Για in vitro διαγνωστική χρήση Για χρήση με το σύστημα BD MAX Ελληνικά

MAX Cdiff 442555 Για in vitro διαγνωστική χρήση P0215(02) Για χρήση με το σύστημα BD MAX 2017-01 Ελληνικά ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ Η ανάλυση BD MAX Cdiff που πραγματοποιείται στο σύστημα BD MAX είναι μια αυτοματοποιημένη in vitro διαγνωστική εξέταση για την άμεση, ποιοτική ανίχνευση του γονιδίου τοξίνης Β Clostridium difficile (tcdb) σε δείγματα ανθρώπινων υγρών ή μαλακών κοπράνων από ασθενείς για τους οποίους πιθανολογείται λοίμωξη από Clostridium difficile (CDI). Η εξέταση πραγματοποιείται απευθείας στο δείγμα με χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε πραγματικό χρόνο, για την ενίσχυση του DNA του γονιδίου τοξίνης Β Clostridium difficile και των ειδικών για τον στόχο φθοριζόντων ανιχνευτών υβριδισμού με σκοπό την ανίχνευση του ενισχυμένου DNA. Η ανάλυση BD MAX Cdiff προορίζεται ως βοήθημα για τη διάγνωση CDI. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το Clostridium difficile είναι ένας αναερόβιος, gram θετικός βάκιλλος, ο οποίος αποτελεί την κύρια αιτία διάρροιας και ψευδομεμβρανώδους κολίτιδας που σχετίζονται με τα αντιβιοτικά στο νοσοκομειακό περιβάλλον. 1,2 Η επίπτωση της CDI αυξάνεται και εμφανίζονται όλο και πιο συχνά βαριά περιστατικά. 3,4,5 Τα συμπτώματα της CDI κυμαίνονται από ήπια διάρροια έως βαριά κολίτιδα και διάτρηση του εντέρου, και μπορούν να οδηγήσουν ακόμη και σε θάνατο. Η πιο συχνός παράγοντας κινδύνου είναι η έκθεση στα αντιβιοτικά. 6 Η διάγνωση της λοίμωξης από Clostridium difficile βασίζεται στα κλινικά σημεία και συμπτώματα, όπως η διάρροια, και στις εργαστηριακές ή παθολογοανατομικές εξετάσεις. Η εργαστηριακή διάγνωση του τοξινογόνου Clostridium difficile περιλαμβάνει την αναερόβια καλλιέργεια και στη συνέχεια την ανίχνευση της τοξίνης ή την ανίχνευση των γονιδίων, ή των ενζύμων, της τοξίνης που απαντώνται στα κόπρανα. 7 Η τοξίνη Β φαίνεται ότι είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη CDI. 8 Ο έλεγχος κυτταροτοξικότητας ιστοκαλλιέργειας που πραγματοποιείται απευθείας στα κόπρανα ή σε απομονωμένο στέλεχος Clostridium difficile είναι δύσκολος, χρονοβόρος και τα αποτελέσματα λαμβάνονται μεταξύ 24 έως 96 ωρών. Ο ενζυμικός ανοσοπροσδιορισμός (EIA) που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της τοξίνης Α, της τοξίνης Β και της γλουταμικής αφυδρογονάσης (GDH), ενός ενζύμου που απαντάται σε όλα τα στελέχη Clostridium difficile, χρησιμοποιείται επί του παρόντος στα περισσότερα κλινικά εργαστήρια, επειδή τα αποτελέσματα καθίστανται διαθέσιμα αυθημερόν, είναι εύκολη και σχετικά οικονομική μέθοδος. Ωστόσο, η ευαισθησία είναι χαμηλή, ειδικά για τον EIA των τοξινών, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στη αποτυχία λήψης θετικών αποτελεσμάτων. 7 Πρόσφατα, αναπτύχθηκαν μέθοδοι PCR για την ανίχνευση της τοξίνης Α ή/και της τοξίνης Β με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα συγκριτικά με τον έλεγχο κυτταροτοξικότητας και τους ανοσοπροσδιορισμούς. 9 Επιπλέον, οι εξετάσεις αυτές μπορούν να πραγματοποιηθούν σε λιγότερο από 3 ώρες. Ο συνδυασμός αυτών των χαρακτηριστικών μπορεί να επιτρέψει την άμεση στοχευμένη θεραπεία ασθενών με CDI και, συνεπώς, μια εν δυνάμει βελτίωση ως προς την έκβαση των ασθενών, τη μείωση του χρόνου αποκατάστασης και τις πρακτικές ελέγχου της λοίμωξης. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Συλλέγεται ένα δείγμα υγρών ή μαλακών κοπράνων και μεταφέρεται στο εργαστήριο. Για την πραγματοποίηση της εξέτασης, ένας αναλώσιμος κρίκος ενοφθαλμισμού 10 µl βυθίζεται στο δείγμα των κοπράνων και κατόπιν διανέμεται σε ένα σωληνάριο BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube (σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος BD MAX Cdiff). Το σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος κλείνεται με διαφραγματικό καπάκι και υποβάλλεται σε περιδίνηση. Δημιουργείται η λίστα εργασιών και το σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος, η ταινία ενοποιημένων αντιδραστηρίων BD MAX Cdiff Unitized Reagent Strip και η φύσιγγα BD MAX PCR Cartridge φορτώνονται στο σύστημα BD MAX. Το σύστημα BD MAX αυτοματοποιεί την παρασκευή των δειγμάτων συμπεριλαμβανομένης της λύσης του στόχου, την εκχύλιση και τη συγκέντρωση του DNA, την επανενυδάτωση των αντιδραστηρίων, καθώς και την ενίσχυση και την ανίχνευση στοχευόμενων νουκλεϊκών οξέων χρησιμοποιώντας PCR σε πραγματικό χρόνο. Το σύστημα BD MAX ερμηνεύει αυτόματα τα αποτελέσματα της εξέτασης. Η ανάλυση περιλαμβάνει επίσης ένα πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων, το οποίο υπάρχει στο σωληνάριο εκχύλισης. Το πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων παρακολουθεί τα βήματα της εκχύλισης του DNA, τα βήματα του θερμικού κύκλου, την ακεραιότητα των αντιδραστηρίων και την παρουσία ανασταλτικών ουσιών. 1

Μετά την ενζυματική κυτταρική λύση, τα νουκλεϊκά οξέα που απελευθερώνονται δεσμεύονται από μαγνητικά σφαιρίδια. Τα σφαιρίδια με τα δεσμευμένα νουκλεϊκά οξέα πλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και τα νουκλεϊκά οξέα υφίστανται θερμική έκλουση σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Το εκλουσμένο DNA εξουδετερώνεται με ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης και μεταφέρεται στο κύριο μείγμα για την επανενυδάτωση των αντιδραστηρίων PCR. Μετά την ανασύσταση, το σύστημα BD MAX διανέμει έναν σταθερό όγκο έτοιμου για PCR διαλύματος που περιέχει εκχυλισμένα νουκλεϊκά οξέα στη φύσιγγα BD MAX PCR Cartridge. Οι μικροβαλβίδες της φύσιγγας BD MAX PCR Cartridge, που περιέχει το μείγμα ενίσχυσης, σφραγίζονται από το σύστημα πριν από την έναρξη της PCR για την αποτροπή της εξάτμισης και της επιμόλυνσης. Οι ενισχυμένοι στόχοι DNA ανιχνεύονται με ανιχνευτές υδρόλυσης (TaqMan) που φέρουν στο ένα άκρο φθορίζουσα χρωστική (φθορισμοφόρο) και στο άλλο άκρο αποσβέστη φθορισμού. Οι ανιχνευτές που φέρουν διαφορετικά φθορισμοφόρα χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αμπλικονίων του tcdb και του προτύπου ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων σε δύο διαφορετικά οπτικά κανάλια στη σύστημα BD MAX. Όταν οι ανιχνευτές είναι στη γηγενή τους κατάσταση, αποσβένεται ο φθορισμός του φθορισμοφόρου λόγω της εγγύτητας με τον αποσβέστη φθορισμού. Ωστόσο, παρουσία του στοχευόμενου DNA, οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες και υδρολύονται από τη δράση της 5 3 εξωνουκλεάσης της πολυμεράσης του DNA καθώς συνθέτει την αναδυόμενη αλυσίδα κατά μήκος της μήτρας του DNA. Κατά συνέπεια, τα φθορισμοφόρα διαχωρίζονται από τα μόρια απόσβεσης και εκπέμπεται φθορισμός. Η ποσότητα του φθορισμού που ανιχνεύεται στα δύο οπτικά κανάλια που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση BD MAX Cdiff είναι ευθέως ανάλογη της ποσότητας του αντίστοιχου ανιχνευτή που υδρολύεται. Το σύστημα BD MAX παρακολουθεί αυτά τα σήματα σε κάθε κύκλο της PCR και ερμηνεύει τα δεδομένα στο τέλος του προγράμματος για τη δημιουργία του τελικού αποτελέσματος. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΦ Περιεχόμενα Ποσότητα 442555 BD MAX Cdiff Master Mix Ξηρό κύριο μείγμα PCR που περιέχει ειδικούς για tcdb μοριακούς ανιχνευτές και εκκινητές μαζί με μοριακό ανιχνευτή ειδικό για το πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων. BD MAX Cdiff Strips Ταινίες ενοποιημένων αντιδραστηρίων που περιέχουν όλα τα υγρά αντιδραστήρια και τα αναλώσιμα ρύγχη πιπετών που είναι απαραίτητα για την επεξεργασία του δείγματος και την εκχύλιση του DNA. BD MAX Cdiff Extraction Tube Λυοφιλιωμένο ίζημα που περιέχει μαγνητικά σφαιρίδια δέσμευσης DNA, αχρωμοπεπτιδάση και πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων. BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube 2 24 εξετάσεις 24 εξετάσεις 24 εξετάσεις 24 εξετάσεις Διαφραγματικά καπάκια 25 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΑΛΛΑ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ BD MAX PCR Cartridges (BD Diagnostic Systems αρ. καταλόγου 437519) VWR Multi-Tube Vortexer (VWR αρ. καταλόγου 58816-115) Vortex Genie 2 (VWR αρ. καταλόγου 58815-234) ή αντίστοιχο NALGENE Cryogenic Vial Holder (VWR, αρ. καταλόγου 66008-783) Κρίκοι ενοφθαλμισμού μίας χρήσεως (10 µl) Γάντια μίας χρήσεως, χωρίς πούδρα Στεγνά, καθαρά δοχεία για τη συλλογή δειγμάτων υγρών ή μαλακών κοπράνων Εάν η καλλιέργεια πραγματοποιείται για εξωτερικά πρότυπα ελέγχου: Τρυβλίο άγαρ που έχει υποστεί προηγουμένως αναγωγή για αναερόβια (π.χ. Brucella Agar with 5% sheep blood, hemin and vitamin K1 plate, BBL αρ. καταλόγου 221547) ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η ανάλυση BD MAX Cdiff προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση. Αυτό το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο στο σύστημα BD MAX. Μη χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια ή/και τα υλικά μετά την ημερομηνία λήξης. Μη χρησιμοποιείτε το κιτ εάν η ετικέτα που σφραγίζει το εξωτερικό κουτί είναι κομμένη κατά την παραλαβή. Μη χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια εάν, κατά την παραλαβή, τα προστατευτικά σακουλάκια είναι ανοιχτά ή σχισμένα. Μη χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια αν δεν υπάρχει αποξηραντικό υλικό ή είναι φθαρμένο μέσα στα σακουλάκια των αντιδραστηρίων. Μην αφαιρείτε το αποξηραντικό υλικό από τα σακουλάκια των αντιδραστηρίων. Μετά από κάθε χρήση, κλείνετε αμέσως τα προστατευτικά σακουλάκια των αντιδραστηρίων με την αεροστεγή σφράγιση. Αφαιρέστε τυχόν περίσσεια αέρα από τα σακουλάκια πριν από τη σφράγιση. Προστατέψτε τα αντιδραστήρια από θερμότητα και υγρασία. Η παρατεταμένη έκθεση σε υγρασία θα επηρεάσει την απόδοση του προϊόντος. Μη χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια εάν η αλουμινένια συσκευασία είναι σχισμένη ή φθαρμένη. Μην αναμειγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικά σακουλάκια ή/και κιτ ή/και παρτίδες. Μην εναλλάσσετε ή επαναχρησιμοποιείτε τα πώματα, επειδή μπορεί να προκληθεί επιμόλυνση και να αλλοιωθούν τα αποτελέσματα της εξέτασης.

Ελέγξτε τις ταινίες ενοποιημένων αντιδραστηρίων για ορθή πλήρωση υγρών (βεβαιωθείτε ότι τα υγρά βρίσκονται στον πυθμένα των σωληναρίων) (ανατρέξτε στην Εικόνα 1). Ελέγξτε τις ταινίες ενοποιημένων αντιδραστηρίων για να βεβαιωθείτε ότι υπάρχουν όλα τα ρύγχη πιπετών (ανατρέξτε στην Εικόνα 1). Συνεχίστε με προσοχή όταν χρησιμοποιείτε χημικά διαλύματα, επειδή ο γραμμωτός κώδικας του κύριου μείγματος και του σωληναρίου εκχύλισης μπορεί να έχει καταστεί δυσανάγνωστος. Η χρήση ορθής εργαστηριακής τεχνικής είναι ουσιώδης για τη σωστή απόδοση αυτής της ανάλυσης. Εξαιτίας της μεγάλης αναλυτικής ευαισθησίας αυτής της εξέτασης, θα πρέπει να δοθεί εξαιρετική προσοχή για να διατηρηθεί η καθαρότητα όλων των υλικών και των αντιδραστηρίων. Στις περιπτώσεις όπου και άλλες εξετάσεις PCR διενεργούνται στον ίδιο χώρο του εργαστηρίου, πρέπει να διασφαλίζετε ότι η ανάλυση BD MAX Cdiff, τυχόν επιπλέον αντιδραστήρια που απαιτούνται για την εξέταση και το σύστημα BD MAX δεν έχουν επιμολυνθεί. Πρέπει να αποφεύγετε πάντοτε τη μικροβιακή επιμόλυνση και την επιμόλυνση από δεοξυριβονουκλεάση (DNAse) των αντιδραστηρίων. Πρέπει να γίνεται αλλαγή γαντιών πριν από τον χειρισμό των αντιδραστηρίων και των φυσίγγων. Για την αποφυγή της μόλυνσης του περιβάλλοντος από αμπλικόνια, μη διαλύετε τις φύσιγγες BD MAX PCR Cartridges μετά τη χρήση. Οι σφραγίδες των φυσίγγων BD MAX PCR Cartridges είναι σχεδιασμένες να αποτρέπουν την επιμόλυνση. Το εργαστήριο θα πρέπει να πραγματοποιεί περιβαλλοντική παρακολούθηση σε τακτική βάση για την ελαχιστοποίηση του κινδύνου διασταυρούμενης επιμόλυνσης. Οι φύσιγγες BD MAX Microfluidic Cartridges μπορούν να χρησιμοποιηθούν για έως δύο εκτελέσεις. Η εκτέλεση της ανάλυσης BD MAX Cdiff έξω από τα συνιστώμενα χρονικά όρια μπορεί να οδηγήσει σε μη έγκυρα αποτελέσματα. Οι αναλύσεις που δεν πραγματοποιούνται εντός των καθορισμένων χρονικών ορίων, θα πρέπει να επαναλαμβάνονται. Είναι δυνατή η εξέταση επιπλέον προτύπων ελέγχου σύμφωνα με τις οδηγίες ή τις απαιτήσεις των τοπικών, πολιτειακών, επαρχιακών ή/ και ομοσπονδιακών κανονισμών ή οργανισμών πιστοποίησης. Να χειρίζεστε πάντοτε τα δείγματα σαν να ήταν μολυσματικά και σύμφωνα με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στο έγγραφο CLSI Document M29 10 και στην αναφορά Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 11 Κατά τον χειρισμό των αντιδραστηρίων, πρέπει να φοράτε προστατευτική ενδυμασία και γάντια μίας χρήσεως. Μετά την πραγματοποίηση της εξέτασης πρέπει να πλύνετε καλά τα χέρια σας. Μην αναρροφάτε την πιπέτα με το στόμα. Μην καπνίζετε, μην πίνετε και μη μασάτε ή τρώτε σε περιοχές όπου χρησιμοποιούνται δείγματα ή αντιδραστήρια από κιτ. Απορρίψτε τα αχρησιμοποίητα αντιδραστήρια και τα απόβλητα σύμφωνα με τους τοπικούς, πολιτειακούς, επαρχιακούς ή/και ομοσπονδιακούς κανονισμούς. Συμβουλευτείτε το εγχειρίδιο χρήσης του συστήματος BD MAX 12 για επιπλέον προειδοποιήσεις, προφυλάξεις και διαδικασίες. ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ Τα δείγματα που συλλέγονται θα πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία μεταξύ 2 C και 25 C κατά τη διάρκεια της μεταφοράς τους. Προστατέψτε τα από την ψύξη ή την έκθεση σε υπερβολική θερμότητα. Πριν από την εξέταση, τα δείγματα μπορούν να φυλάσσονται για έως 5 ημέρες σε θερμοκρασία 2 8 C ή για έως 48 ώρες σε θερμοκρασία 2 25 C. Τα συστατικά της ανάλυσης BD MAX Cdiff είναι σταθερά στους 2 25 C μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μη χρησιμοποιείτε τα συστατικά, εφόσον παρέλθει η ημερομηνία λήξης. Το κύριο μείγμα και τα σωληνάρια εκχύλισης της ανάλυσης BD MAX Cdiff παρέχονται σε σφραγισμένα σακουλάκια. Για την προστασία του προϊόντος από την υγρασία, επανασφραγίστε αμέσως μετά το άνοιγμα. Τα σωληνάρια των αντιδραστηρίων είναι σταθερά για έως 7 ημέρες στους 2 25 C μετά το αρχικό άνοιγμα και την επανασφράγιση. ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Συλλογή/μεταφορά δειγμάτων Με σκοπό τη λήψη επαρκούς δείγματος, πρέπει να τηρείται πιστά η διαδικασία συλλογής δειγμάτων. Χρησιμοποιώντας στεγνό και καθαρό δοχείο, συλλέξτε δείγματα υγρών ή μαλακών κοπράνων σύμφωνα με την ακόλουθη διαδικασία: 1. Βάλτε στο δοχείο υγρά ή μαλακά κόπρανα (αλλά όχι ούρα). Αποφύγετε την ανάμειξη χαρτιού τουαλέτας, νερού ή σαπουνιού με το δείγμα. 2. Τοποθετήστε την ετικέτα στο δοχείο. 3. Η αποστολή του δοχείου στο εργαστήριο πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με τις τυποποιημένες διαδικασίες λειτουργίας του νοσοκομείου (ανατρέξτε στην ενότητα «Φύλαξη και σταθερότητα»). 3

Παρασκευή δείγματος ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για την εξέταση κάθε δείγματος και κάθε εξωτερικού προτύπου ελέγχου απαιτούνται ένα (1) σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος, ένα (1) διαφραγματικό καπάκι, ένα (1) κύριο μείγμα, ένα (1) σωληνάριο εκχύλισης και μία (1) ταινία ενοποιημένων αντιδραστηρίων. Αφαιρέστε τον απαιτούμενο αριθμό των υλικών από τα προστατευτικά σακουλάκια ή τα κουτιά τους. Για να αποθηκεύσετε τα ανοιγμένα σακουλάκια του κύριου μείγματος ή των σωληναρίων εκχύλισης, αφαιρέστε την περίσσεια αέρα και κλείστε τα σακουλάκια με την αεροστεγή σφράγιση. 1. Τοποθετήστε την ετικέτα με το αναγνωριστικό του δείγματος στο σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος που είναι επισημασμένο με γραμμωτό κώδικα (διάφανο καπάκι) προσέχοντας να μην καλύψετε, να μη γράψετε και να μην τοποθετήσετε την ετικέτα επάνω στους γραμμωτούς κώδικες. 2. Περιδινήστε το δείγμα σε υψηλή ταχύτητα για 15 δευτερόλεπτα και βυθίστε τον κρίκο ενοφθαλμισμού 10 µl στα κόπρανα για την εξέταση. Για δείγματα μαλακών κοπράνων, αφαιρέστε τυχόν περίσσεια κοπράνων που υπάρχει στο εξωτερικό του κρίκου προκειμένου να πάρετε περίπου 10 µl. 3. Αφαιρέστε το καπάκι από το σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος και, κατόπιν, τοποθετήστε τον κρίκο στο υγρό. Περιστρέψτε τον κρίκο με τα δάχτυλά σας προκειμένου να απελευθερωθεί το δείγμα στο σωληνάριο. 4. Σφραγίστε το σωληνάριο με το διαφραγματικό καπάκι. 5. Τοποθετήστε το σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος στη βάση φιαλιδίων NALGENE Cryogenic Vial holder. 6. Παρασκευάστε τυχόν επιπλέον δείγματα για εξέταση επαναλαμβάνοντας τα βήματα 1 έως 5, και κατόπιν μεταβείτε αμέσως στο βήμα 7. 7. Περιδινήστε ταυτόχρονα όλα τα παρασκευασθέντα δείγματα στη μέγιστη ταχύτητα για ένα (1) λεπτό με τον αναδευτήρα πολλαπλών φιαλιδίων. Η ανάλυση BD MAX Cdiff πρέπει να πραγματοποιείται αμέσως μετά το βήμα της περιδίνησης. Λειτουργία συστήματος BD MAX ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του συστήματος BD MAX 12 για λεπτομερείς οδηγίες (ενότητα «Λειτουργία»). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η εξέταση της ανάλυσης BD MAX Cdiff πρέπει να πραγματοποιηθεί αμέσως μετά το παραπάνω βήμα περιδίνησης (Παρασκευή δείγματος, βήμα 7). Εάν είναι απαραίτητη η επανάληψη της εξέτασης, περιδινήστε ξανά τα δείγματα. 1. Ενεργοποιήστε το σύστημα BD MAX (εάν δεν το έχετε κάνει ήδη) και συνδεθείτε εισάγοντας το <user name> (όνομα χρήστη) και το <password> (κωδικός πρόσβασης). 2. Πρέπει να γίνεται αλλαγή γαντιών πριν από τον χειρισμό των αντιδραστηρίων και των φυσίγγων. 3. Αφαιρέστε τον απαιτούμενο αριθμό ταινιών ενοποιημένων αντιδραστηρίων από το κιτ BD MAX Cdiff. Χτυπήστε ελαφρά κάθε ταινία σε μια σκληρή επιφάνεια για να βεβαιωθείτε ότι όλα τα υγρά βρίσκονται στον πυθμένα των σωληναρίων. 4. Αφαιρέστε τον απαιτούμενο αριθμό σωληναρίων εκχύλισης και σωληναρίων κύριου μείγματος από τα προστατευτικά σακουλάκια τους. Αφαιρέστε την περίσσεια αέρα και κλείστε τα σακουλάκια με την αεροστεγή σφράγιση. 5. Για κάθε δείγμα που θα εξεταστεί, τοποθετήστε μία (1) ταινία ενοποιημένων αντιδραστηρίων στον φορέα του συστήματος BD MAX, ξεκινώντας με τη Θέση 1 του Φορέα Α. 6. Κουμπώστε ένα (1) σωληνάριο εκχύλισης (λευκή αλουμινένια συσκευασία) σε κάθε ταινία ενοποιημένων αντιδραστηρίων στη Θέση 1 όπως φαίνεται στην Εικόνα 1. 7. Κουμπώστε ένα (1) σωληνάριο κύριου μείγματος (πράσινη αλουμινένια συσκευασία) σε κάθε ταινία ενοποιημένων αντιδραστηρίων στη Θέση 2 όπως φαίνεται στην Εικόνα 1. Εικόνα 1: Κούμπωμα σωληναρίων κύριου μείγματος και εκχύλισης BD MAX Cdiff στις ταινίες ενοποιημένων αντιδραστηρίων. 8. Κάντε κλικ στο εικονίδιο Run (Εκτέλεση) και εισαγάγετε τον αριθμό παρτίδας του κιτ για την ανάλυση BD MAX Cdiff (για την ιχνηλασιμότητα της παρτίδας) είτε σαρώνοντας τον γραμμωτό κώδικα με τον σαρωτή είτε πληκτρολογώντας τον αριθμό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Επαναλάβετε το βήμα 8 κάθε φορά που χρησιμοποιείται μια νέα παρτίδα κιτ. 9. Περιηγηθείτε στο Worklist (Λίστα εργασιών). Από το αναπτυσσόμενο μενού επιλέξτε <BD MAX Cdiff 56>. 10. Εισαγάγετε το Sample Buffer Tube ID (Αναγνωριστικό σωληναρίου ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος), το Patient ID (Αναγνωριστικό ασθενούς) και το Accession Number (Αριθμός δείγματος) (κατά περίπτωση) στη λίστα εργασιών είτε σαρώνοντας τον γραμμωτό κώδικα με τον σαρωτή είτε πληκτρολογώντας τα στοιχεία. 4

