ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΩΝ, ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΟΥΑΛΕΝΙΟΥ ΣΕ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΜΕ HPLC-DAD

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΙΔΡΥΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ - ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ» ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΚΟΦΕΡΟΛΩΝ, ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΟΥΑΛΕΝΙΟΥ ΣΕ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΜΕ HPLC-DAD ΜΑΡΤΑΚΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ ΙΟΥΛΙΟΣ 2019

2

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου προσδιορισμού τοκοφερολών, χρωστικών και σκουαλενίου σε ελαιόλαδο με HPLC-DAD ΜΑΡΤΑΚΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Α.Μ.: 171303 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: Θωμαΐδης Νικόλαος, Καθηγητής ΕΚΠΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Θωμαΐδης Νικόλαος, (Καθηγητής, τμήμα Χημείας ΕΚΠΑ) Οικονόμου Αναστάσιος, (Καθηγητής, τμήμα Χημείας ΕΚΠΑ) Κόκκινος Χρήστος, (Επίκουρος Καθηγητής, τμήμα Χημείας ΕΚΠΑ) ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 02/07/2019

4

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία διπλώματος ειδίκευσης έγινε ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και επικύρωση μίας μεθόδου ταυτόχρονου προσδιορισμού τοκοφερολών, χρωστικών και σκουαλενίου σε δείγματα εξαιρετικά παρθένου ελαιόλαδου. Στην συνέχεια, έγινε εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα ελαιόλαδου από την Περιφέρεια Βορείου Αιγαίου. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε με χρήση στατιστικής, με σκοπό την κατανόηση και συσχέτιση των παραμέτρων καλλιέργειας και ελαιοποίησης με το τελικό προϊόν, έτσι ώστε να προκύψουν χρήσιμες πληροφορίες για τις συγκεντρώσεις των χημικών αυτών ουσιών στο ελαιόλαδο. Ακόμα, αναφέρονται τα συμπεράσματα που προέκυψαν από την ανάπτυξη της μεθόδου, αλλά και από την συσχέτιση των παραμέτρων που ελέγχθηκαν. Η ποικιλία του ελαιόδεντρου, το νησί καλλιέργειας, το επίπεδο ωρίμανσης του καρπού καθώς και η προσθήκη νερού κατά την μάλαξη, είναι παράμετροι που επιδρούν θετικά ή αρνητικά στις συγκεντρώσεις των ουσιών αυτών στο τελικό προϊόν. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Αναλυτική Χημεία ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙ ΙΑ: ελαιόλαδο, χρωστικές, τοκοφερόλες, σκουαλένιο, HPLC 5

6

ABSTRACT In this thesis, an analytical method was developed, optimized and validated for the simultaneous determination of tocopherols, pigments and squalene in samples of extra virgin olive oil. The method was applied to extra virgin olive oil samples from the North Aegean Region. The evaluation of the results was carried out using statistics to understand and correlate the cultivation and oil extraction parameters, in order to obtain useful information on the concentrations of these compounds in olive oil. In addition, the conclusions from the development of the method, as well as the correlation of the parameters checked, are reported. The variety of the olive tree, the island of origin, the level of ripening of the fruit and the addition of water during the malaxation, are parameters that influence positively or negatively the concentrations of these substances in the final product. SUBJECT AREA: Analytical Chemistry KEYWORDS: olive oil, pigments, tocopherols, squalene, HPLC 7

8

Στoυς γονείς μου, την αδερφή μου και την Μαρία, που με στηρίζουν αδιάκοπα και πιστεύουν σε μένα, ακόμα και όταν δεν πιστεύω εγώ στον εαυτό μου. 9

10

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Για τη διεκπεραίωση της παρούσας ερευνητικής εργασίας, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή κ. Νικόλαο Θωμαΐδη για τη συνεργασία και την πολύτιμη συμβολή του στην ολοκλήρωση της καθώς και τον κ. Μιχάλη Πεντογέννη για την πολύτιμη συνεισφορά του στην περισυλλογή των δειγμάτων που αναλύθηκαν. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θέλω να εκφράσω στην Δρ. Νατάσα Καλογιούρη και στον Δρ. Μάριο Κωστάκη για την βοήθεια τους καθ όλη την διάρκεια εκπόνησης της εργασίας μου, καθώς και στον Δημήτρη-Χρήστο Κανάκη, την Ευαγγελία Κρητικού και την Κωνσταντίνα Λαζάρου για την πολύτιμη βοήθεια τους. Ακόμα, θέλω να ευχαριστήσω όλα τα μέλη της ερευνητικής ομάδας του κ. Θωμαΐδη, TrAMS Group, για την άψογη συνεργασία που είχαμε τα τελευταία δύο χρόνια. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστώ στην οικογένεια και τους φίλους μου για την υποστήριξη και την υπομονή που υπέδειξαν όλα αυτά τα χρόνια. 11

12

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 25 1. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 27 Ελαιόλαδο... 27 Κατηγορίες ελαιόλαδου... 27 Συστατικά ελαιόλαδου... 34 Λιπαρά οξέα... 34 Τριγλυκερίδια... 35 Μονο- και διακυλογλυκερόλες... 35 Υδρογονάνθρακες... 35 Τοκοφερόλες... 36 Χρωστικές ουσίες... 36 Αλειφατικές και αρωματικές αλκοόλες... 36 Στερόλες... 37 Τριτερπενοειδή οξέα... 37 Πτητικές και αρωματικές ενώσεις... 37 Άλλα δευτερεύοντα συστατικά... 38 Χρωστικές και τοκοφερόλες στο ελαιόλαδο... 38 Χλωροφύλλες... 39 Φαιοφυτίνες... 40 Πυροφαιοφυτίνες... 41 β- καροτένιο... 41 Λουτεΐνη... 42 Τοκοφερόλες (Βιταμίνη Ε) στο ελαιόλαδο... 42 Σκουαλένιο... 43 13

2. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ... 45 Μέθοδοι για τον προσδιορισμό χρωστικών και αντιοξειδωτικών στο ελαιόλαδο 45 Συμπεράσματα από την βιβλιογραφική ανασκόπηση... 55 Σκοπός της Εργασίας... 56 3. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ... 57 3.1 Υγροχρωματογραφικό σύστημα με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων... 57 Χρωματογραφία Κατανομής... 58 Χρωματογραφία αντίστροφης φάσης... 59 Οργανολογία υγροχρωματογραφίας... 60 Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων... 62 Εργαστηριακός εξοπλισμός... 64 Διαλύτες και αντιδραστήρια... 65 Πρότυπες ουσίες... 65 Πρότυπα και ενδιάμεσα διαλύματα παρακαταθήκης... 65 4. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ... 67 Χαρακτηριστικά στατικής φάσης... 67 Βελτιστοποίηση της σύστασης της κινητής φάσης... 67 Επιλογή της κατάλληλης κινητής φάσης... 67 Προκατεργασία του δείγματος... 70 Συνθήκες ανιχνευτή DAD... 73 5. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ... 77 Εισαγωγή... 77 Γραμμικότητα της μεθόδου... 77 Καμπύλη αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης αναλύτη... 78 14

Καμπύλη αναφοράς γνωστής προσθήκης... 82 Ορθότητα και Πιστότητα της μεθόδου... 87 Ορθότητα και Επαναληψιμότητα της μεθόδου... 87 Ενδιάμεση πιστότητα... 91 Όριο Ανίχνευσης Ποσοτικοποίησης... 100 6. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ ΒΟΡΕΙΟΥ ΑΓΑΙΟΥ... 105 Εισαγωγή... 105 Δειγματοληψία... 105 Ανάλυση των δειγμάτων και αποτελέσματα... 109 Ποσοτικά Αποτελέσματα... 110 Παρουσίαση αποτελεσμάτων (box-and-whiskers plots)... 110 Νησί καλλιέργειας... 111 Ζώνη Καλλιέργειας (Νήσος Λέσβος)... 116 Ποικιλία... 120 Στάδια ωρίμανσης του καρπού... 124 Προσθήκη Νερού κατά την Μάλαξη... 127 7. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 131 8. ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ... 134 9. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ... 135 10. ΑΝΑΦΟΡΕΣ... 136 15

16

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1: Καμπύλη αναφοράς της λουτεΐνης.... 79 Σχήμα 2: Καμπύλη αναφοράς του β-καροτενίου.... 79 Σχήμα 3: Καμπύλη αναφοράς της α- τοκοφερόλης.... 80 Σχήμα 4: Καμπύλη αναφοράς της (β+γ)- τοκοφερόλης.... 80 Σχήμα 5: Καμπύλη αναφοράς της δ- τοκοφερόλης.... 81 Σχήμα 6: Καμπύλη αναφοράς της χλωροφύλλης α.... 81 Σχήμα 7: Καμπύλη αναφοράς του σκουαλενίου.... 82 Σχήμα 8: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για το β-καροτένιο.... 84 Σχήμα 9: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την λουτεΐνη.... 84 Σχήμα 10: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την α-τοκοφερόλη.... 85 Σχήμα 11: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για τις (β+γ)- τοκοφερόλη.... 85 Σχήμα 12: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την δ- τοκοφερόλη.... 86 Σχήμα 13: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την χλωροφύλλη α.... 86 Σχήμα 14: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για το σκουαλένιο.... 87 Σχήμα 15: Box plot Λουτεΐνης ανάλογα με το νησί καλλιέργειας... 111 Σχήμα 16: Box plot α-τοκοφερόλης ανάλογα με το νησί καλλιέργειας... 112 Σχήμα 17: Box plot β+γ-τοκοφερόλης ανάλογα με την νησί καλλιέργειας... 113 Σχήμα 18: Box plot β-καροτενίου ανάλογα με την νησί καλλιέργειας... 114 Σχήμα 19: Box plot σκουαλενίου ανάλογα με το νησί καλλιέργειας... 115 Σχήμα 20: Box plot Λουτεΐνης ανάλογα με την Ζώνη Καλλιέργειας... 116 Σχήμα 21: Box plot α-τοκοφερόλης ανάλογα με την Ζώνη Καλλιέργειας... 117 Σχήμα 22: Box plot (β+γ)-τοκοφερόλης ανάλογα με την Ζώνη Καλλιέργειας... 118 Σχήμα 23: Box plot σκουαλενίου ανάλογα με την Ζώνη Καλλιέργειας... 119 Σχήμα 24: Box plot λουτεΐνης ανάλογα με την ποικιλία... 120 Σχήμα 25: Box plot α-τοκοφερόλης ανάλογα με την ποικιλία... 121 17

Σχήμα 26: Box plot β+γ-τοκοφερόλης ανάλογα με την ποικιλία... 122 Σχήμα 27: Box plot σκουαλενίου ανάλογα με την ποικιλία... 123 Σχήμα 28: Box plot λουτεΐνης ανάλογα με το επίπεδο ωρίμανσης του καρπού... 124 Σχήμα 29: Box plot α-τοκοφερόλης ανάλογα με το επίπεδο ωρίμανσης του καρπού.. 125 Σχήμα 30: Box plot σκουαλενίου ανάλογα με το επίπεδο ωρίμανσης του καρπού... 126 Σχήμα 31: Box plot α-τοκοφερόλης ανάλογα με την προσθήκη νερού κατά την μάλαξη... 127 Σχήμα 32: Box plot β+γ-τοκοφερόλης ανάλογα με την προσθήκη νερού κατά την μάλαξη... 128 Σχήμα 33: Box plot σκουαλενίου ανάλογα με την προσθήκη νερού κατά την μάλαξη. 129 18

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: Δομή της χλωροφύλλης α (επάνω) και της χλωροφύλλης β (κάτω) [23]... 39 Εικόνα 2: Δομή της φαιοφυτίνης α [25]... 40 Εικόνα 3: Δομή της φαιοφυτίνης β [26]... 40 Εικόνα 4: Δομή β-καροτενίου [32]... 41 Εικόνα 5: Δομή της λουτεΐνης [37]... 42 Εικόνα 6: Χημικές δομές των τοκοφερολών ανάλογα με τους υποκαταστάτες R1, R2 [40]... 43 Εικόνα 7: Δομή του σκουαλενίου [42]... 43 Εικόνα 8: Χημική τροποποίηση υδρόφιλων ομάδων σιλανόλης με τις υδρόφοβες ομάδες... 59 Εικόνα 9: Σύστημα υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης... 61 Εικόνα 10: Σχηματική αναπαράσταση ενός ανιχνευτή DAD [55]... 63 Εικόνα 11: Χρωματογράφημα μίγματος προτύπων στα 450 nm, με το πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης του πίνακα 3.... 69 Εικόνα 12: Χρωματογράφημα μίγματος προτύπων στα 450 nm, με το πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης του πίνακα 4... 69 Εικόνα 13: Πειραματική πορεία βασισμένη στην ISO 29841:2014 [57]... 71 Εικόνα 14: Χρωματογράφημα ανάλυσης του μη πολικού κλάσματος των αιθέρων. Διακρίνονται οι κορυφές των (β+γ) και α-τοκοφερόλης.... 72 Εικόνα 15: Τελική πειραματική πορεία για τον προσδιορισμό τοκοφερολων και χρωστικών σε ελαιόλαδο... 73 Εικόνα 16: Φάσμα απορρόφησης της λουτεΐνης, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου... 75 Εικόνα 17: Φάσμα απορρόφησης του β-καροτενίου, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου... 75 Εικόνα 18:Φάσμα απορρόφησης των τοκοφερολών, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου... 75 19

Εικόνα 19: Φάσμα απορρόφησης της φαιοφυτίνης α σε δείγμα ελαιόλαδου... 76 Εικόνα 20: Φάσμα απορρόφησης της χλωροφύλλης α σε πρότυπο διάλυμα... 76 Εικόνα 21: Φάσμα απορρόφησης του σκουαλενίου, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου... 76 Εικόνα 22: Ποσοστό δειγμάτων ελαιολάδου από τα νησιά του Β. Αιγαίου... 106 Εικόνα 23: (α) Ποσοστό δειγμάτων ελαιολάδου καταμερισμένο σε ζώνες δειγματοληψίας στη Λέσβο, (β) Ζώνες δειγματοληψίας στη Λέσβο-χαρτογραφική απεικόνιση... 106 20

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1: Χαρακτηριστικά ελαιόλαδου... 31 Πίνακας 2: Προσδιορισμός των αναφερθέντων ουσιών σύμφωνα με την βιβλιογραφία 46 Πίνακας 3: Πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης Α... 68 Πίνακας 4: Πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης Β... 68 Πίνακας 5: Παράγοντας Συμμετρίας Κορυφών... 70 Πίνακας 6: Παράμετροι μέτρησης ανιχνευτή DAD... 74 Πίνακας 7: Εξισώσεις παλινδρόμησης και συντελεστές συσχέτισης για κάθε αναλύτη.. 78 Πίνακας 8: Εξισώσεις παλινδρόμησης και συντελεστές συσχέτισης καμπύλη αναφοράς γνωστής προσθήκης για κάθε αναλύτη... 83 Πίνακας 9: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (β-καροτένιο)... 88 Πίνακας 10: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (λουτεΐνη)... 88 Πίνακας 11: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (α- τοκοφερόλη)... 89 Πίνακας 12: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας. (β+γ- τοκοφερόλη)... 89 Πίνακας 13: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (δ - τοκοφερόλη)... 90 Πίνακας 14: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (χλωροφύλλη α)... 90 Πίνακας 15: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (σκουαλένιο)... 91 Πίνακας 16: Δεδομένα ανακτήσεων για τον έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (βκαροτένιο)... 92 Πίνακας 17: Δεδομένα ανακτήσεων για τον έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (λουτεΐνη)... 93 Πίνακας 18: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (ατοκοφερόλη)... 94 Πίνακας 19: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (β+γ - τοκοφερόλη)... 95 Πίνακας 20: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (δ - τοκοφερόλη)... 96 21

