Προσδιορισμός του αριθμού σαπωνοποίησης (Α.Σ.) σε λίπος βουτύρου, λίπος κακάο και άλλες λιπαρές ύλες Γενικά. Ο αριθμός σαπωνοποίησης αποτελεί μέτρο των εστεροποιημένων και ελεύθερων λιπαρών οξέων μιας λιπαρής ύλης. Εξαρτάται από τη μοριακή μάζα των λιπαρών οξέων που απαντώνται στη λιπαρή ύλη και από τη σχετική αναλογία τους στη λιπαρή ύλη. Ένα δείγμα λιπαρής ύλης που είναι πλουσιότερο σε μονο- και διγλυκερίδια ή ασαπωνοποίητα συστατικά από δείγμα λιπαρής ύλης που έχει την ίδια σύσταση σε λιπαρά οξέα, εμφανίζει ελαφρώς μειωμένο αριθμό σαπωνοποίησης. Όταν το δείγμα αυτό είναι πλουσιότερο σε ελεύθερα λιπαρά οξέα εμφανίζει έναν ελαφρώς αυξημένο αριθμό σαπωνοποίησης. Με τον προσδιορισμό του αριθμού σαπωνοποίησης είναι εφικτή η εκτίμηση της γνησιότητας μιας λιπαρής ύλης. Αρχή. Καθορισμένη ποσότητα ξηρής λιπαρής ύλης σαπωνοποιείται με περίσσεια αραιού διαλύματος καυστικού καλίου σε υψηλή θερμοκρασία. Από την περίσσεια του αλκάλεως, η οποία προσδιορίζεται οξυμετρικώς, υπολογίζεται η ποσότητα του καυστικού καλίου, σε mg, η οποία καταναλώθηκε για τη μετατροπή σε σάπωνες των εστεροποιημένων και των ελεύθερων λιπαρών οξέων που υπάρχουν σε 1 g δείγματος (αριθμός σαπωνοποίησης). Αντιδραστήρια. Αιθανολικό διάλυμα καυστικού καλίου, 0,5 mol/l, αιθανολικό διάλυμα φαινολοφθαλεϊνης, 1% w/v, διάλυμα θειικού οξέος, 0,25 mol/l. Σκεύη. Υδρόλουτρο, εσμυρισμένη κωνική φιάλη των 250 ml, εσμυρισμένος ψυκτήρας, προχοϊδα των 50 ml. Βοηθητικά μέσα. Πέτρα βρασμού. Μέθοδος. Ποσότητα περίπου 2 g του κατάλληλα προετοιμασμένου δείγματος ζυγίζεται σε εσμυρισμένη κωνική φιάλη (250 ml) με ακρίβεια 1 mg. Στη φιάλη προστίθενται 25 ml αιθανολικού διαλύματος καυστικού καλίου, 0,5 mol/l, μετρημένα με προχοΐδα, και μικρή πέτρα βρασμού. Στη φιάλη προσαρμόζεται κάθετος ψυκτήρας στα τοιχώματα του οποίου κυκλοφορεί ψυχρό νερό, και αυτή θερμαίνεται για μια τουλάχιστον ώρα σε ζέον υδρόλουτρο. Στη διάρκεια αυτής της θέρμανσης, η φιάλη ανακινείται περιοδικώς για να επιταχυνθεί η σαπωνοποίηση του λίπους. Στο θερμό μίγμα ογκομετρείται στη συνέχεια η περίσσεια του αλκάλεως παρουσία φαινολοφθαλεΐνης με ένα διάλυμα θειικού οξέος, 0,25 mol/l. Με ανάλογο τρόπο εκτελείται και λευκός προσδιορισμός (χωρίς χρήση δείγματος). Υπολογισμός. Ο αριθμός σαπωνοποίησης, σε mg KOH / g λιπαρής ύλης, ο οποίος δίνεται με ακρίβεια ακέραιας μονάδας, υπολογίζεται από τη σχέση: Α.Σ. = 2 56,1 (β α) C / Β όπου α και β τα καταναλωθέντα ml του διαλύματος θειικού οξέος (κατά τον κυρίως και τον λευκό προσδιορισμό αντιστοίχως), C η συγκέντρωση του θειικού οξέος στο διάλυμα του, σε mol/l, και Β το ακριβές βάρος του δείγματος, σε g. Παρατηρήσεις 1. Για την παρασκευή του αλκοολικού διαλύματος του αλκάλεως, 35 g καυστικού καλίου διαλύονται σε 20 ml αποσταγμένου νερού εντός ογκομετρικής φιάλης των 1000 ml και ο όγκος συμπληρώνεται με χρησιμοποίηση αποσταγμένης αιθανόλης, 95% v/v, ελεύθερης αλδεϋδών.