Εργαστηριακή άσκηση 6: Κυτταρομετρία ροής Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδασκαλίας: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία
Εισαγωγικά ιστορικά στοιχεία Οι πρώτες μελέτες για αναλυτές Κυτταρομετρίας Ροής έγιναν το 1934 από τον Moldavan και συνεχίστηκαν με τις εργασίες του W.Coulter Οι πρώτες εφαρμογές της Κυτταρομετρίας Ροής στην ιατρική άρχισαν την δεκαετία του 60 απο τους Kamentsky και Fulwyler Η ανακάλυψη των μονοκλωνικών αντισωμάτων (Nobel 1984 στους Kohler και Milstein) άνοιξε το δρόμο στη σύγχρονη Κυτταρομετρία Ροής που διεύρυνε σημαντικά το πεδίο των κλινικών εφαρμογών H πρώτη συσκευή κυτταρομετρίας ροής από τους αδερφούς Coulter H πρώτη πατέντα των αδερφών Coulter
Γενικά χαρακτηριστικά Η Κυτταρομετρία Ροής είναι μια τεχνική που εκμεταλλεύεται την μέτρηση ορισμένων βιοχημικών και βιοφυσικών παραμέτρων των κυττάρων μεμονωμένα, όταν αυτά βρίσκονται σε εναιώρημα εντός υγρού που ρέει σε νηματοειδή ροή. Η ανάλυση αυτή μπορεί να αφορά το μέγεθος, τον όγκο, την κοκκίωση, καθώς και χημικές ιδιότητες όπως την περιεκτικότητα σε DNA και RNA, πρωτεΐνες και ένζυμα. Κυτταρικά επιφανειακά μόρια μπορούν ευκρινώς να ανιχνευθούν με ανοσοφθορισμό με την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η ανίχνευση αυτών των παραμέτρων επιτυγχάνεται με την μέτρηση της σκέδασης του φωτός, με την ανίχνευση του όγκου των κυττάρων και με τη μέτρηση της έντασης του φθορισμού
Mόνο μετρήσεις τελικού σημείου Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της κυτταρομετρίας ροής Πλεονεκτήματα: Μικρός όγκος δείγματος Μικρή επεξεργασία δείγματος Ταυτόχρονος προσδιορισμός πολλών χαρακτηριστικών των κυττάρων (πολυπαραμετρική ανάλυση) Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Επαναληψιμότητα των μετρήσεων Πολύ μεγάλη ταχύτητα μέτρησης (500-10000 κύτταρα/sec) Μειονεκτήματα: Δεν λαμβάνονται υπόψη οι διατμητικές δυνάμεις Ακριβά αντιδραστήρια Είναι διαθέσιμη σε λίγα διαγνωστικά εργαστήρια σαν πρώτης γραμμής διαγνωστικό τεστ
Εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής Ανοσολογία-Αιματολογία Φαινοτυπική ανάλυση των λεμφοκυττάρων και των υποπληθυσμών τους Μελέτη μικτής καλλιέργειας λεμφοκυττάρων Καθορισμός του λευκοκυτταρικού τύπου Προσδιορισμός αντιαιμοπεταλιακών αντισωμάτων Έλεγχος της φαγοκυτταρικής λειτουργίας Φαινοτυπική ανάλυση κακοήθων κυττάρων Διάγνωση και τυποποίηση λευχαιμιών και λεμφωμάτων Διάγνωση και παρακολούθηση κληρονομικών και επίκτητων ανοσοανεπαρκειών Διάγνωση και παρακολούθηση αυτοάνοσων νοσημάτων Μέτρηση ανοσοσυμπλεγμάτων HLA τυποποίηση Διασταύρωση ιστοσυμβατότητας
Εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής (2) Ογκολογία Καθορισμός της περιεκτικότητας ενός κυτταρικού πληθυσμού σε DNA RNA Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου Ανάλυση ογκογονιδίων Προσδιορισμός πυρηνικών αντιγόνων Προσδιορισμός δεικτών όγκων Ανάλυση πολυπλοειδίας του DNA Μικροβιολογία Ταυτοποίηση βακτηρίων με χρήση χρώσεων DNA, ενζυμικής δραστικότητας ή παραμέτρων σκέδασης φωτός Προσδιορισμός και αρίθμηση μικροοργανισμών και ενδοκυτταριων παρασίτων Ενδοκρινολογία Ανάλυση σπέρματος με μέτρηση περιεκτικότητας σε DNA Υποδοχείς ορμονών Γενετική Χρωμοσωματική ανάλυση Άλλες εφαρμογές Ενδοκυττάριες κυτταροκίνες, Δυναμικό μεμβράνης
