ΑΙΜΟΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΙΑ Η συµβολή της µοριακής ανάλυσης Eλισάβετ Οικονοµάκη Βιολόγος Αιµοπαθολογοανατοµικό Εργαστήριο ΠΓΝΑ << Ευαγγελισµός >>
ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ (Μη µορφολογικές) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (PCR) Αντίστροφης Μεταγραφάσης Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (ReverseTranscriptase PCR) (RT PCR) Ποσοτική PCR Πραγµατικου Χρόνου (Real Time Quantitative PCR) Ανάλυση αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (Sequencing) Mικροδιατοµή ιστού µε ακτίνες Laser (Laser Microdissection)
Πλεονεκτήµατα µοριακών τεχνικών εν εξαρτώνται από αντιγονική έκφραση Πληροφορίες σχετικά µε παθογένεση διάγνωση και πρόγνωση αιµατολογικών νόσων
Μειονεκτήµατα Χρονοβόρο σταντάρισµα Υψηλό κόστος Κατάργηση κυτταρικής µορφολογίας
Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης Polymerase Chain Reaction
Αρχικό δίκλωνο µόριο (DNA template) 100 90 80 70 60 50 RT
Αποδιάταξη 100 90 80 70 60 50 94º C
Επικόλληση Επιµήκυνση 100 90 80 70 60 50 55º C 72º C
ιπλασιασµένο µόριο DNA
Μετα από 40 κυκλους PCR Tο PCR προιόν ανιχνεύεται µε ηλεκτροφόρηση
Είδη PCR Aπλή PCR Φωλιασµένη PCR (Nested PCR) Ηµιφωλιασµένη PCR (Seminested PCR) ReverseTranscriptase PCR Real Time PCR
Target region Initial PCR 3 5 5 3 Target region 5 3 3 5 P4 3 5 5 3 P3 Second PCR amplification
Πλεονεκτήµατα Αύξηση της ευαισθησίας Η περιοχή στόχος είναι σε λίγα αντίγραφα Κατεστραµένο DNA λόγω µονιµοποίησης Μειονεκτήµατα Κίνδυνος επιµόλυνσης!!
Εφαρµογές της PCR σε λεµφοϋπερπλαστικές εξεργασίες Aνίχνευση κλωνικότητας σε Β- ή Τ- κυτταρικής προέλευσης εξεργασίες ιαφορική διάγνωση µεταξύ µονοκλωνικής και πολυκλωνικής λεµφοϋπερπλασίας Ανίχνευση ελαχίστης ή υπολειµµατικής νόσου Ανίχνευση χρωµοσωµικών µεταθέσεων πχ JH/BCL2,JH/BCL1 σε Οζώδες Λέµφωµα και Λέµφωµα Μανδύα Ανίχνευση ιών π.χ. ΕΒV
ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ
Υποδοχέας Β-λεµφοκυττάρων (ανοσοσφαιρίνες) Υποδοχέας Τ-λεµφοκυττάρων Aνίχνευση κλωνικότητας σε Β- ή Τ- κυτταρικής προέλευσης εξεργασίες
BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936: PCR-based clonality studies VH DH JH 6 VH-FR1 primers J H primer Heteroduplex analysis MW Monoclonal Monoclonal Polyclonal HO 2 polyclonal GeneScan analysis CTGTGCAAGAG CGGGCTATGGTTCAGGGAGTTAT GGCTACTACGGTATGGACGTCTGG CTGTGCAAGAG GACGAAACAGTAACT GCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGG CTGTGCAAGAGA GATAGTATAGCAGCTCGT ACAACTGGTTCGACTCCTGG CTGTGCAAGAGA TCCGGGCAGCTCGTTT TGCTTTTGATATCTGG CTGTGCAAGAG CCTCTCTCCACTGGGATGGGGGG CTACTGG CTGTGCAAGAG CAGCAGCTCGGCCCCCTTTGACTACTGG CTGTGCAAGAG GACTTTGGATGCTTTTGATATCTGG CTGTGCAAGAG GGTGGGAGCTACTA GACTACTGG CTGTGCAAG GGTAGCTAAAC CTTTGACTACTGG CTGTGCAA TATCTACTTTGACTACTGG monoclonal Απο Σταµατόπουλος και συν.
