1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Τα αντισώματα που περιέχονται σε έναν αντιορό, σε απόκριση χορήγησης ενός αντιγόνου, είναι πολύ ετερογενή, εξαιτίας των πολλαπλών αντιγονικών καθοριστών, που επάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση διαφόρων κλώνων Β λεμφοκυττάρων. Μια τέτοια ανοσοαπόκριση εξυπηρετεί τον εντοπισμό, τη φαγοκυττάρωση και τη λύση του αντιγόνου και παρέχει σημαντικά πλεονεκτήματα στον οργανισμό in vivo. Για τις in vitro όμως μελέτες, η χρησιμοποίηση των κλασικών αντιορών, παρουσιάζει βασικά μειονεκτήματα, που οφείλονται: 1) στη μεγάλη ετερογένειά τους, 2) στην περιορισμένη διαθέσιμη ποσότητα, 3) στο γεγονός ότι, ενώ ο τίτλος των αντισωμάτων είναι υψηλός, ο τίτλος μιας συγκεκριμένης ανοσοσφαιρίνης είναι συνήθως χαμηλός και 4) στο ότι είναι θεωρητικά δύσκολο και πρακτικά αδύνατο να επιτευχθεί η παραγωγή του ίδιου ακριβώς συνδυασμού αντισωμικών ειδικοτήτων σε άλλο ζώο, του ίδιου ή διαφορετικού είδους. Στα 1975, οι Kohler και Milstein (Βραβείο Νόμπελ Ιατρικής 1984) χρησιμοποίησαν τη γνωστή τεχνική υβριδισμού σωματικών κυττάρων, για να δώσουν νέες κατευθύνσεις στη Βιολογική έρευνα. Η συγχώνευση κυττάρων μιας μυελωματικής σειράς ποντικού, που αναπτύσσονταν λογαριθμικά in vitro και σπληνικών κυττάρων ποντικού ανοσοποιημένου με ερυθροκύτταρα προβάτου, από τους ερευνητές αυτούς, είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή υβριδίων κυττάρων και στη συνέχεια κλώνων από μεμονωμένα υβρίδια κύτταρα, που είχαν διπλή ιδιότητα: 1) του πατρικού καρκινικού κυττάρου για διατήρηση in vitro και 2) του πατρικού σπληνικού Β-λεμφοκυττάρου ή πλασματοκυττάρου για σύνθεση και έκκριση μιας καθορισμένης, επιθυμητής, ομογενούς ή μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης. Αυτή η επιτυχία, απέδειξε άμεσα την ισχύ της θεωρίας της επιλογής του κλώνου, που ανέπτυξε ο Burnet (1959) και υποστήριζε τη μονοκλωνικότητα των Β-λεμφοκυττάρων. Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή, προτείνεται ότι κάθε Β-λεμφοκύτταρο έχει τη γενετική πληροφορία για τη σύνθεση μιας μόνο αντισωμικής ειδικότητας.
