ΚΕΦ. 18 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΧΑΡΤΗ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ - ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

Χρωματογραφία Χάρτη (1) Εισαγωγή Αναπτύχθηκε από Consden, Gordon και Martin (1944) Είδος Επίπεδης Χρωματογραφίας (Planar Chromatography) Ταινία ήφύλλο χάρτη (κυτταρίνη) ως στερεό υλικό στήριξης στατικής φάσης Στατική φάση: Σύμπλοκο ύδατος - κυτταρίνης

Κυτταρίνη Στερεό υλικό στήριξης στατικής φάσης

Χρωματογραφία Χάρτη (2) Μηχανισμός Διαχωρισμού Κύριος μηχανισμός διαχωρισμού: κατανομή μεταξύ δύο υγρών: Ενός πολικού (συνήθως νερό) καθηλωμένου στο χάρτη (στατική φάση) Ενός λιγότερου πολικού (οργανικός διαλύτης), που κινείται στο χάρτη (κινητή φάση) Σε μικρή κλίμακα συμβαίνει και Προσρόφηση Ιονανταλλαγή

Χρωματογραφία Χάρτη (3) Τρόπος Χρωματογράφησης Οι ζώνες συστατικών δεν αφήνονται να εκλουστούν Ηχρωματογράφηση διακόπτεται ενόσω το μέτωπο του διαλύτη βρίσκεται ακόμα στο χάρτη

Χρωματογραφία Χάρτη (4) Κινητή φάση Συνήθως μείγμα οργανικών διαλυτών με νερό. Μπορεί να είναι: Ουδέτερη Βασική Όξινη Τυπικά παραδείγματα κινητών φάσεων Ισοπροπανόλη αμμωνία νερό κ-βουτανόλη οξικό οξύ νερό Υδατικό διάλυμα φαινόλης

Χρωματογραφία Χάρτη (5) Κινητή φάση Μερικά μείγματα σχηματίζουν διφασικά συστήματα, όταν ανακινούται Η πολική φάση χρησιμοποιείται για κορεσμό του χάρτη (εξισορρόπηση) πριν από τη χρήση του Η μη υδατική (λιγότερο πολική φάση) χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος Με αλλαγή αναλογιών μείγματος διαλυτών μεταβάλλεται δραστικά ηδύναμη έκλουσης (διαχωριστική ικανότητα) ενός διαλύτη ανάπτυξης

Χρωματογραφία Χάρτη (6) Υλικό στήριξης Ειδικός χάρτης από πολύ καθαρή κυτταρίνη Συνήθως χρησιμοποιείται χάρτης διήθησης (π.χ. Whatman No 1) Τύπος χάρτη ρυθμίζει ταχύτητα ροής του υγρού ανάπτυξης Χάρτης με χονδρές ίνες επιτρέπει μεγαλύτερες ταχύτητες

Λωρίδες και Φύλλα Κυτταρίνης για χρωματογραφία χάρτη

Εκτέλεση χρωματογραφίας χάρτη (1) Τοποθέτηση σταγόνων (λίγα μl) με μικροσιφώνιο ήμικρομετρική σύριγγα, ως κηλίδα, πλησίον του ενός άκρου λωρίδας ή φύλλου χάρτη Προσημειωμένες θέσεις με μολύβι Εάν χρησιμοποιηθεί μελάνι θα διαχωρισθεί σε έγχρωμα συστατικά Ξήρανση κηλίδας με εξάτμιση διαλύτη Τοποθέτηση λωρίδας ήφύλου χάρτη στο θάλαμο ανάπτυξης, που περιέχει τον πολικό διαλύτη στατικής φάσης σε ξεχωριστό δοχείο

Εκτέλεση χρωματογραφίας χάρτη (2) Αποκατάσταση εξισορρόπησης Κορεσμός χάρτη με ατμούς πολικού διαλύτη Επιτάχυνση με τοποθέτηση γύρω από τα τοιχώματα θαλάμου φύλλων διηθητικού χάρτη εμποτισμένων με διαλύτη Προσθήκη κινητής φάσης Να έρθει σε επαφή με το άκρο του χάρτη Οδιαλύτης να μην αγγίξει την κηλίδα του δείγματος