το διάλυμα μετά από παραμονή μιας ημέρας στην πωματισμένη ογκομετρική φιάλη αποχύνεται ταχέως σε έγχρωμη γυάλινη φιάλη που φέρει πλαστικό πώμα, όπου και φυλάσσεται. Η περιεκτικότητά του διαλύματος αυτού σε αιθανόλη πρέπει να ανέρχεται τουλάχιστον σε 90% v/v. 2. Η χρησιμοποίηση καυστικού καλίου αντί καυστικού νατρίου προτιμάται επειδή οι σάπωνες του καλίου είναι πιο ευδιάλυτοι στην αιθανόλη με αποτέλεσμα το περιεχόμενο της φιάλης μετά το πέρας της σαπωνοποίησης να είναι περισσότερο ομοιογενές.
3. Η σαπωνοποίηση θεωρείται ότι έχει ολοκληρωθεί όταν στο περιεχόμενο της φιάλης δεν παρατηρούνται επιπλέοντα σταγονίδια λίπους. Αυτό όμως συμβαίνει μόνο όταν το δείγμα δεν είναι πλούσιο σε ασαπωνοποίητα συστατικά, τα οποία είναι αδιάλυτα στην αιθανόλη. 4. Η εξουδετέρωση της περίσσειας του αλκάλεως γίνεται εν θερμώ για να αποφευχθεί η μερική καταβύθιση των σαπώνων η οποία ενέχει τον κίνδυνο εγκλεισμού στη μάζα τους μικρής ποσότητας αλκάλεως. Η ποσότητα αυτή είναι ικανή να οδηγήσει σε εσφαλμένο αποτέλεσμα. 5. Το περιεχόμενο της φιάλης στο τέλος της ογκομέτρησης πρέπει να περιέχει αιθανόλη σε συγκέντρωση τουλάχιστον 50% v/v ώστε να είναι αδύνατη μια ενδεχόμενη υδρόλυση των σαπώνων που έχει ως συνέπεια εσφαλμένο αποτέλεσμα. 6. Τα περισσότερα λίπη και έλαια εμφανίζουν Α.Σ. ο οποίος κυμαίνεται από 182 έως 198. Ελαφρώς υψηλότερο Α.Σ. μπορεί να εμφανίζουν τόσο το λίπος κακάο (192-202) όσο και το φοινικέλαιο (190-209). Πολύ υψηλότερο Α.Σ. εμφανίζουν το κοκόλιπος (248-265), το φοινικοπυρηνέλαιο (230-254) και το λίπος βουτύρου (πάνω από 226). 7. Με προσδιορισμό του αριθμού σαπωνοποίησης μπορεί να διαπιστωθεί με βεβαιότητα η προσθήκη κοκολίπους σε λίπος βουτύρου στην περίπτωση που το ποσοστό της είναι πιο υψηλό από 36%. Προσδιορισμός των αριθμών Reichert-Meissl (Α.R-M.) και Polenske (Α.Ρ.) στο λίπος βουτύρου, το λίπος κακάο και άλλες λιπαρές ύλες Γενικά. Ο αριθμός Reichert-Meissl αποτελεί μέτρο της παρουσίας σε μια λιπαρή ύλη του βουτανοϊκού (βουτυρικού) και του εξανοϊκού (καπρονικού ή καπροϊκού) οξέος, ενώ ο αριθμός Polenske μέτρο της παρουσίας του δεκανοϊκού (καπρινικού ή καπρικού) και του οκτανοϊκού (καπρυλικού) οξέος. Κατά τον προσδιορισμό του αριθμού Reichert-Meissl συμπροσδιορίζονται ακόμη οκτανοϊκό (σε ένα σχετικώς σταθερό χαμηλό ποσοστό) και δεκανοϊκό οξύ (σε ένα πολύ χαμηλό ποσοστό), ενώ κατά τον προσδιορισμό του αριθμού Polenske συμπροσδιορίζονται δωδεκανοϊκό (σε ένα σχετικώς σταθερό χαμηλό ποσοστό) και δεκατετρανοϊκό οξύ (σε ένα πολύ χαμηλό ποσοστό). Με προσδιορισμό των αριθμών Reichert-Meissl και Polenske μπορεί να διαπιστωθεί κυρίως η γνησιότητα ενός δείγματος λίπους βουτύρου, κοκολίπους ή φοινικοπυρηνελαίου. Αρχή. Καθορισμένη ποσότητα μιας λιπαρής ύλης σαπωνοποιείται παρουσία γλυκερόλης σε πολύ υψηλή θερμοκρασία. Οι σάπωνες οι οποίοι σχηματίζονται διαλύονται σε θερμό νερό και διασπώνται παρουσία αραιού οξέος προς ελεύθερα λιπαρά οξέα. Τα πτητικά