ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΩΝ ΙΩΣΕΩΝ

Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β, Τόμος 15, Τεύχος 2, σελ. 54-60 2010 ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΤΩΝ ΙΩΣΕΩΝ Μ. ΓΙΑΝΝΑΚΗ-ΨΙΝΑΚΗ Η ευαισθησία, η ειδικότητα, η θετική και αρνητική προγνωστική αξία, η επαναληψιμότητα, η χρονική διάρκεια εκτέλεσης της διαδικασίας και το οικονομικό κόστος, αποτελούν ιδιότητες μιας διαγνωστικής τεχνικής με βάση τις οποίες γίνεται η επιλογή για να εφαρμοστούν στη διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων. Ο εργαστηριακός έλεγχος περιλαμβάνει την αναζήτηση του ιού και αντισωμάτων έναντι αυτού, την τυποποίηση και τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντι-ιικά φάρμακα. Στα κλινικά εργαστήρια συνήθως η διάγνωση γίνεται με εξετάσεις αντιγόνων, αντισωμάτων ή και γονιδιώματος του ιού. Στα ερευνητικά εργαστήρια ή τα κέντρα αναφοράς επιπλέον εφαρμόζονται η ηλεκτρονική μικροσκόπηση και η κυτταροκαλλιέργεια. Οι μέθοδοι γονιδιωματικής και πρωτεομικής είναι προς το παρόν απαγορευτικά ακριβές για τα διαγνωστικά εργαστήρια ρουτίνας. Για την εκτίμηση και την ασφάλεια των αποτελεσμάτων κάθε τεχνικής είναι απαραίτητη η εφαρμογή εσωτερικού και εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου. (Λέξεις ευρετηρίου: αξιολόγηση εργαστηριακών διαγνωστικών μεθόδων, νέες τεχνικές, ανίχνευση, τυποποίηση, έλεγχος ευαισθησίας ιών). Στο άρθρο αυτό παρουσιάζονται οι αρχές των διαγνωστικών μεθόδων που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη διάγνωση των ιογενών λοιμώξεων. Επίσης οι παράμετροι αξιολόγησης για την επιλογή της τεχνικής που πρέπει να ε- φαρμοσθεί στην κάθε περίπτωση, καθώς και οι τρόποι ελέγχου της ποιότητας του αποτελέσματος. Οι ιδιότητες βάσει των οποίων επιλέγεται μία μέθοδος για να εφαρμοστεί στο διαγνωστικό εργαστήριο είναι: η ευαισθησία, η ειδικότητα, η προγνωστική αξία, η επαναληψιμότητα, η Μικροβιολογικό Τμήμα του Νοσοκομείου Παίδων «Η Αγία Σοφία» χρονική διάρκεια της διαδικασίας, η δυνατότητα εκτέλεσης μεμονωμένων εξετάσεων και οπωσδήποτε το κόστος. Με τον όρο ευαισθησία (sensitivity) ορίζεται το ποσοστό των ατόμων με την ιογενή λοίμωξη που βρίσκονται θετικά με τη συγκεκριμένη δοκιμή ή ο αριθμός των θετικών απαντήσεων σε εκατό πάσχοντες. Πρακτικά μία δοκιμή είναι τόσο πιο ευαίσθητη όσο λιγότερα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα δίνει. Με τον όρο ειδικότητα (specificity) ορίζεται το ποσοστό των ατόμων χωρίς την ιογενή λοίμωξη που βρίσκονται αρνητικά με τη συγκεκριμένη δοκιμή ή κατ άλλη διατύπωση ο αριθμός των αρνητικών απαντήσεων σε εκατό μη πάσχοντες.

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 55 Πίνακας 1. Υπολογισμός των παραμέτρων αξιολόγησης μιας δοκιμής. Ευαισθησία (sensitivity) Ειδικότητα (specificity) Θετική προγνωστική αξία (Positive Predictive Value) Αρνητική προγνωστική αξία (Negative Predictive Value) Πρακτικά μια δοκιμή είναι τόσο πιο ειδική όσο λιγότερα ψευδώς θετικά αποτελέσματα παρέχει. Κατά την ανάπτυξη μιας τεχνικής καθορίζεται το όριο (cut-off) μεταξύ αρνητικού και θετικού αποτελέσματος. Όσο υψηλότερα τοποθετείται το όριο αυτό η τεχνική γίνεται λιγότερο ευαίσθητη αλλά πιο ειδική, πράγμα που σημαίνει ότι είναι δυνατόν να διαφύγουν τη διάγνωση κάποιοι πάσχοντες, θα εξάγονται όμως λιγότερα ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Το αντίθετο θα συμβαίνει αν το όριο τοποθετηθεί χαμηλότερα. Το cut-off θα πρέπει επίσης να προσδιορίζεται χωριστά για κάθε πληθυσμό π.χ. τον παιδιατρικό ή των ενηλίκων. Η προγνωστική αξία (Predictive Value) εκφράζει πιθανότητα. Ως θετική προγνωστική αξία ορίζεται η πιθανότητα να πάσχει από την ιογενή λοίμωξη ασθενής με θετικά αποτέλεσμα δοκιμής, δηλαδή η πιθανότητα να είναι αληθινό το θετικό αποτέλεσμα. Αντίστοιχα ως αρνητική προγνωστική αξία ορίζεται η πιθανότητα να μη νοσεί άτομο με αρνητικό αποτέλεσμα, η πιθανότητα δηλαδή να είναι αληθινό το αρνητικό αποτέλεσμα. Στον Πίνακα 1 αναγράφονται οι τύποι υ- πολογισμού των παραμέτρων αξιολόγησης. Οι υπολογισμοί στηρίζονται στην εφαρμογή της προς εκτίμηση τεχνικής σε πληθυσμούς υγιών (αληθώς αρνητικό αποτέλεσμα) και πασχόντων (αληθώς θετικό αποτέλεσμα). Καταργείται ε- πομένως η σύγκριση μιας μεθόδου με άλλη που θεωρείται «χρυσό πρότυπο» (Gold standard), γιατί καμία μέθοδος δεν είναι τέλεια. Οι όροι αληθώς/ψευδώς θετικό/αρνητικό αποτέλεσμα αναφέρονται σε πάσχοντα ή όχι από τη λοίμωξη άτομα σύμφωνα με κλινικά, επιδημιολογικά και λοιπά εργαστηριακά κριτήρια. Στην αποδοχή του αποτελέσματος υπεισέρχονται και στατιστικά στοιχεία κυριότερο των οποίων είναι η συχνότητα του νοσήματος στον πληθυσμό που ανήκει ο εξεταζόμενος ασθενής. Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει να δίνεται με ιδιαίτερη προσοχή το θετικό αποτέλεσμα σε σπάνιο νόσημα. Η επαναληψιμότητα ελέγχεται εξετάζοντας το ίδιο δείγμα δύο τουλάχιστον φορές στην ίδια (intra-assay) ή σε διαφορετικές (inter-assay) μετρήσεις και με υπολογισμό του Συντελεστή Μεταβλητότητας (Coefficient of Variation-CV) %. Για κάθε τεχνική αποδεχόμαστε διαφορετικό CV π.χ. για τις ραδιοανοσολογικές είναι αποδεκτός συντελεστής κάτω του 3%, ενώ για τις ανοσοενζυμικές έως 10%. Εργαστηριακός έλεγχος των ιογενών λοιμώξεων Περιλαμβάνει: την αναζήτηση του ιού, τον προσδιορισμό αντισωμάτων έναντι αυτού, την τυποποίηση του ιού και τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντι-ιικά φάρμακα (Πίνακας 2). Καλλιέργεια TP TP+FN TN TN+FP TP TP+FP ΤΝ TN+FN TP=True Positive à Αληθώς θετικό αποτέλεσμα (Ο εξεταζόμενος πάσχει από το νόσημα) FP=False Positive à Ψευδώς θετικό αποτέλεσμα (Ο εξεταζόμενος δεν πάσχει από το νόσημα) x 100% x 100% x 100% x 100% ΤΝ=True Negative à Αληθώς αρνητικό αποτέλεσμα (Ο εξεταζόμενος δεν πάσχει από το νόσημα) FΝ=False Negative à Ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα (Ο εξεταζόμενος πάσχει από το νόσημα) Τα κλινικά δείγματα ενοφθαλμίζονται σε κυτταρικά υποστρώματα και επωάζονται. Οι ιοί πολλαπλασιάζονται και η ανίχνευσή τους βασίζεται στην κυτταροπαθογόνο επίδρασή

56 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Πίνακας 2. Εργαστηριακός έλεγχος ιογενών λοιμώξεων. Ανίχνευση του ιού: Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Κυτταροκαλλιέργεια Αντιγόνο Γονιδίωμα Προσδιορισμός αντισωμάτων (ανοσολογικές μέθοδοι) Τυποποίηση ιών Έλεγχος ευαισθησίας στα αντι-ιικά φάρμακα Μέθοδοι γονιδιωματικής και πρωτεομικής τους (CPE) στα κύτταρα. Η ταυτοποίηση του ιού γίνεται ανάλογα με το είδος και το χρόνο εμφάνισης των αλλοιώσεων, η δε τυποποίηση με τη χρήση ειδικών αντιορών. Η παρουσία του ιού μπορεί να ανιχνευθεί γρηγορότερα (μετά ένα ή δύο 24ωρα από τον ενοφθαλμισμό) με την προσθήκη μονοκλωνικού αντισώματος, σημασμένου με φθορίζουσα χρωστική (shell vial culture), καθώς επίσης και με αιμοσυγκόλληση ή με μοριακή μέθοδο. Η κυτταροκαλλιέργεια δεν εφαρμόζεται στα διαγνωστικά εργαστήρια, αλλά μόνο σε κέντρα αναφοράς για ανίχνευση και τυποποίηση ιών, για έλεγχο ευαισθησίας στα αντι-ιικά φάρμακα και παρασκευή εμβολίων. Προσδιορισμός αντισωμάτων Αναζητούνται ολικά, IgG, IgA και IgM ειδικά αντισώματα. Τα ευρήματα αξιολογούνται σύμφωνα με το διάγραμμα της κινητικής των αντισωμάτων κατά την πρωτολοίμωξη του οργανισμού με τον ιό και κατά πιθανές επόμενες, ως αναμόλυνση ή αναζωπύρωση (Σχήμα 1). Στην πρωτολοίμωξη αναμένονται θετικές αρχικά οι IgM ή και IgA ανοσοσφαιρίνες και λίγο αργότερα οι IgG. Σε επόμενη επαφή με τον ιό, λόγω ενεργοποίησης του μηχανισμού της ανοσιακής μνήμης, οι IgG ανέρχονται αμέσως σε υψηλά επίπεδα, οι IgM σπανιότατα παράγονται σε ανιχνεύσιμα επίπεδα και οι IgA μπορεί να επανεμφανισθούν κυρίως αν πρόκειται για λοίμωξη βλεννογόνων. Επομένως, η παρουσία της IgM δηλώνει πρωτολοίμωξη ενώ της IgA ενεργό δράση ιογενούς λοίμωξης. Οι μέθοδοι προσδιορισμού αντισωμάτων αναγράφονται στον Πίνακα 3. Η σύνδεση συμπληρώματος χρησιμοποιήθηκε ευρέως στο παρελθόν. Η α- ναστολή της αιμοσυγκολλήσεως καθώς και η μέτρηση εξουδετερωτικών αντισωμάτων εφαρμόζονται συνήθως σε εργαστήρια αναφοράς γιατί απαιτούν καλλιέργεια του ιού. Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (Indirect Fluorecent ImmunoAssay-IFA), όπως και οι ραδιοανοσολογικές και οι ανοσοενζυμικές τε- α επαφή με αντιγόνο β επαφή Σχήμα 1. Συνήθης αντισωματική απάντηση στα διάφορα στάδια λοίμωξης.