2 Οι μυελωματικές σειρές που χρησιμοποιούνται στον υβριδισμό είναι κατάλληλα επιλεγμένες, ώστε να αποκλείεται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων τους σε ειδικά επιλεγμένο θρεπτικό μέσο. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα αναπτύσσονται παρουσία 8-αζαγουανίνης, η οποία σχετίζεται με την απώλεια της δραστικότητας ενός ενζύμου, της υποξανθιν - γουανιν - φωσφοριβοσυλτρανσφεράσης, ή παρουσία 5-βρωμο-δεοξυουριδίνης, η οποία σχετίζεται με την απώλεια της δραστικότητας της κινάσης της θυμιδίνης. Αν αυτά τα κύτταρα αναπτυχθούν σε θρεπτικό μέσο που περιέχει εξωγενείς βάσεις υποξανθίνης, θυμιδίνης και αμινοπτερίνη, δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν την κύρια οδό βιοσύνθεσης του DNA τους (η αμινοπτερίνη αναστέλλει τη σύνθεση πουρινών), ούτε κάποια παράπλευρη, αφού δεν διαθέτουν τα κατάλληλα ένζυμα (Εικόνα 1). Τα φυσιολογικά Β-λεμφοκύτταρα, διαθέτουν όλα τα απαραίτητα ένζυμα για να χρησιμοποιήσουν τις εξωγενείς βάσεις για τη βιοσύνθεση του DNA τους, με την παράπλευρη οδό, αλλά δεν διατηρούνται σε πρωτογενή καλλιέργεια για περισσότερες από οκτώ έως δέκα ημέρες. Εικόνα 1. Οδοί βιοσύνθεσης του DNA. Επιλογή της ειδικότητας των μονοκλωνικών αντισωμάτων Η επιλογή των κλώνων των υβριδίων κυττάρων που εκκρίνουν την επιθυμητή ανοσοσφαιρίνη είναι μία πολύ σημαντική διαδικασία, αφού μερικά υβρίδια κύτταρα εκκρίνουν αντίσωμα ειδικό για το αντιγόνο που χρησιμοποιήθηκε, ενώ άλλα εκκρίνουν μη ειδικά αντισώματα. Η εξέταση επομένως του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου κάθε καλλιέργειας, το οποίο
3 περιέχει το αντίσωμα που έχει εκκριθεί, αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την επιλογή μόνο των επιθυμητών κλώνων. Οι δύο πιο κοινές μέθοδοι ανίχνευσης είναι η μέθοδος ELISA και η μέθοδος RIA, οι οποίες εφαρμόζονται πολύ εύκολα για μαζική ανίχνευση σε ειδικές μικροπλάκες των 96 θέσεων. Και στις δύο μεθόδους, το αντιγόνο μετά την προσκόλλησή του στα τοιχώματα των οπών της μικροπλάκας, επωάζεται με υπερκείμενα καλλιεργειών και σχηματίζει σύμπλοκα (με τα ειδικά αντισώματα), τα οποία στη συνέχεια ανιχνεύονται με δύο τρόπους. Στην πρώτη μέθοδο, ενζυμικά, με προσθήκη αντι-αντισώματος συζευγμένου με κατάλληλο ένζυμο και στη δεύτερη μέθοδο με προσθήκη επισημασμένου (συνήθως με 125 Ι ή 131 Ι) αντιαντισώματος. Αν το αντίσωμα είναι ειδικό για μεμβρανικό υποδοχέα, χρησιμοποιείται η μέθοδος ανοσοφθορισμού, με την ίδια βασική αρχή και τη διαφορά ότι το αντι-αντίσωμα είναι συζευγμένο με κατάλληλη φθορίζουσα ουσία. Αναπαραγωγή υβριδωμάτων που εκκρίνουν ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα Μετά την ταυτοποίηση μιας καλλιέργειας ως προς την ειδικότητα του εκκρινόμενου αντισώματος, πρέπει να ακολουθήσει η διαδικασία της κλωνοποίησης με τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων, έτσι ώστε να εξασφαλιστεί ότι η καλλιέργεια είναι πραγματικά μονοκλωνική. Οταν ένα υβρίδιο κύτταρο αναπτύσσεται σε ειδικές φιάλες καλλιέργειας, το αντίσωμα εκκρίνεται στο υπερκείμενο θρεπτικό μέσο σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (10-100μg/ml). Αν όμως τα κύτταρα της καλλιέργειας αυτής χορηγηθούν στην περιτοναϊκή κοιλότητα ιστοσυμβατού ζώου, αναπτύσσεται ασκιτικό υγρό, που χαρακτηρίζεται από πολύ υψηλές συγκεντρώσεις μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης (1-25mg/ml). Το μονοκλωνικό αντίσωμα μπορεί στη συνέχεια να απομονωθεί από το ασκιτικό υγρό με κατάλληλες τεχνικές χρωματογραφίας. Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων ανθρώπου Η ομοιογένεια και η μονο-ειδικότητα των μονοκλωνικών αντισωμάτων τα καθιστά ιδιαίτερα χρήσιμα για in vivo χρήσεις στον άνθρωπο, τόσο για διαγνωστικούς, όσο και για θεραπευτικούς σκοπούς. Το κύριο όμως εμπόδιο
4 για κλινικές εφαρμογές των μονοκλωνικών αντισωμάτων στον άνθρωπο οφείλεται στο γεγονός ότι τα αντισώματα αυτά προέρχονται συνήθως από ποντίκια και επομένως αναγνωρίζονται ως "ξένα", προκαλώντας αντι-ισοτυπική απόκριση. Η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων ανθρώπου παρεμποδίζεται από πολλές τεχνικές δυσκολίες. Η μεγαλύτερη δυσκολία είναι ότι δεν μπορούν να παραχθούν και να χρησιμοποιηθούν Β-λεμφοκύτταρα από σπλήνα ανθρώπου. Τα υβριδώματα μπορούν να παρασκευαστούν από Β-λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος, από τα οποία λίγα είναι διαφοροποιημένα και συνήθως εκκρίνουν αντισώματα της τάξης Μ. Τα μυελωματικά κύτταρα ανθρώπου, από την άλλη πλευρά, είναι πολύ ευαίσθητα σε καλλιέργειες in vitro, και σε αντίθεση με τα μυελωματικά κύτταρα ποντικού, έχουν μικρό χρόνο ζωής. Ενας τρόπος για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα, είναι η μετατροπή των φυσιολογικών Β-λεμφοκυττάρων ανθρώπου σε καρκινικά, με καλλιέργειά τους in vitro, παρουσία του ιού Epstein-Barr. Πράγματι, πρόσφατα βρέθηκε ότι κάτω από αυτές τις συνθήκες, τα Β-λεμφοκύτταρα του ανθρώπου, εμφανίζουν την ικανότητα απεριορίστων πολλαπλασιασμών in vitro, ενώ ταυτόχρονα διατηρούν την ικανότητα σύνθεσης και έκκρισης της συγκεκριμένης ανοσοσφαιρίνης. Κλωνοποίηση των κυττάρων αυτών, έχει επιτρέψει τη μαζική παραγωγή διαφόρων μονοκλωνικών αντισωμάτων ανθρώπου. Εφαρμογές των μονοκλωνικών αντισωμάτων Τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται σήμερα πλατειά, σε μία ραγδαία αναπτυσσόμενη αγορά, ως διαγνωστικά και θεραπευτικά προϊόντα in vitro και in vivo. α) Καθαρισμός πρωτεϊνών Πριν την ανακάλυψη των μονοκλωνικών αντισωμάτων, η απομόνωση ή ο καθαρισμός μιας πρωτεΐνης από ένα πολύπλοκο μίγμα, ήταν μια χρονοβόρα διαδικασία, αφού απαιτούσε συνήθως πολλά στάδια και η ανάκτησή της ήταν πολύ χαμηλή. Η παραγωγή ενός μονοκλωνικού αντισώματος ειδικού για την πρωτεΐνη αυτή, βοηθά στην πολύ εύκολη απομόνωσή της. Κλασικό παράδειγμα αυτής της εφαρμογής, αποτελεί η απομόνωση ιντερφερόνης λευκοκυττάρων από τους ερευνητές Secher και Burke. Παρασκεύασμα της ιντερφερόνης (η καθαρότητά
5 της ήταν περίπου 1%), χρησιμοποιήθηκε ως αντιγόνο για την παραγωγή ενός μονοκλωνικού αντισώματος με πολύ σημαντική ειδικότητα ως προς αυτό. Το μονοκλωνικό αυτό αντίσωμα, προσδέθηκε σε κατάλληλο υλικό χρωματογραφίας (Εικόνα 2). Οταν στη συνέχεια, χρωματογραφήθηκε το αρχικό παρασκεύασμα της ιντερφερόνης σ' αυτή τη στήλη, όλες οι πρωτεΐνες πλην της ιντερφερόνης εκλούστηκαν από τη στήλη, ενώ η ιντερφερόνη προσδέθηκε στα μόρια του μονοκλωνικού αντισώματος και εκλούστηκε με κατάλληλες τεχνικές, σε πολύ καθαρή, ομοιογενή μορφή. Εικόνα 