Οδηγός γρήγορης αναφοράς λογισμικού Για χρήση με κιτ τυπολόγησης IMMUCOR MIA FORA NGS HLA Για διαγνωστική χρήση In Vitro Σελίδα 1 από 18
Το παρόν εγχειρίδιο δημιουργήθηκε για χρήση με το Λογισμικό MIA FORA NGS Software 00017 SR-790- Για ερωτήσεις, σχόλια και αιτήματα για επιπλέον αντίγραφα, επικοινωνήστε στην παρακάτω διεύθυνση. Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322 Germany (Γερμανία) Τηλέφωνο: (+49) 6074-84 20-0 Τεχνικό σέρβις στην Ευρώπη: +32/3 385 47 91 Η ονομασία IMMUCOR είναι εμπορικό σήμα της Immucor, Inc. Η ονομασία MIA FORA είναι εμπορικό σήμα της Sirona Genomics, Inc. Η ονομασία illumina είναι εμπορικό σήμα της Illumina, Inc. Η ονομασία MiSeq είναι εμπορικό σήμα της Illumina, Inc. Σελίδα 2 από 18
Προοριζόμενη χρήση Το κιτ τυπολόγησης MIA FORATM NGS HLA προορίζεται για ενίσχυση και προσδιορισμό αλληλουχίας των HLA γονιδίων HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 και -DPB1 στην πλατφόρμα προσδιορισμού αλληλουχίας Illumina NGS. Το λογισμικό MIA FORA προορίζεται για χρήση ως οδηγός για τον καθορισμό τύπου HLA από τα δεδομένα που παράγονται με το κιτ βιβλιοθήκης MIA FORA NGS HLA. Η δοκιμή προορίζεται για χρήση σε εργαστήριο εξειδικευμένο στον χειρισμό DNA για ενίσχυση και προσδιορισμό αλληλουχίας. Πληροφορίες για αυτόν τον οδηγό Αυτός ο οδηγός παρέχει βασικές οδηγίες για τη χρήση του λογισμικού MIA FORA NGS SR-790-00017 σε συνδυασμό με τα ακόλουθα κιτ: Κιτ τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA χρήση IVD μόνο στην Ευρωπαϊκή Ένωση) SR-800-10377 (σήμανση CE για Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο χρήστη για το λογισμικό MIA FORA NGS. Ο παρών οδηγός δεν προορίζεται για αντικατάσταση του εγχειριδίου χρήσης. Σχετική τεκμηρίωση Τα παρακάτω έγγραφα περιέχουν πρόσθετες πληροφορίες που σχετίζονται με ή αναφέρονται σε αυτόν τον οδηγό. Εγχειρίδιο χρήσης λογισμικού MIA FORA NGS (LC1619) Ένθετο προϊόντος κιτ τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA (LC1618CE) Περιορισμοί Για περιορισμούς, ανατρέξτε στη σχετική τεκμηρίωση. Σελίδα 3 από 18
Δημιουργία έργου και ανάλυση δείγματος: 1. Δημιουργήστε ένα Αρχείο γραμμικών κωδικών δειγμάτων (ένα αρχείο CSV με παράθυρα διαχωρισμένα με κόμμα) με ονόματα δειγμάτων και αντιστοιχίσεις γραμμικών κωδικών. Συμπεριλάβετε Όνομα έργου και θέσεις φρεατίων. Αυτό θα χρησιμοποιηθεί για ανάλυση αλληλουχίας. a. Ανοίξτε το λογισμικό MIA FORA και περιηγηθείτε στην καρτέλα Projects (Έργα). Κάντε κλικ στο κουμπί New Project (Νέο έργο) στην κάτω δεξιά γωνία της κύριας σελίδας. b. Καταχωρήστε το επιθυμητό Όνομα έργου, τον αριθμό παρτίδας κιτ MIA FORA NGS, την ημερομηνία λήψης και το όνομα Χειριστή. Κάντε κλικ στο κουμπί Browse (Περιήγηση) για να φορτώσετε το Αρχείο γραμμικών κωδικών δειγμάτων (CSV). Σημείωση: Το όνομα του έργου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τους 30 χαρακτήρες. Οι παύλες και οι κάτω παύλες είναι αποδεκτές αλλά οι ειδικοί χαρακτήρες δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και θα αφαιρούνται. Σελίδα 4 από 18