με υδρατμούς λιπαρά οξέα, τα οποία παραλαμβάνονται μετά από απόσταξη, διαχωρίζονται σε υδατοδιαλυτά και σε αδιάλυτα στο νερό μετά από τη διήθηση του αποστάγματος. Τα υδατοδιαλυτά προσδιορίζονται αλκαλιμετρικώς στο διήθημα προκειμένου να υπολογισθεί ο αριθμος Reichert-Meissl (ml διαλύματος αλκάλεως, 0,1 mol/l, που απαιτούνται για την εξουδετέρωση των υδατοδιαλυτών πτητικών με υδρατμούς λιπαρών οξέων τα οποία απαντούν εστεροποιημένα ή ελεύθερα σε 5 g λίπους ή ελαίου). Αντιθέτως, τα αδιάλυτα στο νερό προσδιορίζονται αλκαλιμετρικώς, μετά από διαλυτοποίηση σε αιθανόλη, για να υπολογισθεί ο αριθμος Polenske (ml διαλύματος αλκάλεως, 0,1 mol/l, που απαιτούνται για την εξουδετέρωση των αδιάλυτων στο νερό πτητικών με υδρατμούς λιπαρών οξέων που απαντούν εστεροποιημένα ή ελεύθερα σε 5 g λίπους ή ελαίου). Αντιδραστήρια. Γλυκερόλη, πυκνό διάλυμα καυστικού νατρίου, 50% w/w (ελεύθερο ανθρακικών αλάτων), διάλυμα θειικού οξέος, 2,5% v/v, αιθανόλη εμπορίου, 95% v/v (εξουδετερωμένη), αιθανολικό διάλυμα φαινολοφθαλεΐνης, 0,5% w/v, διάλυμα καυστικού νατρίου, 0,1 mol/l. Βοηθητικά μέσα. Πέτρα βρασμού, διηθητικό χαρτί. 2
Σκεύη. Ειδική συσκευή Reichert-Meissl (αποτελείται από εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη με επίπεδο πυθμένα των 310 ± 10 ml, επίθεμα και ψυκτήρα με κατάλληλες διαστάσεις, και ογκομετρική φιάλη η οποία φέρει χαραγή στα 100 και στα 110 ml), ογκομετρικοί κύλινδροι των 25 ml και 100 ml, σιφώνιο αρίθμησης των 5 ml, σιφώνιο πλήρωσης των 50 ml, θερμόμετρο, ύαλος ωρολογίου, γυάλινο χωνί με διάμετρο 8 cm, κωνικές φιάλες των 250 ml, προχοϊδα των 50 ml. Μέθοδος Α. Σαπωνοποίηση. Περίπου 5 g του κατάλληλα προετοιμασμένου δείγματος ζυγίζονται σε εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη (250 ml) με ακρίβεια mg. Στη φιάλη προστίθενται 20 g γλυκερόλης και 2 ml διαλύματος καυστικού νατρίου, 50% w/w, και το μίγμα θερμαίνεται υπό συνεχή ανακίνηση με τη βοήθεια της γυμνής φλόγας ενός λύχνου Bunsen μέχρις ότου διαυγάσει και αφού προηγουμένως παύσει να αφρίζει. Η θέρμανση συνεχίζεται με συνεχή ανακίνηση της φιάλης και μετά τη διαύγαση του περιεχομένου της για πέντε επιπλέον λεπτά της ώρας. Μετά από τη συμπλήρωση του απαιτούμενου χρόνου θέρμανσης, το στόμιο της φιάλης καλύπτεται με ύαλο ωρολογίου προκειμένου να αποτραπεί ενδεχόμενη δέσμευση διοξειδίου του άνθρακα από το θερμό περιεχόμενό της, που αφήνεται να ψυχθεί για μερικά λεπτά σε θερμοκρασία 80 έως 90 ο C. Β. Διάσπαση σαπώνων. Στη φιάλη προστίθεται ακολούθως 90 ml αποσταγμένου νερού με ανάλογη θερμοκρασία, που πρέπει να έχει βράσει τουλάχιστον για δεκαπέντε λεπτά της ώρας ώστε να μην περιέχει διαλυμένο διοξείδιο του άνθρακα. Τελικώς το θερμό αυτό σαπωνοδιάλυμα οξινίζεται με προσθήκη 50 ml διαλύματος θειικού οξέος, 2,5% v/v, με αποτέλεσμα να διασπώνται οι σάπωνες και να ελευθερώνονται τα λιπαρά οξέα. Γ. Απόσταξη των πτητικών με υδρατμούς λιπαρών οξέων. Η