ΔΙΑΚΥΜΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VIII, ΚΥΣΤΙΔΙΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΤΟΝ TF ΣΕ FFP ΠΛΟΥΣΙA ΚΑΙ ΦΤΩΧA ΣΕ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΑΚΥΜΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VIII, ΚΥΣΤΙΔΙΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΤΟΝ TF ΣΕ FFP ΠΛΟΥΣΙA ΚΑΙ ΦΤΩΧA ΣΕ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ ΦΟΙΤΗΤΡΙΑ: ΚΟΚΚΙΝΟΓΕΝΗ ΣΤΑΜΑΤΙΝΑ ΚΟΚΚΙΝΟΓΕΝΗ ΣΤΑΜΑΤΙΝΑ ΕΙΣΗΓΗΤΕΣ: ΚΡΙΕΜΠΑΡΔΗΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ, ΠΑΥΛΟΥ ΕΥΘΥΜΙΑ ΑΘΗΝΑ 2016 1

HELLENIC REPUBLIC TECHNOLOGICAL EDUCATIONAL INSTITUTE OF ATHENS Faculty of Health and Caring Professions Department of Medical Laboratories THESIS FACTOR VII LEVELS PLATELET VESICLES AND TISSUE FACTOR IN PLATELET RICH PLASMA AND PLATELET POOR PLASMA FRESH FROZEN PLASMA STUDENT ΚΟΚΚΙΝΟΓΕΝΗ ΣΤΑΜΑΤΙΝΑ KOKKINOGENI STAMATINA SUPERVISORS: KRIEBARDIS ANASTASIOS, PAVLOU EFTHIMIA ATHENS 2016 2

3

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους δικούς μου ανθρώπους, την οικογένεια μου και τους φίλους μου, που με στηρίζουν σε κάθε επιλογή που κάνω, κάθε στιγμή. Ένα ευχαριστώ στους εργαζόμενους στο τμήμα Αιμοδοσίας Έλεγχος Αιμόστασης και Παραγώγων του Ιπποκρατείου Νοσοκομείου Αθηνών για την βοήθεια που προσέφεραν ώστε να ολοκληρωθεί αυτή η εργασία. Ένα μεγαλύτερο ευχαριστώ στους καθηγητές μου, κ. Κριεμπάρδη και κα Παύλου για τη βοήθεια και την καθοδήγηση τους. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου ξεχωριστά στις συμφοιτήτριες και συναδέλφους Κόγια Άννα και Μήτσια Μάγδα, που με στήριξαν και βοήθησαν στη διαχείριση του άγχους μου μέχρι την ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Σας ευχαριστώ!!! 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ.4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ..7 ABSTRACT..8 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ..9 Α1. Φρέσκο Κατεψυγμένο Πλάσμα...10 Α1.1. Ενδείξεις μετάγγισης FFP...12 Α1.2. Νεότερες χρήσεις του PRP...12 Α2. Αιμόσταση...13 Α2.1. Πρωτογενής αιμόσταση....13 Α2.2. Δευτερογενής αιμόσταση..14 Α2.3. Ινωδόλυση..18 Α3. Αιμοπετάλια.. 18 Α3.1. Μορφολογία αιμοπεταλίων..18 Α3.1.1. Κυτταρική μεμβράνη.19 Α3.1.2. Γλυκοκάλυκας 20 Α3.1.3. Κυτταρικός σκελετός.21 Α3.1.4. Κυτταρόπλασμα.21 Α3.1.5. Υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης. 22 Α3.1.5.1. Ιντεγκρίνες - GPIIb-IIIa 23 Α3.1.5.2. Υποδοχείς πλούσιοι σε λευκίνη - GPIb-V-IX 24 Α3.1.5.3. Σελεκτίνες - P-σελεκτίνη. 24 Α4. Κυστίδια (MPs).25 Α4.1. Κυστίδια αιμοπεταλίων (PMPs)..26 Α4.2. Κυστίδια και θρόμβωση... 27 Α4.3. Ανίχνευση αιμοπεταλιακών κυστιδίων...27 Α4.4. Ανεξίνη V... 28 Α4.5. Διάκρηση κυστιδίων-εξωσωμάτων-αποποτωτικών σωμάτων. 28 Α4.6. Απομάκρυνση κυστιδίων από την κυκλοφορία..28 Α5. Παράγοντας VIII..29 Α5.1. Δομή...29 Α5.2. Δράση και αδρανοποίηση 30 5

Α5.3 Σύνδεση με τον παράγοντα νοn Willebrand.. 31 Α5.4. Έλλειψη παράγοντα VIII 31 Α6. Ιστικός Παράγοντας TF..32 Α6.1.Δομή και ιδιότητες TF. 32 A6.2. Έκφραση και κατανομή TF...34 Α6.3. Παθολογική αύξηση TF.35 A6.4. Ενεργοποίηση και αναστολή TF.35 Α6.5. Αναστολέας της οδού του TF - Tissue factor pathway inhibitor (TFPI).35 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...36 Β1. Δειγματοληψία Επεξεργασία δειγμάτων...38 Β2. Μέτρηση Γενικών Αίματος και Βιοχημικών 37 Β3. Πρωτόκολλα 38 Β3.1. Επίπεδα Παράγοντα VIII...38 Β3.2. Μέτρηση Αιμοπεταλιακών Κυστιδίων.39 Β3.3. Επίπεδα TOTAL TFPI....40 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ......42 Γ1. Παράγοντας VIII.42 Γ2. Κυστίδια αιμοπεταλίων..44 Γ3. TFPI..49 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...51 Δ1. Παράγοντας VIII..51 Δ2. Κυστίδια αιμοπεταλιακής προέλευσης..51 Δ3. Προσδιορισμός TFPI...52 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...53 6

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η μετάγγιση αίματος αποτελεί ένα πολύ χρήσιμο αγαθό για την αντιμετώπιση πολλών κλινικών καταστάσεων. Αν και έχει υπάρξει αντικείμενο μελέτης πολλά χρόνια, πολλοί μηχανισμοί δράσης των συστατικών του αίματος δεν είναι ακόμα ξεκάθαροι. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η παρατήρηση του παράγοντα VIII, των αιμοπεταλιακών κυστιδίων και της εξωγενούς οδού πήξης σε φρέσκο κατεψυγμένο πλάσμα φτωχό, αλλά και πλούσιο σε αιμοπετάλια. 7

ABSTRACT Blood transfusion is a valuable good in terms of multiple clinical situations. Though it has been studied for many years, there are mechanisms of action of blood products that is not clear yet. The purpose of this study is to observe coagulation factor VIII levels, platelet vesicles and the extrinsic coagulation pathway in platelet poor fresh frozen plasma samples but also in platelet rich fresh frozen plasma samples. 8

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το αίμα είναι ο υγρός ιστός του ανθρώπινου οργανισμού. Αποτελείται από κύτταρα όπως ερυθροκύτταρα (red blood cells, RBCs), λευκοκύτταρα (white blood cells, WBCs), αιμοπετάλια ή θρομβοκύτταρα (platelets, PLTs), δικτυοερυθροκύτταρα (ΔΕΚ) και από μεσοκυττάρια ουσία (πλάσμα). Τα κύτταρα του αίματος αιωρούνται μέσα στο πλάσμα και ονομάζονται αιμοσφαίρια. (1,2) Το αίμα αποτελεί πηγή ζωής για τον ανθρώπινο οργανισμό, με τη μετάγγισή του να είναι σωτήρια για τις ζωές των ασθενών με ακατάσχετη αιμορραγία, καθώς και εκείνων που δεν μπορούν να το παράγουν αποτελεσματικά λόγω διαταραχών της αιμοποίησης τους. Το ολικό αίμα σπάνια χρησιμοποιείται αυτούσιο σε μεταγγίσεις ασθενών. Συνήθως παραγωγίζεται στα συστατικά του, όπως τα συμπυκνωμένα ερυθρά αιμοσφαίρια (prbcs, packed Red Blood Cells), το φρέσκο καταψυγμένο πλάσμα (FFP, Fresh Frozen Plasma) και τα αιμοπετάλια (PLTs, Platelets), τα οποία χρησιμοποιούνται για την αναπλήρωση της απώλειας του εκάστοτε παραγώγου ή ως προφυλακτική θεραπεία. (3) Με την παραγώγηση του ολικού αίματος επιτυγχάνεται η βέλτιστη διαχείριση τους, αφού το κάθε παράγωγο συντηρείται σε διαφορετικές συνθήκες, καθώς επίσης υπάρχει ευελιξία στην επιλογή παραγώγου που θα χορηγηθεί στον ασθενή, ανάλογα με τις ανάγκες που έχει. Συμπυκνωμένα Ερυθρά Αιμοσφαίρια (ΣΕ) Λαμβάνονται με αφαίρεση του πλάσματος με ενσωματωμένες συσκευασίες μεταφοράς, μέσω φυγοκέντρησης ήπιας ή υψηλής ταχύτητος. Ο όγκος τους είναι 200-350 ml και ο αιματοκρίτης τους υπολογίζεται συνήθως 55%-80%. Η χορήγηση μιας μονάδα ΣΕ σε ενήλικα, αυξάνει κατά μέσο όρο την αιμοσφαιρίνη του κατά 1 g/dl σε 2-24 ώρες μετά τη μετάγγιση, εξαρτάται βέβαια από το ύψος και βάρος του ασθενούς, την παρουσία ή μη σπληνομεγαλίας ή νεφρικής ανεπάρκειας και τη συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης της μεταγγιζόμενης μονάδας ΣΕ, την ηλικία των RBCs. 9

