COBAS TaqMan MTB Test

COBAS TaqMan MTB Test ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB 48 Tests P/N: 04803531 190 AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP 100 Tests P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 ΣΗΜΕΙΩΣΗ Η αγορά του παρόντος προϊόντος επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για ενίσχυση και ανίχνευση αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και σχετικές διαδικασίες για in vitro διάγνωση σε δείγματα ανθρώπινης προέλευσης. Διά του παρόντος δεν παρέχεται κανένα δικαίωμα ευρεσιτεχνίας γενικού τύπου ή άλλη άδεια οποιουδήποτε τύπου εκτός από το παρόν ειδικό δικαίωμα χρήσης από την αγορά του προϊόντος. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το COBAS TaqMan MTB Test είναι μια in vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος, για την ποιοτική ανίχνευση DNA των οργανισμών του συμπλόκου Mycobacteria tuberculosis (MTB) σε υγροποιημένα, απολυμασμένα και συμπυκνωμένα ανθρώπινα αναπνευστικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένων πτυέλων και βρογχιοκυψελιδικών εκπλύσεων (BAL). Στην εξέταση χρησιμοποιείται το Κιτ Προετοιμασίας Αναπνευστικών Δειγμάτων AMPLICOR για τη χειροκίνητη προετοιμασία του δείγματος και ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής για την αυτόματη ενίσχυση και ανίχνευση. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Τα στελέχη του γένους Mycobacterium είναι οξεοάντοχα, μη κινητικά, ραβδόμορφα, αερόβια βακτήρια που δεν σχηματίζουν σπόρια. Περιλαμβάνουν αρκετά παθογόνα είδη για τον άνθρωπο. Πολλά είδη μυκοβακτηρίων είναι σαπρόφυτα χώματος και νερού. Τα κύρια παθογόνα για τον άνθρωπο είναι τα είδη του συμπλόκου M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum και M. microti) και M. leprae. Το M. tuberculosis είναι το πιο σημαντικό μυκοβακτηριακό παθογόνο και εντοπίζεται μόνο στον άνθρωπο. Η φυματίωση (TB) είναι μεταδοτική ασθένεια. Όπως το κοινό κρυολόγημα, μεταδίδεται μέσω του αέρα. Η μετάδοση της ασθένειας προκαλείται μόνο από άτομα που πάσχουν από φυματίωση στους πνεύμονες. Τα άτομα αυτά εκκρίνουν μικρόβια φυματίωσης στον αέρα κατά το βήχα, το πτέρνισμα, την ομιλία και την απόπτυση. Για τη μετάδοση της ασθένειας αρκεί η εισπνοή μικρής ποσότητας μικροβίων. Συνολικά, το ένα τρίτο περίπου του παγκόσμιου πληθυσμού φέρει το βάκιλο της φυματίωσης. Από τον πληθυσμό που φέρει βάκιλους φυματίωσης, ένα ποσοστό 5-10% νοσεί ή μεταδίδει την ασθένεια κατά τη διάρκεια της ζωής του. Εκτιμάται ότι το 2004 προκλήθηκαν 1,7 εκατομμύρια θάνατοι λόγω φυματίωσης. Όπως συμβαίνει με τις περισσότερες μεταδοτικές ασθένειες, υπολογίζεται ότι ο μεγαλύτερος αριθμός θανάτων σημειώνεται στην περιοχή της Νότιο-ανατολικής Ασίας. Ωστόσο, η υψηλότερη θνησιμότητα κατά κεφαλή σημειώνεται στην περιοχή της Αφρικής, όπου ο ιός HIV έχει οδηγήσει σε ταχεία αύξηση των περιστατικών φυματίωσης και της πιθανότητας θανάτου λόγω φυματίωσης. Στόχοι του ΠΟΥ, που επικυρώθηκαν κατά την Παγκόσμια Σύνοδο Υγείας το 1991, είναι η ανίχνευση του 70% των νέων περιστατικών μόλυνσης από φυματίωση και η θεραπεία του 85% των περιστατικών που ανιχνεύτηκαν, μέχρι το 2005. Δεκαοκτώ χώρες είχαν ήδη επιτύχει τους στόχους αυτούς το 2002 1-5. Εξαιτίας του κινδύνου εξάπλωσης της ασθένειας, της πιθανότητας ανάπτυξης στελεχών ανθεκτικών στα φάρμακα και της σοβαρότητας της ασθένειας σε ασθενείς μολυσμένους με τον ιό HIV-1, είναι ιδιαίτερα σημαντική η ταχεία διάγνωση του συμπλόκου M. tuberculosis. Για την οριστική διάγνωση της φυματίωσης απαιτείται η απομόνωση ενός οργανισμού από το σύμπλοκο M. tuberculosis. Οι συνηθισμένες καλλιέργειες είναι χρονοβόρες και μπορεί να διαρκέσουν έως και οχτώ εβδομάδες. Η εξέταση με μικροσκόπιο οξεοαντόχων επιχρισμάτων αποτελεί την ταχύτερη μέθοδο ανίχνευσης μυκοβακτηρίων, δεν πρόκειται όμως για μια ευαίσθητη ή ειδική μέθοδο. Οι ανοσολογικές και ορολογικές τεχνικές παρουσιάζουν γενικά περιορισμούς λόγω μικρής ευαισθησίας και/ή ειδικότητας 6,7. Η ανάπτυξη ειδικών για μυκοβακτήρια εξετάσεων βασισμένων στην PCR έχει αποδειχτεί ότι βελτιώνει περαιτέρω την ταχεία διάγνωση της φυματίωσης επιτρέποντας την άμεση ανίχνευση μυκοβακτηρίων σε κλινικά δείγματα 8-14. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το COBAS TaqMan MTB Test βασίζεται σε δύο κύριες διαδικασίες: (1) χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων, για τη λήψη DNA του MTB, (2) ταυτόχρονη ενίσχυση PCR του DNA στόχου με τη χρήση συμπληρωματικών εκκινητών και ανίχνευση του DNA στόχου μέσω της πέψης των ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών που φέρουν διπλή φθορίζουσα επισήμανση 15,16. Με το συνδυασμό των δύο αυτών διαδικασιών είναι δυνατή η ανίχνευση του ενισχυμένου προϊόντος MTB στόχου (amplicon) και του DNA Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου, του οποίου η ενίσχυση και ανίχνευση πραγματοποιούνται ταυτόχρονα με το δείγμα. Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου. 05174953001-08EL 1 Doc Rev. 8.0

Το αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος περιέχει ένα ζεύγος εκκινητών που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση μιας ειδικής για το συγκεκριμένο γένος περιοχής του χρωμοσώματος. Η ειδικότητα για το σύμπλοκο M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum και M. microti) παρέχεται από ένα διπλά επισημασμένο ιχνηθέτη ανίχνευσης στόχου. Τι ίδιο ζεύγος εκκινητών χρησιμοποιείται για την ενίσχυση του DNA Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNΑ εκτελείται με ειδικούς για το στόχο και για το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου διπλά επισημασμένους ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες που επιτρέπουν την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) MTB και του κλώνου (amplicon) του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου. Προετοιμασία Δείγματος Τα απολυμασμένα δείγματα πτύελου και BAL που έχουν υγροποιηθεί με χρήση NALC/NaOH 17 υποβάλλονται σε πλύση με Διάλυμα Πλύσης Αναπνευστικού Δείγματος. Πραγματοποιείται λύση των οργανισμών μέσω επώασης στο Αντιδραστήριο Λύσης Αναπνευστικού Δείγματος και το δείγμα προετοιμάζεται για ενίσχυση με την προσθήκη Αντιδραστηρίου Εξουδετέρωσης Αναπνευστικού Δείγματος. Ενίσχυση PCR Επιλογή Στόχου Το γονιδίωμα του Μυκοβακτηρίου περιλαμβάνει μια συντηρημένη σε υψηλό βαθμό περιοχή, περίπου 1500 νουκλεοτιδίων, η οποία κωδικοποιεί το γονίδιο 16S rrna. Το COBAS TaqMan MTB Test χρησιμοποιεί τους ειδικούς εκκινητές για το γένος του Μυκοβακτηρίου για τον προσδιορισμό μιας αλληλουχίας εντός της συγκεκριμένης περιοχής 18. Ενίσχυση Στόχου Η ενίσχυση PCR πραγματοποιείται σε K-tubes ή K-trays, στα οποία προστίθενται τα προετοιμασμένα δείγματα, στο μίγμα ενίσχυσης. Το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται για την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA και την έκθεση των αλληλουχιών-στόχου του εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στόχους. Η Z05 DNA πολυμεράση, με την παρουσία Mg 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dntp), επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος των προτύπων στόχων, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός δίκλωνου DNA που ονομάζεται κλώνος (amplicon). Ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους προορίζεται για το διπλασιασμό του DNA κλώνου (amplicon). Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στη μεταξύ των εκκινητών περιοχή του γονιδιώματος MTB. Δεν ενισχύεται ολόκληρο το γονιδίωμα MTB. Ενίσχυση Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Στις διαδικασίες ενίσχυσης βάσει ενζύμων, όπως στην PCR, η αποτελεσματικότητα μπορεί να μειωθεί από αναστολείς που ενδέχεται να υπάρχουν στο κλινικό δείγμα. Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου επιτρέπει την ταυτοποίηση προετοιμασμένων δειγμάτων που περιέχουν ουσίες οι οποίες ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν με την ενίσχυση PCR. Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου είναι ένα μη μολυσματικό, ανασυνδυασμένο, γραμμικοποιημένο πλασμίδιο DNA με περιοχές δέσμευσης εκκινητή όμοιες με εκείνες της αλληλουχίας στόχου M. tuberculosis, μια τυχαία εσωτερική αλληλουχία παρόμοιου μεγέθους και σύνθεσης βάσεων με την αλληλουχία στόχο M. tuberculosis και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη, η οποία διαφοροποιεί το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου από τον κλώνο (amplicon) στόχο. Τα χαρακτηριστικά αυτά έχουν επιλεγεί για τη διασφάλιση ισοδύναμης ενίσχυσης του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου και του DNA στόχου του M. tuberculosis. Το Αντιδραστήριο Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου περιλαμβάνεται στο COBAS TaqMan MTB Test και εισάγεται σε κάθε αντίδραση ενίσχυσης, για την πραγματοποίηση ενίσχυσης μαζί με το DNA του MTB από το κλινικό δείγμα. Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου έχει σχεδιαστεί για τη διασφάλιση της ταυτοποίησης δειγμάτων τα οποία περιέχουν αναστολείς που θα αλληλεπιδρούσαν με την ενίσχυση και την ανίχνευση της ακολουθίας στόχου του MTB. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται με το COBAS TaqMan MTB Test με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη Ν γλυκοζυλάση) 19 και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει την αποδόμηση των κλώνων του DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, αλλά όχι του DNA που περιέχει θυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης ως ενός από τα dntps του αντιδραστηρίου Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. Οποιοδήποτε μη ειδικό προϊόν σχηματίζεται μετά την αρχική ενεργοποίηση του Κύριου Μίγματος από μαγνήσιο, καταστρέφεται από το ένζυμο AmpErase. To ένζυμο AmpErase, το οποίο περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος, καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήματα δεσοξυουριδίνης, ανοίγοντας την αλυσίδα της δεσοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης στο αλκαλικό ph του Κύριου Μίγματος, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase είναι αδρανές σε θερμοκρασίες πάνω από τους 55 C, δηλαδή, σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης και για το λόγο αυτόν δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon) στόχο που σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης. 05174953001-08EL 2 Doc Rev. 8.0

Ανίχνευση Προϊόντων PCR σε ένα COBAS TaqMan Test Το COBAS TaqMan MTB Test χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου. Η χρήση ιχνηθετών με διπλή φθορίζουσα επισήμανση επιτρέπει την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο παρακολουθώντας την ένταση εκπομπής των φθοριζουσών χρωστικών του αναφορέα που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης. Οι ιχνηθέτες αποτελούνται από ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για το MTB και το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου, τα οποία επισημαίνονται με χρωστική αναφορέα και παρεμποδιστή. Στο COBAS TaqMan MTB Test, οι ιχνηθέτες MTB και Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου επισημαίνονται με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναφορέα. Όταν οι διπλά επισημασμένοι με φθορίζουσα χρωστική ιχνηθέτες είναι ανέπαφοι, ο φθορισμός αναφορέα καταστέλλεται από την εγγύτητα της χρωστικής παρεμποδιστή, λόγω των φαινομένων μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Κατά τη διάρκεια της PCR, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε μια αλληλουχία στόχο και διασπάται από την 5' προς 3' δράση εξωνουκλεάσης της θερμοσταθερής Z05 DNA πολυμεράσης. Μόλις απελευθερωθούν και αποχωριστούν οι χρωστικές αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher), δεν πραγματοποιείται πλέον παρεμπόδιση και η φθορίζουσα δραστηριότητα της χρωστικής αναφορέα (reporter) αυξάνεται. Η ενίσχυση του DNA του MTB και του DNA του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου μετράται ανεξάρτητα, σε διαφορετικά μήκη κύματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης εκπομπής των μεμονωμένων χρωστικών αναφορέα, επιτρέποντας την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του DNA του MTB και του DNA του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit 100 Εξετάσεις Κιτ Προετοιμασίας Αναπνευστικών Δειγμάτων AMPLICOR RSP PREP (P/N: 20756903 122, ART: 07 5690 3, US: 83267) RW 2 x 25 ml (Διάλυμα Πλύσης Αναπνευστικού Δείγματος) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hcl < 1% Σταθεροποιητής διαλύματος EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου RL 3 x 6 ml (Αντιδραστήριο Λύσης Αναπνευστικού Δείγματος) 0,2% Υδροξείδιο του νατρίου < 1% Σταθεροποιητής διαλύματος EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου RN 2 x 5 ml (Αντιδραστήριο Εξουδετέρωσης Αναπνευστικού Δείγματος) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hcl χλωριούχο μαγνήσιο 0,05% Αζίδιο του νατρίου COBAS TaqMan MTB Test 48 Εξετάσεις (P/N: 04803531 190) CTM MTB Αντιδραστήρια Ελέγχου MYCO IC 4 x 0,1 ml (Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI < 0,001% Μη μολυσματικό DNA πλασμιδίου (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχίες δέσμευσης εκκινητών Μυκοβακτηρίου και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA Χρωστική ύλη αμαράνθης 0,05% Αζίδιο του νατρίου MTB (+) C 1 x 0,75 ml [M. tuberculosis Θετικός Ορός Ελέγχου] Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI < 0,001% Μη μολυσματικό πλασμίδιο DNA (μικροβιακό) που περιέχει αλληλουχίες MTB < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου 05174953001-08EL 3 Doc Rev. 8.0

