ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΟΣΟΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΟΣ ΝΕΟΥ ΔΕΙΚΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΤΟΥ ΔΕΚΑΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΠΡΟΤα(100-109), ΣΤΟ ΠΛΑΣΜΑ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ

1 ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ 2013 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΟΣΟΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΟΣ ΝΕΟΥ ΔΕΙΚΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΤΟΥ ΔΕΚΑΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΠΡΟΤα(100-109), ΣΤΟ ΠΛΑΣΜΑ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Επιστημονικά Υπεύθυνη: Ουρανία Τσιτσιλώνη Επίκουρη Καθηγήτρια Ανοσολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Μέλη Ομάδας: Αναστάσιος Γερμενής, Καθηγητής Ανοσολογίας, Διευθυντής Εργαστηρίου Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Έλενα Τσιτσάμη, Επιστ. Συνεργάτης, Μονάδα Παιδιατρικής Ρευματολογίας, Α Παιδιατρική Κλινική, Νοσοκομείο Παίδων «Αγία Σοφία» Ιωάννης Βουτσάς, Βιολόγος, Ερευνητής-Μεταδιδάκτορας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Πηνελόπη Σαμαρά, Βιολόγος, Υποψήφια διδάκτωρ, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Δεκέμβριος 2013

ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Στόχος μας ήταν η ανάπτυξη ανοσοδοκιμασίας τύπου ELISA, για τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης του δεκαπεπτιδίου προτα(100-109) σε βιολογικά υγρά και συγκεκριμένα στον ορό του αίματος. Αξιολογήσαμε την ανοσοδοκιμασία in vitro (σε κυτταρικές καλλιέργειες), in vivo (σε μοντέλα λοίμωξης σε ποντίκια) και ex vivo (σε δείγματα ορού ασθενών με λοιμώξεις), προκειμένου να προτείνουμε ένα νέο διαγνωστικό προϊόν με προοπτική χρησιμοποίησης στην κλινική πράξη. Τα επίπεδα του προτα(100-109) στον ορό φαίνεται να αποτελούν επικουρικό δείκτη ένδειξης και έγκαιρης διάγνωσης βακτηριακών λοιμώξεων. 2 ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ Η ερευνητική μας ομάδα αποτελείται από τα παρακάτω μέλη: Ουρανία Τσιτσιλώνη, Επίκουρη Καθηγήτρια Ανοσολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών (Συντονίστρια) Συμμετέχοντες: 1) Αναστάσιος Γερμενής, Καθηγητής Ανοσολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, 2) Έλενα Τσιτσάμη, Επιστημονική Συνεργάτης, Υπεύθυνη Μονάδας Παιδιατρικής Ρευματολογίας, Α Παιδιατρική Κλινική, Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία» 3) Ιωάννης Βουτσάς, Βιολόγος, Ερευνητής-Μεταδιδάκτορας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ 4) Πηνελόπη Σαμαρά, Βιολόγος, Υποψήφια διδάκτορας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η προθυμοσίνη α (προτα) είναι πυρηνική πρωτεΐνη απαραίτητη για την κυτταρική ανάπτυξη. Κατά την απόπτωση, θραυσματοποιείται από τις κασπάσες στο D 99. Από τα παραγόμενα θραύσματα, το προτα(1-99) παραμένει στο κυτταρόπλασμα, ενώ το προτα(100-109), που είναι το ανοσοδραστικό κέντρο του πολυπεπτιδίου, εξωκυτταρώνεται με άγνωστο μηχανισμό. Το προτα(100-109) όπως και η προτα δρουν εξωκυτταρικά ως «σήματα κινδύνου», ενισχύοντας τις λειτουργίες των ανοσοκυττάρων. Για να μελετήσουμε την εξωκυτταρικό μηχανισμό δράσης του προτα(100-109), αναπτύξαμε ειδική και ευαίσθητη ELISA για την ποσοτικοποίησή του σε βιολογικά υγρά. Το προτα(100-109) ανιχνεύθηκε σε υπερκείμενα κυτταρικών σειρών και λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών που οδηγήθηκαν in vitro σε απόπτωση. Χρησιμοποιώντας in vivo μοντέλα βακτηριακών λοιμώξεων σε ποντίκια, παρατηρήσαμε ότι η συγκέντρωση του προτα(100-109) στον ορό των ζώων ήταν ελάχιστη πριν τη μόλυνση, και αυξήθηκε ανάλογα με την πορεία και την βαρύτητα της λοίμωξης. Τέλος, μετρήθηκαν τα επίπεδα του προτα(100-109) στον ορό υγιών δοτών, παιδιατρικών ασθενών με αυτοφλεγμονώδη νοσήματα και λοιμώξεις, και σε ασθενείς νοσηλευόμενους σε Μονάδα Εντατικής Θεραπείας. Διαπιστώσαμε ότι η συγκέντρωση του προτα(100-109) στον ορό αυξάνεται σε περιπτώσεις λοίμωξης από βακτήρια, ενώ είναι σταθερά χαμηλή σε άσηπτες φλεγμονές. Επομένως, η μέτρηση του δεκαπεπτιδίου στον ορό, μπορεί να αποτελέσει ένα νέο βιοδείκτη έγκαιρης διάγνωσης βακτηριακών λοιμώξεων και διαφοροδιάγνωσής τους από φλεγμονώδεις καταστάσεις μη λοιμώδους αιτιολογίας. 3