Αιμοπετάλια (PLTs) Τα συμπυκνωμένα αιμοπετάλια από ολικό αίμα τυχαίων δοτών παράγονται με δύο τρόπους: από πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (Platelet Rich Plasma, PRP) και από τη στιβάδα των λευκοκυττάρων (4), ενώ ο αριθμός των περιεχομένων αιμοπεταλίων εξαρτάται από τη μέθοδο παρασκευής τους. Περιληπτικά από μια μονάδα ολικού αίματος τυχαίου δότη (από PRP ή BC) λαμβάνονται 0,45-0,85 10 11 αιμοπετάλια/ασκό ενώ από δεξαμενή BC (4-8 μονάδες τυχαίων δοτών), η ελάχιστη περιεκτικότητα είναι 2,3 10 11 αιμοπετάλια/ασκό. Α1. Φρέσκο Κατεψυγμένο Πλάσμα Φρέσκο κατεψυγμένο πλάσμα (Fresh Frozen Plasma, FFP) ονομάζεται το πλάσμα το οποίο καταψύχεται σε θερμοκρασία ίση ή μικρότερη των -30 O C σε διάστημα εντός 8 ωρών από τη συλλογή του. Αυτή η συλλογή γίνεται είτε με επεξεργασία από ασκό ολικού αίματος, κατά την οποία η ποσότητα του πλάσματος που λαμβάνεται είναι περίπου 250 ml, είτε με πλασμαφαίρεση (FFPA), όπου η ποσότητα είναι περίπου 500ml. (5,6) Μετά τη λήψη αίματος σε τριπλό σύστημα ασκών γίνεται φυγοκέντρηση και συμπίεση αυτού ώστε να διαχωριστούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια από το πλάσμα και τα αιμοπετάλια (Platelet Rich Plasma, PRP). Έπειτα, με μια δεύτερη φυγοκέντρηση και συμπίεση του ασκού που περιέχει το PRP, διαχωρίζονται τα αιμοπετάλια από το πλάσμα (Platelet Poor Plasma, PPP). Αμέσως μετά ο ασκός του πλάσματος, ο οποίος περιέχει αντιπηκτικό citrate, καταψύχεται. Η σταθερότητα του προϊόντος κατά την αποθήκευση εξαρτάται από τη διαθέσιμη θερμοκρασία αποθήκευσης, η οποία σύμφωνα με τον Bartolomeu Nascimento και τους συνεργάτες του είναι κάτω των - 30 O C. (5) Ο ασκός, σύμφωνα με το Εθνικό Κέντρο Αιμοδοσίας, μπορεί να συντηρηθεί 24 μήνες σε θερμοκρασία χαμηλότερη από -25 ο C, 3 μήνες σε θερμοκρασία από -18 ο C έως -25 ο C. (7) Για να μεταγγιστεί ένας ασκός τοποθετείται σε υδατόλουτρο 37 o C για 20-30 λεπτά. Μετά την απόψυξη, ο ασκός μπορεί να συντηρηθεί για 24 ώρες σε θερμοκρασία 1-6 ο C. (8,9) Το FFP, όπως φαίνεται και στον πίνακα 1, περιέχει όλους τους παράγοντες πήξης σε φυσιολογικές ποσότητες, πρωτεΐνες του πλάσματος (κυρίως λευκωματίνη), 10

ηλεκτρολύτες, φυσικούς αναστολείς πήξης (πρωτεΐνη C, πρωτεΐνη S κ.α) και το αντιπηκτικό. (5,10) Επίσης υπάρχουν και κάποια εναπομείναντα κύτταρα, τα όρια των οποίων είναι: ερυθροκύτταρα <6,0 x 10 9 /L, λευκοκύτταρα <0.1 x 10 9 /L, αιμοπετάλια <50 x 10 9 /L (7). Κάποιοι παράγοντες πήξης, όπως ο παράγοντας VIII (Factor VIII, FVIII) και το ινωδογόνο χρησιμοποιούνται ως δείκτες ποιότητας πλάσματος, λόγω της μεγάλης τους ευαισθησίας. (11) Πίνακας 1. Περιεκτικότητα αιμαστατικών παραγόντων σε FFP που έχει αποψυχθεί και φυλαχθεί στους 4 o C. Μια τυπική μονάδα 300 ml περιλαμβάνει: μονάδες μέτρησης (IU/ml), εκτός από ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ Ινωδογόνο ΕΠΙΠΕΔΑ ΠΡΟΣΦΑΤΑ ΑΠΟΨΥΓΜΕΝΟΥ το ινωδογόνο (g/l). (10) ΕΠΙΠΕΔΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ 24 ΩΡΕΣ ΕΠΙΠΕΔΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ 5 ΗΜΕΡΕΣ 2*67 2*25 2*25 FII 80 80 80 FV 80 75 66 FVII 90 80 72 FVIII 92 51 41 FIX 100 FX 85 85 80 FXI 100 FXII 83 FXIII 100 11

ΑΝΤΙΘΡΟΜΒΙΝΗ III 100 von Willebrand 80 Οι τιμές προσδιορίστηκαν στο Εργαστήριο Παθολογίας του Southampton University Hospitals Trust. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης C είναι σε φυσιολογικό εύρος. Α1.1. Ενδείξεις μετάγγισης FFP Το FFP χορηγείται κυρίως για την θεραπεία ασθενών με πηκτικές διαταραχές που αιμορραγούν ή υπάρχει κίνδυνος αιμορραγίας. Μεταγγίζεται επίσης, σε ασθενείς με πολλαπλά τραύματα, που βρίσκονται σε κρίσιμη κατάστασή και σε περίπτωση αιμορραγικής καταπληξίας. Ο ακριβής μηχανισμός δράσης του δεν είναι ακόμα γνωστός, ωστόσο τα αυξημένα ποσοστά επιβίωσης στους ασθενείς που χορηγείται αποδεικνύουν ότι η μετάγγιση του βοηθά στην αύξηση της πηκτικής ικανότητας αυτών. (11) Πιο συγκεκριμένα, ενδείξεις χορήγησης FFP αποτελούν: Διάχυτη Ενδαγγειακή Πήξη Αμεση διόρθωση αιμορραγικής διάθεσης οφειλόμενης στην δράση κουμαρινικών Αντικατάσταση μεμονωμένης έλλειψης παραγόντων όταν δεν είναι διαθέσιμο το ειδικό σκεύασμα. Θρομβωτική Θρομβοπενική Πορφύρα ή Αιμολυτικό Ουραιμικό Σύνδρομο σε αιμορραγίες με παθολογικές εργαστηριακές εξετάσεις πήξης όπως, καρδιοπνευμονικές επεμβάσεις και ηπατική νόσος Μαζική μετάγγιση Ειδικές παιδιατρικές ενδείξεις Α1.2. Νεότερες χρήσεις του PRP 12

Τα τελευταία χρόνια όλο και πιο συχνά γίνεται χρήση του PRP και σε άλλους τομείς, εκτός της αιμοδοσίας. Το PRP χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο σε επεμβάσεις όπως ολική αρθροπλαστική ισχίου και γόνατος, επιδιόρθωση σκολίωσης, σπονδυλοδεσία, επέμβαση χεριών, ποδιών και οστικού μοσχεύματος. Ακόμη χρησιμοποιείται για την αντιμετώπιση χρόνιων ή οξειών τραυματισμούς μυών, τενόντων, αλλά και στην αισθητική χειρουργική σε ουλές και ρυτίδες ή τραύματα από εγκαύματα, με σκοπό να βελτιώσει την όψη και την υφή του δέρματος. Δεν είναι ακόμα απολύτως γνωστός ο μηχανισμός δράσης του PRP σε αυτές τις περιπτώσεις, τα πρώτα αποτελέσματα είναι αρκετά ενθαρρυντικά, παρόλα αυτά απαιτείται περαιτέρω έρευνα πάνω στο θέμα. (12,13,14) Α2. Αιμόσταση Αιμόσταση είναι ο φυσιολογικός μηχανισμός άμυνας του οργανισμού που εμποδίζει την απώλεια του αίματος λόγω βλάβης των αιμοφόρων αγγείων του, διασφαλίζοντας την ακεραιότητα του τοιχώματος. Η ομαλή κυκλοφορία του αίματος και η ρευστότητά του εξασφαλίζεται από τη λειτουργική ακεραιότητα και αποτελεσματικότητα του μηχανισμού της αιμόστασης. (15) Α2.1. Πρωτογενής αιμόσταση Διακρίνουμε τέσσερα στάδια στην αιμόσταση: την σύσπαση του τραυματισμένου αγγείου (αγγειοσύσπαση), την αρχική αιμόσταση, την πήξη του αίματος και την ινωδόλυση. Αυτά τα στάδια βρίσκονται σε πλήρη ισορροπία μεταξύ τους για την ομαλή κυκλοφορία του αίματος στα αγγεία. Με τον τραυματισμό του αγγείου, αυτό συσπάται, ως αποτέλεσμα αγγειοσυσπαστικών ουσιών που είτε εκλύονται στο σημείο αυτό από τα ίδια τα ενδοθηλιακά κύτταρα, ή από τα παρευρισκόμενα ή προσερχόμενα με την κυκλοφορία αιμοπετάλια (όπως η σερετονίνη) είτε προσφέρονται με την κυκλοφορία (όπως η αδρεναλίνη). Στο πρώτο λοιπόν στάδιο της αιμάστασης, τα χείλη του τραύματος έρχονται πιο κοντά και έτσι διευκολύνεται η επίσχεση της αιμορραγίας. (6) Το δεύτερο στάδιο είναι αυτό της αρχικής αιμόστασης, στο οποίο γίνεται ενεργοποίηση και προσκόλληση των αιμοπεταλίων. (16) Ο τραυματισμός του ενδοθηλίου του αγγείου αποκαλύπτει το υπενδοθηλιακό κολλαγόνο και τα 13

