Προϊόντα Elucigene QST*R Οδηγός λογισμικού ανάλυσης

Προϊόντα Elucigene QST*R Οδηγός λογισμικού ανάλυσης Κατασκευάζεται από την: Gen-Probe Life Sciences Ltd. Oaks Business Park Crewe Road Wythenshawe Manchester M23 9HZ, Ηνωμένο Βασίλειο Για πωλήσεις, εξυπηρέτηση πελατών και τεχνική υποστήριξη: Τηλ.: +49 (0) 6122 7076451 Φαξ: +49 (0) 6122 7076155 E: eucustomerservice@hologic.com E: eutechnicalsupport@hologic.com AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 1 από 31

Ανάλυση GeneMapper Εισαγωγή Η παρακάτω ενότητα περιγράφει τις διαδικασίες ανάλυσης δειγμάτων των αποτελεσμάτων Elucigene QST*R, με χρήση των πακέτων λογισμικού GeneMapper της Applied Biosystems (έκδοση 3.7 ή μεταγενέστερη) και τον τρόπο τοποθέτησης των δεδομένων στο πρότυπο αναφορών Excel QST*R. Διαδικασία ανάλυσης Η διαδικασία ανάλυσης δειγμάτων συνοψίζεται στο διάγραμμα ροής που εμφανίζεται παρακάτω: AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 2 από 31

GeneMapper Ανοίξτε το αρχείο του προγράμματος GeneMapper και εισάγετε τα απαιτούμενα αρχεία.fsa κάνοντας κλικ στο κουμπί «add samples to project» (προσθήκη δειγμάτων στο σχέδιο). Μεταβείτε στον επιθυμητό φάκελο εκτέλεσης ανάλυσης χρησιμοποιώντας το δέντρο φακέλων που βρίσκεται στην αριστερή πλευρά του παραθύρου. Επιλέξτε τον φάκελο και κάντε κλικ στο κουμπί «Add to List >>» (Προσθήκη στη λίστα). Ο φάκελος εκτέλεσης ανάλυσης θα εμφανίζεται πλέον στο παράθυρο «samples to add» (δείγματα για προσθήκη). Εάν κάνετε διπλό κλικ στο εικονίδιο φακέλου εκτέλεσης ανάλυσης σε αυτό το παράθυρο θα εμφανιστούν όλα τα αρχεία.fsa που θα εισαχθούν (Εικόνα 1). Στη συνέχεια, τα δείγματα προστίθενται, εάν κάνετε κλικ στο κουμπί «Add» (Προσθήκη). Εικόνα 1: Τα δείγματα είναι έτοιμα να προστεθούν στο σχέδιο AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 3 από 31

Εισαγωγή ρυθμίσεων ανάλυσης του QST*R GeneMapper στο πρόγραμμα GeneMapper Manager Είναι απαραίτητη η εισαγωγή των ρυθμίσεων QST*R για την εφαρμογή GeneMapper. Αυτή η διαδικασία ελέγχεται διαμέσου την επιφάνειας εργασίας του προγράμματος «GeneMapper Manager». Οι ρυθμίσεις για την εφαρμογή QST*R GeneMapper διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: www.gen-probe.com/global/products-services/ 1. Ανοίξτε το πρόγραμμα GeneMapper Manager κάνοντας κλικ στο εικονίδιο (Εικόνες 2 και 3). Εικόνα 2: Άνοιγμα προγράμματος GeneMapper Manager Εικόνα 3: Επιφάνεια εργασίας της εφαρμογής GeneMapper Manager AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 4 από 31

2. Επιλέξτε την καρτέλα «Analysis Methods» (Μέθοδοι ανάλυσης) και κατόπιν κάντε κλικ στο κουμπί «Import» (εισαγωγής). 3. Μεταβείτε και εισάγετε το αρχείο (ή τα αρχεία) των απαιτούμενων ρυθμίσεων ανάλυσης QST*R: 3130 ή 3500 (Εικόνα 4). Εικόνα 4: Εισαγωγή μεθόδων ανάλυσης 4. Επαναλάβετε τη διαδικασία, επιλέγοντας την κατάλληλη καρτέλα και εισάγοντας το αντίστοιχο αρχείο για: Table Settings (Ρυθμίσεις πινάκων) Plot Settings (Ρυθμίσεις γραφημάτων) Size Standards (Πρότυπα μεγέθους) Σημείωση: Οι καρτέλες Cluster Plot Settings (Ρυθμίσεις γραφημάτων σε ομάδες), Matrices (Πλέγματα), SNP Sets (Σετ SNP) και Report Settings (Ρυθμίσεις αναφορών) δεν απαιτούν εισαγωγές αρχείων. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 5 από 31

Εισαγωγή ρυθμίσεων ομάδας QST*R στο πρόγραμμα Panel Manager (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων) Είναι απαραίτητη η εισαγωγή των ρυθμίσεων ομάδας και «bin» QST*R για την εφαρμογή GeneMapper. Αυτή η διαδικασία ελέγχεται διαμέσου την επιφάνειας εργασίας του προγράμματος «Panel Manager» (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων). Οι ρυθμίσεις ομάδας και «bin» για την εφαρμογής QST*R GeneMapper διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: www.gen-probe.com/global/products-services/ 1. Ανοίξτε το πρόγραμμα Panel Manager (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων) κάνοντας κλικ στο εικονίδιο. 2. Κάντε κλικ στην επιλογή «Panel Manager» (Πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων) στο αριστερό παράθυρο περιήγησης. Το πρόγραμμα διαχείρισης ομάδων (Panel Manager) θα εμφανίζεται πλέον επισημασμένο με μπλε χρώμα. 3. Επιλέξτε «File/Import Panels» (Αρχειοθέτηση/εισαγωγή ομάδων). Περιηγηθείτε και εισαγάγετε το αρχείο ομάδας της εφαρμογής GeneMapper «anan000 gmbf*.txt» (Εικόνα 5). 4. Το αρχείο ομάδας θα εμφανίζεται πλέον στο αριστερό παράθυρο περιήγησης. Κάντε κλικ στο αρχείο ομάδας, επιβεβαιώνοντας ότι έχει επισημανθεί με μπλε χρώμα. 5. Επιλέξτε «File/Import Bin Set» (Αρχειοθέτηση/εισαγωγή σετ «bin»). Περιηγηθείτε και εισαγάγετε το αρχείο «bin» της εφαρμογής GeneMapper «anan000 gmbf*.txt» (Εικόνα 6). 6. Κάντε κλικ στην επιλογή «Apply» (Εφαρμογή) και στη συνέχεια κάντε κλικ στην επιλογή «OK». Εικόνα 5: Εισαγωγή αρχείου ομάδας QST*R AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 6 από 31