φιάλη, αφού προστεθεί πέτρα βρασμού, τοποθετείται πάνω σε πλέγμα αμιάντου, που φέρει άνοιγμα διαμέτρου 6,5 cm, και συνδέεται μέσω ενός ειδικού επιθέματος με κατάλληλο ψυκτήρα, το κάτω άκρο του οποίου καταλήγει εντός του χείλους μιας ογκομετρικής φιάλης που έχει χαραγή στα 100 και στα 110 ml. Αμέσως η φιάλη θερμαίνεται με γυμνή φλόγα λύχνου Bunsen, στην αρχή με ήπιο τρόπο μέχρις ότου τακούν τα επιπλέοντα αδιάλυτα λιπαρά οξέα, και στη συνέχεια εντονότερα έτσι ώστε σε χρονικό διάστημα από δεκαεννέα μέχρι εικοσιένα λεπτά της ώρας να παραληφθούν 110 ml αποστάγματος. Το νερό της ψύξης πρέπει να έχει κατά την έξοδο από τον ψυκτήρα μια θερμοκρασία η οποία να κυμαίνεται από 18 έως 21 ο C. Η ογκομετρική φιάλη απομακρύνεται από το κάτω άκρο του ψυκτήρα μετά από την παραλαβή των 110 ml αποστάγματος και στη θέση της τοποθετείται ένας ογκομετρικός κύλινδρος των 25 ml με ταυτόχρονη διακοπή της θέρμανσης. Δ. Προσδιορισμός των υδατοδιαλυτών πτητικών με υδρατμούς λιπαρών οξέων. Το απόσταγμα ψύχεται αμέσως σε θερμοκρασία 15 ο C με παραμονή της ογκομετρικής φιάλης σε ψυχρό νερό για δέκα τουλάχιστον λεπτά της ώρας. Η φιάλη αναστρέφεται προσεκτικά πέντε έως έξι φορές και το περιεχόμενό της διηθείται από ένα ξηρό πτυχωτό ηθμό (π.χ. Whatmann No 4 ή No 1) διαμέτρου 8 cm. Ο ηθμός, που πρέπε να έχει διαβραχεί πριν από τη διήθηση με μικρή ποσότητα αποσταγμένου νερού ή αποστάγματος (5 ml), φυλάσσεται ώστε να χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια στο στάδιο του προσδιορισμού των πτητικών με υδρατμούς αδιάλυτων στο νερό λιπαρών οξέων. 100 ml από το διήθημα, μετρημένα με σιφώνιο πληρώσεως των 50 ml, μεταφέρονται σε κωνική φιάλη όπου ογκομετρούνται παρουσία φαινολοφθαλεΐνης με διάλυμα καυστικού νατρίου, 0,1 mol/l. Ε. Προσδιορισμός των αδιάλυτων στο νερό πτητικών με υδρατμούς λιπαρών οξέων. Τα εσωτερικά τοιχώματα της ογκομετρικής φιάλης και του ψυκτήρα πλένονται τρεις φορές με 15 ml αποσταγμένου νερού κάθε φορά, το οποίο μεταφέρεται πρώτα στον ογκομετρικό κύλινδρο των 25 ml (τοποθετήθηκε στη θέση της ογκομετρικής φιάλης μετά την παραλαβή των 110 ml αποστάγματος). Τα υγρά από κάθε έκπλυση διηθούνται από τον ηθμό (βλέπε Δ) και το διήθημα απορρίπτεται. Στη συνέχεια εφαρμόζεται ανάλογη 3
διαδικασία πλύσεων με χρησιμοποίηση ουδέτερης αιθανόλης, 95% v/v (3 15 ml), όπου διαλύονται μόνο τα αδιάλυτα στο νερό πτητικά με υδρατμούς λιπαρά οξέα. Τα ενωμένα διηθήματα (περίπου 45 ml), που έχουν συλλεγεί μετά από τις τρεις διαδοχικές εκπλύσεις με την αιθανόλη, ογκομετρούνται παρουσία φαινολοφθαλεΐνης με διάλυμα καυστικού νατρίου, 0,1 mol/l. Υπολογισμός. Ο αριθμός Reichert-Meissl υπολογίζεται από τον αυξημένο κατά 10% όγκο του διαλύματος αλκάλεως που απαιτήθηκε για να εξουδετερωθούν τα υδατοδιαλυτά πτητικά με υδρατμούς λιπαρά οξέα σε 100 ml από το διηθημένο απόσταγμα. Ο αριθμός Polenske υπολογίζεται από τον όγκο του προτύπου διαλύματος καυστικού νατρίου που