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΠΟΥ ΑΚΟΛΟΥΘΗΘΗΚΕ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από τα παραχθέντα υψηλού τίτλου και συγγένειας πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι του προτα(100-109), απομονώσαμε με χρωματογραφία συγγένειας τις ειδικές για το δεκαπεπτίδιο IgG. Μετά από σειρά πειραμάτων βελτιστοποίησης της δοκιμασίας, αναπτύξαμε, τελικά, ανταγωνιστικού τύπου ανοσοδοκιμασία ELISA, το πρωτόκολλο της οποίας αποτελείται από τα παρακάτω βήματα: (1) μικροπλάκα 96 φρεατίων επιστρώνεται με πρωτεΐνη Α, η οποία προσδένει την σταθερή (Fc) περιοχή των IgG, (2) οι ειδικές για το δεκαπεπτίδιο IgG προεπωάζονται με βιοτινυλιωμένο και ελεύθερο προτα(100-109) προς ανταγωνισμό, (3) το μίγμα που περιέχει τα συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος μοιράζεται στην επιστρωμένη μικροπλάκα και επωάζεται, (4) προστίθεται συζευγμένη με υπεροξειδάση στρεπταβιδίνη και διάλυμα ενζυμικού υποστρώματος ABTS και (5) η οπτική πυκνότητα μετριέται σε φωτόμετρο ELISA στα 405 nm. Η ευαισθησία της αναπτυχθείσας ELISA είναι από 10 μg/ml έως 0,1 ng/ml προτα(100-109), δεν παρουσιάζει χιαστά διασταυρούμενη αντίδραση με άλλες θυμοσίνες ή την BSA, ενώ τα αντισώματα αναγνωρίζουν εξίσου καλά και προσδένουν και την ακέραιη προτα. Με την αναπτυχθείσα ELISA, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του δεκαπεπτιδίου προτα(100-109) in vitro σε υπερκείμενα κυττάρων που οδηγήθηκαν σε κυτταρικό θάνατο, in vivo στον ορό ποντικών μολυσμένων με βακτήρια και ex vivo σε ανθρώπινο ορό από φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Για την επαγωγή κυτταρικού θανάτου (απόπτωσης ή νέκρωσης), χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα HeLa τα οποία φυσιολογικά υπερεκφράζουν την προτα. Τα ποσοστά των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων ελέγχθηκαν με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας τους δείκτες αννεξίνη V, η οποία δεσμεύεται με τη φωσφατιδυλοσερίνη και επιτρέπει την αναγνώριση και ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών κυττάρων, και ιωδιούχο προπίδιο (PI), για τη διάκριση των νεκρωτικών κυττάρων. Για την επαγωγή απόπτωσης, ως βέλτιστες συνθήκες ορίστηκαν εκείνες κατά τις οποίες το μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων HeLa βρισκόταν στο στάδιο της πρώιμης απόπτωσης (δηλ. ήταν annexin+ και PI-). Η επώαση των κυττάρων με το συνδυασμό 5 ng/ml TNF-α και 1 μg/ml εμετίνης για 4 ώρες, αποτέλεσε τη βέλτιστη συνθήκη επαγωγής απόπτωσης, καθώς το 85,7% των κυττάρων HeLa χαρακτηρίστηκαν ως πρώιμα αποπτωτικά (Εικόνα 1). 4

