Ανάπτυξη Μεθόδων Ανίχνευσης/Ποσοτικού Προσδιορισμού Σημειακών Μεταλλάξεων/Πολυμορφισμών με Μοριακές Τεχνικές

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ανάπτυξη Μεθόδων Ανίχνευσης/Ποσοτικού Προσδιορισμού Σημειακών Μεταλλάξεων/Πολυμορφισμών με Μοριακές Τεχνικές ΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΓΑΡΙΤΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ 2015

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ανάπτυξη Μεθόδων Ανίχνευσης/Ποσοτικού Προσδιορισμού Σημειακών Μεταλλάξεων/Πολυμορφισμών με Μοριακές Τεχνικές ΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΓΑΡΙΤΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ 2015

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ανάπτυξη Μεθόδων Ανίχνευσης/Ποσοτικού Προσδιορισμού Σημειακών Μεταλλάξεων/Πολυμορφισμών με Μοριακές Τεχνικές ΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΓΑΡΙΤΑ Α.Μ.: 102814 ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: Πηνελόπη Ιωάννου - Αμαραντίδου, Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας, Τμήματος Χημείας ΕΚΠΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ: Πηνελόπη Ιωάννου-Αμαραντίδου, Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ Θεόδωρος Χριστόπουλος, Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Jan Traeger-Συνοδινός, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Γενετικής, Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Πηνελόπη Ιωάννου-Αμαραντίδου, Επιβλέπουσα, Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ 2. Θεόδωρος Χριστόπουλος, Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 3. Jan Traeger-Συνοδινός, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Γενετικής, Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ 4. Ευρύκλεια Λιανίδου, Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ 5. Μιχαήλ Κουππάρης, Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ 6. Μαρία Τζέτη, Επίκουρη Καθηγήτρια Γενετικής, Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ 7. Αναστάσιος Οικονόμου, Αναπληρωτής Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ ΝΟΕΜΒΡΗΣ 2015

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων αποτελούν δημοφιλή μέθοδο διεξαγωγής διαγνωστικών δοκιμασιών. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ποικιλίας αναλυτών όπως αντιγόνα ή αντισώματα, ενώ τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται και για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων και σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκε ταχεία και αξιόπιστη μέθοδος για την ταυτόχρονη ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών, που σχετίζονται με διάφορες ασθένειες. Χρησιμοποιήθηκε η αντίδραση επέκτασης εκκινητή για τη διάκριση των αλληλίων σε συνδυασμό με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση των προϊόντων της γονοτυπικής αντίδρασης. Η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με α και β-θαλασσαιμία, θρομβοφιλία και νόσο του Wilson. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων που προκαλούν α-θαλασσαιμία με ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας και πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη με τη μέθοδο γονοτύπησης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η μέθοδος γονοτύπησης με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων περιλαμβάνει: α) αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την ενίσχυση τμημάτων γονιδίων που περιέχουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, β) πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή παρουσία αλληλοειδικών εκκινητών (ένα ζεύγος για κάθε μετάλλαξη), biotin-dutps και DNA πολυμεράσης με υπολειπόμενη 3-5 εξωνουκλεοτιδική δραστικότητα και γ) ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων με χρήση νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Για την επίτευξη του καλύτερου οπτικού διαχωρισμού των αλληλομόρφων, βελτιστοποιήθηκαν τόσο οι παράμετροι της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή όσο και οι παράμετροι της ανίχνευσης των προϊόντων με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για κάθε εφαρμογή της μεθόδου. Για την αξιολόγηση των μεθόδων πολλαπλής γονοτύπησης/ανίχνευσης μεταλλάξεων σε κάθε 3

εφαρμογή, αναλύθηκαν κλινικά δείγματα γνωστού και άγνωστου γονότυπου και τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με μεθόδους αναφοράς. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Μοριακή διάγνωση ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Γονοτύπηση, αντίδραση επέκτασης εκκινητή, ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, οπτική ανίχνευση, ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας. 4

ABSTRACT Lateral flow assays are prefabricated strips of a carrier material containing dry reagents that are activated by applying the fluid sample. Lateral flow assays are important for diagnostic purposes and are currently used for qualitative, semiquantitative and to some extent quantitative monitoring in resource-poor or non-laboratory environments. In the present thesis, we report a rapid and reliable dry-reagent dipstick method that enables simultaneous visual detection of mutations and singlenucleotide polymorphisms (SNPs) associated with various diseases. The primer extension (PEXT) reaction was used in this approach for genotyping of single-nucleotide polymorphisms. The method was applied to detect mutations associated with alpha- and beta-thalassemia, thrombophilia and Wilson's disease. In addition, high-resolution melting curve analysis (HRMA) was used for the detection of mutations causing alpha-thalassemia and the results were compared to those obtained by multi-allele dipstick assay. The procedure involves: a) Polymerase chain reaction in order to amplify fragments of the gene(s) flanking the mutations of interest, b) multiplex primer extension reaction in presence of allele-specific primers (one pair per mutation), biotin d-utps and DNA polymerase that lacks 3-5 nuclease activity and c) rapid visual detection of primer extension products by means of multiplex dry reagent dipstick assay using anti-biotin functionalized gold nanoparticles as reporters. Optimization studies of various parameters influencing the multiplex genotyping reaction as well as the performance of the visual multiplex detection system were performed in order to achieve the best optical allele discrimination. For the method evaluation, clinical samples previously characterized or with unknown genotype (blind samples), were analysed by the proposed genotyping methods and the results were found to be fully concordant with reference methods. 5

SUBJECT AREA: Molecular diagnostics KEYWORDS: Genotyping, visual detection, primer extension reaction, multiallele DNA biosensor, high resolution melting analysis (HRMA) 6