Τοποθέτηση Σταγόνων Δείγματος ως Κηλίδα σε Λωρίδα Χάρτη

Θάλαμοι ανάπτυξης χρωματογραφίας χάρτη (1) Μεγάλος δοκιμαστικός σωλήνας Ογκομετρικός κύλινδρος Ειδικές υάλινες συσκευές, που επιτρέπουν τη σύγχρονη τοποθέτηση περισσότερων λωρίδων ήφύλλων χάρτη Οθάλαμος συγκρατεί το χάρτη στη θέση του κατά διάρκεια ανάπτυξης Με τη βοήθεια αγκίστρων ήάλλων μηχανισμών

Θάλαμοι ανάπτυξης χρωματογραφίας χάρτη (2) Οθάλαμος παρέχει ατμόσφαιρα κορεσμένη με ατμούς διαλύτη ανάπτυξης Πρέπει να κλείνει αεροστεγώς

Θάλαμοι χρωματογραφίας χάρτη

Τρόποι Ανάπτυξης Χρωματογραφίας Χάρτη 1. Ανιούσα χρωματογραφία 2. Κατιούσα χρωματογραφία 3. Κυκλική ήοριζόντια χρωματογραφία

Ανιούσα χρωματογραφία (1) Οδιαλύτης ανάπτυξης τοποθετείται στον πυθμένα του θαλάμου Έρχεται σε επαφή με τη λωρίδα χάρτη που κρέμεται από σκέπασμα Ο διαλύτης (κινητή φάση) ανέρχεται μέσα από ίνες χάρτη με τριχοειδείς δυνάμεις Παρασύρει τα συστατικά της κηλίδας (τοποθετείται στο κάτω άκρο λωρίδας) με διαφορετική ταχύτητα, ανάλογα με λόγο κατανομής

Ανιούσα χρωματογραφία (2) Όσο περισσότερο υδρόφοβη (λιπόφιλη) η ουσία, τόσο ταχύτερα μετακινείται Όσο περισσότερο υδρόφιλη, τόσο μεγαλύτερη τάση να παραμείνει στη στατική φάση Έτσι πετυχαίνεται οδιαχωρισμός

Ανιούσα Χρωματογραφία

Διαχωρισμός Μαύρης Μελάνης με Ανιούσα Χρωματογραφία Χάρτη

Ανιούσα Χρωματογραφία Χάρτη σε Θάλαμο

Κατιούσα Χρωματογραφία Χάρτη Κινητή φάση τοποθετείται σε σκαφίδιο στο άνω μέρος του θαλάμου Άνω άκρη χάρτη βυθίζεται και συγκρατείται μέσα στην κινητή φάση Οδιαλύτης κατέρχεται μέσα από ίνες του χάρτη, κυρίως λόγω βαρύτητας Παρασύρει τα συστατικά της κηλίδας, που τοποθετείται στο άνω άκρο χάρτη

Κατιούσα Χρωματογραφία

Κυκλική ήοριζόντια χρωματογραφία Χρησιμοποιείται κυκλικό φίλτρο χάρτη Ηκηλίδα δείγματος τοποθετείται στο κέντρο του χάρτη Οχάρτης κρατείται σε οριζόντια θέση πάνω σε κάψα Ηκάψα περιέχει το υγρό αναπτύξεως Μια θρυαλλίδα φέρνει σε επαφή το υγρό αναπτύξεως με το κέντρο του κυκλικού χάρτη Ηκυκλική κίνηση διαλύτη σχηματίζει ομόκεντρους δακτυλίους, αντί κηλίδων

Κυκλική χρωματογραφία χάρτη

Διατάξεις για (α) ανιούσα, (β) κατιούσα και (γ) οριζόντια χρωματογραφία

Διδιάστατη χρωματογραφία (1) Όταν συστατικά μείγματος διαχωρίζονται δύσκολα με σύστημα ενός διαλύτη Λόγω παρόμοιων χημικών ιδιοτήτων Χρησιμοποιείται τετράγωνο φύλλο χάρτη Τοποθετείται κηλίδα δείγματος στη γωνία του χάρτη Γίνεται ανάπτυξη χρωματογραφήματος με ένα διαλύτη Α

Διδιάστατη χρωματογραφία (2) Στρέφεται το φύλλο χάρτη σε γωνία 90 ο Γίνεται ανάπτυξη χρωματογραφήματος με διαλύτη Β Τα συστατικά διαχωρίζονται πληρέστερα