υπενδοθηλιακά ινίδια πάνω στα οποία γίνεται η προσκόλληση των αιμοπεταλίων, με τη βοήθεια ειδικών υποδοχέων που φέρουν στην επιφάνεια τους. Πιο συγκεκριμένα, ο υποδοχέας GPIb/IX/V ευθύνεται για την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στα υπενδοθηλιακά ινίδια με γέφυρα σύνδεσης τον παράγοντα Von Willebrand. Η σύνδεση με το κολλαγόνο γίνεται άμεσα με τους υποδοχείς GPIa/IIa (α2β1 ιντεργκρίνη ), GPVI και ιντεργκρίνης αiibβ3. (17). Με την ενεργοποίηση τους τα αιμοπετάλια μεταβάλλουν το σχήμα τους και εκκρίνουν κυρίως ADP. Η έκκριση αυτή του ADP προκαλεί συσσώρευση των αιμοπεταλίων, η οποία τελικά οδηγεί σε συγκόλληση αυτών μέσω των μεμβρανικών υποδοχέων GPIIb/IIIa. Τα συγκολλημένα αιμοπετάλια εκκρίνουν διάφορες ουσίες όπως ADP, αδρεναλίνη, σεροτονίνη, αιμοπεταλιακό παράγοντα 4 (PF-4) και κυρίως θρομβοξάνη Α2. Όλες αυτές οι λειτουργίες ολοκληρώνονται με τον σχηματισμό του αιμοπεταλιακού (λευκού) θρόμβου. (8,15,17,18) Εικόνα 1 Σχηματική απεικόνιση πρωτογενούς αιμόστασης. (16) Α2.2. Δευτερογενής αιμόσταση Η δευτερογενής αιμόσταση είναι η διαδικασία που περιγράφει τη μετατροπή του ινωδογόνου σε αδιάλυτο ινώδες. Τα μόρια του ινώδους πολυμερίζονται και 14

σχηματίζουν ένα τρισδιάστατο πλέγμα, που ονομάζεται πλέγμα ινικής και το οποίο εγκλωβίζει τα έμορφα συστατικά του αίματος. Πρόκειται για ένα πολύπλοκο βιολογικό φαινόμενο στο οποίο συμμετέχει ένας μεγάλος αριθμός ουσιών, συμπεριλαμβανομένων του ιστικού παράγοντα και των πλασματικών παραγόντων, τον παράγοντα von Willebrand, φωσφολιπιδίων και ιόντων ασβεστίου (Ca ++ ). (19) Πρόσφατα περιγράφηκε από τους Andre Amaral, Steven M. Opal, Jean-Lois Vincent (20) ένα κυτταρικό μοντέλο που αναφέρεται στη δευτερογενή αιμόσταση. Σύμφωνα με αυτό, η έναρξη της πήξης συμβαίνει όταν ο ιστικός παράγοντας (TF) εκλύεται είτε από τους ινοβλάστες (όταν υπάρχει βλάβη του ιστού όπως τραύμα ή έγκαυμα), είτε από μονοκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία ενεργοποιούνται από τις κυτταροκίνες (σε περιπτώσεις σήψης). Εκτός από τον TF που είναι ο κύριος παράγοντας έναρξης της πήξης, η ενδοτοξίνη, ξένα σώματα και αρνητικά φορτισμένα μόρια μπορούν επίσης να συμβάλουν στην ενεργοποίηση του πηκτικού μηχανισμού. Ο TF λοιπόν σε συνδυασμό με τον FVIIa στις επιφάνειες των κυτταρικών μεμβρανών προκαλούν την έναρξη της διαδικασίας την πήξης και ακολουθεί μαζική ενίσχυση της παραγωγής θρομβίνης από το προθρομβινικό σύμπλεγμα ( FXa και FVa), πάνω στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων. Η εξωγενής οδός πήξης ξεκινά με τον σχηματισμό του συμπλέγματος TF/VIIa. Σε φυσιολογικές συνθήκες το μεγαλύτερο μέρος (99%) του FVII κυκλοφορεί στο πλάσμα σε αδρανή μορφή. Μόλις συνδεθεί με τον TF ενεργοποιείται μέσω περιορισμένης πρωτεόλυσης. Το ενεργό σύμπλεγμα TF/FVII ενεργοποιεί τον FIX (FIXa) και εν μέρει τον FX (FXa), από την ενεργοποίηση του οποίου δημιουργούνται τα πρώτα ίχνη θρομβίνης. Ο FIX σχηματίζει σύμπλεγμα με τον FVIIIa, που έχει ενεργοποιηθεί από τα πρώτα ίχνη θρομβίνης και παρουσία ιόντων Ca ++ και φωσφολιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης, ενεργοποιεί επίσης τον FX (FXa), ξεκινώντας έτσι η ενδογενής οδός πήξης. Οι παράγοντες V,VIII, IX και X είναι παρόντες στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, προστατευμένοι από την αναστολή από το πρωτεάσες του πλάσματος, συμβάλουν στην παραγωγή της θρομβίνης η οποία με την σειρά της θα μετατρέψει το ινωδογόνο σε ινώδες. Ταυτόχρονα, οι παράγοντες αυτοί ασκούς θετική ανάδραση στη δική τους οδό ενεργοποιώντας τους παράγοντες V,VIII και XI. Η ενεργοποίηση των FIX και FVIII συμβάλλει περισσότερο στη διατήρηση του σχηματισμού ινώδους. Ο κοινός στόχος που έχουν τα ενζυμικά συμπλέγματα 15

IXa/VIIIa και TF/VIIa είναι η ενεργοποίηση του FX. Ο FXa, παρουσία ιόντων Ca ++ και φωσφολιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης, συνδέεται με τον FVa, ο οποίος έχει ενεργοποιηθεί από τη θρομβίνη. Το σύμπλεγμα Xa/Va ονομάζεται προθρομβινάση ή προθρομβινικό σύμπλεγμα και μετατρέπει ταχύτατα την προθρομβίνη σε μεγάλη ποσότητα θρομβίνης. Η τελική δράση της θρομβίνης συνίσταται στη μετατροπή του ινωδιγόνου σε ασταθές ινώδες και στην ενεργοποίηση του FXIII, ο οποίος συμμετέχει στη δημιουργία σταθερού θρόμβου, με τον σχηματισμό διασταυρωτών συνδέσμων που καθιστούν την ινική ανθεκτικότερη στη διάσπαση από την πλασμίνη. Η συμμετοχή των αιμοπεταλίων στον αιμοστατικό θρόμβο προσδίδει σε αυτόν ακόμα σταθερότερη δομή. Ένα ακόμα σημαντικός παράγοντας στην σταθεροποίηση του θρόμβου είναι ο αναστολέας της ινωδόλυσης ενεργοποιημένος από θρομβίνη (TAFI, thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor). Η πρωτεΐνη αυτή περιορίζει σημαντικά τη δραστηριότητα της πλασμίνης, δεσμεύοντας τα αμινοξέα του ινώδους, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δέσμευση με την πλασμίνη. (20) 16

Εικόνα 2 Σχηματική αναπαράσταση της ενδογενούς και εξωγενούς οδού πήξης. Στο σχήμα φαίνεται η δράση του Ιστικού παράγοντα στην έναρξη του μηχανισμού της πήξης, η αλληλεπίδραση των δύο οδών και ο ρόλος της θρομβίνης στην στήριξη του καταρράκτη. Από: Ferguson et al, Eur Heart J 1998; Suppl 19:8. Graphic 69920 Version 1.0 Το σύστημα πήξης του αίματος έχει την ικανότητα να ρυθμίζει τα ένζυμα της αιμόστασης, έτσι ώστε το ινώδες να περιορίζεται στο σημείο της βλάβης να μην γενικεύεται η όλη διαδικασία της πήξης. Οι μηχανισμοί που αποτρέπουν τη γενίκευση αυτή περιλαμβάνουν τους φυσικούς αναστολείς της πήξης, όπως η αντιθρομβίνη 17

(AT), η πρωτεΐνη C (PC), η πρωτεΐνη S (PS) και ο αναστολέας της οδού του ιστικού παράγοντα (TFPI, tissue factor pathway inhibitor). Α2.3. Ινωδόλυση Το τελευταίο βήμα της αιμόστασης, είναι η ινωδόλυση, η οποία εξασφαλίζει την ομαλή ροη του αίματος στα αγγεία λύνοντας το θρόμβο και ομαλοποιώντας το ενδοθηλιακό τοίχωμα των αγγείων. Βασική ουσία της ινωδόλυσης είναι μια β2- σφαιρίνη του αίματος, το πλασμινογόνο, που παράγεται στο ήπαρ και κυκλοφορεί στο αίμα προσκολλημένο πάνω στο ινωδογόνο. Το πλασμινογόνο ενεργοποιείται από τον ιστικό ενεργοποιητή (tpa) και την ουροκινάση (upa) και σχηματίζεται η πλασμίνη. Η πλασμίνη αδρανοποιεί τους παράγοντες V, VIII και XIII, διασπά το ινωδογόνο, παράγοντας μονομερή D και E και διασπά το ινώδες, παράγοντας επίσης μονομερή E και D διμερή. (2,21,22,16) Ο αιμοστατικός μηχανισμός είναι ένας φυσιολογικός μηχανισμός άμυνας του οργανισμού. Οποιαδήποτε εκτροπή αυτού έχει ως επακόλουθο την εμφάνιση παθολογικών κλινικοεργαστηριακών ευρημάτων. Ανεπάρκεια των παραγόντων πήξης ή αυξημένη δραστηριότητα του ινωδολυτικού συστήματος έχει ως αποτέλεσμα εμφάνιση αιμορραγικού συνδρόμου. Αντίθετα, ανεπάρκεια των αναστολέων πήξης ή αυξημένη δραστηριότητα του πηκτικού μηχανισμού οδηγεί σε θρόμβωση. Α3. Αιμοπετάλια Τα αιμοπετάλια είναι τα μικρότερα έμμορφα στοιχεία της κυκλοφορίας με διάμετρο 2-5 μm και πάχος 0,5 μm, ενώ δεν έχουν πυρήνα. Παράγονται στο μυελό των οστών από τη θραύση του κυτταροπλάσματος των μεγακαρυοκυττάρων, κάθε μεγακαρυοκύτταρο παράγει 3 έως 4 χιλιάδες αιμοπετάλια. Η διάρκεια ζωής των αιμοπεταλίων στο αίμα είναι περίπου 10 ημέρες και τελικώς απομακρύνονται από τα μακροφάγα του σπλήνα. Καθημερινά ανανεώνεται περίπου το 10% του αριθμού τους, ο οποίος φθάνει στις 150.000 έως 400.000 ανά μl αίματος. Α3.1. Μορφολογία αιμοπεταλίων Σε κατάσταση ηρεμίας τα αιμοπετάλια έχουν δισκοειδές σχήμα, ενώ όταν ενεργοποιηθούν γίνονται πιο σφαιρικά και αναπτύσσουν προσεκβολές. Σύμφωνα με μελέτη που έκαναν το 2007 οι Γκιρτοβίτης, Μακρής και Παπαδόπουλος (23), 18

