήκαηνο. Σν δεχηεξν ζηεξίδεηαη ζην γεγνλφο φηη κπνξεί ν εξεπλεηήο λα επσθειεζεί απφ ηηο αιιειεπηδξάζεηο πξσηετλψλ- 20

ειεθηξνιπηψλ, γηα λα επεθηαζεί ην εχξνο ησλ δπλαηνηήησλ γηα θιαζκαηηθή θαζίδεζε πνπ παξέρνπλ νη νξγαληθνί δηαιχηεο. Σα νπδέηεξα άιαηα γεληθά απμάλνπλ ηε δηαιπηφηεηα ησλ πξσηετλψλ. Ζ ξχζκηζε ηεο ζπγθέληξσζεο ελφο άιαηνο ζην παξαζθεχαζκα ζε ρακειέο ζπγθεληξψζεηο, νδεγεί ζε εθιεθηηθή θαζίδεζε νξηζκέλσλ πξσηετλψλ. ε πεξηπηψζεηο άγλσζησλ πξσηετλψλ, πξέπεη λα ρξεζηκνπνηνχληαη ζπγθεληξψζεηο αιάησλ γχξσ ζην 3 x 10-3 M. Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε κεηαβνιή ηνπ ph Οη πξσηεΐλεο είλαη ακθνιχηεο. Λφγσ ηεο ηδηφηεηαο απηήο έρνπλ ηζνειεθηξηθά ζεκεία, ππάξρεη δειαδή κηα ηηκή ph γηα ηελ νπνία ην θαζαξφ θνξηίν ηεο πξσηεΐλεο είλαη κεδέλ. ην ηζνειεθηξηθφ ηνπο ζεκείν νη πξσηεΐλεο έρνπλ ηε κηθξφηεξε δηαιπηφηεηα. Δίλαη δπλαηή ινηπφλ ε θαηαθξήκληζε ηεο πξσηεΐλεο πνπ καο ελδηαθέξεη ή ησλ ππνινίπσλ πξσηετλψλ, ξπζκίδνληαο ην ph ζε δηάθνξεο ηηκέο. Ζ ξχζκηζε ηνπ ph κπνξεί λα γίλεη είηε απεπζείαο κε ηελ πξνζζήθε νμένο ή βάζεσο, είηε κε δηαπίδπζε ηνπ παξαζθεπάζκαηνο κε ξπζκηζηηθά δηαιχκαηα νξηζκέλνπ ph. ην ζρήκα 6.2.2 παξνπζηάδνληαη νη αιιαγέο πνπ παξαηεξνχληαη ζε κηα πξσηεΐλε θαηά ηελ αιιαγή ηνπ ph. ρήκα 6.2.2 Αιιαγέο πνπ παξαηεξνχληαη ζε κηα πξσηεΐλε θαηά ηελ αιιαγή ηνπ ph. Κιαζκαηηθή θαζίδεζε κε ζέξκαλζε ε πεξηπηψζεηο πνπ ε πξσηεΐλε είλαη αλζεθηηθή ζε πςειέο ζεξκνθξαζίεο, ην παξαζθεχαζκα ζεξκαίλεηαη ζε πδαηφινπηξν θαη απνκαθξχλνληαη ζηε ζπλέρεηα νη κεηνπζησκέλεο πξσηεΐλεο πνπ θαηαθξεκλίδνληαη. ηελ πξνθεηκέλε πεξίπησζε 21

παίδνπλ ξφιν ηφζν ην ph φζν θαη ε ζπγθέληξσζε ησλ ειεθηξνιπηψλ, πνπ πξέπεη λα δηαηεξνχληαη ζηαζεξά, ψζηε λα είλαη επαλαιήςηκε ε κέζνδνο. Άιιεο ηερληθέο: Ζ ρξεζηκνπνίεζε πνιπκεξψλ κεγάινπ κνξηαθνχ βάξνπο (π.ρ πνιπαηζπιελνγιπθφιε) είλαη κηα απφ ηηο πξνζπάζεηεο πνπ γίλνληαη κε επηηπρία. Σα πνιπκεξή έρνπλ ην πιενλέθηεκα φηη δελ αληηδξνχλ κε ηελ πξσηεΐλε θαη φηη νη πξσηεΐλεο θαηαθξεκλίδνληαη ζε ρακειέο ζπγθεληξψζεηο πνιπκεξψλ. Σν κεηνλέθηεκα ηνπο είλαη φηη δελ μερσξίδνπλ εχθνια απφ ην κίγκα ησλ πξσηετλψλ. 1.7 Πξνζξόθεζε Έλαο αξηζκφο αησξεκάησλ δπζδηάιπησλ αιάησλ κπνξνχλ λα πξνζξνθνχλ ζηελ επηθάλεηα ηνπο πξσηεΐλεο. Σέηνηα άιαηα είλαη ην θσζθνξηθφ αζβέζηην, ν πδξνμπαπαηίηεο θαη ε Cγ κνξθή ηνπ πδξνμπιίνπ ηνπ αξγηιίνπ. Έλαο πξνζξνθεηήο, γεληθά, κπνξεί λα πξνζξνθήζεη ή ην έλδπκν θαη λα κελ πξνζξνθήζεη ηηο πεξηζζφηεξεο αδξαλείο πξσηεΐλεο ή λα πξνζξνθήζεη αληίζεηα ηηο πεξηζζφηεξεο αδξαλείο πξσηεΐλεο θαη φρη ην ελεξγφ έλδπκν. ηελ δεχηεξε πεξίπησζε αθνινπζεί απιά θπγνθέληξεζε θαη θξαηείηαη ην ππεξθείκελν θαζψο εθεί βξίζθεηαη ζε δηαιπηή θαη θαζαξή κνξθή ην έλδπκν ηνπ ελδηαθέξνληνο. ηελ πξψηε πεξίπησζε, αθνχ ην ππεξθείκελν δηάιπκα απνκαθξπλζεί κε θπγνθέληξεζε, ην έλδπκν εθινχεηαη κε ηελ αηψξεζε ηνπ ηδήκαηνο ζε ειαθξά αιθαιηθφ ξπζκηζηηθφ δηάιπκα. Γηα έλδπκα πνπ πξνζξνθνχληαη ηζρπξά, ην ξπζκηζηηθφ δηάιπκα κπνξεί λα πεξηέρεη θαη ιίγν ζεηηθφ ακκψλην. 1.8 Γηήζεζε κε κεκβξάλεο Απφ ην 1960 θαη κεηά νη κεκβξάλεο ππεξδηήζεζεο έρνπλ αξρίζεη λα ηειεηνπνηνχληαη κε εμαηξεηηθφ ξπζκφ. Πξφθεηηαη γηα κηα κέζνδν πνπ δηαρσξίδεη πξσηεΐλεο ρσξίο αιιαγή θάζεο θαη κε κηθξή θαηαλάισζε ελέξγεηαο. Οη κεκβξάλεο είλαη δηαθφξσλ ηχπσλ (νμηθή θπηηαξίλε, πνιπαθξπινληηξίιην, πνιπζνπιθίδηα, PVC θιπ.) θαη κε δηαθνξεηηθή δηάκεηξν πφξσλ. Ζ αλζεθηηθφηεηα ησλ κεκβξαλψλ θηάλεη κέρξη ηνπο 93 C θαη ζε πεξηνρέο ph απφ 0.5 κέρξη 13. Σν κφλν κεηνλέθηεκα είλαη ε απφθξαμε ησλ πφξσλ. 1.9.1 Υξσκαηνγξαθία ζηήιεο Οη πην απνηειεζκαηηθέο κέζνδνη πνπ έρνπκε ζήκεξα ζηε δηάζεζε καο είλαη νη ρξσκαηνγξαθηθέο. Ζ ρξσκαηνγξαθία κπνξεί λα ραξαθηεξηζηεί σο κηα κέζνδνο δηαρσξηζκνχ κνξηαθψλ κηγκάησλ κέζσ δχν θάζεσλ. Ζ κηα είλαη ε ζηαηηθή θάζε θαη ε θηλεηή θάζε. Οη δχν θάζεηο έξρνληαη ζε επαθή θαη αιιειεπηδξνχλ κε δπλάκεηο φπσο, ειεθηξνζηαηηθέο, αγρηζηείαο, πξνζξφθεζεο θιπ. Αλάινγα κε ηηο δπλάκεηο πνπ ππεξηζρχνπλ θάζε θνξά δηαθξίλνληαη ηα δηάθνξα είδε 22