Η μέθοδος της κυτταρομετρίας ροής Για τη μέτρηση των δειγμάτων αυτό που απαιτείται αρχικά είναι το δείγμα να βρίσκεται σε μορφή κυτταρικού εναιωρήματος. Κάθε κύτταρο μεγέθους μεταξύ 0.2-150 μm είναι κατάλληλο για ανάλυση. Τα προς εξέταση κύτταρα επισημαίνονται με ένα ή περισσότερα μονοκλωνικά αντισώματα που έχουν σημανθεί με τις κατάλληλες φθορίζουσες χρωστικές και το δείγμα αναλύεται στο κυτταρόμετρο ροής
Αρχές λειτουργίας της κυτταρομετρίας ροής Ένας κυτταρομετρητης ροής αποτελείται από τα εξής μέρη: Υδραυλικό σύστημα που αναγκάζει τα κύτταρα να ρέουν το ένα μετά το άλλο μπροστά στην ακτίνα LASER Πηγή φωτός (ακτίνα LASER Argon-ion) Ανιχνευτές του φωτός και του φθορισμού Μονάδα ηλεκτρονικού υπολογιστή για την επεξεργασία των σημάτων
Σύστημα ροής υγρών-υδροδυναμικό σύστημα Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιεί την αρχή της υδροδυναμικής εστίασης των κυττάρων. Το δείγμα εισέρχεται σε ειδικό διαμέρισμα όπου υδροδυναμικά η ροή στενεύει σε διάμετρο αναγκάζοντας το κύτταρο να διέλθει ένα-ένα πριν συναντήσει τη δέσμη laser. Το πρώτο υδραυλικό κύκλωμα προσροφά το υπο εξέταση δείγμα και το προωθεί προς μια χανοειδή κατασκευή (κυψελίδα ροής) Το δεύτερο υδραυλικό κύκλωμα αναρροφά απο το αποθηκευτικό δοχείο ένα ρυθμιστικό ισότονο διάλυμα που είναι το περιβάλλον υγρό (sheath fluid) Το κυτταρικό εναιώρημα διέρχεται κατα μήκος του κεντρικού άξονα αυτής της ροής όπου η πίεση έχει την χαμηλότερη τιμή
Οπτικό σύστημα Καθώς τα κύτταρα διέρχονται σε μονήρη διάταξη από την κυψελίδα ροής προσπίπτει σε αυτά κάθετα μια δέσμη φωτός Η οπτική αρχή της μέτρησης βασίζεται στο φαινόμενο της σκέδασης του φωτός όταν αυτό προσπίπτει σε μικρά σωματίδια. Κάθε κύτταρο δέχεται την ακτινοβολία κάθετα προς την ροή του. Ένα μέρος αυτής απορροφάται ενώ το υπόλοιπο σκεδάζεται προς όλες τις κατευθύνσεις στο χώρο και ανιχνεύεται υπό διαφορετικές γωνιές με διάταξη ειδικών φωτοδιόδων Στα σύγχρονα κυτταρόμερα χρησιμοποιούνται αποκλειστικά πηγές LASER επειδή δινουν μονοχρωματικές, λεπτές, πολύ ισχυρές και σταθερές δέσμες φωτός Πχ. Το κυτταρόμετρο ροής μπορεί να έχει ως πηγή φωτός μια ακτίνα laser Αργού, η οποία παράγει φως ισχύος 15mW και μήκος κύματος 488nm.
Οπτικό σύστημα (2) Συνήθως, τα περισσότερα κυτταρόμετρα έχουν 2 ή 3 πηγές ακτινοβολίας laser με διαφορετικό μήκος κύματος. Υπάρχουν όμως και κυτταρόμετρα που μπορεί να έχουν έως και 12 laser διαφορετικού μήκους κύματος. Όταν η ακτινοβολία συναντήσει τα κύτταρα τότε σκεδάζει (διασκορπίζεται) σε 2 κατευθύνσεις. Ο σκεδασμός που γίνεται σε κατεύθυνση παράλληλη ως προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία ονομάζεται εμπρόσθιος σκεδασμός (forward scatter). Ο σκεδασμός που γίνεται σε κατεύθυνση κάθετη ή πλάγια ως προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία ονομάζεται πλευρικός σκεδασμός (side scatter).