Αφιερωμένο με αγάπη στους γονείς μου, Αριστείδη και Βούλα. 7

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 3 ABSTRACT... 5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 13 1. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 15 1.1 Δοκιμασίες πλάγιας ροής... 15 1.2 Δομή και λειτουργία ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων... 16 1.3 Ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων... 19 1.3.1 Μέθοδοι ανίχνευσης προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων... 19 1.3.2 Εφαρμογές ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων στην ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων... 21 1.4 Ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) και μεταλλάξεων... 24 1.4.1 Μέθοδοι διάκρισης αλληλίων και μέθοδοι ανίχνευσης προϊόντων γονοτυπικών αντιδράσεων... 24 1.4.2 Εφαρμογές ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων στην ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών και μεταλλάξεων... 27 2. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Ανάπτυξη ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης για την ανίχνευση 5 μεταλλάξεων στο γονίδιο της β-σφαιρίνης... 49 2.1 Εισαγωγή... 49 2.2 Οργανολογία και Μέθοδοι... 54 2.2.1 Οργανολογία... 54 2.2.2 Κλινικά δείγματα... 55 2.2.3 Μέθοδοι... 55 2.3 Αποτελέσματα και Συζήτηση... 59 8

2.3.1 Αρχή της δοκιμασίας... 59 2.3.2 Μελέτες βελτιστοποίησης... 61 2.3.3 Ειδικότητα της μεθόδου... 63 2.3.4 Επαναληψιμότητα της μεθόδου... 65 2.3.5 Αξιολόγηση της μεθόδου... 66 2.4 Συμπεράσματα... 69 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι... 74 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ... 75 3. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: Ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης για τη γονοτύπηση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων του γονιδίου HBA2 με αντίδραση επέκτασης εκκινητή... 76 3.1 Εισαγωγή... 76 3.2 Οργανολογία και Μέθοδοι... 81 3.2.1 Οργανολογία... 81 3.2.2 Κλινικά δείγματα... 81 3.2.3 Σχεδίαση εκκινητών... 82 3.2.4 Γονοτύπηση 10 μεταλλάξεων στο γονίδιο ΗΒΑ2 με πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων... 83 3.3 Αποτελέσματα... 88 3.3.1 Αρχή της δοκιμασίας... 88 3.3.2 Μελέτες βελτιστοποίησης των αντιδράσεων PCR και PEXT... 89 3.3.3 Ειδικότητα της μεθόδου... 91 3.3.4 Επαναληψιμότητα της μεθόδου... 91 3.3.5 Αξιολόγηση της μεθόδου... 92 3.4 Συζήτηση... 95 3.5 Συμπεράσματα... 96 9

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι... 101 4. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: Ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας για την ανίχνευση μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στα γονίδια HBA1 και HBA2 της α-σφαιρίνης... 102 4.1 Εισαγωγή... 102 4.2 Υλικά και Μέθοδοι... 104 4.2.1 Κλινικά δείγματα... 104 4.2.2 Σχεδίαση εκκινητών... 106 4.2.3 Ενίσχυση με αντίδραση PCR... 107 4.2.4 Παρασκευή ανασυνδυασμένων συνθετικών τμημάτων DNA του γονιδίου της α σφαιρίνης... 108 4.2.5 Ανάλυση καμπύλης τήξης... 110 4.3 Αποτελέσματα... 111 4.4 Συζήτηση... 116 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι... 125 5. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: Ανάπτυξη ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης για τη γονοτύπηση γενετικών παραγόντων που σχετίζονται με τη θρομβοφιλία... 127 5.1 Εισαγωγή... 127 5.2 Οργανολογία και Μέθοδοι... 131 5.2.1 Οργανολογία... 131 5.2.2 Κλινικά δείγματα... 131 5.2.3 Μέθοδοι... 131 5.3 Αποτελέσματα και Συζήτηση... 135 5.3.1 Αρχή της δοκιμασίας... 135 10

5.3.2 Μελέτες βελτιστοποίησης... 138 5.3.3 Αξιολόγηση της μεθόδου... 140 5.4 Συμπεράσματα... 145 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι... 150 6. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6: Δοκιμασία πολλαπλής γονοτύπησης με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων μεταλλάξεων που σχετίζονται με τη νόσο του Wilson... 154 6.1 Εισαγωγή... 154 6.2 Οργανολογία και Μέθοδοι... 156 6.2.1 Οργανολογία... 156 6.2.2 Κλινικά δείγματα... 157 6.2.3 Σχεδίαση εκκινητών... 157 6.2.4 Γονοτύπηση 5 μεταλλάξεων στο γονίδιο ATP7B... 157 6.2.5 Πολλαπλή ενίσχυση με αντίδραση PCR τμημάτων του γονιδίου ATP7B..... 158 6.2.6 Πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή... 158 6.2.7 Κατασκευή ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων... 159 6.2.8 Σύζευξη NH 2 -ολιγονουκλεοτιδίων με σφαιρίδια πολυστυρενίου που φέρουν στην επιφάνεια τους ομάδες -COOH... 159 6.2.9 Σήμανση των ολιγονουκλεοτιδίων ακινητοποιημένων στην επιφάνεια των σφαιριδίων πολυστυρενίου με βιοτίνη... 159 6.2.10 Σύζευξη νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα έναντι βιοτίνης... 159 6.2.11 Οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων... 160 6.2.12 Ερμηνεία των αποτελεσμάτων... 160 6.3 Αποτελέσματα και Συζήτηση... 161 11

6.3.1 Αρχή της δοκιμασίας... 161 6.3.2 Μελέτες βελτιστοποίησης αντίδρασης PEXT... 162 6.3.3 Μελέτες βελτιστοποίησης της οπτικής ανίχνευσης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων... 164 6.4 Συμπεράσματα... 168 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι... 172 7. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 175 8. ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ... 178 9. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ... 182 10. ΑΝΑΦΟΡΕΣ... 184 12