Εικόνα 6: Εισαγωγή αρχείου σετ «bin» QST*R Τροποποίηση του αρχείου παραμέτρων ανάλυσης Ίσως να χρειαστεί να τροποποιήσετε τα προεπιλεγμένα «Analysis Ranges» (Εύρη ανάλυσης) στις ρυθμίσεις αναλύσεις QST*R για να υπολογιστεί η τοπική μεταβλητότητα των συνθηκών εκτέλεσης ανάλυσης. Το ελάχιστο εύρος ανάλυσης θα εξαρτηθεί από το τριχοειδές και το πολυμερές που χρησιμοποιήθηκε κατά τη συλλογή δεδομένων. Για να δείτε τις τρέχουσες ρυθμίσεις ανάλυσης: 1. Ανοίξτε το πρόγραμμα «GeneMapper Manager». 2. Επιλέξτε την καρτέλα «Analysis Methods» (Μέθοδοι ανάλυσης). Το αρχείο QST*R που έχει εισαχθεί θα παρατίθεται στον κατάλογο ως «QSTR Analysis» (Ανάλυση QSTR). 3. Κάντε κλικ στην επιλογή «QSTR Analysis» (Ανάλυση QSTR). Η γραμμή θα εμφανίζεται πλέον επισημασμένη. 4. Κάντε κλικ στο κουμπί «Open» (Άνοιγμα) και επιλέξτε την καρτέλα «Peak Detector» (Ανιχνευτής αιχμής) (Εικόνα 7). Ως προεπιλογή, τα εύρη ανάλυσης έχουν ρυθμιστεί να ξεκινούν από το 2.000 και να σταματούν στο 18.000. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 7 από 31

Εικόνα 7: Εύρη ανάλυσης Για να βρείτε το σωστό εύρος ανάλυσης για το εργαστήριό σας: 1. Από το κύριο παράθυρο του GeneMapper, κάντε διπλό κλικ στον φάκελο εκτέλεσης ανάλυσης που έχει εισαχθεί για να δείτε τη λίστα των αρχείων.fsa που περιέχει. 2. Επιλέξτε ένα αρχείο.fsa. 3. Εάν κάνετε κλικ στην καρτέλα «Raw data» (Μη επεξεργασμένα δεδομένα) θα εμφανιστεί το ηλεκτροφόρημα των μη επεξεργασμένων δεδομένων. 4. Χρησιμοποιώντας την πρώτη αιχμή του προτύπου μεγέθους (π.χ. 75 ζεύγη βάσεων του GS500LIZ) ως οδηγό, επιλέξτε ένα σημείο δεδομένων περίπου 100 σημείων δεδομένων μεγαλύτερο (Εικόνα 8). Αυτό προσδιορίζει το κατώτατο σημείο στο εύρος ανάλυσης. 5. Βεβαιωθείτε ότι το μέγιστο εύρος ανάλυσης εμπεριέχει τη μέγιστη αιχμή του προτύπου μεγέθους (π.χ. 500 ζεύγη βάσεων του GS500LIZ ή 600 ζεύγη βάσεων του GS600LIZv2). 6. Εισάγετε τις νέες τιμές στο αρχείο ανάλυσης QST*R (προσπελάστε την όπως περιγράφεται παραπάνω). AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 8 από 31

Εικόνα 8: Εύρεση ελάχιστου εύρους χρησιμοποιώντας τα μη επεξεργασμένα δεδομένα του δείγματος Ανάλυση εισαγόμενων αρχείων QST*R 1. Στο κύριο παράθυρο του GeneMapper, επιλέξτε «QST*R Table settings» (Ρυθμίσεις πίνακα QST*R) (Εικόνα 9). Εικόνα 9: Αναπτυσσόμενο μενού ρυθμίσεων πίνακα QST*R 2. Στο κύριο παράθυρο του GeneMapper επιλέξτε το πρώτο κελί στη στήλη «Analysis Method» (Μέθοδος ανάλυσης) και επιλέξετε είτε «QSTR Analysis 3130» (Ανάλυση QSTR 3130) είτε «QSTR Analysis 3500» (Ανάλυση QSTR 3500) από το αναπτυσσόμενο μενού. Επαναλάβετε τη διαδικασία για τη στήλη Size Standard (Πρότυπο μεγέθους), επιλέγοντας «QSTRLIZ500» ή «QSTRLIZ600» από το αναπτυσσόμενο μενού. 3. Επιλέξτε ομάδα «QSTR_gm*» και κάντε κλικ στην κατάλληλη υποομάδα (Εικόνα 10). 4. Συμπληρώστε κάθε στήλη επιλέγοντας την επικεφαλίδα της στήλης και πατώντας τα πλήκτρα «Ctrl-D». 5. Κάντε κλικ στο για να ξεκινήσετε την ανάλυση δειγμάτων. Εκχωρήστε όνομα σχεδίου όταν σας ζητηθεί. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 9 από 31