MYCO ( ) C 1 x 0,75 ml [Αρνητικός Ορός Ελέγχου Μυκοβακτηρίου] Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης MTB MMX (Κύριο Μίγμα COBAS TaqMan MTB) 4 x 12 Εξετάσεις Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine 4 x 0,46 ml Οξικό κάλιο Υδροξείδιο του καλίου Διμεθυλοσουλφοξείδιο Γλυκερόλη < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% εκκινητές MTB < 0,001% Ειδικοί για το MTB και το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου ολιγονουκλεοτιδικοί ιχνηθέτες με φθορίζουσα επισήμανση < 0,001% Ολιγονουκλεοτιδική απταμέρη < 0,05% Z05 DNA Πολυμεράσης (μικροβιακό) < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) 0,09% Αζίδιο του νατρίου MYCO Mg 2+ (Αντιδραστήριο Μαγνησίου Μυκοβακτηρίου) 4 x 12 Εξετάσεις < 1,0% Οξικό μαγνήσιο 4 x 0,2 ml 0,09% Αζίδιο του νατρίου ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση μόνο με πτύελα ή BAL που έχουν υγροποιηθεί, απολυμανθεί και συμπυκνωθεί με τη χρήση μεθόδων NALC-NaOH 17. Γ. Μην εκτελείτε αναρρόφηση με πιπέτα από το στόμα. Δ. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια μιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και κιτ αντιδραστηρίων. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια όταν αφαιρείτε τα κλάσματα δειγμάτων από τις φιάλες αντιδραστηρίων. ΣΤ. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών και ακροφυσίων πιπετών μιας χρήσης. Ζ. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. Η. Μη συνδυάζετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ. Θ. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. Ι. Μη χρησιμοποιείτε κιτ μετά την ημερομηνία λήξης τους. ΙΑ. Διατίθενται Δελτία Δεδομένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. ΙΒ. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να εκτελείται σύμφωνα με τις ασφαλείς εργαστηριακές πρακτικές, όπως αυτές περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 και στο Έγγραφο CLSI M29-A 21. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα οικιακά υγρά λευκαντικά του εμπορίου περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Η αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγει διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. ΙΓ. Τα RW, RL, RN, MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C και MYCO ( ) C περιέχουν οζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Όταν απορρίπτετε διαλύματα που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφύγετε τη συσσώρευση αζιδίου. 05174953001-08EL 4 Doc Rev. 8.0

ΙΔ. Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. ΙΕ. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. ΙΣΤ. Σε περίπτωση που ανοίξει ένα K-tube ή K-tray μετά την ενίσχυση, καθαρίστε με λευκαντικό το K-carrier, τα βυθίσματα και τα υγρά που διέρρευσαν (ιδανική συγκέντρωση 5000 ppm, 0,5%) και αφήστε τα στο λευκαντικό κατά τη διάρκεια της νύχτας, ώστε να καταστραφεί ο κλώνος (amplicon) που έχει διαρρεύσει. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια ή τους ορούς ελέγχου. A. Αποθηκεύετε τα RW, RL και RN στους 2-25 C. Αν δεν ανοιχτούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για 30 ημέρες στους 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. B. Αποθηκεύετε τα MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C και MYCO ( ) C στους 2-8 C. Αν δεν ανοιχτούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Γ. Μεταξύ των αναλύσεων, αποθηκεύετε τα μερικώς χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια MTB (+) C και MYCO ( ) C στους 2-8 C. Ελέγξτε την ημερομηνία λήξης των ανοιχτών ορών ελέγχου πριν από τη χρήση. Τα αντιδραστήρια MTB (+) C και MYCO ( ) C μπορούν να χρησιμοποιηθούν έως και τέσσερις φορές. Μετά το άνοιγμα, χρησιμοποιήστε τα αντιδραστήρια MTB (+) C και MYCO ( ) C εντός 4 εβδομάδων ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Δ. Τα αντιδραστήρια MTB MMX, MYCO Mg 2+ και MYCO IC παρέχονται ως φιαλίδια μίας χρήσης, για σετ 12 αντιδράσεων. Τυχόν μη χρησιμοποιημένο υλικό πρέπει να απορρίπτεται. E. Το Κύριο Μίγμα εργασίας (που έχει προετοιμαστεί με την προσθήκη MYCO Mg 2+ και MYCO IC σε MTB MMX) μπορεί να αποθηκευτεί σε σκοτεινό χώρο, στους 2-8 C, για έως και 2 ώρες. ΣΤ. Τα προετοιμασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να προστίθενται στο Κύριο Μίγμα εργασίας εντός 4 ωρών από την προετοιμασία, εφόσον έχουν αποθηκευτεί σε θερμοκρασία δωματίου, εντός 4 ημερών αν έχουν αποθηκευτεί στους 2-8 C ή εντός 6 μηνών αν έχουν αποθηκευτεί στους -80 C. Ζ. Η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει εντός 90 λεπτών από το χρόνο προσθήκης των επεξεργασμένων δειγμάτων και ορών ελέγχου στο Κύριο Μίγμα Εργασίας. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Αντιδραστήρια Προετοιμασίας Δείγματος A. AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit Κιτ Προετοιμασίας Αναπνευστικών Δειγμάτων AMPLICOR (P/N: 20756903 122, ART: 07 5690 3, US: 83267) RW (Διάλυμα Πλύσης Αναπνευστικού Δείγματος) RL (Αντιδραστήριο Λύσης Αναπνευστικού Δείγματος) RN (Αντιδραστήριο Εξουδετέρωσης Αναπνευστικού Δείγματος) RSP PREP Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης B. COBAS TaqMan MTB Test (P/N: 04803531 190) MYCO IC (Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου) MTB (+) C [M. tuberculosis Θετικός Ορός Ελέγχου] MYCO ( ) C [Αρνητικός Ορός Ελέγχου Μυκοβακτηρίου] MTB MMX (Κύριο Μίγμα COBAS TaqMan MTB) MYCO Mg 2+ (Αντιδραστήριο Μαγνησίου Μυκοβακτηρίου) CTM MTB 05174953001-08EL 5 Doc Rev. 8.0

ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Όργανα και Λογισμικό COBAS TaqMan 48 Αναλυτής AMPLILINK λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 Σταθμός δεδομένων για το AMPLILINK λογισμικό Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο Αρχείο Ορισμού Εξέτασης (TDF). Για το όνομα και την έκδοση του TDF ανατρέξτε στην Καρτέλα Στοιχείων Προϊόντος που παρέχεται μαζί με το κιτ. Πωματιστής K-tube (P/N: 03516539001) Εργαλείο πωματισμού K-tray (P/N: 03339904001) K-carrier COBAS TaqMan 48 Αναλυτή (P/N: 28150397001) K-tray carrier COBAS TaqMan 48 Αναλυτή (P/N: 03341488001) Υλικά μίας χρήσης K-tubes (P/N: 03137082001) K-trays COBAS TaqMan 48 Αναλυτή (P/N: 03343146001) ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Αναδευτήρας τύπου Vortex Βοήθημα Πιπέτας: Drummond (P/N: 4-000-100) ή αντίστοιχο Σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα, αποστειρωμένα, χωρίς σιλικόνη, κωνικά (Sarstedt 72.692.105 ή αντίστοιχα)** Υποδοχείς σωληναρίων (Sarstedt 93.1428 ή αντίστοιχοι) Συσκευές πιπέτας (χωρητικότητας, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl και 1000 µl)* με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης Αποστειρωμένες πιπέτες μεταφοράς με λεπτό ακροφύσιο Μικροφυγόκεντρος (μέγ. RCF 16.000 x g, ελάχ. RCF 12.500 x g), Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M ή αντίστοιχη μονάδα θερμότητας 60 C ± 2 C Θερμόμετρο Απορροφητικό χαρτί Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Θάλαμος βιολογικής ασφάλειας με αρνητική πίεση * Οι πιπέτες πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ελεύθερα από DNase (ή νουκλεάση) ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης, πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου προδιαγράφεται, για να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). ** Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. A. Συλλογή Δειγμάτων Τα μόνα αποδεκτά αναπνευστικά δείγματα είναι τα πτύελα απόχρεμψης και προκλητά πτύελα ή BAL. Τα δείγματα αυτά πρέπει να υγροποιηθούν, να απολυμανθούν και να συμπυκνωθούν με τη χρήση μεθόδων NALC-NaOH 17. B. Μεταφορά Δειγμάτων Τα απολυμασμένα δείγματα πρέπει να μεταφέρονται στο εργαστήριο στους 2-25 C, εντός 24 ωρών από τη συλλογή. Αν τα δείγματα δεν μεταφερθούν εντός 24 ωρών, θα πρέπει να αποθηκευτούν και να μεταφερθούν στους -70 C. Τα δείγματα πρέπει να μεταφέρονται σύμφωνα με όλους τους κρατικούς, ομοσπονδιακούς και τοπικούς κανονισμούς για τη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 22. Γ. Αποθήκευση Δειγμάτων Τα απολυμασμένα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C για έως και 2 εβδομάδες. 05174953001-08EL 6 Doc Rev. 8.0

ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, λεπτομερή περιγραφή των πιθανών διευθετήσεων, εκτύπωση αποτελεσμάτων και ερμηνεία ενδείξεων, σχολίων και μηνυμάτων σφάλματος, ανατρέξτε στο (1) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή για χρήση με Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3, (2) Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, COBAS TaqMan αναλυτή, COBAS TaqMan 48 αναλυτή, COBAS AMPLICOR αναλυτή και cobas p 630 όργανο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν η προετοιμασία του δείγματος, η ενίσχυση και η ανίχνευση εκτελούνται σε μία μόνο ημέρα εργασίας, ακολουθήστε τις διαδικασίες εξέτασης όπως περιγράφονται παρακάτω. Αν η προετοιμασία των δειγμάτων πραγματοποιηθεί σε διαφορετική ημέρα από την ενίσχυση και την ανίχνευση, εκτελέστε την Προετοιμασία Αντιδραστηρίων την ίδια ημέρα με την Ενίσχυση και την Ανίχνευση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια ενίσχυσης και ανίχνευσης πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Απομακρύνετέ τα από το χώρο αποθήκευσης στους 2-8 C τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από τη χρήση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα δείγματα πρέπει να αποψυχθούν (εάν έχουν καταψυχθεί), να περιέλθουν σε θερμοκρασία δωματίου για 15-30 λεπτά και να αναμιχθούν πριν από τη χρήση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όπου προδιαγράφεται, χρησιμοποιείτε συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή μόλυνσης. Αριθμός Aναλύσεων: Κάθε κιτ COBAS TaqMan MTB Test περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για τέσσερις αναλύσεις 12 εξετάσεων, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν ξεχωριστά ή ταυτόχρονα. Σε κάθε K-carrier έως και 22 δειγμάτων πρέπει να συμπεριλαμβάνεται ένα MYCO ( ) C και ένα MTB (+) C (βλ. ενότητα Ποιοτικός Έλεγχος ). Τα Αντιδραστήρια Ενίσχυσης και Ανίχνευσης είναι συσκευασμένα σε φιαλίδια μίας χρήσης για 12 εξετάσεις. Για την αποτελεσματικότερη χρήση των αντιδραστηρίων, τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία σε παρτίδες, ο αριθμός των οποίων πρέπει να είναι πολλαπλάσιο του 12. A. Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου Εκτελείται στην: Περιοχή Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου - πριν από την ενίσχυση 1. Καθορίστε τον αριθμό δειγμάτων για εξέταση και τοποθετήστε αρκετά σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτά πώματα στην περιοχή εργασίας, ώστε να αντιστοιχεί ένα σωληνάριο για κάθε δείγμα και ένα σωληνάριο για κάθε ορό ελέγχου. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. Βλ. Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις. Επικολλήστε μια ετικέτα με τον αναγνωριστικό αριθμό του δείγματος σε κάθε σωληνάριο προετοιμασίας δείγματος. 2. Προσθέστε 500 μl RW σε κάθε σωληνάριο δείγματος. 3. Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων, προσθέστε 100 µl υγροποιημένου, απολυμασμένου και συμπυκνωμένου αναπνευστικού δείγματος στο κατάλληλα επισημασμένο σωληνάριο που περιέχει RW. Χρησιμοποιήστε μια νέα πιπέτα με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων για κάθε δείγμα. Πωματίστε ξανά τα σωληνάρια και στροβιλίστε για 5 δευτερόλεπτα. 4. Φυγοκεντρίστε στα 12.500 x g για 10 λεπτά. 5. Αναρροφήστε το υπερκείμενο υγρό χρησιμοποιώντας μια πιπέτα μεταφοράς με λεπτό ακροφύσιο και προσθέστε 100 µl RL στα κυτταρικά καθιζήματα χρησιμοποιώντας συσκευή πιπέτας με νέο ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων για κάθε δείγμα. Στροβιλίστε για 5 δευτερόλεπτα για να μετατρέψτε το συσσωμάτωμα σε εναιώρημα. 6. Προετοιμάστε τους Ορούς Ελέγχου ως εξής: ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι οροί ελέγχου εργασίας θα πρέπει να προετοιμάζονται φρέσκοι κάθε ημέρα που εκτελείται η εξέταση και θα πρέπει να απορρίπτονται στο τέλος της ημέρας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια MTB (+) C και MYCO ( ) C που παρέχονται στο κιτ COBAS TaqMan MTB Test προορίζονται για χρήση έως και τέσσερις φορές, για την προετοιμασία των Ορών Ελέγχου Εργασίας MTB (+) και MYCO ( ). Μετά το άνοιγμα, χρησιμοποιήστε τα αντιδραστήρια MTB (+) C και MYCO ( ) C εντός 4 εβδομάδων ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. α. Στροβιλίστε το φιαλίδιο του MYCO ( ) C για 5 δευτερόλεπτα. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl MYCO ( ) C σε ένα φιαλίδιο πολυπροπυλενίου 1,5 ml, χρησιμοποιώντας πιπέτα με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων. Προσθέστε 200 µl RL. Στροβιλίστε για 5 δευτερόλεπτα. Αυτός είναι ο ( ) Ορός Ελέγχου Εργασίας Μυκοβακτηρίου. 05174953001-08EL 7 Doc Rev. 8.0