2. Απομόνωση ομοιογενούς ιντερφερόνης με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. β) Ταυτοποίηση και απομόνωση υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων Μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση και την απομόνωση διαφόρων υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων που εκφράζουν χαρακτηριστικά πρότυπα μεμβρανικών πρωτεϊνών. Επειδή οι πρωτεΐνες αυτές αντανακλούν τη φάση διαφοροποίησης των κυττάρων, μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για κάθε μία από αυτές τις πρωτεΐνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό διαφόρων σταδίων διαφοροποίησης των λεμφοκυττάρων. Για παράδειγμα, τα Τ-κύτταρα βοηθοί εκφράζουν τη μεμβρανική πρωτεΐνη CD4 και τα Τ-κυτταροτοξικά κύτταρα εκφράζουν τη μεμβρανική πρωτεΐνη CD8 τόσο στον άνθρωπο όσο και το ποντίκι. Αν
6 επισημανθούν μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για τις δύο πρωτεΐνες με διαφορετικές φθορίζουσες ουσίες και επωαστούν με ένα αιώρημα λεμφοκυττάρων, τα ΤΗ και ΤC κύτταρα μπορούν να διαχωριστούν εύκολα. Εναλλακτικά, ένας συγκεκριμένος υποπληθυσμός μπορεί να αφαιρεθεί από ένα δείγμα με επώαση των κυττάρων με μονοκλωνικό αντίσωμα και συμπλήρωμα που επιφέρει τη λύση των κυττάρων για τα οποία είναι ειδικό το αντίσωμα. Εικόνα 3. ιαχωρισμός ΤΗ και TC λεμφοκυττάρων με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. γ) Ανίχνευση όγκων και μεταστάσεων Σήμερα είναι δυνατόν να παραχθούν μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για μεμβρανικές πρωτεΐνες - δείκτες όγκων. Οι πρωτεΐνες αυτές υπάρχουν στα καρκινικά κύτταρα αλλά όχι στα φυσιολογικά. Η παραγωγή τέτοιων μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι χρονοβόρα και περιλαμβάνει διαδικασίες ανίχνευσης μεγάλου αριθμού υβριδίων κυττάρων, για να ταυτοποιηθούν οι κλώνοι που εκκρίνουν το συγκεκριμένο αντίσωμα. Η σημασία αυτής της έρευνας φαίνεται από την εργασία μιας ομάδας ερευνητών (Minna, Cuttita και Rosen) οι οποίοι ανοσοποίησαν ποντίκια με καρκινικά κύτταρα (καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου) και παρασκεύασαν υβρίδια κύτταρα που είχαν την
7 ικανότητα σύνθεσης και έκκρισης αντισώματος ειδικού για τα καρκινικά αυτά κύτταρα. οκίμασαν 20.000 κλώνους υβριδίων κυττάρων και βρήκαν 80 κλώνους που ήταν ειδικοί για διάφορα καρκινικά κύτταρα (καρκίνου του πνεύμονα) αλλά δεν αντιδρούσαν με φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα. Ενα από αυτά τα μονοκλωνικά αντισώματα ήταν ειδικό για μία μορφή καρκίνου του πνεύμονα που εμφανίζεται στις Η.Π.Α σε ποσοστό 25% του συνολικού αριθμού καρκινοπαθών. Τέτοια μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν είτε για την ανίχνευση μεταστατικών καρκίνων ή για τη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Κύριοι τύποι καρκίνου, απελευθερώνουν στο αίμα δείκτες (tumor-specific antigens) και η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων για την ανίχνευση τέτοιων όγκων είναι πολύ σημαντική. Για παράδειγμα, σε μια μελέτη, μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για ένα γλυκο-λιπιδικό αντιγόνο που εκκρίνεται στο αίμα σε περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου, βοήθησαν στην ανίχνευση καρκίνου σε 23 