Παράμετροι FSC και SSC Αν η ανίχνευση του σκεδαζόμενου φωτός γίνεται υπό γωνία 2 0 έως 28 0 έχουμε τη μέτρηση του κατ ευθείαν ή προσθίως σκεδαζόμενου φωτός (Forward Light Scatter, FSC). Η μέτρηση με FSC είναι πολύ σημαντική, γιατί είναι αντίστοιχη του μεγέθους του κυττάρου και χρησιμοποιείται για να ξεχωρίσει διαφορετικά είδη κυττάρων, όπως λευκά και ερυθρά αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια ή αλλά κύτταρα Αν η ανίχνευση του σκεδαζόμενου φωτός γίνεται υπό γωνία 90 0 τότε έχουμε τη μέτρηση του καθέτως ή πλαγίως σκεδαζόμενου φωτός (Side Scatter SSC). Η μέτρηση με τον ανιχνευτή SSC δίνει πληροφορίες για την πολλυπλοκότητα του κυττάρου (κυτταροπλασματική κοκκίωση)
Το φαινόμενο του φθορισμού στην κυτταρομετρία ροής Εκτός από τον σκεδασμό, συμβαίνει και φθορισμός της ακτινοβολίας FITC Φωτοανιχνευτής Διεγείρουσα ακτινοβολία Εκπεμπόμενη ακτινοβολία Κυψελίδα ροής Φθορισμός είναι η ιδιότητα ορισμένων ουσιών να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος από αυτήν που δέχονται (διεγείρουσα ακτινοβολία). Εφόσον τα εξεταζόμενα κύτταρα τα επεξεργαστούμε με ανιχνευτές που φθορίζουν - μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώματα, ενωμένα με φθορίζουσες χρωστικές που ανιχνεύουν χαρακτηριστικά αντιγόνα κυττάρων, καθώς και χημικές φθορίζουσες ουσίες που συνδέονται με το DNA και το RNA - εκτός από τη σκεδαζόμενη πρωτογενή ακτινοβολία, μπορεί να ανιχνευθεί και η δευτερογενής από τον φθορισμό ακτινοβολία (flurescence-1 FL-1 πράσινος φθορισμός, flurescence-2 FL-2 κόκκινος φθορισμός).
Οπτικό σύστημα (3) Το σύστημα οπτικής συλλογής κατευθύνει την σκεδάζουσα και τη φθορίζουσα ακτινοβολία, δηλαδή την εκπεμπόμενη ακτινοβολία (emission light) σε ανιχνευτές (detectors) ακτινοβολίας. Το σύστημα οπτικής συλλογής αποτελείται από φακούς που κατευθύνουν την εκπεμπόμενη ακτινοβολία σε οπτικές ίνες. Οι οπτικές ίνες μεταδίδουν την ακτινοβολία σε φίλτρα και κάτοπτρα που στη συνέχεια μεταδίδουν ακτινοβολίες συγκεκριμένου μήκους κύματος στους ανιχνευτές. Το ορατό φως αποτελείται από ακτινοβολίες που κυμαίνονται από 400-800nm. H εκπεμπόμενη από τα κύτταρα ακτινοβολία (συγκεκριμένου μήκους κύματος) μπορεί να αναλυθεί με τα φίλτρα σε δύο ή περισσότερες ακτινοβολίες που θα καταλήξουν σε αντίστοιχους ανιχνευτές. Peridinin πρωτεΐνη συμπλόκου χλωροφύλλης (PerCP) πειράματα κυτταρομετρίας ροής. Το PerCP είναι μια υδατοδιαλυτή καροτενοειδής χρωστική ουσία που βρίσκεται σε φωτοσυνθετικές διφωσφονικές ενώσεις. Διεγείρεται από ένα λέιζερ αργού 488 nm, και με μια σχετικά μεγάλη μετατόπιση Stokes, εκπέμπει σε μέγιστο μήκος κύματος 675 nm. Λόγω αυτών των φασματικών χαρακτηριστικών, υπάρχει ελάχιστη επικάλυψη με άλλα κοινώς χρησιμοποιούμενα φθοροχρώματα όπως η φυκοερυθρίνη (ΡΕ) ή η φλουορεσκεΐνη. Αυτό καθιστά τα επισημασμένα με PerCP αντισώματα ιδιαίτερα χρήσιμα για ανάλυση πολλαπλών χρωμάτων με ΡΕ και συζευγμένα με φλουορεσκεΐνη αντισώματα. Επιπλέον, η χαμηλή διασταυρούμενη συζήτηση μεταξύ των