5 Εικόνα 1. Ενδεικτικά στικτογράμματα κυττάρων HeLa που επωάστηκαν για 4 ώρες σε σκέτο θρεπτικό υλικό (μάρτυρας) και με το συνδυασμό 5 ng/ml TNF-α + 1 μg/ml εμετίνη, μετά από χρώση με αννεξίνη V και PI. Τα ποσοστά των κυττάρων με πρώιμα αποπτωτικά, όψιμα αποπτωτικά/πρώιμα νεκρωτικά και νεκρωτικά χαρακτηριστικά σημειώνονται στο κάτω δεξιά, άνω δεξιά και άνω αριστερά τεταρτημόριο, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα από διάφορες σειρές (MCF-7, YAC-1, K562, U937, THP-1), καθώς και λευκοκυτταρικοί υποπληθυσμοί (ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα), απομονωμένοι από περιφερικό αίμα υγιών δοτών, τα οποία οδηγήθηκαν σε απόπτωση. Τα υπερκείμενα των αποπτωτικών καλλιεργειών συλλέχθηκαν και ελέγχθηκαν με την αναπτυχθείσα ELISA. Το προτα(100-109) ανιχνεύθηκε σε όλα τα αποπτωτικά υπερκείμενα (σε επίπεδα από 3-13 ng/ml), ενώ στα αντίστοιχα υπερκείμενα-μάρτυρες, η συγκέντρωσή του ήταν χαμηλή (Εικόνα 2). Για την επαγωγή νέκρωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε 3 διαδοχικούς κύκλους ψύξης-απόψυξης ή επωάστηκαν με υψηλή συγκέντρωση του χημειοθεραπευτικού παράγοντα δοξορουβικίνη (100 μg/ml). Στα νεκρωτικά υπερκείμενα, ανιχνεύθηκε ανοσοδραστικό υλικό (~9 ng/ml), το οποίο πιθανόν αφορά την ακέραιη προτα που απελευθερώνεται κατά τη λύση της κυτταρικής μεμβράνης των κυττάρων και την οποία τα αντισώματα αναγνωρίζουν εξίσου καλά με το προτα(100-109).

6 Εικόνα 2. Συγκέντρωση του δεκαπεπτιδίου προτα(100-109) σε υπερκείμενα καλλιεργειών αποπτωτικών κυτταρικών σειρών και λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών. Με άσπρο χρώμα απεικονίζονται τα επίπεδα του δεκαπεπτιδίου στα υπερκείμενα-μάρτυρες, ενώ με μαύρο αυτά των υπερκειμένων από τα αντίστοιχα αποπτωτικά κύτταρα. Ακολούθως, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του προτα(100-109) στο ορό BALB/c και C57BL/6 ποντικών, τα οποία μολύνθηκαν με τέσσερα διαφορετικά είδη βακτηρίων (Streptococcus pyogenes, Corynebacterium urealyticum, Pasteurella multocida και Klebsiella oxytoca). Χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια από διαφορετικές εργαστηριακές συνθήκες: αυτά που μεγάλωσαν σε συμβατικές συνθήκες (conventional) και αυτά τα οποία δεν είχαν έρθει σε επαφή με κανένα παθογόνο από τη γέννησή τους (germ-free). Τα ποντίκια ενοφθαλμίστηκαν ενδοπεριτοναϊκά με μία δόση βακτηριακού εναιωρήματος (1000 βακτηριακές αποικίες (CFU)/0,5 ml/ποντίκι) και συλλέχθηκε αίμα πριν τη μόλυνση (0 ώρες), καθώς και 2, 24 και 72 ώρες μετά από αυτή. Μετά την απομόνωσή τους με φυγοκέντρηση, οι οροί κατακρημνίστηκαν με ψυχρή ακετόνη πριν τη μέτρησή τους με την ΕLISA, προκειμένου να απομακρυνθούν οι μεγαλομοριακές πρωτεΐνες του ορού που προκαλούν στερεοχημική παρεμπόδιση της αναγνώρισης και δέσμευσης του μικρομοριακού αντιγόνου από τα ειδικά για αυτό αντισώματα. Παρατηρήσαμε διαφορές ως προς την ανιχνευθείσα ποσότητα του προτα(100-109) στον ορό των ζώων, ανάλογα με τη φυλή, τις εργαστηριακές συνθήκες διαβίωσης και το είδος του παθογόνου που τα μόλυνε. Γενικά, φάνηκε ότι τα επίπεδα του προτα(100-109) πριν τη μόλυνση είναι ελάχιστα, αυξήθηκαν σταδιακά με την πρόοδο της λοίμωξης και, για τα περισσότερα παθογόνα, κορυφώθηκαν στις 72 ώρες (Εικόνα 3). Γνωρίζοντας ότι τα περισσότερα βακτηριακά στελέχη προκαλούν μαζική απόπτωση των μακροφάγων στα ζώα, θεωρούμε ότι