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 57 Πίνακας 3. Ανοσολογικές μέθοδοι προσδιορισμού αντισωμάτων. Σύνδεση συμπληρώματος Συγκολλητιναντιδράσεις (αναστολή αιμοσυγκολλήσεως) Εξουδετερωτικά αντισώματα Ανοσοφθορισμός Ραδιοανοσολογικές Ανοσοενζυμικές Ανοσοαποτύπωση (WB) Ταχείες δοκιμές ανοσοχρωματογραφία χνικές (Enzyme ImmunoAssay-EIA) ακολουθούν την ίδια αρχή (Σχήμα 2) διαφέρουν μόνο κατά το είδος της σήμανσης. Αναλόγως του αντι-αντισώματος που θα χρησιμοποιηθεί επιτυγχάνεται ο ποσοτικός προσδιορισμός IgG, IgA, IgM ή ολικών αντισωμάτων. Οι ορολογικές τεχνικές σήμανσης έχουν ευρύτατη εφαρμογή στα διαγνωστικά εργαστήρια. Σε αυτή ή σε παραλλαγές τους στηρίζονται τα αυτοματοποιημένα συστήματα ανοσοενζυμικής τεχνικής με τελική σήμανση φθορισμού (ΜΕΙΑ, ELFA) ή με χημειοφωταύγεια (CMIA). Ανοσοαποτύπωση (Western blot, Dot blot). Προηγείται διαχωρισμός των αντιγονικών πρωτεϊνών αναλόγως του μοριακού βάρους και ακολουθεί η ανοσοενζυμική ανίχνευση των αντισωμάτων. Λόγω της υψηλής τους ειδικότητας αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται ως επιβεβαιωτικές. Όμως το υψηλό κόστος είναι μειονέκτημα. Η ανοσοχρωματογραφία χρησιμοποιείται μόνο για την αναζήτηση ετερόφιλων αντισωμάτων στη λοιμώδη μονοπυρήνωση. Προσδιορισμός αντισωμάτων στο Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΕΝΥ) Η παρουσία αντισωμάτων στο ΕΝΥ έναντι ενός ιού αποτελεί ένδειξη τοπικής παραγωγής και επομένως λοίμωξης του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος. Επειδή όμως από μήνιγγες που φλεγμαίνουν διαπερνούν αντισώματα από τον ορό στο ΕΝΥ παθητικά, καταφεύγουμε στη χρήση τύπων π.χ. Γενική αρχή αναζήτησης αντισωμάτων ορός (Αντίσωμα ;) Αντι-αντίσωμα συνδεδεμένο (conjugate) Σχήμα 2. Ανοσολογικές τεχνικές σήμανσης για αναζήτηση αντισωμάτων.

58 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Ειδικά αντισώματα ΕΝΥ/Ειδικά αντισώματα ορού Λευκωματίνη ΕΝΥ/Λευκωματίνη ορού ή Ειδικά αντισώματα ΕΝΥ/Ειδικά αντισώματα ορού IgG ENY/IgG ορού Δείκτης μεγαλύτερος από μονάδα αποτελεί ένδειξη λοίμωξης στο ΚΝΣ. Σήμερα, με τη διάδοση των μοριακών τεχνικών θα πρέπει το ΕΝΥ να εξετάζεται με PCR για γονιδίωμα των ιών που θεωρούνται υπεύθυνοι για τη λοίμωξη. Λειτουργική συγγένεια των αντισωμάτων (Avidity) Με τον όρο αυτό εννοείται η ισχύς σύνδεσης αντιγόνου-αντισώματος, η οποία είναι χαμηλή σε πρόσφατη λοίμωξη και αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου. Υψηλή επομένως λειτουργική συγγένεια δηλώνει παλαιά λοίμωξη, επαναλοίμωξη ή επανενεργοποίηση του ιού. Για τον υπολογισμό της εκτελούμε την ορολογική μέτρηση των αντισωμάτων με ELISA ή IFA με δύο τρόπους: κατά τα γνωστά και παράλληλα με την προσθήκη ουσίας, π.χ. ουρίας που διασπά τους χαλαρούς δεσμούς. Το αποτέλεσμα εκφράζεται ως Avidity Index x 100: Τιμή παρουσία ουσίας Τιμή απουσία ουσίας Προσδιορισμός αντιγόνων x 100% Για την ανίχνευσή τους χρησιμοποιούνται η ανοσοενζυμική δοκιμή, ο άμεσος ανοσοφθορισμός και οι ταχείες τεχνικές. Η ανοσοενζυμική τεχνική δεν είναι κατάλληλη για την εξέταση μεμονωμένων δειγμάτων επειδή η αναμονή για συγκέντρωση δειγμάτων καθυστερεί την εκτέλεση της εξέτασης, άρα και το διαγνωστικό αποτέλεσμα. Ο άμεσος ανοσοφθορισμός (Direct Fluorescent Assay DFA) είναι απλή στην εκτέλεση δοκιμή με υψηλή ειδικότητα λόγω της χρήσης μονοκλωνικών αντισωμάτων συνδεδεμένων με φθορίζουσα χρωστική. Η δυσκολία συνίσταται στην ανεύρεση του «ειδικού» αντιγονικού τμήματος για την παρασκευή του μονοκλωνικού αντισώματος Οι ταχείες δοκιμές αποτελούν πολύ χρήσιμη ομάδα εξετάσεων. Το αποτέλεσμα δίνεται σε λίγα λεπτά, δεν απαιτείται ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός, τα αντιδραστήρια διατηρούνται εκτός ψυγείου και έχουν υψηλή ειδικότητα γιατί χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα. Η ευαισθησία τους ποικίλλει γιατί εξαρτάται από τη συγκέντρωση του αντιγόνου του ιού στο κλινικό δείγμα, καθώς και από το χρόνο και τον τρόπο της λήψης. Οι ταχείες δοκιμές σχεδιάστηκαν με το σκοπό να χορηγείται το αποτέλεσμα γρήγορα, «παρά την κλίνην» του ασθενούς (bedside tests). Αναφέρεται ότι πιο αξιόπιστα αποτελέσματα προκύπτουν ό- ταν εκτελούνται από εργαστηριακούς ιατρούς. Φαίνεται ότι παρά την απλή τους διαδικασία, η εξοικείωση με τις εργαστηριακές τεχνικές είναι χρήσιμη. Γι αυτό σε χώρες με οργανωμένα συστήματα περίθαλψης (π.χ. Καναδάς) οι κλινικοί ιατροί, νοσηλευτές και τεχνολόγοι ακολουθούν προγράμματα συνεχούς εκπαίδευσης και συμμετέχουν υποχρεωτικά σε προγράμματα ποιοτικού ελέγχου. Η ανοσοχρωματογραφία είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται σήμερα για την ταχεία ανίχνευση ιικών αντιγόνων. Κατ αρχήν το αναζητούμενο αντιγόνο συνδέεται με μονοκλωνικό αντίσωμα συνδεδεμένο με κολλοειδή χρυσό και στο σημείο της καθήλωσης εμφανίζεται χρώμα. Μοριακές μέθοδοι Παραλλαγές της PCR που χρησιμοποιούνται στα διαγνωστικά εργαστήρια είναι: α) η πραγματικού χρόνου (Real-time), που παρέχει τη δυνατότητα ποσοτικής μέτρησης, δηλαδή προσδιορισμό του ιικού φορτίου, β) η πολλαπλή (Multiplex), για ταυτόχρονη ανίχνευση

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 59 διαφόρων ιών με τη χρήση περισσοτέρων του ενός ζευγών εκκινητών, γ) η διπλή ή εμφωλεάζουσα (Nested) για αύξηση της ευαισθησίας και της ειδικότητας και δ) η ανάστροφης τρανσκριπτάσης (RT-PCR) για ανίχνευση των RNA ιών. Οι μοριακές τεχνικές εφαρμόζονται για ανίχνευση ιών, μέτρηση του ιικού φορτίου, έλεγχο ευαισθησίας στα αντι-ιικά φάρμακα και τυποποίηση στελεχών με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων (sequencing). Μέθοδοι γονιδιωματικής και πρωτεομικής (Genomics-Proteomics) Αποτελούν την πιο σύγχρονη διαγνωστική μέθοδο που επιτρέπει τον ταυτόχρονο προσδιορισμό γονιδίων και πρωτεϊνών που εκφράζονται. Με τον τρόπο αυτό αναζητούνται ταυτόχρονα πολλοί ιοί ή στελέχη ιών. Η διαδικασία είναι σχετικά απλή, απαγορευτικά δαπανηρή όμως για ένα διαγνωστικό εργαστήριο, τουλάχιστον προς το παρόν. Στην ελληνική αγορά κυκλοφορούν αντιδραστήρια με τα οποία δίνεται η δυνατότητα προσδιορισμού στο ΕΝΥ, ταυτόχρονα και χωριστά, όλων των ερπητοϊών 1-6 (HSV 1 και 2, VZV, EBV, CMV, HHV-6,7 και 8), καθώς και εντεροϊών (Coxsackie-, Polio- και Enterovirus). Επίσης σε δείγμα αναπνευστικού είναι δυνατή η ανίχνευση Influenza A, B και C, Parainfluenza 1, 2, 3, 4, 4a και 4b, RSV Α και Β, Rhino-, Adeno-, Echo-, Boca-, Corona-, & Metapneumovirus A και Β). Έλεγχος ποιότητας των διαγνωστικών δοκιμών (Quality Control) Όλες οι δοκιμές που εφαρμόζονται στη διαγνωστική των ιογενών λοιμώξεων πρέπει να ελέγχονται για την ποιότητα του αποτελέσματος. Για τον εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο χρησιμοποιούνται δείγματα γνωστής περιεκτικότητας που περιλαμβάνονται στη συσκευασία των αντιδραστηρίων ή που παραγγέλλονται χωριστά. Τα δείγματα είναι θετικά ή αρνητικά όταν αφορούν ποιοτικές εξετάσεις και συγκεκριμένου εύρους τιμών όταν αφορούν ποσοτικές. Για τον εξωτερικό ποιοτικό έλεγχο χρησιμοποιούνται δείγματα άγνωστης περιεκτικότητας τα οποία παρέχονται από οίκους του εξωτερικού και πρέπει να εξετάζονται όπως ακριβώς των ασθενών. Σημειώνεται η διαγνωστική μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε, τα αποτελέσματα και η κλινική ερμηνεία και αποστέλλονται στην προμηθεύτρια εταιρεία. Εκεί αξιολογούνται μαζί με τα αποτελέσματα και άλλων εργαστηρίων που συμμετέχουν στο πρόγραμμα. Όλα τα δεδομένα, μαζί με χρήσιμα σχόλια, αποστέλλονται μετά από μικρό χρονικό διάστημα ταχυδρομικά και ηλεκτρονικά, στα εργαστήρια. Συνοψίζοντας, οι εξετάσεις αναζήτησης α- ντιγόνων είναι χρήσιμες στην οξεία φάση μιας ιογενούς λοίμωξης και πραγματοποιούνται με ταχείες τεχνικές, ανοσοχρωματογραφία και ά- μεσο ανοσοφθορισμό. Εφαρμόζονται ευρύτατα στις λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος. Δείγμα πρέπει να εξετάζεται το νωρίτερο δυνατό από την έναρξη των συμπτωμάτων. Οι εξετάσεις αντισωμάτων εφαρμόζονται στα περισσότερα εργαστήρια και αποτελούν το συνήθη τρόπο διάγνωσης πολλών ιογενών λοιμώξεων κυρίως. Το δείγμα θα πρέπει να λαμβάνεται αρκετές ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων, αν και με τις νέες τεχνικές είναι δυνατόν να ανιχνευθεί η IgM ακόμη και από την 3η-4η ημέρα της νόσου. Η δοκιμή Avidity αποτελεί συμπληρωματική εξέταση και προϋποθέτει υψηλή IgG ειδική ανοσοσφαιρίνη. Οι μοριακές τεχνικές κερδίζουν δικαίως ό- λο και μεγαλύτερο μέρος στη διάγνωση, επειδή όμως ανιχνεύουν γονιδίωμα και νεκρού ιού θα πρέπει να αξιολογούνται ανάλογα. Η γνώση των δυνατοτήτων και περιορισμών των εργαστηριακών δοκιμών, ο σωστός σχεδιασμός των εργαστηριακών εξετάσεων, ο ποιοτικός έλεγχος και κυρίως η συνεργασία με τον κλινικό, οδηγούν στο καλύτερο αποτέλεσμα που θα ωφελήσει ουσιαστικά τον ασθενή.

