--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2

3

4

5

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 363 6

7

8

9

10

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 17.4 SPEKTROGRAFICKÁ ANALÝZA (upravené) Spektrografickou analýzou možno získať informácie o tom, z akých prvkov (predovšetkým kovových) sa skladá analyzovaná vzorka (kvalitatívna analýza), ako aj o ich kvantitatívnom zastúpení (kvantitatívna analýzy). 11

Na získanie a analýzu emisných spektier sa používajú zariadenia, ktoré sa vo všeobecnosti skladajú z budiaceho zdroja (zdroja žiarenia), spektrálneho prístroja a detektora. Optická schéma hranolového spektrografu Q-24 firmy Zeiss (JENA) je na obrázku 17.4. Obr. 17.4. Optická schéma hranolového spektrografu Q-24 s osvetľovacou sústavou a detektorom 1- zdroj žiarenia, 2, 4. 5- šošovky osvetľovacej sústavy, 3- revolverová medziclona, 6 clona, 7- vstupná štrbina spektrografu, 8- kolimátorový objektív, 9- disperzný hranol, 10- kamerový objektív, 11- fotografická platňa (detektor) Polychromatické žiarenie z budiaceho zdroja (1) prechádza systémom šošoviek (2, 4, 5) tvoriacich osvetľovaciu sústavu, vstupuje do spektrálneho prístroja vstupnou štrbinou (7), ktorá je umiestnená v ohnisku kolimátorového objektívu (8). Ten zo zväzku žiarivých tokov vychádzajúcich zo štrbiny vytvorí zväzok rovnobežných žiarivých tokov dopadajúcich na hranol (9). Tu sa žiarenie láme a pretože index lomu materiálu hranola sa mení s vlnovou dĺžkou, žiarenie sa rozkladá podľa jednotlivých frekvencií. Žiarenie rozložené na monochromatické žiarivé toky sústreďuje kamerový objektív (10) na detektor (117), ktorým je fotografická platňa. Na ploche spektrálnej platne sa zobrazí toľko obrazcov štrbiny v podobe spektrálnych čiar, koľko rôznych frekvencií (vlnových dĺžok) obsahuje žiarenie vstupujúce do prístroja. V tmavej komore sa vloží do kazety spektrálna platňa tak, aby po vložení kazety do kazetového rámu bola emulzia na strane prístroja. Po upevnení kazety a nastavení jej polohy do predpísanej výšky sa vysunie posuvný uzáver kazety. Na platňu sa nasníma stupnica vlnových dĺžok a kazeta sa posunie o 10mm. Na analýzu roztokov vzoriek sa používajú tyčkové elektródy s priemerom 3 až 6mm a dĺžkou asi 4cm. Nosné elektródy sa obrúsia, aby mali rovnú kruhovú plochu a postavia sa na stojan. Malou pipetou alebo kapilárou (pre každú vzorku inou) sa nakvapká z roztoku vzorky na elektródu jedna kvapka a pod infralampou sa vysuší. Nakvapkanie a vysušenie sa opakuje ešte niekoľkokrát (podľa potreby), takže na elektróde zostane homogénny suchý nálet vzorky. Protielektródou je uhlíková elektróda s kužeľovým zakončením. 12