β. Στροβιλίστε το φιαλίδιο MTB (+) C για 5 δευτερόλεπτα. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl MTB (+) C σε ένα φιαλίδιο πολυπροπυλενίου 1,5 ml χρησιμοποιώντας μια πιπέτα με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων. Προσθέστε 200 µl RL. Στροβιλίστε για 5 δευτερόλεπτα. Αυτός είναι ο (+) Ορός Ελέγχου Εργασίας M. tuberculosis. γ. Διοχετεύστε με πιπέτα 100 µl από κάθε Ορό Ελέγχου Εργασίας σε σωληνάριο πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα για να προετοιμαστεί παράλληλα με τα κλινικά δείγματα. 7. Επωάστε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου σε μονάδα ξηρής θερμότητας 60 C ± 2 C για 45 λεπτά. 8. Αφαιρέστε τα σωληνάρια από τη μονάδα θερμότητας και φυγοκεντρίστε παλμικά τα σωληνάρια για 5 δευτερόλεπτα, ώστε να αφαιρεθούν τα συμπυκνώματα από το πώμα. 9. Χρησιμοποιώντας συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων, προσθέστε 100 µl RN σε κάθε σωληνάριο δείγματος και ορού ελέγχου. Στροβιλίστε για 5 δευτερόλεπτα σε μισή ταχύτητα. Χρησιμοποιήστε ένα νέο ακροφύσιο πιπέτας με φραγή αερολυμάτων για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. 10. Μεταφέρετε τα προετοιμασμένα δείγματα (δείγματα ασθενών και ορούς ελέγχου) στην Περιοχή Ενίσχυσης/Ανίχνευσης. B. Προετοιμασία Αντιδραστηρίων και Φόρτωση K-carrier Εκτελείται στην: Περιοχή Προετοιμασίας Αντιδραστηρίων πριν από την Ενίσχυση ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το COBAS TaqMan MTB Κύριο Μίγμα (MTB MMX), «Κύριο Μίγμα Εργασίας» (Working MMX) και το Κύριο Μίγμα Εργασίας μαζί με τα προετοιμασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου είναι ευαίσθητα στο φως. Προστατέψτε τα αντιδραστήρια αυτά από το φως. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το COBAS TaqMan MTB Κύριο Μίγμα (MTB MMX), το COBAS TaqMan Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου (MYCO IC) και το COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Μαγνησίου Μυκοβακτηρίου (MYCO Mg 2+ ) πρέπει να παραμείνουν σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος Εργασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Προετοιμάστε το Κύριο Μίγμα Εργασίας μετά την ολοκλήρωση της χειροκίνητης Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα προετοιμασμένα δείγματα και οροί ελέγχου είναι σταθερά για έως και 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, έως και 4 ημέρες στους 2-8 C ή έως και 6 μήνες στους -80 C πριν από την προσθήκη στο κύριο μίγμα εργασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Κύριο Μίγμα Εργασίας πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C και να χρησιμοποιείται εντός 2 ωρών από την προετοιμασία. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μόλις τα προετοιμασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου προστεθούν στο Κύριο Μίγμα Εργασίας, η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει εντός 90 λεπτών. 1. Αφήστε σε θερμοκρασία δωματίου ένα φιαλίδιο MTB MMX, ένα φιαλίδιο MYCO Mg 2+ και ένα φιαλίδιο MYCO IC για τουλάχιστον 30 λεπτά. 2. Τοποθετήστε ένα Κ-carrier σε ένα συγκρατητή Κ-carrier. 3. Τοποθετήστε νέα K-tubes ή ένα νέο K-tray σε ένα K-carrier, χωρίς να αγγίξετε τα τοιχώματα των K-tubes ή των βυθισμάτων του K-tray. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν πρόκειται να πραγματοποιήσετε λιγότερες από 24 αναλύσεις, οι θέσεις των βυθισμάτων K-tube 1, 2, 5, 20, 23 και 24 πρέπει να χρησιμοποιηθούν για να ισορροπήσει το K-carrier στο Θερμοκυκλοποιητή. 4. Εάν είναι δυνατόν, αφαιρέστε τα πώματα από τα K-tubes χρησιμοποιώντας τον Πωματιστή K-tube. Τοποθετήστε τα πώματα στο Συγκρατητή Θέσης Αναμονής K-tube. 5. Προετοιμάστε το Κύριο Μίγμα Εργασίας ως εξής: Προσθέστε 200 µl MYCO Mg 2+ και 50 µl MYCO IC σε ένα φιαλίδιο MTB MMX. Πωματίστε το σωληνάριο και αναμίξτε καλά αναστρέφοντας 10 φορές. Μη στροβιλίζετε το Κύριο Μίγμα Εργασίας. Προστατέψτε το Κύριο Μίγμα Εργασίας από το φως και χρησιμοποιήστε το εντός 2 ωρών. 6. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl Κύριου Μίγματος Εργασίας σε κάθε K-tube ή κατάλληλο βύθισμα του K-tray. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Κύριο Μίγμα Εργασίας είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στο φως. Ελαχιστοποιήστε την έκθεση των K-tubes ή του K-tray που περιέχει το Κύριο Μίγμα Εργασίας στο φως. 7. Προσθέστε 50 μl από κάθε προετοιμασμένο δείγμα ή ορό ελέγχου στο κατάλληλο K-tube ή βύθισμα του K-tray που περιέχει Κύριο Μίγμα Εργασίας, χρησιμοποιώντας μια συσκευή μικροπιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Αναμίξτε ελαφρά κάθε δείγμα ή ορό ελέγχου αναρροφώντας πάνω-κάτω τρεις φορές με τη συσκευή μικροπιπέτας χωρίς να δημιουργήσετε φυσαλίδες. 05174953001-08EL 8 Doc Rev. 8.0

8. Επαναλάβετε το βήμα 7 για κάθε προετοιμασμένο δείγμα και κάθε προετοιμασμένο ορό ελέγχου, μέχρι να μεταφερθούν όλα στα K-tubes ή τα K-trays. Χρησιμοποιήστε ένα νέο ακροφύσιο για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Ελέγξτε οπτικά για την παρουσία φυσαλίδων και αφαιρέστε τις αν υπάρχουν. Πωματίστε τα K-tubes/K-trays χρησιμοποιώντας τον Πωματιστή K-tube/Εργαλείο πωματισμού K-tray. Βεβαιωθείτε οπτικά ότι έχουν προστεθεί οι κατάλληλοι όγκοι. 9. Αν η ενίσχυση δεν ξεκινήσει αμέσως, αποθηκεύστε το έτοιμο για PCR K-carrier σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 15-30 C. Η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει εντός 90 λεπτών μετά την προσθήκη των προετοιμασμένων δειγμάτων και ορών ελέγχου στα K-tubes ή στο K-tray που περιέχει το Κύριο Μίγμα Εργασίας. Γ. Ενίσχυση και Ανίχνευση Εκτελείται στην: Περιοχή Ενίσχυσης/Ανίχνευσης, μετά την Ενίσχυση Φόρτωση και Χειρισμός του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή 1. Ενεργοποιήστε τον υπολογιστή του σταθμού εργασίας και συνδεθείτε στα Windows XP χρησιμοποιώντας την κατάλληλη Ταυτότητα Χρήστη και τον κωδικό πρόσβασης. 2. Ενεργοποιήστε τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την έναρξη της ανάλυσης. Βεβαιωθείτε ότι το όργανο ενεργοποιείται και είναι έτοιμο για χρήση. Αν σε κάποιον Θερμοκυκλοποιητή υπάρχουν ακόμη K-carriers από προηγούμενες αναλύσεις, αφαιρέστε τους χρησιμοποιώντας το μεταφορέα K-carrier. 3. Ανοίξτε το AMPLILINK λογισμικό στον υπολογιστή. Συνδεθείτε χρησιμοποιώντας την κατάλληλη Ταυτότητα Χρήση και τον κωδικό πρόσβασης. 