ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ ENZIME HEPATICE CU ROL ÎN DIAGNOSTIC

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMELOR CU IMPORTANŢĂ ÎN EXPLORAREA HEPATICĂ GENERALITATI Datele de laborator care exploreaza afectarea hepatica sunt denumite in mod obisnuit teste functionale hepatice (TFH). Acestea cuprind o baterie de analize biochimice care susţin diagnosticul de hepatopatie. Ficatul este sediul unor multitudini impresionanate de procese biochimice, astfel încat nu există nici un test care sa poata fi considerat indicator unic pentru disfunctia hepatică. Astfel în cadrul testelor funcţionale hepatice un posibil profil biochimic ar avea următoarea structură: A. enzime hepatice: ALAT (alanin amino transferaza), ASAT(aspartat aminotransferaza), ALP (fosfataza alcalină), GGT (gamma glutamiltranspeptidaza), LDH (lactat dehidrogenaza) etc. B. bilirubină serică C. proteine totale D. albumină E. uree ENZIME HEPATICE CU ROL ÎN DIAGNOSTIC DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ALANIN AMINOTRANSFERAZEI (ALAT) (GPT) Principiul metodei: Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizează următoarea reacţie: C=O CH NH 2 ALAT C NH 3 C=O CH 3 Acid

-cetoglutaric Alanină Acid glutamic Acid piruvic Piruvatul format este transformat în lactat de către NADH+H + în reacţia catalizata de LDH (lactat dehidrogenază) conform reacţiei: CH 3 C O NADH+H + LDH NAD CH 3 CH OH Acid piruvic Acid lactic Se măsoară viteza de diminuare a concentraţiei NADH+H + pe măsură ce trece în NAD +, prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea ALAT. Aparatură: Spectrofotometru Cronometru Reactivi: 1. Soluţie substrat; L-alanina 800 mm in tampon fosfat 100 mm şi ph=7,4 2. Amestec de: -cetoglutarat 10 mm, NADH + +H + 0,2 mm, LDH 10mg/l în tampon fosfat 100 mm, ph=7,4 Mod de lucru: În momentul începerii determinărilor se amestecă soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1 parte reactiv 2 ). Amestec de reactivi 1+2 (µl) 1000 Ser (µl) 250 Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de unda de 366 nm în cuve de l cm. Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la 25 C Calcularea rezultatelor: Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se notează cu ( A/min). Concentraţia ALAT în UI/l = ( A/min) x 1520 Observaţii: dacă valoarea ( A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua şi la 30 C şi 37 C.

Intervale de referinţă: 25 C 30 C 37 C Bărbaţi pînă la 22 UI/l pînă la 29 UI/l pînă la 40 UI/l Femei pînă la 17 UI/l pînă la 22 UI/l pînă la 31 UI/l DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ASPARTAT AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)- (GOT) Principiul metodei: Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizează următoarea reacţie: ASAT C=O CH NH 2 HC NH 3 C=O Acid Acid Acid Acid α cetoglutaric aspartic glutamic oxalacetic Oxalacetatul format este transformat în malat de către NADH + + H + în reacţia catalizată de MDH (malat dehidrogenază) conform reacţiei: C=O MDH HC OH NADH+H + NAD Acid oxalacetic Acid malic Se măsoară viteza de diminuare a cantităţii de NADH+H + pe măsură ce trece în NAD +, prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea enzimei ASAT. Aparatură: Spectrofotometru Cronometru

Reactivi: 1. Soluţie substrat: aspartat 200 mm în tampon fosfat 100 mm şi ph =7,4 2. Amestec de: -cetoglutarat 12 mm, NADH + +H + 0,2 mm, LDH 10mg/l, MDH 10 mg/l în tampon fosfat 100 mm ph=7,4 Mod de lucru: În momentul începerii determinărilor se amesteca soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1 parte reactiv 2 ). Amestec de reactivi 1+2 (µl) 1000 Ser (µl) 250 Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de undă de 366 nm în cuve de 1 cm. Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la 25 C Calcularea rezultatelor: Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se notează cu ( A/min). Concentraţia ALAT în U/l = ( A/min) x 1520. Observaţii: Dacă valoarea ( A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua şi la 30 C şi 37 C. Intervale de referinţă: 25 C 30 C 37 C Bărbaţi pînă la 18 U/l pînă la 25 U/l pînă la 37 U/l Femei pînă la 15 U/l pînă la 21 U/l pînă la 31 U/l Interpretarea rezultatelor: Permeabilitatea membranei celulare hepatice creşte gradat funcţie de suferinţă. Investigaţiile biochimice evidenţiază creşteri în ser a unor enzime celulare (ALAT, ASAT, LDH, etc.).nivelul seric al acestor enzime de leziune, variază în funcţie denumărul de hepatocite afectate, de gravitatea lezării fiecărei celule, de viteza cu care s-a produs leziunea şi de viteza de eliminare din ser (t 1/2) a enzimelor respective.