60 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Διεύθυνση Επικοινωνίας: Μ. Γιαννάκη-Ψινάκη Βιοπαθολόγος, Αναπληρώτρια Διευθύντρια Μικροβιολογικού Τμήματος, Νοσοκομείου Παίδων «Η Αγία Σοφία» Summary M. GIANNAKI-PSINAKI Current laboratory diagnosis of viral infections Department of Microbiology «Agia Sofia» Athens Children s Hospital Applied Clinical Microbiology The selection of methods that a laboratory carries out for the diagnosis of viral infections is based on the sensitivity, specificity, positive and negative predictive value, the duration of the process and the cost of the test. The common laboratory diagnosis includes serological and molecular (PCR) techniques. Electron microscopy and cellculture and performed only be reference laboratories. Genomics and proteomics have been too expensive for routine diagnosis. at least until now. This article is a brief account of the principles and utility of these tests. Internal as well as external control are necessary for the evaluation of any methods used. (Key words: principles and application of laboratory techniques to diagnostic virology). ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, 9th Edition. 2. Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική. Τόμος 14, Τεύχος 2, 2009. 3. Mandell, Douglas and Bennett s Principles and Practice of Infectious Diseases, Seventh Edition, 2010. 4. Manual of Clinical Laboratory Immunology, ASM Press, Fifth Edition 2005. 5. Ζησιμόπουλος ΑΣ. Κλινικές εφαρμογές πυρηνικής ιατρικής. Εκδ. Πασχαλίδης, Αθήνα 2004. ΣΩΣΤΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΙΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟΥ ΤΕΥΧΟΥΣ Ερώτηση 1η A+B: (η παρουσία IgM και η χαμηλή avidity) Ερώτηση 2η Β+Γ: (μέτρηση της IgG avidity και PCR αμνιακού) Ερώτηση 3η Ε: (και οι τρεις παράγοντες, χρόνος, ηλικία, είδος δείγματος) Ερώτηση 4η Γ: (Rhinovirus)

Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β, Τόμος 15, Τεύχος 2, σελ. 61-73 2010 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΙΟΓΕΝΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Κ. ΚΑΛΛΕΡΓΗ Η έγκαιρη αιτιολογική διάγνωση των αναπνευστικών ιών είναι πρόκληση για το σύγχρονο κλινικό εργαστήριο. Ιοί που προκαλούν συχνά σοβαρές λοιμώξεις (influenza, parainfluenzα, RSV, και adenovirus) είναι εύκολα ανιχνεύσιμοι ακόμη και με τις συμβατικές μεθόδους. Το εργαστήριο που έχει πρόσβαση σε μοριακές τεχνικές, είναι σε θέση να ανιχνεύσει τους picorna και corona-ιούς, οι οποίοι προκαλούν ήπιες, αλλά πολύ συχνές λοιμώξεις. Μετά το 2000, ανιχνεύονται με τις μοριακές τεχνικές και νέα παθογόνα, όπως ο hmpv, ο ΗBoV, και οι νέοι corona-ιοί. Περιγράφονται αναλυτικά οι τεχνικές ανίχνευσης αντιγόνου, ιικού γονιδιώματος, και των ειδικών αντισωμάτων, καθώς και οι εφαρμογές τους στη διάγνωση των αναπνευστικών ιών που απασχολούν συχνότερα τα κλινικά εργαστήρια. (Λέξεις ευρετηρίου: αναπνευστικοί ιοί, εργαστηριακή διάγνωση, ανίχνευση αντιγόνου, μοριακές τεχνικές, ανίχνευση αντισωμάτων). Εισαγωγή Οι λοιμώξεις του αναπνευστικού είναι στην πλειονότητά τους ιογενείς με υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας σε παγκόσμια κλίμακα. Οι ιοί που προσβάλλουν το αναπνευστικό είναι πολλοί και ανήκουν σε ποικίλες οικογένειες (Πίνακας 1). Διάφορες άλλες ομάδες ιών που δεν ανήκουν στους «αναπνευστικούς», είναι συχνά αίτια οξείας αναπνευστικής νόσου (ερπητοϊοί, ιός της ιλαράς, Hantavirus, HIV). Οι ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού έχουν ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά. Οι Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων «Π. & Α. Κυριακού». πρωτολοιμώξεις εμφανίζονται νωρίς κατά τη βρεφική και νηπιακή ηλικία, με ποικιλία κλινικών εκδηλώσεων και συνήθως περιορίζονται στο αναπνευστικό σύστημα. Οι επαναλοιμώξεις παρουσιάζουν μικρότερη κλινική βαρύτητα ή είναι ασυμπτωματικές. Σοβαρές λοιμώξεις συμβαίνουν στις ακραίες ηλικίες, σε άτομα με υποκείμενο νόσημα και σε ανοσοκαταστολή. Η μετάδοση γίνεται κυρίως με εισπνοή μολυσμένων σταγονιδίων, αλλά και με άμεση επαφή 1. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει σημαντικά βήματα στη διάγνωση και τη θεραπεία των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού, με την ανάπτυξη νέων ευαίσθητων τεχνικών ανίχνευσης και την παραγωγή αντι-ιικών φαρμάκων. Η αιτιολογική διάγνωση κρίνεται απαραίτητη και

62 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Πίνακας 1. Ιογενή αίτια αναπνευστικών λοιμώξεων. Οικογένεια Orthomyxoviridae Influenzavirus Influenza A Influenza B Influenza C Paramyxoviridae Paramyxovirinae PIV1, PIV2, PIV3, PIV4 Pneumovirinae RSV hmpv Adenoviridae Mastadenovirus 47 ορότυποι Picornaviridae Rhinovirus >100 ορότυποι Enterovirus 62 ορότυποι HPeV 2 ορότυποι Coronaviridae Coronavirus 5 είδη Parvoviridae Bocavirus HBoV Μη «αναπνευστικοί» ιοί HSV, CMV, EBV, VZV, HHV6 Hantavirus, measles, HIV επιβάλλεται στα νεογνά, τους υπερήλικες και σε κάθε περίπτωση ανοσοκαταστολής, όπου η λοίμωξη συνήθως εμφανίζεται με αυξημένη βαρύτητα 1. Η έγκαιρη διάγνωση μπορεί να βοηθήσει στη διακοπή της θεραπευτικής αγωγής με αντιβιοτικά και τη χορήγηση της ειδικής αντι-ιικής θεραπείας. Επιπλέον εμποδίζεται η διασπορά της λοίμωξης στο νοσοκομείο και διευκολύνεται η επιδημιολογική επιτήρηση. Σημαντική είναι επίσης η μείωση του κόστους και των ημερών νοσηλείας του ασθενούς 2. Η εργαστηριακή διερεύνηση των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού 3 γίνεται με: 1. Ανίχνευση του αντιγόνου του ιού στο κλινικό δείγμα 2. Ανίχνευση του ιικού γονιδιώματος με μοριακές τεχνικές 3. Ανίχνευση των ειδικών αντισωμάτων στον ορό. Η απομόνωση του ιού με καλλιέργεια και η ακόλουθη ταυτοποίησή του, παραμένει σε χρήση στα κέντρα αναφοράς και εξυπηρετεί ερευνητικούς και επιδημιολογικούς σκοπούς. Είναι πολύ δύσκολο, αν όχι αδύνατο, ένα κλινικό εργαστήριο να μπορεί να εφαρμόσει στη ρουτίνα του, τόσο τη συμβατική καλλιέργεια, όσο και την ταχεία παραλλαγή της (shell vial τεχνική) με τη στενότητα χώρου και την έλλειψη προσωπικού που υπάρχει συνήθως στη χώρα μας. Συλλογή και επεξεργασία κλινικού δείγματος Οι αναπνευστικοί ιοί προσβάλλουν και πολλαπλασιάζονται αρχικά στα επιθηλιακά κύτταρα του οπίσθιου ρινοφάρυγγα και το ιικό φορτίο στην περιοχή αυτή είναι υψηλό στην αρχή της λοίμωξης. Το υλικό εκλογής για τη διάγνωση είναι το ρινικό και το ρινοφαρυγγικό έκπλυμα, ιδιαίτερα όταν πρόκειται να ακολουθήσει ανίχνευση του αντιγόνου 4. Η λήψη του στα παιδιατρικά νοσοκομεία είναι καθημερινή πράξη ρουτίνας στα νεογνά και βρέφη, αλλά δύσκολη και ενοχλητική διαδικασία σε μεγαλύτερα παιδιά και ενήλικες. Τα επιχρίσματα θεωρούνται λιγότερο κατάλληλα γιατί περιέχουν μικρότερο αριθμό κυττάρων και χαμηλότερο ιικό φορτίο 5, αλλά αποτελούν την πλειονότητα των δειγμάτων από ενήλικες και θρομβοπενικούς ασθενείς. Αποδεκτά κατά περίπτωση είναι και τα τραχειακά και βρογχοκυψελιδικά εκπλύματα, ενώ σε σπάνιες περιπτώσεις το

