ΧΗΜΕΙΟΤΡΟΠΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΟΥ ΔΑΚΟΥ (Bactrocera oleae GMEL.) ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ

ΧΗΜΕΙΟΤΡΟΠΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΟΥ ΔΑΚΟΥ (Bactrocera oleae GMEL.) ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ Γεώργιος Ζαχαριουδάκης 1 και Ελευθέριος Αλυσσανδράκης 2 1 Τμήμα Φυτικής Παραγωγής, Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας Τ.Ε.Ι. Κρήτης. 2 Εργαστήριο Γεωργικής Εντομολογίας και Φαρμακολογίας, Τμήμα Φυτικής Παραγωγής, Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας Τ.Ε.Ι. Κρήτης. Περίληψη Ο δάκος της ελιάς αποτελεί τη σημαντικότερη απειλή της ελαιοκομίας στη λεκάνη της Μεσογείου. Το φυτό-ξενιστής εκλύει διάφορες πτητικές ουσίες, κάποιες από τις οποίες ασκούν επιρροή στον δάκο. Η αντίδραση του εντόμου σε αυτές τις ουσίες καλείται χημειοτροπική συμπεριφορά. Από τις διάφορες ουσίες που εκλύονται από το δέντρο της ελιάς, το τολουόλιο και το αιθυλοβενζόλιο ήταν οι πιο ελκυστικές, ενώ η (Ε)-2-εξενάλη είχε ισχυρή απωθητική δράση. Σε πειράματα αναφορικά με την ωοτοκία του θηλυκού δάκου, το α-πινένιο φάνηκε να προσελκύει περισσότερο το δάκο για ωοτοκία. Αντίθετα, οι ουσίες (Ε)-2-εξενάλη και εξανάλη είχαν απωθητική δράση. Στο νερό ξαλμυρίσματος των καρπών και το νερό απορροής των φύλλων της ελιάς βρέθηκαν συνολικά 11 πτητικές ουσίες. Από αυτές, το στυρένιο και η αμμωνία βρέθηκαν να έχουν την μεγαλύτερη ελκυστική δράση για το δάκο. Το στυρένιο εξειδικευμένα προσελκύει τα θηλυκά άτομα του δάκου, ενώ η αμμωνία είναι ελκυστική για όλα τα έντομα της οικογένειας Tephritidae. Και οι δύο αυτές ουσίες είναι προϊόντα μικροβιακής δραστηριότητας. ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 1

1. Εισαγωγή Στην Ελλάδα η ελιά είχε ξεχωριστή θέση από την αρχαιότητα και είχε συνδεθεί με τη διατροφή, τη θρησκεία, την υγεία και την τέχνη. Σήμερα, είναι η πρώτη σε σπουδαιότητα δενδρώδης καλλιέργεια στη χώρα μας, αφού καταλαμβάνει σε έκταση το 15% περίπου της καλλιεργούμενης γης και το 75% των εκτάσεων που είναι φυτεμένες με δένδρα. Με την καλλιέργεια της ελιάς απασχολείται περίπου το 1/3 του αγροτικού πληθυσμού της χώρας, ενώ σε πολλές περιοχές το ελαιόλαδο αποτελεί το αποκλειστικό εισόδημα των αγροτών. Η Ελλάδα είναι η τρίτη χώρα στον κόσμο (μετά την Ισπανία και την Ιταλία) στην παραγωγή ελαιόλαδου. Η ελιά καλλιεργείται στους 50 από τους 54 νομούς της χώρας. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν γύρω στα 130 εκατομμύρια ελαιόδενδρα, 2800 ελαιοτρίβεια, 335 συσκευαστήρια-ραφιναριστήρια-πυρηνελαιουργεία και 80 εργοστάσια επεξεργασίας ελιάς. Ετησίως παράγονται περίπου 300.000 τόνοι ελαιόλαδου άριστης ποιότητας (το 75% είναι της ποιοτικής κατηγορίας παρθένο ), από τους οποίους οι 100.000 εξάγονται. Παράγονται τέλος γύρω στους 25.000 τόνους πυρηνέλαιο. Με τα προϊόντα της αυτά η ελιά συμμετέχει κάθε χρόνο κατά 2% στα συνολικά εθνικά έσοδα και κατά 15 % στο εθνικό αγροτικό εισόδημα. Η ελιά είναι υποτροπικό είδος, αιθάλες, που αναπτύσσεται σε θάμνο ή δένδρο. Χαρακτηρίζεται από την μακροζωία του. Στην περιοχή της Μεσογείου υπάρχουν δένδρα πολλών εκατονταετηρίδων και μερικά που ξεπερνούν και τη χιλιετηρίδα (π.χ. ελιά του Πλάτωνα). Εάν για οποιοδήποτε λόγο καταστραφεί το υπέργειο μέρος, το φυτό αναγεννάται εύκολα με νέα βλάστηση από το λαιμό ή και τις ρίζες. Σημαντικότερος εχθρός της ελιάς είναι η μύγα του δάκου (Bactrocera oleae, Diptera: Tephritidae, εικόνα 1) που προσβάλλει τους καρπούς του ελαιόδενδρου με αποτέλεσμα την μείωση και την υποβάθμιση της παραγωγής. Το ύψος των ζημιών που προκαλούνται μπορεί να φτάσει το 80% της παραγωγής κάτω από ευνοϊκές για την ανάπτυξη του εντόμου συνθήκες και εάν δεν εφαρμοστούν μέτρα καταπολέμησης του. Συνήθως, όμως, τα ποσοστά ζημιών περιορίζονται γύρω στο 5% με την σωστή φυτοπροστασία. ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 2