Πίνακας 21: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (χλωροφύλλη)... 97 Πίνακας 22: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (σκουαλένιο)... 98 Πίνακας 23: Σύγκριση RSDR μεταξύ πειραματικών αποτελεσμάτων και αποτελεσμάτων που ελήφθησαν από την εξίσωση Horwitz... 99 Πίνακας 24: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (β-καροτένιο)... 101 Πίνακας 25: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (λουτεΐνη)... 101 Πίνακας 26: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (α-τοκοφερόλη)... 102 Πίνακας 27: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (β+γ-τοκοφερόλη)... 102 Πίνακας 28: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (δ-τοκοφερόλη)... 103 Πίνακας 29: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (χλωροφύλλη)... 103 Πίνακας 30: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (σκουαλένιο)... 104 Πίνακας 31: Κατηγοριοποίηση των δειγμάτων ελαιολάδου... 107 Πίνακας 32: Ποικιλίες ελαιολάδου νησιών Β. Αιγαίου... 109 Πίνακας 33: Αποτελέσματα λουτεΐνης ανάλογα με την προέλευση... 111 Πίνακας 34: Αποτελέσματα α-τοκοφερόλης ανάλογα με την προέλευση... 112 Πίνακας 35: Αποτελέσματα (β+γ)-τοκοφερόλης ανάλογα με την προέλευση... 113 Πίνακας 36: Αποτελέσματα β-καροτενίου ανάλογα με την προέλευση... 114 Πίνακας 37: Αποτελέσματα σκουαλενίου ανάλογα με την προέλευση... 115 Πίνακας 38: Αποτελέσματα λουτεΐνης ανάλογα με την Ζώνη καλλιέργειας... 116 22

Πίνακας 39: Αποτελέσματα α-τοκοφερόλης ανάλογα με την Ζώνη καλλιέργειας... 117 Πίνακας 40: Αποτελέσματα (β+γ)-τοκοφερόλης ανάλογα με την Ζώνη καλλιέργειας... 118 Πίνακας 41: Αποτελέσματα σκουαλενίου ανάλογα με την Ζώνη καλλιέργειας... 119 Πίνακας 42: Αποτελέσματα λουτεΐνης ανάλογα με την ποικιλία... 120 Πίνακας 43: Αποτελέσματα α-τοκοφερόλης ανάλογα με την ποικιλία... 121 Πίνακας 44: Αποτελέσματα (β+γ)-τοκοφερόλης ανάλογα με την ποικιλία... 122 Πίνακας 45: Αποτελέσματα σκουαλενίου ανάλογα με την ποικιλία... 123 Πίνακας 46: Αποτελέσματα λουτεΐνης ανάλογα με την ωρίμανση του καρπού... 124 Πίνακας 47: Αποτελέσματα α-τοκοφερόλης ανάλογα με την ωρίμανση του καρπού... 125 Πίνακας 48: Αποτελέσματα σκουαλενίου ανάλογα με την ωρίμανση του καρπού... 126 Πίνακας 49: Προσθήκη νερού κατά την μάλαξη (α-τοκοφερόλη)... 127 Πίνακας 50: Προσθήκη νερού κατά την μάλαξη (β+γ-τοκοφερόλη)... 128 Πίνακας 51: Προσθήκη νερού κατά την μάλαξη (σκουαλένιο)... 129 Πίνακας 52: Πίνακας ορολογίας με τις αντιστοιχίσεις των ελληνικών και ξενόγλωσσων όρων... 134 23

24

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η ανάπτυξη και επικύρωση μιας νέας οικονομικής και γρήγορης μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των τοκοφερολών, των χρωστικών και του σκουαλενίου σε δείγματα ελαιόλαδου. Τα δείγματα τα οποία αναλύθηκαν σε αυτή την Μεταπτυχιακή Εργασία Ειδίκευσης, αποκτήθηκαν στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος «ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗ ΕΡΕΥΝΑ ΠΡΟΩΘΗΣΗΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΚΑΙ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΕΛΙΑΣ ΒΟΡΕΙΟΥ ΑΙΓΑΙΟΥ ΜΕΣΩ ΑΝΑΔΕΙΞΗΣ ΤΟΥ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΙΔΙΑΙΤΕΡΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ» το οποίο ανατέθηκε από την Περιφέρεια Βορείου Αιγαίου στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Συνολικά αναλύθηκαν 452 δείγματα εξαιρετικά παρθένου ελαιόλαδου από πέντε νησιά του Βορείου Αιγαίου (Λέσβος, Σάμος, Χίος, Ικαρία και Φούρνοι). 25

26

1. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ελαιόλαδο Το ελαιόλαδο αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της Μεσογειακής Διατροφής, αλλά η κατανάλωση του εξαπλώθηκε σε όλο τον κόσμο, τόσο για την μοναδική του γεύση, αλλά και για τις ευεργετικές του ιδιότητες, που οφείλονται στα συστατικά του, όπως φυσικά αντιοξειδωτικά και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα [1]. Ελαιόλαδο ονομάζεται το έλαιο που λαμβάνεται από τους καρπούς της ελαίας της Ευρωπαϊκής (Olea Europea) με μέσα αποκλειστικά μηχανικά και φυσικές μεθόδους ή επεξεργασίες σε κατάλληλες θερμοκρασίες που να μην προκαλούν αλλοίωση του ελαίου [2]. Το ελαιόλαδο διαχωρίζεται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με την οξύτητα του. Κατηγορίες ελαιόλαδου (Α) Παρθένα ελαιόλαδα: Τα παρθένα ελαιόλαδα είναι έλαια που λαμβάνονται αποκλειστικά με μηχανικές ή άλλες φυσικές μεθόδους υπό συνθήκες θερμικές, οι οποίες δεν προκαλούν αλλοίωση του ελαίου. Τα έλαια αυτά, δεν έχουν υποστεί άλλη επεξεργασία, εκτός από την πλύση, την καθίζηση, τη φυγοκέντρηση και τη διήθηση. Τα έλαια που έχουν ληφθεί μετά από επεξεργασία με διαλύτη ή με μεθόδους επανεστεροποίησης και μίγματα ελαίων με έλαια άλλης φύσης εξαιρούνται [2]. Τα Παρθένα ελαιόλαδα διαχωρίζονται περαιτέρω στις παρακάτω κατηγορίες, σύμφωνα με τον Κώδικα Τροφίμων και Ποτών: (α) Εξαιρετικό Παρθένο ελαιόλαδο: Παρθένο ελαιόλαδο όπου ο βαθμός οργανοληπτικής αξιολόγησης είναι μεγαλύτερος ή ίσος του 6.5. Η ελεύθερη οξύτητα, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, είναι μικρότερη ή ίση του 0,8 g/100g ελαίου. Τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα προς τα προβλεπόμενα για την κατηγορία αυτή [2]. 27

(β) Παρθένο ελαιόλαδο: Ονομάζεται επίσης και «εκλεκτό». Είναι παρθένο ελαιόλαδο όπου ο βαθμός οργανοληπτικής αξιολόγησης είναι μεγαλύτερος ή ίσος του 5.5, και η ελεύθερη οξύτητα του, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, είναι μικρότερη ή ίση του 2 g/100g ελαίου. Τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα προς τα προβλεπόμενα για την κατηγορία αυτή [2]. (γ) Κοινό παρθένο ελαιόλαδο: παρθένο ελαιόλαδο με βαθμό οργανοληπτικής αξιολόγησης μεγαλύτερο ή ίσο του 3.5, και ελεύθερη οξύτητα, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, μικρότερη ή ίση του 3,3 g/100g ελαίου. Τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα προς τα προβλεπόμενα για την κατηγορία αυτή [2]. (δ) Μειονεκτικό (LAMPANTE) παρθένο ελαιόλαδο: παρθένο ελαιόλαδο του οποίο ο βαθμός οργανοληπτικής αξιολόγησης είναι κατώτερος του 3.5 ή/και του οποίου η ελεύθερη οξύτητα, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, είναι ανώτερη των 3,3 g/100g ελαίου. Τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα προς τα προβλεπόμενα για την κατηγορία αυτή [2]. (Β) Εξευγενισμένο (ραφινέ) ελαιόλαδο: Ελαιόλαδο που λαμβάνεται από τον εξευγενισμό παρθένου ελαιόλαδου. Η ελεύθερη του οξύτητα εκφράζεται σε ελαϊκό οξύ, και δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,5g/100g ελαίου. Τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα προς τα προβλεπόμενα για την κατηγορία αυτή [2]. (Γ) Ελαιόλαδο: Ελαιόλαδο που προέρχεται από ανάμιξη εξευγενισμένου ελαιόλαδου και παρθένου ελαιόλαδου, εξαιρούμενου του μειονεκτικού. Η ελεύθερη οξύτητα του, εκφραζόμενη σε ελαϊκό οξύ, δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1,5 g/100g ελαίου. Τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα προς τα προβλεπόμενα για την κατηγορία αυτή [2]. 28

(Δ) Βιομηχανικό ελαιόλαδο: Ελαιόλαδο που δεν είναι δυνατό με οποιαδήποτε επεξεργασία ή οποιοδήποτε τρόπο να χρησιμοποιηθεί ως πρώτη ύλη για την παρασκευή προϊόντων διατροφής. Σε αυτή την κατηγορία εντάσσονται τα έλαια που έχουν παλμιτικό οξύ σε θέση 2 των τριγλυκεριδίων ανώτερο του 2,2%, έχουν δηλαδή υποστεί αλλοίωση της μοριακής του σύστασης, χωματέλαια, μουργέλαια κλπ. Αυτά τα έλαια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή σαπουνιού και γλυκερίνης [2]. Με τον όρο «Βιομηχανοποιήσιμο ελαιόλαδο» ονομάζονται τα ελαιόλαδα και τα εξευγενισμένα ελαιόλαδα με δυσάρεστα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά ή/και με οξύτητα μεγαλύτερη από τα καθορισμένα όρια, εκφραζόμενη πάντα σε ελαϊκό οξύ [2]. 29

30

Πίνακας 1: Χαρακτηριστικά ελαιόλαδου Κατηγορία Εξαιρετικά Παρθένο ελαιόλαδο Παρθένο ελαιόλαδο Κοινό Παρθένο ελαιόλαδο Μειονεκτικ ό παρθένο ελαιόλαδο Εξευγενισμένο ελαιόλαδο Ελαιόλαδο Οξύτητα (%) 1,0 2,0 3,3 >3,3 0,5 1,5 Κ270 0,20 0,25 0,25 >0,25 1,20 1,00 Κ270 υπεράνω αλουμίνας 0,10 0,10 0,10 0,11 - - ΔΚ 0,01 0,01 0,01-0,16 0,13 Κ232 2,50 2,60 2,60 3,70 3,40 3,30 Δείκτης υπεροξειδίων (meqo 2/kg) Οργανοληπτική αξιολόγηση Αλογονωμένοι υδρογονάνθρακες (mg/kg) 20 20 20 >20 5 15 6,5 5,5 3,5 < 3,5 - - 0,20 0,20 0,20 > 0,20 0,20 0,20 Μυριστικό οξύ % 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Λινολενικό οξύ % 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 31

Αραχιδικό οξύ % 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Εικοσενοϊκό οξύ % 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Βεχενικό οξύ % 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Λιγνοκηρικό οξύ % 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Σύνολο trans ισομερών του ελαϊκού οξέος % Σύνολο trans ισομερών του λινελαϊκού + του λινολενικού οξέος % Κεκορεσμένα λιπαρά οξέα στη θέση 2 των τριγλυκεριδίων % 0,05 0,05 0,05 0,10 0,20 0,20 0,05 0,05 0,05 0,10 0,30 0,30 1,3 1,3 1,3 1,3 1,5 1,5 Στιγμασταδιένια mg/kg 0,15 0,15 0,15 0,50 - - Κήροι (mg/kg) 250 250 250 350 350 350 Σύνολο Στερολών (mg/kg) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Χοληστερόλη % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Βρασσικαστερόλη % 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 32

Καμπεστερόλη % 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 Στιγμαστερόλη % < Καμπεστερό λη < Καμπεστερό λη < Καμπεστερό λη < Καμπεστερό λη < Καμπεστερόλη < Καμπεστερόλη β-σιτοστερόλη % 93,0 93,0 93,0 93,0 93,0 93,0 Δ7-Στιγμαστενόλη % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Ερυθροδιόλη + Ουβαόλη % Υγρασία και πτητικές ουσίες % Αδιάλυτες ύλες στον πετρελαϊκό αιθέρα % Διαφορά ECN 42 HPLC και ECN 42 θεωρητικός υπολογισμός 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 0,2 0,2 0,2 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,05 0,05 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 33

Συστατικά ελαιόλαδου Το έλαιο που προέρχεται από τον καρπό της ελιάς Olea Europea, έχει συγκεκριμένη σύσταση, και αποτελείται από δύο κλάσματα, το σαπωνοποιήσιμο και το μη σαπωνοποιήσιμο. Το σαπωνοποιήσιμο κλάσμα αποτελεί το 98,5-99,5% του ελαίου [3]. Το κύριο συστατικό του ελαιόλαδου είναι τα τριγλυκερίδια, τα οποία αποτελούν το 99% της σύστασης του [4]. Αποτελείται επίσης από ελεύθερα λιπαρά οξέα, μονο- και διάκυλογλυκερόλες, υδρογονάνθρακες, τοκοφερόλες, αλειφατικές και αρωματικές αλκοόλες, στερόλες, τριτερπενικά οξέα, χρωστικές και τέλος πτητικές και αρωματικές ενώσεις. Στις παρακάτω παραγράφους αναπτύσσεται η κάθε κατηγορία συστατικών του ελαιόλαδου που προαναφέρθηκε. Λιπαρά οξέα Στο ελαιόλαδο υπάρχουν λιπαρά οξέα κορεσμένα και ακόρεστα, και η περιεκτικότητα τους ορίζει το είδος του ελαιόλαδου, μέσω της ελεύθερης οξύτητας που εκφράζεται με το ελαϊκό οξύ, αλλά και την βρωσιμότητα του (trans- λιπαρά οξέα) [5]. Κορεσμένα λιπαρά οξέα στο ελαιόλαδο είναι το Λαυρικό οξύ (C12:0), Μυριστικό οξύ (C14:0), Παλμιτικό οξύ (C16:0), Στεατικό οξύ (C18:0), Αραχιδικό οξύ (C20:0), Επταδεκανοϊκό οξύ (C17:0), Βεχενικό οξύ (C22:0), και Λιγνοκηρικό οξύ (C24:0) [5,6]. Ακόρεστα λιπαρά οξέα στο ελαιόλαδο είναι το Παλμιτελαϊκό οξύ (C16:1), Επταδεκενοϊκό οξύ (C17:1), Ελαϊκό οξύ (C18:1), Λινολεϊκό οξύ (C18:2), Λινολενικό οξύ (C18:3), Εικοσεναϊκό οξύ (C20:1), και Ερουκικό οξύ (C22:1). Η περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα διαφέρει σε διαφορετικά δείγματα, αφού παίζει ρόλο ο γεωγραφικός παράγοντας, το κλίμα, η ποικιλία, αλλά και το στάδιο ωριμότητας του καρπού [1]. Τα κύρια λιπαρά οξέα, που βρίσκονται γενικά σε μεγαλύτερη περιεκτικότητα είναι το ελαϊκό οξύ, το παλμιτικό και το λινελαϊκό οξύ. Βάση των περιεκτικοτήτων αυτών των λιπαρών οξέων, τα ελαιόλαδα κατατάσσονται σε δύο τύπους, στα ελαιόλαδα με υψηλή περιεκτικότητα σε ελαϊκό οξύ και χαμηλή περιεκτικότητα σε παλμιτικό και λινελαϊκό, και στα 34

ελαιόλαδα με χαμηλή περιεκτικότητα σε ελαϊκό οξύ και ψηλή περιεκτικότητα σε παλμιτικό και λινελαϊκό οξύ [6]. Τριγλυκερίδια Τα κύρια τριγλυκερίδια που βρίσκονται σε σημαντικές ποσότητες στο ελαιόλαδο είναι τα OOO (40-59%), POO (12-20%), OOL (12,5-20%), POL (5-5,7%) και SOO(3-7%). Σε μικρότερο ποσοστό, υπάρχουν επίσης τα POP, POS, OLL, LOL, OLO, PLL, PLO και LLL [5]. Μονο- και διακυλογλυκερόλες Η παρουσία των μερικών-γλυκερών οφείλεται σε ατελή τριακυλογλυκερολική βιοσύνθεση ή σε υδρολυτικές αντιδράσεις που έλαβαν χώρα. Γενικά στο παρθένο ελαιόλαδο, η συγκέντρωση των διακυλογλυκερολών κυμαίνεται στο 1-2,8% [6]. Υδρογονάνθρακες Στο ελαιόλαδο υπάρχουν κυρίως δύο υδρογονάνθρακες, το σκουαλένιο και το β-καροτένιο. Υπάρχουν επίσης σε μικρότερες περιεκτικότητες διτερπένια και τριτερπένια, πολυολεφίνες, n-παραφίνες και ισοπρενοειδή [6]. Το σκουαλένιο αποτελεί το 90% του υδρογονανθρακικού κλάσματος του ελαιόλαδου, και είναι ο τελευταίος μεταβολίτης που προηγείται του σχηματισμού στερολικού δακτυλίου [6]. Πιστεύεται ότι η περιεκτικότητα του ελαιόλαδου σε σκουαλένιο είναι σημαντική για την παρουσία ευεργετικών ιδιοτήτων του ελαιόλαδου στη υγεία και τη δράση του ενάντιας ορισμένων μορφών καρκίνου [6-9]. Όπως και τα υπόλοιπα συστατικά, έτσι και στο σκουαλένιο, η συγκέντρωση του εξαρτάται από την ποικιλία της ελιάς και τον τρόπο εκχύλισης του ελαιόλαδου. 35