4. Για να δημιουργήσετε εντολές K-carrier για τα δείγματα που πρόκειται να υποβληθούν σε ανάλυση, κάντε κλικ στο εικονίδιο Orders. Επιλέξτε την καρτέλα Sample και στη συνέχεια κάντε κλικ στο κουμπί New και εισάγετε τον αριθμό εντολής για κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας το πληκτρολόγιο ή το σαρωτή ανάγνωσης γραμμωτού κώδικα. Επιλέξτε το Αρχείο Ορισμού Εξέτασης για το COBAS TaqMan MTB Test. Για τα ονόματα και τις εκδόσεις των Αρχείων Ορισμού Εξέτασης, ανατρέξτε στην Καρτέλα Στοιχείων Προϊόντος που παρέχεται μαζί με το κιτ. Επαναλάβετε για κάθε δείγμα. Κάντε κλικ στο κουμπί Save. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν πρόκειται να πραγματοποιήσετε λιγότερες από 24 αναλύσεις, οι θέσεις των βυθισμάτων K-tube 1, 2, 5, 20, 23 και 24 πρέπει να είναι χρησιμοποιηθούν για να ισορροπήσει το K-carrier στο Θερμοκυκλοποιητή. 5. Εισάγετε πληροφορίες Ποιοτικού Ελέγχου, επιλέγοντας την καρτέλα Quality Control στο παράθυρο Orders. Κάντε κλικ στο κουμπί New και εισάγετε τις πληροφορίες από την Καρτέλα Τιμών του COBAS TaqMan MTB Test που παρέχεται μαζί με το κιτ, χρησιμοποιώντας το πληκτρολόγιο ή το σαρωτή ανάγνωσης γραμμωτού κώδικα. Εισάγετε τον αριθμό παρτίδας και την ημερομηνία λήξης του COBAS TaqMan MTB Test. Κάντε κλικ στο OK. 6. Αντιστοιχίστε έναν αριθμό K-carrier για την ανάλυση κάνοντας κλικ στην καρτέλα K-Carrier, στο παράθυρο Orders. Στο παράθυρο K-Carrier, κάντε κλικ στο New. Στο πεδίο δεξιά από το K-Carrier ID, εισάγετε τον αριθμό K-carrier από το γραμμωτό κώδικα στο K-carrier ή το K-tray, χρησιμοποιώντας το πληκτρολόγιο ή το σαρωτή ανάγνωσης γραμμωτού κώδικα. Επιλέξτε το Αρχείο Ορισμού Εξέτασης για το COBAS TaqMan MTB Test από τον πίνακα εξετάσεων στο κάτω μέρος του παραθύρου. Για τα ονόματα και τις εκδόσεις των Αρχείων Ορισμού Εξέτασης, ανατρέξτε στην Καρτέλα Στοιχείων Προϊόντος που παρέχεται μαζί με το κιτ. 7. Στο Worklist, επιλέξτε την πρώτη σειρά της στήλης Type (T). Επισημάνετε αυτό το πεδίο για πρόσβαση στο πτυσσόμενο μενού και στη συνέχεια επιλέξτε τον απαιτούμενο τύπο ορού ελέγχου. Στη συνέχεια, κάντε διπλό κλικ στο πεδίο ταυτότητας δείγματος για την ίδια σειρά. Εμφανίζεται το παράθυρο LookUp Control με όλους τους διαθέσιμους ορούς ελέγχου. Μόλις επιλέξετε έναν ορό ελέγχου, εμφανίζονται ο αντίστοιχος αριθμός παρτίδας και η αντίστοιχη ημερομηνία λήξης στον πίνακα πληροφοριών κάτω δεξιά. Επαναλάβετε αυτή τη διαδικασία για όλους τους απαιτούμενους ορούς ελέγχου. 8. Για να εισάγετε δείγματα στο Worklist, κάντε διπλό κλικ στην πρώτη θέση (σειρά) για καταχώρηση δείγματος. Εμφανίζεται το παράθυρο Lookup Sample με αντιστοιχισμένες εντολές δείγματος. Χρησιμοποιήστε το πλήκτρο Shift και τα πλήκτρα Βέλους για να επισημάνετε περισσότερους από έναν αριθμούς εντολών. Βεβαιωθείτε ότι το Αρχείο Ορισμού Εξέτασης για το COBAS TaqMan MTB Test έχει αντιστοιχιστεί σε όλες τις εντολές. Για τα ονόματα και τις εκδόσεις των Αρχείων Ορισμού Εξέτασης, ανατρέξτε στην Καρτέλα Στοιχείων Προϊόντος που παρέχεται μαζί με το κιτ. 9. Κάντε κλικ στο Save για να αποθηκεύσετε την αντιστοίχιση της εντολής K-carrier. 05174953001-08EL 9 Doc Rev. 8.0

10. Επιλέξτε το εικονίδιο Systems στην καρτέλα System και κάντε κλικ στο Open για να ανοίξετε το Θερμοκυκλοποιητή. Μόλις το κάλυμμα του Θερμοκυκλοποιητή ανοίξει τελείως και εμφανιστεί το μήνυμα Ready to Load στο παράθυρο Systems, σηκώστε και κρατήστε ανοικτό το καπάκι του Θερμοκυκλοποιητή. Χρησιμοποιώντας το Μεταφορέα K-carrier, μεταφέρετε το φορτωμένο K-carrier που περιέχει τα κλειστά K-tubes με το Κύριο Μίγμα Εργασίας και τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου στο Θερμοκυκλοποιητή. Κλείστε το καπάκι του Θερμοκυκλοποιητή. 11. Κάντε κλικ στο Start στο παράθυρο Systems κάτω από το εικονίδιο TC για να κλείσετε το Κάλυμμα του Θερμοκυκλοποιητή και να ξεκινήσετε την ανάλυση. 12. Η ενίσχυση και η ανίχνευση εκτελούνται αυτόματα από τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΥπολογισμός αποτελεσμάτων με το AMPLILINK, έκδοση σειράς 3.3 Ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής προσδιορίζει αυτόματα αν πραγματοποιείται ανίχνευση DNA του ΜΤΒ για το δείγμα ή τον ορό ελέγχου. Ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής: Καθορίζει την τιμή Κατωφλίου του Κύκλου (Ct) για το DNA του MTB και του DNΑ Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου. Καθορίζει αν το DNA του ΜΤΒ ανιχνεύεται με βάση τις τιμές Ct για το DNA του ΜΤΒ και το DNA Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου. Καθορίζει την εγκυρότητα των MTB (+) C και MYCO ( ) C. Επαλήθευση Ανάλυσης Ελέγξτε το παράθυρο αποτελεσμάτων του AMPLILINK ή την εκτύπωση για ενδείξεις και σχόλια για να βεβαιωθείτε ότι η ανάλυση είναι έγκυρη. Η ανάλυση είναι έγκυρη αν δεν εμφανίζονται ενδείξεις για τους COBAS TaqMan Ορούς Ελέγχου MTB. Για μια έγκυρη ανάλυση, λαμβάνονται τα ακόλουθα αποτελέσματα: Ορός ελέγχου Αποτέλεσμα Ερμηνεία Αρνητικός Ορός Ελέγχου Negative Ορός Ελέγχου εντός Εύρους Θετικός Ορός Ελέγχου Positive Ορός Ελέγχου εντός Εύρους Η ανάλυση δεν είναι έγκυρη αν εμφανίζεται οποιαδήποτε από τις παρακάτω ενδείξεις για τους COBAS TaqMan Ορούς Ελέγχου MTB: Αρνητικός Ορός Ελέγχου MYCO: Ένδειξη Αποτέλεσμα Ερμηνεία NC_INVALID Invalid Απουσία σήματος IC ή σήμα IC εκτός εύρους Θετικός Ορός Ελέγχου MTB: Ένδειξη Αποτέλεσμα Ερμηνεία PC_INVALID Invalid Ορός Ελέγχου εκτός Εύρους, απουσία σήματος στόχου ή απουσία σήματος IC Αν είναι άκυρος ένας ορός ελέγχου, όλα τα δείγματα της ανάλυσης αναφέρονται ως INVALID. Επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση συμπεριλαμβανομένης της προετοιμασίας δείγματος και ορού ελέγχου, της ενίσχυσης και της ανίχνευσης. Ερμηνεία Αποτελεσμάτων: Για μια έγκυρη ανάλυση, ελέγξτε κάθε μεμονωμένο δείγμα για ενδείξεις ή σχόλια στην εκτύπωση αποτελεσμάτων. Ερμηνεύστε τα αποτελέσματα ως εξής: Μια έγκυρη ανάλυση μπορεί να περιλαμβάνει τόσο έγκυρα όσο και άκυρα αποτελέσματα δείγματος ανάλογα με τις ενδείξεις και/ή τα σχόλια που λαμβάνονται για τα μεμονωμένα δείγματα. 05174953001-08EL 10 Doc Rev. 8.0