ρξσκαηνγξαθίαο. Σα δχν θχξηα είδε ηεο ρξσκαηνγξαθίαο είλαη ε Αέξηα (ε θηλεηή θάζε είλαη αέξηα) θαη ε Τγξή (ε θηλεηή θάζε είλαη πγξή) Υξσκαηνγξαθία. αλ πιηθφ ζηήιεο κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ δηάθνξεο νπζίεο πνπ δηαρσξίδνπλ ηηο πξσηεΐλεο κε δηαθνξεηηθνχο κεραληζκνχ. ηνλ θαζαξηζκφ πξσηετλψλ ρξεζηκνπνηνχληαη ηα εμήο είδε ρξσκαηνγξαθίαο. ρήκα 9.1.1 Α)Υξσκαηνγξαθία ηνληθήο αληαιιαγήο Τπάξρεη έλαο κεγάινο αξηζκφο ηνληθψλ αληαιιαθηψλ, πνπ έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί θαηά θαηξνχο γηα ηνλ θαζαξηζκφ πξσηετλψλ. Σα ηειεπηαία ρξφληα ρξεζηκνπνηνχληαη θπξίσο ππνθαηεζηεκέλεο θπηηαξίλεο, φπσο ν θαηηνληθφο αληαιιάθηεο δηαηζπιακηλναηζπινθπηηαξίλε (DEAE-cellulose) θαη ηα αληίζηνηρα ππνθαηεζηεκέλα πνιπδεμηξάληα (CM-Sephadex). Με θαηάιιειε ξχζκηζε ηνπ ph θαη ηεο ηνληθήο ηζρχνο ησλ ξπζκηζηηθψλ δηαιπκάησλ πνπ ιεηηνπξγνχλ σο εθινπζηηθά, επηηπγράλνληαη ηθαλνπνηεηηθνί θαζαξηζκνί. 23

Β) Υξσκαηνγξαθία πξνζξόθεζεο Πνιιέο θνξέο επηηπγράλνληαη ηθαλνπνηεηηθνί θαζαξηζκνί κε ηελ εθαξκνγή πξνζξνθεηή κέζα ζηε ζηήιε. Γηα ην ζθνπφ απηφ ρξεζηκνπνηείηαη ζπλήζσο ν πδξνμπαπαηίηεο. Γ) Υξσκαηνγξαθία κνξηαθήο δηήζεζεο Γηάθνξα δπζδηάιπηα πνιπκεξή, φπσο δεμηξάληα, αγαξφδε, πνιπαθξπιακίδην θ.α κπνξνχλ λα θαηαζθεπαζηνχλ κε θαηάιιειν κέγεζνο πφξσλ θαη λα παθησζνχλ ζε ζηήιε. Ο δηαρσξηζκφο επηηπγράλεηαη κε βάζε ην κνξηαθφ βάξνο ησλ πξσηετλψλ. Σα κηθξά κφξηα εηζέξρνληαη κέζα ζην πιέγκα ηνπ πιηθνχ ηεο πεθηήο θαη παξακέλνπλ πεξηζζφηεξν ζηε ζηήιε, ελψ ηα κεγάια πιηθά δε κπνξνχλ λα θξαηεζνχλ ζηε ζηήιε θαη βγαίλνπλ ακέζσο ζρεδφλ θαηά ηελ εθαξκνγή ηνπ δείγκαηνο ζηε ζηήιε. Γ) Υξσκαηνγξαθία αγρηζηείαο Δάλ ζε έλα ζηεξεφ κέζν ρξσκαηνγξαθίαο θαζεισζεί κηα νπζία πνπ απνηειεί πξνζδέηε γηα κηα πξσηεΐλε, φπσο π.ρ. ην ππφζηξσκα γηα έλα έλδπκν ή έλαο αλαζηνιέο ή έλαο αξηζκφο άιισλ ζπλαξκνηψλ φπσο ATP θαη NAD θαη δηαβηβαζζεί απφ ηε ζηήιε ην πξσηετληθφ παξαζθεχαζκα, ηφηε ην κφλν πνπ ζα δεζκεπζεί ζηε ζηήιε θάησ απφ ηηο θαηάιιειεο ζπλζήθεο, ζα είλαη ε πξσηεΐλε ηνπ ελδηαθέξνληνο ιφγσ αιιειεπίδξαζεο κε ηνλ πξνζδέηε, ελψ φιεο νη άιιεο πξσηεΐλεο ζα πεξάζνπλ κέζα απφ ηε ζηήιε ρσξίο λα θαηαθξαηεζνχλ. Οη πξσηεΐλε ηνπ ελδηαθέξνληνο εθινχεηαη ζηε ζπλέρεηα απφ ηε ζηήιε κε αχμεζε ηεο ηνληθήο ηζρχνο ηνπ εθινπζηηθνχ. ρήκα 9.1.2 Καηαλνκή ησλ δηαιπηψλ κνξίσλ κέζα ζε κηα ζηήιε ρξσκαηνγξαθίαο. 24

Ζ ηαθηηθή ζηηο κεζφδνπο ρξσκαηνγξαθίαο, είλαη πξψηα λα πξνεγείηαη κηα ζηήιε ηνληθήο αληαιιαγήο πνπ ειαηηψλεη ηνπο φγθνπο θαη απνκαθξχλεη πνιιέο απφ ηηο κε επηζπκεηέο πξσηεΐλεο θαη ζηε ζπλέρεηα λα ρξεζηκνπνηνχληαη νη ζηήιεο κνξηαθήο δηήζεζεο ή αγρηζηείαο. ηε ζπλέρεηα ζα αλαπηπρζνχλ αλαιπηηθφηεξα ηα είδε ηεο ρξσκαηνγξαθίαο. ρξσκαηνγξαθηθή ζηήιε. 1.9.2 Υξσκαηνγξαθία ηνληθήο αληαιιαγήο Οη πξσηεΐλεο δεζκεχνληαη ζηνπο ηνληθνχο αληαιιάθηεο κε ειεθηξνζηαηηθέο δπλάκεηο κεηαμχ ησλ θνξηίσλ ζηελ επηθάλεηα ησλ πξσηετλψλ θαη ησλ νκάδσλ πνπ είλαη ζπλδεδεκέλεο ζηε ξεηίλε ηνπ πιηθνχ ηεο ζηήιεο. Σα θνξηία ηνπ πιηθνχ ηεο ζηήιεο πξηλ ηελ εθαξκνγή ηνπ πξσηετληθνχ δηαιχκαηνο, εμηζνξξνπνχληαη κε εηδηθά εμηζνξξνπηζηηθά φπσο ηφληα κεηάιισλ, ηφληα ρισξίνπ θαη κεξηθέο θνξέο ηφληα απφ ξπζκηζηηθά δηαιχκαηα. Ζ πξσηεΐλε πξέπεη λα απνκαθξχλεη ηα εμηζνξξνπηζηηθά απφ ηηο νκάδεο ηνπ πιηθνχ ηεο ζηήιεο θαη λα δεζκεπζεί. Σα πξσηετληθά κφξηα ζε δηάιπκα είλαη εμηζνξξνπεκέλα. Σν ζπλνιηθφ απνηέιεζκα ζε κηα πεξηνρή ηνπ πιηθνχ ηεο ζηήιεο πξέπεη λα είλαη ειεθηξηθά νπδέηεξν. ην δηάγξακκα απηφ κηα αξλεηηθά θνξηηζκέλε πξσηεΐλε έρεη εμηζνξξνπεζεί κε ξπζκηζηηθφ δηάιπκα Tris-chloride. Σν πιηθφ ηεο ζηήιεο DEAE έρεη σο εμηζνξξνπηζηηθά ηφληα ρισξίνπ. Ζ πξσηεΐλε ζηε ζπλέρεηα απνκαθξχλεη ηα ηφληα ρισξίνπ, δεζκεχεηαη ζε κηα ζέζε ηνπ αληαιιάθηε θαη ην Tris-Cl εμνπδεηεξψλεηαη. Σν απνηέιεζκα είλαη κηα αχμεζε ηεο ηνληθήο ηζρχνο ηνπ δηαιχκαηνο πνπ εμέξρεηαη απφ ηε ζηήιε θαη κεηαβνιή ηνπ ph. Γηα λα απνθεπρζνχλ νη κεηαβνιέο απηέο ε ζπγθέληξσζε ηεο πξσηεΐλεο ζην δηάιπκα πνπ εθαξκφδεηαη ζηε ζηήιε δελ είλαη πνιχ κεγάιε. Γχν κνξθέο αιιειεπηδξάζεσλ παξαηεξνχληαη θαηά ηελ πξνζξφθεζε κηαο πξσηεΐλεο απφ έλαλ ηνληθφ αληαιιάθηε. Ζ «κε-αληηζηξεπηή» θαη ε «αληηζηξεπηή». χκθσλα κε ηε κε αληηζηξεπηή απφ ηε ζηηγκή πνπ ε πξσηεΐλε δεζκεπηεί ζην πιηθφ δελ κπνξεί λα απνδεζκεπηεί. Μηα αιιαγή ηνπ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο ψζηε λα κεηαηξαπνχλ ζηαδηαθά νη ζπλζήθεο ζε αληηζηξεπηέο είλαη ε ιχζε. 25

