Μελέτη της Επίδρασης Υπερυψηλής Πίεσης και Παλλόμενων Ηλεκτρικών Πεδίων στη Δραστικότητα Ενδογενών Ενζύμων Ελιάς Β. Ανδρέου 1, Ζ. Αλεξανδράκης 1, Γ.Κατσαρός 1, Δ.Οικονόμου 2, Π.Ταούκης 1 1 Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο 2 Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας Τροφίμων και Γεωργικών Υποπροϊόντων, Ινστιτούτο Τεχνολογίας Γεωργικών Προϊόντων, ΕΛΓΟ ΔΗΜΗΤΡΑ Λέξεις κλειδιά: Παλλόμενα Ηλεκτρικά πεδία, Υπερυψηλή πίεση, ένζυμα, ελαιόλαδο ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το ελαιόλαδο που εξάγεται από τους καρπούς της ελιάς (Olea europaea, οικογένεια Oleaceae), αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της μεσογειακής διατροφής και η ποιότητα του αμέσως μετά την παραγωγή του θεωρείται πολύ σημαντική για τα χαρακτηρισμό του. Στην ποιοτική υποβάθμιση του ελαιόλαδου εκτός από την οξείδωσή του, συντελεί και η δράση ενζύμων όπως η λιποξυγενάση (ΛΟΞ) και πολυφαινολική οξειδάση (ΠΦΟ). Τα συγκεκριμένα ένζυμα μεταφέρονται στο ελαιόλαδο κατά την παραλαβή του από τους ελαιοκάρπους και έχουν αρνητική επίδραση στα ποιοτικά του χαρακτηριστικά κατά την αποθήκευσή του. Η ΛΟΞ προκαλεί την οξείδωση των ακόρεστων λιπαρών οξέων με μετέπειτα σχηματισμό ανεπιθύμητων ελευθέρων ενώσεων που οδηγούν σε δυσάρεστη γεύση και οσμή, ενώ η ΠΦΟ είναι υπεύθυνη για την ενζυματική οξείδωση των πολυφαινολών (ενζυμική αμαύρωση). Επεξεργασία των ελιών με μη θερμικές τεχνολογίες πριν την εκχύλιση τους εκτός του ότι δυνητικά βελτιώνει την απόδοση σε ελαιόλαδο υψηλής ποιότητας, έχει επίδραση και στη δραστικότητα των ενζύμων ΛΟΞ και ΠΦΟ. Από τη συγκεκριμένη μελέτη φάνηκε ότι η Υπερυψηλή Πίεση είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της εναπομένουσας δραστικότητας και των δύο ενζύμων, σε όλες τις ποικιλίες ελιών που μελετήθηκαν, ανάλογα και με την ένταση των συνθηκών επεξεργασίας. Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε και για τα δείγματα που επεξεργάστηκαν με Παλλόμενα Ηλεκτρικά Πεδία. Μεγαλύτερη ένταση των ΠΗΠ οδήγησε σε μείωση της εναπομένουσας δραστικότητας τόσο για τη ΛΟΞ όσο και για τη ΠΦΟ. Συνολικά, η επίδραση των τεχνολογιών στα ένζυμα φαίνεται να εξαρτάται από την ποικιλία των ελιών από τις οποίες προέρχεται το ελαιόλαδο, μιας και για ίδια ένζυμα παρατηρήθηκε διαφορετική συμπεριφορά κατά την απενεργοποίησή τους με τη ΛΟΞ και ΠΦΟ από τις ποικιλίες Κορωνέικη και Μανάκι, αντίστοιχα να εμφανίζονται ως τα λιγότερο ανθεκτικά. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ελαιόλαδο ως φυσικό προϊόν (προερχόμενο από την έκθλιψη της ελιάς) διατηρεί τις βιολογικές του ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων των βιταμινών, των αντιοξειδωτικών του συστατικών και των ιχνοστοιχείων του. Η παρουσία αυτών των συστατικών του προσδίδει εξαιρετική οξειδωτική σταθερότητα και πλούσια γεύση. Στο ελαιόλαδο περιέχονται και ενδογενή ένζυμα που εξάγονται από τους καρπούς της