απαιτήθηκε για να εξουδετερωθούν τα πτητικά με υδρατμούς αδιάλυτα στο νερό λιπαρά οξέα στα περίπου 45 ml των ενωμένων διηθημάτων που προέκυψαν από τις διαδοχικές εκπλύσεις με την αιθανόλη. Οι τιμές δίνονται με ακρίβεια ενός δεκαδικού ψηφίου. Για να είναι ακριβείς οι υπολογισθείσες τιμές των αριθμών Reichert-Meissl και Polenske πρέπει να ληφθεί υποχρεωτικά υπόψη τόσο το ακριβές βάρος του αναλυτικού δείγματος, όσο και ο ακριβής τίτλος του διαλύματος του αλκάλεως. Παρατηρήσεις 1. Η γλυκερόλη χρησιμοποιείται ως κοινός διαλύτης του πυκνού διαλύματος αλκάλεως και του λίπους, και ως μέσο επιτάχυνσης της σαπωνοποίησης λόγω του υψηλού σημείου ζέσεως. 2. Η παρουσία διοξειδίου του άνθρακα και ανθρακικών αλάτων είναι ανεπιθύμητη επειδή κατά την οξίνιση για τη διάσπαση των σαπώνων σχηματίζεται ανθρακικό οξύ που ως υδατοδιαλυτό πτητικό με υδρατμούς οξύ θα οδηγήσει σε εσφαλμένη τιμή του αριθμού Reichert-Meissl. 3. Στη διάρκεια της σαπωνοποίησης πρέπει να μην προκαλείται υπερθέρμανση. Αν το μίγμα της αντίδρασης καταστεί καστανόχρουν, η σαπωνοποίηση πρέπει να επαναληφθεί σε νέο δείγμα. Αν πάλι το μίγμα της αντίδρασης δεν διαυγάζει, αυτό υποδηλώνει ότι το δείγμα είναι πλούσιο σε ασαπωνοποίητα συστατικά. 4. Για να εξακριβωθεί μια τεχνητή αύξηση του αριθμού Reichert-Meissl με προσθήκη βουτυρικού οξέος ή βουτυρικού εστέρα, εφαρμόζεται η μέθοδος χωρίς να εκτελεσθεί το στάδιο της σαπωνοποίησης (το αραιό διάλυμα του θειικού οξέος δεν προκαλεί υδρόλυση των ακυλογλυκερολών). 5. Για να εξακριβωθεί μια τεχνητή αύξηση του αριθμού Reichert-Meissl με προσθήκη τριβουτυρίνης γίνεται υγροχρωματογραφική ανάλυση των τριγλυκεριδίων του δείγματος ή αεριοχρωματογραφική ανάλυση των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων του δείγματος για την εξακρίβωση της σύστασής του σε βουτυρικό οξύ. Το λίπος βουτύρου δεν περιέχει τριβουτυρίνη, ενώ το βουτυρικό οξύ αποτελεί έως 4% του συνόλου των λιπαρών οξέων. 6. Τα περισσότερα λίπη και έλαια έχουν χαμηλό αριθμό Reichert-Meissl, που κυμαίνεται από 0,1 έως 2,5, και χαμηλό αριθμό Polenske, που κυμαίνεται από 0,1 έως 0,9. Εξαίρεση αποτελούν το κοκόλιπος (A.R-M. 6,0-8,5, A.P. 13-18), το φοινικοπυρηνέλαιο (A.R-M. 4-7, A.P. 8-12) και το λίπος βουτύρου (A.R-M. πάνω από 24, A.P. 3-10). 7. Με προσδιορισμό του αριθμού Reichert-Meissl μπορεί να διαπιστωθεί με βεβαιότητα η προσθήκη κοκολίπους σε λίπος βουτύρου στην περίπτωση που το ποσοστό της είναι πιο υψηλό από 29%. Ανίχνευση κοκολίπους σε λίπος βουτύρου και φοινικελαίου σε λίπος κακάο μετά από μετεστεροποίηση των τριακυλογλυκερολών και αεριοχρωματογραφική ανάλυση των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων Γενικά. Οι λιπαρές υλές διαφέρουν ως προς τη σύσταση σε λιπαρά οξέα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να είναι δυνατή η εξακρίβωση της παρουσίας σε μια συγκεκριμένη λιπαρή 4