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 63 δείγμα είναι εξίδρωμα από τον επιπεφυκότα, υγρό παρακέντησης τυμπανικού υμένα ή παραρρινίων κόλπων. Το άριστο δείγμα είναι αυτό που συλλέγεται τις τρεις πρώτες ημέρες της νόσου, όταν ο ιός απεκκρίνεται σε μεγάλες ποσότητες. Η απέκκριση παρατείνεται για εβδομάδες ή και μήνες σε παιδιά με πρωτολοίμωξη ή σε περιπτώσεις ανοσοκαταστολής. Τα εκπλύματα μεταφέρονται σε στείρο δοχείο και τα επιχρίσματα στο ειδικό υλικό μεταφοράς ιών (Viral Transporτ Medium-VTM), ή σε στείρο φυσιολογικό ορό. Οι εταιρείες παραγωγής διαγνωστικών αντιδραστηρίων συχνά παρέχουν ή αναφέρουν το συμβατό με την τεχνική τους υλικό μεταφοράς 4. Η μεταφορά στο εργαστήριο γίνεται χωρίς καθυστέρηση. Το δείγμα μπορεί να παραμείνει στους 4 C για 96 ώρες και στους 70 C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Η επεξεργασία του δείγματος εξαρτάται από τη διαγνωστική δοκιμασία που θα ακολουθήσει. Η παρουσία βλέννας μπορεί να επηρεάσει σε σημαντικό βαθμό το αποτέλεσμα της ανίχνευσης του αντιγόνου, τόσο με τον ανοσοφθορισμό, όσο και με τις ανοσοενζυμικές τεχνικές. Η απομάκρυνσή της γίνεται με διάφορους τρόπους προαναλυτικά 4. Αν επιλεγεί η RT-PCR για τη διάγνωση, ο τρόπος παραλαβής και εκχύλισης του RNA θα πρέπει να το προφυλάσσει από τις νουκλεάσες του περιβάλλοντος. Παράλληλα με το δείγμα για τις άμεσες τεχνικές λαμβάνεται το πρώτο δείγμα ορού (οξείας φάσης) και προγραμματίζεται η λήψη ενός δεύτερου (ορός ανάρρωσης) μετά από 2-3 εβδομάδες για τον έλεγχο της ορομετατροπής. Εναλλακτικά, αν δεν υπάρχει ορός οξείας φάσης, ελέγχεται ένα δείγμα ορού για την παρουσία της ειδικής IgM ή IgA μετά την πρώτη εβδομάδα της νόσου. Ανίχνευση αντιγόνου Είναι η πρώτη μέθοδος διαγνωστικής προσέγγισης των αναπνευστικών ιών στα νοσοκομειακά εργαστήρια, με τη μορφή του ανοσοφθορισμού (FA) ή της ανοσοενζυμικής τεχνικής (EIA) 6. Η ευαισθησία των μεθόδων ανίχνευσης αντιγόνου παρουσιάζει μεγάλες διακυμάνσεις και εξαρτάται από τον τύπο του δείγματος, το χρόνο συλλογής του, την ηλικία του ασθενούς και τις ιδιαιτερότητες κάθε ιού. Γενικά, τα εκπλύματα δίνουν καλύτερα αποτελέσματα α- πό τα επιχρίσματα και τα παιδιά απεκκρίνουν τους ιούς σε υψηλότερους τίτλους και για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα συγκριτικά με τους ενήλικες 5-9. Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ), είναι οι πιο δημοφιλείς. Η κλασική ΕΙΑ σε πλάκα μικροτιτλοποίησης δεν είναι εύχρηστη παρά μόνο σε εργαστήρια που ελέγχουν μεγάλο αριθμό δειγμάτων καθημερινά. Οι γρήγορες παραλλαγές της (ΕΙΑ μεμβράνης και ανοσοχρωματογραφία) είναι πολύ πρακτικές. Είναι ταχύτατες (15-30 ), πολύ απλές στην εκτέλεση και δεν α- παιτούν ειδικό εξοπλισμό. Είναι κατάλληλες ακόμη και για δείγματα που έχουν φυλαχθεί στην κατάψυξη. Οι περισσότερες έχουν εσωτερικό μάρτυρα για τον έλεγχο της σωστής εκτέλεσης της δοκιμασίας 10. Υπάρχουν εμπορικά αντιδραστήρια για την ανίχνευση των ιών της γρίπης (influenza A και Β) και του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού (RSV) 6. Πρόσφατα κυκλοφόρησαν αντιδραστήρια ανοσοχρωματογραφίας για τον αδενοϊό και τον ανθρώπειο μεταπνευμονοϊό (hmpv). Είναι δύσκολο να προσδιοριστεί με ακρίβεια η ευαισθησία και η ειδικότητα των ανοσοενζυμικών τεχνικών, γιατί οι συγκριτικές μελέτες που υπάρχουν έχουν διαφορετικό σχεδιασμό, πληθυσμό ελέγχου και μέθοδο αναφοράς. Tο ελάχιστο ιικό φορτίο που ανιχνεύεται είναι 10 5-10 6 ιικά σωματίδια 6. Κατά την περίοδο της υψηλής επίπτωσης των αναπνευστικών ιών στην κοινότητα, η ειδικότητα των ανοσοενζυμικών τεχνικών είναι υψηλή. Η ειδικότητα και η θετική διαγνωστική αξία (PPV) ελαττώνονται σημαντικά όταν εφαρμόζονται εκτός επιδημικής περιόδου. Σε αυτές τις περιπτώσεις το θετικό αποτέλεσμα

64 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία επιβεβαιώνεται με ανοσοφθορισμό ή μοριακή τεχνική 6,7. Ο ανοσοφθορισμός, έμμεσος (DFA) ή ά- μεσος (IFA), είναι πιο αξιόπιστος από τις ανοσοενζυμικές 6. Υπάρχουν εμπορικά αντιδραστήρια μεμονωμένα ή πολλαπλά (σε ομάδες), που ανιχνεύουν τους επτά κλασικούς α- ναπνευστικούς ιούς (influenza A και B, RSV, adenovirus και parainfluenza 1,2,3) και τον hmpv, με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (mabs) σημασμένων με φθοριόχρωμα. Η ευαισθησία της δεξαμενής των αντισωμάτων (pool) είναι 80% στο σύνολο των ιών που εξετάζονται, ενώ διαφέρει σημαντικά ανά ιό 6. Είναι πολύ ικανοποιητική για την influenza και τον RSV, ενώ δεν συμβαίνει το ίδιο για τον αδενοϊό και τους ιούς parainfluenza 1,2,3. Η ειδικότητα είναι εξαιρετική για όλους τους ελεγχόμενους ιούς 6,7. Η σήμανση των mabs με διαφορετικά φθοριοχρώματα στην ίδια δεξαμενή αντιδραστηρίων, επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση και ταυτοποίηση ενός ή περισσότερων ιών στο ίδιο παρασκεύασμα. Υπάρχουν αντιδραστήρια με συνδυασμούς ομάδων ιών και χρησιμοποιούνται ανάλογα με την κλινική εικόνα και την επιδημιολογία τους στην κοινότητα 6. Στον ανοσοφθορισμό υπάρχει δυνατότητα ελέγχου της ποιότητας του δείγματος. Α- παιτείται ένας ελάχιστος αριθμός ακέραιων κροσσωτών επιθηλιακών κυττάρων (20-100) για να θεωρηθεί αποδεκτό 11. Αρκούν 1-2 κύτταρα με ειδικό φθορισμό για να χαρακτηριστεί το δείγμα θετικό, ενώ το αρνητικό αποτέλεσμα είναι επισφαλές σε περίπτωση πτωχού σε κύτταρα δείγματος. Με την κυτταροφυγοκέντρηση συγκεντρώνονται τα κύτταρα στην περίπτωση πτωχού δείγματος, ενώ συγχρόνως διατηρείται η ακεραιότητα και η μορφολογία τους 12. Το είδος και η θέση του φθορισμού στο κύτταρο είναι χαρακτηριστικά για κάθε ιό. Μοριακές τεχνικές Είναι το αναδυόμενο «χρυσό πρότυπο» στη διάγνωση, με ευαισθησία ίση ή και μεγαλύτερη από αυτή της κυτταροκαλλιέργειας. Έ- χουν όριο ανίχνευσης τα 10 ιικά σωματίδια και δεν επηρεάζονται σημαντικά από το είδος και το χρόνο συλλογής του δείγματος 13. Στη διαγνωστική ιολογία, των αναπνευστικών ι- ών, σε ευρεία χρήση είναι η PCR πραγματικού χρόνου (Real -time) και η πολυπλεκτική ή πολλαπλή (Multiplex) PCR, η οποία ανιχνεύει πολλούς ιούς ταυτόχρονα με οικονομία χρόνου και χρήματος 7,14. Οι μοριακές τεχνικές έχουν αποδειχθεί πολλαπλά χρήσιμες και τα τελευταία χρόνια έχουν δημοσιευτεί εκατοντάδες μελέτες, οι οποίες περιγράφουν τις εφαρμογές τους, αναλύουν τα πλεονεκτήματά τους και τις συγκρίνουν με τις συμβατικές μεθόδους διάγνωσης των ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων. Οι μελέτες αυτές έχουν επιβεβαιώσει ότι οι μοριακές τεχνικές συμβάλλουν 13 : 1. Στη βελτίωση της ευαισθησίας ανίχνευσης των ιών από το αναπνευστικό Σε περιπτώσεις όπου οι συμβατικές μέθοδοι είναι διαθέσιμες, αλλά έχουν χαμηλή ευαισθησία, όπως συμβαίνει στις λοιμώξεις από αδενοϊό και ιούς parainfluenza (PIVs). 2. Στη διάγνωση ιών για τους οποίους δεν είναι δυνατή η ανίχνευση αντιγόνου Ανιχνεύονται γνωστά παθογόνα αίτια νόσων του αναπνευστικού, όπως ο PIV4, οι εντεροϊοί, οι ρινοϊοί και οι corona-ιοί 229E και OC43. 3. Στην ανίχνευση νέων αναπνευστικών ιών Πρακτικά η χρήση των μοριακών τεχνικών ανέδειξε ορισμένους ρινοϊούς ως αίτιο μη ειδικής αναπνευστικής νόσου και λοιμώξεων του κατώτερου αναπνευστικού, καθώς και τη συμμετοχή των νέων corona-ιών NL63 και HKUI σε αναπνευστικά σύνδρομα ποικίλης βαρύτητας. Ο ανθρώπινος bocavirus (hbov) αναγνωρίζεται σήμερα ως αίτιο λοιμώξεων του αναπνευστικού στα παιδιά, είτε μόνος είτε σε συνδυασμό με άλλους αναπνευστικούς ιούς.