Εικόνα 1. Ακμαίο θηλυκό του δάκου. Ο βιολογικός κύκλος του εντόμου ποικίλει ανάλογα με τις καιρικές συνθήκες. Διαχειμάζει στο στάδιο της πούπας στο έδαφος ή σε διάφορα καταφύγια (σχισμές δένδρων κ.λ.π.) τα πρώτα τέλεια εμφανίζονται την περίοδο Απριλίου-Μαΐου που έχουν την τάση να κατευθύνονται και να παραμένουν στα πιο ηλιόλουστα μέρη του δένδρου. Κατά κανόνα εισάγει ένα αυγό ανά καρπό. Η προνύμφη ορύσσει στοά στο μεσοκάρπιο και όταν συμπληρώσει την ανάπτυξη της νυμφώνεται, το μεν θέρος συνήθως μέσα στο καρπό, το δε φθινόπωρο και το χειμώνα στο έδαφος σε μικρό βάθος. Ο δάκος προκαλεί ζημιές γιατί η προνύμφη κατατρώγει το μεσοκάρπιο της ελιάς (εικόνα 2), το οποίο στην συνέχεια πέφτει. Ως χημειοτροπική συμπεριφορά του δάκου σε σχέση με την ελιά αναφέρεται η αντίδραση του σε ουσίες που εκλύονται από το δέντρο. Οι ουσίες αυτές μπορεί να ασκούν ελκυστική ή απωθητική δράση στο έντομο ή να σχετίζονται με άλλες λειτουργίες αυτού. Σκοπός της εργασίας είναι η απομόνωση των χημικών ουσιών που εκκρίνει το δένδρο της ελιάς, η ταυτοποίηση της και ο έλεγχος τους σε σχέση ως προς την ελκυστικότητα, απωθητικότητα και επίδραση αυτών στην ωοτοκία του δάκου. Απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν ουσίες που εκλύονται από το δέντρο και μελετήθηκε η επίδρασή τους στο ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 3

δάκο. Επίσης, έγινε προσπάθεια να δοθούν απαντήσεις σε δύο παρατηρήσεις: α) ποιος ο λόγος που πνίγονται μεγάλος αριθμός δάκων στα υπολείμματα νερού από το ξαλμύρισμα των βρώσιμων ελιών (Vita και Cirio, 1980), και β) που οφείλεται η μαζική επιστροφή των δάκων στους ελαιώνες έπειτα από άφθονες καλοκαιρινές βροχές (Girolami et al., 1982). Εικόνα 2. Τομή καρπού ελιάς. Διακρίνεται η στοά που έγινε από την προνύμφη και η πούπα του δάκου. Η παρούσα εργασία βασίστηκε στις δημοσιευμένες εργασίες του Scarpati και συνεργατών (1993, 1996). 2. Υλικά και μέθοδοι Αναφορικά με τις ουσίες που εκλύονται από την ελιά, τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν (φύλλα ή καρποί διαφόρων σταδίων ωριμότητας) τοποθετούνταν σε κλειστό χώρο, από όπου διερχόταν αέριο που παρέσυρε τις ουσίες που εκλύονταν. Αυτές οι ουσίες οδηγούνταν σε κατάλληλη παγίδα και ακολουθούσε η ταυτοποίησή τους. Για να γίνει μελέτη της παρατήρησης που σχετίζεται με το νερό ξαλμυρίσματος, ελιές αφέθηκαν σε νερό για 8-10 μέρες, σε θερμοκρασία δωματίου. Το νερό αυτό (ΝΞ= νερό ξαλμυρίσματος) χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας, ενώ αναλύθηκε και ως προς τα πτητικά ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 4