από 33 ασθενείς με επιβεβαιωμένο καρκίνο. Αλλη σημαντική εφαρμογή περιλαμβάνει την επισήμανση μονοκλωνικών αντισωμάτων ειδικών για καρκίνο του μαστού με 131 I. Το επισημασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα χορηγείται ενδοφλέβια για τη διάγνωση είτε πρωτογενούς καρκίνου του μαστού, είτε μεταστατικού καρκίνου στους γειτονικούς λεμφαδένες. Παρόλο ότι η σημασία της χρησιμοποίησης μονοκλωνικών αντισωμάτων στη διάγνωση διαφόρων μορφών καρκίνου είναι δεδομένη, υπάρχουν μειονεκτήματα για την ευρεία χρήση τους. Το κύριο μειονέκτημα είναι ότι πολλοί όγκοι ενός συγκεκριμένου τύπου, όπως π.χ. του μαστού, δεν έχουν κοινούς πρωτεϊνικούς δείκτες. δ) Θανάτωση όγκων Μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν να θανατώσουν καρκινικά κύτταρα, σε μερικές περιπτώσεις άμεσα, με λύση παρουσία του συστήματος του συμπληρώματος. Μη συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην αγωγή λεμφωμάτων και λευχαιμιών ανθρώπου. Ο Levy και οι συνεργάτες του είχαν ένα ασθενή με λέμφωμα. Στη διάρκεια της αγωγής, το λέμφωμα έκανε μετάσταση στο ήπαρ, το σπλήνα, το μυελό των οστών και το αίμα. Επειδή ο όγκος αυτός ήταν ενός Β-κυττάρου, το μεμβρανοσυνδεόμενο αντίσωμα σε όλα τα καρκινικά κύτταρα είχε τον ίδιο
8 ιδιότυπο. Οι ερευνητές αυτοί, αρχικά συγχώνευσαν καρκινικά Β-κύτταρα από τον ασθενή με μυελωματικά κύτταρα ανθρώπου για να παράγουν ένα υβρίδιο κύτταρο που διατηρούσε την ικανότητα σύνθεσης και έκκρισης ενός μονοκλωνικού αντισώματος ειδικού για το Β-λέμφωμα. Το μονοκλωνικό αυτό αντίσωμα, που έφερε τον προκαθορισμένο ιδιότυπο, το χρησιμοποίησαν ως αντιγόνο, για να ανοσοποιήσουν ποντίκια. Τα σπληνικά κύτταρα των ποντικιών, τα συγχώνευσαν με μυελωματικά κύτταρα ποντικιών. Τα υβρίδια κύτταρα που προέκυψαν, τα δοκίμασαν για να βρουν ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για τον ιδιότυπο του Β-λεμφώματος του ανθρώπου (Εικόνα 4). Οταν χορηγήθηκε αυτό το μονοκλωνικό αντίσωμα στον ασθενή, συνδέθηκε ειδικά στα κύτταρα του Β-λεμφώματος, επειδή μόνο αυτά τα κύτταρα εξέφραζαν τον συγκεκριμένο αυτό ιδιότυπο. Επειδή τα Β-κύτταρα του λεμφώματος ήταν ευαίσθητα σε λύση μέσω του συμπληρώματος, το μονοκλωνικό αυτό αντίσωμα, ενεργοποιούσε το σύστημα του συμπληρώματος και προκαλούσε λύση των κυττάρων του λεμφώματος, χωρίς να καταστρέψει τα υπόλοιπα κύτταρα. Μετά τη χορήγηση 4 δόσεων αυτού του ιδιοτυπικού αντισώματος, ο όγκος συρρικνώθηκε σημαντικά. Παρόλο ότι μεγάλος αριθμός καρκινικών κυττάρων είναι ανθεκτικός στη λύση μέσω του συμπληρώματος, ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα, μπορεί να συζευχθεί με θανατηφόρα τοξίνη ή με ραδιενεργό για να παραχθεί μία ανοσοτοξίνη, ικανή να φονεύει καρκινικά κύτταρα. ιάφορες τοξίνες όπως η ρισίνη, η Shigella και η diphtheria αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση και είναι τόσο ισχυρές ώστε ένα μόριο της τοξίνης να φονεύει ένα κύτταρο. Κάθε μία από αυτές τις τοξίνες αποτελείται από δύο τμήματα: το ένα είναι η τοξίνη (μία πολυπεπτιδική αλυσίδα) και το άλλο ένας προσδέτης (ligand) που συνδέεται σε υποδοχείς πάνω στην κυτταρική μεμβράνη. Χωρίς τον προσδέτη, η τοξίνη δεν μπορεί να εισέλθει στα κύτταρα και έτσι είναι ανενεργή. Μία ανοσοτοξίνη παρασκευάζεται