Τα αποτελέσματα δειγμάτων ερμηνεύονται ως εξής: Αποτελέσματα Αποτέλεσμα Παρατηρήσεις Ερμηνεία Ορού Ελέγχου Δείγματος Ένδειξης PC_INVALID Ακυρο Invalid και/ή Οι οροί ελέγχου δεν είναι έγκυροι, όλα τα δείγματα NC_INVALID στην ανάλυση επισημαίνονται ως άκυρα. Δεν ανιχνεύτηκε DNA M. tuberculosis. Το δείγμα είναι πιθανόν αρνητικό για M. tuberculosis. Ένα Θετικό για PC ( ) Απουσία αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει τη μόλυνση με Αρνητικό για NC ένδειξης M. tuberculosis, καθώς τα αποτελέσματα εξαρτώνται από την επαρκή συλλογή δείγματος, την απουσία αναστολέων και την ανίχνευση επαρκούς DNA. Θετικό για PC MTB Απουσία Ανιχνεύτηκε DNA M. tuberculosis. Το δείγμα Αρνητικό για NC ένδειξης είναι θετικό για M. tuberculosis. Θετικό για PC Το αποτέλεσμα δείγματος είναι άκυρο. Κάντε δεξί κλικ Αρνητικό για NC Invalid S_INVALID στις Παρατηρήσεις Ένδειξης για να προβάλετε τις Λεπτομερείς Ενδείξεις. (1) Το Ct Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου είναι αφύσικα χαμηλό και το δείγμα αναφέρεται ως Invalid. Επεξεργαστείτε ένα άλλο κλάσμα του αρχικού Θετικό για PC Invalid QS_INVALID δείγματος και επαναλάβετε την εξέταση. Αν το αρχικό Αρνητικό για NC δείγμα δεν είναι διαθέσιμο, θα πρέπει να γίνει συλλογή ενός νέου δείγματος. Σημείωση: Στο AMPLILINK λογισμικό, έκδοση 3.3, η αποτυχία του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου (IC) λόγω χαμηλής τιμής Ct του IC επισημαίνεται ως QS_INVALID. (1) Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις Παρατηρήσεις Ενδείξεων και τις Λεπτομερείς Ενδείξεις, ανατρέξτε στο κεφάλαιο Ενδείξεις, στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 όργανο. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Σε κάθε K-carrier πρέπει να συμπεριλαμβάνεται από ένας Ορός Ελέγχου MYCO ( ) και ένας Ορός Ελέγχου MTB (+). Όπως συμβαίνει με κάθε νέα εργαστηριακή διαδικασία, οι νέοι χειριστές θα πρέπει να εξετάσουν το ενδεχόμενο χρήσης πρόσθετων ορών ελέγχου κάθε φορά που εκτελείται η εξέταση, μέχρι να αποκτήσουν υψηλό βαθμό εμπιστοσύνης στην ικανότητά τους για ορθή εκτέλεση της εξέτασης. Δεν υπάρχουν απαιτήσεις όσον αφορά τη θέση των ορών ελέγχου στο K-carrier. Ελέγξτε την εκτύπωση της ανάλυσης για ενδείξεις και σχόλια, ώστε να βεβαιωθείτε ότι η ανάλυση είναι έγκυρη. Αρνητικός Ορός Ελέγχου Το MYCO ( ) C πρέπει να δίνει αποτέλεσμα Negative, δηλαδή, η τιμή Ct για το DNA του MTB ξεπέρασε το όριο για την ανάλυση ή δεν προέκυψε τιμή Ct για το DNA του ΜΤΒ, αλλά προέκυψε έγκυρη τιμή Ct για το DNA Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου Μυκοβακτηρίου. Αν το MYCO ( ) C δεν πληροί τα κριτήρια αυτά, ολόκληρη η ανάλυση θεωρείται μη έγκυρη. Επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία (προετοιμασία δειγμάτων και ορών ελέγχου, ενίσχυση και ανίχνευση). Αν τα αποτελέσματα του MYCO ( ) C είναι συνεχώς μη έγκυρα, επικοινωνήστε με το τοπικό γραφείο της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. Θετικός Ορός Ελέγχου Το αποδιδόμενο εύρος για το MTB (+) C ορίζεται στο Αρχείο Ορισμού Εξέτασης για το COBAS TaqMan MTB Test.. Τα αποτελέσματα για το MTB (+) C πρέπει να είναι εντός του αποδιδόμενου εύρους για να είναι έγκυρα. Το σωστό αποτέλεσμα υποδεικνύεται με την ένδειξη Positive. Αν το αποτέλεσμα για το MTB (+) C είναι εκτός του αποδιδόμενου εύρους, το αποτέλεσμα του Θετικού Ορού Ελέγχου θα είναι Invalid με Παρατήρηση Ένδειξης PC_INVALID. Αν ο Θετικός Ορός Ελέγχου δεν πληροί αυτό το κριτήριο, ολόκληρη η ανάλυση είναι μη έγκυρη. Επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία (προετοιμασία δείγματος και ορού ελέγχου, ενίσχυση και ανίχνευση). Αν το αποτέλεσμα του Θετικού Ορού Ελέγχου είναι συνεχώς εκτός του αποδιδόμενου εύρους, επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. 05174953001-08EL 11 Doc Rev. 8.0

Ο MTB (+) Ορός Ελέγχου περιέχει περίπου 20 αντίγραφα/εξέταση μιας αλληλουχίας DNA πλασμιδίου M. tuberculosis. Ισοδυναμεί με το τετραπλάσιο περίπου του ελάχιστου επιπέδου ανίχνευσης της ανάλυσης όπως καθορίζεται από την ανάλυση Poisson. Η ενίσχυση και η ανίχνευση του MTB (+) Ορού Ελέγχου επιβεβαιώνει την πραγματοποίηση ενίσχυσης. Ο MTB (+) Ορός Ελέγχου δεν παρακολουθεί την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης ή το επίπεδο ανίχνευσης της Εξέτασης. Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου προορίζεται για την ταυτοποίηση δειγμάτων που περιέχουν αναστολείς πολυμεράσης. Η χρήση του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου δεν θα εξαλείψει όλα τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα της εξέτασης. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όπως συμβαίνει με όλες τις διαδικασίες εξέτασης, η ορθή εργαστηριακή πρακτική είναι απαραίτητη για τη σωστή εκτέλεση αυτής της εξέτασης. Λόγω της υψηλής αναλυτικής ευαισθησίας της παρούσας εξέτασης, θα πρέπει να είστε ιδιαίτερα προσεκτικοί σε ό,τι αφορά τη διατήρηση της καθαρότητας των αντιδραστηρίων του κιτ ή των μιγμάτων ενίσχυσης. Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να παρακολουθούνται σχολαστικά για την καθαρότητά τους. Απορρίψτε οποιοδήποτε αντιδραστήριο ενδέχεται να είναι ύποπτο. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί μόνο με χρήση δειγμάτων πτύελων απόχρεμψης και προκλητών πτύελων καθώς και δειγμάτων BAL που έχουν υγροποιηθεί, απολυμανθεί και συμπυκνωθεί με τη χρήση NALC- NaOH. Η εξέταση άλλων τύπων δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά αποτελέσματα. 2. Η ανίχνευση M. tuberculosis εξαρτάται από τον αριθμό των οργανισμών που βρίσκονται στο δείγμα και μπορεί να επηρεαστεί από τις μεθόδους συλλογής δείγματος, παράγοντες που σχετίζονται με τους ασθενείς (δηλ. ηλικία, παρουσία συμπτωμάτων) και/ή το στάδιο της μόλυνσης με M. tuberculosis. 3. Μπορούν να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα λόγω αναστολής της πολυμεράσης. Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου Μυκοβακτηρίου έχει προστεθεί στο COBAS TaqMan MTB Test, ώστε να είναι δυνατή η ταυτοποίηση των επεξεργασμένων δειγμάτων που περιέχουν ουσίες, οι οποίες ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν με την ενίσχυση PCR περισσότερων από 20 αντιγράφων/εξέταση. 4. Ενδέχεται να προκύψουν ψευδή αρνητικά αποτελέσματα παρουσία ειδών Μυκοβακτηρίου υψηλού τίτλου διαφορετικών από το σύμπλοκο M. tuberculosis (MTB) εάν υπάρχει MTB χαμηλότερου τίτλου σε σχέση με το είδος Μυκοβακτηρίου που αλληλεπιδρά. 5. Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων εξαρτάται από τις διαδικασίες συλλογής, μεταφοράς, αποθήκευσης και επεξεργασίας δειγμάτων. Λόγω της αποθήκευσης οι μεταβλητές δεν έχουν προσδιοριστεί πλήρως. 6. Η προσθήκη του ενζύμου AmpErase στο Κύριο Μίγμα επιτρέπει την επιλεκτική ενίσχυση του DNA στόχου. Ωστόσο, για να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση των αντιδραστηρίων, απαιτούνται ορθές εργαστηριακές πρακτικές και προσεκτική τήρηση των διαδικασιών που καθορίζονται στο παρόν Ένθετο Συσκευασίας. 7. Η θεραπευτική επιτυχία ή αποτυχία δεν μπορεί να προσδιοριστεί με τη χρήση αυτής της εξέτασης. 8. Όπως συμβαίνει με κάθε διαγνωστική εξέταση, τα αποτελέσματα από το COBAS TaqMan MTB Test θα πρέπει να ερμηνεύονται λαμβάνοντας υπόψη όλα τα σχετικά κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. 