Hartmannova clona (obr. 17.5) má deväť výrezov otvorov. Horné tri označené číslami 2, 5, 8 sú pre spektrá Fe, ostatné (1, 3, 4, 6, 7, 9) sú pre vzorky. Obr. 17.5. Hartmannova clona Do držiakov elektród v iskrisku spojených s prívodmi od generátora sa upevnia železné elektródy, ovládacími prvkami iskriska sa nastavia do optickej osi (ich projekciu vytvorenú projekčnou žiarovkou možno vidieť na revolverovej medziclone (3) (obr. 17.4)) a vzdialenosť medzi nimi sa nastaví na 2 mm. Na generátore sa nastaví intenzita prúdu medzi elektródami na 4 A. Dovtedy je štrbina spektrografu zakrytá bielym krytom s terčíkom. Súčasne s odstránením krytu sa stlačia stopky, spektrum Fe sa exponuje asi 7 s, štrbina sa prikryje krytom a vypne sa generátor. Takto sa na fotografickej platni získajú tri spektrá železa v poradí spektier 2, 5 a 8. Hartmannova clona sa posunie do polohy 3 (kazeta ostáva v nezmenenej polohe), do dolného držiaka elektród sa upevní nosná uhlíková elektróda so vzorkou a do horného držiaka uhlíková kužeľová protielektróda. Nastavenie elektród do optickej osi a ďalší postup je rovnaký ako pri snímaní spektra železa s tým rozdielom, že vzorka sa exponuje 45 s prúdom 6 A. Rovnakým spôsobom sa nasnímajú spektrá ostatných vzoriek, pričom po každej vzorke sa zmení poloha Hartmannovej clony (4, 6, 7, 9). Po naexponovaní spektier všetkých vzoriek sa zasunie posuvný uzáver kazety a platňa sa vyvolá v tmavej komore. Platňa sa vyberie z kazety, ponorí sa po hrane do pripravenej vývojky emulziou nahor a kolísavým pohybom miskou, aby vývojka bola v pohybe, sa vyvoláva asi 2 minúty pri 18 ºC. Po tomto čase sa platňa vyberie, dôkladne opláchne destilovanou vodou a ponorí do ustaľovača opäť' emulziou nahor, kde sa ustaľuje l0 minút. Nakoniec sa platňa vyberie z ustaľovača a v umývadle sa premýva tečúcou vodou ďalších 10 minút. Potom sa platňa vyberie, opláchne destilovanou vodou, v šikmej polohe (s emulziou na 13

spodnej strane, aby na ňu nepadal prach) sa nechá vysušiť. Vysušená fotografická platňa so záznamom spektier vzoriek sa položí na stolík spektroprojektora emulziou nahor a upevni sa perovými príchytkami. Po zapnutí žiarovky kondenzorom sa zaostrí zväčšený obraz na projekčnú platňu tak, aby čiary boli ostré. Ovládacími prvkami spektroprojektora sa nastaví fotografická platňa tak, aby pod vyhodnocovanou časťou spektra vzorky bolo spektrum čistého Fe. V atlase spektrálnych čiar železa sa vyhľadá príslušný list a po položení na projekčnú platňu sa prekryjú obidve spektrá tak, aby sa premietnuté spektrum železa presne krylo so zobrazeným spektrom železa na liste. Potom sa zisti, ktoré čiary v spektre vzorky sa kryjú s vyznačenými polohami jednotlivých prvkov v atlase nad spektrom železa. Priaznivé prípady sa zaznačia a v prípade viacnásobného výskytu čiar určitého prvku sa poznačia k symbolu prvku vlnové dĺžky týchto (troch najintenzívnejších) čiar. Prvok sa považuje za dokázaný, ak sa preň našli aspoň tri čiary. Na približnú orientáciu v spektre a rýchle vyhľadanie príslušných listov atlasu sa používa pomocná stupnica nafotografovaná na spektrograme. Spracovanie výsledkov má obsahovať: názov práce, opis vzorky (roztok, prášok, zliatina a pod.), typ spektrografu, budiaci zdroj, budiace podmienky, typ elektródy, podmienky vyvolávania a ustaľovania, (čas), poradie spektier a kvalitatívne zloženie vzoriek. 17.5 KONTROLNÉ ÚLOHY A PRÍKLADY 1. Vysvetlite, čo sú emisné spektrá čiarové, pásové a spojité a ako vznikajú. 2. Z ktorých hlavných časti sa skladá emisný spektrograf? 3. Vysvetlite princíp kvalitatívnej spektrálnej analýzy. 4. Čo je koincidencia a ako ovplyvňuje analýzu? 5. Vysvetlite princíp kvantitatívnej analýzy emisnou spektrografiou. 6. Čo sú posledné čiary a aký význam majú pre kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu? 7. Uveďte princíp a hlavné výhody emisnej plameňovej fotometrie. 8. Aké rušivé vplyvy sa môžu uplatňovať v emisnej plameňovej fotometrii? 9. Čo je podstata ionizačných a žiarivých rušivých vplyvov a ako ich možno eliminovať? 10.Vysvetlite princíp metódy systému kalibračných kriviek. 11.Intenzívne čiary v spektre kadmia majú tieto vlnové dĺžky: λ 1 = 226,602 nm; λ 2 = 228,802 nm; λ 3 = 326,106 nm. Pre každú vlnovú dĺžku vypočítajte energiu fotónu, jeho kmitočet a vlnočet. 12.Z tabuliek spektrálnych čiar boli vybraté štyri atómové čiary medi, charakterizované vlnovými dĺžkami a budiacimi potenciálmi: λ 1 = 282,437 nm; E`1 = 5,78 ev (9,26.l0-19 J); λ 2 = 324,754 nm, E`2 = 3,82 ev (6,12.l0-19 J); λ 3 = 276,637 nm, E`3 = 6,12 ev (9,80.10-19 J); λ 4 = 261,837 nm, E`4 = 6,12 ev (9,80.10-19 J). Vypočítajte energie dolných hladín prechodov zodpovedajúcich týmto čiaram. 14