μετά τον ενδοκυτταρικό κατακερματισμό της προτα, το δεκαπεπτίδιο προτα(100-109) εξωκυτταρώνεται στον ορό, λειτουργώντας ως «σήμα κινδύνου». Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με MALDI-TOF φασματομετρία μάζας, όπου ανιχνεύθηκε μικρή κορυφή που αντιστοιχούσε στη μοριακή μάζα του δεκαπεπτιδίου (1207,7) (Εικόνα 4). 7 Εικόνα 3. Συγκέντρωση του δεκαπεπτιδίου προτα(100-109) στον ορό ποντικών που μολύνθηκαν με Streptococcus pyogenes. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν από C57/BL6 (n=4) και BALB/c (n=6) ποντίκια πριν από τη μόλυνση (0 ώρες), 2, 24, και 72 ώρες μετά τη μόλυνση. Τα ζώα είχαν μεγαλώσει είτε σε συμβατικές συνθήκες (CONV), είτε δεν είχαν έρθει σε επαφή με παθογόνα από τη γέννησή τους (GF). Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του δεκαπεπτιδίου που προσδιορίστηκε ανά ζώο στο αντίστοιχο χρονικό σημείο. Στα σημεία που απεικονίζονται λιγότερα ζώα από τα αναφερόμενα, είτε δεν κατέστη δυνατή η αιμοληψία, είτε η ποσότητα του ορού δεν ήταν επαρκής. Οι οριζόντιες γραμμές απεικονίζουν τις μέσες τιμές.

8 Εικόνα 4. Πεπτιδικά φάσματα των κατακρημνισμένων με ακετόνη ορών των ποντικών που μολύνθηκαν με Klebsiella oxytoca (δείγματα 0, 24, και 72 ωρών μετά τη λοίμωξη). Η ανάλυση έγινε σε φασματόμετρο μάζας MALDI-TOF. Με κόκκινο κύκλο επισημαίνονται οι κορυφές που αντιστοιχούν στη μοριακή μάζα του προτα(100-109). Ως συνέχεια των μοντέλων αυτών, αναπτύξαμε ένα πιο επιθετικό μοντέλο θανατηφόρου σηψαιμίας, με τη χρήση δύο στελεχών Klebsiella pneumoniae σε ποντίκια της φυλής ICR. Το ένα στέλεχος είναι κλινικά απομονωμένο (L-78), χαμηλής μολυσματικότητας και ενδοκυτταρώνεται από τα μονοκύτταρα/μακροφάγα του περιφερικού αίματος, ενώ το δεύτερο είναι πρότυπο στέλεχος (ATCC43816), υψηλής μολυσματικότητας και δεν ενδοκυτταρώνεται. Τα ποντίκια μολύνθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με τα LD 50 των στελεχών, και οι αιμοληψίες έγιναν πριν τη μόλυνση (0), 3, 6, 12, 24 και 48 ώρες μετά από αυτή. Στα ζώα που χορηγήθηκε το L-78 στέλεχος, παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης του προτα(100-109), με τη μέγιστη ποσότητά του να ανιχνεύεται 48 ώρες μετά τη λοίμωξη. Στα ζώα που μολύνθηκαν με το στέλεχος ATCC43816, παρατηρήσαμε αυξομειώσεις στην ανιχνευθείσα συγκέντρωση του δεκαπεπτιδίου. Στην περίπτωση αυτή, λόγω της μη ενδοκυττάρωσης του βακτηρίου, ενεργοποιούνται πολλαπλά μονοπάτια θανάτου, κυρίως νεκρωτικού τύπου, όπως φάνηκε κατά την ανάλυση των σπληνοκυττάρων των ζώων με κυτταρομετρία ροής, μετά από χρώση με αννεξίνη V/PI.