ύλη μιας άλλης λιπαρής ύλης με αεριοχρωματογραφικό διαχωρισμό των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων του δείγματος της λιπαρής ύλης που εξετάζεται. Το λίπος βουτύρου αποτελεί τη μοναδική εδώδιμη λιπαρή ύλη που περιέχει βουτανοϊκό οξύ, ενώ περιέχει και άλλα χαμηλού μοριακού βάρους λιπαρά οξέα, όπως εξανοϊκό, οκτανοϊκό, δεκανοϊκό και δωδεκανοϊκό οξύ που απαντώνται και στο κοκόλιπος. Το λίπος βουτύρου είναι σε σχέση με το κοκόλιπος ελαφρώς πλουσιότερο σε εξανοϊκό οξύ, αρκετά πτωχότερο σε οκτανοϊκό και δεκανοϊκό οξύ, και πολύ πτωχότερο σε δωδεκανοϊκό οξύ (2,5 έως 4% έναντι 43 έως 51%). Με βάση την αναλογία του δωδεκανοϊκού οξέος στο σύνολο των λιπαρών οξέων του λίπους που περιέχει δείγμα προϊόντος, το οποίο σύμφωνα με τη νομοθεσία πρέπει να περιέχει μόνο λίπος βουτύρου, μπορεί να διαπιστωθεί η προσθήκη κοκολίπους, ακόμη και όταν αυτό αποτελεί το 5% του ολικού λίπους. Το λίπος κακάο και το φοινικέλαιο που περιέχουν λιπαρά οξέα με περισσότερα από 12 άτομα άνθρακα διαφέρουν κυρίως ως προς την περιεκτικότητα σε παλμιτικό και στεατικό οξύ. Η αναλογία του παλμιτικού προς το στεατικό οξύ κυμαίνεται από 7-13 στο φοινικέλαιο και από 0,6-1,0 στο λίπος κακάο με συνέπεια στο λίπος που έχει παραληφθεί από δείγμα σοκολάτας τύπου κουβερτούρα που πρέπει να περιέχει, σύμφωνα με τη νομοθεσία για τα τρόφιμα, μόνο λίπος κακάο να είναι δυνατή η διαπίστωση της παρουσίας φοινικελαίου ακόμη και όταν αυτό αποτελεί μόλις το 10% του ολικού λίπους. Ο υπολογισμός της περιεκτικότητας ενός δείγματος τροφίμου, όπως η σοκολάτα γάλακτος, σε λίπος γάλακτος, γίνεται με βάση την περιεκτικότητα του λίπους που έχει παραληφθεί από αυτό σε βουτανοϊκό οξύ. Αρχή. Αρχικώς παρασκευάζονται μεθυλεστέρες των λιπαρών οξέων της λιπαρής ύλης με αλκαλική μεθανόλυση των ακυλογλυκερολών σε θερμοκρασία περιβάλλοντος παρουσία μη πολικού διαλύτη. Στο μίγμα της αντίδρασης, μετά από την παρέλευση του αναγκαίου χρόνου, προστίθεται κρυσταλλικό όξινο θειικό νάτριο για να αποτραπεί η σαπωνοποίηση των μεθυλεστέρων. Ακολουθεί φυγοκέντρηση και παραλαβή από την υπερκείμενη φάση του αναγκαίου όγκου για τον αεριοχρωματογραφικό διαχωρισμό των μεθυλεστέρων και τον υπολογισμό της εκατοστιαίας αναλογίας του καθένα από αυτούς στο μίγμα τους για τη διαπίστωση της παρουσίας κοκολίπους ή λίπους βουτύρου στο δείγμα που εξετάζεται. Αντιδραστήρια. Μεθανολικό διάλυμα καυστικού καλίου 2 mol/l (παρασκευάζεται με τη χρήση μεθανόλης που δεν πρέπει να περιέχει νερό σε συγκέντρωση υψηλότερη από 0,5%, w/w), κ-εξάνιο ή κ-επτάνιο, αναλυτικώς καθαρό, μονοένυδρο όξινο θειικό νάτριο, μίγμα προτύπων μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων με 4 έως 20 άτομα άνθρακα. Σκεύη. Εσμυρισμένος δοκιμαστικός σωλήνας των 10 ml με πλαστικό πώμα και σιφώνια αρίθμησης των 10 ml και του 1 ml. Συσκευές. Κυκλομίκτης (vortex apparatus) Όργανα. Αεριοχρωματογράφος εφοδιασμένος με διάταξη έγχυσης δείγματος τύπου splitsplitless και ανιχνευτή ιονισμού φλόγας, στο φούρνο του οποίου τοποθετείται τριχοειδής στήλη τύπου WCOT, κατασκευασμένη από fused silica, η οποία έχει μήκος 25 ή 30 m και εσωτερική διάμετρο 0,25 ή 0,32 mm, και φέρει στα τοιχώματά της μη πολική ή πολική στατική φάση με τη μορφή υμενίου πάχους στιβάδας 0,20 ή 0,25 μm, συνδεδεμένος με καταγραφέα (ολοκληρωτή ή προσωπικό υπολογιστή) που διαθέτει κατάλληλο λογισμικό για την αποτίμηση των αεριοχρωματογραφημάτων. Μέθοδος. 