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή με θέμα: Ανάπτυξη Μεθόδων Ανίχνευσης/ Ποσοτικού Προσδιορισμού Σημειακών Μεταλλάξεων/Πολυμορφισμών με Μοριακές Τεχνικές εκπονήθηκε στο εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, στο τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών με έδρα το Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο στο Νοσοκομείο Παίδων Αγία Σοφία. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου κα Πηνελόπη Ιωάννου-Αμαραντίδου για την ανάθεση του θέματος, για την πολύτιμη καθοδήγηση της και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε σε όλα τα στάδια της ερευνητικής αυτής εργασίας, αλλά κυρίως για την ηθική υποστήριξη και τη μετάδοση της αγάπης της για την Αναλυτική Χημεία και γενικότερα την επιστήμη. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά τον κ Θεόδωρο Χριστόπουλο και την κα Ιωάννα Traeger Συνοδινού για τη συνεργασία, καθώς και για τις συμβουλές και τις διορθώσεις τους στο κείμενο της εργασίας ως μέλη της τριμελούς επιτροπής. Οφείλω επίσης, να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς επιτροπής για τις υποδείξεις τους και τη συμμετοχή τους στην επίβλεψη της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Θα ήθελα επίσης, να ευχαριστήσω το Εργαστήριο Αιματολογίας της Μονάδας Μοριακής Βιολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων για τα κλινικά δείγματα που μας παραχώρησαν στα πλαίσια της ερευνητικής εργασίας. Ευχαριστώ επίσης, θερμά τις διδάκτορες Μυρτώ Πούλου και Χριστίνα Βρεττού για τη συνεργασία μας και την επιστημονική συνεισφορά τους στην υλοποίηση της εργασίας αυτής. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στη διδάκτορα Αλεξάνδρα Ηλιάδη και τον υποψήφιο διδάκτορα Φραντζέσκο Παπανίκο για την άψογη συνεργασία μας, αλλά και για την ηθική και επιστημονική συνεισφορά τους στη διάρκεια της εργασίας αυτής. 13

Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Αμαλία Πούλα για τη συνεργασία μας, αλλά και για την πολύτιμη βοήθεια της στη διάρκεια της εργασίας αυτής, καθώς και τους αποφοιτήσαντες μεταπτυχιακούς φοιτητές Μαρία Αμβροσιάδου και Νίκο Φούντογλου. Ευχαριστώ ιδιαιτέρως, την υποψήφια διδάκτορα Στέλλα Κουλουλία για τη βοήθεια της, αλλά κυρίως για την αγάπη της. Η θετική της ενέργεια και σκέψη μου δίνει δύναμη ακόμη και τώρα που βρίσκεται μακριά. Ξεχωριστά θα αναφερθώ στη διδάκτορα Αρετή Στρατή για την αμέριστη συμπαράσταση και βοήθεια. Η ιδιαίτερη παρουσία της στο εργαστήριο κάνει τις στιγμές μοναδικές. Επίσης, ευχαριστώ τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Κατερίνα Γαλάζιου για τη συνεργασία μας το τελευταίο διάστημα. Η διακριτική και ευχάριστη παρουσία της στο εργαστήριο συνέβαλλε στο να κλείσει όμορφα ένας κύκλος. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στις συναδέλφους και φίλες μου Αθηνά Κλάδη, Έφη Κοσμίδου για τη συμπαράσταση και την ηθική υποστήριξη τους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ και όλους τους μεταπτυχιακούς φοιτητές, υποψήφιους διδάκτορες και διδάκτορες του εργαστηρίου της κας Λιανίδου για την αρμονική συνύπαρξη στο εργαστήριο. Δεν θα είχα φτάσει ποτέ ως εδώ αν δεν είχα τη στήριξη και την αγάπη των δικών μου ανθρώπων και φίλων, τους οποίους ευχαριστώ ιδιαίτερα. Ευχαριστώ πολύ τους γονείς μου, Αριστείδη και Βούλα Πετροπούλου και την αδερφή μου, Νάντια, για όλα όσα μου έχουν προσφέρει όλα αυτά τα χρόνια. 14

Κεφάλαιο 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Δοκιμασίες πλάγιας ροής Οι δοκιμασίες πλάγιας ροής (Lateral Flow Assay, LFA) ή τύπου εμβαπτιζόμενου χάρτη ή ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων αποτελούν δημοφιλή μέθοδο διεξαγωγής διαγνωστικών δοκιμασιών. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ποικιλίας αναλυτών όπως αντιγόνα ή αντισώματα, γι αυτό και ονομάστηκαν ανοσοχρωματογραφικές δοκιμασίες (Lateral Flow Immunoassay, LFIA). Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται και για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων. Η αρχή λειτουργίας της δοκιμασίας πλάγιας ροής υιοθετήθηκε από τη δοκιμασία συγκόλλησης του ελαστικού κόμμεος (Latex Agglutination Assay) που αναπτύχθηκε το 1956 από τους Plotz και Singer [1]. Την ίδια περίοδο είχε ξεκινήσει και η ανάπτυξη δοκιμασιών σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης. Ο πρώτος ραδιοανασοχημικός προσδιορισμός (RadioImmunoAssay, RIA) αναπτύχθηκε το 1950, ενώ ο ενζυμικός ανοσοπροσδιορισμός (Enzyme ImmunoAssay, EIA) εισήχθη για πρώτη φορά το 1960, επιφέροντας σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως την αντικατάσταση των ραδιοϊσοτόπων με ένζυμα, τους συντομότερους χρόνους αντίδρασης και την καλύτερη ειδικότητα. Οι δοκιμασίες πλάγιας ροής άρχισαν να εμφανίζονται στις αρχές της δεκαετίας του 1980 και καθιερώθηκαν στα τέλη της ίδιας δεκαετίας. Η κυριότερη εφαρμογή της τεχνολογίας στερεής φάσης είναι το τεστ εγκυμοσύνης, το οποίο αντιπροσωπεύει σημαντική δοκιμασία για ιατρικούς διαγνωστικούς σκοπούς. Ως αποτέλεσμα του έργου στους τομείς αυτούς, τα πρώτα προϊόντα της τεχνολογίας πλάγιας ροής εισήχθησαν στην αγορά στο τέλος της δεκαετίας του 1980 και από τότε η τεχνολογία, οι εφαρμογές της και η παραγωγή συνεχίζουν να εξελίσσονται. Από το 2006 πάνω από 200 εταιρείες σε όλο τον κόσμο παράγουν τέτοιου είδους δοκιμασίες. Η εφαρμογή 15