Εικόνα 10: Επιλογή των ρυθμίσεων ομάδας QST*R Έλεγχος δεδομένων QST*R 1. Επιλέξτε το δείγμα που θα αναλυθεί (επισημάνετε τη σειρά δείγματος). 2. Κάντε κλικ στο για να πραγματοποιήσετε «Display Plots» (Εμφάνιση γραφημάτων). 3. Επιλέξτε «QST*R Plot settings» (Ρυθμίσεις γραφήματος QST*R) (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Ρυθμίσεις γραφήματος QST*R, αναπτυσσόμενο μενού. 4. Το παράθυρο του γραφήματος θα εμφανίσει το προφίλ του δείγματος με τα δεδομένα σε μορφή πίνακα (Εικόνα 12). Θα επισημαίνονται δύο αιχμές το μέγιστο για κάθε δείκτη αυτόματα από την εφαρμογή GeneMapper. Εάν υπάρχουν τρία αλληλόμορφα για έναν δείκτη, η τρίτη μη επισημανθείσα αιχμή θα πρέπει να επισημαίνεται μη αυτόματα (βλ.: Μη αυτόματη επεξεργασία προφίλ). Σημείωση: Τα εύρη μεγεθών αλληλόμορφων κάθε δείκτη βασίζονται σε δεδομένα που έχουν παρατηρηθεί παλαιότερα. Τα σπάνια αλληλόμορφα ενδέχεται να εμπίπτουν εκτός του δεδομένου εύρους μεγέθους δεικτών και ενδέχεται να είναι απαραίτητη η προσαρμογή του σετ «bin», αντίστοιχα. 5. Συνιστάται η ενεργοποίηση της επιλογής «Single click editing» (Επεξεργασία με ένα κλικ) στο παράθυρο γραφήματος. Για να το κάνετε αυτό επιλέξτε «Alleles/set click editing» (Αλληλόμορφα/ορισμός κλικ επεξεργασίας) και διασφαλίστε ότι έχει γίνει αυτή η επιλογή. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 10 από 31

Εικόνα 12: Το παράθυρο Sample Plot (Γράφημα δείγματος) που εμφανίζει τα επισημανθέντα δεδομένα ίχνους και ο πίνακας συσχετισμού γονοτύπου AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 11 από 31

Μη αυτόματη επεξεργασία προφίλ ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ! Η εφαρμογή GeneMapper θα εκχωρήσει σημάνσεις έως και 2 αιχμών ανά δείκτη. Ενδέχεται να απαιτείται επίσης μη αυτόματη επεξεργασία των προφίλ, δηλαδή κατά την εκχώρηση σημάνσεων στις 3ες αιχμές (εάν υπάρχουν) ή κατά την αφαίρεση επισημάνσεων από αιχμές που οφείλονται σε υπερπαραγωγή προϊόντων (stutter). Για να προσθέσετε μια σήμανση αιχμής, κάντε αριστερό κλικ στην αιχμή που δεν φέρει σήμανση. Θα έχετε την επιλογή να προσθέσετε το σχόλιο του αλληλόμορφου. Κάντε κλικ στην επιλογή «OK». Η αιχμή θα επισημαίνεται πλέον με το μέγεθός της σε ζεύγη βάσεων και με το εμβαδόν της αιχμής της. Ο πίνακας θα ενσωματώσει αυτόματα την νεοεπισημανθείσα αιχμή. Για να αφαιρέσετε μια σήμανση αιχμής, κάντε αριστερό κλικ στην επισήμανση της αιχμής. Θα έχετε την επιλογή να διαγράψετε το σχόλιο του αλληλόμορφου. Κάντε κλικ στην επιλογή «OK». Η σήμανση της αιχμής θα αφαιρεθεί πλέον. Ο πίνακας θα αφαιρέσει αυτόματα τα δεδομένα της διαγραφείσας αιχμής. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη βαθμολόγηση των δειγμάτων QST*R, ανατρέξτε στα έντυπα Elucigene QST*R: Instructions for Use (Οδηγίες χρήσης) και Guide to Interpretation (Οδηγός ερμηνείας) που διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: www.gen-probe.com/global/products-services/ Αντιγραφή των δεδομένων του πίνακα 1. Επισημάνετε όλες τις σειρές εντός του πίνακα στο κάτω μέρος του παραθύρου του γραφήματος. 2. Αντιγράψτε τις επιλεγμένες σειρές πατώντας τα πλήκτρα «Ctrl+C». Πρότυπο αναφορών QST*R Τα πρότυπα αναφορών QST*R μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό των αναλογιών των αιχμών ενός δείκτη. Το πρότυπο αναφορών για καθένα από το προϊόντα της σειράς QST*R διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: www.gen-probe.com/global/products-services/ 1. Ανοίξτε το κατάλληλο αρχείο προτύπων αναφορών. 2. Στο πρότυπο αναφορών εμφανίζεται μία προειδοποίηση ασφάλειας που υποδεικνύει ότι έχουν απενεργοποιηθεί οι μακροεντολές, κάντε κλικ στο κουμπί Options (επιλογών) όπως υποδεικνύεται στην Εικόνα 13. 3. Θα εμφανιστεί ένα παράθυρο Security Options (Επιλογές ασφάλειας) (Εικόνα 14). Επιλέξτε «Enable this content» (Επιλογή αυτού του περιεχομένου) και κάντε κλικ στην επιλογή «OK». AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 12 από 31