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 65 4. Στην ανίχνευση μικτών λοιμώξεων Το ποσοστό των μικτών λοιμώξεων αποδείχτηκε πολύ μεγαλύτερο από αυτό που ανιχνεύουν οι λιγότερο ευαίσθητες συμβατικές τεχνικές. Επιπλέον η multiplex PCR συντομεύει τη διαδικασία της διάγνωσης με την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών παθογόνων. Στα μειονεκτήματα των μοριακών τεχνικών θα πρέπει να αναφερθούν ο δαπανηρός εξοπλισμός και το υψηλό κόστος σε αντιδραστήρια και αναλώσιμα. Αν και με τις νεότερες τεχνικές έχει ελαττωθεί ο αριθμός των επιμολύνσεων, υπάρχει η πιθανότητα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, ή αντίθετα ψευδώς αρνητικών, αν υπάρχουν αναστολείς της πολυμεράσης στο δείγμα 13. Ανίχνευση αντισωμάτων Στις ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού οι ορολογικές δοκιμασίες αποτελούν τη δεύτερη και πολλές φορές την τρίτη επιλογή για τη διάγνωση. Η ανίχνευση των αντισωμάτων γίνεται για να διαπιστωθεί η πρόσφατη λοίμωξη, να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα των άμεσων τεχνικών, να ελεγχθεί η ανοσία και σε μερικές περιπτώσεις η αποτελεσματικότητα των εμβολίων 12,15. Επιπλέον διαπιστώνεται η αιτιολογική σχέση του ιού που ανιχνεύτηκε, με τη νόσο. Αυτό ισχύει κυρίως για ιούς που αποικίζουν το ανώτερο αναπνευστικό για μεγάλο χρονικό διάστημα, όπως οι αδενοϊοί και οι εντεροϊοί 16. Η πρόσφατη λοίμωξη ελέγχεται με την ανίχνευση των ειδικών IgM ή IgA ανοσοσφαιρινών σε δείγμα ορού μία εβδομάδα μετά την έναρξη της νόσου. Εναλλακτικά, ελέγχεται η ορομετατροπή σε δύο δείγματα ορού (οξείας φάσης και ανάρρωσης), τα οποία απέχουν χρονικά 2-3 εβδομάδες και εξετάζονται συγχρόνως 1. Ο τετραπλασιασμός του τίτλου των αντισωμάτων ορίζεται ως ορομετατροπή και δηλώνει πρόσφατη λοίμωξη. Έχει μεγάλη αξιοπιστία, αλλά σπάνια χρησιμοποιείται στην κλινική πράξη 9,15. Τα περισσότερα εργαστήρια χρησιμοποιούν τις ανοσοενζυμικές τεχνικές (ELISA) ή τον έμμεσο ανοσοφθορισμό (IFA) για την α- νίχνευση των αντισωμάτων. Οι κλασικές μέθοδοι, όπως η σύνδεση του συμπληρώματος (Complement fixation-cf) και αναστολή της αιμοσυγκόλλησης (Haemagglutination Inhibition- HI) έχουν αποσυρθεί ή χρησιμοποιούνται σε ειδικές περιπτώσεις. Η αναδρομική διάγνωση και οι πιθανές διασταυρούμενες αντιδράσεις μεταξύ των ιών της ίδιας οικογένειας, είναι τα κυριότερα μειονεκτήματα των ορολογικών μεθόδων. Επιπλέον οι ιδιαιτερότητες που υπάρχουν στην ανοσιακή απάντηση στα βρέφη και στους ανοσοκατασταλμένους, ελαττώνουν τη διαγνωστική τους αξία στη συγκεκριμένη ομάδα πληθυσμού. Ιός γρίπης (Influenzavirus) Προκαλεί επιδημίες το χειμώνα από τον Δεκέμβριο έως τον Μάρτιο. Τα ετήσια επιδημικά κύματα οφείλονται στην αντιγονική εκτροπή (drift), αφορούν τους δύο οροτύπους Α και Β και είναι αποτέλεσμα σημειακών μεταλλαγών στα γονίδια της αιμοσυγκολλητίνης (HA) και της νευραμινιδάσης (NA). Οι πανδημίες αφορούν μόνο τη γρίπη Α, οφείλονται στην αντιγονική μεταβολή (shift) και είναι το αποτέλεσμα αντικατάστασης του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης ή και της νευραμινιδάσης. Αυτό συμβαίνει κυρίως με γενετικό ανασυνδυασμό σε ξενιστή που έχει μολυνθεί με δύο ιούς διαφορετικών ειδών 12. Το φάσμα των κλινικών εκδηλώσεων της γρίπης είναι αρκετά ευρύ και κυμαίνεται από τη σχεδόν ασυμπτωματική λοίμωξη έως τη σοβαρή πνευμονία. Ο τύπος Β προκαλεί ηπιότερη νόσο και είναι συχνότερος στα παιδιά. Οι επιπλοκές είναι συχνότερες στις ακραίες ηλικίες και σε άτομα με υποκείμενο νόσημα. Αφορούν κυρίως το αναπνευστικό σύστημα και είναι η μέση ωτίτιδα στα παιδιά και η οξεία βρογχίτιδα στους ενήλικες. Πολύ σοβαρές επιπλοκές οι οποίες αυξάνουν τη θνητότητα είναι η πρωτο-

66 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία παθής ιογενής και η δευτεροπαθής βακτηριακή πνευμονία. Από τις εξωπνευμονικές επιπλοκές αναφέρονται η εγκεφαλίτιδα και τα σύνδρομα Guillain-Barré και Reye. Στα παιδιά είναι συχνή η μεταλοιμώδης μυοσίτις 1,12. Ανίχνευση αντιγόνου Η πιο αξιόπιστη μέθοδος είναι ο ανοσοφθορισμός, παρά τις δυσκολίες στην εκτέλεση και την αξιολόγησή του 14,15. Χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της νουκλεοπρωτεΐνης και ο φθορισμός είναι ομοιογενής στον πυρήνα και στικτός στο κυτταρόπλασμα. Σε πραγματικές συνθήκες εργαστηρίου η ευαισθησία του είναι 50-100% 7,12,14 και η ειδικότητα 80-100%. Σε ιδανικές συνθήκες που αφορούν κυρίως το είδος και το χρόνο συλλογής του δείγματος, η ευαισθησία και η ειδικότητά του ξεπερνούν το 90% 12. Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι είναι πιο προσιτές και κυκλοφορούν πολλά εμπορικά αντιδραστήρια ΕΙΑ μεμβράνης και ανοσοχρωματογραφίας με ευαισθησία 40-100% και ειδικότητα 65-100% 6,10,12,15.Τα περισσότερα έχουν τη δυνατότητα διάκρισης του τύπου, αλλά η ευαισθησία τους στην ανίχνευση του ιού influenza Β δεν είναι ικανοποιητική 6,7,12,15. Γενικά η ευαισθησία είναι μεγαλύτερη στα παιδιά και τις πρώτες 48 ώρες από την έναρξη των συμπτωμάτων αυτός είναι ο λόγος που οι ΕΙΑs δεν συνιστώνται για τη διάγνωση μετά την 3η ημέρα της νόσου 15. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι οι ανοσοενζυμικές τεχνικές ανίχνευσαν το νέο ιό της γρίπης Α (Η1Ν1) σε ποσοστό μόλις 10-51% 17,18, ενώ ο ανοσοφθορισμός είχε καλύτερα αποτελέσματα 19. Εντελώς πρόσφατη μελέτη από την Ιαπωνία αναφέρει την ανάπτυξη τεχνικής ανοσοχρωματογραφίας που ανιχνεύει ειδικά τον πανδημικό ιό Α (Η1Ν1) 20. Μοριακές τεχνικές Βοηθούν σημαντικά, τόσο στην ανίχνευση του ιού στο κλινικό δείγμα, όσο και στο χαρακτηρισμό των στελεχών 12,14,15. Η RT-PCR αποδείχτηκε περισσότερο ευαίσθητη και ειδική από την καλλιέργεια και είναι πλέον το «χρυσό πρότυπο» για τη διάγνωση της γρίπης 12. Έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε μεταμοσχευμένους και άτομα με χρόνια πνευμονικά νοσήματα, στα οποία συχνά η λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού εμφανίζεται με χαμηλό ιικό φορτίο 15. Εκτός από την τυποποίηση υπάρχει δυνατότητα διάκρισης των στελεχών του ίδιου υποτύπου, με ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας επιλεγμένων γονιδίων 12,14. Ανίχνευση αντισωμάτων Η συστηματική ανοσιακή απάντηση αναπτύσσεται έναντι των επιφανειακών γλυκοπρωτεϊνών (ΗΑ και ΝΑ), και των δομικών πρωτεϊνών ΝΡ και M (matrix) 12,15.Tα αντισώματα εμφανίζονται τη 2η εβδομάδα και ανιχνεύονται με τις νέες και τις κλασικές μεθόδους. Η ELISA είναι η πιο ευαίσθητη και μετρά τις ειδικές IgM ή IgA ανοσοσφαιρίνες στην αρχή της λοίμωξης, με ειδικότητα που εξαρτάται από το αντιγόνο της στερεάς φάσης. H CF ανιχνεύει αντισώματα έναντι της ΝΡ, διαχωρίζει τους τύπους Α και Β, είναι προτυπωμένη και χρησιμοποιείται για τη διάγνωση της πρόσφατης λοίμωξης με ορομετατροπή. Η αναστολή της αιμοσυγκόλλησης (ΗΙ) ανιχνεύει τα αντισώματα έναντι υ- ποτύπου-στελέχους και προσδιορίζει το βαθμό ανοσίας του ατόμου έναντι του συγκεκριμένου υποτύπου. Αξιολόγηση μεθόδων Η ανίχνευση του αντιγόνου επιτρέπει την ταχεία διάγνωση της γρίπης και βοηθά στη θεραπεία του ασθενούς και την προστασία του περιβάλλοντός του. Αυτό είναι πολύ σημαντικό τόσο για τα νοσοκομεία όσο και για άλλα ιδρύματα, όπως γηροκομεία και οικοτροφεία. Ο α- νοσοφθορισμός προσφέρει αξιόπιστο αποτέλεσμα, τόσο στην αρχή του επιδημικού κύματος, όσο και εκτός επιδημίας 15. Οι ανοσοενζυμικές