Διδιάστατη χρωματογραφία

Διδιάστατη Χρωματογραφία SF: Solvent Front (Μέτωπο Διαλύτη)

Χρωματογραφία Χάρτη Αντίστροφης Φάσης Εάν ουσίες μείγματος ελάχιστα διαλυτές στο νερό (λιπαρά οξέα, μη πολικές ενώσεις) Οι ουσίες απλώς μετακινούνται με μέτωπο διαλύτη Διαχωρισμός ατελής ήανύπαρκτος Εφαρμόζεται τεχνική αντίστροφης φάσης Οχάρτης διαποτίζεται με υδρόφοβη ουσία (σιλικόνη ή ορυκτέλαιο) (στατική φάση) Κινητή φάση είναι νερό ήμείγματα που περιέχουν νερό Ηκατανομή ουσιών στις δύο φάσεις αντίστροφη από την κανονικής φάσης

Εμφάνιση Χρωματογραφήματος (1) Όταν διαλύτης φθάσει σε άλλο άκρο χάρτη, σημειώνεται η θέση (μέτωπο διαλύτη) με μολύβι Ηθέση συνήθως προσημειώνεται Οχάρτης ξηραίνεται με ρεύμα θερμού αέρα ήστο πυριατήριο Ακολουθεί εμφάνιση χρωματογραφήματος Ανίχνευση κηλίδων ουσιών που διαχωρίζονται

Εμφάνιση Χρωματογραφήματος (2) Με κατάλληλα αντιδραστήρια που σχηματίζουν με διαχωρισμένες ουσίες έγχρωμες ενώσεις Με έκθεση χρωματογραφήματος σε ακτινοβολία UV Οι φθορίζουσες ουσίες παρέχουν κιτρινοπράσινες ή κυανές κηλίδες Οι ουσίες που απορροφούν ακτινοβολία UV φαίνονται μαύρες κηλίδες σε κυανωπό φθορίζον πεδίο του χάρτη Οι εμφανιζόμενες κηλίδες σημειώνονται με μολύβι

Εμφάνιση χρωματογραφήματος αμινοξέων με ψεκασμό με νινυδρίνη

Εμφάνιση Χρωματογραφήματος

Ανάλυση 10 αιθερίων ελαίων με TLC μετά από ψεκασμό με αντιδραστήριο βανιλίνης

Εμφάνιση με Έκθεση σε Ακτινοβολία UV

Ενόργανες και Ειδικές Ανιχνεύσεις Ραδιοχημικά Αγωγιμομετρικά με ηλεκτρόδια κατά μήκος του χάρτη Μικροβιολογικά Οι ζώνες των αντιβιοτικών εντοπίζονται με επίθεση χρωματογραφήματος σε καλλιέργεια μικροβίων Εμφανίζονται ζώνες αναστολής

Κύριο κριτήριο επιλογής αντιδραστηρίου εμφάνισης Δυνατότητα να αντιδράσει με όσο το δυνατό περισσότερες ουσίες

Κοινά αντιδραστήρια εμφανίσεως χρωματογραφίας χάρτη

Διαπίστωση ταυτότητας συστατικών μείγματος Με βάση την τιμή συντελεστή επιβράδυνσης R F Στην περίπτωση χρωματογραφίας χάρτη δίνεται από σχέση R F = απόσταση απόσταση _ που _ που _ διάνυσε _ ουσία _ διάνυσε _ µ έτωπο _ διαλύτη

Υπολογισμός RF

Συντελεστής Επιβράδυνσης R F (1) Επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες Σύσταση διαλύτη ανάπτυξης Φύση χάρτη Τρόπο ανάπτυξης χρωματογραφήματος Θερμοκρασία

Συντελεστής Επιβράδυνσης R F (2) Σε καθορισμένες συνθήκες χαρακτηριστική σταθερά, χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση ουσίας Σύγκριση R F προς τιμές R F γνωστών ουσιών στις ίδιες συνθήκες Για αύξηση αξιοπιστίας παράλληλη χρωματογράφηση γνωστών ουσιών και άγνωστου δείγματος στο ίδιο φύλλου χάρτη