Εικόνα 13: Προειδοποίηση ασφάλειας (απενεργοποιημένες μακροεντολές) Εικόνα 14: Παράθυρο Security Options (Επιλογές ασφάλειας) (για την ενεργοποίηση των μακροεντολών) 4. Επιλέξτε το φύλλο «Import GM» (Εισαγωγή GM) και επιβεβαιώστε ότι έχει επιλεγεί το κελί A1. 5. Επικολλήστε τα δεδομένα του πίνακα που έχουν αντιγραφεί από την εφαρμογή GeneMapper πατώντας τα πλήκτρα «Ctrl+V» και κάνοντας αμέσως κλικ στο κουμπί «Sort» (Ταξινόμηση) (Εικόνα 15). Σημείωση: Όλα τα δεδομένα που έχουν επικολληθεί ΠΡΕΠΕΙ να είναι επιλεγμένα για να εκτελεστεί η λειτουργία «Sort» (Ταξινόμηση). 6. Επιλέξτε την καρτέλα «QSTR-GM» (- θα υποδείξει ποιο λογιστικό φύλλο χρησιμοποιείται τη δεδομένη στιγμή). Η αναφορά των αποτελεσμάτων θα περιλαμβάνει πλέον όλες τις πληροφορίες αιχμών και τις αναλογίες για το δείγμα σας (Εικόνα 16). AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 13 από 31

Εικόνα 15: Παράδειγμα εισαχθέντα πίνακα GeneMapper για QST*Rplusv2 Εικόνα 16: Αναφορά παραδείγματος QST*Rplusv2 AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 14 από 31

Βαθμολόγηση της αναφοράς 1. Η τρισωμία καθορίζεται από οποιαδήποτε από τις: a) Δύο αιχμές ανόμοιου ύψους λόγω του γεγονότος ότι η μία από τις αιχμές αντιπροσωπεύει δύο αλληλόμορφα τα οποία είναι κοινά και για τους δύο γονείς. Σε αυτή την περίπτωση η αναλογία μεταξύ των δύο αιχμών θα ταξινομηθεί ως 2:1 ή 1:2. Όπου η αναλογία A1/A2 θα δώσει αποτέλεσμα στην περιοχή 1,8 έως 2,4, όταν η αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μικρότερου μήκους είναι μεγαλύτερη σε εμβαδόν από την αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μεγαλύτερου μήκους ή όπου η αναλογία A1/A2 θα δώσει ένα αποτέλεσμα στην περιοχή 0,45 έως 0,65, όταν η αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μικρότερου μήκους είναι μικρότερη σε εμβαδόν από την αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μεγαλύτερου μήκους. Και στις δύο περιπτώσεις θα εμφανιστεί η ένδειξη «Ratio» (Αναλογία) στη στήλη «Warning» (Προειδοποίηση). b) Υπάρχουν τρεις αιχμές συγκρίσιμου ύψους. Η αναλογία των δύο αιχμών θα ταξινομηθεί ως 1:1:1 και οι τιμές τους θα εμπίπτουν εντός του φυσιολογικού εύρους 0,8 1,4 (παρόλο που για αλληλόμορφα που διαχωρίζονται κατά περισσότερα από 24 ζεύγη βάσεων, μια αναλογία αλληλόμορφων 1,5 είναι αποδεκτή). Σε αυτή την περίπτωση θα εμφανιστεί η ένδειξη «3 Alleles» (3 αλληλόμορφα) στη στήλη «Warning» (Προειδοποίηση). 2. Για να ερμηνεύσετε ένα αποτέλεσμα ως μη φυσιολογικό (δηλαδή παρουσία τρισωμίας), απαιτούνται τουλάχιστον δύο πληροφοριακοί δείκτες συμβατοί με γονότυπο τριών αλληλόμορφων με όλους τους δείκτες να είναι μη πληροφοριακοί. Δεν συνιστάται η ερμηνεία ενός αποτελέσματος ως μη φυσιολογικό με βάση τις πληροφορίες από έναν μόνο δείκτη. 3. Για να ερμηνεύσετε ένα αποτέλεσμα ως φυσιολογικό, απαιτούνται τουλάχιστον δύο πληροφοριακοί δείκτες συμβατοί με γονότυπο δύο αλληλόμορφων, με όλους τους άλλους δείκτες να είναι μη πληροφοριακοί. Ένα φυσιολογικό αποτέλεσμα υποδεικνύει τη φυσιολογική συμπληρωματικότητα των δύο από τα χρωμοσώματα που εξετάζονται. 4. Οι αναλογίες του εμβαδού αιχμών που εμπίπτουν μεταξύ των ευρών φυσιολογικού και μη φυσιολογικού αποτελέσματος ταξινομούνται ως αμφίβολες. Τα αμφίβολα αποτελέσματα ενδέχεται να μη διαλευκανθούν με χρήση κιτ ενός χρωμοσώματος. 5. Απουσία δεδομένων οποιασδήποτε αιχμής για κάποιον δείκτη, θα εμφανίζεται η ένδειξη «Absent» (Απούσα) στη στήλη προειδοποίησης. Αυτή η προειδοποίηση θα παρατηρείται συνήθως απουσία δεικτών του χρωμοσώματος Y. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 15 από 31

Ανάλυση GeneMarker Εισαγωγή Η παρακάτω ενότητα περιγράφει τις διαδικασίες ανάλυσης δειγμάτων των αποτελεσμάτων Elucigene QST*R, με χρήση των πακέτων λογισμικού SoftGenetics GeneMarker (έκδοση 1.65 και μεταγενέστερη). Οι εικόνες που χρησιμοποιούνται σε αυτή την ενότητα έχουν ληφθεί από την έκδοση 1.85 του λογισμικού GeneMarker. Διαδικασία ανάλυσης Η διαδικασία ανάλυσης δειγμάτων συνοψίζεται στο διάγραμμα ροής που εμφανίζεται παρακάτω: AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 16 από 31