9. Η χρήση αυτού του προϊόντος πρέπει να επιτρέπεται μόνο σε προσωπικό εκπαιδευμένο στις τεχνικές PCR. 10. Το COBAS TaqMan MTB Test παρέχει ποιοτικά αποτελέσματα. Δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί συσχετισμός του μεγέθους μιας θετικής τιμής καμπής του COBAS TaqMan MTB Test και του αριθμού των κυττάρων M. tuberculosis μέσα σε ένα μολυσμένο δείγμα. 11. Το προϊόν αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο με τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. 12. Η παρουσία αναστολέων PCR μπορεί να προκαλέσει ψευδώς αρνητικά ή μη έγκυρα αποτελέσματα. 13. Αν και πρόκειται για σπάνια περίπτωση, οι μεταλλάξεις στις περιοχές υψηλής διατήρησης του βακτηριακού γονιδιώματος που καλύπτονται από τους εκκινητές της εξέτασης και/ή τους ιχνηθέτες, ενδέχεται να οδηγήσουν σε αποτυχία ανίχνευσης των βακτηρίων. 14. Λόγω εγγενών διαφορών μεταξύ των τεχνολογιών, πριν από τη μετάβαση στην επόμενη τεχνολογία, συνιστάται η πραγματοποίηση μελετών συσχετισμού μεθόδων από το χειριστή στο εργαστήριο, για την αξιολόγηση των διαφορών τεχνολογίας. 05174953001-08EL 12 Doc Rev. 8.0

ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΗ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Αναλυτική Ειδικότητα Η αναλυτική ειδικότητα του COBAS TaqMan MTB Test αξιολογήθηκε με την εξέταση των παρακάτω βακτηρίων, ιών και μυκήτων, μεγάλος αριθμός των οποίων αποτελεί φυσιολογική χλωρίδα ή είναι κοινά παθογόνα στην αναπνευστική οδό. Κανένας από τους παρακάτω οργανισμούς δεν έδειξε αντιδραστικότητα στο COBAS TaqMan MTB Test: Μυκοβακτηριακά Είδη Mycobacterium abscessus Mycobacterium neoaurum Mycobacterium asiaticum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium avium Mycobacterium phlei Mycobacterium chelonae Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium chitae Mycobacterium senegalens Mycobacterium fallax Mycobacterium shimoidei Mycobacterium flavescens Mycobacterium simiae Mycobacterium fortuitum Mycobacterium smegmatis Mycobacterium gastri Mycobacterium sphagni Mycobacterium gordonae Mycobacterium szulgai Mycobacterium intracellulare Mycobacterium terriae Mycobacterium kansasii Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium komassense Mycobacterium triviale Mycobacterium malmoense Mycobacterium vaccae Mycobacterium marinum Mycobacterium xenopi Μη Μυκοβακτηριακά Είδη Acinetobacter calcoaceticus Actinomadura madurae Actinomyces pyogenes Actinoplanes italicus Aeromonas hydrophila Arthrobacter oxydans Bacillus subtilis Bacteriodes fragilis Blastomyces dermatitidis Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella (Moraxella) catarrhalis Brevibacterium linens Campylobacter jejuni Candida albicans Chlamydia trachomatis Chromobacterium violaceum Citrobacter freundii Clostridium perfringens Coccidioides immitis Corynebacterium aquaticum Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium flavescens Corynebacterium glutamicum Corynebacterium jeikeium Corynebacterium minutissimum Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium renale Corynebacterium striatum Corynebacterium xerosis Cryptococcus neοformans Deinococcus radiodurans Dermatophilus congolensis Derxia gummosa Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Legionella micdadei Legionella pneumophila Mycoplasma hominis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica Neisseria meningitidis Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Nocardia farcinica (W5218) Nocardia nova (W5194) Nocardia otitidiscaviarum Nocardia transvalensi Oerskovia turbata Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Rhodococcus aichiensis Rhodococcus chubuensis Rhodococcus equi Salmonellacholeraesus subsp Choleraesuis Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseinus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus 05174953001-08EL 13 Doc Rev. 8.0

Enterococcus faecalis Xanthomonas maltophilia Enterococcus faecium Yersinia enterocolitica Escherichia coli Αναπνευστικός συγκυτιακός ιός Fusobacterium nucleatum Ανθρώπινος αδενοϊός Gordona sputi Ανθρώπινος εντεροϊός Haemophilus influenzae Ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός Histoplasma capsulatum Ανθρώπινος ρινοϊός 14 Klebsiella pneumoniae Ιός γρίπης B Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Ιός Herpes simplex τύπου 1 Lactobacillus casei Ιός Parainfluenza 2 Αναλυτική Ευαισθησία: Κύτταρα M. tuberculosis Το όριο ανίχνευσης του COBAS TaqMan MTB Test καθορίστηκε προσδιορίζοντας τον ελάχιστο αριθμό μονάδων M. tuberculosis που σχηματίζουν αποικία (CFU), οι οποίες μπορούν να ανιχνευτούν αναπαραγωγικά ( 95% Θετικά Αποτελέσματα) από το COBAS TaqMan MTB Test. Μια απολυμασμένη καλλιέργεια MTB αραιώθηκε σε αρνητικό πτύελο, υγροποιημένο με NALC/NaOH, για τη δημιουργία ενός πίνακα με 7 επίπεδα 10, 5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 και 0 MTB CFU/PCR. Ο πίνακας αυτός προετοιμαζόταν εκ νέου, κάθε ημέρα, για 3 ημέρες. Πραγματοποιήθηκε εξέταση πενήντα-τεσσάρων αντιγράφων κάθε επιπέδου του πίνακα, χρησιμοποιώντας τρεις παρτίδες αντιδραστηρίων του COBAS TaqMan MTB Test. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης Probit (Πίνακας 1) υποδεικνύουν ότι η τιμή του ορίου ανίχνευσης του COBAS TaqMan MTB Test είναι 0,46 CFU/PCR ή περίπου 18 CFU/mL σε δείγματα πτύελου. Πίνακας 1 Όριο Ανίχνευσης του COBAS TaqMan MTB Test με Κύτταρα M. tuberculosis Στοιχείο Ονομαστική Εισαγωγή CFU/PCR Αρ. μη έγκ. αποτ. Αρ. έγκ. αποτ. Αρ. θετ. αποτ. Αρ. δοκιμών % Αποτελεσμάτων 95% Cl 1 10 0 54 54 54 100,0% 94,6-100% 2 5 0 54 54 54 100,0% 94,6-100% 3 1 0 54 54 54 100,0% 94,6-100% 4 0,5 0 54 51 54 94,4% 84,6-98,8% 5 0,25 0 54 46 54 85,2% 72,9-93,4% 6 0,1 0 54 33 54 61,1% 46,9-74,0% 7 0 0 54 0 54 0,0% 0,0-5,4% 95% LOD κατά PROBIT = 0,46 CFU/PCR 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης = 0,33-0,83 CFU/PCR Συμπερίληψη Το COBAS TaqMan MTB Test αξιολογήθηκε με όλα τα είδη Μυκοβακτηρίων που βρίσκονται στο σύμπλοκο MTB (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti και M. africanum). Πραγματοποιήθηκε εξέταση προετοιμασμένων δειγμάτων ποσοτικοποιημένου γενομικού DNA (10 αντίγραφα/pcr) και καλλιεργειών βακτηρίων. Στο επίπεδο εισαγωγής 10 γενομικών αντιγράφων/pcr και τα 4 μέλη του Συμπλόκου MTB ταυτοποιήθηκαν ως θετικά. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση 169 καλλιεργειών ειδών του Συμπλόκου MTB (M. tuberculosis = 159, M. bovis = 6, M. microti = 3 και M. africanum = 1) με το COBAS TaqMan MTB Test. Μια καλλιέργεια M. microti και μια καλλιέργεια M. tuberculosis βρέθηκαν αρνητικές, με αποτέλεσμα ο συνολικός βαθμός συμπερίληψης να είναι της τάξεως του 99%. 05174953001-08EL 14 Doc Rev. 8.0