της τεχνολογίας έχει επεκταθεί σε τομείς όπως η κλινική διάγνωση, η κτηνιατρική, η γεωργία, τα τρόφιμα, η περιβαλλοντική ανάλυση και ασφάλεια, οι βιομηχανικές δοκιμές, καθώς και σε νεότερους τομείς όπως η μοριακή διαγνωστική και τα theranostics [2]. Η σύγχρονη γενιά δοκιμασιών πλάγιας ροής χαρακτηρίζεται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, καθώς και ευκολία στη χρήση. Η ειδικότητα και η ευαισθησία επιτυγχάνονται συνδυάζοντας τη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, τη χρήση ειδικών προς τον αναλύτη αντισωμάτων ή DNA/RNA ολιγονουκλεοτιδίων και την ειδική σήμανση του αναλύτη. 1.2. Δομή και λειτουργία ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων Οι δοκιμασίες πλάγιας ροής παρέχουν τη δυνατότητα πραγματοποίησης βιολογικών και χημικών δοκιμασιών με τρόπο εύκολο και σχετικά χαμηλού κόστους. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι δοκιμασίες αυτές έχουν μεγάλο και συνεχώς αυξανόμενο εύρος εφαρμογών. Αυτή η συναρπαστική τεχνολογία έχει σχεδόν απεριόριστες δυνατότητες. Η επιλογή των υλικών αποτελεί ένα σημαντικό κριτήριο για την επιτυχία οποιασδήποτε δοκιμασίας πλάγιας ροής με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Οι ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων αποτελούνται από τέσσερα τμήματα: το χάρτη εμβάπτισης, την περιοχή απόθεσης των συζευγμάτων και του δείγματος, τη διαγνωστική μεμβράνη ή περιοχή ανάγνωσης του σήματος, καθώς και το χάρτη απορρόφησης για την απορρόφηση του υγρού ανάπτυξης. Τα τμήματα επικαλύπτονται το ένα με το άλλο, προκειμένου να διευκολύνεται η ροή του διαλύματος ανάπτυξης, και είναι ακινητοποιημένα σε μία ειδική κάρτα, η οποία ολοκληρώνει τη συσκευή (Σχ. 1.1). Όταν εκτελείται μία δοκιμασία, το δείγμα τοποθετείται στο εγγύς άκρο της ταινίας, την περιοχή απόθεσης του δείγματος. Προηγουμένως το δείγμα υφίσταται μία επεξεργασία για να καταστεί συμβατό με τα άλλα συστατικά της δοκιμασίας. Το υγρό δείγμα ανέρχεται στην ταινία λόγω δράσεως τριχοειδών δυνάμεων και παρασύρει τα ακινητοποιημένα συζευγμένα σωματίδια από την περιοχή απόθεσης των συζευγμάτων. Τα συζευγμένα σωματίδια μπορούν τυπικά να είναι κολλοειδής χρυσός ή άνθρακας, έγχρωμα νανοσφαιρίδια latex, λιποσώματα, φθορίζοντα μόρια για 16

σύζευξη με λιποσώματα ή πρωτεΐνες, καθώς και παραμαγνητικά σωματίδια. Στις νέες τεχνολογίες σήμανσης συγκαταλέγονται οι κβαντικές κουκίδες (quantum dots) και η τεχνολογία up-converting phosphor [2, 3]. Η σύζευξη των σωματιδίων αυτών πραγματοποιείται είτε με κάποιο αντιγόνο είτε με κάποιο αντίσωμα, αναλόγως με το είδος της δοκιμασίας. Το δείγμα (σε υγρή μορφή) επαναδιαλυτοποιεί το ξηρό αντιδραστήριο σύζευξης, το οποίο ταυτόχρονα αντιδρά με τον αναλύτη, και εν συνεχεία, και τα δύο μεταφέρονται στο επόμενο τμήμα της ταινίας, που αποτελεί την καρδιά της δοκιμασίας. Το τμήμα αυτό είναι μία πορώδης μεμβράνη, πάνω στην οποία έχουν ακινητοποιηθεί (μη αντιστρεπτά) σημαντικά συστατικά της δοκιμασίας. Συνήθως, πρόκειται για αντισώματα ή αντιγόνα τα οποία έχουν αποτεθεί σε συγκεκριμένες θέσεις πάνω στη διαγνωστική μεμβράνη, με σκοπό να ακινητοποιήσουν τον αναλύτη και τα σωματίδια σύζευξης καθώς διέρχονται από τις θέσεις αυτές. Τουλάχιστον δύο ζώνες μπορούν να αποτεθούν πάνω στην ταινία, η ζώνη δοκιμασίας και η ζώνη ελέγχου. Στην ίδια ταινία είναι δυνατόν να αναλυθούν ταυτόχρονα περισσότεροι από ένας αναλύτες. Η ύπαρξη σήματος στη ζώνη ελέγχου επιβεβαιώνει τη σωστή λειτουργία του συστήματος. Η περίσσεια των αντιδραστηρίων διέρχεται από τις θέσεις ακινητοποίησης και συσσωρεύεται στην απορροφητική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται στη διαγνωστική μεμβράνη με την παρουσία ή απουσία σήματος σε συγκεκριμένες θέσεις και η ανάγνωση γίνεται είτε με γυμνό μάτι είτε με τη χρήση ειδικού οργάνου. Σχήμα 1.1. Σχηματική απεικόνιση ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων και των τμημάτων από τα οποία αποτελείται. 17