11. Επιλέξτε τον κατάλληλο αριθμό παρτίδας κιτ (αναγράφεται στο εξωτερικό κουτί) από το αναπτυσσόμενο μενού. 12. Επαναλάβετε τα βήματα 9 έως 11 για όλα τα υπόλοιπα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος. 13. Τοποθετήστε τα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος στους φορείς του συστήματος BD MAX κατ αντιστοιχία με τις ταινίες ενοποιημένων αντιδραστηρίων που τοποθετήθηκαν στα βήματα 5 έως 7. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τοποθετήστε τα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος στους φορείς δειγμάτων με τις ετικέτες μονοδιάστατου γραμμωτού κώδικα στραμμένες προς τα έξω (έτσι καθίσταται ευκολότερη η σάρωση των σωληναρίων ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος κατά τη διάρκεια της καταχώρισης των δειγμάτων). 14. Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό φυσίγγων BD MAX PCR Cartridge στο σύστημα BD MAX (βλ. Εικόνα 2). Κάθε φύσιγγα δέχεται συνολικά 24 δείγματα, 12 δείγματα ανά εκτέλεση για 2 εκτελέσεις. Το σύστημα BD MAX επιλέγει αυτόματα τη θέση και τη σειρά στη φύσιγγα PCR για κάθε εκτέλεση. Οι φύσιγγες BD MAX PCR Cartridge μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλές φορές έως ότου χρησιμοποιηθούν όλες οι λωρίδες. Για να μεγιστοποιήσετε τη χρήση των φυσίγγων BD MAX PCR Cartridge, χρησιμοποιώντας τη λειτουργία 2000 Sample Mode, επιλέξτε Run Wizard (Οδηγός εκτέλεσης) στην καρτέλα Worklist (Λίστα εργασιών) για να αντιστοιχίσετε λωρίδες. Συμβουλευτείτε το εγχειρίδιο χρήσης του συστήματος BD MAX για περισσότερες λεπτομέρειες. 15. Φορτώστε τους φορείς στο σύστημα BD MAX (Εικόνα 3). Εικόνα 2: Φόρτωση φυσίγγων BD MAX PCR Cartridges Πλευρά A Πλευρά B Εικόνα 3: Φόρτωση φορέων στο σύστημα BD MAX. 16. Κλείστε το κάλυμμα του συστήματος BD MAX και κάντε κλικ στο <Start> (Έναρξη) για να ξεκινήσει η επεξεργασία. 17. Στο τέλος της εκτέλεσης, ελέγξτε αμέσως τα αποτελέσματα ή φυλάξτε τα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος σε θερμοκρασία 2 8 C για έως και 5 ημέρες Ή σε θερμοκρασία 25 ± 2 C για μέγιστο διάστημα 5 ωρών έως ότου ελεγχθούν τα αποτελέσματα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν κάποιο διαφραγματικό καπάκι υπέστη ζημιά κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης, αντικαταστήστε το με ένα νέο πριν από τη φύλαξη του δείγματος. 5

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα έτοιμα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος BD MAX Cdiff φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2 8 C για μέγιστο διάστημα 120 ωρών (5 ημέρες) Ή σε θερμοκρασία 25 ± 2 C για μέγιστο διάστημα 5 ωρών μετά την προσθήκη του δείγματος στα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος. Εάν το αποτέλεσμα είναι απροσδιόριστο (IND), ανεπίλυτο (UNR) ή ελλιπές (INC), ή σε περίπτωση αποτυχίας του εξωτερικού προτύπου ελέγχου, πρέπει να πραγματοποιηθεί επαναληπτική εξέταση από το έτοιμο σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος εντός του συγκεκριμένου χρονικού πλαισίου (ανατρέξτε στην ενότητα «Επανάληψη της διαδικασίας εξέτασης»). ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Με τις διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου παρακολουθείται η απόδοση της ανάλυσης. Τα εργαστήρια πρέπει να καθορίζουν τον αριθμό, τον τύπο και τη συχνότητα των υλικών προτύπου ελέγχου των εξετάσεων σύμφωνα με τις οδηγίες ή τις απαιτήσεις των τοπικών, επαρχιακών, πολιτειακών, ομοσπονδιακών ή/ και κρατικών κανονισμών ή οργανισμών πιστοποίησης, με σκοπό την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας ολόκληρης της αναλυτικής διαδικασίας. Για γενικές οδηγίες ποιοτικού ελέγχου, ο χρήστης μπορεί να ανατρέξει στα έγγραφα CLSI MM03 και EP12. 13,14 1. Τα υλικά του εξωτερικού προτύπου ελέγχου δεν παρέχονται από τη BD. Τα εξωτερικά θετικά και αρνητικά πρότυπα ελέγχου δεν χρησιμοποιούνται από το λογισμικό του συστήματος BD MAX για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της εξέτασης των δειγμάτων. Τα εξωτερικά πρότυπα ελέγχου χρησιμοποιούνται σαν να ήταν δείγματα από ασθενείς. (Ανατρέξτε στον Πίνακα 1 της ενότητας «Ερμηνεία των αποτελεσμάτων» για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της ανάλυσης του εξωτερικού προτύπου ελέγχου.) 2. Στο σύστημα BD MAX κάθε εργαστηρίου θα πρέπει να υποβάλλεται σε ανάλυση, τουλάχιστον σε ημερήσια βάση, ένα (1) εξωτερικό θετικό πρότυπο ελέγχου και ένα (1) εξωτερικό αρνητικό πρότυπο ελέγχου έως ότου η επικύρωση της επεξεργασίας κριθεί επαρκής. Η μικρότερη συχνότητα εξέτασης των προτύπων ελέγχου θα πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς. Το εξωτερικό θετικό πρότυπο ελέγχου προορίζεται για την παρακολούθηση της ουσιαστικής αποτυχίας του αντιδραστηρίου. Το εξωτερικό αρνητικό πρότυπο ελέγχου προορίζεται για την ανίχνευση της επιμόλυνσης (ή μόλυνσης εκ μεταφοράς) του αντιδραστηρίου ή του περιβάλλοντος από τα στοχευόμενα νουκλεϊκά οξέα. 3. Συνιστώνται ποικίλοι τύποι εξωτερικών προτύπων ελέγχου προκειμένου ο χρήστης να επιλέξει τον καταλληλότερο για το πρόγραμμα ποιοτικού ελέγχου του εργαστηρίου του. α. Εξωτερικό αρνητικό πρότυπο ελέγχου: Εμπορικά διαθέσιμο υλικό προτύπου ελέγχου [π.χ. μη τοξινογόνο στέλεχος Clostridium difficile (ATCC 700057)] ή ήδη χαρακτηρισμένο δείγμα ως μη τοξινογόνο ή ως αρνητικό για τοξινογόνο Clostridium difficile. Η BD συνιστά το εξωτερικό αρνητικό πρότυπο ελέγχου να παρασκευάζεται πριν από το εξωτερικό θετικό πρότυπο ελέγχου για να μειωθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης ως αποτέλεσμα της παρασκευής του προτύπου ελέγχου. β. Εξωτερικό θετικό πρότυπο ελέγχου: Εμπορικά διαθέσιμο υλικό προτύπου ελέγχου [π.χ. στέλεχος Clostridium difficile που φέρει το γονίδιο tcdb (ATCC 43255)] ή ήδη χαρακτηρισμένο δείγμα ως τοξινογόνο ή ως θετικό για τοξινογόνο Clostridium difficile. Για την παρασκευή εναιωρήματος εξωτερικού προτύπου ελέγχου, συνιστάται η επανεναιώρηση των απομονωθέντων στελεχών σε αλατούχο διάλυμα σε θολερότητα 0,5 McFarland (~1 X 10 7 CFU/mL). Αραιώστε επανειλημμένα με αλατούχο διάλυμα για να λάβετε ένα τελικό εναιώρημα ~3,3 X 10 5 CFU/mL και ενοφθαλμίστε στο αντίστοιχο σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος έναν κρίκο 10 µl από το βακτηριακό εναιώρημα. Πραγματοποιήστε την επεξεργασία και την εξέταση όπως με τα δείγματα (ανατρέξτε στις ενότητες «Παρασκευή δείγματος» και «Λειτουργία συστήματος BD MAX»). 4. Όλα τα εξωτερικά πρότυπα ελέγχου θα πρέπει να αποδίδουν τα αναμενόμενα αποτελέσματα (θετικό για τα εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου και αρνητικό για τα εξωτερικά αρνητικά πρότυπα ελέγχου) και να μην αποτυγχάνει κανένα εξωτερικό πρότυπο ελέγχου (ανεπίλυτα ή απροσδιόριστα αποτελέσματα). 5. Το εξωτερικό αρνητικό πρότυπο ελέγχου που αποδίδει θετικό αποτέλεσμα εξέτασης υποδηλώνει σφάλμα χειρισμού του δείγματος ή/και επιμόλυνση. Ελέγξτε την τεχνική χειρισμού των δειγμάτων για την αποφυγή ανάμειξης ή/και επιμόλυνσης. Το εξωτερικό θετικό πρότυπο ελέγχου που αποδίδει αρνητικό αποτέλεσμα εξέτασης υποδηλώνει πρόβλημα χειρισμού/παρασκευής του δείγματος. Ελέγξτε την τεχνική χειρισμού/παρασκευής των δειγμάτων. 6. Το εξωτερικό πρότυπο ελέγχου που αποδίδει ανεπίλυτο, απροσδιόριστο ή ελλιπές αποτέλεσμα εξέτασης υποδηλώνει αποτυχία ενός αντιδραστηρίου ή του συστήματος BD MAX. Ελέγξτε την οθόνη του συστήματος BD MAX για μηνύματα σφάλματος. Ανατρέξτε στην ενότητα «Σύνοψη σφαλμάτων συστήματος» του εγχειριδίου χρήσης του συστήματος BD MAX 12 για την ερμηνεία των κωδικών προειδοποίησης και σφάλματος. Εάν το πρόβλημα επιμένει, χρησιμοποιήστε αντιδραστήρια από ένα κλειστό σακουλάκι ή χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ ανάλυσης. 