Dozarea ALAT şi ASAT rămîne cea mai utilă şi sensibilă investigaţie biochimică în caz de afectare hepatocelulară acută (virală, toxică, medicamentoasă), valori 500 U/l sugerînd acest diagnostic. Valori crescute: cele mai mari creşteri 100-2000 U/l apar în hepatitele virale, intoxicaţia cu tetraclorură de carbon, în leziuni induse de medicamente. creşterea rapidă şi marcantă a ASAT şi ALAT (>600 U/l şi adesea >2000 U/l) urmată de o scădere bruscă în primele 12-72 de ore de la debut este considerată specifică pentru obstrucţia acută a ductelor biliare. creşteri importante ale ASAT şi ALAT asociate cu creşteri ale fosfatazei alcaline indică icter hepatocelular. ASAT crescută ( 300 U/l) şi ALAT ( 200 U/l) se înregistrează în obstrucţia biliară completă. Enzimele revin la normal în decurs de o săptămînă de la îndepărtarea obstrucţiei. o stare patologică particulară caracterizată prin creşterea marcantă a enzimelor hepatice (ALAT, ASAT,OTC), a celor musculare (creatinkinaza CK), precum şi a -amilazei şi lipazei pancreatice se întîlneşte în sindromul Reye. creşteri moderate al ALAT şi ASAT, asociate cu creşteri ale fosfatazei alcaline sugerează icter colestatic. valori mai ridicate de 150 U/l apar în hepatitele alcoolice (mai ales dacă pacientul are şi delirum tremens). valori 100 UI/l apar în ciroza alcoolică, nivelul ALAT este normal în 50 % din cazuri, iar ASAT în 25% din cazuri. creşteri abia schiţate ale ALAT şi ASAT apar în procesele neoplazice ale ficatului, cînd leziunile celulare hepatice se produc pe arii limitate în jurul infiltratului malign.(asat>alat). ALAT şi ASAT cresc în urma transplantului hepatic, după reperfuzia alogrefei (de 4-5 ori limita superioară a intervalului de referinţă). Creşterile persistente sau tardive se pot datora rejecţiei, infecţiilor virale, abcesului hepatic sau ocluzia arterei hepatice. creşteri moderate ale ALAT şi ASAT se evidenţiază în infecţiile cu virus Epstein-Barr, precum şi în mononucleoza serică. Alături de creşterile individuale ale enzimelor celulare se produc şi modificări ale raportului dintre ele. Astfel raportul ASAT/ALAT (raport de Ritis) la subiecţii normali este 1,3, dar poate fi modificat în funcţie de afecţiune. ASAT/ALAT<1 apare în hepatitele virale. ASAT/ALAT >2, cu ALAT <300 U/l sugerează hepatită alcoolică. ASAT/ALAT 3 la pacienţi cu ciroză hepatică sau cu hipertensiune portală sugerează ciroză biliară primară.

Valori scăzute : deficit de piridoxal fosfat ce apare în sarcină, afecţiuni hepatice secundare consumului de alcool. neoplazii infecţii urinare În majoritatea afecţiunilor hepatice sunt necesare dozări seriate ale enzimelor, valoarea acestora indicînd evoluţia clinică. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII GAMMA-GT ( -GT) (metoda cinetică) Principiul metodei: Determinarea activităţii -GT se face folosind ca substrat L- - glutamil-3-carboxi-4- nitroanilida. Reacţia este următoarea: HOOC CH C=O H2N C=O NH 2 NH NO 2 CH2 HN L-Gama-glutamil p-nitro-anilida Glicil-glicina HOOC CH NH 2 C=O NH C=O HN CH2 H 2 N NO 2 L-Gama-glutamil glicil-glicina p-nitro-anilina Creşterea absorbanţei pe măsură ce se formează 4-nitroanilina este direct proporţională cu activitatea -GT. Citirile se efectuează la 405 nm.