Το β-καροτένιο ανήκει στην κατηγορία των Χρωστικών ενώσεων όπως θα αναφερθεί και παρακάτω [2]. Τοκοφερόλες Από τις οκτώ ομόλογες τοκοφερόλες, στο παρθένο ελαιόλαδο εμφανίζονται οι α-τοκοφερόλη, β-τοκοφερόλη, γ-τοκοφερόλη και δ-τοκοφερόλη. Το 90% της περιεκτικότητας του παρθένου ελαιόλαδου σε τοκοφερόλες καταλαμβάνει η α- τοκοφερόλη, στην ελεύθερη της μορφή [10]. Η περιεκτικότητα της στο ελαιόλαδο, κυμαίνεται σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων, που εξαρτάται από την ποικιλία ελιάς και την τεχνολογία εκχύλισης [10,11]. Η α-τοκοφερόλη είναι γνωστό in vivo αντιοξειδωτικό, οπότε είναι επιθυμητό να διατηρείται. Έχει βρεθεί ότι κατά τις διαδικασίες εξευγενισμού και υδρογόνωσης του ελαίου η συγκέντρωση τοκοφερόλης μειώνεται [12,13]. Χρωστικές ουσίες Οι χρωστικές ουσίες που υπάρχουν στο ελαιόλαδο είναι χλωροφύλλες και τα καρετονοειδή, τα οποία του δίνουν το χαρακτηριστικό του χρώμα. Αυτές οι ενώσεις μπορούν να υποστούν οξείδωση, κάτω από ορισμένες συνθήκες, σε άχρωμα προϊόντα [14]. Είναι γνωστό πως η περιεκτικότητα των χρωστικών επηρεάζεται από την ποικιλία ελιάς, την γεωγραφική θέση παραγωγής, το στάδιο ωρίμανσης, τον τρόπο εκχύλισης και τις συνθήκες αποθήκευσης. Εάν και ακόμα δεν υπάρχει τυποποιημένη μέθοδος μέτρησης της περιεκτικότητας των χρωστικών, αποτελούν δείκτη ποιότητας του ελαιόλαδου [5,15]. Κυρίαρχη ένωση ανάμεσα στις χλωροφύλλες είναι η φαιοφυτίνη-α, ενώ κυρίαρχες ενώσεις καροτενοειδών είναι η λουτεΐνη και το β-καροτένιο [5,14] Αλειφατικές και αρωματικές αλκοόλες Οι κυριότερες κατηγορίες αλειφατικών και αρωματικών αλκοολών είναι οι λιπαρές αλκοόλες και οι διτερπενοειδείς αλκοόλες, που μπορούν να συναντηθούν στην ελεύθερη αλλά και στην εστεροποιημένη μορφή τους [5]. 36

Λιπαρές αλκοόλες: Είναι ευθύγραμμες κορεσμένες αλκοόλες με περισσότερα από 16 άτομα άνθρακα, και βρίσκονται στην ελεύθερη αλλά και εστεροποιημένη μορφή. Οι κυριότερες λιπαρές αλκοόλες που βρίσκονται στο ελαιόλαδο είναι η εικοσιδυανόλη, η εικοσιτετρανόλη, η εικοσιεξανόλη και η εικοσιοκτανόλη. Οι περιεκτικότητες των εστεροποιημένων λιπαρών αλκοολών με λιπαρά οξέα είναι σημαντικές, αφού χρησιμοποιούνται για την διαφοροποίηση του ελαιόλαδου στις κατηγορίες του [5,16]. Διτερπενοειδή αλκοόλες: Οι κυριότερες άκυκλες διτερπενοειδής αλκοόλες που βρίσκονται στο αλειφατικό κλάσμα αλκοολών του ελαιόλαδου είναι η φυτόλη και η γερανυλγερανιόλη [5,16]. Στερόλες Οι στερόλες είναι λιπίδια που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο γνησιότητας του ελαιόλαδου. Υπάρχουν τέσσερις κατηγορίες στερολών στο ελαιόλαδο: οι κοινές στερόλες, οι 4α- μεθυλοστερόλες, οι τριτερπενοειδείς αλκοόλες και οι τριτερπενοειδείς διαλκοόλες. H περιεκτικότητα τους εξαρτάται από την ποικιλία ελιάς, αλλά και τις τεχνικές επεξεργασίας, που χρησιμοποιούνται κατά την εξαγωγή ελαιόλαδου [5,17] Τριτερπενοειδή οξέα Τα υδροξυπεντακυκλικά τριτερπενοειδή οξέα βρίσκονται σε μικρές περιεκτικότητες στο ελαιόλαδο. Είναι ενώσεις βιοδραστικές, που έχουν ευεργετικές ιδιότητες στην υγεία του ανθρώπου [18]. Το ολεανολικό οξύ και το μασλινικό οξύ είναι τα κύρια συστατικά ελαιόλαδου αυτής της κατηγορίας, και η περιεκτικότητα τους επηρεάζεται κατά την επεξεργασία ραφιναρίσματος [5]. Πτητικές και αρωματικές ενώσεις Στις πτητικές ενώσεις που προσδιορίστηκαν στο ελαιόλαδο περιέχονται υδρογονάνθρακες, αλκοόλες, αλδεΰδες και κετόνες, οξέα, εστέρες, αιθέρες, 37

παράγωγα φουρανίου, παράγωγα θειοφαινίου, πυραζόνες, θειόλες, και πυραζίνες [19]. Αναγνωρίστηκαν περίπου διακόσιες ογδόντα πτητικές ενώσεις, όμως μόνο εξηνταεπτά από αυτές συμβάλλουν στο άρωμα του παρθένου ελαιόλαδου, λόγω των περιεκτικοτήτων τους [5]. Άλλα δευτερεύοντα συστατικά Σε αυτή την κατηγορία εμπεριέχονται τα φωσφολιπίδια και οι πρωτεΐνες. Τα δυο αυτά συστατικά βρίσκονται σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις εφόσον οι ποσότητες τους μειώνονται έντονα κατά το φιλτράρισμα και το ραφινάρισμα του ελαιόλαδου [5]. Χρωστικές και τοκοφερόλες στο ελαιόλαδο Οι χρωστικές που περιέχονται στο ελαιόλαδο (χλωροφύλλη, φαιοφυτίνη, πυροφαιοφυτίνη, λουτεΐνη, β-καροτένιο) είναι υπεύθυνες για το χρώμα του (πράσινο-κιτρινωπό). Η περιεκτικότητα του ελαιόλαδου σε αυτές τις χρωστικές ποικίλει και εξαρτάται από το κλίμα, το υψόμετρο καλλιέργειας, την θερμοκρασία, την υγρασία, την μέθοδο παραγωγής του, την αποθήκευση του καρπού κ.α. [14,20] Ο αριθμός και η περιεκτικότητα των χρωστικών αποτελεί χαρακτηριστικό ποιότητας για το ελαιόλαδο. Συγκεκριμένα, υψηλή συγκέντρωση φαιοφυτινών και πυροφαιοφυτίνης υποδηλώνει ένα ελαιόλαδο παλαιό ή συντηρημένο σε λάθος συνθήκες. Επίσης, χαρακτηριστικό ποιότητας και φρεσκότητας ενός ελαιόλαδου αποτελεί ο λόγος μεταξύ των χρωστικών του [20]. Οι τοκοφερόλες (α, β, γ και δ) ή κοινώς Βιταμίνη Ε είναι θρεπτικά συστατικά που περιέχονται στα τρόφιμα και στα εδώδιμα έλαια. Έχουν πολύ ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα και μειώνουν τον κίνδυνο καρδιαγγειακών προβλημάτων [21,22]. Η περιεκτικότητα τους εξαρτάται από την ποικιλία, το κλίμα καλλιέργειας, το επίπεδο ωρίμανσης του καρπού, την μέθοδο καλλιέργειας, την μέθοδο παρασκευής του ελαιόλαδου, την αποθήκευση του καρπού κ.α. 38

Χλωροφύλλες Το μόριο της χλωροφύλλης είναι ιδιαίτερα πολύπλοκο και αποτελείται από μία μορφή δακτυλίου (δομή της πορφυρίνης) με ένα κεντρικό ιόν μαγνησίου και μία μακριά υδρόφοβη πλευρική αλυσίδα. Υπάρχουν δύο διαφορετικά μόρια, η χλωροφύλλη α και η χλωροφύλλη β. Ευθύνονται για το πράσινο χρώμα του καρπού της ελιάς και κατ επέκταση του ελαιόλαδου [14,20,24]. Εκτός από τον καρπό της ελιάς περιέχεται και στα φύλλα, τα οποία μπορεί να βρίσκονται μαζί με τους καρπούς κατά την παραγωγή του ελαιόλαδου. Δεν υπάρχει κάποιο νομοθετικό όριο ως προς την παρουσία τους στο ελαιόλαδο. Εικόνα 1: Δομή της χλωροφύλλης α (επάνω) και της χλωροφύλλης β (κάτω) [23] 39

Φαιοφυτίνες Οι φαιοφυτίνες είναι προϊόντα φυσικής αποικοδόμησης των χλωροφυλλών και ευθύνονται για την καφετί απόχρωση των παλαιών ελαιόλαδων. Η αποικοδόμηση αυτή πραγματοποιείται με δύο τρόπους. Ο πρώτος τρόπος είναι μέσω της απώλειας του κεντρικού ιόντος μαγνησίου λόγω θέρμανσης ή/και υποκατάστασης του από ιόντα υδρογόνου (H + ). Ο δεύτερος τρόπος είναι λόγω απώλειας της ομάδας της φυτόλης μέσω της επίδρασης του ενζύμου χλωροφυλλάση [24]. Όπως και στην χλωροφύλλη υπάρχουν δύο μόρια, η φαιοφυτίνη α και η φαιοφυτίνη β. Δεν υπάρχουν νομοθετικά όρια ως προς την παρουσία τους στα τρόφιμα. Εικόνα 2: Δομή της φαιοφυτίνης α [25] Εικόνα 3: Δομή της φαιοφυτίνης β [26] 40

Πυροφαιοφυτίνες Οι πυροφαιοφυτίνες είναι τα τελικά προϊόντα φυσικής διάσπασης των χλωροφυλλών, που προέρχονται από τις αντίστοιχες φαιοφυτίνες. Προκύπτουν μετά από θέρμανση του ελαιόλαδου. Βρίσκονται σε υψηλή συγκέντρωση στα ραφιναρισμένα και τα εξευγενισμένα έλαια, γιατί η παραγωγή τους απαιτεί θέρμανση του ελαίου. Για αυτόν τον λόγο χρησιμοποιείται ως δείκτης φρεσκότητας του ελαίου. Στα νοθευμένα ελαιόλαδα συχνά προστίθενται συνθετική χλωροφύλλη, για αυτό χρησιμοποιείται ως δείκτης ο λόγος μεταξύ της φαιοφυτίνης α και της πυροφαιοφυτίνης α. Γενικά, η συγκέντρωση της πυροφαιοφυτίνης αυξάνεται με το χρόνο, με τις συνθήκες αποθήκευσης να παίζουν σημαντικό ρόλο. Στην Ευρώπη και τις Η.Π.Α. δεν έχει θεσπιστεί κάποιο νομοθετικό όριο για την συγκέντρωση της πυροφαιοφυτίνης στο ελαιόλαδο, σε αντίθεση με την Αυστραλία όπου το όριο είναι 17% (για το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο) [24,27,28]. β- καροτένιο Το β-καροτένιο είναι μία χρωστική με έντονο πορτοκαλί χρώμα που περιέχεται στο ελαιόλαδο. Έχει αντιοξειδωτική δράση είτε δεσμεύοντας το ατμοσφαιρικό ή διαλυμένο οξυγόνο ή τις ελεύθερες ρίζες που μπορεί να προκαλέσουν οξείδωση του ελαίου. Ακόμα, έχει μελετηθεί η δράση του ενάντια σε διάφορες μορφές καρκίνου, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα και ο καρκίνος του μαστού [29-31]. Δεν υπάρχει κάποιο νομοθετικό όριο για την παρουσία του στο ελαιόλαδο. Εικόνα 4: Δομή β-καροτενίου [32] 41

Λουτεΐνη Η λουτεΐνη είναι η δεύτερη σημαντικότερη ένωση στην κατηγορία των καροτενοειδών που απαντάται στο ελαιόλαδο και ευθύνεται για το κιτρινωπό χρώμα ορισμένων ελαιόλαδων. Όπως και το β-καροτένιο, έτσι και η λουτεΐνη έχει αντιοξειδωτική δράση, εμποδίζοντας την αυτοοξείδωση του ελαιόλαδου ή την φωτοξείδωση του [31,33]. Σε πρόσφατες εργασίες, μελετήθηκε η δράση της στην ίριδα του οφθαλμού και η δυνητική δράση της στον εγκέφαλο και το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, επηρεάζοντας την γνωστική λειτουργία [34,35,36] Εικόνα 5: Δομή της λουτεΐνης [37] Τοκοφερόλες (Βιταμίνη Ε) στο ελαιόλαδο Οι τοκοφερόλες είναι ενώσεις που ανήκουν στο σύμπλεγμα της Βιταμίνης Ε. Υπάρχουν τέσσερις διαφορετικές μορφές α-, β-, γ- και δ-. Από αυτές σημαντικότερη και πιο συχνά απαντώμενη στο παρθένο ελαιόλαδο, σε ποσοστό μεγαλύτερο του 90%, είναι η τοκοφερόλη α [38,39]. Σε αρκετά μικρότερες συγκεντρώσεις έχουν βρεθεί η τοκοφερόλη β και η τοκοφερόλη γ. Για την α-τοκοφερόλη έχει θεσπιστεί το όριο των 200 mg/kg στις Η.Π.Α. για συγκεκριμένους τύπους ελαιόλαδου, που έχει γίνει προσθήκη α-τοκοφερόλης στο τελικό προϊόν (κυρίως λόγω απώλειας της κατά την διαδικασία εξευγενισμού). 42

Εικόνα 6: Χημικές δομές των τοκοφερολών ανάλογα με τους υποκαταστάτες R1, R2 [40] Σκουαλένιο Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο 1.3.4, το σκουαλένιο είναι ο κύριος υδρογονάθρακας που περιέχεται στο ελαιόλαδο. Πρόκειται για μία ένωση με μακριά ανθρακική αλυσίδα που ανήκει στα τριτερπένια. Είναι μια ένωση υψηλής βιολογικής σημασίας, καθώς συμμετέχει στην σύνθεση των περισσότερων στερολών τόσο σε ζωικούς όσο και φυτικούς οργανισμούς [6,7]. Χρησιμοποιείται ευρέως από βιομηχανίες καλλυντικών παγκοσμίως καθώς έχει πολλαπλά οφέλη για το δέρμα [41]. Δεν έχει θεσπιστεί κάποιο όριο για την παρουσία του στο ελαιόλαδο. Εικόνα 7: Δομή του σκουαλενίου [42] 43

44

2. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Μέθοδοι για τον προσδιορισμό χρωστικών και αντιοξειδωτικών στο ελαιόλαδο Στον Πίνακα 2 παρουσιάζεται ο βιβλιογραφικός πίνακας με τις απαιτούμενες πληροφορίες κάθε μεθόδου, σύμφωνα με την βιβλιογραφία. Οι μέθοδοι προσδιορισμού αυτών των ενώσεων χρησιμοποιούν κατά κόρον την τεχνική της υγρoχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (HPLC-DAD). Στην βιβλιογραφία υπάρχουν αναφορές για ταυτόχρονο προσδιορισμό ορισμένων ενώσεων που αναφέραμε ή για μεμονωμένο προσδιορισμός τους αλλά όχι για όλες μαζί. 45