Προσθήκη αρχείων δειγμάτων στο πρόγραμμα GeneMarker Ανοίξτε το αρχείο του προγράμματος GeneMarker και όταν σας ζητηθεί επιλέξτε «Open Data» (Άνοιγμα δεδομένων). Θα εμφανιστεί το πλαίσιο Open Data Files (Άνοιγμα αρχείου δεδομένων). Κάντε κλικ στο κουμπί «Add» (Προσθήκη). Θα εμφανιστεί το πλαίσιο διαλόγου ανοίγματος. Μεταβείτε στον κατάλογο που περιέχει τα αρχεία μη επεξεργασμένων δεδομένων. Επιλέξτε όλα τα αρχεία πατώντας CTRL+A ή χρησιμοποιήστε τα πλήκτρα CTRL ή/και SHIFT για να επιλέξετε μεμονωμένα δείγματα Κάντε κλικ στο κουμπί «Open» (Άνοιγμα) στο πλαίσιο διαλόγου ανοίγματος Τα αρχεία που επιλέγονται θα εμφανιστούν στο πεδίο Data File List (Λίστα αρχείου δεδομένων) (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Δείγματα που έχουν προστεθεί στη λίστα Data File (Αρχείο δεδομένων) Κάντε κλικ στο κουμπί «OK», στο πλαίσιο διαλόγου Open Data Files (Άνοιγμα αρχείων δεδομένων) και τα δείγματα θα αποσταλούν στο GeneMarker. Στη συνέχεια, το λογισμικό θα ανοίξει αυτόματα το παράθυρο Raw Data Analysis (Ανάλυση μη επεξεργασμένων δεδομένων) (Εικόνα 2). AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 17 από 31

Εικόνα 2: Παράθυρο ανάλυσης μη επεξεργασμένων δεδομένων AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 18 από 31

Εισαγωγή ρυθμίσεων ομάδας για την εφαρμογή QST*R GeneMarker Είναι απαραίτητη η εισαγωγή των ρυθμίσεων ομάδας QST*R για την εφαρμογή GeneMarker. Αυτή η διαδικασία ελέγχεται διαμέσου την επιφάνειας εργασίας του προγράμματος «Panel Editor» (Πρόγραμμα επεξεργασίας ομάδων). Οι ρυθμίσεις ομάδας για την εφαρμογής QST*R GeneMarker διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: www.gen-probe.com/global/products-services Ανοίξτε την εφαρμογή «Panel Editor» (Πρόγραμμα επεξεργασίας ομάδας) από το αναπτυσσόμενου μενού «Tools» (Εργαλεία). Εικόνα 3: Επιλογή Panel Editor (Πρόγραμμα επεξεργασίας ομάδας) Επιλέξτε «Import Panels» (Εισαγωγή ομάδων) από το αναπτυσσόμενου μενού «File» (Αρχείο). Εικόνα 4: Εισαγωγή ομάδων Περιηγηθείτε και εισαγάγετε την ομάδα, π.χ. anan0pl_gupf***.xml AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 19 από 31

(Σημείωση: Το * υποδηλώνει τον τριψήφιο αριθμό έκδοσης (π.χ. anan0pl_gupf002.xml) Επαναλάβετε τη διαδικασία, όπως απαιτείται για άλλα σχετικά αρχεία ομάδων. Επεξεργασία δεδομένων Μετά από την αποστολή των αρχείων μη επεξεργασμένων δεδομένων στο GeneMarker, είναι έτοιμα να υποστούν επεξεργασία. Το βήμα επεξεργασίας περιλαμβάνει εφαρμογή του προτύπου προσδιορισμού μεγέθους, φιλτράρισμα των αιχμών λόγω θορύβου και σύγκριση με γνωστή ομάδα αλληλόμορφων, εάν είναι επιθυμητό. Το πρόγραμμα GeneMarker συνδυάζει όλα αυτά τα βήματα με ένα απλό εργαλείο που ονομάζεται «Run Wizard» (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) (Εικόνα 5). Για πρόσβαση στο Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) κάντε απλά κλικ στο εικονίδιο «Run Project» (εκτέλεσης ανάλυσης του σχεδίου) στην κύρια γραμμή εργαλείων. Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) δημιουργία ενός προτύπου εκτέλεσης ανάλυσης Είναι απαραίτητη η δημιουργία ενός προτύπου εκτέλεσης ανάλυσης την πρώτη φορά που θα χρησιμοποιηθεί αυτό το λογισμικό για την ανάλυση δεδομένων QST*R. Αυτό πραγματοποιείται μέσω του Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης). Για πρόσβαση στο Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης), κάντε απλά κλικ στο εικονίδιο «Run Project» (εκτέλεσης ανάλυσης του σχεδίου) στην κύρια γραμμή εργαλείων. Εκχωρήστε ένα Template Name (Όνομα προτύπου), π.χ. QSTR Επιλέξτε Panel (Ομάδα), Size Standard (Πρότυπο μεγέθους), Standard Colour (Χρώμα προτύπου) και Analysis Type (Τύπος ανάλυσης), όπως φαίνεται στην εικόνα 5 παρακάτω Κάντε κλικ στην επιλογή «Save» (Αποθήκευση) για να αποθηκεύσετε το πρότυπο για μελλοντικές αναλύσεις Κάντε κλικ στην επιλογή «Next» (Επόμενο) για να συνεχίσετε AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 20 από 31

Εικόνα 5: Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) παράθυρο Teamplate Selection (επιλογής μήτρας) Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) Data Process (επεξεργασία δεδομένων) Το παράθυρο Data Process (Επεξεργασία δεδομένων) του Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) επιτρέπει στον χρήστη να επιλέξει τις παραμέτρους φιλτραρίσματος αιχμών. Επιλέξτε τις κατάλληλες ρυθμίσεις ανάλυσης στο παράθυρο Data Process (Διαδικασία δεδομένων), όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. Κάντε κλικ στην επιλογή «Next» (Επόμενο) για να συνεχίσετε. Σημείωση: Η ρύθμιση εύρους ανάλυσης εντός του πλαισίου ανάλυσης μη επεξεργασμένων δεδομένων θα διαφέρει, ανάλογα με το πολυμερές που χρησιμοποιείται για τη συλλογή δεδομένων. Ο χειριστής θα πρέπει να επιλέξει μια τιμή αρχικού σημείου δεδομένων, η οποία να περιλαμβάνει την αιχμή προτύπου μεγέθους μήκους 75 ζευγών βάσεων. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 21 από 31