ρήκα 9.2.1 Μηα αξλεηηθά θνξηηζκέλε πξσηεΐλε πεξλά θαη δεζκεχεηαη απφ έλαλ αληνληθφ αληαιιάθηε. Σα πιηθά ηνληθήο αληαιιαγήο πνπ απνηεινχληαη απφ νπζίεο κε ηε κνξθή ζθαηξηδίσλ νξηζκέλνπ κεγέζνπο θαη πφξσλ θνξηηζκέλεο ζεηηθά ή αξλεηηθά, απνηεινχλ ηα πην επξέσο ρξεζηκνπνηνχκελα πιηθά ρξσκαηνγξαθίαο. Οη ηνληθνί αληαιιάθηεο αλαγλσξίδνπλ ηα αληίζεηα θνξηία ησλ πξσηετλψλ θαη αληηδξνχλ κε απηά κε ειεθηξνζηαηηθέο δπλάκεηο. Γηαθξίλνληαη ζε δχν νκάδεο: ηνπο αληνληθνχο αληαιιάθηεο (πιηθά ζεηηθά θνξηηζκέλα) θαη ηνπο θαηηνληθνχο αληαιιάθηεο (πιηθά αξλεηηθά θνξηηζκέλα). Δληφο απηψλ ησλ δχν ηάμεσλ δηαθξίλνληαη πνιινί δηαθνξεηηθνί ηχπνη πιηθψλ πνπ δηαθέξνπλ σο πξνο ηε ρεκεία ησλ ππνθαηαζηαζηψλ, ην βαζκφ ππνθαηάζηαζεο θαη ηνλ ηξφπν ζχλδεζεο ηνπ ππνθαηαζηάηε. Οη πην θνηλνί αληνληθνί αληαιιάθηεο είλαη ην diethy laminoethyl- (DEAE-) θαη ην quaternary aminoethyl- (TEAE-, QAE-) ζπλδεδεκέλα απεπζείαο ζηηο πδξνμπιηθέο νκάδεο ηνπ πιηθνχ πάθησζεο ηεο ζηήιεο. Δπηπξφζζεηα, νη αληαιιάθηεο πνιπαηζπιελεκίλεο ρξεζηκνπνηνχληαη θαηά θχξην ιφγν γηα chromatofocusing. Κάζε αληνληθφο αληαιιάθηεο έρεη έλα κφλν ζεηηθφ θνξηίν ζε έλα άηνκν αδψηνπ. ηελ πεξίπησζε ησλ ηξηηνηαγψλ αληαιιαθηψλ είλαη κε απνζπλδπαζηφ, αιιά ζηελ πεξίπησζε ησλ DEAE ην πξσηφλην ηνπ αδψηνπ απνκαθξχλεηαη ζε πςειφ ph αθήλνληαο έλα ζπλνιηθά αθφξηηζην πιηθφ πάλσ απφ ph 9.5. Οη αληαιιάθηεο DEAE είλαη αθφξηηζηνη ζε νπδέηεξν ph θαη δελ πξσηνληψλνληαη πιήξσο αθφκε θαη ζε ph 6. Αλ θαη απηφ ζεκαίλεη φηη ζην ph πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη είλαη ελ κέξε θνξηηζκέλα, ιεηηνπξγνχλ σο πνιχ ηζρπξά ξπζκηζηηθά δηαιχκαηα, γεγνλφο πνπ κπνξεί λα ιεηηνπξγεί σο ζεηηθφ ζηνπο δηαρσξηζκνχο θαη ηνπο θαζαξηζκνχο. Οη θαηηνληθνί αληαιιάθηεο δηαθξίλνληαη ζε ηξεηο θαηεγνξίεο: «αζζελή» carboxymethyl- ππνθαηαζηάηεο (CM-), «ηζρπξέο» sulfonate νκάδεο (S- θαη SP-) θαη θσζθνξηθά. Σα ηειεπηαία αλ θαη δελ είλαη αθφκε ζίγνπξν γηα ην θαηά πφζν δξνπλ σο θαηηνληθνί αληαιιάθηεο, έρνπλ ζπγθεθξηκέλε δξάζε αγρηζηείαο, 26

ζχκθσλα κε ηελ νπνία αιιειεπηδξνχλ κε έλδπκα πνπ δεζκεχνπλ πνιπθσζθνξηθά ππνζηξψκαηα, φπσο ηα λνπθιετληθά νμέα (Grossman and Moldave, 1974) θαη κε έλδπκα πνπ δεζκεχνπλ θσζθνξηθά ζάθραξα. ρήκα 9.2.2 Γνκέο ησλ πην ζπρλά ρξεζηκνπνηνχκελσλ ηνληθψλ αληαιιαθηψλ α) DEAE- b) QΑ c) CM Σν πνζφ ηεο πξσηεΐλεο πνπ κπνξεί λα δεζκεπζεί αλά κνλάδα φγθνπ ηνπ παθεηαξηζκέλνπ πιηθνχ ηεο ζηήιεο εμαξηάηαη απφ ην πιηθφ αιιά θαη απφ ην κέγεζνο ησλ κνξίσλ ηεο πξσηεΐλεο. Μφξηα κε κνξηαθά βάξε κεγαιχηεξα απφ 10 6 εθινχνληαη ακέζσο απφ ηνπο πεξηζζφηεξνπο ηνληθνχο αληαιιάθηεο θπηηαξίλεο. Αθξηβψο φπσο θαη ζηελ πεξίπησζε ηεο ρξσκαηνγξαθίαο κνξηαθήο δηήζεζεο. Ζ ζπλνιηθή ηθαλφηεηα δέζκεπζεο εμαξηάηαη απφ ην ζπλνιηθφ φγθν ηνπ πιηθνχ ηεο ζηήιεο πνπ είλαη πξνζβάζηκν ζηελ πξσηεΐλε. Τπάξρνπλ ζπλζεηηθά πιηθά ηνληθήο αληαιιαγήο, ηα νπνία κπνξνχλ λα δεζκεχζνπλ πξσηετληθά κφξηα κεγαιχηεξα απφ 10 7, φπσο ην Trisacryl TM. Οη πξσηεΐλεο εθινχνληαη απφ ηε ζηήιε ζχκθσλα κε ην ηζνειεθηξηθφ ηνπο ζεκείν, μεθηλψληαο απφ πςειφ ph θαη κεηψλνληαο ηελ ηηκή ηνπ. Ζ έθινπζε ησλ πξσηετλψλ πξαγκαηνπνηείηαη κε δχν ηξφπνπο: 1) Μεηαβνιή ηνπ ph ηνπ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο ζε κηα ηηκή ηέηνηα πνπ εμαζζελνχλ νη δπλάκεηο δέζκεπζεο ηεο πξσηεΐλεο ζηε ζηήιε. ηελ πεξίπησζε ηνπ αληνληθνχ αληαιιάθηε ην ph κεηψλεηαη, ελψ ζηελ πεξίπησζε ηνπ θαηηνληθνχ αληαιιάθηε απμάλεηαη. 2) Αχμεζε ηεο ηνληθήο ηζρχνο ηνπ εθινπζηηθνχ δηαιχκαηνο, κε απνηέιεζκα ηελ εμαζζέληζε ηεο ηνληθήο αιιειεπίδξαζεο κεηαμχ ηεο πξσηεΐλεο θαη ηνπ ηνληθνχ αληαιιάθηε. 27