Πίνακας 2: Προσδιορισμός των αναφερθέντων ουσιών σύμφωνα με την βιβλιογραφία Χημική Ένωση Προκατεργασία Δείγματος Τεχνική Εύρη Συγκεντρώσεων (mg/kg)/ Αριθμός δειγμάτων Βιβλιογραφία Λουτεΐνη, χλωροφύλλη A, φαιοφυτίνη A, β-καροτένιο 0,3 g δείγματος Προκατεργασία: SPE Si 300 mg Εκλουστικό: 10 ml εξάνιο/διαίθυλ αιθέρας 87:13 Δεύτερη έκλουση : 10 ml ακετόνη. Εξάτμιση και ανασύσταση με 700 μl ακετόνη το πρώτο κλάσμα και με 1 ml ακετόνη το δεύτερο. HPLC-DAD Στήλη:18-DB Supelco 3m, 150 mm x4,6 mm Κινητή Φάση : A: ακετόνη: μεθανόλη 60:40 B: μεθανόλη Μήκος κύματος ανιχνευτή: 410 nm Λουτεΐνη: 1,01-8,55 Χλωροφύλλη: 0,20-1,95 Φαιοφυτίνη: 4,51-21,36 β-καροτένιο: 1,03-3,30 Αριθμός δειγμάτων: 17 [43] HPLC-DAD α-, β-, γ-, τοκοφερόλη 1,5 g δείγματος διαλύθηκαν σε 10 ml 0,5% 2-προπανόλης σε εξάνιο Στήλη: Si60 (250 mm x 4,6 mm i.d., 5 mm Particle size, Merck, Germany) Κινητή φάση: 0,5% 2-προπανόλη σε εξάνιο α-τοκοφερόλη: 82-502 β-τοκοφερόλη: ND-5 γ-τοκοφερόλη: ND-29 Αριθμός δειγμάτων: 29 [44] Μήκος κύματος ανιχνευτή: 295 nm 46

HPLC- UV α-, β-, γ-, δ- τοκοφερόλη 1 g δείγματος διαλύεται σε 25 ml εξανίου και ενίεται στο όργανο Στήλη: Supelco NH2 NP (25 cm 9 4,6 mm, i.d. 5 μm) Κινητή φάση A: εξάνιο/οξικός αιθυλεστέρας (70:30 v/v) Μήκος κύματος ανιχνευτή: 295 nm & 340 nm Δεν αναφέρονται όρια ή εύρη Δεν αναφέρεται αριθμός δειγμάτων [45] Χρόνος Ανάλυσης: 7 min HPLC-DAD πυροφαιοφυτίνη 0,6 g δείγματος, διαλύση σε εξάνιο. Προκατεργασία: SPE, έκπλυση με 2 x 5 ml πετρελαϊκού - διαιθυλαιθέρας (90:10) υπό ελαφρό κενό. Εκλουστικό: 2 x 5 ml ακετόνης Το διάλυμα διηθήθηκε, και εξατμίστηκε μέχρι ξηρού Το υπόλειμμα διαλύθηκε σε 200 μl ακετόνης Στήλη: Phenomenex Luna 5 μ silica column (250 x 4,60 mm), Κινητή φάση: νερό :μεθανόλη :ακετόνη (4:36:60) Ισοκρατικά Μήκος κύματος ανιχνευτή: 410 nm Δεν αναφέρονται όρια ή εύρη συγκεντρώσεων Δεν αναφέρεται αριθμός δειγμάτων [45] 47

HPLC-UV α-τοκοφερόλη 2 g δείγματος διαλύονται σε 25 ml εξάνιο, ακολουθεί διήθηση και ένεση Στήλη: Phenomenex Luna silica column (250 x 4,60 mm i.d. 5 μm) Κινητή φάση A: εξάνιο: 2- Δεν αναφέρονται όρια ή εύρη συγκεντρώσεων Δεν αναφέρεται αριθμός [46] προπανόλη 99:1 ισοκρατικά δειγμάτων Μήκος κύματος ανιχνευτή: 292 nm HPLC-DAD Στήλη: Symmetry C18 (150mm 3,9 mm, i.d. 5μm, με προστήλη_bondapak C18 α-τοκοφερόλη: 28 ng/ml α-, β-, γ-, δ- τοκοφερόλη 0,04-0,12 g δείγματος διαλύονται σε 1 ml 2- προπανόλη, αναδεύονται και (Waters, Millford, MA, USA) Κινητή φάση A: Ακετονιτρίλιο 50% Κινητή φάση B: μεθανόλη 50% β-τοκοφερόλη: 8 ng/ml γ-τοκοφερόλη: 8 ng/ml [47] ακολουθεί ένεση στο όργανο Μήκος κύματος ανιχνευτή: 295 nm & 325 nm Αριθμός δειγμάτων: τουλάχιστον 3 48

HPLC-DAD Χλωροφύλλη, φαιοφυτίνη α Ποσότητα δέιγματος 8% w/v διαλύεται σε εξάνιο, ακολουθεί διήθηση από φίλτρο 0.45 μm, Στήλη: 250 4 mm i.d. LiChrospher-100 Si, 5 μm, column (Analyzentechnik, Mainz, Germany) Κινητή φάση A: Εξάνιο/2- προπανόλη (98:2, vol/vol) B: 2-προπανόλη Φαιοφυτίνη α: 6,7-33,8 Αριθμός δειγμάτων: 40 [48] και ένεση στο όργανο Βαθμιδωτή έκλουση: 0% B για 10 λεπτά, 0 5% B για 4 λεπτά, 5% B για 6 λεπτά, 5 0% B για 4 λεπτά, 0% B για 6 λεπτά Μήκος κύματος ανιχνευτή: 410 nm Χλωροφύλλη φαιοφυτίνη α πυροφαιοφυτίνη 300 mg δείγματος σε 1 ml επτάνιο προκατεργασία: SPE Silica 60. Έκπλυση 2 x 1 ml πετρελαϊκού αιθέρα, 2 x 5 ml πετρελαϊκού/διαιθυλαιθερα 9/1. Ο αναλύτης παραλαμβάνεται με 2 x 5 ml ακετόνης, το δείγμα εξατμίζεται σε περιστροφικό συμπυκνωτή και ενίεται στο όργανο HPLC-DAD Στήλη: 150 x 4,60 mm, 5 micron filling Gemini RP C18, 5 μm, 110 A Κινητή Φάση: νερό:μεθανόλη:ακετόνη 1:9:15 ισκορατικά Μήκος κύματος ανιχνευτή: 410 nm Χρόνος Ανάλυσης: 30 min Χλωροφύλλη% χλωροφύλλη: 0-2,09 Φαιοφυτίνη α% σε %χλωροφύλλη: 70,79-89,53 Φαιοφυτίνη α % σε χλωροφύλλη: 10,47-15,00 Πυροφαιοφυτίνη% σε χλωροφύλλη : 0-17,44 Αριθμός δειγμάτων: 15 [24] 49

HPLC-DAD Στήλη: Cosmosil 5PYE (Nacalai, Kyoto, Japan) RP column (4,6 ID x 250 mm) YMC C30 (YMC, Kyoto, Japan) column (4,6 ID x 250 mm) (καροτενοειδή) Τοκοφερόλες β-καροτένιο λουτεΐνη, σκουαλένιο 1 g δείγματος διαλύεται σε 10 ml μεθανόλης/χλωροφόρμιο 1:1 και διηθείτε από φίλτρα 0,20 μm και στην συνέχεια ενίεται στο όργανο Κινητή φάση A: μεθανόλη/νερό 95:5 (v/v) Για τα καροτενοειδή: Κινητή φάση A: μεθανόλη/ακετόνη 60:40 (v/v), B ακετόνη/νερό 60:40 v/v α-τοκοφερόλη: 159-266 β-καροτένιο: 2,0-4,3 λουτεΐνη: 3,3-4,3 σκουαλένιο: 484-846 [49] Μήκος κύματος ανιχνευτή: 292 nm Αριθμός δειγμάτων: 33 Για τα καροτενοειδή 450 nm Χρόνος Ανάλυσης: 30 min 50

HPLC-DAD Στήλη: 250 x 4 mm i.d. LiChrospher-Si 60, 5 μm, (Analyzentechnik, Mainz, Germany) β-καροτένιο 0,05-5,0 (ng/ml) Κινητή φάση A: Εξάνιο/2- προπανόλη α-τοκοφερόλη 0,5-25 (ng/ml) (99:1, v/v) Καροτενοειδή χλωροφύλλες τοκοφερόλες Διάλυση του δείγματος σε εξάνιο/2 προπανόλη 99:1, διήθηση και ένεση στο όργανο Αποφεύγεται η ηλιακή Κινητή φάση B: 2-προπανόλη Βαθμιδωτή Έκλουση: 0% B για 10 λεπτά, 0-5% B για 4 λεπτά, 5% B για 6 λεπτά, 5-0% B για 4 λεπτά, and 0% B για 6 λεπτά Μήκος κύματος ανιχνευτή: χλωροφύλλη α 0,6-10(ng/ml) χλωροφύλλη β 0,6-10(ng/ml) [50] ακτινοβολία 294 nm τοκοφερόλες, 410 nm φαιοφυτίνη b, 430 nm φαιοφυτίνη b και χλωροφύλλη a, 453 nm λουτεΐνη και χλωροφύλλη b φαιοφυτίνη α 0,6-10(ng/ml) Χρόνος Ανάλυσης: 30 min φαιοφυτίνη β 0,6-10(ng/ml) Αριθμός δειγμάτων: 38 51

HPLC-PDA Στήλη: LiChroCART column (125 x 4,0mm i.d.; 4m) Κινητή φάση: 100% ACN Σκουαλένιο 0,1 g ελαίου σε 3 ml ΚΟΗ (600 g/l). Προστέθηκαν 2 ml αιθανόλης και 5 ml αιθανολικού διαλύματος πυρογαλλόλης (60 g/l) και ακολουθεί ανακίνηση. Η αλκαλική σαπωνοποίηση διεξήχθη σε υδατόλουτρο στους 75 C για 30 λεπτά. Προστέθηκαν 15 ml διαλύματος NaCl (10 g/l) και το μίγμα εκχυλίστηκε δύο φορές (5 λεπτά) με 15 ml n-εξανίου / οξικού αιθυλεστέρα (9:1, v/v). Η σαπωνοποίηση πραγματοποιήθηκε τρεις φορές και τα μη σαπωνοποιημένα εκχυλίσματα συνελέγησαν μαζί. Μετά την εξάτμιση του διαλύτη, έγινε ανασύσταση σε ακετόνη. Μήκος κύματος ανιχνευτή: 208 nm Σκουαλένιο: 3619,5-9384,5 Αριθμός δειγμάτων: 21 [51] 52

HPLC-DAD Στήλη: 250 x 4 mm i.d. LiChrospher-Si 60, 5 μm, (Analyzentechnik, Mainz, Germany) Κινητή φάση A: Εξάνιο/2- προπανόλη (99:1, v/v) Κινητή φάση B: 2-προπανόλη α-τοκοφερόλη Διάλυση του δείγματος σε εξάνιο/2-προπανόλη 99:1, διήθηση και ένεση στο όργανο Αποφεύγεται η ηλιακή ακτινοβολία 0% B για 10 λεπτά, 0-5% B για 4 λεπτά, 5% B για 6 λεπτά, 5-0% B για 4 λεπτά, and 0% B για 6 λεπτά Ταχύτητα ροής: 1,2 ml/min Εισαγόμενος όγκος:20 μl α-τοκοφερόλη: 198,9-505,9 αριθμός δειγμάτων: 21 [52] Μήκος κύματος ανιχνευτή: 294 nm 53

Λουτεΐνη, τοκοφερόλη 0,1 g δείγματος σε 0,25 ml L- ασκορβικού νατρίου (0,2 g/ml), 2 ml αιθανολικού διαλύματος ΚΟΗ (2 Μ) και ανακινήθηκε σε vortex. Στη συνέχεια ο σωλήνας εισάγεται σε υδατόλουτρο και θερμαίνεται στους 60 C για 1 ώρα. Μετά την ψύξη, προστίθενται 2 ml νερού και 2 ml εξανίου. Το μίγμα ανακινήθηκε έντονα για 1 λεπτό και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 1600 σ.α.λ. και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα (x3). Τέλος, τα εκχυλίσματα εξανίου πλύθηκαν με νερό μέχρις ότου λάβει χώρα εξουδετέρωση και έπειτα ξηράνθηκε με άνυδρο θειικό νάτριο. 3 ml των εκχυλισμάτων τοποθετήθηκαν σε ένα νέο σωλήνα και ο διαλύτης εξατμίστηκε υπό ρεύμα αζώτου. Το υπόλειμμα επαναδιαλύθηκε σε 1,0 ml ακετονιτριλίου, διηθήθηκε από φίλτρο 0,22 χιλ. PTFE, και έγινε ένεση στο όργανο LC-MS HPLC-APCI-MS Στήλη: Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 5 mm, 4,6 mm - 150 mm A: H 2O (0.1% Formic acid) B: ACN Γ: MeOH Gradient elusion: 0-8 min: Α:2% B:95% Γ:3%. 8-10 min: Α:2% Β:95% Γ:3% έως Α:2% Β:0% Γ:98% 10-28 min: Α:2% Β:0% Γ:98%, 28-30 min: Α:2% Β:0% Γ:98% έως Α:2% Β:95% Γ:3%, 30-35 min: Α:2% Β:95% Γ:3%. Λουτεΐνη: 2,3-3,6 α-τοκοφερόλη: 246-359 (β+γ)-τοκοφερόλη: 6,54-17,6 Αριθμός δειγμάτων: n=5 [53] 54

Συμπεράσματα από την βιβλιογραφική ανασκόπηση Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, για τον προσδιορισμό των τοκοφερολών, των χρωστικών και του σκουαλενίου, χρησιμοποιείται κατά κόρον η τεχνική της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοση με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων. Όσον αφορά τον προσδιορισμό των τοκοφερολών, χρησιμοποιείται τόσο χρωματογραφία κανονική φάσης (στατική φάση πολική) ([44-46,50,52]) με κινητή φάση μίγμα εξανίου και 2-προπανόλης, όσο και χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (στατική φάση C18, C30) με κινητή φάση μίγμα μεθανόλης και ακετονιτριλίου [47,49,53]. Αναφορικά με τις χλωροφύλλες, και εδώ πραγματοποιείται ο διαχωρισμός σε χρωματογραφία αντίστροφης φάσης με κινητή φάση μίγμα εξανίου και 2- προπανόλης ([45,48,50]) αλλά και με χρωματογραφία κανονικής φάσης με κινητή φάση μίγμα νερού, μεθανόλης και ακετόνης [24]. Το β-καροτένιο επίσης προσδιορίζεται και με τους δύο τύπους χρωματογραφίας. Στην χρωματογραφία κανονικής φάσης χρησιμοποιείται ως κινητή φάση μίγμα εξανίου και 2-προπανόλης, ενώ στην αντίστροφης φάσης χρησιμοποιείται μίγμα οξινισμένου νερού, ακετονιτριλίου και μεθανόλης, ή μίγμα μεθανόλης και ακετόνης [50,53]. Η λουτεΐνη και το σκουαλένιο, προσδιορίζονται μόνο με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης στην βιβλιογραφία χρησιμοποιώντας ως κινητή φάση μίγμα μεθανόλης-ακετόνης και ακετονιτρίλιο [49,51,53]. Επομένως, επιλέχθηκε χρωαμτογραφία αντίστροφης φάσης με κινητή φάση μεθανόλη και ακετονιτρίλιο σε αναλογία 50-50%, ισοκρατικά. Στην πλειονότητα των βιβλιογραφικών αναφορών η θερμοκρασία της στήλης δεν κρίθηκε ως κρίσιμη παράμετρος, έτσι οι αναλύσεις έλαβαν χώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 55