συστατικά του. Για την παρατήρηση που αφορά στη μαζική επιστροφή του δάκου, φρεσκοκομμένα κλαδιά ελιάς εισήχθησαν σε μεγάλο δοχείο με νερό, το οποίο ανακινήθηκε δυνατά. Το νερό που παραλήφθηκε προσομοιάζει το νερό απορροής των φύλλων της ελιάς έπειτα από δυνατή βροχή (ΝΑ= νερό απορροής). Προκειμένου να γίνει ανάλυση των πτητικών ουσιών που ελευθερώνονται έπειτα από δυνατή βροχή, 1 L νερό ψεκάστηκε για 5 λεπτά σε κλαδί που βρισκόταν πάνω στο δέντρο και συλλεγόταν το νερό που έτρεχε. Το ίδιο νερό ψεκαζόταν ξανά και τελικά συλλέχθηκε 0,5 L νερού απορροής. Για την ανάλυση των πτητικών ουσιών χρησιμοποιήθηκε αέριος χρωματογράφος, συνδυασμένος με ανιχνευτή φασματόμετρο μαζών. Η αμμωνία υπολογίστηκε με χρωματομετρική μέθοδο. Προκειμένου να μελετηθεί η ελκυστικότητα των διαφόρων ουσιών που απομονώθηκαν χρησιμοποιήθηκαν κλωβοί από πλεξιγκλάς, διαστάσεων 20 Χ 20 Χ 20 εκ., στα οποία τοποθετούνταν δύο τριβλία, ένα με σκέτο νερό και ένα με την προς μελέτη ουσία. Κατόπιν, εισάγονταν 25 άτομα του δάκου και μετριόνταν τα άτομα που επισκέπτονταν κάθε τριβλίο. Για το πείραμα που αφορούσε την παρεμπόδιση ωοτοκίας, σε κλωβό ίδιων διαστάσεων τοποθετούνταν ελιές πάνω από τριβλίο που περιείχε νερό ή την προς μελέτη ουσία (σχήμα 1). Έπειτα από 6 ώρες μετριόνταν τα νύγματα στις ελιές. Σχήμα 1. Κλωβός στον οποίο έγινε το τεστ ωοτοκίας. ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 5

3. Αποτελέσματα-Συζήτηση Ουσίες που απομονώθηκαν από το δέντρο. Αναφορικά με τις ουσίες που απομονώθηκαν από το δέντρο, αυτές συγκρίθηκαν με το ΝΞ, το οποίο θεωρείται ότι έχει την πιο ελκυστική δράση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2, το τολουόλιο και το αιθυλοβενζόλιο ήταν οι πιο ελκυστικές ουσίες Σχήμα 2. Τεστ ελκυστικότητας του δάκου. Τα διαφορετικά νούμερα δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. 1: πτητικές ουσίες καρπών ελιάς, 2: πτητικές ουσίες του ΝΞ, 3: πτητικές ουσίες φύλλων ελιάς, 4: πτητικές ουσίες συνεθλιβμένων καρπών ελιάς, 5: ΝΞ, 6: τολουόλιο, 7: αιθυλοβενζόλιο, 8: κ-οκτάνιο, 9: α-πινένιο, 10: μάρτυρας (νερό). Το τεστ απωθητικότητας έγινε με τη χρήση διαφόρων ουσιών. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3, η (Ε)-2-εξενάλη έχει ισχυρή απωθητική δράση ενάντια στο δάκο. Σχήμα 3. Τεστ απωθητικότητας του δάκου. Τα διαφορετικά νούμερα δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. 1: ΝΞ, 2: εννιανάλη, 3: τολουόλιο, 4: (Ε)-2-επτενάλη, 5: εξανάλη, 6: κ-οκτάνιο, 7: α-πινένιο, 8: β-πινένιο, 9: αιθυλοβενζόλιο, 10: (Ε)-2-εξενάλη, 11: μάρτυρας (νερό). ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 6