ελιάς, όπως η λιποξυγενάση (ΛΟΞ) και η πολυφαινολική οξειδάση (ΠΦΟ). Η ΛΟΞ προκαλεί την οξείδωση των ακόρεστων λιπαρών οξέων με μετέπειτα σχηματισμό ανεπιθύμητων ελευθέρων ενώσεων που καταστρέφουν πρωτεΐνες και βιταμίνες αλλά συντελούν και σε σχηματισμό υπεροξειδίων που οδηγούν σε δυσάρεστη γεύση και οσμή. Η ΠΦΟ είναι υπεύθυνη για την ενζυματική οξείδωση των πολυφαινολών (ενζυμική αμαύρωση του ελαιολάδου) οδηγώντας σε σκουρόχρωμα προϊόντα. Η ΠΦΟ είναι το κύριο ένζυμο που συμμετέχει στην οξείδωση των μονοφαινολών και των ο-διφαινολών. Η οξείδωση τους περιλαμβάνει 2 αντιδράσεις: την υδροξυλίωση των μονοφαινολών σχηματίζοντας δι-φαινόλες και την οξείδωση αυτών σε κινόνες. Οι κινόνες που σχηματίζονται πολυμερίζονται και αντιδρούν δευτερογενώς με άλλες ενώσεις με δημιουργία καστανών ή μελανών χρωστικών. Τα τελευταία χρόνια μελετάται και η δυνατότητα χρήσης νέων τεχνολογιών για την αύξηση της απόδοσης αλλά και τη διατήρηση ή/και βελτίωση της ποιότητας του παραγόμενου ελαιολάδου. Η Υπερυψηλή πίεση (ΥΠ) αλλά και τα Παλλόμενα Ηλεκτρικά Πεδία (ΠΗΠ) είναι δυο από τις τεχνολογίες που θα μπορούσαν να εφαρμοστούν (Puertolas et al., 2015; Abenoza et al., 2013). Η τεχνολογία των ΠΗΠ στηρίζεται στην εφαρμογή μικρών παλμών ηλεκτρικού πεδίου εντάσεως από 10 έως 80 kv/cm διάρκειας από μsec έως msec, με ελάχιστες θερμικές
επιπτώσεις στο προϊόν. Ουσιαστικά το τρόφιμο διέρχεται μεταξύ δυο αντίθετα φορτισμένων ηλεκτρικών πλακών, με αποτέλεσμα να δημιουργείται ηλεκτρική εκκένωση η οποία συμβάλλει στη συντήρησή του με απενεργοποίηση των αλλοιογόνων παραγόντων. Όσον αφορά την ΥΠ, η αρχή λειτουργίας της έγκειται στη διάρρηξη των εξωτερικών τοιχωμάτων μικροοργανισμών εξαιτίας της πολύ μεγάλης πίεσης (πιέσεις από 1000-10000 bar, ανάλογα με την ένταση της επεξεργασίας), αλλά και σε αλλαγές στη δομή των ενζύμων με αποτέλεσμα τη μείωση της καταλυτικής τους δράσης. Η πίεση που ασκείται στα τρόφιμα είναι υδροστατική με αποτέλεσμα να μην αλλοιώνεται η εμφάνισή τους εξαιτίας μηχανικής πίεσης. Η επεξεργασία με ΥΠ ή ΠΗΠ θα μπορούσε δυνητικά να συμβάλλει στη μείωση της δραστικότητας των ΠΦΟ και ΛΟΞ, επηρεάζοντας την πιθανή αύξηση του χρόνου ζωής του ελαιολάδου. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να αξιολογηθεί κατά πόσο η εφαρμογή των τεχνολογιών Υπερυψηλής Πίεσης (ΥΠ) και Παλλόμενων Ηλεκτρικών Πεδίων (ΠΗΠ) στις ελιές επηρεάζει την εναπομένουσα δραστικότητα των επιλεγμένων ενζύμων που συναντώνται στο λάδι. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ελιές από τέσσερις (4) διαφορετικές ποικιλίες (Κορωνέικη, Τσουνάτη, Αμφίσσης και Μανάκι) επεξεργάστηκαν σε διάφορες συνθήκες ΥΠ (200-600 MPa για 1-5 min, 20 o C) ή ΠΗΠ (1.5 kv/cm, με συνολικό ποσό Ενέργειας από 1 έως 21 kj)) και στη συνέχεια ακολουθήθηκε η τυπική διαδικασία εξαγωγής του ελαιολάδου. Αρχικά πραγματοποιήθηκε θρυμματισμός του ελαιοκάρπου με σκοπό τη διάσπαση των κυττάρων στο μεσοκάρπιο και την