Εικόνα 6: Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) παράθυρο Data Process (επεξεργασίας δεδομένων) Σημείωση: Για δεδομένα του 3500, αυξήστε την τιμή της επιλογής Minimum Intensity (Ελάχιστη ένταση) στο 150. Run Wizaed (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) Additional Settings (Πρόσθετες ρυθμίσεις) Δεν υπάρχουν πρόσθετες ρυθμίσεις που απαιτούνται κατά την πραγματοποίηση ανάλυσης QST*R. Κάντε κλικ στην επιλογή «OK» για να συνεχίσετε. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 22 από 31

Εικόνα 7: Run Wizard (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης) Additional Settings (Πρόσθετες ρυθμίσεις) Πλαίσιο επεξεργασίας δεδομένων Αφού κάνετε κλικ στην επιλογή «OK», στο πλαίσιο Run Wizard Additional Settings (Βοηθητικό πρόγραμμα εκτέλεσης ανάλυσης-πρόσθετες ρυθμίσεις), εμφανίζεται το πλαίσιο Data Processing (Επεξεργασία δεδομένων) (Εικόνα 8). Τα μη επεξεργασμένα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία και μετράται το μέγεθός τους. Κατόπιν εφαρμόζονται οι παράμετροι φιλτραρίσματος και η επιλεγμένη ομάδα QST*R. Κάντε κλικ στην επιλογή «OK» στο πλαίσιο Data Processing (Επεξεργασία δεδομένων) όταν ολοκληρωθεί η ανάλυση. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 23 από 31

Εικόνα 8: Πλαίσιο Data Processing (επεξεργασίας δεδομένων) Παράθυρο κύριας ανάλυσης Το παράθυρο κύριας ανάλυσης (Εικόνα 9) του προγράμματος GeneMarker έχει μία εύχρηστη διάταξη. Αυτή η διάταξη περιλαμβάνει: Τη λίστα αρχείων δειγμάτων εμφανίζεται στην αριστερή πλευρά του παραθύρου. Εικόνα συνθετικής γέλης εμφανίζεται στο επάνω μέρος του παραθύρου. Ηλεκτροφορήματα δεδομένων κάτω από την εικόνα γέλης. Ένας πίνακας αναφορών εμφανίζεται στη δεξιά πλευρά του παραθύρου. Σε αυτό το παράθυρο είναι σημαντικό να ελέγξετε ότι όλες οι αντίστοιχες αιχμές σε κάθε προφίλ έχουν ονομαστεί σωστά. Κάντε διπλό κλικ σε κάθε δείγμα διαδοχικά στο δέντρο αρχείων δειγμάτων στην αριστερή πλευρά της οθόνης. Κάντε δεξί κλικ σε οποιαδήποτε από τις εν λόγω αιχμές και κάντε τις επιλογές στο πλαίσιο διαλόγου, π.χ. επεξεργασία ή διαγραφή αλληλόμορφου, επιβεβαίωση ή αναίρεση επιβεβαίωσης, όπως είναι απαραίτητο. Από το παράθυρο κύριας ανάλυσης, επιλέξτε το αναπτυσσόμενο μενού «Applications» (Εφαρμογές) από το επάνω μέρος της οθόνης. Επιλέξτε «Trisomy Analysis» (Ανάλυση τρισωμίας). Θα ανοίξει στη συνέχεια το πλαίσιο Trisomy Analysis Settings (Ρυθμίσεις ανάλυσης τρισωμίας) (Εικόνα 10). AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 24 από 31

Εικόνα 9: Παράθυρο κύριας ανάλυσης Εικόνα 10: Πλαίσιο Trisomy Analysis Settings (Ρυθμίσεις ανάλυσης τρισωμίας) Σημείωση: Για δεδομένα του 3500, αυξήστε την τιμή της επιλογής Minimum Intensity (Ελάχιστη ένταση) στο 150. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 25 από 31

Trisomy Analysis Settings (Ρυθμίσεις ανάλυσης τρισωμίας) Εντός του πλαισίου Trisomy Analysis settings (Ρυθμίσεις ανάλυσης τρισωμίας) υπάρχουν δύο διαθέσιμες καρτέλες: Καρτέλα Analysis (Ανάλυση) Καρτέλα Statistics Plot (Γράφημα στατιστικών στοιχείων) Καρτέλα Analysis (Ανάλυση) Η καρτέλα Analysis (Ανάλυση) παρέχει επιλογές ρύθμισης του ουδού για την ανάλυση Trisomy (Τρισωμία). Βεβαιωθείτε ότι έχει επιλεγεί το «BPG» στο πλαίσιο ανάλυσης, καθώς και ότι εμφανίζονται οι παρακάτω ρυθμίσεις. Peak Height (Ύψος αιχμής) 50: Το ελάχιστο ύψος των αιχμών που θα προσδιοριστούν είναι 50. (150 εάν χρησιμοποιείτε δεδομένα του αναλυτή 3500.) Height Ratio (Αναλογία ύψους) 30%: Μέγιστο ποσοστό της κύριας αιχμής, στο οποίο θα πρέπει να φθάσει η δεύτερη αιχμή προκειμένου να ταυτοποιηθούν δύο αλληλόμορφα. Quantification by Peak Area (Ποσοτικοποίηση βάσει Εμβαδόν αιχμής). Έχει επιλεγεί Shorter Length/Longer Length (Μικρότερο μήκος/μεγαλύτερο μήκος). Οι ουδοί Trisomy Ratio (Αναλογία τρισωμίας) είναι 0,80 1,40. Είναι αποεπιλεγμένο το Apply Linear Correction (Εφαρμογή γραμμικής διόρθωσης). Κάντε κλικ στην επιλογή «OK». Παράθυρο Trisomy Analysis (Ανάλυση τρισωμίας) Το παράθυρο Trisomy Analysis (Ανάλυση τρισωμίας) (Εικόνα 11) επιτρέπει στον χειριστή να ελέγχει τα δεδομένα του δείγματος QST*R και να εμφανίζει την αναλογία των κορυφών για κάθε δείκτη, καθώς και να αποκτά πρόσβαση στην αναφορά GeneMarker. Υπάρχουν διάφορες οθόνες που υποβοηθούν τον χειριστή στην ανάλυση δεδομένων: Αυτές είναι: Λίστα δειγμάτων Ηλεκτροφόρημα Γράφημα αναλογιών Πίνακας αναφορών AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 26 από 31