7. Κάθε σωληνάριο εκχύλισης περιέχει ένα πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων, το οποίο είναι ένα πλασμίδιο που περιέχει μια συνθετική αλληλουχία του στοχευόμενου DNA. Το πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων εκχυλίζεται, εκλούεται και ενισχύεται μαζί με το DNA που υπάρχει στο επεξεργασμένο δείγμα, διασφαλίζοντας την προβλεψιμότητα της ανάλυσης. Το πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων παρακολουθεί την αποτελεσματικότητα της δέσμευσης, της πλύσης και της έκλουσης του DNA κατά τη διάρκεια των βημάτων της επεξεργασίας του δείγματος, καθώς και την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης και της ανίχνευσης του DNA κατά τη διάρκεια της ανάλυσης PCR. Εάν το αποτέλεσμα του προτύπου ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων αποτύχει να ικανοποιήσει τα κριτήρια αποδοχής, το αποτέλεσμα του δείγματος θα αναφερθεί ως ανεπίλυτο (Unresolved). Ωστόσο, θα αναφερθούν τα θετικά (POS) αποτελέσματα της ανάλυσης και δεν θα χαρακτηριστεί ως αρνητικός (NEG) κανένας στόχος. Ένα ανεπίλυτο αποτέλεσμα υποδηλώνει αναστολή που σχετίζεται με το δείγμα ή αποτυχία αντιδραστηρίου. Επαναλάβετε την εξέταση των δειγμάτων που αναφέρθηκαν ως ανεπίλυτα σύμφωνα με την ενότητα «Επανάληψη της διαδικασίας εξέτασης» παρακάτω. 6

ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Τα αποτελέσματα είναι διαθέσιμα στην καρτέλα Results (Αποτελέσματα), στο παράθυρο Results (Αποτελέσματα) στην οθόνη του συστήματος BD MAX. Το λογισμικό του συστήματος BD MAX ερμηνεύει αυτόματα τα αποτελέσματα της εξέτασης. Το αποτέλεσμα της εξέτασης μπορεί να χαρακτηριστεί ως NEG (αρνητικό), POS (θετικό) ή UNR (ανεπίλυτο)] με βάση την κατάσταση της ενίσχυσης του στόχου και του προτύπου ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων. Τα αποτελέσματα IND (απροσδιόριστο) ή INC (ελλιπές) οφείλονται σε αποτυχία του συστήματος BD MAX. Τα αποτελέσματα βασίζονται στον ακόλουθο αλγόριθμο απόφασης. Πίνακας 1: Ερμηνεία αποτελεσμάτων ανάλυσης BD MAX Cdiff Αναφερόμενο αποτέλεσμα ανάλυσης Cdiff POS Cdiff NEG Ερμηνεία του αποτελέσματος α Ανιχνεύθηκε DNA γονιδίου tcdb Δεν ανιχνεύθηκε DNA γονιδίου tcdb Cdiff UNR IND INC Ανεπίλυτο δεν πραγματοποιήθηκε ενίσχυση του στόχου ή του προτύπου ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων. Ανασταλτικό δείγμα ή αποτυχία αντιδραστηρίου Απροσδιόριστο αποτέλεσμα λόγω αποτυχίας του συστήματος BD MAX (με κωδικούς προειδοποίησης ή σφάλματος β ) Ελλιπής εκτέλεση (με κωδικούς προειδοποίησης ή σφάλματος β ) α Τα αποτελέσματα της ανάλυσης BD MAX Cdiff μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να κατευθύνουν το επίπεδο των μέτρων προφύλαξης σύμφωνα με τα προγράμματα και τις πρακτικές των ιδρυμάτων. β Ανατρέξτε στην ενότητα «Αντιμετώπιση προβλημάτων» του εγχειριδίου χρήσης του συστήματος BD MAX 12 για την ερμηνεία των κωδικών προειδοποίησης και σφάλματος. ΕΠΑΝΑΛΗΨΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο όγκος του σωληναρίου ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος επαρκεί για μία επανάληψη της εξέτασης στο σύστημα BD MAX. Για τα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος που φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου, η επανάληψη της εξέτασης πρέπει να πραγματοποιείται εντός 5 ωρών μετά το τέλος της εκτέλεσης. Εναλλακτικά, για τα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος που φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2 8 C, η επανάληψη της εξέτασης πρέπει να πραγματοποιηθεί εντός 120 ωρών (5 ημέρες). Το δείγμα κοπράνων που απομένει μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την επανάληψη της εξέτασης εντός 5 ημερών από τη συλλογή, εφόσον φυλαχθεί σε θερμοκρασία 2 8 C, ή εντός 48 ωρών, εφόσον φυλαχθεί σε θερμοκρασία 2 25 C. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η εξέταση των νέων δειγμάτων μπορεί να πραγματοποιηθεί στην ίδια εκτέλεση με τα δείγματα της επανάληψης. ΑΝΕΠΙΛΥΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ Ανεπίλυτα αποτελέσματα μπορούν να ληφθούν στην περίπτωση που κάποια αναστολή σχετιζόμενη με το δείγμα ή αποτυχία αντιδραστηρίου εμποδίζει τη σωστή ενίσχυση του στόχου ή του προτύπου ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων. Η εξέταση των δειγμάτων μπορεί να επαναληφθεί από τα αντίστοιχα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος εντός του χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Περιδινήστε τα δείγματα για ένα (1) λεπτό και ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Λειτουργία συστήματος BD MAX». Το δείγμα κοπράνων που απομένει μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την επανάληψη της εξέτασης εντός του χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Παρασκευή δείγματος». ΑΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ Απροσδιόριστα αποτελέσματα μπορούν να ληφθούν σε περίπτωση αποτυχίας του συστήματος. Η εξέταση των δειγμάτων μπορεί να επαναληφθεί από τα αντίστοιχα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος εντός του χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Περιδινήστε τα δείγματα για ένα (1) λεπτό και ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Λειτουργία συστήματος BD MAX». Το δείγμα κοπράνων που απομένει μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την επανάληψη της εξέτασης εντός του χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Παρασκευή δείγματος». Για την ερμηνεία των μηνυμάτων κωδικών προειδοποίησης και σφάλματος, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του συστήματος BD MAX 12 (ενότητα «Αντιμετώπιση προβλημάτων»). ΕΛΛΙΠΕΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ Ελλιπή αποτελέσματα μπορούν να ληφθούν στην περίπτωση που η παρασκευή του δείγματος ή η PCR δεν πέτυχε τα αναμενόμενα χρονικά σημεία. Η εξέταση των δειγμάτων μπορεί να επαναληφθεί από τα αντίστοιχα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος εντός του επιτρεπτού χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Περιδινήστε τα δείγματα για ένα (1) λεπτό και ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Λειτουργία συστήματος BD MAX». Το δείγμα κοπράνων που απομένει μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την επανάληψη της εξέτασης εντός του χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Παρασκευή δείγματος». Για την ερμηνεία των μηνυμάτων κωδικών προειδοποίησης και σφάλματος, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του συστήματος BD MAX 12 (ενότητα «Αντιμετώπιση προβλημάτων»). 7

ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Τα εξωτερικά πρότυπα ελέγχου θα πρέπει να αποδίδουν τα αναμενόμενα αποτελέσματα όταν εξετάζονται. Εάν χρειαστεί να επαναληφθεί η εξέταση δειγμάτων λόγω εσφαλμένου αποτελέσματος εξωτερικού προτύπου ελέγχου, αυτή θα πρέπει να γίνεται από τα σωληνάρια ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος μαζί με πρόσφατα παρασκευασμένα εξωτερικά πρότυπα ελέγχου εντός του χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Περιδινήστε τα δείγματα για ένα (1) λεπτό και ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Λειτουργία συστήματος BD MAX». Το δείγμα κοπράνων που απομένει μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την επανάληψη της εξέτασης εντός του χρονικού πλαισίου που καθορίστηκε παραπάνω. Ξεκινήστε ξανά τη διαδικασία από την ενότητα «Παρασκευή δείγματος». ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Για να γίνει ταυτοποίηση των ειδών απευθείας από τα κόπρανα, τα κλινικά δείγματα μπορούν να καλλιεργηθούν ακολουθώντας τις διαδικασίες του νοσοκομείου. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Αυτό το προϊόν προορίζεται για χρήση μόνο με μη διατηρημένα υγρά ή μαλακά κόπρανα. Δεν έχουν επιβεβαιωθεί τα χαρακτηριστικά απόδοσης άλλων τύπων κλινικών δειγμάτων. Αυτό το προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο στο σύστημα BD MAX. Ενδέχεται να προκύψουν εσφαλμένα αποτελέσματα εξέτασης από ακατάλληλη συλλογή δείγματος, ακατάλληλο χειρισμό ή φύλαξη, τεχνικό σφάλμα, ανάμειξη δειγμάτων μεταξύ τους ή επειδή ο αριθμός των μικροοργανισμών στο δείγμα είναι μικρότερος από αυτόν που μπορεί να προσδιοριστεί με βάση την αναλυτική ευαισθησία της εξέτασης. Για την αποφυγή εσφαλμένων αποτελεσμάτων είναι απαραίτητη η πιστή τήρηση των οδηγιών που περιέχονται στο ένθετο συσκευασίας και στο εγχειρίδιο χρήσης του συστήματος BD MAX 12. Ένα θετικό αποτέλεσμα της ανάλυσης BD MAX Cdiff δεν υποδηλώνει απαραίτητα την παρουσία βιώσιμων μικροοργανισμών. Υποδεικνύει ωστόσο την παρουσία του γονιδίου tcdb και επιτρέπει την πιθανή ανίχνευση του τοξινογόνου μικροοργανισμού Clostridium difficile. Η ανάλυση BD MAX Cdiff δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση ειδών καθώς δεν περιέχει ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτές για το Clostridium difficile. Όπως συμβαίνει με όλες τις in vitro διαγνωστικές εξετάσεις που βασίζονται στην PCR, ενδέχεται να ανιχνευτούν εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα στόχου, τα οποία βρίσκονται κάτω από το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης, αλλά τα αποτελέσματα να μη μπορούν να αναπαραχθούν. Το Mesalamine rectal suspension enema και το Gynol II* μπορούν να προκαλέσουν ελαφρά αναστολή της ανάλυσης BD MAX Cdiff (ανατρέξτε στην ενότητα «Ουσίες παρεμβολής» για περαιτέρω λεπτομέρειες). Τα υγρά Tums* και Maalox* μπορούν να προκαλέσουν την αναστολή της ανάλυσης BD MAX Cdiff (ανατρέξτε στην ενότητα «Ουσίες παρεμβολής» για περαιτέρω λεπτομέρειες). Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω της απώλειας νουκλεϊκού οξέος από ανεπαρκή συλλογή, μεταφορά και φύλαξη των δειγμάτων, ή λόγω ανεπαρκούς λύσης των βακτηριακών κυττάρων. Το πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων έχει προστεθεί στην εξέταση με σκοπό να συμβάλλει στην ταυτοποίηση των δειγμάτων που περιέχουν αναστολείς της ενίσχυσης PCR. Το πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων δεν υποδεικνύει τυχόν απώλεια νουκλεϊκού οξέος από ανεπαρκή συλλογή, μεταφορά και φύλαξη των δειγμάτων, ή τυχόν ανεπάρκεια της λύσης των βακτηριακών κυττάρων. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης BD MAX Cdiff ενδέχεται ορισμένες φορές να είναι ανεπίλυτα, λόγω μη έγκυρου προτύπου ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων, ή να είναι απροσδιόριστα ή ελλιπή, λόγω αποτυχίας του συστήματος, και απαιτείται επανάληψη τη εξέτασης, γεγονός που μπορεί να καθυστερήσει τη λήψη των τελικών αποτελεσμάτων. Οι μεταλλάξεις ή οι πολυμορφισμοί σε περιοχές σύνδεσης εκκινητή ή ανιχνευτή, ενδέχεται να επηρεάσουν την ανίχνευση παραλλαγών του γονιδίου tcdb του Clostridium difficile οδηγώντας σε ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα με την ανάλυση BD MAX Cdiff. Οι παραλλαγές τοξινογόνου Clostridium difficile χωρίς το γονίδιο tcdb ή με μη λειτουργική πρωτεΐνη τοξίνης Β είναι σπάνιες. 15-18 Η ανάλυση BD MAX Cdiff στοχεύει το γονίδιο tcdb και δεν είναι γνωστό εάν θα ήταν δυνατή η ανίχνευση παραλλαγών στελεχών με τοξίνη Α+/τοξίνη Β-. Η υπερβολική ποσότητα κοπράνων μπορεί να αναστείλει την ανάλυση BD MAX Cdiff. Όπως συμβαίνει με όλες τις in vitro διαγνωστικές εξετάσεις, οι θετικές και οι αρνητικές προγνωστικές τιμές εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τον επιπολασμό. Η απόδοση της ανάλυσης BD MAX Cdiff ενδέχεται να διαφέρει ανάλογα με τον επιπολασμό και τον εξεταζόμενο πληθυσμό. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Τα χαρακτηριστικά της κλινικής απόδοσης της ανάλυσης BD MAX Cdiff προσδιορίστηκαν σε μια πολυκεντρική, προοπτική, διερευνητική μελέτη. Έξι (6) ερευνητικά κέντρα συμμετείχαν στη μελέτη. Για την εισαγωγή τους στη μελέτη, τα δείγματα έπρεπε να προέρχονται από ασθενείς με πιθανολογούμενη λοίμωξη από Clostridium difficile, για τα οποία είχε υποδειχθεί και ζητηθεί η διενέργεια διαγνωστικών εξετάσεων. Συμπεριλήφθηκαν μόνο δείγματα μαλακών ή υγρών κοπράνων και μόνο ένα δείγμα ανά ασθενή. Η συγκριτική μέθοδος αναφοράς περιλάμβανε τοξινογόνο καλλιέργεια, η οποία ορίζεται ως αναερόβια καλλιέργεια για την απομόνωση ενός στελέχους Clostridium difficile,και κατόπιν, εφόσον το στέλεχος υπάρχει, την αξιολόγηση της τοξινογονικότητας του απομονωθέντος στελέχους με έλεγχο κυτταροτοξικότητας ιστοκαλλιεργειών. Η αναερόβια καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε σε τρυβλία με τροποποιημένο άγαρ κυκλοσερίνης-κεφοξιτίνης-φρουκτόζης. Οι αποικίες που μορφολογικά έμοιαζαν με Clostridium difficile και επιβεβαιώθηκαν από χρώση Gram, από χαρακτηριστική δυσάρεστη οσμή, από θετικό αποτέλεσμα με τη μέθοδο διάχυσης με δίσκους (L-προλίνη) και από μη αντοχή των αερόβιων σε τρυβλίο με σοκολατούχο άγαρ αξιολογήθηκαν ως προς την τοξινογονικότητα. Ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε με έλεγχο τοξινών/αντιτοξινών σε διηθήματα ζωμού cooked meat glucose (CMG) όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. 8