Σκοπός της Εργασίας Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, οι χρωστικές ενώσεις που απαντώνται στο ελαιόλαδο μπορούν να δώσουν χρήσιμες πληροφορίες για την παλαιότητα και την ποιότητα του, ενώ οι τοκοφερόλες (οι οποίες δρουν ως αντιοξειδωτικά) προστατεύουν το ελαιόλαδο από την οξείδωση, την φωτοξείδωση αλλα και την αυτοξείδωση. Μετά την βιβλιογραφική ανασκόπηση, παρατηρήθηκε ότι δεν έχει αναπτυχθεί καμία μέθοδος για ταυτόχρονο προσδιορισμό όλων των προαναφερθέντων χημικών ενώσεων στο ελαιόλαδο. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και επικύρωση μιας μεθόδου προσδιορισμού των χλωροφυλλών, των φαιοφυτινών, των πυροφαιοφυτινών, των καροτενοειδών και των τοκοφερολών με την τεχνική της υγρoχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων, θα γίνει στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και θα σχολιαστούν τα όποια συμπεράσματα προκύψουν. Στο πλαίσιο του ερευνητικού προγράμματος με τίτλο «ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗ ΕΡΕΥΝΑ ΠΡΟΩΘΗΣΗΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΚΑΙ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΕΛΙΑΣ ΒΟΡΕΙΟΥ ΑΙΓΑΙΟΥ ΜΕΣΩ ΑΝΑΔΕΙΞΗΣ ΤΟΥ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΙΔΙΑΙΤΕΡΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ» αναλύθηκαν δείγματα εξαιρετικά παρθένου ελαιόλαδου από πέντε νησιά του Βορείου Αιγαίου, την Λέσβο, την Χίο, τους Φούρνους, την Ικαρία και την Σάμο. Όλα τα δείγματα παράχθηκαν από τον Νοέμβριο του 2017 έως τον Φεβρουάριο του 2018. 56

3. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 3.1 Υγροχρωματογραφικό σύστημα με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων Στα πλαίσια της συγκεκριμένης εργασίας- μελέτης χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (Diode Array Detector, DAD). Παρακάτω αναφέρονται οι βασικές αρχές της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης. Με τον όρο «χρωματογραφία» αναφερόμαστε σε μια μεγάλη ποικιλία μεθόδων ανάλυσης, οι οποίες διευκολύνουν τον χημικό αναλυτή στο να διαχωρίσει ουσίες με παρόμοιες χημικές ιδιότητες από σύνθετα μίγματα. Ένα μεγάλο ποσοστό των διαχωρισμών αυτών δεν είναι δυνατό να πραγματοποιηθούν χρησιμοποιώντας άλλη μέθοδο ανάλυσης. Σε όλους τους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς το δείγμα κινείται σε μία κινητή φάση (mobile phase), η οποία μπορεί να είναι ένα αέριο, ένα υγρό ή ένα υπερκρίσιμο ρευστό. Στην συνέχεια η κινητή φάση εξαναγκάζεται να διέλθει μέσα από μία στατική φάση (stationary phase), η οποία είναι ακίνητη σε μία στήλη ή σε μία στερεή επιφάνεια. Στην υγροχρωματογραφία η κινητή φάση είναι υγρή. Οι δύο φάσεις επιλέγονται με τέτοιο τρόπο, ώστε τα συστατικά του δείγματος κατανέμονται μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης σε διαφορετικό βαθμό. Τα συστατικά τα οποία κατακρατούνται ισχυρότερα από τη στατική φάση κινούνται αργά κατά τη ροή της κινητής φάσης. Αντίθετα, τα συστατικά τα οποία κατακρατούνται ασθενέστερα από τη στατική φάση, κινούνται ταχύτερα. Ως αποτέλεσμα αυτών των διαφορών στην ευκινησία, τα συστατικά του δείγματος διαχωρίζονται καταλαμβάνοντας το καθένα ξεχωριστές ζώνες, όπου στην συνέχεια τα συστατικά αυτά μπορούν να προσδιορισθούν ποιοτικά ή/και ποσοτικά [54]. 57

Χρωματογραφία Κατανομής Στη χρωματογραφία κατανομής η στατική φάση είναι ένα δεύτερο υγρό που δεν αναμειγνύεται με την υγρή κινητή φάση. Στους πρώτους τύπους χρωματογραφίας κατανομής χρησιμοποιούνταν στήλες υγρού-υγρού, οι οποίες στα σύγχρονα συστήματα LC, αντικαταστάθηκαν με στήλες υγρήςσυνδεδεμένης-φάσης (liquid-bonded-phase). Στη χρωματογραφία κατανομής υγρού-υγρού, η υγρή στατική φάση κατακρατείται στην επιφάνεια του υλικού πλήρωσης με φυσική προσρόφηση, ενώ στη χρωματογραφία συνδεδεμένης φάσης, η στατική φάση δεσμεύεται με χημικό δεσμό στην επιφάνεια του υλικού στήριξης. Τα υλικά στήριξης για την πλειονότητα των υλικών πλήρωσης στη χρωματογραφία κατανομής συνδεδεμένης φάσης παρασκευάζονται από άκαμπτη πυριτία ή σύνθεση που βασίζεται σε πυριτία. Αυτά τα στερεά σχηματίζονται ως ομοιόμορφα, πορώδη και μηχανικώς σκληρά σωματίδια με συνήθη διάμετρο 3-5 μm. Ανάλογα με τη σχετική πολικότητα της κινητής και της στατικής φάσης διακρίνονται δύο τύποι χρωματογραφίας κατανομής: i. Χρωματογραφία κανονικής φάσης. Η στατική φάση είναι πολικότερη από την κινητή, η οποία αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες, όπως εξάνιο, τετραχλωράνθρακας κ.ά. ii. Χρωματογραφία αντίστροφης φάσης. Η κινητή φάση είναι κάποιος πολικός διαλύτης (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, ύδωρ κ.ά.), ενώ η στατική φάση είναι μη πολική (συνήθως ένας υδρογονάνθρακας C8 ή C18). Στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης το πολικότερο συστατικό εμφανίζεται πρώτο. Αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του χρόνου έκλουσης. Το αντίθετο συμβαίνει στη χρωματογραφία κανονικής φάσης [54]. 58

Χρωματογραφία αντίστροφης φάσης Περιλαμβάνει μια πολική (συνήθως υδατική) ή μετρίως πολική μήτρα του δείγματος (κινητή φάση) και μία μη πολική στατική φάση. Ο αναλύτης που μας ενδιαφέρει είναι συνήθως μετρίως ή μη πολικός. Το πληρωτικό υλικό που χρησιμοποιείται στην χρωματογραφία αντίστροφης φάσης είναι συνήθως χημικώς τροποποιημένη silica με υδρόφοβες ομάδες όπως αλκυλομάδες και αρυλομάδες. Εδώ, οι υδρόφιλες ομάδες σιλανόλης στην επιφάνεια της ακατέργαστης σίλικας (συνήθως 60Α μέγεθος πόρων, των σωματιδίων 40 μm μέγεθος) έχουν υποστεί χημική τροποποίηση με υδρόφοβες λειτουργικές ομάδες αλκυλίου ή αρυλίου από αντίδραση με τα αντίστοιχα σιλάνια. Εικόνα 8: Χημική τροποποίηση υδρόφιλων ομάδων σιλανόλης με τις υδρόφοβες ομάδες Η διατήρηση των οργανικών αναλυτών από τις πολικές ενώσεις (π.χ. νερό) επάνω σε αυτά τα υλικά προσρόφησης οφείλεται κατά κύριο λόγο στις ελκτικές δυνάμεις μεταξύ των δεσμών άνθρακα-υδρογόνου στον αναλύτη και στις λειτουργικές ομάδες στην επιφάνεια της πυριτίας. Αυτές οι μη πολικές-μη πολικές ελκτικές δυνάμεις συνήθως ονομάζονται δυνάμεις van der Waals, ή δυνάμεις διασποράς. Για να εκλουστεί μία προσροφημένη ένωση από έναν αντίστροφης φάσης στήλη, χρησιμοποιούμε ένα μη πολικό διαλύτη ώστε να διαταραχτούν οι δυνάμεις που δεσμεύουν την ένωση με το υλικό πλήρωσης. Όλες οι σιλικοποιημένες φάσεις έχουν κάποιο ποσοστό υπολειμματικών σιλανολών που δεν αντέδρασε και δρουν σαν δευτερογενείς θέσεις αλληλεπίδρασης. Αυτές οι δευτερεύουσες αλληλεπιδράσεις μπορεί να είναι χρήσιμες για την εκχύλιση ή κατακράτηση των αναλυτών υψηλής πολικότητας ή των προσμείξεων, αλλά μπορεί επίσης να δεσμεύσει μη αντιστρεπτά αναλύτες ενδιαφέροντος. 59

Οι στατικές φάσεις αντίστροφης φάσης και τα μέσα μη πολικής προσρόφησης συνήθως ενεργοποιούνται με έναν οργανικό διαλύτη διαλυτό στο νερό, όπως μεθανόλη, κι ακολούθως με νερό ή με ένα υδατικό ρυθμιστικό διάλυμα. Η μεθανόλη διαβρέχει την επιφάνεια του υλικού προσρόφησης και διεισδύει στις αλκυλο-συνδεδεμένες ομάδες επιτρέποντας στο νερό να βρέξει την επιφάνεια της σίλικας ικανοποιητικά. Μερικές φορές χρησιμοποιείται ένας διαλύτης προκατεργασίας πριν το στάδιο προσθήκης της μεθανόλης. Αυτός ο διαλύτης είναι συνήθως ίδιος με το διαλύτη έκλουσης και χρησιμοποιείται για να απομακρύνει τυχόν προσμίξεις από τη στήλη που θα μπορούσαν να παρεμποδίσουν την ανάλυση και μπορεί να είναι διαλυτές μόνο σε έναν ισχυρό διαλύτη έκλουσης. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται σε αυτές διαδικασίες έχουν ένα πολύ μεγάλο εύρος ph. Τα υλικά πλήρωσης με βάση τη σίλικα, όπως αυτά που χρησιμοποιούνται στις στήλες της HPLC συνήθως έχουν ένα σταθερό εύρος ph από 2 έως 7,5. Σε επίπεδα ph πάνω και κάτω από αυτά τα όρια, η δεσμευμένη φάση μπορεί να υδρολυθεί και να απομακρυνθεί από την επιφάνεια της σίλικας, ή η ίδια η σίλικα μπορεί να διαλυτοποιηθεί. Αν η ένωση που μας ενδιαφέρει είναι όξινη ή βασική θα πρέπει, στις περισσότερες περιπτώσεις, να χρησιμοποιήσουμε ένα ph στο οποίο η ένωση να μην είναι φορτισμένη [54]. Οργανολογία υγροχρωματογραφίας Ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) αποτελείται από τα εξής: 60

α)φιάλες διαλυτών, β) απαερωτές, γ) αντλία, δ) βαλβίδα έγχυσης, ε) χρωματογραφική στήλη, στ) ανιχνευτή, ζ) καταγραφέα- σύστημα επεξεργασίας δεδομένων και η) δοχείο αποβλήτων. Εικόνα 9: Σύστημα υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης Παρακάτω παρουσιάζονται σύντομα οι λειτουργίες καθενός από τα προαναφερθέντα τμήματα του χρωματογράφου: Οι φιάλες διαλυτών περιέχουν τους διαλύτες που χρησιμοποιούνται για τη μεταφορά του δείγματος μέσω του συστήματος της υγροχρωματογραφίας. Οι διαλύτες αρχικά πρέπει να φιλτράρονται για να απομακρύνονται σωματίδια που θα μπορούσαν δυνητικά να προκαλέσουν βλάβη στο σύστημα, όπως έμφραξη της στήλης. Οι αντλίες ωθούν τους διαλύτες μέσα στο χρωματογραφικό σύστημα μετά την απαέρωσή τους. Ακολουθεί η βαλβίδα έγχυσης η οποία εισάγει το δείγμα μέσω βρόγχου. Επειδή το δείγμα συχνά περιέχει σωματίδια, είναι σημαντικό να χρησιμοποιείται φίλτρο για την πρόληψη ζημιάς της βαλβίδας και της στήλης. Μετά την έγχυση του δείγματος, η αναλυτική στήλη το διαχωρίζει στα διάφορα συστατικά του. Αυτό βασίζεται στην διαφορική έλξη των συστατικών του δείγματος με το διαλύτη και το υλικό εντός της στήλης. Μια προστήλη συχνά προηγείται της αναλυτικής στήλης για την απομάκρυνση όχι μόνο αιωρούμενων σωματιδίων και προσμίξεων από το διαλύτη, αλλά και συστατικών του δείγματος που συνδέονται με τη στατική φάση κατά μη 61

αντιστρεπτό τρόπο. Μετά την αναλυτική στήλη, τα διαχωρισμένα συστατικά διέρχονται στον ανιχνευτή, πριν περάσουν στη δεξαμενή αποβλήτων. Κοινοί τύποι ανιχνευτών είναι: απορρόφησης, φθορισμού ή φασματομετρίας μαζών. Μερικές φορές χρησιμοποιείται ένας συνδυασμός διαφορετικών τύπων ανιχνευτών. Εξελιγμένα συστήματα συλλογής και ανάλυσης δεδομένων είναι διαθέσιμα για όλους τους τύπους ανιχνευτών. Τέλος, συστήματα απαέρωσης διαλύτη και ρύθμισης οπισθοπίεσης συχνα εγκαθίστανται στο σύστημα της υγροχρωματογραφίας. Η απαέρωση του διαλύτη εμποδίζει το σχηματισμό φυσαλίδων όταν τα συστατικά της κινητής φάσης αναμιγνύονται στο σύστημα και η ρύθμιση της οπισθοπίεσης περιορίσει την πτώση της πίεσης κατά μήκος της διαδρομής που θα μπορούσε να συντελέσει σε περαιτέρω σχηματισμό φυσαλίδων. Σχετικά με το σύστημα παροχής κινητής φάσης και το σύστημα έκλουσης διακρίνονται δύο κατηγορίες: Ισοκρατική έκλουση (Isocratic elusion): Για τον διαχωρισμό χρησιμοποιείται διαλύτης σταθερής σύστασης. Βαθμιδωτή έκλουση ( Gradient elusion): Ο λόγος των διαλυτών μεταβάλλεται κατά τον διαχωρισμό με προγραμματισμένο τρόπο (συνεχώς ή με σειρά βημάτων) [54]. Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων Ο ανιχνευτής που ήταν εξοπλισμένο το χρωματογραφικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία, ήταν ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων (diode array detector- DAD). Σε αυτό το είδος ανιχνευτή υπάρχουν δύο λυχνίες, μία που εκπέμπει στο ορατό φάσμα και μία που εκπέμπει στο υπεριώδες. Καθώς το έκλουσμα βγαίνει από την χρωματογραφική στήλη εισέρχεται στην κυψελίδα όπου διέρχεται και το φως που εκπέμπεται από τις δύο λυχνίες και στην συνέχεια, αφού η ακτινοβολία διέλθει από την οπτική σχισμή, καταλήγει σε ένα φράγμα περίθλασης όπου αναλύεται στα διάφορα μήκη κύματος. Τέλος, η ακτινοβολία εισέρχεται στις φωτοδιόδους όπου γίνεται η καταγραφή του σήματος απορρόφησης [55]. Το 62

πλεονέκτημα του DAD είναι η καταγραφή του φάσματος καθ όλη την διάρκεια του χρωματογραφήματος, για ένα εύρος μηκών κύματος. Εικόνα 10: Σχηματική αναπαράσταση ενός ανιχνευτή DAD [55] 63

Για τις ανάγκες της συγκεκριμένης εργασίας χρησιμοποιήθηκε ο υγροχρωματογράφος 1200 Series της εταιρείας Agilent εξοπλισμένος με τα παρακάτω περιφερειακά εξαρτήματα: Αυτοματοποιημένο σύστημα εισαγωγής δείγματος G1329A Θερμοστάτης για το σύστημα εισαγωγής δείγματος G1330B Αντλία υγροχρωματογραφίας Bin Pump G 1312A με δυνατότητα βαθμίδωσης δύο διαλυτών. Απαερωτής διαλυτών G1379B Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων DAD G1315D Φούρνος στήλης G1316A Προσωπικός υπολογιστής Intel Pentium 4 με λογισμικό LC ChemStation Software για τον προγραμματισμό και την λειτουργία του συστήματος, καθώς και για την επεξεργασία των χρωματογραφημάτων. Στο παραπάνω χρωματογραφικό σύστημα χρησιμοποιήθηκε στήλη Spherisorb ODS2 C18 (Waters Corporation, USA) 4,6 mm x 250 mm, i.d. 5 μm. Εργαστηριακός εξοπλισμός Στον εργαστηριακό εξοπλισμό που χρησιμοποιήθηκε περιλαμβάνονται: Συσκευή παραγωγής υπερκάθαρου νερού ειδικής αντίστασης 18,2 ΜΩ/cm (Millipore Direct-Q UV) Διακριβωμένος αναλυτικός ζυγός πέντε δεκαδικών ψηφίων (Mettler AT 250) Συσκευή περιδίνησης τύπου Vortex (Velp Scientific) Συσκευή για εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE, Vac Elut SPS 24) Αυτόματες πιπέτες μεταβλητού όγκου για υδατικούς διαλύτες 100-1000 μl, 20-200 μl, 10-100 μl (Trasnferpette) Στηλάκια SPE Strata Silica (55 μm, 70 A) 1 g/ 6ml (Phenomenex, USA) Ογκομετρικές φιάλες 5, 10 και 50 ml 64