Εικόνα 11: Παράθυρο Trisomy Analysis (Ανάλυση τρισωμίας) Για πιο λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τις δυνατότητες Trisomy analysis (Ανάλυση τρισωμίας) και τη χρήση τους, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο GeneMarker. Αναφορά GeneMarker Η εφαρμογή GeneMarker περιλαμβάνει ένα πρότυπο αναφορών που είναι συμβατό με τα κιτ Elucigene QST*R. Για να αποκτήσετε πρόσβαση στην αναφορά, κάντε κλικ στο εικονίδιο «Print» (εκτύπωσης) στη γραμμή εργαλείων που βρίσκεται στον επάνω αριστερό τμήμα του παραθύρου Trisomy Analysis (Ανάλυση τρισωμίας). Με αυτή την ενέργεια, θα ανοίξει στη συνέχεια το παράθυρο Trisomy Print Settings (Ρυθμίσεις εκτύπωσης τρισωμίας) (Εικόνα 12). Παράθυρο Trisomy Print Settings (Ρυθμίσεις εκτύπωσης τρισωμίας) Το παράθυρο Trisomy Print Settings (Ρυθμίσεις εκτύπωσης τρισωμίας) παραθέτει λεπτομερώς τις επιλογές για τη συμπερίληψη και την απεικόνιση των δεδομένων των δειγμάτων στην αναφορά GeneMarker. Κάντε τις επιλογές που εμφανίζονται στην Εικόνα 12. Βεβαιωθείτε ότι η επιλογή «Custom Size Range» (Τυπικό εύρος μεγέθους) έχει τεθεί στο 98 bp (Start [Αρχή]) και 510 bp (End [Τέλος]). AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 27 από 31

Εικόνα 12: Παράθυρο Trisomy Print Settings (Ρυθμίσεις εκτύπωσης τρισωμίας) AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 28 από 31

Προεπισκόπηση της αναφοράς GeneMarker Κάντε κλικ στην επιλογή «Preview» (Προεπισκόπηση) για να δείτε την αναφορά GeneMarker (Εικόνα 13). Από αυτό το παράθυρο, ο χειριστής μπορεί να ελέγξει και να εκτυπώσει τα δεδομένα αιχμών κάθε δείγματος όλων των δεικτών, παρέχοντας μία απλή, μονοσέλιδη ή δισέλιδη αναφορά δείγματος. Εικόνα 13: Αναφορά GeneMarker Η αναφορά GeneMarker περιλαμβάνει τα παρακάτω χαρακτηριστικά: Επικεφαλίδα αναφοράς: Περιέχει πληροφορίες σχετικά με την ανάλυση, το σχέδιο, το δείγμα και τις παραμέτρους. Πλαίσιο υπογραφών: Ημερομηνία και αρχικό διάστημα για ελεγκτές της αναφοράς. Ηλεκτροφόρημα: Όπως και στο παράθυρο ανάλυσης Trisomy (Τρισωμία), εμφανίζονται όλα τα χρώματα των χρωστικών στο ίχνος του δείγματος. Πίνακας αναφορών: Εμφανίζει τις επιλεγμένες τιμές αιχμών και δεικτών για το τρέχον δείγμα. Οι προσδιορισμοί Trisomy (Τρισωμία) επισημαίνονται με γκρι χρώμα. Παρέχεται πρόσθετη στήλη ελέγχου για τα αρχικά του ελεγκτή. Διορθωμένο γράφημα αναλογιών: Περιλαμβάνει τα σημεία των γραφημάτων για ολόκληρο το σετ δεδομένων, για όλους τους δείκτες στο χρώμα της χρωστικής. Τα σχήματα των συμβόλων αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς δείκτες και μπορούν να διακριθούν από τη σειρά «Symbol» (Σύμβολο) στο «Report Table» (Πίνακας αναφοράς). Τα σύμβολα που είναι πληρωμένα με κίτρινο χρώμα AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 29 από 31

