IZOLÁCIA KVASNIČNEJ INVERTÁZY Z PEKÁRENSKÝCH KVASNÍC

Transcript

1 IZOLÁCIA KVASNIČNEJ INVERTÁZY Z PEKÁRENSKÝCH KVASNÍC 1

2 1. TEORETICKÝ ÚVOD 1.1 Izolácia enzýmov Enzýmy sú katalyzátory biochemických reakcií. Skoro vždy ide o katalyticky aktívne bielkoviny, ktoré urýchľujú reakcie tisíc až miliónnásobne. Všetky enzýmy sa syntetizujú v bunke, ale niektoré z nich sa v bunke uplatňujú (intracelulárne enzýmy), iné sa vylučujú do okolitého prostredia (extracelulárne enzýmy). Pri príprave enzýmov, či už v laboratóriu alebo priemyselne, sa kultivujú producentské bunky pri optimálnych podmienkach, pričom sa v nich syntetizujú želané enzýmy. Tieto sa potom musia od produkčných buniek oddeliť v procese nazývanom izolácia. Vo všeobecnosti sa v prvej fáze izolácie oddelia bunky od kvapalného média filtráciou alebo odstreďovaním. Ďalší postup izolácie enzýmov závisí od toho, či sú enzýmy extracelulárne alebo intracelulárne. V prípade extracelulárnych enzýmoch sa pri ich získavaní z kvapalného média často uplatňujú zrážanie, ultrafiltrácia alebo extrakcia. Intracelulárne enzýmy treba najprv získať z buniek do roztoku v procese dezintegrácie. Dezintegrácia buniek sa najčastejšie uskutočňuje buď mechanicky, chemicky alebo enzýmovo. Výber vhodnej metódy závisí najmä od typu producentských buniek (živočíšne bunky, rastlinné bunky alebo mikroorganizmy). Medzi mechanické dezintegrátory, v ktorých sa generujú vysoké strihové napätia pôsobiace na bunky deštruktívne, zaraďujeme guľový mlyn, vysokotlakový dezintegrátor a ultrazvukový dezintegrátor. Pri chemickej dezintegrácii sa prídavkom organických rozpúšťadiel alebo povrchovo aktívnych látok oslabí alebo celkom rozpustí bunková stena. Rozklad bunkovej steny sa dá dosiahnuť aj pôsobením lytických enzýmov. Každá z uvedených metód má výhody aj nevýhody, ktoré treba pri výbere zvážiť. Výťažok dezintegrácie je definovaný ako pomer rozbitých buniek ku začiatočnému počtu buniek: ( N0 N ) 100 Y (%) = (1) N0 Takto definovaný výťažok sa dá určiť priamym počítaním celých buniek pred a po dezintegrácii, čo je však pracné a nie veľmi presné, najmä v prípade, ak bunky majú tendenciu aglomerovať. Preto je výhodnejšie sledovať určité zložky (napríklad enzým, alebo rozpustné bielkoviny), ktoré sa uvoľnia do roztoku počas dezintegrácie. Potom sa výťažok dezintegrácie vypočíta z pomeru množstva uvoľneného materiálu, R, ku maximálnemu množstvu toho 2

3 istého materiálu, R m, ktoré je teoreticky možné uvoľniť do roztoku. Množstvo tohto materiálu sa stanovuje v supernatante po odstránení tuhých podielov odstredením. 1.2 Dezintegrácie buniek vysokotlakovým dezintegrátorom (Frenchov lis) Suspenzia buniek je umiestnená v pracovnej cele Frenchovho lisu. Aplikáciou vysokého tlaku na piest sa v pracovnej cele zvýši tlak, čo spôsobí zvýšenie vnútrobunkového tlaku v bunkách. Keď suspenzia buniek prechádza cez výpustný ventil von z pracovnej cely, vonkajší tlak, ktorý pôsobí na bunkové steny prudko klesne na hodnotu atmosférického tlaku. Táto tlaková zmena spôsobí, že membrána bunkovej steny praskne a vnútrobunkový obsah sa uvoľní do okolitého roztoku. 1.3 Kvasničná invertáza Kvasničná invertáza (E.C , β-fruktofuranozidáza) patrí do skupiny hydroláz. Základnou reakciou, ktorou možno charakterizovať jej katalytické vlastnosti je hydrolýza sacharózy: Invertáza sacharóza + H 2 O glukóza + fruktóza Invertáza sa vyskytuje v mikrobiálnych bunkách v intracelulárnej aj extracelulárnej forme. V bunkách kvasiniek Saccharomyces cerevisiae je extracelulárna invertáza situovaná v polysacharidovej vrstve bunkovej steny, kde tvorí manán-proteínový komplex. Oligosacharidová časť extracelulárnej invertázy zvyšuje jej rozpustnosť. Intracelulárna invertáza sa vyskytuje vo vnútri buniek a neobsahuje cukornú zložku. Jednotka aktivity invertázy (unit, U) je definovaná ako množstvo enzýmu potrebné na hydrolýzu 1 µmólu sacharózy na glukózu a fruktózu za min pri ph 4,6 a 30 C. Z definície vyplýva, že aktivitu invertázy môžeme vypočítať ako 1000 cgl VR Aktivita = (2) t VE kde c GL je koncentrácia glukózy (mmol dm -3 ), V R a V E sú objemy reakčnej zmesi a enzýmu pri enzýmovej reakcii (dm -3 ), t je reakčný čas (min). Aktivita bude vyjadrená v -3 U dm E. 3