Ογκομετρικοί κύλινδροι των 10, 50, 100, και 200 ml Πλαστικές πιπέτες τύπου Pasteur Ποτήρια ζέσεως Eppendorf tubes των 1,5 και 2 ml Λουτρό υπερήχων Ultrasosns H-D P-SELECTA Διαλύτες και αντιδραστήρια Στην παρούσα ερευνητική εργασία χρησιμοποιήθηκαν ακετονιτρίλιο HPLC gradient grade, μεθανόλη HPLC gradient grade, διαιθυλαιθέρας analytical reagent, ακετόνη HPLC gradient grade (Fischer Chemical), ισοπροπανόλη HPLC gradient grade (Fluka Analytical, Sigma Aldrich) και υπερκάθαρο νερό (18,2 MΩ/cm). Πρότυπες ουσίες Χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα για κάθε αναλύτη: Χλωροφύλλη α (απομόνωση από σπανάκι), λουτεΐνη 99%, σκουαλένιο 98%, β-καροτένιο (συνθετικό) 97%, τοκοφερόλη α (συνθετική) 96%, τοκοφερόλη γ (συνθετική) 96%, τοκοφερόλη δ (συνθετική) 96%. Όλες οι πρότυπες ουσίες αγοράστηκαν από την εταιρία Sigma-Aldrich. Πρότυπα και ενδιάμεσα διαλύματα παρακαταθήκης Για κάθε αναλύτη παρασκευάστηκε πρότυπο διάλυμα συγκέντρωσης 1000 mg/l ζυγίζοντας 0,010 g σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml και προσθήκη του κατάλληλου διαλύτη: Διάλυμα παρακαταθήκης λουτεΐνης: 0,010 g σε 10 ml MeOH Διάλυμα παρακαταθήκης σκουαλενίου: 0,010 g σε 10 ml Et 2O Διάλυμα παρακαταθήκης β-καροτενίου: 0,010 g σε 10 ml EtOH Διαλύματα παρακαταθήκης για τις τοκοφερόλες : 0,010 g σε 10 ml EtOH Διάλυμα παρακαταθήκης χλωροφύλλης: 0,010 g σε 10 ml ακετόνης 65

Τα διαλύματα αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη στους -20 ο C. Για την λουτεΐνη, λόγω του υψηλού κόστους αγοράς της πρότυπης ουσίας, αποκτήθηκε δευτερεύουσα πρότυπη ουσία η οποία βαθμονομήθηκε με χρήση της πρώτης. Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε η δευτερεύουσα πρότυπη ουσία, εκτός από την γραμμικότητα που χρησιμοποιήθηκε το πρότυπο υψηλής καθαρότητας. Στην συνέχεια παρασκευάστηκαν ενδιάμεσα πρότυπα συγκέντρωσης από 100-500 mg/l με παραλαβή 100-500 μl από το πυκνό διάλυμα, με χρήση πιπέτας για υδατικούς διαλύτες και αραίωση σε eppendorf με 2-προπανόλη σε τελικό όγκο 1,0 ml. Τέλος, παρασκεύαστηκαν πρότυπα διαλύματα μίγματος των προαναφερθέντων ενώσεων σε διάφορες συγκεντρώσεις (1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300 mg/l) με λήψη της αντίστοιχης ποσότητας από τα ενδιάμεσα διαλύματα, με σκοπό τον εμβολιασμό τους σε μητρικό υλικό, κάτι το οποίο θα αναφερθεί σε επόμενο κεφάλαιο. 66

4. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Χαρακτηριστικά στατικής φάσης Όπως αναφέρθηκε στο υποκεφάλαιο 2.3, κατά την βιβλιογραφική ανασκόπηση παρατηρήθηκε ότι για τον προσδιορισμό αυτών των ενώσεων σε έλαια χρησιμοποιούταν ευρέως η υγροχρωματογραφία αντίστροφης φάσης (reverse phase- RP-HPLC). Για τον λόγο αυτό επιλέχθηκε μια στήλη βασισμένη σε σιλανομάδες στις οποίες είναι προσδεμένες δεκαοκτυλ- ομάδες (C18). H στήλη που χρησιμοποιήθηκε είχε διαστάσεις 250 mm x 4,6 mm, i.d. 5 μm. Βελτιστοποίηση της σύστασης της κινητής φάσης Η βελτιστοποίηση των χρωματογραφικών παραμέτρων είναι μείζονος σημασίας για την επίτευξη της μεγαλύτερης δυνατής ευαισθησίας της μεθόδου καθώς και για τον διαχωρισμό των αναλυτών. Στην υγροχρωματογραφία, η πιο καθοριστική παράμετρος είναι η σύσταση της κινητής φάσης και συνεπώς είναι η πρώτη παράμετρος που βελτιστοποιείται. Επιλογή της κατάλληλης κινητής φάσης Αρχικά η μέθοδος που αναπτύχθηκε βασίστηκε στην μέθοδο ISO 29841:2014, η οποία αναφέρεται σε προσδιορισμό μόνο των φαιοφυτινών και των πυροφαιοφυτινών σε έλαια και λίπη λαχανικών. Στην συγκεκριμένη μέθοδο χρησιμοποιείται ως κινητή φάση μίγμα υπερκάθαρου νερού, μεθανόλης και ακετόνης σε αναλογία 4:36:60, με ισοκρατική έκλουση. Ένα πρόβλημα που εντοπίστηκε και ουσιαστικά απέκλειε τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των χρωστικών, των τοκοφερολών και του σκουαλενίου ήταν το γεγονός πως η ακετόνη απορροφά σε μήκος κύματος 330 nm, ενώ οι τέσσερεις τοκοφερόλες απορροφούν σε μήκος κύματος 295 nm και το σκουαλένιο στα 210 nm [50,56]. Επομένως, ήταν επιτακτική ανάγκη τα συστατικά της κινητής φάσης να απορροφούν ακτινοβολία σε μήκος κύματος μικρότερο από αυτό που απορροφούν οι τοκοφερόλες και το σκουαλένιο. 67

Έτσι, με βάση ένα μεγάλο μέρος της αντίστοιχης βιβλιογραφίας, χρησιμοποιήθηκε ως κινητή φάση μίγμα μεθανόλης και ακετονιτριλίου σε αναλογία 50:50 με ισοκρατική έκλουση. Κατά την διάρκεια των πειραμάτων έγιναν προσπάθειες για βελτίωση των χρωματογραφικών κορυφών αλλά και μείωσης του χρόνου ανάλυσης έτσι ώστε να μην ξεπερνά τα 30 λεπτά. Στα πλαίσια αυτών των δοκιμών, δοκιμάστηκαν δύο προγράμματα βαθμιδωτής έκλουσης: Πίνακας 3: Πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης Α Χρόνος Ανάλυσης (min) MeOH (%) ACN (%) 0,0 50 50 7,00 50 50 12,00 100 0 15,00 100 0 15,10 50 50 30,00 50 50 Πίνακας 4: Πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης Β Χρόνος Ανάλυσης (min) MeOH (%) ACN (%) 0,00 50 50 7,00 50 50 12,00 0 100 15,00 0 100 15,10 50 50 30,00 50 50 68

Παρακάτω παρατίθενται τα χρωματογραφήματα Λουτεϊνη χλωροφύλλη β-καροτένιο Εικόνα 11: Χρωματογράφημα μίγματος προτύπων στα 450 nm, με το πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης του πίνακα 3. Λουτεϊνη χλωροφύλλη β-καροτένιο Εικόνα 12: Χρωματογράφημα μίγματος προτύπων στα 450 nm, με το πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης του πίνακα 4 Ως κριτήριο της απόδοσης της χρωματογραφίας, το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε, χρησιμοποιεί τον παράγοντα συμμετρίας για κάθε κορυφή. Συγκεκριμένα αναφέρεται πως κορυφές με συμμετρία 0,8-1,3 θεωρούνται αποδεκτές και η χρωματογραφία κρίνεται αξιόπιστη. Στον Πίνακα 5 παρουσιάζονται οι παράγοντες συμμετρίας για τις κορυφές και με τα δύο προγράμματα βαθμιδωτής έκλουσης. 69

Πίνακας 5: Παράγοντας Συμμετρίας Κορυφών Πρόγραμμα Βαθμιδωτής Έκλουσης Ένωση Χρόνος Ανάσχεσης (min) Συμμετρία Κορυφής 1 Λουτεΐνη 6,0 1,12 Χλωροφύλλη 10,0 1,18 β-καροτένιο 22,5 0,84 Λουτεΐνη 6,0 1,1 2 Χλωροφύλλη 10,0 0,80 β-καροτένιο 24,0 0,66 Από τον Πίνακα 5, φαίνεται πως για το πρώτο πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης, δεν πληρείται το κριτήριο συμμετρίας για την κορυφή του β- καροτενίου. Επομένως προτιμήθηκε το δεύτερο πρόγραμμα αφού από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν μειώθηκε ο χρόνος του χρωματογραφήματος και επιτεύχθηκε καλύτερος διαχωρισμός Άλλες χρωματογραφικοί παράμετροι όπως η θερμοκρασία της στήλης, η ιοντική ισχύς, η πολικότητα και το ph της κινητής φάσης δεν επηρεάζουν σημαντικά την συγκεκριμένη αναλυτική πορεία, επομένως δεν έγινε προσπάθεια βελτιστοποίησης τους. Προκατεργασία του δείγματος Όπως για την σύσταση της κινητής φάσης, έτσι και για την προκατεργασία των δειγμάτων η μέθοδος στηρίχθηκε στην μέθοδο ISO 29841:2014. Στην συγκεκριμένη μέθοδο γίνεται χρήση συσκευής εκχύλισης στερεάς φάσης όπου το δείγμα διέρχεται από μια μικρή στήλη SPE Silica, και στην συνέχεια ακολουθεί έκπλυση με διαιθυλαιθέρα και πετρελαΐκο αιθέρα σε αναλογία 1:9, και ακολούθως γίνεται έκλουση με ακετόνη προς παραλαβή των χρωστικών και των τοκοφερολών. Στην Εικόνα 13, παρουσιάζεται η πειραματική πορεία που βασίστηκε στην μέθοδο ISO 29841:2014. 70

Ζύγιση ~ 1 g δείγματος σε eppendorf Διάλυση σε κ-εξάνιο μέχρι όγκου 2 ml Διήθηση από στήλη SPE Silica 6 g/1000ml Έκπλυση με 10 ml πετρελαϊκο αιθέρα: διαιθυλαίθερα 9:1 Έκλουση των αναλυτών με 10 ml ακετόνης Εξάτμιση μέχρι ξηρού Ανασύσταση με 200 μl ακετόνης και ένεση στο όργανο Εικόνα 13: Πειραματική πορεία βασισμένη στην ISO 29841:2014 [57] 71

Αυτό που διαπιστώθηκε κατά την πειραματική πορεία είναι πως κάποιες ενώσεις (β-καροτένιο, α-τοκοφερόλη, (β+γ)-τοκοφερόλη και δ-τοκοφερόλη) απομακρύνονταν από την στήλη με το μη πολικό κλάσμα των αιθέρων (Εικόνα 14). Αυτό ήταν αναμενόμενο αφού οι τοκοφερόλες είναι διαλυτές σε μη πολικούς διαλύτες. Αυτό όμως, είχε σαν αποτέλεσμα να απαιτείται ανάλυση και των δύο κλασμάτων που προκύπτουν από την διαδικασία εκχύλισης, γεγονός που αυξάνει τον χρόνο της ανάλυσης αλλά και το κόστος αυτής. β+γ-τοκοφερόλη α-τοκοφερόλη Εικόνα 14: Χρωματογράφημα ανάλυσης του μη πολικού κλάσματος των αιθέρων. Διακρίνονται οι κορυφές των (β+γ) και α-τοκοφερόλης. Επίσης διαπιστώθηκε πως υπήρχε πρόβλημα με τις ανακτήσεις για τον έλεγχο της ορθότητας της μεθόδου. Έτσι, με βάση την βιβλιογραφία, επιλέχθηκε ως διαλύτης η 2-προπανόλη και αποφασίστηκε να γίνει απευθείας διάλυση του ελαίου. Ο συγκεκριμένος διαλύτης είναι λιγότερο τοξικός από άλλους αντίστοιχους και έχει το πλεονέκτημα της επιτυχούς διάλυσης πολλών ελαίων [58,59]. Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η τελική πειραματική πορεία που επιλέχθηκε. 72

Λήψη 100 μl δείγματος και ζύγιση Διάλυση σε 900 μl 2-προπανόλη Αναλογία 1:9 Διήθηση από φίλτρο μεμβράνης αναγεννημένης κυτταρίνης 0,2 μm (Chromafil RC) Ένεση 20 μl στο όργανο Εικόνα 15: Τελική πειραματική πορεία για τον προσδιορισμό τοκοφερολων και χρωστικών σε ελαιόλαδο Συνθήκες ανιχνευτή DAD Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, ο ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων χρησιμοποιεί μία λυχνία ορατού και μία λυχνία που εκπέμπει στο υπεριώδες, και αφού το φως διέλθει από την κυψελίδα με το δείγμα, εκπίπτει σε ένα φράγμα περίθλασης όπου γίνεται ο διαχωρισμός στα διάφορα μήκη κύματος. Οι αναλύτες που απασχόλησαν στην συγκεκριμένη δοκιμή απορροφούσαν ακτινοβολία στα παρακάτω μήκη κύματος: 73

Πίνακας 6: Παράμετροι μέτρησης ανιχνευτή DAD Ένωση Μήκος Κύματος (nm) Χρόνος Ανάσχεσης (min) Καροτενοειδή 430 450 Λουτεΐνη: 6,0 β-καροτένιο: 26,0 δ τοκοφερόλη: 7,5 Τοκοφερόλες 295 β+γ τοκοφερόλη: 8,5 α τοκοφερόλη : 9,5 Χλωροφύλλες 410 660 Χλωροφύλλη α: 10,0 Φαιοφυτίνη α: 15,0 Πυροφαιοφυτίνη: 18,0 Σκουαλένιο 210 15,5 Η ταυτοποίηση των ενώσεων έγινε τόσο με την ταύτιση του χρόνου ανάσχεσης, σύμφωνα με τα πρότυπα διαλύματα, όσο και με την ταύτιση του φάσματος απορρόφησης κάθε ένωσης (είτε από τα πρότυπα διαλύματα, είτε από φάσματα που βρέθηκαν στην βιβλιογραφία). Επίσης, παρασκευάστηκαν δείγματα εμβολιασμένα (spiked) με τους αναλύτες, ώστε να υπάρχει ακόμα μία ένδειξη για την ταυτοποίηση των ενώσεων. Στις παρακάτω εικόνες παρατίθενται τα φάσματα απορρόφησης για κάθε ένωση τόσο σε πρότυπα διαλύματα όσο και σε δείγματα ελαιόλαδου. 74

Εικόνα 16: Φάσμα απορρόφησης της λουτεΐνης, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου Εικόνα 17: Φάσμα απορρόφησης του β-καροτενίου, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου Α Β Εικόνα 18:Φάσμα απορρόφησης των τοκοφερολών, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου 75

Α Β Εικόνα 21: Φάσμα απορρόφησης του σκουαλενίου, (Α) σε πρότυπο διάλυμα και (Β) σε δείγμα ελαιόλαδου Εικόνα 20: Φάσμα απορρόφησης της χλωροφύλλης α σε πρότυπο διάλυμα Εικόνα 19: Φάσμα απορρόφησης της φαιοφυτίνης α σε δείγμα ελαιόλαδου 76

5. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Εισαγωγή Ως επικύρωση μιας αναλυτικής μεθόδου αναφέρεται η αξιολόγηση των χαρακτηριστικών ποιότητας της μεθόδου μέσω πειραματικής τεκμηρίωσης και η εξέταση της ανταπόκρισης της προς προδιαγραφές (specifications) για να αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλη για τον σκοπό για τον οποίο προορίζεται (fitness for purpose) [60,61]. Για την επικύρωση της συγκεκριμένης μεθόδου ελέγχθηκαν οι ακόλουθοι παράμετροι: Ακρίβεια (Accuracy) Ορθότητα (Trueness) Πιστότητα (Precision) Επαναληψιμότητα (Repeatability) Ενδιάμεση πιστότητα (Intermediate Precidion) Ανιχνευσιμότητα (Detectability) Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection, LOD) Όριο Ποσοτικοποίησης (Limit of Quantitation, LOQ) Γραμμικότητα (Linearity) Σε αυτό το κεφάλαιο θα παρουσιαστούν τα αποτελέσματα για κάθε μία παράμετρο ποιότητας, και για κάθε αναλύτη ξεχωριστά. Γραμμικότητα της μεθόδου Η γραμμικότητα της μεθόδου αξιολογήθηκε με την παρασκευή προτύπων διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης και την κατασκευή καμπύλης αναφοράς για κάθε αναλύτη. Επιπροσθέτως, παρασκευάστηκαν καμπύλες προσθήκης γνωστής ποσότητας για κάθε αναλύτη, ώστε να μελετηθεί η επίδραση μήτρας 77

και να αποφασισθεί με ποιόν τρόπο ποσοτικοποίησης λαμβάνονται ορθότερα αποτελέσματα. Καμπύλη αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης αναλύτη Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι συγκεντρώσεις που παρασκευάστηκαν και μετρήθηκαν, οι εξισώσεις παλινδρόμησης, η κλίση, η τομή καθώς και συντελεστής συσχέτισης για κάθε αναλύτη. Η επιλογή των συγκεντρώσεων που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς, έγινε με βάση τα αναμενόμενα εύρη συγκεντρώσεων που αναμένουμε σύμφωνα με την βιβλιογραφία. Πίνακας 7: Εξισώσεις παλινδρόμησης και συντελεστές συσχέτισης για κάθε αναλύτη Εύρος Συντελεστής Αναλύτης Συγκεντρώσεων Εξίσωση Παλινδρόμησης συσχέτισης (mg/l) (r) β-καροτένιο 0,1-5,5 y = 111,6(±3,1) x + 11,8(±8,6) 0,998 Λουτεΐνη 0,1-10 y = 198,70(±0,84) x + 7,4(±3,9) 0,999 α-τοκοφερόλη 2-140 y = 7,373(±0,049) x - 1,3 (±3,3) 0,9998 γ- τοκοφερόλη 0,1-20 y = 9,382(±0,030) x - 0,27 (±0,26) 0,99994 δ- τοκοφερόλη 5-100 y = 8,14(±0,21)x - 7,7(±10,9) 0,998 Σκουαλένιο 30-200 y=66,5(±2,6)x+ 244(±301) 0,997 Χλωροφύλλη 0,5-10 y = 42,72(±0,68) x + 3,7 (±3,5) 0,9995 Στα παρακάτω σχήματα παρατίθενται οι καμπύλες αναφοράς για κάθε ένωση. 78

Εμβαδόν Κορυφής Εμβαδόν Κορυφής 2500 Λουτεΐνη y = 198,70(±0,84) x + 7,4(±3,9) R² = 0,9999 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 1: Καμπύλη αναφοράς της λουτεΐνης. 700 600 β-καροτένιο y = 111,6(±3,1) x + 11,8(±8,6) R² = 0,997 500 400 300 200 100 0 0 1 2 3 4 5 6 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 2: Καμπύλη αναφοράς του β-καροτενίου. 79

Εμβαδόν Κορυφής Εμβαδόν Κορυφής 1200 1000 α- Τοκοφερόλη y = 7,373(±0,049) x - 1,3 (±3,3) R² = 0,9998 800 600 400 200 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 3: Καμπύλη αναφοράς της α- τοκοφερόλης. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 (β+γ)- Τοκοφερόλη y = 9,382(±0,030) x - 0,27 (±0,26) R² = 0,9999 0 5 10 15 20 25 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 4: Καμπύλη αναφοράς της (β+γ)- τοκοφερόλης. 80

Εμβαδόν Κορυφής Εμβαδόν Κορυφής 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 δ- Τοκοφερόλη y = 8,14(±0,21)x - 7,7(±10,9) R² = 0,997 0 20 40 60 80 100 120 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 5: Καμπύλη αναφοράς της δ- τοκοφερόλης. 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Χλωροφύλλη α y = 42,72(±0,68) x + 3,7 (±3,5) R² = 0,9992 0 2 4 6 8 10 12 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 6: Καμπύλη αναφοράς της χλωροφύλλης α. 81

Εμβαδόν Κορυφής 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 Σκουαλένιο y=66,5(±2,6)x+ 244(±301) R² = 0,997 0 0 50 100 150 200 250 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 7: Καμπύλη αναφοράς του σκουαλενίου. Καμπύλη αναφοράς γνωστής προσθήκης Παρασκευάστηκε σειρά δειγμάτων εμβολιασμένα με γνωστή αυξανόμενη ποσότητα για κάθε αναλύτη και αναλύθηκαν με την συγκεκριμένη μέθοδο. Στην συνέχεια, παρασκευάστηκαν οι καμπύλες αναφοράς που παρουσιάζονται παρακάτω. 82

Πίνακας 8: Εξισώσεις παλινδρόμησης και συντελεστές συσχέτισης καμπύλη αναφοράς γνωστής προσθήκης για κάθε αναλύτη Εύρος Συντελεστής Αναλύτης Συγκεντρώσεων Εξίσωση Παλινδρόμησης συσχέτισης (mg/l) (R) β-καροτένιο 0-5,5 y=143 (±10)x + 12 (±28) 0,98 Λουτεΐνη 0-0,7 y=0,0056 (±0,0002)x + 0,022 (0,018) 0,996 α-τοκοφερόλη 0-125 y=7,39 (±0,28)x 21 (±21) 0,994 γ- τοκοφερόλη 0-10 y=6,06 (±0,67)x + 0,4 (±1,5) 0,98 δ- τοκοφερόλη 0-100 y=8,437(±0,090)x -4,4(±5,5) 0,9998 Σκουαλένιο 0-300 y=26,7(±3,1)x + 1308(±584) 0,98 Χλωροφύλλη 0-100 y=82,8(±3,7)x -126(±232) 0,996 83

Εμβαδόν Κορυφής Εμβαδόν Κορυφής 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Λουτεΐνη y=0,0056 (±0,0002)x + 0,022 (0,018) R² = 0,992 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 9: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την λουτεΐνη. 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 β-καροτένιο y=143 (±10)x + 12 (±28) R² = 0,98 0 1 2 3 4 5 6 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 8: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για το β-καροτένιο. 84

Εμβαδόν Κορυφής Εμβαδόν Κορυφής 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 α-τοκοφερόλη y=7,39 (±0,28)x 21 (±21) R² = 0,994 0 20 40 60 80 100 120 140 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 10: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την α-τοκοφερόλη. (β+γ)-τοκοφερόλη y=6,06 (±0,67)x + 0,4 (±1,5) R² = 0,98 30 25 20 15 10 5 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 11: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για τις (β+γ)- τοκοφερόλη. 85

Εμβαδόν Κορυφής Εμβαδόν Κορυφής 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 δ-τοκοφερόλη y=8,437(±0,090)x -4,4(±5,5) R² = 0,9997 0 20 40 60 80 100 120 Συγκέντρωση mg/l Σχήμα 12: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την δ- τοκοφερόλη. 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Χλωροφύλλη α y=82,8(±3,7)x -126(±232) R² = 0,993 0 20 40 60 80 100 120 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 13: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για την χλωροφύλλη α. 86

Εμβαδόν Κορυφής 12000 10000 Σκουαλένιο y=26,7(±3,1)x + 1308(±584) R² = 0,9736 8000 6000 4000 2000 0 0 50 100 150 200 250 300 350 Συγκέντρωση (mg/l) Σχήμα 14: Καμπύλη γνωστής προσθήκης για το σκουαλένιο. Σε όσες ενώσεις εντοπίστηκε επίδραση μήτρας έγινε ποσοτικοποίηση με χρήση της καμπύλης γνωστής προσθήκης, ενώ στις υπόλοιπες έγινε ποσοτικοποίηση με χρήση της καμπύλης εξωτερικών προτύπων. Ορθότητα και Πιστότητα της μεθόδου Ορθότητα και Επαναληψιμότητα της μεθόδου Η ορθότητα της μεθόδου αξιολογήθηκε με τον υπολογισμό των ανακτήσεων εμβολιασμένων δειγμάτων μίγματος όλων των αναλυτών, δεδομένου ότι το εργαστήριο δε διέθετε πιστοποιημένο υλικό αναφοράς. Για τον υπολογισμό της ανάκτησης της μεθόδου εξετάστηκαν τρία επίπεδα συγκεντρώσεων για κάθε αναλύτη και πραγματοποιήθηκαν 6 επαναλήψεις για κάθε επίπεδο. Για τον υπολογισμό της ανάκτησης χρησιμοποιήθηκε η εξίσωση 6.1 και τα αποτελέσματα των ανακτήσεων για κάθε αναλύτη παρουσιάζονται παρακάτω. 87

%R = Συγκέντρωση εμβολιασμένου δείγματος Συγκέντρωση αγνωστου+γνωστή προσθήκη x100 (6.1) Πίνακας 9: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (β-καροτένιο) Αναλύτης β καροτένιο Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 50 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 200 mg/kg %Ανάκτηση 87,4 104,7 85,4 95,3 93,0 80,5 92,1 81,0 82,6 91,8 103,8 81,8 100,6 104,0 80,7 98,7 93,2 81,9 Μέση Ανάκτηση 94,3 96,6 82,1 Τυπική απόκλιση 4,9 9,4 1,8 Σχετική τυπική απόκλιση (RSDr) 5,2 9,7 2,2 Μέση Ανάκτηση ±SD 94,3 ± 4,9 96,6 ± 9,4 82,1 ± 1,8 Αναλύτης Λουτεΐνη Πίνακας 10: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (λουτεΐνη) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 10 mg/kg 88 Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 50 mg/kg Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg %Ανάκτηση 95,4 86,9 83,2 97,0 93,6 90,9 95,8 93,6 90,9 95,9 88,0 90,6 97,6 88,9 83,8 97,8 95,6 91,8 Μέση Ανάκτηση 96,6 91,1 88,6 Τυπική απόκλιση 1,0 3,6 3,9 Σχετική τυπική απόκλιση (RSDr) 1,0 4,0 4,4 Μέση Ανάκτηση ±SD 96,6 ± 1,0 91,1 ± 3,6 88,6 ± 3,9

Αναλύτης α-τοκοφερόλη Πίνακας 11: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (α- τοκοφερόλη) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 95,4 100,7 92,1 96,7 91,2 93,6 93,9 93,1 95,4 99,3 105,8 91,2 100,5 91,3 92,6 105,6 92,3 94,3 Μέση Ανάκτηση 98,6 95,7 93,2 Τυπική απόκλιση 4,2 6,1 1,5 Σχετική τυπική απόκλιση (RSDr) 4,3 6,4 1,6 Μέση Ανάκτηση ±SD 98,6 ± 4,2 95,7 ± 6,1 93,2 ± 1,5 Πίνακας 12: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας. (β+γ- τοκοφερόλη) Αναλύτης (β+γ)-τοκοφερόλη Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 200 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg 109,3 108,9 102,8 104,8 104,8 104,8 101,3 107,0 106,9 111,9 110,1 107,2 105,5 107,5 109,1 102,5 107,5 110,5 Μέση Ανάκτηση 105,9 107,6 106,9 Τυπική απόκλιση 4,0 1,8 2,8 Σχετική τυπική απόκλιση (RSDr) 3,8 1,7 2,6 Μέση Ανάκτηση ±SD 105,9 ± 4,0 107,6 ± 1,8 106,9 ± 2,8 89

Πίνακας 13: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (δ - τοκοφερόλη) Αναλύτης δ-τοκοφερόλη Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 106,5 113,7 99,9 110,2 98,2 88,2 108,5 98,6 90,0 106,3 100,9 98,2 107,8 97,1 86,6 116,4 97,3 88,9 Μέση Ανάκτηση 109,3 101,0 92,0 Τυπική απόκλιση 3,8 6,4 5,6 Σχετική τυπική απόκλιση (RSDr) 3,5 6,3 6,1 Μέση Ανάκτηση ±SD 109,3 ± 3,8 101,0 ± 6,4 92,0 ± 5,6 Πίνακας 14: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (χλωροφύλλη α) Αναλύτης Χλωροφύλλη α Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 85,5 92,4 91,5 90,9 91,0 90,0 97,2 93,9 88,8 84,7 90,9 91,0 88,7 90,2 88,5 95,2 92,7 87,7 Μέση Ανάκτηση 90,4 91,8 89,6 Τυπική απόκλιση 5,1 1,4 1,5 Σχετική τυπική απόκλιση (RSDr) 5,6 1,5 1,7 Μέση Ανάκτηση ±SD 90,4 ± 5,1 91,8 ± 1,4 89,6 ± 1,5 90

Πίνακας 15: Δεδομένα ανακτήσεων για έλεγχο της ορθότητας (σκουαλένιο) Αναλύτης Σκουαλένιο Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 104,1 91,9 93,6 97,2 90,3 99,8 95,1 92,0 97,3 98,0 106,4 94,4 106,6 90,8 99,4 88,2 99,1 95,5 Μέση Ανάκτηση 98,2 95,1 96,7 Τυπική απόκλιση 6,6 6,4 2,6 Σχετική τυπική απόκλιση (RSDr) 6,7 6,7 2,7 Μέση Ανάκτηση ±SD 98,2 ± 6,6 95,1 ± 6,4 96,7 ± 2,6 Από τα παραπάνω πειραματικά δεδομένα, οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις (Relative Standard Deviation, RSD), κρίνονται ικανοποιητικές αφού είναι μικρότερες από 10%. Επίσης, όλες οι ανακτήσεις που υπολογίστηκαν ήταν μεταξύ 80-120%. Έτσι, η επαναληψιμότητα και η ορθότητα της μεθόδου αξιολογούνται ως καλές. Ενδιάμεση πιστότητα Η ενδιάμεση πιστότητα ελέγχθηκε με τον εμβολιασμό γνωστής ποσότητας των αναλυτών στο μητρικό υλικό του δείγματος ακολουθώντας την πειραματική πορεία που αναφέρθηκε παραπάνω, με την διαφορά ότι τα δείγματα αναλύθηκαν σε τρεις διαφορετικές εργαστηριακές ημέρες. Για την τρίτη μέρα μέτρησης έγινε παρασκευή τεσσάρων διαλυμάτων αφού απαιτούνται συνολικά 6-15 μετρήσεις. Στην συνέχεια υπολογίστηκαν η μέση ανάκτηση, η τυπική απόκλιση και η σχετική τυπική απόκλιση. Τα δεδομένα αυτά παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες. 91

Αναλύτης β- καροτένιο Ημέρα 1 η (ν=6) 2 η (ν=6) 3 η (ν=4) Πίνακας 16: Δεδομένα ανακτήσεων για τον έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (βκαροτένιο) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 50 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 200 mg/kg 87,4 104,7 85,4 95,3 93,0 80,5 92,1 81,0 82,6 91,8 103,8 81,8 100,6 104,0 80,7 98,7 93,2 81,9 119,1 89,3 105,7 104,3 80,2 104,7 99,8 80,1 111,5 109,2 104,0 112,5 102,2 96,7 114,5 103,3 92,4 119,0 118,1 116,6 117,7 115,8 102,8 117,6 114,2 107,8 106,2 116,9 105,1 99,9 Μέση Ανάκτηση 104,3 97,2 100,1 SD 10,2 10,8 15,3 RSD% 9,8 11,1 15,3 92

Πίνακας 17: Δεδομένα ανακτήσεων για τον έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας Αναλύτης Λουτεΐνη Ημέρα 1 η ν=6 2 η ν=6 3 η ν=4 (λουτεΐνη) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 10 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 50 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg 95,4 86,9 83,2 97,0 93,6 90,9 95,8 93,6 90,9 95,9 88,0 90,6 97,6 88,9 83,8 97,8 95,6 91,8 92,1 98,4 96,8 90,3 93,3 98,8 87,1 96,8 98,3 88,5 91,1 90,9 87,1 92,4 90,1 84,1 90,6 89,9 95,4 92,5 92,6 98,8 96,5 90,0 96,7 92,0 88,4 97,0 92,2 88,1 Μέση Ανάκτηση 93,5 92,7 91,0 SD 4,6 3,2 4,3 RSD% 5,0 3,4 4,8 93