Χρήση Χρωματογραφίας Χάρτη Κατ εξοχήν τεχνική ποιοτικής ανάλυσης Μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για ποσοτικούς προσδιορισμούς: Κόβονται τα τμήματα χάρτη, εκχυλίζεται ηκηλίδα με κάποιο διαλύτη Προσδιορισμός με φασματοφωτομετρία ή φθορισμομετρία Απευθείας προσδιορισμός στο χάρτη με τεχνική πυκνομετρίας Το μέγεθος και ένταση χρώματος κηλίδων μετά την εμφάνιση χρησιμοποιούνται για ημιποσοτικό προσδιορισμό

Χαρακτηριστικά Χρωματογραφίας Χάρτη Πολύ ευαίσθητη τεχνική Μπορεί να εφαρμοσθεί για ανίχνευση και ταυτοποίηση σε κάθε είδους μείγματος ανόργανων και οργανικών ουσιών Είναι μικρομέθοδος Απαιτούνται 5-20 μl διαλύματος 0,1-1%, δηλαδή 5-200 μg ουσίας Εάν χρησιμοποιηθούν φθορίζοντα ήραδιενεργά αντιδραστήρια ανιχνεύεται 1 μg ουσίας

Εφαρμογές χρωματογραφίας χάρτη στη φαρμακευτική ανάλυση Ταυτοποίηση πρώτων υλών Σύγκριση R F μεουσίες αναφοράς Έλεγχος ορίων προσμείξεων Σύγκριση διαμέτρου και εντάσεως χρώματος κηλίδας πρόσμειξης με αντίστοιχα χαρακτηριστικά κηλίδας πρότυπης ουσίας με συγκέντρωση ίση με το επιτρεπόμενο όριο Ταυτοποίηση πολυπεπτιδικών αντιβιοτικών Ταυτοποίηση αμινοξέων μετά από υδρόλυση Ανάλυση εκχυλισμάτων δρογών

Χρωματογραφία Χάρτη για την ανίχνευση αφλατοξινών και ναρκωτικών - φαρμάκων

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) ΕΙΣΑΓΩΓΗ (1) Αναπτύχθηκε κυρίως από το Stahl (1950-1958) Τεχνική υγροχρωματογραφίας Καθιερώθηκε ως μία από τις σπουδαιότερες αναλυτικές τεχνικές Στατική φάση και μηχανισμός διαχωρισμού παρόμοιοι με αυτούς της χρωματογραφίας στήλης Λέγεται και χρωματογραφία ανοικτής στήλης

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) ΕΙΣΑΓΩΓΗ (2) Τεχνική λήψεως χρωματογραφήματος ίδια με αυτή χρωματογραφίας χάρτη Αντί χάρτη χρησιμοποιείται υάλινη πλάκα ή φύλλο αλουμινίου ήπλαστικού, επιστρωμένη με λεπτή ομοιόμορφη στιβάδα (συνήθως πάχους 100 300 μm) προσροφητικού υλικού Ενεργοποιημένο SiO 2 (silica gel) Οξείδιο αργιλίου (alumina) Μικροκρυσταλλική κυτταρίνη (cellulose powder) Γη διατόμων (Kieselguhr) Πολυαμίδιο

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) ΕΙΣΑΓΩΓΗ (3) Προσροφητικό υλικό προσκολλάται στην πλάκα συνήθως με συνδετικά υλικά Ένυδρο θειικό ασβέστιο (γύψος) Άμυλο Πολυβινυλοαλκοόλη

Μηχανισμός TLC (1) Συνήθως λειτουργεί ως χρωματογραφία προσρόφησης Χρήση διαλυτών ανάπτυξης με υψηλής πολικότητας διαλύτες (νερό, μεθανόλη) Οπολικός διαλύτης προσροφάται ισχυρά από το υλικό στιβάδας και ομηχανισμός γίνεται συνδυασμός κατανομής προσρόφησης

Μηχανισμός TLC (2) Είναι δυνατή εκτέλεση διαχωρισμών: Κατανομής (κορεσμός προσροφητικού υλικού με πολικό διαλύτη, π.χ. νερό) Ιονανταλλαγής (επίστρωση πλάκας με ιονανταλλακτική ρητίνη) Μοριακού αποκλεισμού (επίστρωση πλάκας με κατάλληλη υδροπηκτή) Αντίστροφης φάσης (σιλανοποίηση υδροξειδίου πυριτίου ήγης διατόμων, οπότε στην επιφάνεια προστίθενται μη πολικές μεθυλικές ομάδες)