0,5 g δείγματος λιπαρής ύλης ζυγίζονται σε εσμυρισμένο δοκιμαστικό σωλήνα, όπου προστίθενται διαδοχικώς 5 ml κ-εξανίου (ή κ-επτανίου) και 0,5 ml μεθανολικού διαλύματος καυστικού καλίου (C=2 mol/l). Ο σωλήνας πωματίζεται και το περιεχόμενό του αναμιγνύεται για ένα λεπτό σε κυκλομίκτη. Στον εσμυρισμένο σωλήνα προστίθενται, μετά από παρέλευση πέντε λεπτών, 0,5 g στερεού όξινου θειικού νατρίου. Ακολουθεί μια εκ νέου ανάμιξη του περιεχομένου του για ένα λεπτό σε κυκλομίκτη. Τελικώς ο σωλήνας φυγοκεντρείται για τρία λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και από την υπερκείμενη διαυγή στιβάδα του περιεχομένου του λαμβάνεται, με τη βοήθεια κατάλληλης σύριγγας, 5
όγκος ίσος με 1 μl, που εισάγεται διαμέσου της διάταξης έγχυσης τύπου split-splitless με την τεχνική της μερικής έγχυσης (split injection) και λόγο μερικής εισαγωγής (split ratio) ίσο με 30:1. Προηγουμένως θα πρέπει να έχει τεθεί σε λειτουργία ο αεριοχρωματογράφος και να έχουν γίνει όλες οι αναγκαίες ρυθμίσεις που αφορούν κυρίως στη θερμοκρασία της διάταξης έγχυσης (230 ο C) και του ανιχνευτή (230 ο C), και στη ροή του αερίου (ήλιο) που χρησιμοποιείται ως κινητή φάση (1 ml/min) και του βοηθητικού αερίου (άζωτο) το οποίο συμβάλλει στην καλύτερη απόδοση του ανιχνευτή (20 ml/min). Για να επιτευχθεί ένας καλός διαχωρισμός των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων εφαρμόζεται ένα πρόγραμμα αύξησης της θερμοκρασίας στο φούρνο του αεριοχρωματογράφου όπου έχει τοποθετηθεί η τριχοειδής στήλη. Αυτό έχει ως εξής: Αρχική θερμοκρασία 40 ο C (παραμονή για 3 λεπτά) Σταδιακή αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 20 ο C/min στους 200 ο C (παραμονή για 11 λεπτά) Σταδιακή αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 15 ο C/min στους 230 ο C (παραμονή για 3 λεπτά) Για να γίνει η αντιστοίχιση των κορυφών του αεριοχρωματογραφήματος στους επιμέρους μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων είναι αναγκαίο να προηγηθεί ανάλογος διαχωρισμός ενός μίγματος προτύπων μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων. Υπολογισμός. Η εκατοστιαία αναλογία του μεθυλεστέρα ενός λιπαρού οξέος στο μίγμα των μεθυλεστέρων όλων των λιπαρών οξέων που απαντούν στο δείγμα υπολογίζεται από το εκατονταπλάσιο του λόγου του εμβαδού της κορυφής του στο αεριοχρωματογράφημα προς το άθροισμα των εμβαδών όλων των κορυφών του αεριοχρωματογραφήματος που αντιστοιχούν σε μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων. Το αποτέλεσμα δίνεται με ακρίβεια ενός δεκαδικού ψηφίου. Παρατηρήσεις 1. Αν δεν είναι δυνατή η αεριοχρωματογραφική ανάλυση των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων αμέσως μετά την παρασκευή τους, αυτοί πρέπει να μεταφερθούν σε ψυγείο (4 o C). 