με αντικατάσταση του προσδέτη με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που είναι ειδικό για ένα συγκεκριμένο τύπο καρκινικών κυττάρων (Εικόνα 5). Θεωρητικά, το δεσμευμένο μονοκλωνικό αντίσωμα, θα οδηγήσει την τοξίνη ειδικά στα καρκινικά κύτταρα, όπου θα προκαλέσει το θάνατο με αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η μεγάλη τοξικότητα αυτών των τοξινών είναι πολύ σημαντική, αφού πολύ λίγα μόρια μιας ανοσοτοξίνης θα έλθουν σε επαφή με τη μάζα του όγκου. ιάφορες μελέτες in vitro έχουν δείξει την ικανότητα της ανοσοτοξίνης να θανατώνει τα καρκινικά κύτταρα, χωρίς να επηρεάζει τα υγιή.
9 Εικόνα 4. Θανάτωση όγκου με χρήση μονοκλωνικού αντισώματος Εικόνα 5. Μηχανισμός δράσης ανοσοτοξινών ε) ιαγνωστικοί παράγοντες Περισσότερα από 100 μονοκλωνικά αντισώματα κυκλοφορούν σήμερα και χρησιμοποιούνται ως διαγνωστικοί παράγοντες. Ανάμεσα σε αυτά περιλαμβάνονται: έλεγχος εγκυμοσύνης, έλεγχος ανίχνευσης παθογόνων πρωτοζώων, βακτηρίων, ιών, έλεγχος επιπέδων διαφόρων φαρμάκων, καρδιακών ασθενειών, ιστοσυμβατά αντιγόνα, διαβήτης, καρκίνος.
10 στ) Μηχανική μονοκλωνικών αντισωμάτων Οταν τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται ως ανοσοτοξίνες για τη θανάτωση όγκων, γενικά πρέπει να χορηγούνται σε υψηλές δόσεις για να δεσμεύεται αρκετή ποσότητά τους στον όγκο. Τα αντισώματα αυτά όμως αναγνωρίζονται ως ξένα και προκαλούν ανοσοαπόκριση. Τα παραγόμενα αντίαντισώματα ανθρώπου έναντι ποντικού, μειώνουν την αποτελεσματικότητα της ανοσοτοξίνης, αφαιρώντας την από το αίμα. Επιπλέον τα σύμπλοκα αντισωμάτων ποντικού - ανθρώπου, μπορούν να προκαλέσουν αλλεργικές αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις αυτές αποτελούν περιοριστικούς παράγοντες στη χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού για τον εντοπισμό και τη θανάτωση όγκων στον άνθρωπο. Από την άλλη πλευρά, είναι πολύ δύσκολη η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων ανθρώπου. Ετσι, η τεχνολογία ανασυνδυασμού του DNA στη Μηχανική των μονοκλωνικών αντισωμάτων αποτελεί σήμερα νέο πεδίο έρευνας. ζ) Χιμαιρικά μονοκλωνικά αντισώματα Μία μέθοδος που αναπτύχθηκε πρόσφατα περιλαμβάνει την κλωνοποίηση ανασυνδυασμένου DNA που περιέχει τον υποκινητή, τον οδηγό και αλληλουχίες μεταβλητής περιοχής ενός γονιδίου αντισώματος ποντικού και εξόνια σταθερής περιοχής ενός γονιδίου αντισώματος ανθρώπου (Εικόνα 6). Το αντίσωμα που κωδικοποιείται από ένα τέτοιο ανασυνδυασμένο γονίδιο, ονομάζεται χίμαιρα ποντικού-ανθρώπου ή ανθρωποποιημένο αντίσωμα (chimera ή humanized). Η αντιγονική του ειδικότητα, που καθορίζεται από τη μεταβλητή του περιοχή προέρχεται από το DNA του ποντικού. Ο ισότυπός του που καθορίζεται από τη σταθερή του περιοχή προέρχεται από το DNA του ανθρώπου. Επειδή οι σταθερές περιοχές κωδικοποιούνται από γονίδια ανθρώπου, τα χιμαιρικά αυτά αντισώματα έχουν ελάχιστους επιτόπους ποντικού και είναι πολύ λιγότερο ανοσογόνα από τα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού όταν χορηγηθούν σε ανθρώπους. Ενα άλλο πλεονέκτημα των χιμαιρικών αντισωμάτων είναι ότι διατηρούν τις βιολογικές ιδιότητες του αντισώματος του ανθρώπου και είναι πολύ πιο αποτελεσματικά στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος.