Ζ εθαξκνγή ζπζηεκάησλ ξπζκηζηηθψλ δηαιπκάησλ κε απμαλφκελε ηνληθή ηζρχ (αθφκε θαη δηαβαζκηζκέλεο ηνληθήο ηζρχνο) θαη ε ρξήζε ηζρπξψλ ηνληθψλ αληαιιαθηψλ, νδεγεί ζε πςειέο απνδφζεηο έθινπζεο θαη απνκφλσζεο κε θαζαξή κνξθή ησλ πξσηετλψλ. Ζ ηερληθή απηή νλνκάδεηαη chromatofocusing (Sluyterman and Wijdenes, 1981). Ζ κείσζε ηεο ηνληθήο ηζρχνο γίλεηαη κε πνιπκεξηθά ξπζκηζηηθά δηαιχκαηα ακθνιπηψλ. Μηα κέζνδνο αθφκε είλαη ε εμηζνξξφπεζε ηεο ζηήιεο ζε πςειφ ph κε ακθνιχηεο, ψζηε λα δεζκεπζεί ε πξσηεΐλε θαη ε εθαξκνγή ζηε ζπλέρεηα ζηε ζηήιε ηνπ ακθνιχηε ζε ph ρακειφηεξν απφ ην ηζνειεθηξηθφ ζεκείν ηεο πξσηεΐλεο. πλήζσο ρξεζηκνπνηείηαη δηαβαζκηζκέλε κεηαβνιή ηνπ ph. Οη δηαβαζκίζεηο αιάησλ είλαη ε πεξηζζφηεξν ρξεζηκνπνηνχκελε κέζνδνο γηα ηελ έθινπζε ησλ πξσηετλψλ. 1.9.3 Τδξόθνβε ρξσκαηνγξαθία Οη πδξφθνβνη πξνζξνθεηέο (Ochoa, 1978) εθκεηαιιεχνληαη ηελ πνηθηιία ησλ εμσηεξηθψλ πδξφθνβσλ ακηλνμέσλ ζηηο πξσηεΐλεο θαη αιιειεπηδξνχλ κε απηέο, εθκεηαιιεπφκελνη ην γεγνλφο φηη ζε πδξφθηια δηαιχκαηα ηα πδξφθνβα ηκήκαηα ησλ πξσηετλψλ εκθαλίδνληαη φια ζηελ επηθάλεηα ηεο πξσηεΐλεο. Οη πδξφθνβεο αιιειεπηδξάζεηο εληζρχνληαη κε πςειέο ζπγθεληξψζεηο άιαηνο θαη πςειέο ζεξκνθξαζίεο, ελψ αζζελνχλ κε ηελ παξνπζία απνξξππαληηθψλ ή αλακίμηκσλ νξγαληθψλ δηαιπηψλ. Σα πην θνηλά πδξφθνβα πιηθά πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζηε ρξσκαηνγξαθία πξσηετλψλ απνηεινχληαη απφ κηθξέο αιεηθαηηθέο αιπζίδεο (C 4 θαη C 10 ) ή απφ βελδπι- (θαηλπιν-) νκάδα δεζκεπκέλε κε ηα πδξνμχιηα ηνπ πιηθνχ. Δπηπξφζζεηα ππάξρνπλ θάπνηνη αθφκε κηθξνί ηχπνη πδξφθνβσλ πιηθψλ πνπ πεξηιακβάλνπλ γηα παξάδεηγκα θαη ζεηηθφ θνξηίν. Σν εχξνο ηεο δέζκεπζεο κηαο πδξφθνβεο πξσηεΐλεο εμαξηάηαη απφ ηνλ ηχπν θαη ηελ ππθλφηεηα ηεο ππνθαηάζηαζεο ηνπ πιηθνχ ηεο ζηήιεο, φπσο επίζεο θαη απφ ηε θχζε ησλ ζπλζεθψλ ηνπ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο. Σα πδξφθνβα πιηθά παξνπζηάδνπλ κεγαιχηεξε πνηθηιία ζπκπεξηθνξάο ζε ζρέζε κε ηνπο ηνληθνχο αληαιιάθηεο θαη εμαηηίαο ηεο θχζεο ησλ δπλάκεσλ πνπ αλαπηχζζνληαη κεηαμχ ησλ πιηθψλ θαη ησλ πξσηετλψλ, ε δηαρσξηζηηθή ηθαλφηεηα είλαη κηθξφηεξε ζε ζρέζε κε ηνπο ηνληθνχο αληαιιάθηεο. Καηά ηελ εθαξκνγή ηνπ δηαιχκαηνο ζηε ζηήιε πξέπεη λα είλαη παξφλ έλα άιαο ην νπνίν απμάλεη ηηο πδξφθνβεο αιιειεπηδξάζεηο θαη δηεπθνιχλεη ηε δέζκεπζε ηεο πξσηεΐλεο. Σα άιαηα πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζπλήζσο είλαη ην ζεηηθφ λάηξην θαη ην ζεηηθφ ακκψλην ζε ζπγθεληξψζεηο πεξίπνπ 0.5 Μ ή θάπνηα ρισξηνχρα άιαηα ζε ζπγθεληξψζεηο 1-2 Μ. Γηα ηελ επηινγή ηνπ πιηθνχ πνπ ζα ρξεζηκνπνηεζεί ειέγρνληαη ην ph, ε ηνληθή ηζρχο ζηελ νπνία δεζκεχεηαη θαιχηεξα ε θάζε πξσηεΐλε, ην θνξηίν ηεο πξσηεΐλεο θιπ. Ζ έθινπζε ησλ πξσηετλψλ απφ ηε ζηήιε 28

επηηπγράλεηαη κε ηε ρξήζε εθινπζηηθνχ πνπ κεηψλεη ηηο αιιειεπηδξάζεηο. Οη πδξφθνβεο αιιειεπηδξάζεηο εμαζζελνχλ κε: 1. ειάηησζε ηεο ζεξκνθξαζίαο 2. εγθιεηζκφ νξγαληθνχ δηαιχηε 3. εγθιεηζκφ πνιπαιθννιψλ, ηδηαίηεξα ηεο πνιπαηζπιελνγιπθφιεο 4. εγθιεηζκφ απνξξππαληηθνχ 5. κείσζε ηνπ ph 6. ειάηησζε ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ άιαηνο, (δηαβαζκηζκέλε ή ηζνθξαηηθή) αλ ε εθαξκνγή ηνπ δηαιχκαηνο γίλεηαη παξνπζία πςειήο ζπγθέληξσζεο ηνπ 1.9.4 Τγξή ρξσκαηνγξαθία πςειήο πίεζεο (HPLC) Ζ πγξή ρξσκαηνγξαθία πςειήο απφδνζεο ή πςειήο πίεζεο (High Performance or High Pressure Liquid Chromatography) βξίζθεη πνιιέο εθαξκνγέο ζην δηαρσξηζκφ βηνινγηθψλ κνξίσλ. ε ζχγθξηζε κε ηηο ζπκβαηηθέο ζηήιεο ρξσκαηνγξαθίαο ν ρξφλνο κπνξεί λα κεησζεί απφ εκέξεο ή εβδνκάδεο ζε ψξεο. Οη ηερληθέο ηεο HPLC είλαη ηδηαίηεξα ρξήζηκεο ζε πεξηπηψζεηο κηθξψλ πνζνηήησλ δείγκαηνο θαη ν δηαρσξηζκφο πνπ επηηπγράλεηαη κπνξεί λα εθαξκνζζεί θαη ζε παξαζθεπαζηηθή θιίκαθα. Σα πγξά δείγκαηα εηζάγνληαη κέζα ζηε ζηήιε δηακέζνπ ελφο δηαθξάγκαηνο, ην νπνίν βξίζθεηαη ζηελ είζνδν ηνπ νξγάλνπ, θαη ζε φγθνπο 20κι κε κηα κηθξνζχξηγγα. Ύζηεξα απφ ηελ έγρπζε ηνπ δείγκαηνο ηα ζπζηαηηθά πνπ δελ αιιειεπηδξνχλ κε ηε ζηάζηκε θάζε εθινχνληαη ηε ρξνληθή ζηηγκή t 0 ζην λεθξφ φγθν V 0. Ο ρξφλνο απηφο αληηπξνζσπεχεη ην ζχλνιν ηνπ δηαζέζηκνπ φγθνπ κεηαμχ ησλ ζσκαηηδίσλ ηεο ζηάζηκεο θάζεο θαη ηνπ πξνζβάζηκνπ φγθνπ εληφο ησλ ζσκαηηδηαθψλ πφξσλ. Ο ρξφλνο θαηαθξάηεζεο ηνπ δείγκαηνο (t r ) είλαη ν ρξφλνο απφ ηελ έγρπζε κέρξη ηε ζηηγκή ηεο κέγηζηεο ζπγθέληξσζεο ζηελ θνξπθή ηεο δψλεο. Ο φγθνο θαηαθξάηεζεο είλαη ν φγθνο ηνπ δηαιχηε πνπ απαηηείηαη γηα λα εθινπζζεί ε δηαιπκέλε νπζία, φπσο απηφο κεηξάηαη απφ ην θέληξν ηεο ρξσκαηνγξαθηθήο δψλεο. Σν t r θαη ην V r ζπζρεηίδνληαη κε ηε ζρέζε: V R = t r x f Όπνπ ην f αληηπξννζσπεχεη ην ξπζκφ ξνήο. Ζ απφδνζε ηεο ρξσκαηνγξαθηθήο ζηήιεο θαζνξίδεηαη απφ ηνλ αξηζκφ ησλ ζεσξεηηθψλ πιαθψλ (Ν) κε ηηο νπνίεο ε ζηήιε είλαη ηζνδχλακε θαη ηζρχεη: Ν = (t r /ζ)² φπνπ ε παξάκεηξνο ζ αληηπξνζσπεχεη ηελ απφθιηζε απφ θαηαλνκή Gauss. 29