Aparatură: Spectrofotometru Cronometru Cronometru Reactivi: 1. Soluţie glicilglicina in tampon TRIS ph=8,25, 100 mmol 2. Soluţie substrat L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida, de concentraţie 2,9 mmol/1 Mod de lucru: 1. Prepararea soluţiei de lucru: Se amestecă 5 părţi reactivul 1 cu o parte reactiv 2. Această soluţie este stabilă 7 zile la temperatură de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C. 2. Dozarea propriu-zisă: Soluţie de lucru ( l) 500 Ser ( l) 50 Se agită şi citesc absorbantele la 1, 2 şi 3 minute Calcularea rezultatelor: Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se notează cu ( A/min). Concentraţia -GT (U/l) = ( A/min) x 1152. Intervale de referinţă: 25 C 30 C 37 C Bărbaţi 6-28 U/l 8-38 U/l 11-50 U/l Femei 4-18 U/l 5-25 U/l 7-32 U/l Observaţii: Serul folosit trebuie să fie proaspăt şi nehemolizat, iar recoltarea se face pe citrat, oxalat sau EDTA. Linearitatea reacţiei se menţine până la valori de 280 U/l. Peste aceste valori se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10.

Interpretarea rezultatelor: Valori crescute: Dozarea γ-gt este cel mai sensibil indicator şi un test de screening folosit uzual pentru determinarea alcoolismului. În acest caz creşterea γ-gt o depăşeşte pe cea a celorlalte enzime hepatice dozate în mod curent. Gradul de creştere a γ-gt la un alcoolic variază de la caz la caz şi depinde mai mult de persistenţa îndelungată a consumului decît de cantitatea ingerată. S-a demonstrat că o încărcare suplimentară cu alcool la un caz de alcoolism cronic produce în decurs de 24 de ore o creştere mult mai accentuată a activităţii serice a γ-gt (3,5x LSN), comparativ cu o acceaşi încărcare cu alcool la un subiect sănătos consumator ocazional de alcool. Pacienţii alcoolici trataţi cu anticonvulsivante au valori ale γ-gt de 50 de ori valoarea normală. La pacienţii trataţi cu anticonvulsivante, dar care nu consumă alcool creşterile pentru γ-gt sunt modeste. În icterul obstructiv creşterile pentru γ-gt sunt mai rapide şi mai importante decît cele pentru ALP şi LAP. În colestaza mecanică şi virală γ-gt creşte cam în aceeaşi proporţie cu ALP şi LAP, pe cînd în colestaza medicamentoasă creşterea pentru γ-gt este mult mai mare. În neoplasmul hepatic nivelul γ-gt creşte progresiv de la o examinare la alta. În ciroza biliară primară valorile pentru γ-gt sunt de aproximativ 13x LSN (limita superioară normală). În hepatita acută creşterile sunt mai puţin marcante decît a celorlalte enzime hepatice, dar este ultima care revine la normal, indicînd covalescenţa. În hepatita cronică activă valorile pot atinge 7x LSN. În stadiul asimptomatic al bolii poate fi singura enzimă hepatică ce prezintă valori serice crescute. γ-gt reprezintă markerul cel mai sensibil al rejectului (după transplant hepatic), nivelul enzimei creşte precoce înaintea ALP şi bilirubinei. γ-gt prezintă creşteri importante alături de cele ale ALP în leptospiroza icterohemoragică (boala Weil). Valori crescute se înregistrează în tumori primitive sau metastatice ale ficatului În intoxicaţia cu clorpromazină valorile pentru γ-gt cresc semnificativ.