Η ανίχνευση μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο μηχανισμούς, είτε απ ευθείας, μη συναγωνιστικά (Σχ. 1.2 αριστερά), είτε συναγωνιστικά (Σχ.1.2 δεξιά). Στον απ ευθείας μηχανισμό, τα συζευγμένα σωματίδια αντιδρούν με τον αναλύτη σχηματίζοντας σύμπλοκα σωματιδίου-αναλύτη. Τα σύμπλοκα αυτά μεταφέρονται και ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιμασίας μέσω αλληλεπίδρασης του αναλύτη με συγκεκριμένα ακινητοποιημένα μόρια. Στον απ ευθείας μηχανισμό δημιουργείται δηλαδή, ένα σύμπλοκο τύπου sandwich. Στην περίπτωση του συναγωνιστικού μηχανισμού, τα συζευγμένα σωματίδια αντιδρούν με ακινητοποιημένα μόρια και στη ζώνη δοκιμασίας και στη ζώνη ελέγχου. Ως εκ τούτου, ο αναλύτης συναγωνίζεται για τις θέσεις δέσμευσης των ακινητοποιημένων μορίων στη ζώνη δοκιμασίας, με αποτέλεσμα να μην συσσωρεύονται τα σωματίδια σύζευξης στη ζώνη αυτή. Απουσία αναλύτη τα σωματίδια σύζευξης ακινητοποιούνται και στη ζώνη δοκιμασίας και στη ζώνη ελέγχου. Και οι δύο μηχανισμοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ποιοτικούς και ημιποσοτικούς προσδιορισμούς πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων. Ο απ ευθείας μηχανισμός χρησιμοποιείται στην περίπτωση ανάλυσης μεγάλων μορίων με πολλαπλούς αντιγονικούς επιτόπους, όπως είναι η β-χοριακή γοναδοτροπίνη. Στην περίπτωση αυτή, το θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύεται με την παρουσία σήματος στη ζώνη δοκιμασίας. Ο συναγωνιστικός μηχανισμός χρησιμοποιείται στην περίπτωση εξέτασης μικρών μορίων που δεν μπορούν να συνδεθούν ταυτόχρονα με δύο αντισώματα. Στην περίπτωση αυτή, το θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύεται από την απουσία σήματος στη ζώνη δοκιμασίας (Σχ. 1.2) [2]. 18

Σχήμα 1.2. Μη συναγωνιστικός (αριστερή εικόνα) και συναγωνιστικός (δεξιά εικόνα) μηχανισμός για την ανίχνευση αναλύτη με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων [2]. 1.3. Ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων Η ανάλυση ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων συνδέεται άμεσα με διάφορους τομείς, όπως η μοριακή διάγνωση ασθενειών, ο έλεγχος τροφίμων, η γεωργία, η εγκληματολογία και ο τομέας του περιβάλλοντος. Το Πρόγραμμα της αποκωδικοποίησης του Ανθρώπινου Γονιδιώματος προσέφερε τεράστιο αριθμό δεδομένων σχετικά με την αλληλουχία του DNA, και ως εκ τούτου, ξεκίνησε μία νέα εποχή ανάπτυξης δοκιμασιών που βασίζονται στην ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων. Ωστόσο, απαιτούνται μέθοδοι υψηλής προσπελασιμότητας και ευαισθησίας προκειμένου να αξιοποιηθεί η συσσωρευμένη γενετική πληροφορία. 1.3.1. Μέθοδοι ανίχνευσης προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων Για περισσότερο από δύο δεκαετίες, η ανάλυση αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων πραγματοποιούνταν με ηλεκτροφόρηση, εν συνεχεία αποτύπωση κατά Southern ή northern ταυτοχρόνως με υβριδοποίηση με ραδιενεργούς 19

ιχνηθέτες, και τέλος αυτοραδιογραφία. Αναμφισβήτητα, η τεχνολογία αυτή έχει προσφέρει τα μέγιστα στην προαγωγή της γνώσης των ιδιοτήτων των νουκλεϊκών οξέων, αλλά παραμένει μια χρονοβόρα τεχνολογία, χωρίς τη δυνατότητα αυτοματοποίησης, ενέχοντας επιπλέον κινδύνους για την υγεία λόγω της χρήσης ραδιενεργών αντιδραστηρίων. Οι τεχνικές ενίσχυσης έχουν αλλάξει τον τρόπο που πραγματοποιείται η ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), η αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης (Ligase Chain Reaction, LCR), η μέθοδος NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA) και η μέθοδος SDA (Strand Displacement Amplification) παρέχουν εκθετική ενίσχυση πολύ μικρών ποσοτήτων DNA και RNA αλληλουχιών, και ως εκ τούτου, αποτελούν σημαντικό στάδιο στις μεθόδους ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των νουκλεϊκών οξέων. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει σημαντικές προσπάθειες για την ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης των προϊόντων ενίσχυσης με PCR. Η συχνότερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος ανάλυσης των προϊόντων PCR βασίζεται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό του DNA, ακολουθούμενο από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), όπως και η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση αποτελούν αυτοματοποιημένες μεθόδους διαχωρισμού και ανίχνευσης των προϊόντων PCR. Οι τρεις μέθοδοι που αναφέρθηκαν παραπάνω ανήκουν στην κατηγορία των μη ειδικών για συγκεκριμένη αλληλουχία. Ανιχνεύονται, δηλαδή, όλα τα προϊόντα PCR, ειδικά και μη. Οι δύο τελευταίες μάλιστα, αποτελούν μεθόδους η εκτέλεση των οποίων απαιτεί τη χρήση εξειδικευμένων οργάνων. Οι δοκιμασίες υβριδισμού σε στερεά επιφάνεια έχουν αναπτυχθεί σε πολυάριθμες παραλλαγές για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων. Οι παραλλαγές αυτές αφορούν στη φύση της στερεάς επιφάνειας, την ακινητοποίηση των νουκλεϊκών οξέων πάνω σε αυτή, τον τρόπο επισήμανσης των νουκλεϊκών οξέων ή των ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών και τα χρησιμοποιούμενα συστήματα ανίχνευσης. Ωστόσο, και σε αυτές τις μεθόδους απαιτείται η χρήση ειδικού εξοπλισμού, καθώς και πολλά στάδια προσθήκης αντιδραστηρίων, επωάσεων και εκπλύσεων, προκειμένου να ακινητοποιηθεί η εξεταζόμενη αλληλουχία, να υβριδοποιηθεί με ειδικούς ανιχνευτές, να απομακρυνθεί η περίσσεια των αντιδραστηρίων και να 20