Γηα ην δηαρσξηζκφ κηγκάησλ πξσηετλψλ κε HPLC κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ αξθεηέο ηερληθέο. 1.9.5 Υξσκαηνγξαθία αλάζηξνθεο θάζεο (RPC) ηε ρξσκαηνγξαθία αλάζηξνθεο θάζεο ε ζηαζεξή θάζε είλαη ιηγφηεξν πνιηθή απφ ηελ θηλεηή θάζε. Οη ειθηηθέο δπλάκεηο κεηαμχ ησλ δχν θάζεσλ είλαη ζηελ πεξίπησζε απηή επηθξαηέζηεξεο κε απνηέιεζκα ε δέζκεπζε ησλ πξσηετλψλ ή ακηλνμέσλ ζην πιηθφ ηεο ζηήιεο κε πδξφθνβεο αιιειεπηδξάζεηο λα είλαη ηζρπξή. Ζ ζηαζεξή θάζε ζπλήζσο απνηειείηαη απφ πιηθφ πάλσ ζην νπνίν έρνπλ δεζκεπζεί αιπζίδεο αιθπιίσλ (κε 4,8,18 άηνκα άλζξαθα). Ζ θηλεηή θάζε απνηειείηαη απφ ηνλ πδαηηθφ δηαιχηε TFA θαη ηνλ νξγαληθφ δηαιχηε αθεηνληηξίιην. Ζ ρξήζε πηεηηθψλ δηαιπκάησλ πνπ δελ απνξξνθνχλ ζηελ πεξηνρή ηνπ ππεξηψδνπο επηηξέπεη ηελ αλίρλεπζε ησλ εθινπφκελσλ ζπζηαηηθψλ ζηα 220nm φπνπ ε επαηζζεζία είλαη πςειή. Σν φλνκα αλάζηξνθε θάζε πξνθχπηεη απφ ηε ρξσκαηνγξαθία κηθξψλ κνξίσλ. ηε ρξσκαηνγξαθία νκαιήο θάζεο πεξηιακβάλεηαη ε ρξήζε ελφο πδξνθηιηθνχ (πνιηθνχ) πιηθνχ, φπσο silica θαη ε ρξήζε ελφο πδξφθνβνπ νξγαληθνχ δηαιχηε. ηελ αλάζηξνθεο θάζεο ην πιηθφ ηεο ζηήιεο είλαη πδξφθνβν θαη ν δηαιχηεο είλαη πνιηθφο, θπξίσο πδαηηθφο. Σε κεγαιχηεξε εθαξκνγή ηεο ε RP-HPLC ηε βξίζθεη θπξίσο δηαρσξηζκφ πεπηηδίσλ. 1.9.6 Υξσκαηνγξαθία αγρηζηείαο Ζ ρξσκαηνγξαθία αγρηζηείαο πεξηιακβάλεη ηε ρξήζε ελφο αθηλεηνπνηεκέλνπ θπζηθνχ ligand, ην νπνίν αιιειεπηδξά εμεηδηθεπκέλα κε ηελ επηζπκεηή πξσηεΐλε. Σν ligand αθηλεηνπνηείηαη ζην πιηθφ ηεο ζηήιεο θαη θαζψο ην πξσηετληθφ δηάιπκα πεξλά απφ ηε ζηήιε δεζκεχεηαη εμεηδηθεπκέλα ε πξσηεΐλε ηνπ ελδηαθέξνληνο ελψ νη ππφινηπεο εμέξρνληαη απφ ηε ζηήιε. Οη ηερληθέο απηέο γεληθά ρξεζηκνπνηνχλ αιιειεπηδξάζεηο βηνεμεηδίθεπζεο, φπσο επίζεο θαη γεληθφηεξα ηελ έλλνηα ηεο έιμεο. Δπνκέλσο ρξεζηκνπνηείηαη ε ρξσκαηνγξαθία αγρηζηείαο κε ρξσζηηθέο, αθηλεηνπνηεκέλα κέηαιια, ζπλαξκφηεο, πνιιαπιψλ δξάζεσλ, ηα νπνία αιιειεπηδξνχλ απνθιεηζηηθά κε ηε θπζηθή ζέζε δέζκεπζεο ηνπ θπζηθνχ ζπλαξκνζηήο. Τπάξρνπλ επίζεο θαη νη πεξηπηψζεηο ηεο ςεπδναγρηζηείαο θαη ε βηνκηκεηηθή, νη νπνίεο πεξηιακβάλνπλ αιιειεπηδξάζεηο ζην ζεκείν δέζκεπζεο ηεο πξσηεΐλεο, κε έλα κε θπζηθφ ζπζηαηηθφ. Σα πεξηζζφηεξα πιηθά γηα ηηο ξαθηθέο ζηήιεο αγρηζηείαο βαζίδνληαη ζηελ αγαξφδε, ππάξρνπλ φκσο θαη θάπνηα άιια ζπλζεηηθά νξγαληθά θαη αλφξγαλα πιηθά. Σα νινθιεξσκέλα πιηθά κε δεζκεπκέλα ηα ligands είλαη ζπλήζσο δηαζέζηκα εκπνξηθά, αλ θαη πνιιέο θνξέο ρξεηάδεηαη ν εξεπλεηήο λα δεζκεχζεη ν 30

ίδηνο ην θαηάιιειν ligand ζην πνιπκεξηθφ πιηθφ ηεο ζηήιε. Ηδηαίηεξε πξνζνρή ιακβάλεηαη ψζηε ε νκνηνπνιηθή δέζκεπζε ηνπ ligand κε ην βξαρίνλα λα γίλεη κε ηέηνην ηξφπν πνπ λα βνεζά ηελ πξσηεΐλε δεζκεπζεί, ν βξαρίνλαο λα έρεη ην θαηάιιειν κήθνο, νη κε εμεηδηθεπκέλεο αιιειεπηδξάζεηο λα κεηψλνληαη θαη λα κελ εκπνδίδνπλ Δθηφο απφ ηα πιηθά πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη εμ νινθιήξνπ γηα ρξσκαηνγξαθία αγρηζηείαο, ρξεζηκνπνηνχληαη θαη ζπλδπαζκέλα πιηθά αγρηζηείαο θαη ηνληθήο αληαιιαγήο. Ζ έθινπζε ησλ πξσηετλψλ κπνξεί λα γίλεη κε ηε ρξήζε ελφο ειεχζεξνπ ζπλαξκνζηή ζην ξπζκηζηηθφ δηάιπκα ην νπνίν ζα απνδεζκεχζεη ζηαδηαθά ηελ πξσηεΐλε, κε αχμεζε ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ άιαηνο, κε εηζαγσγή ελφο παξάγνληα πνπ κεηψλεη ηελ επηθαλεηαθή ηάζε ψζηε λα κεησζνχλ νη πδξφθνβεο αιιειεπηδξάζεηο, φπσο ην απνξξππαληηθφ Triton X-100, ε αηζπιελν-γιπθφιε, ε ηζνπξνπαλφιε, κε ρανηξνπηθνχο παξάγνληεο, κε νπξία, κε αιιαγή ηνπ ph, κε αχμεζε ηεο ζεξκνθξαζίαο. 1.9.7 Αλνζνπξνζξνθεηέο θαη πξσηεΐλε A/G Ζ βηνηερλνινγία ησλ αληηζσκάησλ απνηειεί πιένλ ζεκαληηθφ εξγαιείν γηα δηαγλσζηηθέο θαη θιηληθέο κειέηεο θαη ζηελ έξεπλα. ρεκαηίδνληαη πνιπκεξηθά πιηθά ζηήιεο ηα νπνία κπνξνχλ λα δεζκεχζνπλ ην αληίζσκα ηεο πξσηεΐλεο ηνπ ελδηαθέξνληνο ζηελ πεξίπησζε πνπ επηζπκείηαη ν θαζαξηζκφο ηεο πξσηεΐλεο απηήο απφ έλα πξσηετληθφ εθρχιηζκα. Δπίζεο είλαη δπλαηφ λα δεζκεπζνχλ ζηε ζηήιε πξσηεΐλεο θπξίσο απφ Streptococcus sp. πνπ αληηδξνχλ ηζρπξά θαη εμεηδηθεπκέλα κε ηηο αλνζνγινβίλεο, γηα ηνλ θαζαξηζκφ αληηζσκάησλ. Ζ πξσηεΐλε Α, ε νπνία δεζκεχεη κφξηα αλνζνγινβίλεο IgG, είλαη ε πεξηζζφηεξν ρξεζηκνπνηνχκελε πξσηεΐλε. Ζ πξσηεΐλε G πνπ δεζκεχεη, επίζεο, ηελ IgG είλαη θαιχηεξε γηα ζπγθεθξηκέλα κφξηα IgG θαη γηα ηηο αλνζνγινβνπιίλεο απφ κεγαιχηεξα δψα. 1.9.8 Υξσκαηνγξαθία Μνξηαθήο Γηήζεζεο Ζ ρξσκαηνγξαθία κνξηαθήο δηήζεζεο (Porath and Flodin, 1959) κηα ηερληθή πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηνλ θαζαξηζκφ ησλ πξσηετλψλ κε βάζε ην κνξηαθφ ηνπο βάξνο. Μηα ζηήιε θαηάιιειεο δηακέηξνπ ε νπνία πνηθίιεη αλάινγα κε ηνλ ηχπν ηνπ δηαρσξηζκνχ πνπ είλαη επηζπκεηφο θαη ηελ capacity ηνπ πιηθνχ πάθησζεο πνπ ρξεζηκνπνηείηαη ζε θάζε αλάιπζε, παθηψλεηαη κε ην πνιπκεξηθφ πιηθφ ηεο ζηαηηθήο θάζεο ην νπνίν απνηειείηαη απφ ζσκαηίδηα κε πφξνπο δηαθφξσλ κεγεζψλ. Ζ ζηήιε εθνδηάδεηαη κε θαηάιιειν δηαιχηε/εθινπζηηθφ, ν νπνίνο φρη 31