4 Špecifická aktivita je vztiahnutá na množstvo bielkovín v roztoku enzýmu a má jednotku U g -1. 4

5 2. CIEĽ PRÁCE 1. Dezintegrovať bunky Saccharomyces cerevisiae pomocou vysokotlakového Frenchovho lisu v troch za sebou nasledujúcich cykloch. 2. Stanoviť aktivitu a špecifickú aktivitu invertázy v dezintegrovaných vzorkách a porovnať výťažky v jednotlivých dezintegračných cykloch. 3. POSTUP PRÁCE 3.1 Dezintegrácia buniek na Frenchovom lise 1. Pripravíme suspenziu buniek Saccharomyces cerevisiae v acetátovom pufri (0,05 mol dm -3, ph 4,6) s koncentráciou 100 g dm -3 a objemom 25 ml. 2. Odoberieme 2 ml takto pripravenej suspenzie do ependorfky a odložíme do chladničky. Túto vzorku neskôr použijeme na stanovenie pôvodnej aktivity invertázy. 3. Z princípu izolácie látok z buniek tlakom vyplýva, že počas procesu dôjde k zvyšovaniu teploty suspenzie buniek, preto je nevyhnutné, aby suspenzia ako aj pracovná cela Frenchovho lisu boli vopred vychladené. 4. Podrobný opis zariadenia a postup práce s je uvedený v dokumentácii k Frenchovmu lisu. Dezintegrácia bude prebiehať pri nasledovných podmienkach: poloha prepínacieho ventilu HIGH, tlak... psi (... MPa), prietok približne 1 kvapka za 4-5 s. 5. Po skončení dezintegrácie odoberieme z homogenizátu buniek do skúmavky 2 ml suspenzie a odložíme do chladničky. 6. Zvyšok suspenzie vychladíme a znovu dezintegrujeme pri rovnakých podmienkach. Po dezintegrácii odoberieme 2 ml vzorky do skúmavky. 7. Po ukončení všetkých cyklov dezintegrácie, vzorky v skúmavkách odstredíme. Odstredivku zapneme asi 20 min pred samotným odstreďovaním, aby sa vychladila. 5

6 Do zvyšnej skúmavky napipetujeme 2 ml vody, aby bol rotor odstredivky vyvážený. Podmienky odstreďovania sú: frekvencia 3500 otáčok za minútu, čas 10 minút. 8. Po odstredení pipetou odoberieme číry supernatant do čistej ependorfky a vzorky odložíme do chladničky do času ďalšieho spracovania. 9. Vo všetkých vzorkách stanovíme aktivitu invertázy a vo vzorkách po dezintegrácii aj obsah bielkovín. Pozn: 1 psi = 6 894,75729 Pa 3.2 Stanovenie aktivity invertázy Princíp Aktivita invertázy sa vypočíta pomocou začiatočnej rýchlosti enzýmovej reakcie, ktorú vyjadríme ako rýchlosť vzniku glukózy na začiatku reakcie. Túto rýchlosť experimentálne určíme tak, že zmeriame množstvo vzniknutej glukózy, ktoré vznikne hydrolýzou sacharózy za určitý reakčný čas. Aby bolo zabezpečené, že závislosť koncentrácie glukózy od reakčného času bude lineárna, a teda začiatočná rýchlosť reakcie bude konštantná, je treba pracovať pri takých podmienkach, aby konverzia sacharózy bola menšia než 10% Postup 1. Pripravíme 25 ml roztoku sacharózy v acetátovom pufri (0,05 mol dm -3, ph 4.6) s koncentráciou 100 mmol dm Do ependorfiek napipetujeme 750 µl roztoku sacharózy, počet ependorfiek je rovný počtu vzoriek enzýmu, v ktorých chceme stanoviť aktivitu invertázy. Ependorfky uzavrieme a dáme temperovať do termostatu na 30 C asi 15 min. 3. Po vytemperovaní naštartujeme enzýmovú reakciu tak, že pridáme do každej ependorfky po 50 µl vzorky enzýmu (suspenzia buniek alebo supernatant), zapneme stopky. Ihneď zamiešame a vrátime do termostatu. Na stopkách sledujeme čas reakcie. 4. Po 15 min reakcie do jednotlivých ependorfiek pridáme 80 µl NaOH (c = 2 mol dm -3 ), ihneď premiešame. Týmto sa enzýmová reakcia zastaví. 5. Obsah glukózy v jednotlivých vzorkách stanovíme glukózovým testom. 6