Για τη διεξαγωγή του τεστ ωοτοκίας, χρησιμοποιήθηκε ο κλωβός του σχήματος 1. Οι προς εξέταση ουσίες τοποθετήθηκαν κοντά στις ελιές για να εξασφαλίσουν σταθερή επαφή των πτητικών ουσιών με αυτές. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4, ο αριθμός των νυγμάτων ωοτοκίας του α-πινενίου και του ΝΞ υπερέβησαν καθαρά τα αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με τον μάρτυρα. Η ουσία που βρέθηκε να ελαττώνει δραστικά την ωοτοκία ήταν η (Ε)-2-εξενάλη, ενώ και η εξανάλη, η οποία εκκρίνεται από τις πολτοποιημένες ελιές, έδειξε να εμποδίζει τη δράση της ωοτοκίας. Αυτά τα αποτελέσματα εξηγούν την παρατήρηση (Girolami et al., 1981) ότι ο αριθμός των αποθέσεων αυγών είναι δραστικά μειωμένος αν υπάρχουν εκεί κοντά πολτοποιημένες ελιές. Είναι πολύ πιθανό οι πτητικές ουσίες που εκκρίνονται από την οπή της ωοτοκίας να περιέχουν (Ε)-2-εξανάλη και εξανάλη. Αυτές οι ουσίες φαίνεται ότι αποτρέπουν άλλα θηλυκά να γεννήσουν στον ίδιο καρπό σε συνθήκες αγρού (Cirio και Vita, 1977). Είναι αξιοσημείωτο ότι το α-πινένιο είναι το πιο ελκυστικό μείγμα στο τεστ ωοτοκίας και η παρουσία σημαντικής ποσότητα στις πτητικές ουσίες των φύλων της ελιάς, δείχνει ότι η οσμή του φυτού είναι διεγερτική για την ωοτοκία του δάκου. Σχήμα 4. Τεστ ωοτοκίας. Τα διαφορετικά νούμερα δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. 1: α-πινένιο, 2: ΝΞ, 3: π-ξυλόλιο, 4: μυρκενόνη, 5: αιθυλοβενζόλιο, 6: κ-οκτάνιο, 7: ο-ξυλόλιο, 8: (Ε)-2-εξενάλη, 9: εξανάλη. ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 7

Ουσίες στο νερό ξαλμυρίσματος (ΝΞ) και το νερό απορροής (ΝΑ). Συνολικά 11 πτητικές ουσίες βρέθηκαν στο ΝΞ και το ΝΑ. Από αυτές, η αμμωνία είναι γνωστή ελκυστική ουσία πολλών εντόμων. Στο ΝΞ βρέθηκε σε υψηλή συγκέντρωση, όμως η προσθήκη σε αυτό στρεπτομυκίνης μείωσε σημαντικά την ποσότητα αυτή. Αυτό σημαίνει ότι η αμμωνία παράγεται λόγω μικροβιακής δραστηριότητας. Στο ΝΑ βρέθηκε επίσης αμμωνία, η ποσότητα της οποίας μειώνεται μόλις βρέξει και ανεβαίνει πολύ μετά από 6-10 μέρες λόγω μικροβιακής δράσης. Αναφορικά με την ελκυστικότητα, όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, το ΝΞ είναι το πιο ελκυστικό. Όταν προστεθεί σε αυτό στρεπτομυκίνη, παύει να ελκύει τον δάκο, κάτι που σημαίνει ότι οι ελκυστικές ουσίες παράγονται από μικροβιακή δράση. Από τις διάφορες πτητικές ουσίες που υπάρχουν στο ΝΞ, το στυρένιο είναι η πιο ελκυστική. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, η ελκυστικότητα του σχετίζεται με τη συγκέντρωση. Επίσης, είναι αξιοσημείωτο το ότι δεν έχει καμία ελκυστική δράση απέναντι στους αρσενικούς δάκους. Σχήμα 5. Ελκυστικότητα του δάκου. Τα διαφορετικά νούμερα δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. 1: στυρένιο σε θηλυκούς δάκους, 1m: στυρένιο σε αρσενικούς δάκους 2: νερό, 3: αιθυλοβενζόλιο, 4: τολουόλιο. ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 8