κφλν γεκίδεη ηνπο πφξνπο αιιά θαη ηνλ ελδηάκεζν θελφ ρψξν κεηαμχ ησλ ζσκαηηδίσλ ηεο ζηαηηθήο θάζεο. Σν δείγκα δηαιπηνπνηείηαη ζηνλ ίδην δηαιχηε θαη εθαξκφδεηαη ζηε ζηήιε, ελψ ν δηαιχηεο/εθινπζηηθφ δηαπεξλά κε ζηαζεξφ ζπλερφκελν ξπζκφ ηε ζηήιε. Ζ ξνή ηνπ δηαιχηε είλαη θαζνξηζκέλε γηα θάζε δηαρσξηζκφ θαη είδνο ηνπ δείγκαηνο πξνο αλάιπζε, ε ηξνπνπνίεζε ηεο νπνίαο νδεγεί ζε δηαθνξεηηθφ δηαρσξηζκφ ηνπ δείγκαηνο, φρη κφλν σο πξνο ην ρξφλν θαηαθξάηεζεο ζηε ζηήιε, φζν θαη σο πξνο ηε δηαρσξηζηηθή ηθαλφηεηα θαη ηειηθή απφδνζε δηαρσξηζκνχ ηεο ζηήιεο. Σα κηθξά κφξηα ηεο δηαιπηήο νπζίαο/πξσηεΐλεο εηζέξρνληαη κέζα ζηνπο πφξνπο ηεο πεθηήο θαη ην πιέγκα πνπ δεκηνπξγείηαη απφ ηα ζσκαηίδηα, ηα ελδηάκεζα ζσκαηίδηα ηνπ δείγκαηνο δελ κπνξνχλ λα εηζέιζνπλ ζηνπο κηθξφηεξνπο πφξνπο, ελψ ηα κεγάια δε κπνξνχλ λα εηζέιζνπλ κέζα ζην πιέγκα θαζφινπ. Απνηέιεζκα ησλ παξαπάλσ δηαδηθαζηψλ είλαη ηα κεγάια ζπζηαηηθά λα κε κπνξνχλ λα θξαηεζνχλ απφ ην πιηθφ ηεο ζηήιεο θαη λα εμέξρνληαη απφ ηε ζηήιε ζρεδφλ ακέζσο κεηά ηελ εθαξκνγή ηνπ δείγκαηνο, θαζψο ε ξνή ηνπ εθινπζηηθνχ εμαθνινπζεί, αθνινπζνχλ ηα κεζαία θαη ζην ηέινο εθινχνληαη απφ ηε ζηήιε ηα κηθξφηεξα ζπζηαηηθά, θαζψο έρνπλ λα δηαλχζνπλ κεγαιχηεξν απνηειεζκαηηθφ κήθνο ηξνρηάο, ζρήκα 9.8.1. ρήκα 9.8.1 Υξσκαηνγξαθία Μνξηαθήο Γηήζεζεο 32

Μηα πνηθηιία απφ πεθηέο έρεη ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηε GPC θαη ζπλήζσο είλαη πνιπκεξηθά πιηθά κε δηαθνξεηηθά βαζκφ ζηαπξνζχλδεζεο. Δθηφο απφ ην κέγεζνο ησλ πφξσλ θα επνκέλσο ηε δηαπεξαηφηεηα ηεο πεθηήο έλα άιιν ζεκαληηθφ ραξαθηεξηζηηθφ είλαη ε ζθιεξφηεηα ηεο πεθηήο. Σα πνιχ καιαθά πιηθά ηείλνπλ λα θξάδνπλ ηηο ζηήιεο. Οη πήθηεο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζε πδαηηθά ζπζηήκαηα δηαθξίλνληαη ζε δχν ηάμεηο: Έλαο αξηζκφο ζηαπξνζπλδεδεκέλσλ δεμηξαλψλ, πνπ είλαη γλσζηέο κε ην εκπνξηθφ φλνκα Sephadex, παξαζθεπάδνληαη απφ ηελ εηαηξία Α.Β Pharmacia ζηε νπεδία. Οη πεθηέο Sephadex δηαζέηνπλ πνηθηιία ζηαπξνζχλδεζεο θαη επνκέλσο δηαπεξαηφηεηαο. Πήθηεο πνιπαθξπιακηδίνπ, γλσζηέο εκπνξηθά σο Bio-Gel P, παξαζθεπάδνληαη απφ ηελ εηαηξία BioRad Laboratories, ζηελ Καιηθφξληα. Δπηηξέπνπλ ην δηαρσξηζκφ θαη ηελ ηαπηνπνίεζε ζε ζρεηηθά κεγάια κνξηαθά βάξε. Οη πήθηεο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζηελ πεξίπησζε νξγαληθψλ δηαιπηψλ είλαη θπξίσο, δηαζηαπξσκέλα πνιπζηπξέληα Οη ζηήιεο πξέπεη λα κελ αληηδξνχλ θαη ην αηζάιη είλαη ην ζπρλφηεξα ρξεζηκνπνηνχκελν πιηθφ. Ο λεθξφο φγθνο πξέπεη λα είλαη φζν ην δπλαηφ κηθξφηεξνο θαη απηφ απαηηεί πνιχ θαιή πάθησζε ηεο ζηήιεο. Ζ δηαρσξηζηηθή ηθαλφηεηα απμάλεηαη κε ηελ αχμεζε ηνπ κήθνπο ηεο ζηήιεο θαη ζπλήζσο ηα κεγέζε ησλ ζηειψλ θπκαίλνληαη κεηαμχ 1-12 ft. Ο δηαιχηεο πξέπεη λα είλαη ν θαηάιιεινο γηα ηε δηαιπηνπνίεζε ηεο πξσηεΐλεο θαη επηπξφζζεηα, λα είλαη ρεκηθά ζηαζεξφο, θαηάιιεινο γηα ηε ζπλνιηθή δηάηαμε θαη λα επηηξέπεη ηελ αλάθηεζε ηνπ δείγκαηνο απφ ηα θιάζκαηα έθινπζεο. Σν κέγεζνο ηνπ δείγκαηνο επηιέγεηαη λα είλαη φζν ην δπλαηφ πην κηθξφ. Όζν πην κηθξφ ην κέγεζνο ηνπ δείγκαηνο, ηφζν πην θαιή ε δηαρσξηζηηθή ηθαλφηεηα. Σν πξσηετληθφ δηάιπκα εθαξκφδεηαη ζηε ζηήιε φζν ην δπλαηφ πην θνληά ζηελ θεθαιή ηεο γηα λα απνθεπρζεί ε κείσζε ηεο δηαρσξηζηηθήο ηθαλφηεηαο. Ζ ξχζκηζε πξαγκαηνπνηείηαη κε θαζνξηζκέλα δείγκαηα δηαιπηψλ πξσηετλψλ ζε θαηάιιειν δηαιχηε νη νπνίεο έρνπλ θαζνξηζκέλν κνξηαθφ βάξνο θαη εθινχνληαη απφ ηε ζηήιε ζε γλσζηέο ρξνληθέο ζηηγκέο. Απφ ηνπο ρξφλνπο θαηαθξάηεζεο ησλ δεηγκάησλ απηψλ θαη ηα γλσζηά κνξηαθά ηνπο βάξε έρνπλ ζρεκαηηζζεί δηαγξάκκαηα, πνπ ζπλδένπλ ην ρξφλν θαηαθξάηεζεο γηα δεδνκέλν δηαιχηε, ξνή, πίεζε θαη ζεξκνθξαζία κε ην κνξηαθφ βάξνο φπσο παξνπζηάδεηαη ζην ζρήκα κε ην κήθνο ηεο αιπζίδαο, κε απνηέιεζκα λα κπνξεί λα ππνινγηζζεί ην κνξηαθφ βάξνο ησλ πξσηετλψλ ζε πεξίπησζε πνπ εθαξκφδεηαη ζηε ζηήιε κίγκα πξσηετληθψλ κνξίσλ πνπ αλαιχνληαη. 33