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 67 έχουν υψηλή διαγνωστική αξία μόνο στην ακμή της επιδημίας, και εκτός αυτής πρέπει να επιβεβαιώνονται με άλλη μέθοδο. Παραμένουν ως εναλλακτική δοκιμασία σε εργαστήρια χωρίς εξοπλισμό και χωρίς εμπειρία στον ανοσοφθορισμό. Οι μοριακές είναι ταχύτερες από τις συμβατικές τεχνικές όσον αφορά το διαγνωστικό σκέλος και πιο ακριβείς στο χαρακτηρισμό των στελεχών 12,21. Αν αποτύχει η ανίχνευση αντιγόνου, η RT-PCR είναι το αμέσως επόμενο βήμα για τη διάγνωση σε εργαστήριο που έχει πρόσβαση σε μοριακές τεχνικές. Μετά την οξεία φάση της λοίμωξης, ελαττώνεται σταδιακά η ευαισθησία των άμεσων τεχνικών, αρχίζουν να εμφανίζονται τα αντισώματα και η ανίχνευσή τους μπορεί να βοηθήσει στην αναδρομική διάγνωση 9. Αυτό συμβαίνει συχνά στις μεταλοιμώδεις επιπλοκές της γρίπης, αλλά και σε αρκετές περιπτώσεις που απέτυχαν ή δεν εφαρμόστηκαν οι άμεσες διαγνωστικές δοκιμασίες. Η ανοσία ελέγχεται με αναστολή της αιμοσυγκόλλησης και τίτλος 1:40 θεωρείται προστατευτικός 15. Γίνεται στα εργαστήρια αναφοράς τα οποία εξακολουθούν να απομονώνουν τα στελέχη της γρίπης για ε- ρευνητικούς σκοπούς και για την ετοιμασία του επόμενου εμβολίου. Αναπνευστικός συγκυτιακός ιός (RSV) Είναι το συχνότερο αίτιο βρογχιολίτιδας και πνευμονίας σε νεογνά και βρέφη. Προκαλεί επιδημίες κάθε χρόνο από τον Δεκέμβριο μέχρι τον Απρίλιο με την κορυφή τους μήνες Φεβρουάριο και Μάρτιο 22. Όλα τα βρέφη προσβάλλονται μεταξύ δύο επιδημικών κυμάτων, και σε ποσοστό 20-40% εμφανίζουν βρογχιολίτιδα ή πνευμονία. Η νόσος είναι ηπιότερη στις αναμολύνσεις παιδιών και ενηλίκων και περιορίζεται στο ανώτερο αναπνευστικό. Προδιαθεσικοί παράγοντες για βαρύτερη νόσο και επιπλοκές είναι η προωρότητα, οι συγγενείς διαμαρτίες και τα μεταβολικά νοσήματα. Συχνή επιπλοκή είναι η μέση ωτίτιδα. Σημαντική είναι η νοσηρότητα και η θνητότητα σε υπερήλικες και ανοσοκατασταλμένους, λόγω προσβολής του κατώτερου αναπνευστικού 23. Ανίχνευση αντιγόνου Ο ανοσοφθορισμός με ευαισθησία 84-100% 6,7,14,22 και ειδικότητα 90-100%, θεωρείται η μέθοδος εκλογής για τη διάγνωση. Στην πραγματικότητα οι άμεσες μέθοδοι ανίχνευσης είναι πιο ευαίσθητες από την καλλιέργεια, η οποία δίνει αρκετά ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα λόγω της μεγάλης ευαισθησίας του ιού 6. Τα αντιδραστήρια ανίχνευσης περιέχουν σημασμένα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της νουκλεοπρωτεΐνης και της επιφανειακής γλυκοπρωτεΐνης 22. Ο ειδικός φθορισμός είναι έντονος κοκκιώδης στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη. Οι ανοσοενζυμικές είναι οι μέθοδοι που έχουν εντάξει στη ρουτίνα τους όλα σχεδόν τα κλινικά εργαστήρια, αν και υπολείπονται ελαφρά σε ευαισθησία και ειδικότητα συγκρινόμενες με τον ανοσοφθορισμό. Τά εμπορικά αντιδραστήρια ανοσοχρωματογραφίας αλλά και ΕΙΑ μεμβράνης είναι σε ευρεία χρήση στα παιδιατρικά νοσοκομεία. Η ευαισθησία και η ειδικότητά τους είναι 59-100% και 69-100% αντίστοιχα 6,14,23. Η ευαισθησία εξαρτάται άμεσα από την ηλικία, και το είδος του δείγματος 9,22. Οι μοριακές μέθοδοι χρησιμοποιούνται ως δοκιμασίες αναφοράς στην επικύρωση των νέων εμπορικών αντιδραστηρίων για τη διάγνωση του RSV. Η χρήση τους στα κλινικά εργαστήρια δεν είναι πολύ διαδεδομένη και περιορίζεται στα δείγματα που αναμένεται να έχουν χαμηλό φορτίο 9,22. Με τη χρήση κατάλληλων εκκινητών διαχωρίζονται οι υποομάδες Α και Β του ιού. Τα IgM αντισώματα εμφανίζονται την πρώτη εβδομάδα στην πρωτολοίμωξη, ενώ τα IgG τη δεύτερη. Τα ειδικά αντισώματα εμφανίζονται νωρίτερα στο ρινοφαρυγγικό έκκριμα 23. Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός και η ELISA ανιχνεύουν τα αντισώματα στον ορό την 5η-9η ημέρα νόσου στους ενήλικες, στο 70% των παιδιών >6 μηνών και στο 50% των βρεφών <3 μηνών.

68 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Η σύνδεση συμπληρώματος είναι λιγότερο ευαίσθητη και δεν είναι αξιόπιστη σε βρέφη <3 μηνών, τα οποία αποτελούν σημαντικό ποσοστό του πληθυσμού ελέγχου 22,23. Αξιολόγηση μεθόδων Η μέθοδος εκλογής για τη διάγνωση ιδιαίτερα σε παιδιατρικά νοσοκομεία είναι η ανίχνευση του αντιγόνου. Είναι ταχύτατη και, όταν το δείγμα είναι κατάλληλο, έχει άριστη ευαισθησία και ειδικότητα. Το θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα ανακοινώνεται αμέσως στην κλινική και είναι χρήσιμο για τη διακοπή ή τροποποίηση της φαρμακευτικής αγωγής και για τον έλεγχο της διασποράς του ιού. Δεν συμβαίνει όμως το ίδιο στους ενήλικες και τους υπερήλικες. Υπάρχουν μελέτες που αναφέρουν πολύ χαμηλά ποσοστά ευαισθησίας και τα αποδίδουν στο ακατάλληλο δείγμα (επίχρισμα) και στο γεγονός ότι ο χρόνος απέκκρισης του ιού είναι βραχύς και το ιικό φορτίο χαμηλό 9,22. Οι μοριακές τεχνικές δίνουν τη διάγνωση σε λοιμώξεις ενηλίκων όπου ο ανοσοφθορισμός και οι ανοσοενζυμικές δεν είναι αποτελεσματικά. Η χρήση τους είναι ασύμφορη και δεν προτείνεται στη διάγνωση ρουτίνας όταν ελέγχονται κατά κανόνα υγιή παιδιά. Οι φθηνότερες και ταχύτερες μέθοδοι ανίχνευσης αντιγόνου αρκούν για τη διάγνωση. Η ευαισθησία τους συγκρινόμενη με την RT-PCR υπερβαίνει το 90% στη συγκεκριμένη ομάδα ελέγχου 8. H διαγνωστική αξία των δοκιμασιών ανίχνευσης αντισωμάτων είναι περιορισμένη, ιδιαίτερα σε παιδιά <6 μηνών λόγω της μη ικανοποιητικής ανοσιακής απάντησης και της παραμονής του μητρικού αντισώματος. Αντίθετα μπορεί να είναι περισσότερο χρήσιμες στους ενήλικες και σε περιπτώσεις που δεν έγιναν ή απέτυχαν οι άμεσες τεχνικές 9. Στην πρωτολοίμωξη η IgM- ELISA είναι η καλύτερη επιλογή, ενώ η IgG-ELISA και η σύνδεση συμπληρώματος (CF) προτείνονται για τον έλεγχο της ορομετατροπής στις αναλοιμώξεις. Πολλές φορές υπερήλικες και ανοσοκατασταλμένοι δεν εμφανίζουν σημαντική αύξηση του τίτλου των αντισωμάτων 22. Ιοί παραγρίπης (Parainfluenza viruses - PIVs) Ευθύνονται για το 30% των αναπνευστικών λοιμώξεων στα παιδιά και προκαλούν ήπια νόσο του ανώτερου αναπνευστικού. Η εποχική κατανομή και τα κλινικά σύνδρομα διαφέρουν και εξαρτώνται από τον τύπο του ιού 11,24. Ο PIV1 είναι το κύριο αίτιο croup σε παιδιά <3 ετών, με επιδημικές εξάρσεις ανά διετία κατά τους φθινοπωρινούς και χειμερινούς μήνες. Ο PIV2 προκαλεί ψευδομεμβρανώδη λαρυγγίτιδα (croup) σε παιδιά με ανοσοκαταστολή και χρόνια νοσήματα. O PIV3 ενδημεί ό- λο το χρόνο και είναι το 2ο μετά τον RSV αίτιο βρογχιολίτιδας σε νεογνά και βρέφη. Προκαλεί επιδημίες σε μονάδες νεογνών και μεταμοσχευμένων. O PIV4 είναι αίτιο ήπιων λοιμώξεων σε μεγαλύτερα παιδιά. Οι επαναλοιμώξεις σε παιδιά είναι ήπιες, ενώ οι PIVs ευθύνονται για το 10% των οξέων αναπνευστικών συνδρόμων των ενηλίκων. Προκαλούν σοβαρές λοιμώξεις σε άτομα με συγγενή ή επίκτητη ανοσοανεπάρκεια. Η νοσηρότητα είναι αυξημένη σε μεταμοσχευμένους και η θνητότητα εξαρτάται από το βαθμό της ανοσοκαταστολής 1,11. Η ανίχνευση αντιγόνου με τη μέθοδο άμεσου (DFA) ή έμμεσου (IFA) ανοσοφθορισμού δεν έχει ικανοποιητική ευαισθησία, η οποία κυμαίνεται από 60-83% 11,14,24. Η ειδικότητα είναι πολύ υψηλή. Υπάρχουν έτοιμα εμπορικά αντιδραστήρια με μονοκλωνικά αντισώματα που ανιχνεύουν χωριστά τον κάθε τύπο ή όλους τους τύπους του ιού συγχρόνως (pool). Ο ειδικός φθορισμός περιορίζεται στο κυτταρόπλασμα με τη μορφή λεπτών ή αδρών κοκκίων. Δεν κυκλοφορούν έτοιμα αντιδραστήρια ανίχνευσης αντιγόνου με ανοσοενζυμική μέθοδο, παρά μεμονωμένα μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώματα με χαμηλή ευαισθησία. Tα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι multiplex RT-PCR για την ανίχνευση