διακρίνουν τρεις τύπους κατά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Ο πρώτος τύπος είναι ο «ήρεμος» (circulating form) και είναι αυτός που παρατηρείται στην κυκλοφορία του αίματος σε φυσιολογικές μη ενεργοποιημένες συνθήκες. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, στη φάση αυτή το σχήμα των αιμοπεταλίων είναι δισκοειδές με επιφάνεια διάτρητη από οπές. Ο δεύτερος τύπος είναι ο δενδριτικός (dendritic form) και παρατηρείται κατά την αρχική φάση της ενεργοποίησης τους. Σε αυτό το στάδιο παρατηρείται μεταβολή του σχήματος των αιμοπεταλίων. Αρχικά το σχήμα τους γίνεται πιο σφαιρικό και στη συνέχεια εμφανίζονται προσεκβολές στην επιφάνεια τους. Ο τελευταίος τύπος είναι ο απλωμένος (spread form), κατά τον οποίο τα αιμοπετάλια χάνουν τις προσεκβολές τους και παίρνουν την μορφή λεπτής μεμβράνης που συνεχώς απλώνεται, παρατηρείται επίσης κεντρική αύξηση της πυκνότητας τους. (23) Τα αιμοπετάλια αποτελούνται από μεμβράνη, η οποία επικαλύπτεται από γλυκοκάλυκα, κυτταρικό σκελετό και κυτταρόπλασμα. Α3.1.1. Κυτταρική μεμβράνη Η μεμβράνη των αιμοπεταλίων αποτελείται από μια διπλοστοιβάδα φωσφολιπιδίων, στην οποία εμπεριέχονται κυρίως γλυκοπρωτεΐνες και χοληστερόλη, ενώ ανάμεσα τους βρίσκεται μια ακόμα στιβάδα, πρωτεϊνικής φύσεως. Έχει πάχος 7-9 nm και είναι διάτρητη από ένα σύστημα μικροσωληναρίων, το οποίο αυξάνει εντυπωσιακά την έκταση αλλά και τη λειτουργικότητά της. Προέρχεται από το ενδοπλασματικό δίκτυο των μεγακαρυοκυττάρων. Αποτελεί φυσικό και χημικό φραγμό ενώ παράλληλα επιτρέπει την ενεργό δίοδο ιόντων και μεταβολιτών μέσω της αντλίας καλίου-νατρίου αλλά και άλλων αντλιών. Τα κύρια συστατικά της μεμβράνης είναι τα λιπίδια (35%), οι πρωτεΐνες (57%) και οι υδατάνθρακες (8%), ενώ στην εξωτερική της επιφάνεια υπάρχει πλήθος υποδοχέων. Από το ποσοστό των λιπιδίων, το μεγαλύτερο μέρος (75%) είναι φωσφολιπίδια, τα οποία αποτελούν και το κύριο δομικό υλικό της μεμβράνης. Τα φωσφολιπίδια αυτά αποτελούνται κυρίως από φωσφατιδυλοχολίνη (38%), φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (27%), σφιγγομυελίνη (17%), φωσφατιδυλοσερίνη (10%) και φωσφατιδυλινοσιτόλη (5%). Το υπόλοιπο 25% των λιπιδίων, αποτελείται από ουδέτερα λίπη, κυρίως χοληστερόλη και σε μικρότερο ποσοστό από γλυκολιπίδια. Εξωτερικά, η λιπιδική στιβάδα αποτελείται κυρίως από σφιγγομυελίνη και έχει 19

ουδέτερο ή αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο. Το τμήμα αυτό των αιμοπεταλίων δεν παίρνει μέρος στην αιμόσταση. Εσωτερικά αποτελείται κυρίως από φωσφοδιεστέρες, οι οποίοι έχουν αρνητικό φορτίο και έχουν ιδιότητες που προάγουν τη διαδικασία της πήξη, όπως η φωσφατιδυλοσερίνη. (23,24) Σε κατάσταση ηρεμίας τα αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια βρίσκονται στο εσωτερική επιφάνεια της μεμβράνης των αιμοπεταλίων. Σε περίπτωση αγγειακής βλάβης και αιμορραγίας τα αιμοπετάλια ενεργοποιούνται, τα φωσφολιπίδια βγαίνουν στην εξωτερική επιφάνειά τους και συμβάλουν στην αιμόσταση και στην αντιμετώπιση της βλάβης. Οι πρωτεΐνες της μεμβράνης διακρίνονται σε αυτές που διαπερνούν όλο το μήκος της (ολικές) και σε αυτές που εντοπίζονται στο εσωτερικό της. Το εξωτερικό τμήμα των ολικών πρωτεϊνών γλυκοζυλιώνεται και παρουσιάζει λειτουργίες υποδοχέα, ενώ το εσωτερικό τμήμα των πρωτεϊνών αυτών, αλληλεπιδρά με συστατικά του κυτταρικού σκελετού. Α3.1.2. Γλυκοκάλυκας Ο γλυκοκάλυκας είναι ένα παχύ στρώμα (πάχος 10-50 nm) που περιβάλλει το αιμοπετάλιο εξωτερικά. Αποτελείται από βλεννοπολυσακχαρίτες και από μεγάλη ποσότητα σιαλικού οξέος ενώ περιλαμβάνει και γλυκοπρωτεΐνες (GP), οι οποίες αποτελούν υποδοχείς για τις πρωτεΐνες προσκόλλησης και για τους αγωνιστές των αιμοπεταλίων. Το αρνητικό φορτίο του συμβάλλει στο να ελαχιστοποιούνται οι επαφές με τα υπόλοιπα αιμοπετάλια και το τοίχωμα των αγγείων. (23,24) 20

Εικόνα 3. Απεικόνιση της κυτταρικής μεμβράνης των αιμοπεταλίων. Φαίνονται η διπλοστιβάδα φωσφολιπιδίων, ο γλυκοκάλυκας, η φωσφατιδυλοχολίνη στην εξωτερική στιβάδα και η φωσφατιδυλοσερίνη στην εσωτερικλη στιβάδα. (24) Α3.1.3. Κυτταρικός σκελετός Ο κυτταροσκελετός καθορίζει τη λειτουργία των αιμοπεταλίων, αφού είναι υπεύθυνος για το σχήμα τους, τη δημιουργία των ψευδοποδίων που εμφανίζονται μετά την ενεργοποίησή τους, τη μεταφορά - έκκριση των κυστιδίων διαφόρων ουσιών και άλλες λειτουργίες. Αποτελείται από την ινώδη συσκευή (microfilaments) στο κεντρικό του μέρος και από την περιφερική δέσμη των μικροσωληναρίων (marginal bundle of microtubulus), η οποία αναπτύσσεται ακριβώς κάτω από τη μεμβράνη. Η ινώδης συσκευή αποτελείται από το σύστημα των πυκνών σωληναρίων (Dense Tubular System, DTS), το οποίο αποτελεί κύρια αποθήκη ελεύθερων ιόντων ασβεστίου το σύστημα των ανοικτών σωληναρίων (Surface Connected open canalicular System, SCS), οι κύριες λειτουργίες των οποίων είναι η είσοδος και η μετακίνηση εξωγενούς υλικού προς το εσωτερικό του κυττάρου και η μετακίνηση των κοκκίων του πρωτοπλάσματος προς το κέντρο του, όταν τα αιμοπετάλια διεγερθούν, και η συμβολή στη μετακίνηση των συσταλτών πρωτεϊνών, οι οποίες μετέχουν στη μεταβολή της μορφολογίας των αιμοπεταλίων και στην εσωτερική ανακατανομή των σωματιδίων τους, όταν αυτά διεγερθούν από έναν εξωγενή διεγέρτη, στην εξώθηση του περιεχομένου των σωματιδίων και στη συστολή του θρόμβου. Α3.1.4. Κυτταρόπλασμα Στο κυτταρόπλασμα των αιμοπεταλίων υπάρχουν ριβοσώματα, mrna, μιτοχόνδρια, υπεροξεισώματα, ελεύθερα κοκκία γλυκογόνου, διαφόρων ειδών ινίδια που αποτελούν τον κυτταροσκελετό, εκκριτικά κοκκία κ.α. (24) Τα κοκκία διακρίνονται σε α-κοκκία και σε δ-κοκκία (ή πυκνά). Στα α- κοκκία, τα οποία είναι περισσότερα σε αριθμό (50-80/αιμοπετάλιο), αποθηκεύονται πρωτεΐνες πρόσδεσης, γλυκοπρωτεϊνικοί υποδοχείς, όπως ο υποδοχέας της P- σελεκτίνης καθώς και οι περισσότεροι αιμοπεταλιακοί παράγοντες. Ακόμα αποθηκεύονται οι παράγοντες πήξης (ινωδογόνο, παράγοντας von Willebrand, 21