απελευθέρωση του ελαίου. Μετά το θρυμματισμό και την πολτοποίηση ακολούθησε το στάδιο της μάλαξης της ελαιοζύμης στους 30 ο C για 30 λεπτά που συντελεί στην ομογενοποίηση του δείγματος. Με αυτό τον τρόπο η ελαιοζύμη αποκτά συνεκτικότητα και η απόδοση σε λάδι αυξάνεται σημαντικά. Ειδικότερα, η διαδικασία της μάλαξης συντελεί στη συνένωση των σταγονιδίων του ελαιόλαδου, ώστε να γίνουν μεγαλύτερα. Έτσι ο διαχωρισμός τους επιτυγχάνεται καλύτερα και αποτελεσματικότερα μέσω της φυγοκέντρησης (Σχήμα 1). Στα δείγματα ελαιολάδου που προέκυψαν μελετήθηκε η εναπομένουσα δραστικότητα των ΛΟΞ και ΠΦΟ. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων με ΥΠ χρησιμοποιήθηκε η μονάδα Food Pressure Unit FPU 1.01 της Resato International BV (Roden, Holland). Ο εξοπλισμός περιλαμβάνει μία μονάδα ΥΠ συνδεδεμένη με θαλάμο που είναι ένας κυλινδρικός όγκου 1.5 L και χρησιμοποιείται για την επεξεργασία μεγάλων ποσοτήτων προϊόντων. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων με ΠΗΠ χρησιμοποιήθηκε ο εξοπλισμός Elcrack-5kW,DIL, Quakenbruck, Germany. Αποτελείται από γεννήτρια παραγωγής παλμών και θάλαμο μη συνεχούς ροής (batch chamber), χωρητικότητας 400 ml από ανοξείδωτο χάλυβα με αντίθετα φορτισμένες ηλεκτρικές πλάκες για την επίτευξη του πεδίου. Για τη μέτρηση της δραστικότητας της πολυφαινολικής οξειδάσης και της λιποξυγενάσης, πραγματοποιήθηκε εκχύλισή τους από τα δείγματα ελαιολάδων με βάση τη μέθοδο των Georgalaki et al., 1998. Αρχικά, ποσότητα ελαιόλαδου (1 ml) αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα 50mM Tris-HCl, ph 7.5 (το διάλυμα περιείχε 0.1Μ ΝaCl και 10% v/v γλυκερόλη) σε αναλογία 1:1. Ακολούθησε φυγοκέντρηση του μίγματος στα 10,000 g για 4 min. Στο υπερκείμενο υγρό περιέχονταν τα ένζυμα. Για τη μέτρηση της δραστικότητας της ΛΟΞ ελαιόλαδου χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο (Helios Spectrophotometer, Unicam, USA) με το οποίο μετρήθηκε η απορρόφηση στα 234 nm και αντιστοιχήθηκε με τη δημιουργία διπλών δεσμών που σχηματίζονται από τη δράση του ενζύμου στο υπόστρωμα (λινολεϊκό οξύ). Αναλυτικότερα σε κυψελίδα προστέθηκαν 100 μl από το ενζυμικό εκχύλισμα μαζί με 700μL από 0.4mM λινοελαικό οξύ σε 0.2M buffer sodium phosphate με ph 6.2. Μετρήθηκε η μεταβολή της απορρόφησης για χρόνο t>5min. Η κλίση της καμπύλης Απορρόφησης χρόνου σε κάθε περίπτωση συσχετίστηκε με τη δραστικότητα του ενζύμου. Η μέτρηση της δραστικότητας της ΠΦΟ ελαιόλαδου πραγματοποιήθηκε επίσης με φασματοφωτομέτρηση στα 410 nm και αντιστοιχήθηκε με τη δημιουργία φαινολών που δημιουργούνται από τη δραση του ενζύμου στο υπόστρωμα. Αναλυτικότερα σε κυψελίδα προστέθηκαν 100 μl από το ενζυμικό εκχύλισμα μαζί με 900μL από 6.7mM 4-methyl-catechol σε 50mM buffer sodium citrate με ph=6.2. Μετρήθηκε η μεταβολή της απορρόφησης για χρόνο t>5min. Η κλίση της καμπύλης Απορρόφησης χρόνου σε κάθε περίπτωση συσχετίστηκε με τη δραστικότητα του ενζύμου.