Εξετάστηκαν συνολικά 1.881 δείγματα μαλακών και υγρών κοπράνων με τοξινογόνο καλλιέργεια και την ανάλυση BD MAX Cdiff. Τα συμβατά δείγματα ήταν 1.628 και αναφέρθηκαν 1.607 αποτελέσματα (Πίνακας 2). Συγκριτικά με την τοξινογόνο καλλιέργεια, η ανάλυση BD MAX Cdiff ταυτοποίησε το 96,3% των τοξινογόνων θετικών δειγμάτων Clostridium difficile και το 92,4% των τοξινογόνων αρνητικών δειγμάτων Clostridium difficile (Πίνακας 3). Πίνακας 2: Αποτελέσματα που λήφθηκαν με την ανάλυση BD MAX Cdiff σε σύγκριση με την τοξινογόνο καλλιέργεια Όλα τα κλινικά κέντρα Ανάλυση BD MAX Cdiff Τοξινογόνος καλλιέργεια + - Σύνολο + 158 110 268-6 1.333 1.339 Σύνολο 164 1.443 1.607 Πίνακας 3: Απόδοση της ανάλυσης BD MAX Cdiff σε σύγκριση με την τοξινογόνο καλλιέργεια Κλινικά κέντρα Επιπολασμός Ευαισθησία με 95% CI α Ειδικότητα με 95% CI α Κέντρο 1 4,3% (9/210) Κέντρο 2 10,0% (26/261) Κέντρο 3 8,0% (28/352) Κέντρο 4 3,5% (17/487) Κέντρο 5 14,4% (21/146) Κέντρο 6 18,3% (73/399) Συνολικά 9,4% (174/1.855) α CI: Διαστήματα εμπιστοσύνης 87,5% (7/8) (52,9%, 97,8%) 100% (26/26) (87,1%, 100%) 96% (24/25) (80,5%, 99,3%) 90,9% (10/11) (62,3%, 98,4%) 95,2% (20/21) (77,3%, 99,2%) 97,3% (71/73) (90,5%, 99,2%) 96,3% (158/164) (92,2%, 98,3%) 94,4% (152/161) (89,7%, 97%) 90,6% (213/235) (86,2%, 93,7%) 93,9% (276/294) (90,5%, 96,1%) 90,9% (279/307) (87,1%, 93,6%) 94,3% (115/122) (88,6%, 97,2%) 92%(298/324) (88,5%, 94,5%) 92,4% (1.333/1.443) (90,9%, 93,6%) Από τα 1.635 δείγματα μαλακών ή υγρών κοπράνων που εξετάστηκαν με την ανάλυση BD MAX Cdiff, 47 (2,9%) αναφέρθηκαν αρχικά ως ανεπίλυτα. Για τριάντα τέσσερα (34) από αυτά επαναλήφθηκε η εξέταση και 26 επιλύθηκαν μετά την επανεξέταση. Συνολικά, το 0,5% παρέμεινε ανεπίλυτο μετά την επανάληψη της εξέτασης. Αναλυτική ευαισθησία Η αναλυτική ευαισθησία (όρια ανίχνευσης ή LoD) για την ανάλυση BD MAX Cdiff προσδιορίστηκε ως εξής: Για την παρασκευή προσομοιωμένων θετικών δειγμάτων, βυθίστηκαν κρίκοι ενοφθαλμισμού σε ένα ευρύ φάσμα βακτηριακών εναιωρημάτων Clostridium difficile με διαφορετικές συγκεντρώσεις, τα οποία παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά από καλλιέργειες 4 στελεχών Clostridium difficile που αντιπροσώπευαν 3 τύπους τοξινογονικότητας (0, III, VIII). Στη συνέχεια κάθε κρίκος μεταφέρθηκε σε σωληνάριο ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος που περιείχε κοπρανώδεις ουσίες, αρνητικές για τοξινογόνο Clostridium difficile. Κάθε στέλεχος Clostridium difficile υποβλήθηκε σε εξέταση 24 φορές ανά συγκέντρωση από 2 διαφορετικούς χειριστές χρησιμοποιώντας 3 διαφορετικές παρτίδες παραγωγής της ανάλυσης BD MAX Cdiff. Η αναλυτική ευαισθησία (LoD), που ορίστηκε ως η χαμηλότερη συγκέντρωση για την οποία το αποτέλεσμα ήταν θετικό στο 95% του συνόλου των επαναληπτικών εξετάσεων, κυμάνθηκε από 125 έως 265 CFU ανά κρίκο (Πίνακας 4). Στέλεχος Clostridium difficile Πίνακας 4: Όριο ανίχνευσης της ανάλυσης BD MAX Cdiff Τύπος τοξινογονικότητας LoD (CFU/κρίκο [95% CI α ]) ATCC 43255 0 265 [140, 502] ATCC 9689 0 156 [82, 298] ATCC BAA-1805 III 205 [102, 412] ATCC 43598 VIII 125 [66, 235] α CI: Διάστημα εμπιστοσύνης 9

Αναλυτική συμπεριληψιμότητα Μια ποικιλία τοξινογόνων στελεχών Clostridium difficile συμπεριλήφθηκε σε αυτή τη μελέτη λαμβάνοντας υπόψη τη γεωγραφική προέλευση, τους τύπους τοξινογονικότητας, τις εξάρσεις του NAP1/027/BI και τις χρονικές διαφορές. Εξετάστηκαν εξήντα τέσσερα (64) στελέχη που περιλάμβαναν 23 τύπους τοξινογονικότητας 19-21 και αντιπροσώπευαν 21 χώρες, μεταξύ των οποίων στελέχη από δημόσιες συλλογές και από καλά χαρακτηρισμένα κλινικά απομονωθέντα στελέχη. Η ανάλυση ταυτοποίησε ορθά όλα τα τοξινογόνα στελέχη Clostridium difficile που εξετάστηκαν. Αναλυτική ειδικότητα Η ανάλυση BD MAX Cdiff πραγματοποιήθηκε σε δείγματα που περιείχαν φυλογενετικά σχετιζόμενα είδη (Clostridium εκτός του τοξινογόνου Clostridium difficile) ή άλλους μικροοργανισμούς (βακτήρια, ιοί) που είναι πιθανόν να βρεθούν σε δείγματα κοπράνων. Έξι (6) στα 6 στελέχη Clostridium difficile που δεν έφεραν το γονίδιο tcdb εξετάστηκαν σε συγκέντρωση 1 X 10 8 CFU/mL και έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα με την ανάλυση BD MAX Cdiff. Τριάντα (30) στα 30 στελέχη Clostridium εκτός του Clostridium difficile (συμπεριλαμβανομένων 4 στελεχών Clostridium sordellii), εξετάστηκαν σε συγκέντρωση 1 X 10 8 CFU/mL και έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα με την ανάλυση BD MAX Cdiff. Ενενήντα οχτώ (98) στα 98 βακτηριακά στελέχη (συμπεριλαμβανομένων 93 ειδών και υποειδών) εξετάστηκαν σε συγκέντρωση 1 X 10 8 CFU/mL (ή ~ 1 X 10 8 γονιδιωματικό DNA cp/ml ή 1 X 10 8 στοιχειώδη σωμάτια/ml) και έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα με την ανάλυση BD MAX Cdiff. Επτά (7) στους 7 ιούς εξετάστηκαν σε συγκέντρωση 1 X 10 5 PFU/mL και έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα με την ανάλυση BD MAX Cdiff. Ουσίες παρεμβολής Είκοσι πέντε (25) βιολογικές και χημικές ουσίες που θα μπορούσαν περιστασιακά να χρησιμοποιηθούν ή να βρεθούν σε περιπρωκτικά, πρωκτικά δείγματα και δείγματα κοπράνων αξιολογήθηκαν για την πιθανότητα παρεμβολής στην ανάλυση BD MAX Cdiff. Δύο (2) μικροοργανισμοί (Escherichia coli ATCC 25922 και μη τοξινογόνο Clostridium difficile ATCC 700057) εξετάστηκαν επίσης σε υψηλό φορτίο προκειμένου να αξιολογηθεί η βακτηριακή παρεμβολή. Τα αρνητικά δείγματα τοξινογόνου Clostridium difficile και τα θετικά δείγματα τοξινογόνου Clostridium difficile σε συγκέντρωση 2 3X LoD εξετάστηκαν με την υψηλότερη ποσότητα από κάθε ουσία που είναι πιθανό να βρεθεί στα δείγματα ή με μικροοργανισμούς που προκαλούν παρεμβολή (1 X 10 8 CFU/mL από κάθε στέλεχος). Στις δυνητικές ουσίες παρεμβολής περιλαμβάνονται το ανθρακικό ασβέστιο (Tums*) καθώς και το υδροξείδιο του μαγνησίου και του αργιλίου (υγρό Maalox*). Τα αποτελέσματα δεν κατέδειξαν αναφερτή παρεμβολή από καμία ουσία που εξετάστηκε, εκτός των Mesalamine rectal suspension enema και Gynol II* για τα οποία διαπιστώθηκε ελαφρά αναστολή (καθυστέρηση της τετμημένης κορυφής δεύτερης παραγώγου) στην ανάλυση BD MAX Cdiff. Ωστόσο και στην περίπτωση αυτή λήφθηκαν τα αναμενόμενα αποτελέσματα της ανάλυσης (Πίνακας 5). Πίνακας 5: Ενδογενείς και εμπορικά διαθέσιμες εξωγενείς ουσίες που εξετάστηκαν με την ανάλυση BD MAX Cdiff Ιδιοσκεύασμα ή περιγραφή Αποτέλεσμα Ιδιοσκεύασμα ή περιγραφή Αποτέλεσμα Νυστατίνη NI Pepto Bismol* NI Hyderm* Hydrocortisone (κρέμα) NI Ex-Lax* NI Υπόθετα γλυκερίνης NI Μετρονιδαζόλη NI Ihle s Paste NI Βανκομυκίνη NI Anusol* Plus NI Polysporin* NI Preparation H* with Bio-Dyne* cream NI Naproxen NI Major Prep* με φαινυλεφρίνη NI Tucks* personal cleansing pads NI Tums* I Triglyceride Mix (C2-C10) NI Maalox* υγρό I Παλμιτικό οξύ NI Mesalamine rectal suspension enema α Στεατικό οξύ NI Fleet* mineral oil enema NI Αίμα NI Gynol II* κολπικό αντισυλληπτικό (με νονοξυνόλη-9) α Βλέννα NI Imodium AD* NI Escherichia coli + μη τοξινογόνο Clostridium difficile NI I: Παρεμβολή στην ανάλυση BD MAX Cdiff. NI: Μη αναφερτή παρεμβολή στην ανάλυση BD Cdiff. α Για τα Mesalamine rectal suspension enema και Gynol II* (με νονοξυνόλη-9) διαπιστώθηκε ελαφρά αναστολή (καθυστέρηση της τετμημένης κορυφής δεύτερης παραγώγου) στην ανάλυση BD MAX Cdiff. Ωστόσο και στην περίπτωση αυτή λήφθηκαν τα αναμενόμενα αποτελέσματα της ανάλυσης. 10