προστεθεί το κατάλληλο υπόστρωμα ώστε να γίνει η ανάγνωση του σήματος. Η κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικά για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης με PCR, τα οποία είναι επισημασμένα με φθορίζοντα μόρια και είναι ακινητοποιημένα σε σφαιρίδια πολυστυρενίου. Η κυτταρομετρία ροής είναι κατάλληλη για την ανάπτυξη πολλαπλών δοκιμασιών αλλά προϋποθέτει τη χρήση ειδικής και ακριβής οργανολογίας, καθώς και αντιδραστηρίων υψηλού κόστους. Επιπροσθέτως, έχουν αναπτυχθεί ομογενείς προσδιορισμοί για την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-time PCR) αποτελεί ένα τέτοιο παράδειγμα. Η μέθοδος βασίζεται στην ιχνηθέτηση των προϊόντων της PCR με φθορίζοντα μόρια ή χρωστικές και στη μέτρηση του παραγόμενου φθορισμού κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Η διαδικασία ακολουθεί τη γενική αρχή της συμβατικής PCR, όμως το κύριο χαρακτηριστικό της, είναι ότι το DNA που ενισχύεται, ποσοτικοποιείται καθώς συσσωρεύεται στην αντίδραση μετά από κάθε κύκλο. Η ποσοτικοποίηση λαμβάνει χώρα κατά τη λογαριθμική φάση της PCR με συσχέτιση του αριθμού των κύκλων ενίσχυσης με τον αριθμό των αντιγράφων DNA στο δείγμα. Η ανάλυση πραγματοποιείται είτε με χρήση φθοριζουσών ενώσεων παρεμβολής ή του φαινομένου μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). Ωστόσο, και στη μέθοδο αυτή απαιτείται εξειδικευμένος και υψηλού κόστους εξοπλισμός, παράλληλα με τη χρήση ακριβών αντιδραστηρίων. 1.3.2. Εφαρμογές ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων στην ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων Το αυξανόμενο ενδιαφέρον για ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων και ιδιαίτερα αυτών που στοχεύουν στο σημείο φροντίδας του ασθενούς η σε μικρά διαγνωστικά εργαστήρια, οδήγησε στη σύνδεση της τεχνολογίας ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων με την ταχύτητα και την ευκολία των δοκιμασιών πλάγιας ροής. Το κλειδί σε αυτού του τύπου τις τεχνολογίες έγκειται στην ικανότητα τους να παράγουν αποτελέσματα με υψηλή 21

ευαισθησία σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα, χωρίς τη χρήση εξειδικευμένου και υψηλού κόστους εξοπλισμού. Οι κύριες εφαρμογές των ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων για την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων αφορούν στην ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων καθώς και προϊόντων γονοτυπικών αντιδράσεων. Τα εργαστήρια Αναλυτικής Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Πατρών έχουν μια μακρά πορεία στην ανάπτυξη συστημάτων τύπου ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση, αρχικά, νουκλεϊκών οξέων και, εν συνεχεία, μεταλλάξεων και μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). Στη παρούσα διδακτορική διατριβή η ανασκόπηση της πορείας αυτής επικεντρώνεται στις εργασίες που αφορούν στην κλινική διάγνωση. Στην πρώτη εργασία που δημοσιεύθηκε το 2003 [4], αναπτύχθηκε ταινία τύπου ξηρών αντιδραστηρίων για την οπτική (δια γυμνού οφθαλμού) ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκού οξέος συνδυάζοντας ολιγονουκλεοτίδια υψηλής ειδικότητας με τις μοναδικές οπτικές ιδιότητες των νανοσφαιριδίων χρυσού ως ανιχνευτών. Πρόκειται για την πρώτη ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, στην οποία για σήμανση χρησιμοποιήθηκαν νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια (Σχ. 1.3). Σύμφωνα με την αρχή λειτουργίας της ταινίας, νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδιο (dt) x ακινητοποιούνται (αντιστρεπτά) στην περιοχή απόθεσης συζεύγματος. Βιοτινυλιωμένα προϊόντα ενίσχυσης PCR υβριδοποιούνται με ειδικό, συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο που φέρει ουρά poly(da) και, εν συνεχεία, το προϊόν υβριδοποίησης αποτίθεται σε κατάλληλη περιοχή της ταινίας (βλέπε σχήμα 1.3). Tο κάτω άκρο της ταινίας βυθίζεται σε διάλυμα ανάπτυξης και, καθώς το διάλυμα ανέρχεται, τα ξηρά νανοσφαιρίδια χρυσού επανυγροποιούνται και ταυτόχρονα υβριδοποιούνται με το DNA στόχο μέσω αλληλεπίδρασης poly(da)/(dt). Στη ζώνη δοκιμασίας έχει αποτεθεί στρεπταβιδίνη μέσω της οποίας επιτυγχάνεται η ακινητοποίηση των υβριδίων μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης/βιοτίνης σχηματίζοντας χαρακτηριστικό ερυθρό χρώμα λόγω συσσώρευσης των έγχρωμων σφαιριδίων χρυσού. Η περίσσεια των σφαιριδίων χρυσού ακινητοποιείται στη ζώνη ελέγχου, όπου βρίσκονται ακινητοποιημένα poly(da) ολιγονουκλεοτίδια. 22