Στο πείραμα ωοτοκίας, έγινε σύγκριση του στυρενίου με το α-πινένιο, το οποίο από παλιότερη μελέτη βρέθηκε πολύ δραστικό. Όπως φαίνεται στο σχήμα 6, το στυρένιο είναι δραστικότερο σε μικρές συγκεντρώσεις (5 και 10 ppm). Αντίθετα, το α-πινένιο είναι πιο δραστικό όταν η συγκέντρωση αυξάνει (20 ppm). Σχήμα 6. Τεστ ωοτοκίας. Τα διαφορετικά νούμερα δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. 1: στυρένιο, 2: α-πινένιο, 3: αιθυλοβενζόλιο, Το στυρένιο δε βρέθηκε στις ουσίες που εκλύονται από τους καρπούς της ελιάς ή τα φύλλα. Είναι πολύ πιθανό να προέρχεται από το μεταβολισμό επιφυτικών μικροοργανισμών, κάτι που ισχύει για την αμμωνία. Αυτοί οι μικροοργανισμοί ενεργοποιούνται έπειτα από τις καλοκαιρινές βροχές. Μια βασική διαφορά των δύο αυτών ουσιών ως προς την ελκυστικότητα είναι ότι το στυρένιο εξειδικευμένα προσελκύει τα θηλυκά άτομα του δάκου, ενώ η αμμωνία είναι ελκυστική για όλα τα έντομα της οικογένειας Tephritidae. 4. Συμπεράσματα Για να μελετηθεί η επίδραση των ουσιών που εκλύονται από την ελιά, τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν φύλλα ή καρποί διαφόρων σταδίων ωριμότητας. Από τις ουσίες που απομονώθηκαν, το τολουόλιο και το αιθυλοβενζόλιο ήταν οι πιο ελκυστικές, ενώ η ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 9

(Ε)-2-εξενάλη είχε ισχυρή απωθητική δράση. Σε πειράματα αναφορικά με την ωοτοκία του θηλυκού δάκου, το α-πινένιο φάνηκε να προσελκύει περισσότερο το δάκο για ωοτοκία. Αντίθετα, οι ουσίες (Ε)-2-εξενάλη και εξανάλη βρέθηκαν να ελαττώνουν δραστικά την ωοτοκία. Στο νερό ξαλμυρίσματος των καρπών και το νερό απορροής των φύλλων της ελιάς βρέθηκαν συνολικά 11 πτητικές ουσίες. Από αυτές, το στυρένιο και η αμμωνία βρέθηκαν να έχουν την μεγαλύτερη ελκυστική δράση για το δάκο. Το στυρένιο εξειδικευμένα προσελκύει τα θηλυκά άτομα του δάκου, ενώ η αμμωνία είναι ελκυστική για όλα τα έντομα της οικογένειας Tephritidae. Και οι δύο αυτές ουσίες είναι προϊόντα μικροβιακής δραστηριότητας. Τόσο οι ελκυστικές ουσίες (τολουόλιο, αιθυλοβενζόλιο, α-πινένιο, στυρένιο και αμμωνία), όσο και οι απωθητικές [(Ε)-2-εξενάλη και εξανάλη] θα πρέπει να αξιολογηθούν σαν μέσα παγίδευσης του δάκου με σκοπό την παρακολούθηση του πληθυσμού ή ακόμα και την καταπολέμησή του. Βιβλιογραφία Girolami, V., Strapazzon., A. and De Gerloni, P. F. 1982. Insect-plant relationship in olive flies: General aspects and new findings, pp. 258-267. In: R, Cavalloro (ed.). Fruit Flies of Economic Importance. Proceedings in the CEC/IOBC International Symposium, Athens, Balkema, Rotterdam. Scarpati, M. L., Lo Scalzo, R. and Vita, G. 1993. Olea europaea volatiles attractive and repellent to the olive fruit fly (Dacus oleae, Gmelin). J. Chem. Ecol. 19:881-891. Scarpati, M. L., Lo Scalzo, R., Vita, G. and Gambacorta, A. 1996. Chemiotropic behavior of female olive fly (Bactrocera oleae GMEL.) on Olea europaea L. J. Chem. Ecol., 22:1027-1036. Vita, G. and Cirio, U. 1980. Fruit fly control by chemical attractants and repellents. Boll. Lab. Entomol. Agric., 37:127-139. ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΧΕΙΜΕΡΙΝΟ ΕΞΑΜΗΝΟ 2006-2007 10