7 3.3 Stanovenie glukózy glukózovým testom Princíp Glukózooxidáza katalyzuje oxidáciu glukózy na peroxid vodíka a glukonát. Vzniknutý peroxid vodíka sa stanovuje oxidačnou reakciou so substituovaným fenolom a 4- aminoantipyrínom katalyzovanou enzýmom peroxidázou, pričom vzniká červeno sfarbený produkt Postup 1. Od vedúceho cvičenia si vypýtame štandardné roztoky glukózy. 2. Roztok glukózového testu predhrejeme na 30 C. Do ependorfiek pipetujeme po 1 ml tohto roztoku. Počet ependorfiek je rovný počtu štandardov glukózy + 3 x počet vzoriek Do prvej ependorfky pridáme 10 µl vody, do ďalších po10 µl štandardov glukózy alebo vzorky. Ihneď po pridaní zmes dôkladne premiešame. 4. Stojan s ependorfkami odložíme na tmavé miesto a necháme 30 min inkubovať. 5. Medzitým si zapneme UV/VIS spektrofotometer, aby sa ustálil signál. 6. Po ukončení inkubácie vzorky vyberieme a v každej zmeriame absorbanciu pri vlnovej dĺžke 500 nm. Ako referenčnú kvapalinu použijeme vodu. 3.4 Stanovenie obsahu bielkovín Lowryho metódou Princíp Pri alkalických podmienkach tvorí Cu 2+ ión komplex s dusíkom peptidovej väzby, pričom sa redukuje na Cu + (Biuretova reakcia). Následne Cu + a aromatické aminokyselinové zvyšky (tyrozín, tryptofán a cysteín) reagujú s Folinou reagenciou, pričom vzniká nestabilný produkt, ktorý sa redukuje za vzniku produktu modrej farby. 7

8 3.4.2 Roztoky A. 2% Na 2 CO 3 v 0,1 mol dm -3 NaOH B. 0,5 % CuSO 4 C. 1% vínan sodno-draselný D. zmiešaním 48 dielov A + 1 diel B + 1 diel C E. 1 N Folinova reagencia Postup 1. Od vedúceho cvičenia si vypýtame štandardné roztoky hovädzieho sérového albumínu (BSA). 2. Pripravíme si roztok D zmiešaním roztokov A, B a C. Objem pripravovaného roztoku vypočítame podľa množstva vzoriek a štandardov, pričom na jedno stanovenie treba 1 ml roztoku D. Roztok D pripravujeme tesne pred použitím. 3. Do ependorfiek napipetujeme po 1 ml roztoku D. Počet ependorfiek je počet štandardov + 3 x počet vzoriek Do prvej ependorfky pridáme 200 µl vody, do ostatných po 200 µl štandardov alebo vzoriek. Každú vzorku pipetujeme do 3 ependorfiek, aby sme zvýšili presnosť stanovenia. Ihneď po pridaní zmes dôkladne premiešame. 5. Necháme inkubovať 10 min. 6. Potom do každej ependorfky pridáme 100 µl roztoku E, ihneď zamiešame. Necháme inkubovať 30 min. 7. Zmeriame absorbanciu vzoriek pri vlnovej dĺžke 720 nm. 3.5 Vyhodnotenie v exceli 1. Z meraní absorbancie štandardov glukózy zhotovíme kalibračnú závislosť Abs = f ( ) c GL, vypočítame parametre kalibračnej rovnice a regresný koeficient. 2. Vypočítame koncentráciu glukózy vo vzorkách. 3. Aktivitu invertázy vypočítame podľa vzťahu (2). 8

9 4. Z meraní absorbancie štandardov BSA zhotovíme kalibračnú závislosť Abs = f ( ) c BSA, vypočítame parametre kalibračnej rovnice a regresný koeficient. 5. Vypočítame koncentráciu bielkovín vo vzorkách. 6. Vypočítame špecifickú aktivitu invertázy. 7. Vypočítame výťažky invertázy v jednotlivých cykloch. 9