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 69 και ταυτοποίηση των ιών PIV1 PIV4. Οι ιοί αυτοί έχουν συμπεριληφθεί και στις εμπορικές multiplex και Real- time PCR τεχνικές για την ταυτόχρονη ανίχνευση των αναπνευστικών ιών 14. Η ανοσοσφαιρίνη IgM παράγεται στην πρωτολοίμωξη και η ανίχνευσή της με ανοσοενζυμική (ELISA) ή ανοσοφθορισμό (IFA), είναι ένδειξη πρόσφατης λοίμωξης. Ο τετραπλασιασμός του τίτλου ελέγχεται με ELISA, CF ή HI. Όλες οι ορολογικές μέθοδοι έχουν προβλήματα ειδικότητας και είναι συχνότερα στις κλασικές CF ή HI 11. Αξιολόγηση μεθόδων Δεν υπάρχουν υγιείς φορείς του ιού και η ανίχνευση του αντιγόνου είναι καθοριστική για τη διάγνωση. Το θετικό αποτέλεσμα είναι πάντοτε αξιόπιστο και ανακοινώνεται στην κλινική 11. Σε σοβαρές λοιμώξεις η ανίχνευση του αντιγόνου δεν αρκεί λόγω της χαμηλής αρνητικής διαγνωστικής αξίας και επιβάλλεται η χρήση των μοριακών τεχνικών 13. Multiplex και Real-time τεχνικές ανιχνεύουν τους ιούς (κυρίως τον PIV3) σε λοιμώξεις μεταμοσχευμένων και ανοσοανεπαρκών ατόμων. Η ανίχνευση των αντισωμάτων δεν συνιστάται για τη διάγνωση και γίνεται μόνο για επιδημιολογικούς σκοπούς. Η διάγνωση είναι αναδρομική και υπάρχουν πολλές διασταυρούμενες αντιδράσεις με άλλους παραμυξοϊούς και ετεροτυπικές μεταξύ των 4 οροτύπων του ιού. Τα παιδιά <6 μηνών δεν έχουν καλή ανοσολογική απάντηση, λόγω ανωριμότητας και λόγω της παρουσίας του μητρικού αντισώματος 11. Αδενοϊοί (Adenoviruses) Ευθύνονται για το 1-5% των αναπνευστικών λοιμώξεων, με συχνή συμμετοχή του οφθαλμού και χωρίς ιδιαίτερη εποχική κατανομή. Προσβάλλουν συχνότερα τα παιδιά και προκαλούν επιδημίες σε καταστάσεις συγχρωτισμού. Ορισμένοι ορότυποι προκαλούν συγκεκριμένα κλινικά σύνδρομα, όπως: φαρυγγοαμυγδαλίτιδα σε παιδιά (ορότυποι 1,2,3,5,7), κοκκυτικό σύνδρομο σε παιδιά (ορότυπος 5), οξύ αναπνευστικό σύνδρομο σε νεοσύλλεκτους (ορότυποι 4,7). Οι λοιμώξεις από αδενοϊούς σε άτομα με ανοσοανεπάρκεια ή ανοσοκαταστολή συχνά προκαλούν γενικευμένη νόσο (ορότυποι 1,2,5,11,34,35). Τα παιδιά και οι ανοσοκατασταλμένοι αποβάλλουν τον ιό από το ρινοφάρρυγγα και τα κόπρανα για εβδομάδες ή και μήνες 16. Η ανίχνευση του αντιγόνου των αδενοϊών γίνεται με τη χρήση σημασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της εξόνης, κοινής για όλους τους οροτύπους. Ο ανοσοφθορισμός έχει χαμηλή ευαισθησία (40-60%) 7,14,16 αλλά εξαιρετική ειδικότητα (>99%). Στο παρασκεύασμα τα θετικά κύτταρα εμφανίζονται με αδρό φθορισμό στον πυρήνα και στικτό στο κυτταρόπλασμα. Η ευαισθησία των ανοσοενζυμικών τεχνικών είναι το ίδιο χαμηλή, αν και υπάρχουν μελέτες που ανεβάζουν την ευαισθησία της α- νοσοχρωματογραφίας στο 84-90% 16. Οι μοριακές μέθοδοι όπως είναι φυσικό έχουν τη μεγαλύτερη ευαισθησία και με ειδικούς εκκινητές για συντηρημένες αλληλουχίες του γονιδίου της εξόνης ανιχνεύονται όλοι οι ορότυποι. Η Real -time PCR εμφανίζει τη μεγαλύτερη ευαισθησία (98%), αλλά η μόνη εγκεκριμένη από το FDA μοριακή δοκιμασία έχει ευαισθησία 78,3% και ειδικότητα 100% 14. Η ειδική IgM εμφανίζεται μόνο στο 20-50% των περιπτώσεων της πρωτολοίμωξης, ενώ η IgG καθυστερεί στα παιδιά και στην ανοσοκαταστολή. Για τη διάγνωση της πρόσφατης λοίμωξης προτιμάται η ανοσοενζυμική (ELISA) παρά την έλλειψη προτύπωσης, γιατί είναι πιο ευαίσθητη. Η CF προτυπωμένη και φθηνή, υ- στερεί σε ευαισθησία ιδιαίτερα στα παιδιά. Η ανίχνευση των αντισωμάτων έναντι των οροτύπων γίνεται στα κέντρα αναφοράς με ΗΙ 16. Αξιολόγηση μεθόδων Η επιλογή της διαγνωστικής δοκιμασίας εξαρτάται από την κλινική εικόνα, την ανο-

70 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία σιακή κατάσταση και το χρόνο έναρξης των συμπτωμάτων. Όταν η διάγνωση επείγει για τη λήψη κλινικής απόφασης, οι μέθοδοι ανίχνευσης αντιγόνου έχουν υψηλή θετική διαγνωστική αξία αν η κλινική εικόνα είναι συμβατή. Όμως, επειδή έχουν χαμηλή ευαισθησία, το αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει τη νόσο. Το επόμενο βήμα είναι οι μοριακές τεχνικές, ιδιαίτερα σε άτομα με σοβαρή κλινική εικόνα 7,16. Το θετικό αποτέλεσμα των ευαίσθητων μοριακών τεχνικών πρέπει να αξιολογείται με προσοχή, γιατί μπορεί να οφείλεται σε αποικισμό 8,16. Η ανίχνευση αντισωμάτων αρκεί για τις συνήθεις λοιμώξεις της κοινότητας σε ανοσοεπαρκείς. H διάγνωση είναι αναδρομική, γίνεται με ELISA ή CF και απλώς επιβεβαιώνεται η λοίμωξη από αδενοϊό. Η αιτιολογική σχέση της λοίμωξης με συγκεκριμένο ορότυπο, ελέγχεται με ΗΙ στα κέντρα αναφοράς. Οι ορολογικές δοκιμασίες αποτελούν μέρος της εργαστηριακής προσέγγισης, η οποία περιλαμβάνει επίσης την ανίχνευση αντιγόνου και την PCR. Κάθε εξέταση συμπληρώνει και επιβεβαιώνει τις υ- πόλοιπες. Η διάγνωση είναι ασφαλέστερη αν ερμηνευτούν τα αποτελέσματα με βάση τα κλινικά και επιδημιολογικά δεδομένα. Η διάγνωση είναι ιδιαίτερα προβληματική στους ασθενείς με μεταμόσχευση λόγω της μη ειδικής κλινικής συμπτωματολογίας και της μεγάλης συχνότητας της ασυμπτωματικής απέκκρισης του ιού. Στις περιπτώσεις αυτές υπάρχουν πρωτόκολλα με περιοδικούς ελέγχους του ιικού φορτίου σε δείγματα φάρυγγα, ούρων, κοπράνων και αίματος 16. Ανθρώπειος μεταπνευμονοϊός (Human metapneu movirus hmpv) Εμφανίζει παγκόσμια διασπορά και είναι το 2ο μετά τον RSV αίτιο αναπνευστικής λοίμωξης σε παιδιά 25. Οι δύο τύποι Α και Β κυκλοφορούν όλο το χρόνο και προκαλούν επιδημίες που συμπίπτουν ή ακολουθούν αυτές του RSV 1. Συμμετέχει σε μικτές λοιμώξεις σε ποσοστό 5-30% 14. Προσβάλλει κυρίως το ανώτερο αναπνευστικό στα παιδιά. Η προωρότητα, το υποκείμενο νόσημα και η ανοσοκαταστολή προδιαθέτουν για σοβαρή νόσο με συμμετοχή του κατώτερου αναπνευστικού. Στους υγιείς ενήλικες εμφανίζεται σαν κοινό κρυολόγημα. Σε χρονίως πάσχοντες προκαλεί βρογχίτιδα, πνευμονία, παρόξυνση του άσθματος και της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας. Οι λοιμώξεις στους ανοσοκατασταλμένους είναι σοβαρές και επιμένουσες. Οι μοριακές τεχνικές είναι προς το παρόν η πιο ασφαλής διαγνωστική προσέγγιση. Η RT- PCR είναι η μέθοδος εκλογής, ενώ η multiplex και η Real-time RT-PCR ανιχνεύουν τον hmpv μαζί με άλλους αναπνευστικούς ιούς 14,25. Πρόσφατα κυκλοφόρησε στο εμπόριο ανοσοενζυμική τεχνική ανίχνευσης του αντιγόνου του ιού, με αναφερόμενη ευαισθησία 89% και ειδικότητα 100%. Επίσης έχουν αναπτυχθεί και μονοκλωνικά αντισώματα για ανίχνευση του αντιγόνου στο ρινοφαρυγγικό με άμεσο ανοσοφθορισμό (DFA). Η ευαισθησία και η ειδικότητα του α- νοσοφθορισμού συγκρινόμενη με την RT-PCR, βρέθηκε 74% και 94% 14 αντίστοιχα. Η μέτρηση των αντισωμάτων δεν έχει διαγνωστική αξία και προς το παρόν εξυπηρετεί μόνο επιδημιολογικούς σκοπούς. Ρινοϊοί (Rhinoviruses) Κυκλοφορούν όλο το χρόνο με επιδημικές εξάρσεις στο τέλος της άνοιξης και τις αρχές του φθινοπώρου. Προκαλούν κοινό κρυολόγημα, παραρινοκολπίτιδα, μέση ωτίτιδα και πρόσφατα αναγνωρίστηκαν σαν το σημαντικότερο ιογενές αίτιο παρόξυνσης του άσθματος και της βρογχίτιδας. Οι κλινικές εκδηλώσεις των ρινοϊών σε νοσηλευόμενα βρέφη είναι παρόμοιες με αυτές του RSV, ενώ συχνά συμμετέχουν σε μικτές λοιμώξεις του αναπνευστικού 1,14,26.Απεκκρίνονται σε μεγάλες συγκεντρώσεις τις 2 πρώτες ημέρες της νόσου και ανιχνεύονται στο ρινικό και βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και σπανιότερα σε υλικό παρακέντησης παραρρινίων κόλπων.