Ηλεκτρονικό σύστημα Το ηλεκτρονικό σύστημα αποτελείται από τους ανιχνευτές, τους ενισχυτές σήματος, τους επεξεργαστές σήματος και τον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Αρχικά, οι ανιχνευτές μετατρέπουν το φωτεινό σήμα που φτάνει στους ανιχνευτές σε ηλεκτρονικό σήμα (ηλεκτρικό ρεύμα). Το ηλεκτρονικό σήμα στη συνέχεια αυξάνεται από τους ενισχυτές. Οι επεξεργαστές σήματος μετατρέπουν το ενισχυμένο ηλεκτρονικό σήμα σε ψηφιακό σήμα που αντιστοιχεί σε μια συγκεκριμένη αριθμητική τιμή και το στέλνουν στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Έτσι, στον ηλεκτρονικό υπολογιστή αποθηκεύονται σε ψηφιακή μορφή οι πληροφορίες για κάθε κύτταρο και μπορούν στη συνέχεια να επεξεργαστούν με διάφορους τρόπους. Συγκεκριμένα, ο ηλεκτρονικός υπολογιστής μπορεί να κάνει στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων και να τα παρουσιάσει με μορφή διαφόρων διαγραμμάτων. Τύποι ανιχνευτών Οι ανιχνευτές (ή φωτοανιχνευτές) είναι αισθητήρες φωτός που διεγείρονται από φωτόνια και παράγουν ηλεκτρόνια. Στα κυτταρόμετρα ροής χρησιμοποιούνται οι εξής κατηγορίες φωτοανιχνευτών: 1) οι φωτοδίοδοι που είναι μικρής αποδοτικότητας και παράγουν ένα ηλεκτρόνιο ανά φωτόνιο. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ισχυρής ακτινοβολίας όπως αυτής που προέρχεται από τον εμπρόσθιο σκεδασμό (forward scattering) του κυττάρου. 2) οι φωτοπολλαπλασιαστές που είναι μεγάλης αποδοτικότητας και παράγουν εκατομμύρια ηλεκτρόνια ανά φωτόνιο. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ασθενούς ακτινοβολίας όπως αυτής που προέρχεται από τον πλευρικό σκεδασμό (side scattering) και τον φθορισμό του κυττάρου. Η τάση που εφαρμόζεται (και που μπορεί να καθοριστεί από τον χειριστή) σε ένα φωτοπολλαπλασιαστή καθορίζει και την ευαισθησία του. Όσο μεγαλύτερη τάση εφαρμόζεται τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των ηλεκτρονίων που παράγονται ανά φωτόνιο και άρα τόσο μεγαλύτερη η ευαισθησία του.
Ανάλυση δεδομένων Συνηθέστερος τύπος ανάλυσης δεδομένων είναι το σημειακό γράφημα κυτταροδιαγράμματος (dot plot) Για τον πληθυσμό που απομονώσαμε μπορούμε να πάρουμε ιστόγραμμα φθορισμού Τα δεδομένα μπορούν να παρασταθούν και με άλλους τρόπους
Διάγραμμα κλειστής καμπύλης (contour plot): Παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων αλλά παράλληλα διαχωρίζει σε διαφορετικές περιοχές κύτταρα με παραπλήσιες τιμές και για τα 2 χαρακτηριστικά
Διάγραμμα πυκνότητας (density plot): Παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων αλλά παρουσιάζει με διαφορετικό χρώμα κύτταρα με παραπλήσιες τιμές και για τα 2 χαρακτηριστικά
Έκφραση αποτελεσμάτων κυτταρομετρίας ροής Σημειακό γράφημα κυτταροδιαγράμματος (dot plot): Παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων Καθορισμός ενός συγκεκριμένου πληθυσμού κυττάρων (Gate) Σε ένα πληθυσμό κυττάρων που θα μετρηθεί με το κυτταρόμετρο, μπορεί να θέλουμε να περιορίσουμε την ανάλυσή μας σε ένα συγκεκριμένο υποπληθυσμό κυττάρων.η διαδικασία για να γίνει αυτό ονομάζεται: gating. Συνήθως, το gating γίνεται σε ένα διάγραμμα dot plot όπου φαίνονται οι τιμές του εμπρόσθιου και του πλευρικού σκεδασμού. Μετά το gating, δηλαδή την επιλογή του συγκεκριμένου υποπληθυσμού, σε όλα τα διαγράμματα θα εμφανίζονται οι τιμές που θα αφορούν μόνο αυτόν τον πληθυσμό.