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII FOSFATAZEI ALCALINE (ALP) (metoda cinetică) Principiul metodei: Fosfataza alcalina (ALP), în mediu alcalin (ph=8,6), catalizează hidroliza p- nitrofenilfosfatului în p-nitrofenol şi fosfat. Reacţia este următoarea: OH O P O OH ALP H 2 O NaOH O HO P OH OH OH NO 2 NO 2 p-nitrofenilfosfat Acid fosforic p-nitrofenol Creşterea absorbanţei la 405 nm a p-nitrofenolului pe măsură ce se formează este direct proporţională cu activitatea ALP. Aparatura: Spectrofotometru Cronometru Reactivi: 1. 2-amino-2-metil-1-propanol, ph 10,4; 0,90 mol/l Acetat de magneziu 1,6 mmol/l Sulfat de zinc 0,4 mmol/l 2. p-nitrofenilfosfat 16 mmol/l 3. Ser sau plasma (recoltate pe heparină) 4. Mod de lucru a. Prepararea soluţiei de lucru: se amestecă 4 părţi reactiv 1 cu o parte reactiv 2. Această soluţie este stabilă 5 zile la temperatură de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.

b. Dozarea propriu-zisa: Reactivi ( l) Probă ( l) Blanc ( l) Soluţie de lucru 100 100 Ser 20 - Apă distilată - 20 Se agită şi citesc absorbanţele la 1, 2 şi 3 minute 5. Calcularea rezultatelor: Se face diferenţa între prima şi ultima citire atât pentru probă cât şi pentru blanc şi se împarte la numărul de minute cronometrate. Se notează cu ( A/min probă) şi ( A/min blanc). ( A/min)=( A/min probă)-( A/min blanc). Activitatea ALP (U/l) = ( A/min) x 2757 6. Intervale de referinţă: Adulţi: Copii: ALP (U/l) Femei 20-50 ani 42-98 Bărbaţi 20-50 ani 53-128 Femei > 60 ani 53-141 Bărbaţi > 60 ani 56-119 Fete Băieţi ALP (U/l) 1-30 zile 48-106 75-319 1 lună-1 an 124-341 82-383 1-3 ani 108-317 104-345 4-6 ani 96-297 93-309 7-9 ani 69-325 86-315 10-12 ani 51-332 42-362 13-15 ani 50-162 74-390 16-18 ani 47-119 52-171 Observaţii: Testul este realizat pentru a determina activităţile ALP care corespund unei A/min., maxime de 0.25. Peste aceasta valoare se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10.

Nu s-au observat interferenţe pentru următoarele substrate: acid ascorbic până la 30 mg/dl, bilirubină conjugată până la 60 mg/dl, bilirubină neconjugată până la 25 mg/dl, trigliceride pînă la 2000 mg/dl. Limita minimă de detecţie este de 2 U/l. Interpretarea rezultatelor: Valori crescute: obstrucţie biliară (este considerată cel mai bun marker al obstrucţiei biliare, dar nu diferenţiază colestaza intrahepatică de obstrucţia extrahepatică). În boala hepatobiliară obstructivă nivelul seric al ALP creşte în paralel cu cel al 5 -NT (5 nucleotidazei) şi LAP (leucin aminopeptidazei). creşteri ale ALP în paralel cu -GT şi 5 -NT apar în ciroza biliară primară. raportul -GT/ALP 5 susţine diagnosticul de boală hepatică alcoolică. Creşteri ale - GT determinate de alcool sau anticonvulsivante nu sunt însoţite de creşterea ALP. Stabilirea cauzei creşterii ALP este extrem de utilă în vederea diferenţierii diagnosticului. Enzima serică Obstrucţie biliară Afecţiune osoasă Copilărie Sarcină ALP C C C C 5 -NT C N N N LAP C N N C -GT C N N N Unde: C = valori crescute; N = valori normale nivelul ALP creşte înaintea apariţiei icterului nivele marcat crescute ale ALP apar la sugarii cu atrezie biliară intrahepatică, dar mult mai scăzute în caz de atrezie extrahepatică. creşteri modeste (cam de 3 ori valoarea normală) sunt specifice şi pot fi întîlnite în orice afecţiune hepatică (hepatită virală, hepatită cronică, ciroză hepatică, afecţiuni hepatice infiltrative), dar şi în alte boli cu interesare hepatică (ex. insuficienţa cardiacă congestivă). Valori scăzute: Scăderi ale ALP apar în glicogenoza de tip I (deficit de glucozo-fosfataza).