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 71 Η διάγνωση γίνεται με μοριακές τεχνικές οι οποίες ανιχνεύουν, ταυτοποιούν και τυποποιούν τα στελέχη εύκολα και με λιγότερο κόστος από τις συμβατικές (καλλιέργεια και ε- ξουδετερωτικές). Είναι πιο ευαίσθητες από την καλλιέργεια και με τη χρήση ειδικών εκκινητών διαχωρίζονται οι ρινοϊοί από τους εντεροϊούς 26. Τα εγκεκριμένα από το FDA αντιδραστήρια έδειξαν ευαισθησία 100% και ειδικότητα 91,3% 14. Οι μοριακές τεχνικές απέδειξαν ότι οι ρινοϊοί προσβάλλουν πολύ συχνά το κατώτερο αναπνευστικό σε παιδιά, υπερήλικες, χρονίως πάσχοντες και ανοσοκατασταλμένους. Ιαιμία ανιχνεύθηκε πρόσφατα με RT-PCR σε ποσοστό 11,4 % των μικρών παιδιών με λοίμωξη αναπνευστικού και στο 25% των παιδιών με παρόξυνση του άσθματος από ρινοϊό 26. Ο μεγάλος αριθμός των οροτύπων και η έλλειψη κοινού αντιγόνου ομάδας δεν επιτρέπει τη διάγνωση με ανίχνευση του αντιγόνου στο έκπλυμα ή των αντισωμάτων στον ορό και δεν κυκλοφορούν στο εμπόριο τα ανάλογα αντιδραστήρια 26. Αν και με τις μοριακές τεχνικές έχει αποδειχθεί ο σημαντικός ρόλος των ρινοϊών στις λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού, οι κλινικοί γιατροί δεν ζητούν την ανίχνευσή τους από το εργαστήριο. Πολλές φορές ανιχνεύονται έμμεσα με τις multiplex τεχνικές στο πλαίσιο της αναζήτησης του ιού της γρίπης ή του RSV. Εντεροϊοί (Enteroviruses) H πλειονότητα των αναπνευστικών λοιμώξεων από εντεροϊούς συμβαίνει στο τέλος του καλοκαιριού και στην αρχή του φθινοπώρου σε βρέφη και μικρά παιδιά. Είναι ήπιες, αφορούν κυρίως το ανώτερο αναπνευστικό και το σύνδρομο αναφέρεται χαρακτηριστικά ως «καλοκαιρινό κρυολόγημα» (summer cold) 14,27. Η βρογχιολίτιδα είναι σπάνια και η πνευμονία είναι συχνά σοβαρή στα βρέφη 1. Οι πρώην Echo 22 και 23 κατατάσσονται σήμερα στους Parechoviruses και προκαλούν συμπτώματα κοινού κρυολογήματος ή και πνευμονίας 1,27. Η αιτιολογική διάγνωση γίνεται με RT- PCR, αλλά η αξιολόγηση του αποτελέσματος είναι δύσκολη, επειδή οι εντεροϊοί αποικίζουν το ρινοφάρυγγα για μήνες. Οι ορολογικές έ- χουν περιορισμένη διαγνωστική αξία και δεν κυκλοφορούν εμπορικά αντιδραστήρια, λόγω του μεγάλου αριθμού οροτύπων 27. Οι λοιμώξεις του ανώτερου αναπνευστικού, κατά κανόνα ήπιες, αναγνωρίζονται εύκολα κλινικά και δεν απαιτούν εργαστηριακή τεκμηρίωση. Αντίθετα σε σοβαρές πνευμονίες βρεφών η ανίχνευση του ιού βοηθά στη ρύθμιση της φαρμακευτικής αγωγής. Οι πιο συνήθεις περιπτώσεις που αντιμετωπίζει ένα νοσοκομειακό εργαστήριο αφορούν την ανίχνευση του RSV ή του ιού της γρίπης. Τα περισσότερα εργαστήρια που ελέγχουν κατά κανόνα ανοσοεπαρκή άτομα (παιδιά ή ενήλικες), χρησιμοποιούν αρχικά μία ανοσοενζυμική μέθοδο. Εκτός επιδημίας το θετικό ή το αρνητικό αποτέλεσμα της ΕΙΑ καλό είναι να επιβεβαιώνεται με άλλη πιο αξιόπιστη μέθοδο (λόγω χαμηλής θετικής και αρνητικής διαγνωστικής αξίας αντίστοιχα). Η επιβεβαίωση γίνεται με ανοσοφθορισμό. Σε μερικά εργαστήρια χρησιμοποιείται από την αρχή ως δοκιμασία διαλογής (screening test) η δεξαμενή των αντισωμάτων ανοσοφθορισμού που ανιχνεύει συγχρόνως τους 7 κλασικούς αναπνευστικούς ιούς και επί θετικού αποτελέσματος ελέγχεται κάθε ιός χωριστά. Σε ορισμένες περιπτώσεις συνιστώνται επιπλέον οι μοριακές μέθοδοι γιατί ο ανοσοφθορισμός δεν αρκεί 7. Αυτό συμβαίνει σε δείγματα που λαμβάνονται από: 1. Ασθενείς με ανοσοκαταστολή, μεταμόσχευση ή υποκείμενη νόσο του αναπνευστικού. Τα άτομα αυτά πολύ συχνά είναι υποψήφια για μικτή λοίμωξη με περισσότερους του ενός αναπνευστικούς ιούς σε συνδυασμό με CMV ή HSV. 2. Παιδιά κάτω των 5 ετών με βαριά κλινική νόσο, όπου πρέπει να ελεγχθούν για hmpv, corona-ιούς ή την ύπαρξη μικτής λοίμωξης. 3. Άτομα με πιθανότητα σοβαρής λοίμωξης από αδενοϊό.

72 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Η εργαστηριακή προσέγγιση των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού είναι σήμερα εφικτή σε πολλά νοσοκομεία, κυρίως λόγω της χρήσης των μοριακών τεχνικών. Καλό είναι το κάθε εργαστήριο να επιλέγει ποια είναι η καταλληλότερη μέθοδος για τη ρουτίνα του, α- νάλογα με τον πληθυσμό που ελέγχει, αλλά και τον εξοπλισμό, το προσωπικό και την τεχνογνωσία που διαθέτει. Σήμερα με την αφθονία των διαθέσιμων αντιδραστηρίων, ίσως είναι δυσκολότερη η επιλογή. Το νοσοκομειακό διαγνωστικό εργαστήριο οφείλει να χρησιμοποιεί προτυπωμένες μεθόδους και εγκεκριμένα (IVD ή FDA) αντιδραστήρια. Όσον αφορά τη διαδικασία, υπάρχουν δημοσιευμένοι αλγόριθμοι σε συγγράμματα, σε έγκυρα περιοδικά, ακόμη και στο διαδίκτυο, ώστε η διάγνωση να είναι έγκαιρη, έγκυρη και με το δυνατό λιγότερο κόστος. Διεύθυνση Επικοινωνίας Καλλέργη Κωνσταντίνα Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων «Π & Α. Κυριακού» Τηλ: 210 7726424 Summary K. Kallergi Laborotory diagnosis of viral respiratory infections Department of Microbiology, «P.& A. Kyriakou» Children s Hospital Applied Clinical Microbiology Appropriate management of patients with respiratory virus infections requires rapid and accurate identification of the aetiological agents. The respiratory viruses can be identified using a variety of techniques including antigen detection and serology. In parallel to these conventional methods, the nucleic acid amplification tests are emerging as the preferred approach for diagnosis. This article focuses on the value and the applications of these techniques for the accurate and timely detection of the most common respiratory viruses in the Clinical Laboratory. (Key words: Respiratory virus infection, diagnosis, antigen detection, molecular techniques, serology). Βιβλιογραφία 1. Mahony J, Garman W. Respiratory viral diagnosis. The pathogens J Clin Virol 2007, 40 (Suppl 1): S5-S10. 2. Templeton K. Why diagnose respiratory viral infection? J Clin Virol 2007, 40(Suppl 1): S2-S4. 3. Jeffery K, and Pillay D. Diagnostic Approaches. Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR, Griffiths PD, Schoub(ed).Principles and Practice of Clinical Virology. 5th ed. Chichester: Wiley; 2004, p1-21. 4. Forman S. M. and Valsamakis A. Specimen Collection, Transport, and Processing: Virology. In Manual of Clinical Microbiology 9th ed. ASM Washington 2007, p1284-1296. 5. Loens K, Van Heirstraeten L, Malhotra-Kumar, Goosens H, and Ieven M. Optimal sampling sites and methods for detection of pathogens possibly causing community-acquired lower respiratory track infections. J Clin Microbiol 2009, 47: 21-31. 6. Ginocchio C. Detection of respiratory viruses using non-molecular based methods. J Clin Virol 2007, 40 (Suppl 1): S11-S14. 7. Leland D and Ginocchio C. Role of cell culture for virus detection in the age of technology. Clin Microbiol Rev 2007, 20: 49-78. 8. Kuypers J, Wright N, Ferrenberg J, Huang M, Cent A, Corey L. and Morrow R. Comparison of Real-Time PCR assays with fluorescent-antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children. J Clin Microbiol 2006, 44: 2382-8 9. Falsey A and Walsh E. Viral Pneumonia in older adults. CID 2006, 42: 518-24. 10. Grayson M and Charles P. Point-of-care tests for lower respiratory track infections. MJA 2007, 187: 36-9. 11. Leland D. Parainfluenza and Mumps Viruses. In Manual of Clinical Microbiology 9th ed. ASM Washington 2007, p1352-1360.

Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 2, 2010 73 12. Atmar R. Influenza Viruses. In Manual of Clinical Microbiology 9th ed. ASM Washington 2007, p1340-1351 13. Fox J. Nucleic acid amplification tests for detection of respiratory viruses. J Clin Virol 2007, 40 (Suppl 1): S15-S23. 14. Mahony J. Detection of respiratory viruses by molecular methods. Clin Microbiol Rev 2008, 21: 716-747. 15. Petric M, Comanor L, Petti C. Role of the laboratory in diagnosis of influenza during seasonal epidemics and potential pandemics. JID 2006, 194 (Suppl 2): S98-S109. 16. Robinson C and Echavarria M. Adenoviruses. In Manual of Clinical Microbiology 9th ed. ASM Washington 2007, p1589-1600. 17. Ginocchio C, Zhang F, Manji R, Arora S, Bornfreud M, Falk L, Lotlikar M, Kowerska M, Becker G, Korologos D, de Geronimo M, and Cragword M. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. J Clin Virol 2009, 45: 191-195. 18. CDC. Evaluation of rapid influenza diagnostic tests for detection of novel influenza A (H1N1) Virus United States, 2009. MMWR 2009, 58(30): 826-829. 19. Pollock N, Duong S, Chehg A, Han L, Smole S, and Kirby J. Ruling out novel H1N1 influenza virus infection with direct fluorescent antigen testing. CID 2009, 49: 66-68. 20. Miyoshi-Akiyama T, Narahara K, Mori S, Kitajima H, Kase T, Morikawa S, and Kirikae T. Development of an immunochromatographic assay specifically detecting pandemic H1N1(2009) influenza virus. J Clin Microbiol 2010, 48: 703-708. 21. He J, Bose M, Beck E, Fan J, Tiwari S, Metallo J, Jurgens L, Kehl S, Ledeboer N, Kumar S, Weisburg W, and Henrickson K. Rapid multiplex reverse trascription PCR typing of influenza A and B virus and subtyping of influenza a virus into H1,2,3,5,7,9,N1 (Human), N1 (Animal), N2 and N7, including typing of novel swine origin influenza A (H1N1) virus, during the 2009 outbreak in Milwaukee, Wisconsin. J Clin Microbiol 2009, 47: 2772-2778. 22. Tang Y. W. and Crowe J. Respiratory syncytial virus and human metapneumovirus. In manual of clinical microbiology 9th ed. ASM Washington 2007, p 1361-1377. 23. Hall C, Mc Carthy C. Respiratory syncytial virus. In Mandell, Douglas and Benett s Principles and Practice of Infectious Diseases (Vol II) 6th ed. Elsevier Inc 2005, p 2008-26. 24. Weinberg G. Parainfluenza viruses: An underappreciated cause of pediatric respiratory morbidity. Pediatr Infect Dis J 2006, 25: 447-448. 25. Kahn J. Epidemiology of human metapneumovirus. Clin Microbiol Rev 2006, 19: 546-557. 26. Landry M. L. Rhinoviruses. In Manual of Clinical Microbiology 9th ed. ASM Washington 2007, p 1405-1413. 27. Romero J. Enteroviruses and Parechoviruses. In Manual of Clinical Microbiology 9th ed. ASM Washington 2007, p 1392-1404. ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗ Ενημερώνουμε τους αναγνώστες μας για τη σύνθεση του νέου Διοικητικού Συμβουλίου της Ελληνικής Εταιρείας Εργαστηριακής Αιματολογίας και Αιμοδοσίας όπως αυτό προέκυψε από τις αρχαιρεσίες της 9ης Φεβρουαρίου 2010. Πρόεδρος: Αντιπρόεδρος: Γεν. Γραμματέας: Ειδ. Γραμματέας: Ταμίας: Μέλη: Αναπλ. Μέλη: Θεόδωρος Θεοδωρίδης Μαρία Γεωργιακάκη Πηνελόπη Παρασκευοπούλου Ζωή Παλλαντζά Λεμονιά Παμφίλη Αλεξάνδρα Σταμουλακάτου Σταυρούλα Αλεξιά Βασιλική Τσαγκάρη Παρθενόπη Τσέλιου