παράγοντες FI, FV, FVIII, FXΙ, FXII, FXIII, πρωτεΐνη S, κ.λπ.). Τα δ-κοκκία είναι υπεύθυνα για την αποθήκευση των μη μεταβολικών ουσιών, όπως σεροτονίνη, ασβέστιο, τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP), διφωσφορική αδενοσίνη (ADP) και πυροφωσφορικό οξύ. Τα λυσοσώματα στα αιμοπετάλια του ανθρώπου είναι σχετικά λίγα και δύσκολα διακρίνονται από τα υπόλοιπα α και δ-κοκκία. Είναι γεμάτα υδρολυτικά ένζυμα, τα οποία εκκρίνονται κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων. Τα μιτοχόνδρια κυμαίνονται από 10-60 ανά αιμοπετάλιο. Λειτουργούν ως χώροι αποθήκευσης ασβεστίου. Παράλληλα, σε αυτά πραγματοποιούνται βιοχημικές αντιδράσεις, όπως οι φωσφορυλιώσεις και οι ενδοαιμοπεταλιακές αναπνευστικές αντιδράσεις. Τέλος, παρατηρούνται τα υπεροξεισώματα, που αποτελούν πολύ μικρά οργανίδια και περιέχουν ένζυμα τα οποία καταλύουν τις χημικές αντιδράσεις της σύνθεσης φωσφολιπιδίων. Α3.1.5. Υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης Οι υποδοχείς των αιμοπεταλίων έχουν πρωταρχικό ρόλο στη φυσιολογική διαδικασία της πήξης του αίματος. Είναι εξειδικευμένοι για συγκεκριμένες προσκολλητικές ουσίες, οι οποίες εκτός από τη μεμβράνη των αιμοπεταλίων εντοπίζονται και στο απογυμνωμένο ενδοθήλιο των αγγείων. Επιπλέον, οι υποδοχείς των αιμοπεταλίων μπορούν να δέχονται ερεθίσματα από το εξωτερικό περιβάλλον και να τα διαβιβάζουν στο εσωτερικό του. Σύμφωνα με τους Γκιρτοβίτη, Μακρή και Παπαδόπουλο (23), οι υποδοχείς των αιμοπεταλίων, ανάλογα με τη μοριακή δομή τους, ταξινομούνται σε τέσσερις κυρίως κατηγορίες: στις ιντεγκρίνες, στους πλούσιους σε λευκίνη υποδοχείς, στις σελεκτίνες και στους υποδοχείς ανοσοσφαιρινικής δομής. Πίνακας 2. Υποδοχείς της μεμβράνης αιμοπεταλίων (23) 22

Υποδοχείς Άλλο όνομα Clusters of differentiation (CD) Αριθμός υποδοχέων ανά αιμοπετάλιο Ιντεγκρίνες GPIa-IIa Υποδοχέας κολλαγόνου, α2β1, VLA-2 CD 49b 1.000 GPIc-IIa GPIc-IIa Υποδοχέας φιμπρονεκτίνης, α5β1, VLA-5 υποδοχέας λαμινίνης, α6β1, VLA-6 CD 49c 1.000 CD 49f 1.000 GPIIb-IIIa αιιbβ3 CD 41 CD 61 80.000 100.000 GPαν-ΙΙΙa υποδοχέας βιτρονεκτίνης, ανβ3 CD 51 CD 61 100 Πλούσιοι σε λευκίνη GPIb-V-IX - CD 42a-b-c 25.000 GPIV GPIIIb CD 36 15.000-25.000 Σελεκτίνες P- σελεκτίνη GMP 140 CD 62P 12.000 Ανοσοσφαθρινικοί ICAM-2 - CD 102 5.000 PCAM-1 - CD 31 3.000 Ενσωματωμένοι λυσοσωμικοί CR53 - CD 63 3.000 Για την ονομασία των αιμοπεταλιακών υποδοχέων έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα συστήματα. Από τα πιο διαδεδομένα είναι αυτό που στηρίζεται στην ηλεκτροφοριτική τους ικανότητα σε γέλη πολυακρυλαμίδης. Α3.1.5.1. Ιντεγκρίνες - GPIIb-IIIa 23

Πολλοί από τους πρωτεϊνικούς υποδοχείς των αιμοπεταλίων, ανήκουν στην κατηγορία των ιντεγκρινών. Το μόριο αυτών αποτελείται από μία α και μία β πολυπεπτιδική αλυσίδα, σχηματίζοντας έτσι ετεροδιμερή συμπλέγματα. Το σύμπλεγμα των γλυκοπρωτεϊνών IIb-IIIa ανευρίσκεται αποκλειστικά στα αιμοπετάλια και αποτελούν έτσι το βασικό εκπρόσωπος των υποδοχέων αυτών. Η κύρια προσκολλητική ουσία του υποδοχέα αυτού, είναι το ινωδογόνο, ενώ δευτερεύουσες αποτελούν ο παράγοντας Willebrand, η φιμπρονεκτίνη, η βιτρονεκτίνη και η θρομβοσπονδίνη. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα μη ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, φέρουν στην επιφάνειά τους «ήρεμους» μη ενεργοποιημένους υποδοχείς. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, οδηγεί σε ταχείες μεταβολές του υποδοχέα με αποτέλεσμα την αποκάλυψη θέσεων υψηλής συγγένειας για το ινωδογόνο και τελικά στην ισχυρή σύνδεσή τους με αυτό. Η σύνδεση του ινωδογόνου στον υποδοχέα προκαλεί συσσώρευση των αιμοπεταλίων και μεταφορά σήματος από το εξωτερικό στο εσωτερικό περιβάλλον του κυττάρου, που οδηγούν σε αλλαγές του κυτταρικού σκελετού. Α3.1.5.2. Υποδοχείς πλούσιοι σε λευκίνη - GPIb-V-IX. Το γλυκοπρωτεϊνικό σύμπλεγμα Ib-V-IX αποτελεί τον ειδικό υποδοχέα για την πρόσδεση του παράγοντα Willebrand και παίζει κεντρικό ρόλο στην αρχική αιμόσταση. Μέσω του υποδοχέα αυτού γίνεται η προσκόλληση των κυκλοφορούντων αιμοπεταλίων στις ίνες κολλαγόνου του τραυματισμένου ενδοθηλίου. Α3.1.5.3. Σελεκτίνες - P-σελεκτίνη Οι σελεκτίνες είναι ασύμμετρες μεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες μεσολαβούν στις αντιδράσεις των λευκών αιμοσφαιρίων με το τοίχωμα των αγγείων. Η P - σελεκτίνη εντοπίζεται στα α-σωματίδια των αιμοπεταλίων και στα σωμάτια Weibel-Palade των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων εκκρίνονται μεγάλες ποσότητες P-σελεκτίνης, η οποία προάγει την προσκόλληση των λευκοκυττάρων (ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων) πάνω στα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, παίζοντας έτσι καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση της πήξης. 24

Α4. Κυστίδια (MPs) Τα κυστίδια είναι ανομοιογενή πολύ μικρά σε μέγεθος (0,1-1 μm) τμήματα κυττάρων, τα οποία απελευθερώνονται από τις κυτταρικές μεμβράνες ως απάντηση σε κάποιο συγκεκριμένο ερέθισμα ή απόπτωση. Αποτελούνται από μια στιβάδα φωσφολιπιδίων, πάνω στην οποία υπάρχουν ειδικά αντιγόνα που εξαρτώνται από το κύτταρο από το οποίο προέρχονται. (25) Οι Chargaff και West (26) ήταν οι πρώτοι που περιέγραψαν τα κυστίδια στα μέσα του 20 ου αιώνα ως «κατακρημνίζον παράγοντα» που υπάρχει στο πλάσμα και μπορεί να προάγει τη διαδικασία της πήξης. Ο Wolf (27) το 1967 περιέγραψε τα κυστίδια ως «αιμοπεταλιακή σκόνη» που δημιουργείται λόγω της απόπτωσης των αιμοπεταλίων, η οποία επίσης παρουσιάζει προπηκτική δραστηριότητα. Η «σκόνη» αυτή, όπως χαρακτηρίστηκε από τον Wolf, είναι ορατή με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε ίζημα υπερφυγοκεντρημένου πλάσματος και έχει μέγεθος από 0,1μm έως 0,3μm. Οι πρώτες αυτές αναφορές, αλλά και οι μελέτες που έχουν γίνει μέχρι σήμερα έχουν δώσει πολλές πληροφορίες για τη βιολογική σημασία τόσο των κυστιδίων αιμοπεταλιακής προέλευσης, όσο και αυτών που προέρχονται από άλλα κύτταρα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η επίδραση που έχουν τα κυστίδια, οποιασδήποτε προέλευσης, στη διαδικασία της πήξης. Η απελευθέρωση των κυστιδίων είναι μία φυσιολογική διαδικασία, με αυτά να ανευρίσκονται σε κάθε άτομο. Τα επίπεδα είναι υψηλότερα στις γυναίκες και επηρεάζονται τόσο από καταμήνιο κύκλο όσο και από τον κιρκάδιο ρυθμό. Μέχρι πρόσφατα θεωρούνταν ότι όλα τα κυστίδια χαρακτηρίζονταν από την παρουσία φωσφατιδυλοσερίνης (PS) στην επιφάνειά τους. Σε νεότερες όμως μελέτες, οι Burnier, Fontana, Kwak, Angelillo-Scherrer το 2009 (28), όπως και οι Connor, Exner, Joseph το 2010 (29) αναφέρουν την ύπαρξη κυστιδίων που δεν φέρουν στην επιφάνεια τους PS. Το 2013 έρχονται οι Yuana, Bertina και Osanto (30) να δώσουν τη δική τους εξήγηση στην παρατήρηση αυτή, η οποία δηλώνει ότι η ύπαρξη ή όχι PS σε ένα κυστίδιο σχετίζεται με το κύτταρο προέλευσης του, καθώς και από το μηχανισμό σχηματισμού του. Τα κυστίδια που συναντάμε στην κυκλοφορία προέρχονται κυρίως από ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του αίματος, αν και μπορεί να προέρχονται και 25