Ο σχηματισμός ερυθρής ζώνης ελέγχου υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας. Η ανίχνευση DNA με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων παρουσιάζει αυξημένη ευαισθησία (~8 φορές) σε σχέση με αυτή του βρωμιούχου αιθιδίου (μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης). Σε αντίθεση με την ηλεκτροφόρηση, η δοκιμασία είναι ειδική για την συγκεκριμένη αλληλουχία καθώς περιλαμβάνει υβριδοποίηση με ειδικά για την αλληλουχία ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές. Επιπλέον, μετά από πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών δοκιμασίας και κατασκευή καμπύλης βαθμονόμησης, προέκυψαν ποσοτικά αποτελέσματα. Η ανάλυση εκτελείται χωρίς τη χρήση πολλαπλών σταδίων προσθήκης αντιδραστηρίων, επώασης και έκπλυσης της περίσσειας αυτών, που αποτελούν μειονέκτημα για άλλες σύγχρονες τεχνικές ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Ο βιοαισθητήρας εφαρμόστηκε με επιτυχία στην ανίχνευση του ιού της ηπατίτιδας C σε πλάσμα αίματος 20 ασθενών [4] καθώς και στην ανίχνευση επτά χρωμοσωμικών μεταθέσεων που σχετίζονται με την οξεία και χρόνια λευχαιμία [5]. Σχήμα 1.3. Σχηματική απεικόνιση της αρχής λειτουργίας της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος μέσω υβριδοποίησης. IP: χάρτης εμβάπτισης, CP: χάρτης απόθεσης, M: διαγνωστική μεμβράνη, AP: χάρτης απορρόφησης, S: θέση απόθεσης δείγματος, ΤΖ: ζώνη δοκιμασίας, CZ: ζώνη ελέγχου, SA: στρεπταβιδίνη, B: βιοτίνη [5]. 23

1.4. Ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) και μεταλλάξεων Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs) είναι αλλαγές μίας βάσης, οι οποίες εμφανίζονται στο ανθρώπινο γονιδίωμα με συχνότητα 1 βάσης ανά 1000 και έχουν τη δυνατότητα να επηρεάζουν τη δομή των πρωτεϊνών αλλά και το ποσοστό έκφρασης τους. Ως μετάλλαξη ορίζεται οποιαδήποτε αλλαγή στη νουκλεοτιδική αλληλουχία του γενετικού υλικού ενός οργανισμού, και προκύπτει είτε από λάθη στην αντιγραφή κατά τη διάρκεια της διαίρεσης του κυττάρου, είτε μετά από έκθεση σε υπεριώδη ή ιονίζουσα ακτινοβολία και σε χημικά μεταλλαξογόνα, είτε αυθόρμητα κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί και οι μεταλλάξεις συνιστούν μία νέα γενιά μοριακών δεικτών για τη διάγνωση ασθενειών, τη γενετική προδιάθεση και την ανταπόκριση σε ποικιλία φαρμάκων. Η ανάγκη για ανάπτυξη απλών, γρήγορων και χαμηλού κόστους μεθόδων γονοτυπικού προσδιορισμού μεταλλάξεων και SNPs ολοένα και αυξάνεται τα τελευταία χρόνια. 1.4.1. Μέθοδοι διάκρισης αλληλίων και μέθοδοι ανίχνευσης προϊόντων γονοτυπικών αντιδράσεων Μέχρι σήμερα έχει αναπτυχθεί μεγάλος αριθμός μεθόδων για την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών. Το κύριο στάδιο όλων των μεθόδων γονοτύπησης αποτελεί η ενίσχυση του τμήματος γενωμικού DNA που περιλαμβάνει την υπό εξέταση περιοχή, συνήθως μέσω αντίδρασης PCR. Ακολούθως, η διάκριση των αλληλίων πραγματοποιείται κυρίως, με τις εξής τέσσερις μεθόδους (Σχ. 1.4): Α) Αλληλοειδικός ολιγονουκλεοτιδικός υβριδισμός (Allele-Specific Oligonucleotide, ASO) (Σχ. 1.4 Α) [6]. Η μέθοδος ASO βασίζεται στην ειδική υβριδοποίηση (κάτω από αυστηρές συνθήκες) δύο ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών, ενός συμπληρωματικού στη 24

μεταλλαγμένη αλληλουχία και του άλλου στη φυσιολογική. Η τεχνική είναι αξιόπιστη και έχει χρησιμοποιηθεί σε πληθυσμούς με μία ή δύο κυρίαρχες μεταλλάξεις. Παρόλα αυτά, η μέθοδος περιορίζεται στην ανίχνευση πολλών μεταλλάξεων λόγω πολλαπλών σταδίων επώασης υβριδοποίησης και εκπλύσεων. Β) Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (Primer Extension reaction, PEXT) (Σχ. 1.4 Β) [6]. Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) είναι η πιο διαδεδομένη μέθοδος γονοτύπησης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Βασίζεται στην ακρίβεια ενσωμάτωσης των νουκλεοτιδίων από τη DNA πολυμεράση. Χρησιμοποιείται ένα εκκινητής ο οποίος υβριδοποιείται με τη πολυμορφική περιοχή και επεκτείνεται από τη DNA πολυμεράση με ένα ιχνηθετιμένο ddntp συμπληρωματικό του νουκλεοτιδίου του πολυμορφισμού. Εναλλακτικά, χρησιμοποιείται ένας αλληλοειδικός εκκινητής, το 3 άκρο του οποίου είναι συμπληρωματικό του νουκλεοτιδίου της πολυμορφικής περιοχής. Υπό τις κατάλληλες συνθήκες, επεκτείνονται μόνο οι εκκινητές των οποίων το 3 άκρο είναι απόλυτα συμπληρωματικό με την αλληλουχία στόχο. Για την αντίδραση επέκτασης εκκινητή απαιτούνται μόνο δύο ολιγονουκλεοτίδια και μπορεί εύκολα να βελτιστοποιηθεί. Γ) Αντίδραση λιγάσης (Oligonucleotide Ligation Reaction, OLR) (Σχ. 1.4 Γ) [6]. Κατά την αντίδραση λιγάσης ο DNA-στόχος υβριδοποιείται με αλληλοειδικούς ανιχνευτές, που δεσμεύονται δίπλα σε ένα κοινό ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή. Η DNA λιγάση θα ενώσει τα δύο ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας με την αλληλουχία στόχο. Η αντίδραση λιγάσης αποτελεί μέθοδο υψηλής ειδικότητας, και, αν και συνήθως απαιτούνται δύο ξεχωριστές αντιδράσεις λιγάσης για τη γονοτύπηση των δύο αλληλίων, έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι στις οποίες επιτυγχάνεται ταυτόχρονη ανίχνευση των δύο αλληλίων σε μία αντίδραση. Δ) Invasive Cleavage (Σχ. 1.4 Δ) [6]. Κατά την αντίδραση αυτή ένας downstream ολιγονουκλεοτιδικός ανιχνευτής κόβεται και το ακριβές σημείο πέψης εξαρτάται από το βαθμό επικάλυψης με το upstream ολιγονουκλεοτίδιο. Η πέψη επιτυγχάνεται με τη χρήση ειδικών 25