1.10 Καζαξηζκόο αλαζπλδπαζκέλσλ πξσηετλώλ (Porath 1992) Ο θαζαξηζκφο πξσηετλψλ απφ κεηαζρεκαηηζκέλα θχηηαξα έρεη γίλεη έλα πνιχ θαιφ εξγαιείν κηα θαη ζήκεξα ν θαζαξηζκφο αλαζπλδπαζκέλσλ πξσηετλψλ είλαη ηφζν θνηλφο φζν θαη ν θαζαξηζκφο απφ θπζηθέο πεγέο. Ζ δηαδηθαζία πεξηιακβάλεη πνιιά θαη δχζθνια ζηάδηα αιιά ηα ζεκαληηθά ζεκεία πνπ πξέπεη λα ιεθζνχλ ππ φςηλ είλαη ηα εμήο: 1. Απνκφλσζε ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ γνληδίνπ ή cdna. 2. Έθθξαζε ηεο επηζπκεηήο πξσηεΐλεο ζε πςειά επίπεδα (κεγάινο αξηζκφο πιαζκηδίσλ, ηζρπξνί πξναγσγείο, επαγψγηκε έθθξαζε) 3. Καηαιιειφηεηα ηεο δηαδηθαζίαο θαζαξηζκνχ απφ ηα αλαζπλδπαζκέλα θχηηαξα. Μηα αλαζπλδπαζκέλε πξσηεΐλε πνπ εθθξάδεηαη ζε αλαζπλδπαζκέλα θχηηαξα μεληζηέο είλαη ζπλήζσο είηε εμσθπηηάξηα πξσηεΐλε ή κεκβξαληθή πξσηεΐλε ή ελδνθπηηάξηα πξσηεΐλε ή ζπληίζεηαη κε ηε κνξθή ζσκαηηδίσλ εγθιεηζκνχ. Ο θαζαξηζκφο αλαζπλδπαζκέλσλ πξσηετλψλ πξνζθέξεη πνιιά πιενλεθηήκαηα, θαζψο είλαη δπλαηφ λα απμεζεί ην επίπεδν ηεο πξσηεΐλεο ζην αξρηθφ εγρχιηζκα. Δπηπιένλ, νη ηερληθέο γηα ηνλ θαζαξηζκφ αλεπηζχκεησλ πξσηετλψλ είλαη θπξίσο νη ίδηεο κε απηέο πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη ζηηο ζπκβαηηθέο κεζφδνπο θαζαξηζκνχ. Γπζηπρψο, νη αλαζπλδπαζκέλεο πξσηεΐλεο δελ παξάγνληαη ζε δξαζηηθή κνξθή. Οη ππεξθθξαζκέλεο επθαξπσηηθέο θαη πξνθαξπσηηθέο κε δηαιπηέο πξσηεΐλεο, ηα ζσκαηίδηα εγθιεηζκνχ, κπνξνχλ λα εθρπιηζζνχλ κε ηε ρξήζε ηζρπξψλ ρανηξνπηθψλ αληηδξαζηεξίσλ, φπσο 6 Μ νπξίαο ή 8 Μ πδξνρισξηθήο γνπαληδίλεο, θαη ζηε ζπλέρεηα λα επαλαδηαηαθηνχλ ζσζηά θαηά ηε δηάξθεηα ή κεηά ηελ απνκάθξπλζε ηνπ κεηνπζησηηθνχ παξάγνληα. Δπίζεο, είλαη δπλαηφ λα θαζαξηζηνχλ πξσηεΐλεο απφ ηα ζσκαηίδηα εγθιεηζκνχ κε άκεζε πξνζζήθε ξεηηλψλ αγρηζηείαο, ρσξίο ηα ζηάδηα ηεο κεηνπζίσζεο θαη ηεο επαλαδηάηαμεο. Σα πξνβιήκαηα κε ηνλ θαζαξηζκφ πξσηετλψλ απφ ζσκαηίδηα εγθιεηζκνχ είλαη ηα εμήο: Α) Σα κεηνπζησηηθά είλαη δχζθνια ζηε ρξήζε ηνπο θαη κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ κε αληηζηξεπηή ηξνπνπνίεζε ηεο πξσηετληθήο δνκήο. Β) Ζ επαλαδηάηαμε πξέπεη λα γίλεηαη ζε πνιχ αξαηά δηαιχκαηα θαη θαηφπηλ λα γίλεηαη ζπκπχθλσζε ηεο πξσηεΐλεο. Σν ζηάδην ηεο ζπκπχθλσζεο παξεκπνδίδεηαη απφ ηελ πξσηεφιπζε θαη ηελ παξαπέξα θαηαθξήκληζε ηεο πξσηεΐλεο. Ζ δεκηνπξγία πξσηετλψλ ζχληεμεο απνηειεί κηα λέα ηερληθή θαη έρεη ηδηαίηεξα αλαπηπρζεί. χκθσλα κε ηε κέζνδν απηή, πξηλ πξνρσξήζνπκε ζηελ θισλνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ, ζπλδένπκε ην επηζπκεηφ γνλίδην είηε κε ην γνλίδην κηαο πξσηεΐλεο, 34

ηελ νπνία κπνξνχκε εχθνια λα απνκνλψζνπκε (ζπλήζσο ζε έλα ζηάδην) ή κε έλα ηερλεηφ νιηγνλνπθιενηίδην ην νπνίν θσδηθεχεη ηε ζχλζεζε κηαο αιιεινπρίαο φκνησλ ακηλνμέσλ π.ρ ηζηηδίλεο, αξγηλίλεο, θ.α. Σα πιενλεθηήκαηα απηήο ηεο κεζφδνπ είλαη: Βειηησκέλε ζηαζεξφηεηα ηεο πξσηεΐλεο Βειηίσζε ησ ηδηνηήησλ ηεο πξσηεΐλεο πνπ επηηξέπνπλ ηελ απνκφλσζε ηεο απφ ην εθρχιηζκα ηεο θαιιηέξγεηαο Γξεγνξφηεξε απνκφλσζε Υξήζε ηεο πξσηεΐλεο απφ βηνηερλνινγηθέο βηνκεραλίεο πνπ παξάγνπλ είηε έλδπκα ζε κεγάιεο πνζφηεηεο ή πςειήο θαζαξφηεηαο θαξκαθεπηηθέο νπζίεο. Ζ θαηαζθεπή κηαο πξσηεΐλεο ζχληεμεο ρξεζηκεχεη ηδηαίηεξα ζηηο πεξηπηψζεηο εθείλεο θαηά ηηο νπνίεο είηε ην επίπεδν έθθξαζεο ηεο επηζπκεηήο πξσηεΐλεο είλαη ρακειφ ή ε δηαδηθαζία θαζαξηζκνχ δε δίλεη θαιά απνηειέζκαηα. Πξσηεΐλεο πνπ επηιέγνληαη γηα ζχληεμε κε ηα επηζπκεηά γνλίδηα είλαη θαηά θαλφλα εθείλεο νη νπνίεο αλαγλσξίδνληαη απφ πνιχ εμεηδηθεπκέλνπο ζπλαξκνζηέο / πξνζδέηεο (ligands), έηζη ψζηε λα κπνξνχλ λα απνκνλσζνχλ εχθνια κε ρξσκαηνγξαθηθέο ζηήιεο αγρηζηείαο ζηηο νπνίεο έρεη πξνζδεζεί ν ζπλαξκνζηήο. αλ παξάδεηγκα πξσηεΐλεο ζχληεμεο κπνξεί λα αλαθεξζεί ην έλδπκν ηξαλζθεξάζε ηεο γινπηαζεηφλεο. Όηαλ ζπληερζεί ην γνλίδην ηεο ηξαλζθεξάζεο κε ην επηζπκεηφ γνλίδην, παξάγεηαη κηα πξσηεΐλε πνπ ζην έλα ηεο άθξν έρεη ηελ επηζπκεηή πξσηεΐλε θαη ζην άιιν ηελ ηξαλζθεξάζε ηεο γινπηαζεηφλεο. Αλ ην εθρχιηζκα ησλ θπηηάξσλ πνπ πεξηέρνπλ ηε λέα απηή πξσηεΐλε εθαξκνζζεί ζε κηα ζηήιε αγρηζηείαο πνπ σο πξνζδέηεο έρεη γινπηαζεηφλε, ηφηε ε κφλε πξσηεΐλε πνπ ζα πξνζξνθεζεί ζηε ζηήιε ζα είλαη ε λέα πξσηεΐλε ζχληεμεο πνπ πεξηέρεη ηελ ηξαλζθεξάζε. Σέινο, ε απνκάθξπλζε ηνπ ηκήκαηνο ζχληεμεο κπνξεί λα επηηεπρζεί κε πξσηενιπηηθά έλδπκα (π.ρ. θαξβνμππεπηηδάζε Β) απειεπζεξψλνληαο έηζη ηε θπζηθή πξσηεΐλε. Μηα άιιε πεξίπησζε είλαη εθείλε θαηά ηελ νπνία ζπλδένπκε ηελ επηζπκεηή πξσηεΐλε κε κηα αιιεινπρία 6 ή 10 ηζηηδηλψλ (νχξα ηζηηδηλψλ). Αλ εθαξκνζζεί κηα ηέηνηα πξσηεΐλε ζε ζηήιε αγρηζηείαο πνπ γηα πξνζδέηε έρεη ληθέιην, δεζκεχεηαη ζηε ζηήιε κφλν ε πξσηεΐλε κε ηελ νπξά ηζηηδηλψλ, ιφγσ ηεο κεγάιεο αγρηζηείαο ηεο ηζηηδίλεο κε ην ληθέιην. 35