από άλλα είδη κυττάρων, όπως καρκινικά κύτταρα. Σε υγιή άτομα, το μεγαλύτερο ποσοστό των κυκλοφορούντων κυστιδίων είναι αιμοπεταλιακής προέλευσης. Α4.1. Κυστίδια αιμοπεταλίων (PMPs) Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων περιλαμβάνει μια πληθώρα κυτταρικών αντιδράσεων, όπως αλλαγή του σχήματος, μετατόπιση των γλυκοπρωτεϊνών της μεμβράνης, εξωκυττάρωση των κοκκίων που υπάρχουν στο εσωτερικό τους και ο σχηματισμός κυστιδίων. (25) Πολλοί ερευνητές έχουν αναφέρει ότι σε υγιή άτομα το ποσοστό των μικροκυστιδίων προερχόμενων από τα αιμοπετάλια ανέρχεται στο 70-90% των κυκλοφορούντων. Ο σχηματισμός και η απελευθέρωση των κυστιδίων παρατηρείται συνήθως κατά την απόπτωση και σε περιπτώσεις αυξημένου στρες. Ερεθίσματα που φαίνεται ότι προάγουν τη δημιουργία κυστιδίων περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση από ουσίες, όπως ενδοτοξίνες και τη μερική ή πλήρη λύση, όπως στην περίπτωση του συμπληρώματος ή οξειδωτικού στρες. Σε γενικές γραμμές, απώλεια τμήματος της κυτταρικής μεμβράνης των αιμοπεταλίων, οδηγεί σε έκθεση της PS που υπήρχε στο εσωτερικό τους και η έκθεση αυτή σχετίζεται με τον σχηματισμό των κυστιδίων. Τα κυστίδια αυτά έχουν απασχολήσει πολλούς ερευνητές τα τελευταία χρόνια και παρόλο που ο φυσιολογικός τους ρόλος δεν έχει διευκρινιστεί ακόμη πλήρως, έχει βρεθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο: στην φλεγμονή, στην ανοσία, στις αγγειακές ασθένειες, στον καρκίνο που σχετίζεται με θρομβοεμβολική φλεβική νόσο. (31) Επίσης φαίνεται ότι έχουν τόσο προπηκτική, όσο και αντιπηκτική δράση. (32) Οι πηκτικές ιδιότητες των αιμοπεταλιακών κυστιδίων οφείλονται στη παρουσία φωσφατιδυλοσερίνης στη μεμβράνη τους. Η PS παρέχει θέση πρόσδεσης για τους παράγοντες πήξης VIII, V και X. Επίσης, στην επιφάνεια των κυστιδίων ανιχνεύονται πολλές γλυκοπρωτεΐνες που υπάρχουν στη μεμβράνη των αιμοπεταλίων. Κάποιες από τις γλυκοπρωτεΐνες αυτές είναι GPIb, οι αλυσίδες ιντεγκρίνης aiib, b3 και b1, καθώς επίσης και η P- σελεκτίνη. Η παρουσία αυτών στην επιφάνεια των κυστιδίων είναι πιθανό να αλληλεπιδρά με άλλα κύτταρα και με το ινώδες. (32) 26

Α4.2. Κυστίδια και θρόμβωση Τα μικροκυστίδια θεωρούνται προθρομβωτικά διότι, η αρνητικά φορτισμένη και πλούσια σε PS επιφάνεια τους προωθεί την συσσώρευση και την μετέπειτα ενεργοποίηση των παραγόντων πήξης και οι υψηλοί προπηκτικοί μικροκυστιδιακοί υποπληθυσμοί εκφράζουν προθρομβωτικές πρωτεϊνες όπως ο ιστικός παράγοντας και η P-σελεκτίνη γλυκοπρωτεϊνη συνδέτης-1 (PSGL-1) στην επιφάνειά τους. (27) Η πλούσια σε PS επιφάνεια των μικροκυστιδίων έχει αναφερθεί ότι είναι 50 με 100 φορές πιο προθρομβωτική από την ισοδύναμη περιοχή στα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια. Οι κυκλοφορούμενοι υποπληθυσμοί που εκφράζουν τον ενεργοποιημένο ιστικό παράγοντα, τον κύριο μεσολαβητή της του καταρράκτη της πήξεως, είναι ιδιαίτερα προπηκτικοί. Τα σχετιζόμενα με τον ιστικό παράγοντα μικροκυστίδια, έχει αναφερθεί ότι ανέρχονται διακριτές περιοχές της κυτταρικής μεμβράνης πλούσια σε χοληστερόλη, τις λεγόμενες ''λιπιδικές σχεδίες'' (lipid rafts) και κατάγονται από διεγερμένα μονοκύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα αιμοπετάλια και καρκινικά κύτταρα. Επίσης ο δεσμός των κυστιδίων με τον ιστικό παράγοντα έχει αναφερθεί ότι είναι παρόν σε μια κρυπτογραφημένη μορφή στην κυκλοφορία που δεν εμπλέκεται στην πήξη του αίματος αλλά στην κυτταρική σηματοδότηση. (33) Α4.3. Ανίχνευση αιμοπεταλιακων κυστιδίων Για την ανίχνευση και μελέτη των αιμοπεταλιακών κυστιδίων έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες μέθοδοι, όπως μέθοδοι ανοσοπροσδιορισμού, παρατήρηση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κ.α. Η μέθοδος που έχει επικρατήσει είναι η κυτταρομετρία ροής, η οποία παρέχει τόσο ποιοτικές, όσο και ποσοτικές πληροφορίες για τα ίδια και για την προέλευση τους. η διαδικασία έχει ως εξής: χρησιμοποιώντας ως δείγμα πλάσμα που έχει επεξεργαστεί κατάλληλα ή υπερφυγοκεντρηθεί, γίνεται επώαση με αντισώματα τα οποία συνδέονται στις αντίστοιχες θέσεις. Ανάλογα με τη σκέδαση του φωτός και το φθορισμό των αντισωμάτων, γίνεται ο διαχωρισμός των κυστιδίων. Η επιλογή των αντισωμάτων γίνεται ανάλογα με το είδος των κυστιδίων και με τις πληροφορίες που θέλουμε να πάρουμε σε κάθε περίπτωση. (34) Για τα αιμοπεταλιακής προέλευσης κυστίδια χρησιμοποιούνται αντισώματα που συνδέονται 27

με τους υποδοχείς της μεμβράνης των αιμοπεταλίων που αναφέρθηκαν προηγουμένως (πίνακας 2), όπως anti-cd41 και anti-cd61. Α4.4. Ανεξίνη V Ένα αντίσωμα που έχει ευρεία εφαρμογή στη μελέτη των κυστιδίων με κυτταρομετρία ροής είναι η Ανεξίνη V. Η ανεξίνη V παρουσιάζει μεγάλο βαθμό συγγένειας με τα φωσφολιπίδια και συνδέεται με την PS. Από όσα έχουμε ήδη αναφέρει συμπεραίνεται ότι η αννεξίνη δε συνδέεται ειδικά με κυστίδια αιμοπεταλιακής προέλευσης, αλλά και με τα κυστίδια που προέρχονται από αποπτωτικά κύτταρα. Α4.5. Διάκρηση κυστιδίων-εξωσωμάτων-αποποτωτικών σωμάτων Είναι απαραίτητο να γίνεται διαχωρισμός της έννοιας των κυστιδίων από τα εξωσώματα και τα αποπτωτικά σώματα. Τα εξωσώματα είναι προσχηματισμένα κυστίδια, μεγέθους έως 100nm, που προέρχονται από ενδοκυττάρια σώματα και απελευθερώνονται από το κύτταρο με εξωκύττωση. Έχουν πιο ομοιογενές σχήμα από τα κυστίδια που περιγράφηκαν παραπάνω, φέρουν διαφορετικά αντιγόνα στην επιφάνεια τους και παίζουν ρόλο στην ανοσολογική απόκριση. Η άλλη περίπτωση είναι τα αποπτωτικά σώματα, τα οποία δημιουργούνται κατά το τελευταίο στάδιο της κυτταρικής απόπτωσης. Συνήθως έχουν μεγαλύτερο μέγεθος (1-3μm), αν και σε κάποιες περιπτώσεις φτάνουν και το 0,5μm. Εκφράζουν και αυτά PS στην επιφάνεια τους, το χαρακτηριστικό τους όμως είναι ότι φέρουν DNA σε αντίθεση με τα κυστίδια. (25) Α4.6. Απομάκρυνση κυστιδίων από την κυκλοφορία Ο μηχανισμός της απόρριψης των κυστιδίων από την κυκλοφορία είναι λιγότερο ξεκάθαρος. Τα προερχόμενα από αιμοπετάλια Mps έχει αναφερθεί ότι έχουν χρόνο ζωής 30 λεπτά στα ποντίκια και <10 λεπτά στα κουνέλια, οι οποίοι είναι πολύ λιγοτεροι από την διάρκεια ζωής των αιμοπεταλιών (περίπου 10 μέρες). Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί που οδηγούν στην κάθαρση των κυστιδίων περιλαμβάνουν: την δράση των φωσφολιπασών 28