15

16

17

18

19

20

21

22

------------------------------------------------------------------------------------------------------------404 23

24

----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 407 STANOVENIE MEDI AMONIAKOM Chemikálie a roztoky: CuSO 4.5 H 2 O NH 4 OH, koncentrovaný Postup: Z CuSO 4.5 H 2 O pripravíme roztok štandardu s koncentráciou 2g Cu/l. Z pripraveného roztoku sa postupne odpipetuje do 50 ml odmerných baniek 1, 3, 5, 7, 9 ml. Po zriedení malým prídavkom destilovanej vody sa do každej odmernej banky pridá 5 ml 12,5 % NH 4 OH (zriedený 1:1) a roztok sa doplní po značku destilovanou vodou. Po premiešaní sa odmeria absorbancia pri vlnovej dĺžke maximálnej absorpcie. Obsah Cu v spracovávanom podieli vzorky nemá prekročiť 18 mg. STANOVENIE KYSELINY SALICYLOVEJ V ACYLPYRÍNE Chemikálie a roztoky: kyselina salicylová Fe(NO 3 ) 3.9 H 2 O, pripravený roztok 1% (m/v) etanol (alebo acetón) Postup: Zostrojenie analytickej krivky: 0,2 g kyseliny salicylovej sa rozpustí v malom množstve etanolu, roztok sa preleje do 25 ml odmernej banky a doplní sa po značku etanolom. 2,5 ml roztoku sa odpipetuje do 500 ml odmernej banky, roztok sa doplní po značku destilovanou vodou. Do siedmich 50 ml odmerných baniek sa odpipetuje postupne 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ml tohto roztoku a do každej banky sa pridá 5 ml 1 % roztoku Fe(NO 3 ) 3. Roztoky v odmerných bankách sa doplnia po značku destilovanou vodou a premiešajú sa. Premeraním absorbancie najtmavšieho roztoku v oblasti vlnových dĺžok od 400 nm do 650 nm sa zistí vlnová dĺžka maximálnej absorpcie (λ max ). Ako porovnávací roztok sa použije roztok bez kyseliny salicylovej. Pri vlnovej dĺžke λ max sa odmeria absorbancia všetkých roztokov. Zo získaných hodnôt sa zostrojí analytická krivka. 25

Vlastné stanovenie Presne sa odvážia 1 až 3 tablety acylpyrínu, ktoré sa rozpustia v 20 ml destilovanej vody. Nerozpustný zvyšok sa nechá vylúhovať 20 min pri miešaní roztoku. Roztok sa potom prefiltruje cez filtračný papier do 50 ml odmernej banky. Nerozpustný zvyšok sa premyje malými podielmi vody, ktoré sa spoja s filtrátom. K získanému číremu roztoku sa pridá 5 ml 1 % roztoku Fe(NO 3 ) 3, roztok sa doplní na objem 50 ml a premieša sa. Odmeria sa hodnota absorbancie pri λ max a z analytickej krivky sa zistí odpovedajúca koncentrácia kyseliny salicylovej. Výsledok sa určí ako % obsah kyseliny salicylovej v acylpyríne. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 26