Πηκτή Διοξειδίου Πυριτίου (Silica gel)

Παρασκευή Πλακών TLC Κρίσιμο στάδιο ηπαρασκευή ομοιόμορφης λεπτής στιβάδας στις πλάκες Ειδικές συσκευές για παρασκευή πλακών Πλάκες Επιστρωτήρας ρυθμιζόμενου πάχους Οριζόντια βάση στήριξης Θήκες φύλαξης

Παρασκευή πλακών TLC

Παρασκευή Πλακών TLC (2) Επιστρωμένες πλάκες ξηραίνονται αρχικά σε θερμοκρασία δωματίου και ύστερα σε 110 o C(ενεργοποίηση) Φυλάσσονται σε ξηραντήρα Στο εμπόριο πωλούνται έτοιμες πλάκες από διάφορα υλικά, επιστρωμένες με διάφορους τύπους προσροφητικών υλικών και στιβάδες διαφόρου πάχους

Ξήρανση Φύλαξη Διάθεση Πλακών TLC

Εμπορικές Έτοιμες Επιστρωμένες Πλάκες TLC

Κινητές Φάσεις TLC Ίδιες με χρωματογραφία χάρτη Στην TLC προσρόφησης, ικανότητα έκλουσης διαλυτών αυξάνεται με αύξηση πολικότητας Εξάνιο ακετόνη αλκοόλη νερό Προτιμούνται κινητές φάσεις ενός διαλύτη ήτο πολύ δύο ήτριών διαλυτών Μεικτοί διαλύτες χρωματογραφούνται οι ίδιο καθώς ανέρχονται στη λεπτή στιβάδα και αλλάζει βαθμιαία ησύσταση κινητής φάσης

Πορεία Διαχωρισμού TLC (1) Παρόμοια με αυτή χρωματογραφίας χάρτη Τοποθέτηση διαλύματος δείγματος στην πλάκα με μικροσιφώνιο ή μικροσύριγγα (1-10 μl διαλύματος 1%, δηλ. 10-100 μg ουσίας), σε μικρή απόσταση από το ένα άκρο της Με τη βοήθεια πλαστικών οδηγών (template) καθορίζονται θέσεις κηλίδων δειγμάτων κατά καθορισμένα διαστήματα και ηεπιθυμητή απόσταση διαλύτη.

Εξοπλισμός για τοποθέτηση δειγμάτων

Τοποθέτηση κηλίδων στην πλάκα

Πορεία Διαχωρισμού TLC (2) Τοποθέτηση πλάκας στο θάλαμο χρωματογράφησης, που περιέχει διαλύτη ανάπτυξης και έχει κορεσθεί από ατμούς διαλύτη Τοποθέτηση φύλλων διηθητικού χάρτη εμποτισμένα με κινητή φάση στα τοιχώματα θαλάμου Εμβάπτιση πλάκας στο διαλύτη, στην πλευρά που τοποθετήθηκε το δείγμα Οδιαλύτης να μην φθάσει στο ύψος των κηλίδων

Πορεία Διαχωρισμού TLC (3) Υπάρχει δυνατότητα τοποθέτησης περισσότερων της μιας πλάκας σε κάθε θάλαμο σε ειδικές θήκες

Τυπικός θάλαμος ανάπτυξης TLC

Θάλαμοι Ανάπτυξης χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας

Εξασφάλιση Κορεσμού Θαλάμου Ανάπτυξης με ατμούς διαλύτη (Τοποθέτηση φύλλων διηθητικού χάρτη εμποτισμένων με διαλύτη)

Πορεία Διαχωρισμού (4) Οδιαλύτης προσροφάται στη λεπτή στιβάδα και ανερχόμενος (ανιούσα χρωματογραφία) παρασύρει τα συστατικά μείγματος με διαφορετικές ταχύτητες Έτσι πετυχαίνεται διαχωρισμός

Ανάπτυξη Χρωματογραφήματος

Ξήρανση Πλάκας Μετά την ανάπτυξη χρωματογραφήματος ηπλάκα ξηραίνεται με ρεύμα αέρα ήστο πυριατήριο