2. Σε μια στήλη που φέρει πολική στατική φάση διαχωρίζονται καλύτερα οι μεθυλεστέρες των ακόρεστων λιπαρών οξέων με ίδιο αριθμό ατόμων άνθρακα (π.χ. ελαϊκός, λινελαϊκός και λινολενικός μεθυλεστέρας) απ ότι σε μια στήλη που φέρει μη πολική στατική φάση. 3. Σε μια στήλη που φέρει πολική στατική φάση είναι δυνατό να διαχωρισθούν ακόμη και οι μεθυλεστέρες των γεωμετρικών ισομερών ή των ισομερών θέσης ακόρεστων λιπαρών οξέων, όπως του μεθυλεστέρα του ελαϊδικού από το μεθυλεστέρα του ελαϊκού οξέος, του μεθυλεστέρα του βαξενικού από το μεθυλεστέρα του ελαϊδικού οξέος ή του μεθυλεστέρα του πετροσελινικού από το μεθυλεστέρα του ελαϊκού οξέος. 4. Σε μια στήλη με πολική στατική φάση, ο μεθυλεστέρας του στεατικού οξέος εκλούεται πριν το μεθυλεστέρα του ελαϊκού οξέος, ενώ στη συνέχεια εκλούεται ο μεθυλεστέρας του λινελαϊκού οξέος και μετά από αυτόν ο μεθυλεστέρας του λινολενικού οξέος. 5. Σε μια στήλη που φέρει μη πολική στατική φάση, ο μεθυλεστέρας του στεατικού οξέος εκλούεται μετά από τους μεθυλεστέρες του ελαϊκού, του λινελαϊκού και του λινολενικού οξέος. 6. Το λίπος βουτύρου διαφοροποιείται από τις υπόλοιπες εδώδιμες λιπαρές ύλες ως προς τη σύσταση σε λιπαρά οξέα καθώς περιέχει διακλαδισμένης αλυσίδας κορεσμένα λιπαρά οξέα (με άρτιο ή περιττό αριθμό C-ατόμων και 1-4 μεθύλια στο μόριό τους), κορεσμένα και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα με περιττό αριθμό C-ατόμων, ασυνήθιστα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα με άρτιο αριθμό C-ατόμων, ισομερή θέσης μονοακόρεστων λιπαρών οξέων, κυρίως του ελαϊκού, ελαϊδικό οξύ (trans-ισομερές του ελαϊκού οξέος) και ισομερή θέσης του ελαϊδικού οξέος. Τα οξέα αυτά απαντώνται απαντώνται σε χαμηλή έως πολύ χαμηλή 6
αναλογία στο σύνολο των λιπαρών οξέων. Εξαίρεση αποτελούν το ελαϊδικό οξύ, μερικά ισομερή θέσης του οξέος αυτού, και τα οξέα 10:1, 15:0, 17:0 και 17:1. 7. Η σύσταση σε λιπαρά οξέα του λίπους βουτύρου, του λίπους κακάο, του κοκολίπους και του φοινικελαίου δίνεται στον παρακάτω πίνακα: Οξύ Λίπος βουτύρου Λίπος κακάο Κοκόλιπος Φοινικέλαιο 4:0 2,5-4,0 - - 6:0 1,5-2,5-0,4-0,6-8:0 1,0-1,5-5-10-10:0 2,5-3,5-4,5-8,0-10:1 0,5 - - - 12:0 2,5-4,0-43-51 < 0,4 14:0 7-13 0,1-0,2 16-21 0,5-2,0 14:1 0,7 - - - 15:0 1,0-1,5 - - - 16:0 20-35 23-31 7,5-10 41-47 16:1 1,5-2,5 0,1-0,4 - < 0,6 17:0 0,5-0,9 0,1-0,2 - - 17:1 0,3-0,4 - - - 18:0 10-15 31-37 2-4 3,5-6,0 cis-18:1* 23-30 30-37 5-10 36-44 trans-18:1* 2-6 - - - 18:2 2,0-2,5 1-4 1,0-2,5 6,5-12 18:3 0,4-1,0 0,3-0,5 - < 0,3 19:1 0,2 - - - 20:0 0,5-1,0 0,7-1,0 0,5-1,5 < 1,0 20:1 0,5 - - - 22:0 ίχνη 0,1-0,2 - - * Περιλαμβάνονται και τα ισομερή θέσης των οξέων αυτών 7