Τέλος, μετρήσαμε τα επίπεδα του προτα(100-109) σε ανθρώπινο ορό υγιών ατόμων, παιδιατρικών ασθενών και ασθενών της Μονάδας Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ). Για πρώτη φορά, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα του προτα(100-109) στο ορό υγιών ατόμων, τα οποία βρέθηκαν ιδιαίτερα χαμηλά (<1 ng/ml) και ανεξάρτητα από την ηλικία των ατόμων. Τα δείγματα των παιδιών χωρίστηκαν σε 3 ομάδες: παιδιά με αυτοφλεγμονώδη νοσήματα και χαμηλή CRP, παιδιά με αυτοφλεγμονώδη νοσήματα και υψηλή CRP και παιδιά με λοιμώξεις. Οι ομάδες αυτές επελέγησαν προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι η απελευθέρωση του προτα(100-109) στον ορό είναι ειδική μόνο για συνθήκες μαζικής απόπτωσης των κυττάρων, όπως είναι η μόλυνση από βακτήρια και δε σχετίζεται με οποιαδήποτε φλεγμονώδη νόσο. Πράγματι, στα παιδιά με λοιμώξεις ανιχνεύθηκε υψηλότερη μέση συγκέντρωση δεκαπεπτιδίου (1,966 ng/ml) σε σχέση με τα υπόλοιπα δείγματα των παιδιών με αυτοφλεγμονώδη νοσήματα, όπου η μέση συγκέντρωση του προτα(100-109) ήταν σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα (0,358 ng/ml για τα παιδιά με υψηλή CRP και 0,42 ng/ml για τα παιδιά με χαμηλή CRP). Τα δείγματα από τη ΜΕΘ ελήφθησαν σειριακά από τη στιγμή της εισαγωγής του ασθενούς μέχρι την έξοδό του, ώστε να είναι αντιπροσωπευτικά της πορείας νοσηλείας του. Παρατηρήσαμε διακυμάνσεις στη συγκέντρωση του προτα(100-109) κατά την πορεία νοσηλείας ασθενών που εμφάνισαν βακτηριακές λοιμώξεις, οι οποίες συσχετίζονται με την αντίστοιχη κλινική εικόνα και τους εργαστηριακούς δείκτες. Αντίθετα, ελάχιστη ήταν η συγκέντρωση του προτα(100-109) σε περιστατικά που νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ χωρίς να εμφανίσουν λοίμωξη (Εικόνα 5). 9 Εικόνα 5. Συγκέντρωση του δεκαπεπτιδίου σε ενδεικτικά σειριακά δείγματα 2 ασθενών που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ. Ο ασθενής 4 εμφάνισε βακτηριακή λοίμωξη την ημέρα 22, ενώ ο ασθενής 19 νοσηλεύτηκε χωρίς να εμφανίσει λοίμωξη. Και οι δύο ασθενείς εξήλθαν βελτιωμένοι τις ημέρες 29 και 9, αντίστοιχα.

ΤΕΛΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σήμερα, υπάρχει έντονη ανάγκη εύρεσης νέων μορίων-δεικτών που να διαφοροποιούν τις βακτηριακές από άλλου τύπου λοιμώξεις, καθώς οι περισσότεροι από τους ήδη υπάρχοντες δείκτες στερούνται ειδικότητας και ευαισθησίας, ενώ είναι ανιχνεύσιμοι στο αίμα όταν η λοίμωξη έχει ήδη εγκατασταθεί και έχει προκαλέσει γενικευμένη σήψη. Η σήψη αποτελεί μια βαριά νοσολογική οντότητα, καθώς συνοδεύεται από συστηματική και μη ελεγχόμενη φλεγμονώδη απάντηση. Η ανίχνευση της σήψης και του σηπτικού shock που συχνά ακολουθεί, πρέπει να γίνεται έγκαιρα, καθώς η οποιαδήποτε καθυστέρηση στην έναρξη χορήγησης της κατάλληλης θεραπευτικής αγωγής σχετίζεται με φτωχή πρόγνωση. Μάλιστα, παρά την πρόοδο τόσο στη διαγνωστική προσπέλαση όσο και στη θεραπεία, η σήψη εξακολουθεί να αποτελεί την πρώτη αιτία θανάτου, τόσο μεταξύ των ασθενών που νοσηλεύονται στις ΜΕΘ, όσο και μεταξύ ασθενών με μη λοιμώδη νοσήματα, που εμφανίζουν όμως παρόμοια κλινική εικόνα. Το έργο αυτό αποτελεί μία ολοκληρωμένη μελέτη ανάπτυξης (ανταγωνιστική ELISA για το προτα(100-109)) και αξιολόγησης (προσδιορισμός του προτα(100-109) in vitro σε κυτταρικές σειρές, in vivo σε μοντέλα βακτηριακών λοιμώξεων σε ποντίκια και ex vivo σε ορό ασθενών) μίας διαγνωστικής δοκιμασίας, που μπορεί να αποβεί χρήσιμη στην αντιμετώπιση βασικών κλινικών προβλημάτων που καμία άλλη δοκιμασία μέχρι στιγμής δεν καλύπτει ικανοποιητικά. Το κλινικό όφελος, συνεπώς, που μπορεί να προσφέρει η αναπτυχθείσα δοκιμασία, της διάκρισης δηλαδή άσηπτης φλεγμονής από μία, δυνητικά απειλητική για τη ζωή του ασθενούς, βακτηριακή λοίμωξη, αποτελεί το κυριότερο πλεονέκτημά της, με βαρύνουσα κλινική σημασία. Όπως δείξαμε σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης μας, η ποσοτικοποίηση των επιπέδων του ανοσοδραστικού δεκαπεπτιδίου προτα(100-109) στον ορό του αίματος, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί, σε συνδυασμό με υπάρχοντες εργαστηριακούς δείκτες αλλά και την κλινική εικόνα του ασθενούς, ως διαγνωστικό εργαλείο διαφοροδιάγνωσης μεταξύ σηπτικής και άσηπτης φλεγμονής. Προφανώς, η τελική επιβεβαίωση (validation) της προγνωστικής/διαγνωστικής ικανότητας της ανοσοδοκιμασίας μας, θα πρέπει να γίνει με ανάλυση πολύ μεγαλύτερου αριθμού δειγμάτων ασθενών με λοιμώξεις. 10