Εμφάνιση Χρωματογραφήματος Με ίδιες μεθόδους που περιγράφηκαν στη χρωματογραφία χάρτη

Διαχωρισμός / Ανίχνευση παραγώγων ξανθίνης σε πλάκα C 18 αντίστροφης φάσης Κινητή φάση: CH 3 OH / KH 2 PO 4 (55:45 v/v) Χρόνος ανάπτυξης: 1 hr Ανίχνευση: με ατμούς ιωδίου

Οι τιμές R F των διαφόρων κηλίδων χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση ουσιών με σύγκριση με αυτές προτύπων ουσιών, που χρωματογραφούνται παράλληλα με τα δείγματα Μέτρηση R F

Παρατήρηση χρωματογραφημάτων κάτω από ακτινοβολία UV Γίνεται σε ειδικούς θαλάμους, που διαθέτουν λυχνίες βραχέος (254 nm) και μακρού (360 nm) μήκους κύματος ακτινοβολίας Μη φθορίζουσες ουσίες εντοπίζονται με προσθήκη ανόργανου φθορίζοντος δείκτη στο προσροφητικό υλικό της πλάκας (F 254 ) Κατά την παρατήρηση στο UV οι κηλίδες φαίνονται μαύρες σε φθορίζον πεδίο

Εξοπλισμός για την εμφάνιση χρωματογραφημάτων TLC με ακτινοβολία UV

TLC δύο διαστάσεων μερικών αμινοξέων σε πηκτή SiO 2 Διαλύτης Α: τολουόλιο / 2-χλωροαιθανόλη / πυριδίνη Διαλύτης Β: χλωροφόρμιο / βενζυλική αλκοόλη / οξικό οξύ

Πλεονεκτήματα TLC έναντι χρωματογραφίας χάρτη και στήλης (1) 1. Μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα Πολύ μικρού μερισμού υλικό προσρόφησης Παρέχει καθαρότερες και περισσότερο ευδιάκριτες κηλίδες από χάρτη 2. Περισσότερο ευέλικτη από χρωμ. Χάρτη Χρησιμοποιεί ποικιλία στατικών φάσεων και διάφορους μηχανισμούς Χρωματογραφία χάρτη μόνο ένα μηχανισμό

Πλεονεκτήματα TLC έναντι χρωματογραφίας χάρτη και στήλης (2) 3. Ταχύτερη από χρωματογραφία χάρτη TLC από διοξείδιο πυριτίου 20-30 min, έναντι 2-3 ωρών στη χρωμ. Χάρτη Με χρήση επιστρωμένων αντικειμενοφόρων πλακών μικροσκοπίου πετυχαίνονται χρόνοι ανάπτυξης 5 min 4. Εύκολη χρήση στο διαχωρισμό υδρόφοβων ουσιών Π.χ υδρογονανθράκων

Πλεονεκτήματα TLC έναντι χρωματογραφίας χάρτη και στήλης (3) 5. Χρήση δραστικών μέσων κατά την εμφάνιση, που δεν μπορεί να γίνει στο χάρτη Π.χ. ψεκασμός με π. H 2 SO 4 ανιχνεύονται εύκολα οργανικές ουσίες, δίνοντας μαύρες κηλίδες από άνθρακα 6. TLC πολύ ευαίσθητη και απαιτεί μικρότερες ποσότητες προσροφητικού υλικού και δείγματος (μερικά μgέως 1 mg) από στήλη

Πλεονεκτήματα TLC έναντι χρωματογραφίας χάρτη και στήλης (4) 7. Εύκολη παραλαβή ουσιών που έχουν διαχωρισθεί με απόξυση κηλίδας και εκχύλιση 8. Επιτυχής χρήση στην ποσοτική ανάλυση (ποσοτική TLC)

Μειονέκτημα TLC έναντι χρωματογραφίας χάρτη Μεγαλύτερη δυσκολία καταγραφής και διατήρησης αποτελεσμάτων Χρωματογραφήματα χάρτη διατηρούνται ευκολότερα και για περισσότερο χρόνο