Φχ / Hae III CD20 Smear H2O IgH Ανίχνευση κλωνικότητας για IgH µε PCR
ιαφορική διάγνωση µεταξύ µονοκλωνικής και πολυκλωνικής λεµφοϋπερπλασίας MARKER λέµφωµα Γαστρίτιδα? / λέµφωµα? 120 bp 80 bp γαστρίτιδα Η ανίχνευση Β-µονοκλωνικότητας σε µοριακό επίπεδο µε την µέθοδο της PCR µπορεί να ανιχνεύσει πολύ πρώιµα στάδια λεµφώµατος ή πολύ πρώιµες υποτροπές
Aνίχνευση υπολειµµατικής νόσου
Ανίχνευση ελαχίστης νόσου Βιοψία στοµάχου Β-Λέµφωµα από µεγάλα κύτταρα Οστεοµυελική βιοψία σταδιοποίησης Παρουσία µικρών Β-Λεµφοκυττάρων ιήθηση??
Παρακολούθηση ασθενών για έλεγχο πιθανής υποτροπής Περίπτωση δερµατικού Τ-λεµφώµατος Phix/HaeIII Positive Control IGH NC Πρώτη βιοψία Ιδιος ασθενής υποτροπή 70-95 bp άλλος ασθενής 10% Acrylamide Gel (Mc Carthy)
Πλεονεκτήµατα PCR Μεγάλη ευαισθησία (1/100.000) Αυτοµατοποίηση Χρήση υλικού αρχείου
Mειονεκτήµατα Ύπαρξη ψευδώς αρνητικών DΝΑ κακής ποιότητας και ανεπαρκούς ποσότητας Ανεπαρκής κυτταρικός πληθυσµός Κακή πρόσδεση των εκκινητών στην περιοχή στόχο Ύπαρξη ψευδώς θετικών στην PCR Επιµολύνσεις στην PCR Έπιλεκτικός πολλαπλασιασµός ορισµένων γονιδιακών περιοχών.. ( (Eπιβεβαίωση του αποτελεσµατος PCR µε SEQUENCING ) Κατάργηση κυτταρικής µορφολογίας
DNA απο παραφίνη µυελός ΟΒ Ο ΒΛ PHIX Κακη ποιοτητα
Αντίστροφης Μεταγραφάσης Αλυσιδώτη Αντίδραση Πολυµεράσης Reverse Transcriptase Polynucleotide Chain Reaction (RT PCR)
RT PCR Eφαρµογές Ανίχνευση χιµαιρικών µεταγράφων πχ (Bcr/abl) Ανίχνευση ιικού RNA (ρετροιί( ρετροιί,ιικόιικό φορτίο) Ανίχνευση υπολειµµατικής νόσου συνδεόµενης µε χιµαιρικά γονίδια Μελέτη γονιδιακής έκφρασης
RT PCR Πλεονεκτήµατα Μεγάλη ευαισθησία (1/100.000) Αυτοµατοποίηση Ανίχνευση χιµαιρικών γονιδίων Μειονεκτήµατα Κατάργηση κυτταρικής µορφολογίας Χρήση νωπού υλικού RNA κακής ποιότητας από παραφινωµένους ιστούς (200 bp µέγιστη περιοχή που µπορεί να ενισχυθεί ) Eνίσχυση άσχετων τµηµάτων (ψευδώς θετικά) Επιβεβαίωση του αποτελέσµατος µε Sequencing
Ποσοτική PCR Πραγµατικού Χρόνου Real Time Quantitative PCR Ποσοτική µέθοδος Ανιχνεύει αρχικό αριθµό DNA RNA µορίων στο δείγµα