Αναλύτης α- τοκοφερόλη Ημέρα 1 η ν=6 2 η ν=6 3 η ν=4 Πίνακας 18: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (ατοκοφερόλη) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 95,4 139,8 92,1 96,7 91,2 93,6 93,9 93,1 95,4 99,3 105,8 91,2 100,5 91,3 92,6 137,8 92,3 94,3 105,6 109,4 110,7 102,0 107,0 109,9 103,6 104,3 105,3 102,7 105,3 106,2 98,8 103,8 104,6 103,0 100,0 101,3 94,2 98,0 95,7 97,9 98,4 100,2 96,7 98,9 98,6 101,3 100,7 101,2 Μέση Ανάκτηση 99,5 100,0 99,6 SD 3,6 6,0 6,4 RSD% 3,6 6,0 6,4 94

Πίνακας 19: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (β+γ - Αναλύτης (β+γ)- τοκοφερόλη Ημέρα 1 η ν=6 2 η ν=6 3 η ν=4 τοκοφερόλη) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 200 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg 109,3 108,9 102,8 104,8 104,8 104,8 101,3 107,0 106,9 111,9 110,1 107,2 105,5 107,5 109,1 102,5 107,5 110,5 108,3 105,0 100,2 105,0 105,0 98,9 103,4 101,2 104,3 112,5 114,1 114,2 112,5 112,3 108,8 106,8 111,2 115,1 101,3 99,3 93,6 100,0 96,9 97,5 101,1 98,8 93,6 98,2 100,0 98,9 Μέση Ανάκτηση 105,3 105,6 104,2 SD 4,6 5,2 6,6 RSD% 4,3 4,9 6,4 95

Πίνακας 20: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας (δ - Αναλύτης δ- τοκοφερόλη Μέση Ανάκτηση Ημέρα 1 η ν=6 2 η ν=6 3 η ν=4 τοκοφερόλη) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 106,5 113,7 99,9 110,2 98,2 88,2 108,5 98,6 90,0 106,3 100,9 98,2 107,8 97,1 86,6 116,4 97,3 88,9 102,5 98,7 98,6 132,9 99,7 95,1 96,7 97,6 99,1 103,4 99,5 98,0 140,8 101,7 98,2 99,3 100,8 100,6 100,8 95,4 99,4 93,4 96,1 100,3 101,9 94,9 92,5 96,8 96,3 102,1 103,6 99,2 96,0 SD 6,2 4,4 5,0 RSD% 5,9 4,4 5,3 96

Αναλύτης Χλωροφύλλη Πίνακας 21: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας Ημέρα 1 η ν=6 2 η ν=6 3 η ν=4 (χλωροφύλλη) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 85,5 92,4 91,5 90,9 91,0 90,0 97,2 93,9 88,8 84,7 90,9 91,0 88,7 90,2 88,5 95,2 92,7 87,7 111,5 112,7 111,4 108,0 107,5 113,4 117,5 111,0 113,1 110,4 109,3 107,2 105,8 105,0 112,7 116,1 107,7 111,0 104,3 102,0 104,9 100,3 97,8 107,0 102,7 102,2 107,5 98,8 100,8 107,8 Μέση Ανάκτηση 101,1 100,4 102,1 SD 10,3 7,9 10,3 RSD% 10,2 7,8 10,1 97

Αναλύτης Σκουαλένιο Πίνακας 22: Δεδομένα ανακτήσεων για την έλεγχο της ενδιάμεσης πιστότητας Ημέρα 1 η ν=6 2 η ν=6 3 η ν=6 (σκουαλένιο) Χαμηλό επίπεδο εμβολιασμού 100 mg/kg 98 Μεσαίο επίπεδο εμβολιασμού 500 mg/kg %Ανάκτηση Υψηλό επίπεδο εμβολιασμού 1000 mg/kg 104,1 91,9 93,6 97,2 90,3 99,8 95,1 92,0 97,3 98,0 106,4 94,4 106,6 90,8 99,4 88,2 99,1 95,5 119,1 116,6 119,2 106,7 106,2 111,8 102,5 114,9 112,1 114,8 108,9 108,4 102,1 107,2 102,8 108,8 108,2 106,5 99,0 95,6 105,6 98,6 101,3 105,2 102,0 99,9 107,0 99,8 103,6 108,1 Μέση Ανάκτηση 102,7 102,1 104,2 SD 7,5 8,4 7,2 RSD% 7,3 8,2 6,9 (Σημείωση: οι τιμές με κόκκινο χρώμα θεωρούνται έκτροπες, αφού βρίσκονται εκτός ορίων και έτσι δεν συμμετέχουν στον υπολογισμό της μέσης τιμής, της τυπικής απόκλισης και της σχετικής τυπικής απόκλισης) Ως κριτήριο απόδοσης της μεθόδου ως προς την ενδιάμεση πιστότητα χρησιμοποιείται η εξίσωση Horwitz. Για συγκεντρώσεις 1,2 10-7 C 0,138, χρησιμοποιείται η εξίσωση Horwitz και για συγκεντρώσεις C < 1,2 10-7 η τροποποιημένη εξίσωση Horwitz, οι οποίες είναι γενικευμένες εξισώσεις ακρίβειας και είναι ανεξάρτητες μόνο από την συγκέντρωση για τις περισσότερες αναλυτικές μεθόδους ρουτίνας. Η εξίσωση Horwitz για συγκεντρώσεις 1,2 10-7 C 0,138 παρέχεται από την εξίσωση 6.2:

RSD R = 2 C ( 0,15) (6.2) Όπου το RSDR είναι η σχετική τυπική απόκλιση και υπολογίζεται βάσει των αποτελεσμάτων που προκύπτουν υπό συνθήκες αναπαραγωγιμότητας και το C είναι το ποσοστό της συγκέντρωσης (ήτοι 1 = 100 g/100 g, 0,001=1000 mg/kg). Η εξίσωση Horwitz χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των RSDR για κάθε αναλύτη, σε κάθε επίπεδο εμβολιασμού και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά που ελήφθησαν από τα πειραματικά δεδομένα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 23: Σύγκριση RSD R μεταξύ πειραματικών αποτελεσμάτων και αποτελεσμάτων που ελήφθησαν από την εξίσωση Horwitz Αναλύτης β-καροτένιο Λουτεΐνη α-τοκοφερόλη (β+γ)- τοκοφερόλη δ-τοκοφερόλη Σκουαλένιο Χλωροφύλλη Συγκέντρωση Πειραματικά Horwitz mg/kg αποτελέσματα 50 12,5 9,8 100 11,2 11,1 200 10,1 15,3 10 11,2 5,0 50 8,8 3,4 100 7,9 4,8 100 11,2 3,6 500 8,8 6,0 1000 7,9 6,4 100 11,2 4,3 200 10,1 4,9 500 8,8 6,4 100 11,2 5,9 500 8,8 4,4 1000 7,9 5,3 100 11,2 7,3 500 8,8 8,2 1000 7,9 6,9 100 11,2 10,2 500 8,8 7,8 1000 7,9 10,1 99

Όπως φαίνεται και στον πίνακα 22, τα RSDR που βρέθηκαν πειραματικά έχουν μικρότερη τιμή από τα αντίστοιχα που βρέθηκαν από την εξίσωση Horwitz. Αυτό υποδεικνύει καλή ενδιάμεση πιστότητα. Σε υψηλές συγκεντρώσεις για την χλωροφύλλη και το β- καροτένιο, παρατηρείται πως το RSDR είναι οριακά υψηλότερο από την τιμή που υπολογίστηκε μέσω της εξίσωσης Horwitz, το οποίο μπορεί να οφείλεται σε κάποιο σφάλμα κατά την πειραματική πορεία. Όριο Ανίχνευσης Ποσοτικοποίησης Για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης του οργάνου, παρασκευάστηκαν διαλύματα προτύπων χαμηλής συγκέντρωσης για κάθε αναλύτη και μετρήθηκε δέκα φορές ενώ για τον υπολογισμό των LOD και LOQ της μεθόδου παρασκευάστηκαν διαλύματα προτύπων σε μητρικό υλικό δείγματος, διαφορετικά για κάθε αναλύτη, και τα δείγματα μετρήθηκαν επίσης δέκα φορές. Στην συνέχεια, υπολογίστηκαν η μέση συγκέντρωση και η τυπική απόκλιση. Ο υπολογισμός των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης έγινε με την χρήση των εξισώσεων 6.3 και 6.4. LOD = 3.3 SD b LOQ = 10 SD b (6.3) (6.4) Όπου SD η τυπική απόκλιση και b η κλίση της καμπύλης αναφοράς. Τα αποτελέσματα για τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες. 100

Πίνακας 24: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (β-καροτένιο) Αναλύτης C (mg/l) C (mg/kg) β-καροτένιο 0,082 0,84 0,110 1,12 0,100 1,02 0,103 1,00 0,093 0,90 0,104 1,01 0,107 1,02 0,111 1,05 0,114 1,08 0,096 0,91 Μέση τιμή 0,102 0,99 Τυπική απόκλιση 0,009 0,08 LOD 0,03 0,28 LOQ 0,09 0,83 Πίνακας 25: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (λουτεΐνη) Αναλύτης C (mg/l) C (mg/kg) Λουτεΐνη 0,0278 0,254 0,0288 0,264 0,0298 0,273 0,0263 0,247 0,0263 0,247 0,0273 0,257 0,0293 0,282 0,0268 0,257 0,0303 0,292 0,0288 0,277 Μέση τιμή 0,028 0,26 Τυπική απόκλιση 0,0014 0,014 LOD 0,005 0,05 LOQ 0,013 0,14 101

Πίνακας 26: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (α-τοκοφερόλη) Αναλύτης C (mg/l) C (mg/kg) α-τοκοφερόλη 2,27 18,1 2,26 19,5 2,41 21,0 1,96 22,1 1,93 19,2 1,90 18,9 1,99 20,0 2,27 23,0 2,13 21,5 2,17 21,9 Μέση τιμή 2,1 20,5 Τυπική απόκλιση 0,17 1,6 LOD 0,65 5,3 LOQ 1,7 15,8 Πίνακας 27: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (β+γ-τοκοφερόλη) Αναλύτης C (mg/l) C (mg/kg) (β+γ)-τοκοφερόλη 0,59 4,2 0,61 4,4 0,55 3,8 0,50 5,0 0,52 6,0 0,55 6,4 0,50 2,9 0,51 5,3 0,53 3,7 0,51 5,0 Μέση τιμή 0,54 5,1 Τυπική απόκλιση 0,04 0,8 LOD 0,1 2,6 LOQ 0,4 7,9 102

Πίνακας 28: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (δ-τοκοφερόλη) Αναλύτης C (mg/l) C (mg/kg) 2,352 23,83 2,429 24,61 2,391 24,22 2,442 23,73 δ-τοκοφερόλη 2,391 23,23 2,442 23,73 2,506 23,80 2,519 23,92 2,558 24,29 2,532 24,05 Μέση τιμή 2,456 23,94 Τυπική απόκλιση 0,069 0,38 LOD 0,2 1,2 LOQ 0,6 3,7 Πίνακας 29: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (χλωροφύλλη) Αναλύτης C (mg/l) C (mg/kg) 0,554 4,87 0,487 4,28 0,446 3,92 0,432 3,81 Χλωροφύλλη 0,379 3,35 0,468 4,13 0,465 4,43 0,462 4,40 0,409 3,90 0,415 3,95 Μέση τιμή 0,452 4,10 Τυπική απόκλιση 0,049 0,39 LOD 0,15 1,3 LOQ 0,45 3,9 103

Πίνακας 30: Δεδομένα για τον υπολογισμό των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (σκουαλένιο) Αναλύτης C (mg/l) C (mg/kg) 12,4 120,1 14,2 137,1 10,3 99,5 10,9 107,3 Σκουαλένιο 11,6 114,5 11,3 111,6 11,0 109,6 12,4 123,0 12,4 123,7 11,0 109,7 Μέση τιμή 11,8 115,6 Τυπική απόκλιση 1,1 10,6 LOD 3,7 35,1 LOQ 11,1 105,3 Ανατρέχοντας στον Πίνακα 2, παρατηρείται πως τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης για τις τοκοφερόλες είναι σχεδόν μια τάξη μεγέθους χαμηλότερα. Για την χλωροφύλλη α τα αντίστοιχα όρια είναι οριακά υψηλότερα από αυτά που αναφέρονται στην βιβλιογραφία. Για το β-καροτένιο και την λουτεΐνη δεν βρέθηκαν αναφορές στην βιβλιογραφία στις οποίες να σημειώνονται τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης. Κρίνοντας όμως από τα αντίστοιχα όρια που υπολογίστηκαν σε αυτήν την εργασία, γίνεται αντιληπτό πως τα όρια αυτά είναι αρκετά χαμηλά. Για το σκουαλένιο, κατά την διάρκεια των πειραμάτων παρατηρήθηκε πως η συγκέντρωση του στο ελαιόλαδο, όπως αναφέρεται και στη βιβλιογραφία, αν και ποικίλει, βρίσκεται σε πολύ υψηλά επίπεδα. Επομένως δεν είναι σκόπιμο τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης να είναι πολύ χαμηλά. 104

6. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ ΒΟΡΕΙΟΥ ΑΓΑΙΟΥ Εισαγωγή Στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος «ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗ ΕΡΕΥΝΑ ΠΡΟΩΘΗΣΗΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΚΑΙ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΕΛΙΑΣ ΒΟΡΕΙΟΥ ΑΙΓΑΙΟΥ ΜΕΣΩ ΑΝΑΔΕΙΞΗΣ ΤΟΥ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΙΔΙΑΙΤΕΡΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ» αναλύθηκαν 452 δείγματα εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου από νησιά της Περιφέρειας Βορείου Αιγαίου (Λέσβος, Σάμος, Χίος, Ικαρία και Φούρνοι) με σκοπό τον ποσοτικό προσδιορισμό των χρωστικών και των τοκοφερολών που απαντώνται στο ελαιόλαδο. Όλες οι χημικές αναλύσεις, έλαβαν χώρα στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του ΕΚΠΑ, με χρήση της μεθόδου που αναπτήχθηκε. Δειγματοληψία Η δειγματοληψία των ελαιολάδων πραγματοποιήθηκε κατά την ελαιοκομική περίοδο 2017-2018 και ελήφθησαν δείγματα από τα νησιά Β. Αιγαίου και συγκεκριμένα από τη Λέσβο, τη Σάμο, τη Χίο, την Ικαρία και τους Φούρνους. Ελήφθησαν συνολικά 452 δείγματα ελαιολάδου και η πλειονότητα των δειγμάτων (80% του συνόλου) προήλθαν από τη Λέσβο (Εικόνα 22), η οποία είχε χωριστεί σε 7 διαφορετικές ζώνες δειγματοληψίας για καλύτερη διαχείριση και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων (Εικόνα 23). Για την περίπτωση της Λέσβου, ο αρχικός σχεδιασμός δειγματοληψίας έγινε με βάση το ελαιοτριβείο στο οποίο πραγματοποιήθηκε η παραγωγή του ελαιολάδου και αντίστοιχα έγινε ο καταμερισμός σε ζώνες. Ωστόσο, προκειμένου να είναι δυνατή η χαρτογράφηση του ελαιολάδου ανάλογα τη γεωγραφική προέλευση, θεωρήθηκε αναγκαία η κατανομή των δειγμάτων σε ζώνες, βασιζόμενοι αυτή τη φορά στην περιοχή που βρίσκεται η ελαιοκαλλιέργεια. 105

Εικόνα 22: Ποσοστό δειγμάτων ελαιολάδου από τα νησιά του Β. Αιγαίου Εικόνα 23: (α) Ποσοστό δειγμάτων ελαιολάδου καταμερισμένο σε ζώνες δειγματοληψίας στη Λέσβο, (β) Ζώνες δειγματοληψίας στη Λέσβο-χαρτογραφική απεικόνιση Τα δείγματα ελαιολάδου που ελήφθησαν ταξινομήθηκαν σε κατηγορίες ανάλογα με: Τη γεωγραφική προέλευση του ελαιολάδου Τη ζώνη δειγματοληψίας (στην περίπτωση της Λέσβου) Την ποικιλία του ελαιόδεντρου Το υψόμετρο της δενδροκαλλιέργειας (ορεινό, ημιορεινό, πεδινό) Το είδος της καλλιέργειας (βιολογική, συμβατική καλλιέργεια) Την καλλιεργητική φροντίδα που εφαρμόζεται (άρδευση, λίπανση, καμία καλλιεργητική φροντίδα) 106