αντιπροσωπεύουν τα σημεία δεδομένων του τρέχοντος δείγματος. Τα σύμβολα με κόκκινο περίγραμμα αντιπροσωπεύουν προσδιορισμό τρισωμίας. Σημείωση: Εμφανίζεται στη δεύτερη σελίδα το παράθυρο Corrected Ratio Plot (Διορθωμένο γράφημα αναλογιών) για κάθε δείγμα μόνον όταν είναι επιλεγμένο το Ratio Plot (Γράφημα αναλογιών) στο πλαίσιο Trisomy Print Report Settings (Ρυθμίσεις αναφοράς εκτύπωσης τρισωμίας). Σημάνσεις αιχμών Οι σημάνσεις αιχμών είναι χρωματικά κωδικοποιημένες ανάλογα με την ποιότητα της αντιστοίχισης μεταξύ της ανιχνευμένης αιχμής και των παρατηρούμενων «bin» ομάδων. Στο ηλεκτροφόρημα, οι δείκτες είναι οριζόντιες γκρι γραμμές και το κέντρο των αιχμών επισημαίνεται με μία κάθετη γκρι γραμμή. Οι αιχμές που βρίσκονται εκτός των δεικτών ή των «bin» της ομάδας επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα ως «OL» (off-ladder) (εκτός κλίμακας). Σημείωση: Οι διακυμάνσεις ως προς τον τύπο του πολυμερούς και του προτύπου μεγέθους του μηχανήματος μπορεί να καταστήσει απαραίτητη τη βελτιστοποίηση των «bin» των δεικτών προκειμένου να προσαρμόσετε το λογισμικό στις συνθήκες εκτέλεσης ανάλυσης που χρησιμοποιούνται. Μπορείτε να βρείτε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την τροποποίηση των «bin» των ομάδων στο εγχειρίδιο GeneMarker που παρέχεται μαζί με το λογισμικό. Βαθμολόγηση της αναφοράς Οι γενικές οδηγίες ανάλυσης περιγράφονται λεπτομερώς στην ενότητα «Analysis and Interpretation of Results» (Ανάλυση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων) στο έντυπο Instructions for Use (Οδηγίες χρήσης) που είναι διαθέσιμο από την ιστοσελίδα της Gen- Probe: www.gen-probe.com/global/products-services 1. Η τρισωμία καθορίζεται από οποιαδήποτε από τις: a) Δύο αιχμές ανόμοιου ύψους λόγω του γεγονότος ότι η μία από τις αιχμές αντιπροσωπεύει δύο αλληλόμορφα τα οποία υπάρχουν είτε στον ένα είτε και στους δύο γονείς. Σε αυτή την περίπτωση η αναλογία μεταξύ των δύο αιχμών θα ταξινομηθεί ως 2:1 ή 1:2. Όπου η αναλογία A1/A2 θα δώσει αποτέλεσμα στην περιοχή 1,8 έως 2,4, όταν η αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μικρότερου μήκους είναι μεγαλύτερη σε εμβαδόν από την αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μεγαλύτερου μήκους ή όπου η αναλογία A1/A2 θα δώσει ένα αποτέλεσμα στην περιοχή 0,45 έως 0,65, όταν η αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μικρότερου μήκους είναι μικρότερη σε εμβαδόν από την αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μεγαλύτερου μήκους. b) Υπάρχουν τρεις αιχμές συγκρίσιμου ύψους. Η αναλογία των δύο αιχμών θα ταξινομηθεί ως 1:1:1 και οι τιμές τους θα εμπίπτουν εντός του φυσιολογικού εύρους 0,8 1,4 (παρόλο που για αλληλόμορφα που διαχωρίζονται κατά περισσότερα από 24 ζεύγη βάσεων, μια αναλογία αλληλόμορφων 1,5 είναι αποδεκτή). AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 30 από 31

Σημείωση: Οι δείκτες θα είναι σκιασμένοι με γκρι χρώμα στον πίνακα αναφοράς εάν: Η αναλογία αιχμών για έναν δείκτη βρίσκεται εκτός των προκαθορισμένων ορίων (0,8 και 1,4). Έχουν ανιχνευτεί τρία αλληλόμορφα. 2. Για να ερμηνεύσετε ένα αποτέλεσμα ως μη φυσιολογικό (δηλαδή παρουσία τρισωμίας), απαιτούνται τουλάχιστον δύο πληροφοριακοί δείκτες συμβατοί με γονότυπο τριών αλληλόμορφων με όλους τους δείκτες να είναι μη πληροφοριακοί. Δεν συνιστάται η ερμηνεία ενός αποτελέσματος ως μη φυσιολογικό με βάση τις πληροφορίες από έναν μόνο δείκτη. 3. Για να ερμηνεύσετε ένα αποτέλεσμα ως φυσιολογικό, απαιτούνται τουλάχιστον δύο πληροφοριακοί δείκτες συμβατοί με γονότυπο δύο αλληλόμορφων, με όλους τους άλλους δείκτες να είναι μη πληροφοριακοί. Ένα φυσιολογικό αποτέλεσμα υποδεικνύει τη φυσιολογική συμπληρωματικότητα των δύο από τα χρωμοσώματα που εξετάζονται. 4. Οι αναλογίες του εμβαδού αιχμών που εμπίπτουν μεταξύ των ευρών φυσιολογικού και μη φυσιολογικού αποτελέσματος ταξινομούνται ως αμφίβολες. Τα αμφίβολα αποτελέσματα ενδέχεται να μη διαλευκανθούν με χρήση κιτ ενός χρωμοσώματος. Το ELUCIGENE και QST*R είναι εμπορικά σήματα της Gen-Probe Life Sciences Ltd. Τα GENEMAPPER είναι σήμα κατατεθέν της Life Technologies Corporation. Το GENEMARKER είναι εμπορικό σήμα κατατεθέν της SoftGenetics Corporation. Σημείωση για τον αγοραστή: Περιορισμένη άδεια χρήσης Τα πολυνουκλεοτίδια που επισημαίνονται με χρωστικές VIC, NED και PET ή/και η χρήση τους ενδέχεται να καλύπτονται από μία ή περισσότερες άδειες ευρεσιτεχνίας που ανήκουν στην Applied Biosystems, LLC. Η τιμή αγοράς αυτού του προϊόντος περιλαμβάνει περιορισμένα, μη μεταβιβάσιμα δικαιώματα βάσει ορισμένων αξιώσεων σε συγκεκριμένες άδειες ευρεσιτεχνίας που ανήκουν στην Applied Biosystems, LLC για χρήση μόνον αυτής της ποσότητας του προϊόντος, αποκλειστικά για τις δραστηριότητες του αγοραστή για την ανίχνευση στόχου (ή στόχων), εντός του πεδίου των διαγνωστικών προϊόντων του ανθρώπου. Δεν μεταφέρονται άλλα δικαιώματα. Μπορείτε να λάβετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις άδειες αγοράς που σχετίζονται με τις χρωστικές που αναφέρθηκαν παραπάνω, εάν επικοινωνήσετε με την Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, ΗΠΑ. Πνευματικά δικαιώματα 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd. AN000GSEL Rev.10/2013 Σελίδα 31 από 31