11 Εικόνα 6. Παραγωγή ανθρωποποιημένων ή χιμαιρικών αντισωμάτων ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1. Με την τεχνική του κυτταρικού υβριδισμού και της επιλογής σε θρεπτικό μέσο HAT, πρωτογενή σπληνικά λεμφοκύτταρα μπορούν να υβριδοποιηθούν με μυελωματικά κύτταρα ποντικού (HGPRT -, Ab - ). Aυτά τα υβρίδια κύτταρα, που ονομάζονται υβριδώματα Β-κυττάρων, συνεχίζουν να εκκρίνουν το προκαθορισμένο αντίσωμα του πρωτογενούς Β-κυττάρου, αλλά διατηρούν επίσης την ικανότητα απεριορίστων πολλαπλασιασμών in vitro του μυελωματικού κυττάρου. 2. Σε αντίθεση με τα πολυκλωνικά αντισώματα ένα μονοκλωνικό αντίσωμα είναι ένα ομογενές παρασκεύασμα ειδικό για ένα επίτοπο ενός πολύπλοκου αντιγόνου.
12 3. Μονοκλωνικά αντισώματα έχουν χρησιμοποιηθεί για καθαρισμό αντιγόνων, για εντοπισμό και διαχωρισμό κυτταρικών υποπληθυσμών και για τον εντοπισμό και τη θανάτωση συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται σήμερα σε περισσότερα από 100 διαγνωστικά τεστ. 4. Η τεχνολογία ανασυνδυασμού του DNA έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή χιμαιρικών αντισωμάτων τα οποία αποτελούνται από μεταβλητές περιοχές ποντικού και σταθερές περιοχές ανθρώπου. Αυτά τα χιμαιρικά αντισώματα δεν επάγουν αντί-ισοτυπική ανοσοαπόκριση όταν χορηγούνται σε ανθρώπους. 5. Μονοκλωνικά Fab θραύσματα έχουν παραχθεί με τυχαίο συνδυασμό γονιδίων της βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας και έχουν κατασκευαστεί βιβλιοθήκες σε βακτηριοφάγο λ. Η διαδικασία αυτή επιτρέπει την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων χωρίς αντιγονική διέγερση ή τεχνολογία υβριδισμού. 6. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί διάφορα καταλυτικά μονοκλωνικά αντισώματα (Abzymes). Μελλοντικά, η ταυτοποίηση μεγάλου αριθμού μονοκλωνικών αντισωμάτων που παρασκευάζονται από βιβλιοθήκες γονιδίων, μπορεί να βοηθήσει στην ανίχνευση και ταυτοποίηση άλλων καταλυτικών μονοκλωνικών αντισωμάτων με χρήσιμες καταλυτικές λειτουργίες. 7. Υβριδώματα Τ-κυττάρων, που παράγονται από πρωτογενή Τ-κύτταρα και Τ- κύτταρα θυμώματος (καρκίνου του θύμου), είναι σήμερα πολύ χρήσιμα για την απομόνωση και τον καθαρισμό διαφόρων κυτταροκινών που εκκρίνονται από τα Τ-κύτταρα.