c. Κάντε κλικ στο κουμπί Next (Επόμενο) για να περιηγηθείτε στο φύλλο Γραμμικών κωδικών δειγμάτων και κάντε κλικ στην επιλογή YES (Ναι) για να επιβεβαιώσετε ότι τα ονόματα δειγμάτων είναι σωστά. d. Κάντε κλικ στο κουμπί finish (Τέλος) για να δημιουργήσετε Νέο έργο. 2. Δείτε το Παράρτημα Α για εγκατάσταση του MiSeq Run και ονομασία των αρχείων FASTQ χρησιμοποιώντας τον Illumina Experiment Manager. 3. Το νέο έργο είναι έτοιμο για μεταφόρτωση αρχείων FASTQ όταν το πρώτο βέλος γίνει πορτοκαλί. Σελίδα 5 από 18
a. Κάντε κλικ στο κουμπί Green Play (Πράσινο βέλος αναπαραγωγής) κάτω από το κουμπί Next Step (Επόμενο βήμα) για να εκκινήσετε το πρόγραμμα οδήγησης αρχείων FASTQ. b. Περιηγηθείτε για την μεταφόρτωση των αρχείων FASTQ. Κρατήστε παρατεταμένα το πλήκτρο CTRL πριν επιλέξετε και τα δύο αρχεία. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα ονόματα των αρχείων FASTQ πρέπει να ξεκινούν με το όνομα του έργου ώστε το λογισμικό να αναγνωρίζει τα αρχεία. c. Κάντε κλικ στο κουμπί Finish (Τέλος) για να ξεκινήσει η μεταφόρτωση των αρχείων FASTQ. Σελίδα 6 από 18
4. Κάντε κλικ στο Project name (Όνομα αρχείου) για να επιλέξετε το έργο για ανάλυση και επανεξέταση των δεδομένων Σημείωση: Στην κορυφή της λίστας των έργων αναγράφονται τα πιο πρόσφατα έργα. 5. Κάντε κλικ στην καρτέλα Statistics (Στατιστικά) για να εξετάσετε την ποιότητα της εκτέλεσης a. Επενεξετάστε το Piechart (Γράφημα πίτας) i. Οι έγκυρες ενδείξεις θα πρέπει να είναι >85%. Οι μη έγκυρες ενδείξεις θα πρέπει να είναι <10%. b. Επιλέξτε Insert Distribution (Καταχώρηση διανομής) i. Το μέγεθος καταχώρησης θα πρέπει να πέσει περίπου στο 150-400 c. Επανεξετάστε την επιλογή Read Distribution Among Samples/Barcode (Ένδειξη διανομής ανάμεσα στα δείγματα/γραμμικούς κώδικες) d. Επανεξετάστε την επιλογή Nucleotide Distribution Along Each Position (Διανομή νουκλεοτιδίων σε κάθε θέση) i. Το γράφημα μετά τη θέση 20 θα πρέπει να παρουσιάζει το παρόμοιο % για κάθε βάση e. Επανεξετάστε την επιλογή Quality Score Distribution Along Each Position (Διανομή σκορ ποιότητας σε κάθε θέση) Σελίδα 7 από 18
6. Κάντε κλικ στην καρτέλα Review (Επανεξέταση) για επανεξέταση των δεδομένων ΕΙΚ 1. Παράθυρο επανεξέτασης. (A) Αναπτυσσόμενο μενού δειγμάτων και θέσεων (B) Επιλεγμένη γενότυποι για δείγμα (C) Πίνακες προτάσεων SNP (μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός) και LD (D) Πίνακας υπολογιστικών υποψήφιων αλληλόμορφων (E) Χάρτες κάλυψης και προγράμματα περιήγησης στοίχισης (F) Πρόγραμμα περιήγησης στοίχισης για de novo contigs Σελίδα 8 από 18