Έκφραση αποτελεσμάτων κυτταρομετρίας ροής (2) Ιστόγραμμα έντασης φθορισμού Μέση ένταση φθορισμού Η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη με τον αριθμό των φθοριζόντων αντισωμάτων στην επιφάνεια του κυττάρου. Η ένταση φθορισμού των δειγμάτων συγκρίνεται με την ένταση φθορισμού δειγμάτων αναφοράς (standards).
Έκφραση αποτελεσμάτων κυτταρομετρίας ροής (3) Ισομετρικό διάγραμμα (isometric plot) Α- Α+ Β+ Β+ Α- Α+ Β- Β-
Πολύεδρο διάγραμμα Diamond plot Εμφανίζεται όταν συνυπάρχουν πολλοί τρόποι μέτρησης
Το ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) είναι ένα πρότυπο αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και του αποκλεισμού μη βιώσιμων κυττάρων σε κυτταρομετρία ροής. Το ΡΙ δεσμεύεται σε δίκλωνο DΝΑ, αλλά αποκλείεται από κύτταρα με ακέραιες μεμβράνες πλάσματος. Η αννεξίνη V είναι ένα μέλος της οικογενείας των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών που συνδέεται με φωσφατιδυλοσερίνη (PS) με τρόπο εξαρτώμενο από ασβέστιο. Το PS συνήθως βρίσκεται μόνο στην ενδοκυτταρική της μεμβράνης πλάσματος σε υγιή κύτταρα, αλλά κατά την πρώιμη απόπτωση, η ασυμμετρία της μεμβράνης χάνεται και το PS μεταφέρεται στήν εξωτερική επιφάνεια. Η επισημασμένη με φθοροχρώμα αννεξίνη V μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για να στοχεύσει ειδικά και να ταυτοποιήσει αποπτωτικά κύτταρα. Η δέσμευση της δεν μπορεί να κάνει διάκριση μεταξύ των αποπτωτικών κυττάρων και των νεκρωτικών.
Αποτελέσματα κυτταρομετρίας ροής
Βαθμονόμηση κυτταρομετρητών ροής Πραγματοποιείται με μπίλιες (συγκεκριμένου αριθμού) μαρκαρισμένες με χρωστικές
Κυτταροδιαχωρισμός ροής (flow sorting) Τα μεμονωμένα κύτταρο, οργανίδια κ.λ.π. που προσδιορίστηκαν από την κυτταρομετρία ροής απομονώνονται και απομακρύνονται χωριστά από τα υπόλοιπα.
Διεξαγωγή της εργαστηριακής άσκησης: Προσδιορισμός του CD4 και του CD8 σε ολικό αίμα
Τα CD αντιγόνα Τα λεμφοκύτταρα έχουν στην επιφάνειά τους πολλά πρωτεινικά μόρια τα οποία λέγονται αντιγόνα διαφοροποίησης (CD=cluster of differentiation) που σχετίζονται με διαφορετικές λειτουργίες τους και χρησιμοποιούνται για τη φαινοτυπική τους ταυτοποίηση CD34,αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο CD4, Τ βοηθητικά κύτταρα CD8, Τ κυτταροτοξικά κύτταρα CD20, Β λεμφοκύτταρα
CD4 και CD8 T κύτταρα Η κύρια διαφορά μεταξύ των CD4 και CD8 T κυττάρων είναι ότι τα CD4 T κύτταρα χαρακτηρίζουν τα βοηθητικά Τ-κύτταρα τα οποία βοηθούν άλλα κύτταρα να προάγουν την ανοσολογική απόκριση ενώ τα CD8 T κύτταρα χαρακτηρίζουν τα κυτταροτοξικά κύτταρα τα οποία επάγουν κυτταρικό θάνατο (λύση ή απόπτωση). Συμμετέχουν στην κυτταρική ανοσία. Τα CD4 παράγουν κυτταροκίνες για να ενεργοποιήσουν άλλα κύτταρα της ανοσίας όπως Β- κύτταρα, CD8 και μακροφάγα ενώ τα CD8 καταστρέφουν κύτταρα προσβεβλημένα από ιούς και καρκινικά κύτταρα
Η εξέταση των CD4 και/ή των CD8 κυττάρων Ο έλεγχος των Τ- λεμφοκυττάρων γίνεται για να αξιολογηθεί η κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος Η εξέταση των CD4 και/ή των CD8 κυττάρων χρησιμοποιείται κυρίως για την παρακολούθηση της πορείας της νόσου από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοεπάρκειας (humanimmunodeficiencyvirus-hiv). Επειδή τα CD4 κύτταρα είναι ο κύριος στόχος του HIV, ο αριθμός τους θα μειώνεται καθώς ο HIVεξελίσσεται.