Ανεπεξέργαστο Επεξεργασμένο με ΥΠ 200MPa/1min 200MPa/5min 600MPa/1min 600MPa/5min Θρυμματισμός Μάλαξη Φυγοκέντρηση Επεξεργασμένο με ΠΗΠ 1,8kV/cm, 300 Hz, 16,3kV, με 1kJ-4kJ-6kJ-15kJ και 21kJ Λιποξυγενάση & Πολυφαινολοξειδάση Ελαιόλαδο Σχήμα 1 Διάγραμμα ροής για την εξαγωγή ελαιολάδου από καρπό ελιάς
Η επεξεργασία των ελιών με νέες τεχνολογίες όπως ΥΠ και ΠΗΠ οδήγησε σε μείωση της δραστικότητας των ενδογενών ενζύμων ΛΟΞ και ΠΦΟ. Πιο συγκεκριμένα, για την ΛΟΞ, η ΥΠ είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της εναπομένουσας δραστικότητας σε όλες τις ποικιλίες ελιών που μελετήθηκαν, ανάλογα και με την ένταση των συνθηκών επεξεργασίας. Στις πιο έντονες συνθήκες ΥΠ που εφαρμόστηκαν (600 ΜPa, 5 min) σημειώθηκε μείωση της δραστικότητας της ΛΟΞ άνω του 80% σε σύγκριση με ανεπεξέργαστες ελιές. Ακόμα και σε πιο χαμηλές πιέσεις (200 MPa) και χρόνους επεξεργασίας όμως (1 min), η εναπομένουσα δραστικότητα κυμάνθηκε από 10 έως 60% της αρχικής ανάλογα και με την ποικιλία της ελιάς. Το ελαιόλαδο από Κορωνέικη ποικιλία ελιάς φαίνεται να περιέχει τη λιγότερο ανθεκτική ΛΟΞ σε σύγκριση με τις άλλες μελετώμενες ποικιλίες, ενώ η ποικιλία Τσουνάτη την περισσότερο ανθεκτική. Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε και για τα ένζυμα ελαιολάδου από ελιές επεξεργασμένες με ΠΗΠ. Η συνολική ενέργεια με την οποία επεξεργάζονται τα δείγματα φαίνεται ότι έχει επίδραση στην εναπομένουσα δραστικότητα της ΛΟΞ, με μείωση της μετρούμενης δραστικότητας σε εντονότερες συνθήκες. Όπως στην περίπτωση της ΥΠ, έτσι και στα ΠΗΠ φαίνεται ότι υπάρχει διαφορετική συμπεριφορά μεταξύ ίδιων ενζύμων προερχόμενων από διαφορετικές ποικιλίες ελιάς. Πιο συγκεκριμένα, στην Κορωνέικη ποικιλία η ΛΟΞ φαίνεται να είναι πολύ ευαίσθητη ώστε ακόμη και μετά από επεξεργασία με ΠΗΠ σε 1kJ να είναι ουσιαστικά στα όρια της μέτρησης της μεθόδου. Αντίθετα, στις άλλες τρεις ποικιλίες η ένταση των ΠΗΠ παίζει σημαντικό ρόλο στην απενεργοποίηση με τη ΛΟΞ από ποικιλία Αμφίσσης να εμφανίζεται ως η πλέον ανθεκτική. Συγκρίνοντας τις δύο διαφορετικές τεχνολογίες, δεν παρατηρήθηκε κάποια από τις τεχνολογίες να υπερτερεί έναντι της άλλης όσον αφορά την ανθεκτικότητα της ΛΟΞ. Στην ποικιλία Τσουνάτη η ΥΠ φαίνεται να επηρεάζει λιγότερο τη ΛΟΞ από τα ΠΗΠ, ενώ στην ποικιλία Μανάκι η ΥΠ υπερτερεί σε όλες τις μελετώμενες συνθήκες έναντι των ΠΗΠ. Σχήμα 2. Επίδραση των τεχνολογιών Παλλόμενων Ηλεκτρικών Πεδίων και Υπερυψηλής Πίεσης στην εναπομένουσα δραστικότητα της Λιποξιγενάσης Παρόμοια συμπεριφορά παρουσίασε και η απενεργοποίηση της ΠΦΟ στις ποικιλίες που μελετήθηκαν με διαφορετική