την φαγοκύττωση ύστερα από την έκθεση της φωσφατιδιλοσερίνης (PS) ή έμμεσα από οψωνισμό, προερχόμενο από την πρωτεϊνη S και το συμπλήρωμα. Α5. Παράγοντας VIII Ο παράγοντας VIII συντίθεται κυρίως στο ήπαρ αλλά και στον σπλήνα, τους νεφρούς και τους λεμφαδένες, ενώ υπάρχει στα αιμοπετάλια και η ημιδιάρκεια ζωής του είναι 12 ώρες. Στην κυκλοφορία βρίσκεται συνδεδεμένος με τον παράγοντα Von Willebrand (vwf) με σκοπό να γίνει πιο σταθερός. Σε περίπτωση έλλειψης του vwf η ημιδιάρκεια ζωής του παράγοντα VIII μειώνεται στις 3 ώρες λόγω πρώιμης (2, 22 35) αποδόμησης του από πρωτεάσες όπως την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C. Α5.1. Δομή Πρόκειται για ένα μεγάλο πρωτεϊνικό μόριο (330 kda) μονής αλυσίδας, το οποίο αποτελείται από έξι περιοχές, τρεις Α, μια Β και δυο C περιοχή. Οι τομείς Α1, Α2 και Β αποτελούν τη βαριά αλυσίδα του μορίου, ενώ η ελαφριά αλυσίδα αποτελείται από τους τομείς Α3, C1 και C2. Οι Α τομείς έχουν ομόλογη δομή με την σερουλοπλασμίνη και οριοθετούνται από τις λεγόμενες όξινες περιοχές, a1, a2 και a3, οι οποίες περιλαμβάνουν συμπλέγματα καταλοίπων Asp και Glu. Το διμερές Α1 / A3-C1-C2 συμβάλλει στην σύνδεση παράγοντα ΙΧα, ένα μέρος του οποίου λαμβάνει χώρα εντός του τομέα Α3. (36) Οι C τομείς έχουν ομόλογη δομή με τον παράγοντα V. Ο τομέας C2 συνδέεται με την φωσφατιδυλοσερίνη σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια και ενδοθηλιακά κύτταρα και με τον παράγοντα νοn Willebrand. Διαθέτει ακόμη μια θέση πρόσδεσης για τον παράγοντα Χα. Επίσης, στον τομέα αυτόν παρατηρείται μια θέση δέσμευσης με τη θρομβίνη που είναι υπεύθυνη για τη διάσπαση του παράγοντα VIII στο Arg 16895. Η περιοχή Β είναι η μόνη που δεν παρουσιάζει ομοιότητα με κάποια άλλη δομή, χρησιμεύει ως συνδετική περιοχή που διαχωρίζει το δεύτερο και τον τρίτο τομέα Α, αλλά δεν απαιτείται στην διαδικασία της πήξης. (36,37,38) 29

Εικόνα 4 Δομή παράγοντα VIII. Παρατηρούνται οι Α τομείς (Α1, Α2, Α3) που συνδέονται με τις αντίστοιχες όξινες περιοχές (α1, α2, α3), οι C τομείς που βρίσκονται στην ελαφριά αλυσίδα και ο τομέας Β που συνδέει τις δύο αλυσίδες. (38) Α5.2. Δράση και αδρανοποίηση Η ενεργοποίηση του παράγοντα VIII γίνεται με τη δράση της θρομβίνης ή του παράγοντα Χα, οι οποίοι διασπούν το μόριο στα σημεία Arg372 και Arg1689. Μετά την ενεργοποίηση του απομακρύνεται από τον von Willebrand και παρουσία των ιόντων ασβεστίου των φωσφολιπιδίων και του ενεργοποιημένου παράγοντα IX, αλληλεπιδρά και τελικά ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ, συμμετέχοντας έτσι στην ενδογενή οδό πήξης, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Η απενεργοποίηση του παράγοντα VIII, οφείλεται στην πρωτεΐνη C και την πρωτεΐνη S. Με την ενεργοποίηση τους οι πρωτεΐνες αυτές δρουν αρχικά στο Arg 336, που βρίσκεται στην Α1 περιοχή και έπειτα στο Agr 562 της περιοχής Α2, λύνοντας τα, με τελικό αποτέλεσμα την απενεργοποίηση του παράγοντα VIII. 30

Εικόνα 5 Ενεργοποίηση παράγοντα VIII. Η δράση των παραγόντων ΙΧα και Χα στην ελαφριά αλυσίδα του παράγοντα VIII συμβάλουν στην ενεργοποίηση του και στη δράση του σα συμπαράγοντας. (38) Α5.3 Σύνδεση με τον παράγοντα νοn Willebrand Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ο παράγοντας VIII στην κυκλοφορία βρίσκεται κατά κύριο λόγω συνδεδεμένος με τον παράγοντα von Willebrand (vwf), ως ένα μη ομοιοπολικό σύμπλοκο. Η σύνδεση αυτή αποτρέπει την πρόωρη αποδόμηση του παράγοντα VIII από τις πρωτεΐνες C και S, αυξάνοντας έτσι την σταθερότητα και το χρόνο ημιζωής του. Ο vwf συμβάλει επίσης στον εντοπισμό της θέσης της βλάβης του τοιχώματος του αγγείου, οδηγώντας στο σημείο τον παράγοντα VIII για να ολοκληρωθεί η διαδικασία της αιμόστασης. (37) Ο τομέας C2 του παράγοντα VIII δεσμεύεται από τον VWF και συγκεκριμένα από τους τομείς του D1 και D3. Ο VWF μπορεί να δεσμεύει τον παράγοντα VIII μόνο όταν αυτός δεν έχει διασπαστεί από τη θρομβίνη. Μετά τη διάσπαση από τη θρομβίνη, ο ενεργοποιημένος παράγοντας VIII (VIIa) απελευθερώνεται από VWF και γίνεται πλήρως λειτουργικός και ενεργός συμπαράγοντας στην συνεχή παραγωγή θρομβίνης. Ωστόσο, είναι περισσότερο ασταθής επιρρεπής σε αδρανοποίηση. (37) Α5.4. Έλλειψη παράγοντα VIII Η απουσία ή η έλλειψη δραστικότητας του παράγοντα VIII οδηγεί σε αιμορροφιλία Α. Αιμορροφιλία ονομάζεται η πάθηση που προκαλείται από έλλειψη κάποιου παράγοντα πήξης και έχει ως αποτέλεσμα διαταραχή της αιμόστασης. Υπάρχουν δύο τύποι αιμορροφιλίας, η αιμορροφιλία Α, που όπως προείπαμε 31

προκαλείται από μειωμένα επίπεδα παράγοντα VIII και η αιμορροφιλία Β, η οποία οφείλεται σε έλλειψη ή μειωμένα επίπεδα του παράγοντα IX. Σύμφωνα με τον Σύλλογο Προστασίας Ελλήνων Αιμορροφιλικών, σήμερα στην Ελλάδα υπολογίζεται ότι υπάρχουν περίπου 850 άτομα με αιμορροφιλία, με το μεγαλύτερο ποσοστό να πάσχει από αιμορροφιλία Α. Την ίδια στιγμή στην Ευρώπη υπολογίζεται ότι πάσχουν περίπου 33.000 από αιμορροφιλία και περίπου 250.000 παγκόσμια. Να σημειωθεί ότι ο παράγοντας VIII είναι γνωστός και ως αντιαιμορροφιλικός παράγοντας Α. Α6. Ιστικός Παράγοντας - TF Ο ιστικός παράγοντας (TF), γνωστός επίσης και με το όνομα θρομβοπλαστίνη ή CD142 ή FΙΙΙ, είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί βασικό παράγοντα έναρξης του μηχανισμού της πήξης. Όπως υποδεικνύει και το όνομα του ο TF ανευρίσκεται στους ιστούς αλλά και στην κυκλοφορία του αίματος. Ο TF δεν απαιτεί άλλες διαδικασίες για την ενεργοποίηση του, μπορεί να πυροδοτήσει το μηχανισμό της πήξης μόνο με την φυσική σύνδεση του με τον FVII/FVIIa. (39) Ακόμα φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο και σε άλλα φαινόμενα του οργανισμού. Μία άμεση συσχέτιση του με την φλεγμονή έγκειται στο γεγονός ότι οι ενεργοποιημένοι παράγοντες πήξης πρωτεάσες σερίνης FVIIa, FXa, FIIa καθώς η παραγωγή του ινώδους είναι φλεγμονώδεις παράγοντες. Αυτό οφείλεται στην ενεργοποίηση των υποδοχέων της θρομβίνης (PAR) όπου οι υποδοχείς PAR1, PAR3, PAR4 ενεργοποιούνται έμμεσα από τον TF μέσω της θρομβίνης ενώ ο PAR2 ενεργοποιείται από το σύμπλοκο ΤF-VIIa και από τον Xa. Μελέτες έχουν δείξει την συμμετοχή των υποδοχέων της θρομβίνης σε διάφορες φλεγμονώδεις αποκρίσεις. (40) Αναφορικά άλλα παθοφυσιολογικά γεγονότα που ενοχοποιείται ότι συμμετέχει ο TF και δρα ως υποδοχέας σήματος είναι η νεοαγγειογένεση, η μετάσταση των όγκων, η ανάπτυξη των αγγείων, η επούλωση τραυμάτων και η προαγωγή της προσκόλλησης και της μετανάστευσης των λείων μυϊκών κυττάρων στη αθηροσκλήρωση και στην φλεγμονή. (41,42) Α6.1.Δομή και ιδιότητες TF Το γονίδιο του TF (F3) εδράζεται στο χρωμόσωμα 1 στη θέση 1p22-23 και είναι οργανωμένο σε 6 εξώνια στα οποία παρεμβάλλονται 5 εσώνια. Η περιοχή του 32