Προετοιμασία δείγματος 1. Μέσα σε ένα σωληνάριο που περιέχει αντιπηκτικό συλλέξτε ολικό αίμα 2. Μεταφέρετε σε ένα δεύτερο σωληνάριο 100 μl ολικό αίμα και 5 μl αντίσωμα CD4+ και σε ένα τρίτο σωληνάριο 100 μl ολικό αίμα και 5 μl αντίσωμα CD8+ 3. Για control χρησιμοποιήστε διάλυμα PBS 4. Παραμονή 20 min και ελαφριά ανάδευση κάθε 5 min. 5. Προσθέστε στο ίδιο σωληνάριο 2 ml διάλυμα λύσης κυττάρων και επωάστε για 10-20 min. 6. Τρέξτε το δείγμα.
Βασική λειτουργία κυτταρομετρητη ροής Partec 1. Σιγουρευτείτε ότι υπάρχει αρκετό διάλυμα sheath στο δοχείο με το μπλε καπάκι και δεν είναι περισσότερο από 1600 ml. 2. Σιγουρευτείτε ότι δεν υπάρχουν φυσαλίδες στο κίτρινο φίλτρο μέσα στο δοχείο. 3. Ανοίξτε πρώτα το computer και μετά τον αναλυτή Partec. a. Κάντε click στο εικονίδιο Flomax να ξεκινήσει το πρόγραμμα. i. Μέσα στο Flomax επιλέξτε File. Επιλέξτε My computer Local Disk C Flow max Πηγαίνετε στα templates. Επιλέξτε το template που θέλετε και πατήστε Open. b. Μέσα στο Flomax επιλέξτε Acquisition (ή το εικονίδιο με το τετράγωνο). i. Eπιλέξτε Instrument settings load (κάτω αριστερή γωνία) Flowmax Instrument settings Επιλέξτε Inst in Used ή άλλο Open. 4. Σε αυτό το στάδιο ο αναλυτής είναι έτοιμος να τρέξει δείγματα. Το δείγμα (βλ. στάδιο 1) τοποθετείται στην υποδοχή του FC. H μέτρηση θα ξεκινήσει μόλις ακουστεί το κούμπωμα στην υποδοχή. Τότε η μέτρηση θα ξεκινήσει αμέσως και τα στάδια της θα είναι ορατά από τα λαμπάκια στον αναλυτή. Το δείγμα πρέπει να είναι τουλάχιστον 0,4 ml.
Συντήρηση στο τέλος της μέτρησης 1. Μετά το τέλος των μετρήσεων η μονάδα μέτρησης θα πρέπει να απολυμανθεί. 2. Προσθέστε 3/4 διαλύματος sheath (λευκό διάλυμα) και τρέξτε το ως δείγμα για 2 3 min με ταχύτητα 4. 3. Προσθέστε 1/2 απολυμαντικό (decontamination fluid, το μωβ διάλυμα) σε ένα σωληνάριο και τρέξτε το ως δείγμα με ταχύτητα 5 ή 6 μέχρι να το πιεί όλο. 4. Προσθέστε 1/2 καθαριστικού (cleaning fluid, το πράσινο διάλυμα) σε ένα σωληνάριο και τρέξτε το ως δείγμα με ταχύτητα 5 ή 6 μέχρι να το πιεί όλο. 5. Προσθέστε 1/2 διαλύματος sheath (λευκό διάλυμα) σε ένα σωληνάριο, και τρέξτε το ως δείγμα με ταχύτητα 5 ή 6 μέχρι να το πιεί όλο. 6. Προσθέστε 3/4 διαλύματος sheath (λευκό διάλυμα) σε ένα σωληνάριο, και αφήστε το στον αναλυτή. 7. Κλείστε το πρόγραμμα Flomax. 8. Κλείστε τον υπολογιστή. 9. Κλείστε τον αναλυτή. Πατήστε End κάθε φορά για να σταματήσει η ανάλυση.