a. Ελέγξτε όλα τα δεδομένα χρησιμοποιώντας το Smart Flagging System για να αναζητήσετε ανωμαλίες, ανεπαρκή δεδομένα και ερωτηματικά. b. Περιηγηθείτε στα αναπτυσσόμενα μενού Sample (δείγμα) και Locus (Θέση) για επανεξέταση των δεδομένων (ΕΙΚ. 1 (A)) c. Επανεξετάστε τα αλληλόμορφα στον πίνακα Candidate (Υποψήφιος) (ΕΙΚ. 1 (D)), i. Υπολογίστε τη στήλη ελάχιστης κάλυψης cdna (πέμπτη στήλη) και τη στήλη ελάχιστης κάλυψης κεντρικής ένδειξης cdna (έκτη στήλη). d. Για κάθε ομόζυγη κατάσταση (μόνο ένα αλληλόμορφο αναγράφεται ανά θέση), επανεξετάστε τις πληροφορίες LD suggestion, τη γκρι σκιά στον χάρτη κάλυψης και την καρτέλα Candidate Pairs (Υποψήφια ζεύγη) για στοιχεία για αλληλόμορφα που λείπουν (ΕΙΚ. 1 (C)). Σελίδα 9 από 18
e. Για να δείτε την καρτέλα Coverage Plots (Χάρτες κάλυψης) επισημάνετε τα υποψήφια αλληλόμορφα στον πίνακα υποψηφίων και επιλέξτε Coverage (Κάλυψη) (ΕΙΚ.1 (E)). f. Το αριστερό παράθυρο εμφανίζει τις ακολουθίες αναφορών Coverage along the cdna (Κάλυψη στο cdna), ενώ στο δεξιό παράθυρο εμφανίζονται οι ακολουθίες αναφορών Coverage along the Genomic (Κάλυψη στα Γενομικά). Οι κόκκινες ράβδοι (σύμβολα hash) επάνω από τις καμπύλες κάλυψης υποδεικνύουν τις θέσεις που είναι διαφορετικές ανάμεσα στα επιλεγμένα αλληλόμορφα αναφοράς. Η γκριζαρισμένη περιοχή επισημαίνει τη διαφορά ανάμεσα στη συνολική κάλυψη για το υπογραμμισμένο γονίδιο και τη μερική κάλυψη των επιλεγμένων αλληλόμορφων. g. Για να επιβεβαιώσετε/επανεξετάσετε την αυτόματη κλήση αντιστοίχισης, επιλέξτε το καλούμενο αλληλόμορφο και ένα αλληλόμορφο της επιλογής σας. Κάντε κλικ στο κουμπί Consensus Alignment (Συναινετική αντιστοίχιση) και συγκρίνετε με το καλύτερο αντιστοιχισμένο Contig. h. Περιηγηθείτε ανάμεσα στις διάφορες δυνατότητες αντιστοίχισης για να συγκρίνετε αλληλόμορφα και επιβεβαιώστε ή αλλάξτε την αυτόματη κλήση αντιστοίχισης. Σελίδα 10 από 18
i. Χρησιμοποιήστε τα εργαλεία SNP και LD Suggestion για να μπορέσετε να πραγματοποιήσετε τις καλύτερες δυνατές κλήσεις. i. Στον πίνακα SNP αναγράφονται πολυμορφικές θέσεις από de-novo assembled contigs και φάσεις μπλοκ και η συχνότητα νουκλεοτιδίων σε κάθε πολυμορφική θέση. Αν η σχέση των συχνοτήτων νουκλεοτιδίων στο Contig1 vs Contig2 είναι διαφορετική από τη μέση σχέση στα αντίστοιχα κύτταρα θα επισημανθεί με πορτοκαλί χρώμα. Σελίδα 11 από 18
ii. Στον πίνακα LD Suggestion αναγράφονται καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων Διαταραχής ισορροπίας σύνδεσης των γόνων που περιέχει αλληλόμορφα που αναγράφονται στον πίνακα γενότυπων δειγμάτων. Κάθε σειρά αντιπροσωπεύει αλληλόμορφα που έχουν παρατηρηθεί ότι σχετίζονται το ένα με το άλλο. Ο πίνακας LD suggestion προορίζεται μόνο για πληροφόρηση. Το LD δεν χρησιμοποιείται για υπολογισμό των υπολογιστικών γενότυπων δειγμάτων. j. Αν πραγματοποιηθεί αλλαγή σε κάποια από τις κλήσεις, κάντε κλικ στο κουμπί Refresh (Ανανέωση) επάνω