υποκινητή περιέχει πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Το βασικό μεταγράφημα του mrna είναι 2.3 kb από το οποίο προκύπτει μία αρχική πολυπεπτιδική αλυσίδα 295 αμινοξέων ενώ η ώριμη πρωτεΐνη αποτελείται από 263 αμινοξέα. Ακόμα, υπάρχει και το μεταγράφημα της υδατοδιαλυτής ισομορφής TF στο οποίο δεν περιλαμβάνεται το εξώνιο 5 με αποτέλεσμα το προϊόν του εναλλακτικού ματίσματος να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη 206 αμινοξέων (alternatively-spliced TFasTF) διατηρώντας το μεγαλύτερο εξωκυττάριο τμήμα του πλήρους μεταγραφήματος, αλλά χάνοντας το διαμεμβρανικό τμήμα, καθιστώντας με αυτό τον τρόπο την πρωτεΐνη υδατοδιαλυτή. Ο astf παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε απόκριση στις φλεγμονώδης κυτταροκίνες και θεωρείται ότι αποτελεί μια ενεργή εκκρινόμενη μορφή του TF. Το mrna του astf έχει εντοπισθεί στα νεφρά, τον εγκέφαλο, την καρδιά, τον πλακούντα, τα κύτταρα των νησιδίων, και τον πνεύμονα. Ακόμα εντοπίζεται ο astf στην κυκλοφορία του αίματος και θεωρείται ότι έχει πηκτικές ιδιότητες. (43,44) Η πλήρης μορφή της διαμεμβρανικής γλυκοπρωτεΐνης TF (fltf) είναι 46kDa και αποτελείται από 263 αμινοξέα. Η πρωτεΐνη αποτελείται από τρία διαφορετικά τμήματα: α) το υδρόφιλο εξωκυττάριο τμήμα των 219 αμινοξέων, β) το υδρόφοβο διαμεμβρανικό τμήμα των 23 αμινοξέων και γ) την ενδοκυττάριο τμήμα της κυτταροπλασματικής ουράς που αποτελείται από 21 αμινοξέα. Το υδρόφιλο εξωκυττάριο τμήμα αποτελεί το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης και περιέχει τις βάσεις σύνδεσης του παράγοντα VIIa/VII για την έναρξη του πηκτικού μηχανισμού μέσω της ενεργοποίησης των βιταμινο-κ εξαρτώμενων παραγόντων IX και Χ. Με βάση τη δομική του ομολογία με τον υποδοχέα της ιντερφερόνης-α, κατατάσσεται στους υποδοχείς κυτταροκινών τύπου ΙΙ και τυποποιείται σαν CD142. (40,45,46) Το διαμεμβρανικό τμήμα είναι απαραίτητο για την σταθεροποίηση της πρωτεΐνης και του συμπλέγματός του στην απαιτούμενη θέση για την πρωτεολυτική δράση. Η μικρή κυτταροπλασματική ουρά ή το ενδοκυττάριο τμήμα είναι το καρβοξυτελικό υδρόφιλο άκρο της πρωτεΐνης. Η κυτταροπλασματική ουρά ρυθμίζει την έκφραση και την λειτουργία της ίδιας της πρωτεΐνης μέσω φωσφορυλιώσεων στις τρεις σερίνες που φέρει. 33

A6.2. Έκφραση και κατανομή TF Στα αγγειακά κύτταρα που έρχονται σε επαφή με το αίμα ο ιστικός παράγοντας εκφράζεται υπό προϋποθέσεις διότι η παρουσία του θα ήταν κινητήριος δύναμη της έναρξης του μηχανισμού της πήξης. Η επαφή αυτή εμποδίζεται από τον «αιμοστατικό φάκελο» ο οποίος σχηματίζεται από την ειδική έκφραση του TF ο οποίος προάγει την θρόμβωση γύρω από το αγγειακό σύστημα όταν διαταραχτεί η ακεραιότητα του αγγειακού ενδοθηλίου. Άρα, ο TF κυρίως ανευρίσκεται στο υπενδοθήλιο στα λεία μυϊκά κύτταρα. (41) Σε ιστικό επίπεδο ο TF κατανέμεται και εκφράζεται σε περισσότερο βαθμό σε όργανα με πλούσια αιμάτωση όπως ο εγκέφαλος, ο πλακούντας και οι πνεύμονες ενώ εκφράζεται επίσης πολύ αλλά σε μικρότερο βαθμό στην καρδιά, στα νεφρά, στο έντερο και στην μήτρα. Χαμηλή έκφραση παρατηρείται στο ήπαρ, στον σπλήνα και στο θύμο αδένα. (47) O TF της κυκλοφορίας ή o αιματογενούς προέλευσης TF (blood-borne TF) ανευρίσκεται: στα έμμορφα συστατικά του αίματος (μονοκύτταρα, μακροφάγα, κοκκιοκύτταρα, αιμοπετάλια) στα ελεύθερα αιμοπεταλιακά κυστίδια ως ελεύθερη υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη στο πλάσμα (ισόμορφη astf) που απελευθερώνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα σαν απόκριση στις κυτταροκίνες της φλεγμονής. (39) Το μεγαλύτερο μέρος του TF της κυκλοφορίας εμφανίζεται με την μορφή των μικροσωματιδίων ή κυστιδίων τα οποία προκύπτουν από την ενεργοποίηση και την απόπτωση των κυττάρων του αίματος και του ενδοθηλίου. Ωστόσο τα αποτελέσματα των μελετών είναι αντικρουόμενα σχετικά με τη δραστικότητα του TF των κυστιδίων. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα λευκοκύτταρα δεν παρατηρείται έκφραση του TF υπό φυσιολογικές συνθήκες όμως σε αυτά τα κύτταρα επάγεται η έκφραση του από διάφορα ερεθίσματα. Απαιτείται η ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων η οποία επιτυγχάνεται από συγκεκριμένες οδούς. Οι περισσότεροι μεσολαβητές που διεγείρουν την έκφραση του TF μοιράζονται κοινές οδούς μεταγωγής του σήματος. Επίσης, στα ενδοθηλιακά κύτταρα παράγεται και η υδατοδιαλυτή μορφή astf η 34

οποία απελευθερώνεται στην κυκλοφορία και είναι ικανή να πυροδοτήσει την διαδικασία της πήξης χωρίς να υπάρχει απαραίτητα ιστική καταστροφή. Το 10%-30% του αντιγόνου του TF που ανιχνεύεται στο πλάσμα ανήκει στον astf. (48) Α6.3. Παθολογική αύξηση TF Παθολογικά ο TF εκφράζεται αυξημένα στις αθηρωματικές βλάβες στα αφρώδη μακροφάγα όπου υπάρχει συσσωρευμένη οξειδωμένη και μη LDL, στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, των μονοκυττάρων και των ουδετεροφίλων από τα κυτταρικά προϊόντα βακτηρίων όπως η ενδοτοξίνη LPS των Gram-αρνητικών μικροβίων κα τα συστατικά του συμπληρώματος. Η έκφραση του TF στα παραπάνω κύτταρα υποδηλώνει φλεγμονώδη κατάσταση, σήψη και αθηροσκλήρωση. A6.4. Ενεργοποίηση και αναστολή TF Αναφορικά παράγοντες που διεγείρουν την έκφραση του TF πέρα από τον τραυματισμό του αγγείου είναι: LPS, κυτταροκίνες της φλεγμονής (IFN, IL-6, IL-8, IL-1β, ΤΝF-a), προσδέτης CD40, CRP, MCP-1, ICAM, P-σελεκτίνη, OxLDL, Lp(a) τελικά προϊόντα μη ενζυματικής γλυκοζυλίωσης (AGEs), λεπτίνη, αγγειοτενσίνη ΙΙ, πλασμίνη, αναφυλατοξίνη C5a, apl, υποξία, ομοκυστεΐνη, ισταμίνη, αραχιδονικό οξύ, σεροτονίνη, αυξητικοί παράγοντες (PDGF, bfgf, VEGF, EGF), ουροκινάση, κινάσες (PKC, MAPK), μεταγραφικοί παράγοντες (AP-1, NFκΒ, Erg-1) αντισυλληπτικά, κάπνισμα, νικοτίνη και πολλοί ακόμη. Υπερέκφραση του TF οδηγεί σε υπερπηκτική κατάσταση που μέσω του μηχανισμού της πήξης οδηγεί σε θρόμβωση. (41) Από την άλλη πλευρά η έκφραση του TF αναστέλλεται όταν αναστέλλονται οι παραπάνω παράγοντες δηλαδή: αναστολείς του COX, αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης, ΝΟ, ινσουλίνη, αντιπονεκτίνη, βιταμίνη D3, αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα του camp, παράγοντες που καταστέλουν την μετάφραση και έκφραση του mrna του TF και πολλοί ακόμα. (41) Α6.5. Αναστολέας της οδού του TF - Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) Ο TFPI αποτελεί πρωταρχικό φυσιολογικό αναστολέα της έναρξης της εξωγενούς οδού πήξης και διαμορφώνει τη σοβαρότητα πολλών αιμορραγικών και 35