Ενδεικτική βιλιογραφία: Η ακόλουθη βιβλιογραφία προτείνεται για όσους επιθυμούν να μελετήσουν το συγκεκριμένο θέμα: Samara P, Kalbacher H, Ioannou K, et al. Development of an ELISA for the quantification of the C-terminal decapeptide prothymosin α(100-109) in sera of mice infected with bacteria. J Immunol Methods 2013, 395:54. Samara P, Ioannou K, Neagu M, et al. The C-terminal decapeptide of prothymosin α is responsible for its stimulatory effect on the functions of human neutrophils in vitro. Int Immunopharmacol 2013, 15:50. Ioannou K, Derhovanessian E, Tsakiri E, et al. Prothymosin α and a prothymosin α-derived peptide enhance T(H)1-type immune responses against defined HER-2/neu epitopes. BMC Immunol 2013, 14:43. Ioannou K, Samara P, Livaniou E, et al. Prothymosin alpha: a ubiquitous polypeptide with potential use in cancer diagnosis and therapy. Cancer Immunol Immunother 2012, 61:59.9 Ivády B, Béres BJ, Szabó D. Recent advances in sepsis research: novel biomarkers and therapeutic targets. Curr Med Chem 2011, 18:3211. Skopeliti M, Iconomidou VA, Derhovanessian E, et al. Prothymosin alpha immunoactive carboxyl-terminal peptide TKKQKTDEDD stimulates lymphocyte reactions, induces dendritic cell maturation and adopts a beta-sheet conformation in a sequence-specific manner. Mol Immunol 2009, 46:784. Skopeliti M, Kratzer U, Altenberend F, et al. Proteomic exploitation on prothymosin alphainduced mononuclear cell activation. Proteomics 2007, 7:1814. Skopeliti M, Voutsas IF, Klimentzou P, et al. The immunologically active site of prothymosin alpha is located at the carboxy-terminus of the polypeptide. Evaluation of its in vitro effects in cancer patients. Cancer Immunol Immunother 2006, 55:1247. Evstafieva AG, Belov GA, Rubtsov YP, et al. Apoptosis-related fragmentation, translocation, and properties of human prothymosin alpha. Exp Cell Res 2003, 284:211. Enkemann SA, Wang RH, Trumbore MW, Berger SL. Functional discontinuities in prothymosin alpha caused by caspase cleavage in apoptotic cells. J Cell Physiol 2000, 182:256. 11

ΠΑΡΑΔΟΤΕΑ Προϊόν Η αναπτυχθείσα δοκιμασία τύπου ανταγωνιστικής ELISA είναι μεθοδολογικά ολοκληρωμένη και έχει ήδη γίνει, στο πλαίσιο αυτού του έργου, η πρώτη της αξιολόγηση (validation) σε δείγματα ορού ποντικών και ανθρώπων με βακτηριακές λοιμώξεις. Απομένει η ευρύτερη αξιολόγησή της σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων και η κατάλληλη διαμόρφωσή της σε εμπορεύσιμη δοκιμασία με τη μορφή kit. 12 Δημοσιεύσεις Από τη μελέτη αυτή έχει ήδη προκύψει μία δημοσίευση: Samara P, Kalbacher H, Ioannou K, Radu DL, Livaniou E, Promponas VJ et al. Development of an ELISA for the quantification of the C-terminal decapeptide prothymosin α(100-109) in sera of mice infected with bacteria. J Immunol Methods 2013, 395:54-62. Βρίσκονται στο στάδιο της συγγραφής 2 ακόμα δημοσιεύσεις, μία που αφορά τα αποτελέσματα από τα in vivo μοντέλα λοίμωξης στα ποντίκια και μία για την αξιολόγηση της ανοσοδοκιμασίας στα ανθρώπινα δείγματα ορού. Παρουσιάσεις σε Συνέδρια: 1) Σαμαρά Π, Ιωάννου Κ, Neagu M, Radu D,. Kalbacher H, Voelter W, Τσιτσιλώνη Ο. Ανάπτυξη ανοσοδοκιμασίας για την ποσοτικοποίηση του δεκαπεπτιδόυ προθυμοσίνη α(100-109) σε in vivo μοντέλα λοιμώξεων. 39 ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο, Αθήνα, 22-25 Μαίου 2013 2) Σαμαρά Π, Ιωάννου Κ, Kalbacher H,. Voelter W,. Μυριαγκού Β, Τσιτσάμη Ε,. Κουνουγέρη Α, Κατσιάρη Μ, Μαγκίνα Ν, Γερμενής Α, Τσιτσιλώνη Ο. Το δεκαπεπτίδιο προτα(100-109) ως δείκτης φλεγμονής: ανάπτυξη ειδικής ανοσοδοκιμασίας και αρχική αξιολόγησή της σε δείγματα ορού. 9 ο Πανέλληνιο Συνέδριο Ανοσολογίας, Αθήνα, 12-14 Δεκεμβρίου 2013