ÚLOHA Klinická analýza: spektrofotometrické in vitro stanovenie albumínu v krvnom sére Princíp práce: Albumín je jeden z proteínov krvnej plazmy, tvorí 60 % všetkých plazmových bielkovín. Okrem krvi sa vyskytuje tiež v ďalších telových tekutinách, ako je tkanivový a mozgovomiechový mok. Je dôležitý hlavne pre transport rôznych látok v krvi (vyššie organické kyseliny, minerály, liečivá) a pomáha udržať stále vnútorné prostredie organizmu. Stanovenie koncentrácie albumínu v sére sa používa v diagnóze a monitorovaní pečeňových chorôb (cirhóza pečene). Normálne hodnoty albumínu v ľudskom sére sú u dospelých 35 50 g l -1 a u detí 32 54 g l -1. Sérový albumín v prítomnosti indikátora brómkrezolová zeleň v slabo kyslom roztoku spôsobuje farebnú zmenu indikátora zo žlto-zelenej na zeleno-modrú farbu. Vyžadované vedomosti: Teoretické základy a inštrumentácia v molekulovej absorpčnej spektrálnej analýze, teoretické základy z klinickej analýzy, zásady práce s biologickým materiálom. Chemikálie, roztoky a zariadenia: Reagenčný roztok R pre vyfarbenie albumínu (30 mmol l -1 citrátový tlmivý roztok s ph 4,2 a 0,26 mmol l -1 brómkrezolová zeleň) pripravíme zmiešaním 10 ml 0,3 mol l -1 roztoku citrónanu sodného, 10 ml 0,3 mol l -1 kyseliny citrónovej a 10 ml 2,6 mmol l -1 roztoku indikátora brómkrezolová zeleň. Roztok sa doplní deionizovanou vodou na objem 100 ml. Spektrofotometer Jenway s priloženým návodom na obsluhu a s 1 cm kyvetami. Postup práce: Zostrojenie kalibračnej krivky: Na prípravu kalibračných roztokov použijeme lyofilizované krvné sérum. Sérum sa nachádza v malej fľaške, ktorá je uzavretá pod vákuom, a preto ju musíme otvárať opatrne (aby sa lyofilizát nezvíril). Do fľašky napipetujeme presne 5 ml deionizovanej vody. Fľašku uzavrieme a za občasného premiešania necháme stáť 30 min. POZOR! Fľaškou netrepať! Lyofilizát nesmie peniť. Takto získame lyofilizované krvné sérum s presne známou koncentráciou albumínu. Táto koncentrácia je uvedená v príbalovom letáku použitého séra. Do 4 očíslovaných malých kadičiek postupne odpipetujeme 10, 25, 50 a 100 l lyofilizátu, pridáme 5 ml reagenčného roztoku R, zamiešame a necháme 10 min stáť. Pri vlnovej dĺžke 546 nm zmeriame absorbancie všetkých roztokov oproti reakčnému blanku. Blank pripravíme zmiešaním 100 l vody a 5 ml reagentu R. Sfarbenie roztokov je stabilné približne 60 min. Kalibračnú závislosť vynesieme ako funkciu absorbancie od hmotnosti albumínu A f (m albumín ). Stanovenie albumínu vo vzorke: Ako vzorku použijeme kontrolné lyofilizované krvné sérum v malej fľaške už upravené a rozpustené vyučujúcim. Z fľašky odpipetujeme 50 l séra do malej kadičky, pridáme 5 ml reagentu R, roztok zamiešame a po 10 min zmeriame jeho absorbanciu pri rovnakej vlnovej dĺžke ako kalibračné roztoky oproti reakčnému blanku. Výsledok: Výsledkom stanovenia je hmotnostná koncentrácia albumínu vo vzorke v g l -1.

27

28

29

30

FLUORIMETRICKÉ STANOVENIE CHINÍNU Princíp: Chinín (C 20 H 24 N 2 O 2 ) je heterocyklická zlúčenina. V prostredí zriedenej kyseliny sírovej pri ožiarení UV svetlom intenzívne fluoreskuje s maximom fluorescencie pri 450 nm. Prístroje a zariadenia: Fotometer SPEKOL s nástavcom FK a so zdrojom QL. Chemikálie a roztoky: Roztok síranu chinínu v 0,1 M H 2 SO 4-0,1 g/l, 1M H 2 SO 4 Postup: Do 50 ml odmernej banky sa prenesie vzorka, 5 ml 1 M H 2 SO 4 a roztok sa doplní po značku destilovanou vodou. Kyveta sa naplní roztokom a pri vlnovej dĺžke budiaceho žiarenia 365 nm sa určí intenzita fluorescencie. Analytická krivka sa zostrojí z meraní pre roztoky s obsahom chinínu 0-200 μg. Ak vzorka obsahuje rozpustený CO 2, spracuje sa podľa uvedeného postupu až po krátkom povarení a ochladení. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 31

32

33

34

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 35