1.11.1 Ζιεθξνθόξεζε Ζιεθηξνθφξεζε (Laemmli, 1970) είλαη ε δηαδηθαζία θαηά ηελ νπνία θνξηηζκέλα κφξηα, φπσο DNA θαη πξσηεΐλεο θηλνχληαη ζε ειεθηξηθά πεδία κέζα ζε δηαιχκαηα ή πεθηέο. Υξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ ηαπηνπνίεζε θαη ην δηαρσξηζκφ φισλ ησλ βηνινγηθψλ κνξίσλ. εκαληηθή εθαξκνγή έρεη θαηά ηνλ θαζαξηζκφ πξσηετλψλ. Δάλ έλα κφξην κε θνξηίν q ηνπνζεηείηαη ζε ειεθηξηθφ πεδίν, εθαξκφδεηαη δχλακε πνπ εμαξηάηαη απφ ην θνξηίν ηνπ κνξίνπ θαη ηελ ηζρχ ηνπ πεδίνπ: F=(E/d/)q φπνπ Δ: είλαη ε δηαθνξά δπλακηθνχ κεηαμχ ησλ ειεθηξνδίσλ θαη d ε απφζηαζε αλάκεζα ηνπο. Ο ιφγνο E/d ζπλήζσο αλαθέξεηαη σο δπλακηθφ ηνπ πεδίνπ. Ζ δχλακε F φπσο εθθξάδεηαη απφ ηελ εμίζσζε ηνπ Stokes, εμαξηάηαη απφ ην κέγεζνο θαη ην ζρήκα ηνπ κνξίνπ θαη ην ημψδεο δηακέζνπ ηνπ νπνίνπ θηλνχληαη ηα κφξηα: F=6πrnπ φπνπ r :είλαη ε αθηίλα ηνπ ζθαηξηθνχ κνξίνπ, n: ην ημψδεο π: ε ηαρχηεηα κε ηελ νπνία θηλνχληαη ηα κφξηα πλεπψο ηζρχεη: Δ/d=6πrnπ π=eq/6dπrn πνπ δείρλεη φηη ε ηαρχηεηα ησλ κνξίσλ είλαη αλάινγε ηεο ηάζεο θαη ηνπ θνξηίνπ ησλ κνξίσλ θαη αληηζηξφθσο αλάινγε ηνπ κεγέζνπο ηνπ κνξίνπ θαη ηνπ ημψδνπο ηνπ δηαιχκαηνο. Δθφζνλ θάζε κφξην αλακέλεηαη λα έρεη ραξαθηεξηζηηθφ κέγεζνο θαη θνξηίν, κεηαλαζηεχεη ζε ζπγθεθξηκέλε ζέζε κέζα ζην ειεθηξηθφ πεδίν γηα δεδνκέλν ρξφλν. 36

ρήκα 11.1 Ζιεθξνθφξεζε 1.11.2 Με ζπλερήο ειεθηξνθόξεζε Ζ ειεθηξνθφξεζε κπνξεί λα γίλεη ζε δχν εηδψλ ζπζθεπέο. Δίηε ζε ζπζθεπή κε θπιηλδξηθνχο ζσιήλεο είηε ζε ζπζθεπή κε επίπεδεο γπάιηλεο πιάθεο. Ο πνιπκεξηζκφο ησλ πεθηψλ γίλεηαη ζε θπιηλδξηθνχο ζσιήλεο. Ζ ζχζηαζε ηνπ δηαιχκαηνο πξηλ ηνλ πνιπκεξηζκφ είλαη 10% w/v δηζαθξπιακίδην. 0.35 Μ Tris- HCL Ph 8.9. Ο πνιπκεξηζκφο γίλεηαη κε ηελ πξνζζήθε ζε ηειηθή ζπγθέληξσζε 0.023% v/v TEMED 0.07% w/v ππεξζεηηθφ ακκψλην. Σν δηάιπκα φζν είλαη αθφκα ζε πγξή κνξθή ηνπνζεηείηαη κεηαμχ ησλ δχν γπάιηλσλ πιαθψλ (πεθηή δηαρσξηζκνχ). ην επάλσ κέξνο ηεο πεθηήο απηήο ηνπνζεηείηαη άιιε πεθηή κε δηαθνξεηηθή ζχζηαζε πνπ νλνκάδεηαη πεθηή επηζηνίβαμεο. Ζ ζχζηαζε ηεο είλαη 4.5% w/v αθξπιακίδην, 0.21% w/v δηο-αθξπιακίδην, 0.125 Μ Tris-HCL ph 6.7. Ο πνιπκεξηζκφο ηνπ λένπ δηαιχκαηνο πξαγκαηνπνηείηαη κε ηελ πξνζζήθε TEMED θαη ππεξζεηηθνχ ακκσλίνπ ζηηο ίδηεο ζπγθεληξψζεηο θαη ζρεκαηίδεηαη πεθηή χςνπο 1cm πεξίπνπ. Ζ ζχζηαζε ηνπ δηαιχκαηνο ησλ πξσηετλψλ πνπ ζα ειεθηξνθνξεζνχλ είλαη 25mM Tris-HCL ph 8.3 θαη πεξηέρεη επηπιένλ, 20% v/v γιπθεξίλε θαη 0.02% w/v θπαλνχ ηεο βξσκνθαηλφιεο. Ζ ζχζηαζε ηνπ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο ειεθηξνθφξεζεο είλαη πεξίπνπ 190 mm γιπθίλε, 0.05 mm EDTA, 5 Mm β- κεξθαπηναηζαλφιε, 25 mm Tris-HCL Ph 8.3. Ζ ειεθηξνθφξεζε αξρίδεη κε ξεχκα έληαζεο 0.5 ma/πεθηή. Μεηά απφ 20 ιεπηά αλεβαίλεη ζηα 3 ma/πεθηή. Ζ ειεθηξνθφξεζε ζπλερίδεηαη κέρξηο φηνπ ε ρξσζηηθή θηάζεη ζηελ έμνδν ηεο πεθηήο. 37

Αξρηθά ηα αληφληα ηεο γιπθίλεο θηλνχληαη κέζα ζην δείγκα θαη ζηελ πεθηή επηζηνίβαμεο. Σα αληφληα ηεο γιπθίλεο αληηδξνχλ κε ην ξπζκηζηηθφ δηάιπκα Tris- HCl ρακειφηεξνπ ph θαη ηηηινδνηνχληαη. Ζ ηηηινδφηεζε απηή κεηψλεη ην κέζν αξλεηηθφ θνξηίν ησλ αληφλησλ θαη ηνπο πξνζδίδεη κηθξφηεξε θηλεηηθφηεηα. Αληίζεηα, ζην ph 6.9 νη πεξηζζφηεξεο πξσηεΐλεο κεηαθέξνπλ αξθεηά κεγάιν αξλεηηθφ θνξηίν, ψζηε λα ππεξπεδνχλ ηηο δπλάκεηο ηξηβήο θαη λα παξνπζηάδνπλ κεγαιχηεξε θηλεηηθφηεηα απφ ηα αληφληα γιπθίλεο. Με ηνλ ηξφπν απηφ πξαγκαηνπνηείηαη ε ζπζζψξεπζε ησλ πξσηετλψλ πην κπξνζηά απφ ηα ηφληα γιπθίλεο. Οη πξσηεΐλεο θαζψο εηζέξρνληαη ζηελ πεθηή δηαρσξηζκνχ ηηηινδνηνχληαη ζε ph 8.9 θαη πξνθαιείηαη πζηέξεζε ζηελ θηλεηηθφηεηα ηνπο ιφγσ ηξηβψλ, πνπ έρεη σο απνηέιεζκα θάζε πξσηεΐλε λα κεηαηνπίδεηαη αλάινγα κε ην θνξηίν θαη ην κέγεζνο ηεο ζε ph 8.9. Ο αθξηβήο θαζνξηζκφο ησλ δσλψλ ησλ πξσηετλψλ αληρλεχεηαη κε δηάθνξεο κεζφδνπο βαθήο. Ζ ζχγθξηζε θαη ν ππνινγηζκφο κηαο πξσηεΐλεο ζηελ πεθηή, γίλεηαη αλάινγα κε ην κνξηαθφ ηεο βάξνο, ην νπνίν είλαη γλσζηφ απφ ηε βηβιηνγξαθία. Καηά ηε δηάξθεηα ηεο αλάπηπμεο ησλ πξσηετλψλ ζηελ πεθηή ρξεζηκνπνηνχληαη θαη εηδηθνί κνξηαθνί κάξηπξεο, νη νπνίνη είλαη γλσζηέο θαη ζπγθεθξηκέλεο πξσηεΐλεο κε απφιπηα γλσζηφ κνξηαθφ βάξνο. Με βάζε ην ζεκείν πάλσ ζηελ πεθηή πνπ βξίζθεηαη ν θάζε έλαο απφ ηνπο κάξηπξεο απηνχο ππνινγίδεηαη ην κνξηαθφ βάξνο ηεο πξσηεΐλεο αλ είλαη ε κνλαδηθή πνπ πεξηέρεηαη ζην αληίζηνηρν δηάιπκα ή φηαλ είλαη γλσζηφ ην κνξηαθφ βάξνο ππνινγίδεηαη πνπ βξίζθεηαη πάλσ ζηελ πεθηή. ρήκα11.2.1 Γηαρσξηζκφο πξσηετλψλ κε ειεθηξνθφξεζε κέζσ κε- ζπλερνχο πεθηή πνπ είλαη ξπζκηδκέλν ζε δηαθνξεηηθά PH 38