13

14

15

16 ΤΟ ΔΕΚΑΠΕΠΤΙΔΙΟ ΠΡΟΘΥΜΟΣΙΝΗ α(100-109) ΩΣ ΔΕΙΚΤΗΣ ΦΛΕΓΜΟΝΗΣ: ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΙΔΙΚΗΣ ΑΝΟΣΟΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΑΡΧΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ Π. Σαμαρά 1, Κ. Ιωάννου 1, H. Kalbacher 2, W. Voelter 2, Β. Μυριαγκού 3, Ε. Τσιτσάμη 4, Α. Κουνουγέρη 5, Μ. Κατσιάρη 5, Ν. Μαγκίνα 5, Α. Γερμενής 6, Ο. Τσιτσιλώνη 1 1 Τομέας Φυσιολογίας Ζώων & Ανθρώπου, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ, 2 Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen, Germany, 3 Εργαστήριο Βακτηριολογίας, ΕΙΠ, 4 Μονάδα Παιδιατρικής Ρευματολογίας, Α' Παιδιατρική Κλινική ΕΚΠΑ, Νοσ. Παίδων "Η Αγία Σοφία", 5 ΜΕΘ, Κωνσταντοπούλειο Γ.Ν. Νέας Ιωνίας, 6 Εργαστήριο Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Σκοπός: Λοιμώξεις από συγκεκριμένα παθογόνα βακτήρια επάγουν μαζική απόπτωση διαφόρων σειρών ανοσοκυττάρων. Ένα ιδιαίτερα πρώιμο αποπτωτικό γεγονός είναι η θραυσματοποίηση της προθυμοσίνης α (προτα) και η παραγωγή και εξωκυττάρωση του ανοσοδραστικού δεκαπεπτιδίου της προτα(100-109). Αναπτύξαμε ανοσοδοκιμασία για το προτα(100-109) και ποσοτικοποιήσαμε τα επίπεδά του στον ορό οργανισμών μολυσμένων με βακτήρια. Υλικό και Μέθοδοι: Η αναπτυχθείσα ανταγωνιστική ELISA έχει εύρος μέτρησης 0,1 ng 10 μg/ml προτα(100-109). Προσδιορίσαμε τα επίπεδα του προτα(100-109) στον ορό ποντικών μετά από in vivo μόλυνσή τους με στελέχη βακτηρίων και ασθενών με εργαστηριακά επιβεβαιωμένες λοιμώξεις. Αποτελέσματα: In vivo μόλυνση Balb/c και C57BL/6 ποντικών με Streptococcus pyogenes, Salmonella typhimurium, Corynebacterium urealyticum, Pasteurella multocida και Klebsiella oxytoca οδήγησε, στην πλειονότητα των περιπτώσεων, σε σταδιακή αύξηση των επιπέδων του προτα(100-109) κατά την πορεία της λοίμωξης, που σχετίζεται με τη φυλή και τον παθογόνο μικροοργανισμό. Σε μοντέλο οξείας θανατηφόρου σηψαιμίας με στέλεχος Klebsiella pneumoniae που προσβάλλει τα μακροφάγα, παρατηρήσαμε αύξηση των επιπέδων του προτα(100-109) κατά την εδραίωση της λοίμωξης. Τέλος, σε δείγματα ορού παιδιατρικών ασθενών και ασθενών που νοσηλεύονται σε ΜΕΘ, η ανίχνευση αυξημένων επιπέδων προτα(100-109) φάνηκε να συσχετίζεται μόνο με λοιμώξεις από βακτήρια και όχι με αυτοφλεγμονώδη νοσήματα άλλης αιτιολογίας. Συμπεράσματα: Η φυσιολογικά ελάχιστη συγκέντρωση του προτα(100-109) στον ορό αυξάνει με την πρόοδο της λοίμωξης και συμβαδίζει με την κλινική εικόνα τόσο σε πειραματόζωα, όσο και σε ασθενείς. Γνωρίζοντας ότι τα συγκεκριμένα βακτήρια προκαλούν μαζική απόπτωση των μακροφάγων, υποθέτουμε ότι μετά τον ενδοκυτταρικό κατακερματισμό της προτα, το προτα(100-109) που εξωκυτταρώνεται στον ορό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης βακτηριακής μόλυνσης. Χρηματοδότηση: Η εκπόνηση της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκε με χρηματοδότηση του Κοινωφελούς Ιδρύματος Ιωάννη Σ. Λάτση. Η ευθύνη για το περιεχόμενό της ανήκει αποκλειστικά στους συντάκτες αυτής.

17

18

19

20

21

22

23

24

25