από τον πίνακα γενότυπων. Αν όλες οι κλήσεις είναι σωστές, κάντε κλικ στο κουμπί έγκρισης και μεταβείτε στο επόμενο δείγμα. Μόνο οι επιμελητές με ιδιότητα τεχνικού ή υπευθύνου εργαστηρίου μπορούν να παρακάμψουν την υπολογιστική κλήση. k. Μετά την έγκριση του δείγματος, μόνο ένας χρήστης με ρόλο υπευθύνου μπορεί να αλλάξει το αποτέλεσμα κάνοντας κλικ στο κουμπί ReAnalysis (Επανάληψη ανάλυσης). Σελίδα 12 από 18
7. Κάντε κλικ στην καρτέλα Summary (Περίληψη) για να επανεξετάσετε τον γενότυπο όλων των δειγμάτων πριν δημιουργήσετε την Αναφορά Σελίδα 13 από 18
8. Κάντε κλικ στο κουμπί Report (Αναφορά) και επιλέξτε μορφοποίηση εξόδου (PDF, PDF χωρίς σχόλιο, XML) Σελίδα 14 από 18
ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α Σημείωση: Για τη δημιουργία φύλλου δειγμάτων απαιτείται η εκτέλεση του MiSeq 1. Κάντε λήψη του Illumina Experiment Manager χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο σύνδεσμο. https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloa ds.html 2. Ανοίξτε το λογισμικό και κάντε κλικ στο κουμπί Create Sample Sheet (Δημιουργία φύλλου δειγμάτων) Σελίδα 15 από 18
3. Επιλέξτε MiSeq Instrument και κάντε κλικ στο κουμπί Next (Επόμενο). 4. Κάτω από το μενού Select Category (Επιλογή κατηγορίας) επιλέξτε Other (Άλλο) και κάτω από το μενού Select Application (Επιλογή εφαρμογής) επιλέξτε FASTQ Only και επιλέξτε Next (Επόμενο) Σελίδα 16 από 18
5. Συμπληρώστε τις παραμέτρους ροής εργασιών και επιλέξτε Next (Επόμενο) a. Πεδίο γραμμικών κωδικών φύσιγγας αντιδραστηρίων: Καταχωρήστε τον αριθμό του γραμμικού κώδικα φύσιγγας αντιδραστηρίου MiSeq. Ο αριθμός αντιδραστηρίου βρίσκεται επάνω στην ετικέτα της φύσιγγας. b. Κιτ προετοιμασίας δειγμάτων: Επιλέξτε TruSeq HT c. Ευρετήριο ενδείξεων: επιλέξτε 0 d. Όνομα πειράματος: Πρέπει να ξεκινήσετε με το Όνομα έργου που μόλις δημιουργήθηκε στο λογισμικό MIA FORA (δηλ.: Training_06Jan16_QUAIL) Σημείωση: Αντιγράψτε το Όνομα πειράματος και επικολλήστε το στο πεδίο Αναγνωριστικό δείγματος στο Βήμα 6. e. Όνομα ερευνητή: Το όνομα του ατόμου που εκτελεί το πείραμα f. Περιγραφή: Κάθε πρόσθετη πληροφορία g. Ημερομηνία: Ημερομηνία εκτέλεσης h. Τύπος ένδειξης: Επιλέξτε τέλος σύζευξης i. 1/2 ένδειξη κύκλων: Και οι δύο θα έπρεπε να είναι 151 j. Συγκεκριμένες ρυθμίσεις-ροή εργασιών μόνο FASTQ: Αποεπιλέξτε όλα τα πλαίσια Σελίδα 17 από 18
6. Στην οθόνη Φύλλο δειγμάτων μόνο 1 σειρά είναι απαραίτητη. Επικολλήστε το Όνομα πειράματος που χρησιμοποιείτε στο Βήμα 5 στο πεδίο "Sample ID" (Αναγνωριστικό δείγματος). Επιλέξτε Finish (Τέλος). Το αρχείο FASTQ θα ονομαστεί σύμφωνα με την καταχώρηση στο πεδίο "Sample ID" (Αναγνωριστικό δείγματος) (δηλ.: Training_06Jan16_QUAIL). 7. Αποθηκεύστε το αρχείο CSV με το Όνομα έργου και αποθηκεύστε σε κατάλληλη τοποθεσία για να χρησιμοποιηθεί στο MiSeq. Σελίδα 18 από 18