ανθεκτικότητα στις εξεταζόμενες τεχνολογίες συγκριτικά με τη ΛΟΞ, ανάλογα και με την ποικιλία. Πιο συγκεκριμένα, η μεγαλύτερη απενεργοποίηση και με εφαρμογή των δύο τεχνολογιών παρατηρήθηκε στα ένζυμα του ελαιολάδου από ποικιλία Μανάκι, σε αντίθεση με τη ΛΟΞ που παρόμοια συμπεριφορά βρέθηκε για την ποικιλία Κορωνέικη. Συνολικά, τα ΠΗΠ φαίνεται να έχουν λιγότερη επίδραση στην ΠΦΟ σε σύγκριση με τη ΛΟΞ, αφού ακόμα και στις πιο έντονες συνθήκες επεξεργασίας (21kJ) εμφανίζεται εναπομένουσα δραστικότητα που κυμαίνεται από 35-60% (ανάλογα με την ποικιλία). Η ΥΠ φάνηκε να απενεργοποιεί σε μεγαλύτερο ποσοστό την ΠΦΟ από τα ΠΗΠ, εκτός από την περίπτωση της ποικιλίας Αμφίσσης, όπου ακόμα και μετά από επεξεργασία στα 600MPa-5min μετρήθηκε υπολειπόμενη δραστικότητα
άνω του 40%. Παρότι πρόκειται και σε αυτή την περίπτωση για το ίδιο ένζυμο (ΠΦΟ), η προερχόμενη ποικιλία ελιάς του ελαιολάδου παίζει σημαντικό ρόλο στην ανθεκτικότητα του. Σχήμα 3 Επίδραση των τεχνολογιών Παλλόμενων Ηλεκτρικών Πεδίων και Υπερυψηλής Πίεσης στην εναπομένουσα δραστικότητα της Πολυφαινολικής οξειδάσης Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα που ελήφθησαν και για τα δυο ένζυμα (ΠΦΟ και ΛΟΞ) δείχνουν ότι η προέλευση του ελαιολάδου (ποικιλία ελιάς) είναι σημαντική κατά την επεξεργασία με ΥΠ και ΠΗΠ, μιας και ίδια ένζυμα έχουν διαφορετική συμπεριφορά. Η μεγαλύτερη δυνατή απενεργοποίηση και στα δύο ένζυμα δυνητικά θα οδηγήσει σε ένα σταθερότερο προϊόν στο χρόνο αποθήκευσης. Αυτό θα επιβεβαιωθεί με περαιτέρω έρευνα διατηρισμότητας. Προκαταρκτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι το ελαιόλαδο που έχει εξαχθεί από ποικιλίες Κορωνέικη και Μανάκι με επεξεργασία με ΥΠ φαίνεται διατηρεί άριστα ποιοτικά του χαρακτηριστικά για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Βιβλιογραφία Eduardo Puértolas and Iñigo Martínez de Marañón, 2015 Olive oil pilot-production assisted by pulsed electric field: Impact on extraction yield chemical parameters and sensory properties, Food Chemistry (167) 2015 497-502 M. Abenoza, M. Benito, G. Saldaña, I. Álvarez, J. Raso, A.C. Sánchez-Gimeno, 2013 Effects of pulsed electric field on yield extraction and quality of olive oil, Food and Bioprocess Technology, 6 (2013), pp. 1367 1373 M.D. Georgalaki, T.G. Sotiroudis*, and A. Xenakis, 1998, The Presence of Oxidizing Enzyme Activities in Virgin Olive Oil Industrial Enzymology Unit, Institute of Biological Research and Biotechnology, The National Hellenic Research Foundation, Greece Ευχαριστίες Η παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: ΑΡΙΣΤΕΙΑ ΙΙ.