Εφαρμογές TLC (1) Κύρια εφαρμογή ηανίχνευση και ταυτοποίηση ουσιών σε πολύπλοκα μείγματα: Φάρμακα Εκχυλίσματα φυτών Βιοχημικά παρασκευάσματα Αιθέρια έλαια Βιταμίνες Αμινοξέα Σάκχαρα Διαλύματα ανοργάνων ουσιών, κλπ

Εφαρμογές TLC (2) Κριτήριο ταυτοποίησης (αν και όχι αποδεικτικό): Αντιστοιχία τιμών R F γνωστών ουσιών με άγνωστης ουσίας Επανάληψη TLC με άλλο διαλύτη αυξάνει σημαντικά την αξιοπιστία της δοκιμασίας Συνδυασμός με αποτελέσματα από φασματοσκοπικές τεχνικές UV, IR, NMR, MS και υγροχημική ανάλυση

Εφαρμογές TLC (3) Χρήσιμη για την ανίχνευση προσμείξεων σε φαρμακευτικές πρώτες ύλες Εάν στο χρωματογράφημα μιας ουσίας εμφανισθεί μόνο μία κηλίδα, δεν υπάρχουν προσμείξεις ήυπάρχουν σε ποσότητες μικρότερες του ορίου ανίχνευσης Π.χ. Το ακετυλοσαλικυλικό οξύ (ασπιρίνη) (δραστική πρώτη ύλη και το σαλικυλικό οξύ (πρόσμειξη) διαχωρίζονται και έτσι ελέγχεται η πρόσμειξη

Ποσοτική TLC (1) Ουσίες που διαχωρίσθηκαν με TLC μπορούν να προσδιορισθούν ποσοτικά: Απόξυση προσροφητικού υλικού στην περιοχή της κηλίδας Εκχύλιση με κατάλληλο διαλύτη Μέτρηση με κατάλληλη αναλυτική τεχνική Φασματοφωτομετρία Φθορισμομετρία Ηλεκτροχημικές τεχνικές

Ποσοτική TLC (2) Μέτρηση επιφάνειας κηλίδας Ανάλογη λογαρίθμου ποσότητας ουσίας Μέτρηση με διαφανές χιλιοστομετρικό χάρτη Μέτρηση διαμέτρου κηλίδας Το τετράγωνο της διαμέτρου ανάλογο λογαρίθμου ποσότητας Άμεσος ποσοτικός προσδιορισμός διαχωρισμένων ουσιών με χρήση πυκνομέτρου

Ποσοτική TLC με Πυκνομετρία Τα πυκνόμετρα σαρώνουν την πλάκα πολλές φορές Επιτρέπουν στατιστική επεξεργασία μετρήσεων Τα χρωματογραφήματα TLC κηλίδων μετατρέπονται σε καταγραφήματα κορυφών ισχύος ανακλώμενης ήδιερχόμενης ακτινοβολίας ως προς χρόνο (απόσταση) σάρωσης Υπολογίζεται το εμβαδό με ολοκλήρωση και χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό Μπορεί να μετρηθεί και ηισχύς φθορισμού

Αρχή Πυκνομετρίας για Ποσοτική TLC

Πυκνόμετρο

Χρωματογράφημα TLC και καταγράφημα πυκνομετρίας για ποσοτική ανάλυση

Υψηλής Απόδοσης TLC High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) Χρησιμοποιούνται ειδικά αυτοματοποιημένα όργανα τοποθέτησης κηλίδων (sample spotters) Υλικά επίστρωσης λεπτόκοκκα με αυξημένη ομοιομορφία Σάρωση με πυκνόμετρο Αυξημένη επαναληψιμότητα και ακρίβεια (1-3%) Χρησιμοποιείται για ταχείς και ακριβείς αναλύσεις πολύπλοκων δειγμάτων

Αυτόματο Σύστημα Τοποθέτησης Κηλίδων για TLC

HPTLC καναβινοειδών στα ούρα

Τεχνικές Ηλεκτροφόρησης (1) Πετυχαίνουν διαχωρισμό ουσιών με βάση το λόγο φορτίο / μάζα χρησιμοποιώντας επίδραση ηλεκτρικού πεδίου Χρησιμοποιούνται ευρύτατα για ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό φορτισμένων κολλοειδών σωματιδίων και μακρομοριακών ιόντων:

Τεχνικές Ηλεκτροφόρησης (2) Πρωτεϊνες Νουκλεϊνικά οξέα Πολυσαγχαρίτες Αντισώματα Ένζυμα Αντιβιοτικά Τοξίνες ιών, κλπ Υπάρχουν διάφορες τεχνικές ηλεκτροφόρησης

Ηλεκτροφόρηση Ζώνης (1) Σπουδαιότερη τεχνική ηλεκτροφόρησης Δείγμα τοποθετείται στη μέση οριζόντιας ταινίας ήπλάκας στερεού φορέα: Χάρτης Οξική κυτταρίνη Υδροπηκτή αμύλου Υδροπηκτή πολυακρυλαμιδίου Αφρός πολυουρεθάνης Στα άκρα του φορέα εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο

Ηλεκτροφόρηση Ζώνης (2) Τα φορτισμένα σωματίδια ήιόντα υπό την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου οδεύουν προς ένα από τα δύο ηλεκτρόδια, ανάλογα με το φορτίο τους Ταχύτητα μετακίνησης εξαρτάται από: Φορτίο Μέγεθος Σχήμα Εκτός από ηλεκτρικές δυνάμεις τη μετακίνηση συστατικών προκαλούν και οι κλασικές χρωματογραφικές δυνάμεις

Ηλεκτροφόρηση Ζώνης (3) Ικανότητα συστατικού προς μετακίνηση εκφράζεται με την κινητικότητα (mobility, μ) Απόσταση (cm) που μπορεί να διανύσει σωματίδιο στη μονάδα του χρόνου, ανά μονάδα ισχύος πεδίου (V/cm) Έχει μονάδες cm 2 V -1 s -1 Ρόλος ρυθμιστικού: Μεταφορά ρεύματος (η συγκέντρωσή του επηρεάζει την κινητικότητα συστατικών) Διατήρηση ph ώστε σωματίδια να έχουν σταθερό φορτίο

Ηλεκτροφόρηση Ζώνης (4) Μετά διαχωρισμό ηπλάκα φορέα ξηραίνεται Οι διαχωρισμένες ζώνες ήγραμμές συστατικών εμφανίζονται με: Χρωστικές προσρόφησης Χημικές αντιδράσεις Έκθεση στο UV

Ηλεκτροφόρηση Ζώνης (5) Το λαμβανόμενο μοντέλο ηλεκτροφόρησης (pattern) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ταυτοποίηση συστατικών Ποσοτικός προσδιορισμός συστατικών με: Αποκοπή έγχρωμων ζωνών, Εκχύλιση, Φωτομέτρηση Σάρωση με πυκνόμετρο. Τα ολοκληρωμένα εμβαδά σχετίζονται με συγκεντρώσεις συστατικών

Αρχή Ηλεκτροφόρησης Ζώνης

Οργανολογία Ηλεκτροφόρησης Πηκτής

Συσκευή Ηλεκτροφόρησης Πηκτής και Ηλεκτροφόρημα DNA

Ηλεκτροφόρηση Αγαρόζης για Ανάλυση DNA

Ανάλυση DNA με ηλεκτροφόρηση πηκτής

Εμφάνιση ηλεκτροφορήματος με έκθεση σε UV

Ηλεκτροφόρηση Δίσκων (1) Χρησιμοποιείται κατακόρυφη στήλη υδροπηκτής πολυακρυλαμιδίου εμποτισμένη με ρυθμιστικό διάλυμα Τα συστατικά διαχωρίζονται υπό μορφή λεπτών δίσκων υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου και μοριακού αποκλεισμού που προκαλεί ηυδροπηκτή Χρησιμοποιείται σωλήνας σχήματος U

Ηλεκτροφόρηση Δίσκων (2) Στο ένα σκέλος προστίθεται το δείγμα σε επαφή με ρυθμιστικό διάλυμα Μετρείται με ειδικό σύστημα οδείκτης διάθλασης που μεταβάλλεται Τα διάφορα φορτισμένα συστατικά σχηματίζουν κινούμενες μεσεπιφάνειες με το ρυθμιστικό διάλυμα

Αρχή Ηλεκτροφόρηση Δίσκων

Ηλεκτροφόρημα Δίσκων

Αρχή Τριχοειδούς Ηλεκτροφόρησης

Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση Εσωτερική Δομή Τριχοειδούς

Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση

Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση Κίνηση Σωματιδίων