Αναπαραγωγιμότητα Το πάνελ αναπαραγωγιμότητας περιλάμβανε 5 κατηγορίες δειγμάτων ως εξής: Μέτριο θετικό (MP): 2 5X LoD Χαμηλό θετικό (LP): 1 2X LoD Υψηλό αρνητικό 1:10 (HN1:10): 10πλάσια αραίωση του 1X LoD Υψηλό αρνητικό 1:100 (HN1:100): 100πλάσια αραίωση του 1X LoD Αληθώς αρνητικό Τα δείγματα κάθε κατηγορίας εξετάστηκαν εις τριπλούν, σε 5 διαφορετικές ημέρες, κατά τις οποίες κάθε ημέρα εξετάστηκαν 2 πάνελ από 2 τεχνολόγους, σε 3 κλινικά κέντρα χρησιμοποιώντας 1 παρτίδα αντιδραστηρίων (ανά κέντρο). Το συνολικό ποσοστό συμφωνίας ήταν 100% για τις κατηγορίες MP, LP και Neg με 92,2% και 50,0% αρνητική συμφωνία για τις κατηγορίες HN1:100 και HN1:10 αντίστοιχα (Πίνακας 6). Η τετμημένη κορυφής δεύτερης παραγώγου (SDPA), ένα εσωτερικό κριτήριο που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του τελικού αποτελέσματος της ανάλυσης, επιλέχτηκε ως επιπλέον τρόπος αξιολόγησης της αναπαραγωγιμότητας της ανάλυσης. Οι συνολικές μέσες τιμές SDPA με συνιστώσες διασποράς (SD και %CV) παρουσιάζονται στον Πίνακα 6. Κατηγορία Πίνακας 6: Αποτελέσματα μελέτης αναπαραγωγιμότητας ανά κέντρο χρησιμοποιώντας μία παρτίδα ΚΕΝΤΡΟ Κέντρο 1 Κέντρο 2 Κέντρο 3 Ποσοστό συμφωνίας Ποσοστό συμφωνίας Ποσοστό συμφωνίας Συνολικό ποσοστό συμφωνίας Συνολική μέση τιμή Τιμές SDPA α Neg α 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 28,7 0,30 1,1 HN1:100 α,β 28/30 93,3% 25/30 83,3% 30/30 100,0% 92,2% (84,8%, 96,2%) 28,8 0,39 1,4 HN1:10 α,β 17/30 56,7% 8/30 26,7% 20/30 66,7% 50,0% (39,9%, 60,1%) 28,8 0,36 1,2 LP 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 32,5 0,77 2,4 MP 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 31,6 0,82 2,6 α Για τις κατηγορίες Negative (Αρνητικό) και High Negative (Υψηλό αρνητικό), οι τιμές SDPA που αναφέρονται αφορούν το πρότυπο ελέγχου επεξεργασίας δειγμάτων. Για τις άλλες κατηγορίες, οι τιμές SDPA που αναφέρονται αφορούν τον τοξινογόνο στόχο Clostridium difficile. β Για την κατηγορία High Negative (Υψηλό αρνητικό), το αναμενόμενο αποτέλεσμα της ανάλυσης θεωρήθηκε αρνητικό. Ως εκ τούτου, το ποσοστό συμφωνίας υπολογίστηκε για αρνητικά αποτελέσματα. SD %CV Μόλυνση εκ μεταφοράς / Διασταυρούμενη επιμόλυνση Διενεργήθηκε μια μελέτη για τη διερεύνηση της επιμόλυνσης εντός της εκτέλεσης και μεταξύ εκτελέσεων κατά την επεξεργασία δειγμάτων με υψηλό βακτηριακό φορτίο τοξινογόνου Clostridium difficile στην ανάλυση BD MAX Cdiff. Χρησιμοποιήθηκε ένα πάνελ που περιλάμβανε ένα υψηλά θετικό μέλος και ένα αρνητικό μέλος για την παρασκευή πολυάριθμων δειγμάτων. Χρησιμοποιήθηκε ένα στέλεχος Clostridium difficile (Tox 0, ATCC 9689) για το υψηλά θετικό μέλος Clostridium difficile του πάνελ (~3 x 10 8 CFU/mL). Το αρνητικό μέλος δεν περιείχε κανέναν αναλύτη-στόχο. Δώδεκα (12) αντίγραφα του υψηλά θετικού μέλους του πάνελ και 12 αντίγραφα του αρνητικού μέλους του πάνελ εξετάστηκαν σε κάθε εκτέλεση εναλλάσσοντας τα αρνητικά και τα θετικά δείγματα. Τρεις (3) χειριστές πραγματοποίησαν 3 διαδοχικές εκτελέσεις για συνολικά 9 εκτελέσεις των 24 δειγμάτων. Δεν υπήρξαν ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω μόλυνσης εκ μεταφοράς/επιμόλυνσης. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ 1. Dubberke ER, Wertheimer AI. Review of current literature on the economic burden of Clostridium difficile infection. Infect Control Hosp Epidemiol 2009; 30:57-66. 2. Poutanen SM, Simor AE. Clostridium difficile-associated diarrhea in adults. Can Med Assoc J 2004;171:51-8. 3. Redelings MD, Sorvillo F, Mascola L. Increase in Clostridium difficile-related mortality rates, United States, 1999-2004. Emerg Infect Dis 2007;13:1417-9. 4. McDonald LC, Owing M, Jernigan DB. Clostridium difficile Infection in Patients Discharged from US Short-Stay hospitals, 1996 2003. Emerging Infectious Diseases, 2006, 12 (3):409-415. 5. Pepin J, Valiquettte L, Alary ME. Clostridium difficile associated diarrhea in a region of Quebec from 1991 to 2003: a changing pattern of disease severity. CMAJ. 2004;171:466 72. 6. Bignardi GE. Risk factors for Clostridium difficile infection. J Hosp Infect 1998; 40:1-15. 7. Peterson LR, Robicsek A. Does my patient have Clostridium difficile infection? Ann Intern Med 2009;151:176-9. 8. Lyras D, O Connor JR, Howarth PM, et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature 2009;458:1176-9. 9. Delmee M. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile disease. Clin Microbiol Infect. 2001 Aug;7(8):411-6. 10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (Refer to the latest edition). 11. Centers for Disease Control and Prevention, and National Institutes of Health. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Chosewood L.C. and Wilson D.E. (eds) (2009). HHS Publication number (CDC) 93-8395. 12. BD MAX System User s Manual (Refer to the latest version) BD Life Sciences, Sparks, MD, USA. 11

13. Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, document MM03 (Refer to the latest edition). 14. Clinical and Laboratory Standards Institute. User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline. Document EP12 (Refer to the latest edition). 15. Cohen SH et al. (1998) Isolation of a Toxin B-deficient mutant strain of Clostridium difficile in a case of recurrent Clostridium difficile Associated Diarrhea, Clin. Infect. Dis. 26: 410-412. 16. Cohen SH et al. (2000) Analysis of the pathogenicity locus in Clostridium difficile strains, J. Infect. Dis. 181: 659-63. 17. MacCannell D. et al. (2006) Characterization of a novel, tcdb-deficient, NPA1 variant strain of Clostridium difficile, 46th Annual ICAAC, San Francisco, Sept. 2006. 18. McFarland, L.V., et al., Implications of the changing face of Clostridium difficile disease for health care practitioners. Am J Infect Control, 2007. 35(4): p. 237-53. 19. Rupnik M. et al. A novel toxinotyping scheme and correlation of toxinotypes with serogroups of Clostridium difficile isolates, J Clin Microbiol, 1998, 36 (8): 2240-2247. 20. Rupnik M. et al. Comparison of toxinotyping and PCR ribotyping of Clostridium difficile strains and description of novel toxinotypes, Microbiology 2001, 147, 439-447. 21. Rupnik M. et al. New types of Toxin A-Negative, Toxin B-Positive strains among Clostridium difficile isolates from Asia, J Clin Microbiol, 2003, 41(3): 1118-1125. 12