ενδονουκλεασών, οι οποίες αναγνωρίζουν και κόβουν δομές που σχηματίζονται όταν δύο ολιγονουκλεοτίδια που επικαλύπτονται, υβριδοποιούνται στο μονόκλωνο DNA-στόχο. Η πέψη αυτή είναι αρκετά ειδική, ώστε να καταστεί δυνατή η διάκριση της διαφοράς μίας βάσης και να γίνει η διαφοροποίηση μεταξύ ομοζυγωτών και ετεροζυγωτών για συγκεκριμένες μεταλλάξεις σε συγκεκριμένα γονίδια στο γενωμικό DNA. Γενικά, οι ενζυμικές μέθοδοι ανίχνευσης των δύο αλληλίων (OLR, PEXT) εφαρμόζονται πιο εύκολα σε σχέση με εκείνες που περιλαμβάνουν υβριδοποίηση με αλληλο-ειδικά ολιγονουκλεοτίδια. Τα προϊόντα των αντιδράσεων διαχωρισμού των αλληλίων μπορούν να ανιχνευθούν με πολλές μεθόδους, όπως η ηλεκτροφόρηση, η φθορισμομετρία πολωμένου φωτός (Fluorescence Polarization, FP), το φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), η κυτταρομετρία ροής, η φασματοσκοπία μάζας MALDI-TOF, οι δοκιμασίες σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης με χρήση χημειοφωταύγειας και η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών. Εν τούτοις, για όλες τις προαναφερθείσες τεχνικές απαιτείται εξειδικευμένος εξοπλισμός και αντιδραστήρια υψηλού κόστους. Επιπροσθέτως, οι περισσότερες από τις μεθόδους αυτές περιλαμβάνουν καθαρισμό του προϊόντος ενίσχυσης PCR πριν την αντίδραση διαχωρισμού των αλληλίων ή πριν την ανίχνευση τους, ενώ άλλες περιλαμβάνουν πολλά στάδια επωάσεων και εκπλύσεων. Τα τελευταία χρόνια, υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη απλών μεθόδων γονοτύπησης χαμηλού κόστους για την εφαρμογή τους σε κλινικά εργαστήρια ρουτίνας ή στο σημείο φροντίδας του ασθενούς (Point Of Care Testing, POCT). 26

Σχήμα 1.4. Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων διάκρισης των αλληλίων [6]. 1.4.2. Εφαρμογές ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων στην ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών και μεταλλάξεων Η κλινική εφαρμογή της γενετικής πληροφορίας στην ατομική φροντίδα υγείας απαιτεί απλή και γρήγορη ανίχνευση των νουκλεοτιδικών αλλαγών. Στον τομέα των ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων ο αριθμός των εφαρμογών για την ανίχνευση πολυμορφισμών και μεταλλάξεων είναι περιορισμένος. Οι μέθοδοι των εφαρμογών αυτών περιλαμβάνουν γονοτυπική αντίδραση για τη διάκριση των αλληλίων και ανίχνευση των προϊόντων της γονοτυπικής αντίδρασης με 27

ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων. Ακολουθεί σύντομη περιγραφή της αρχής των μεθόδων και των εφαρμογών τους. Στη μέθοδο συναγωνιστικής υβριδοποίησης μέσω αλληλο-ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων (CASSOH, Competitive Allele-Specific Short Oligonucleotide Hybridization), υιοθετείται η αρχή της μεθόδου υβριδοποίησης με αλληλο-ειδικά ολιγονουκλεοτίδια (ASO) για τη διάκριση των αλληλίων σε συνδυασμό με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση αυτών [7, 8]. Η βασική αρχή της μεθόδου παρουσιάζεται στο σχήμα 1.5. Η περιοχή του γονιδιώματος που περιέχει τις πολυμορφικές θέσεις ή τις μεταλλάξεις που εξετάζονται ενισχύεται με αντίδραση PCR με ένα ζεύγος εκκινητών, ο ένας εκ των οποίων είναι επισημασμένος με διγοξιγενίνη στο 5 άκρο του. Πραγματοποιούνται δύο αντιδράσεις PCR για κάθε δείγμα. Το μίγμα της αντίδρασης PCR περιέχει επίσης, ένα ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών. Χρησιμοποιούνται δύο ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ένα για κάθε αντίδραση PCR. Το ένα ζεύγος χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του φυσιολογικού αλληλίου. Περιέχει ένα ολιγονουκλεοτίδιο συμπληρωματικό στο φυσιολογικό αλλήλιο, επισημασμένο με βιοτίνη στο 3 άκρο του, και ένα μη επισημασμένο, συμπληρωματικό στο μεταλλαγμένο αλλήλιο (αντίδραση Α). Αντιθέτως, το άλλο ζεύγος αποτελείται από ένα ολιγονουκλεοτίδιο συμπληρωματικό στο μεταλλαγμένο αλλήλιο, επισημασμένο με βιοτίνη στο 3 άκρο του, και ένα μη επισημασμένο, συμπληρωματικό στο φυσιολογικό αλλήλιο (αντίδραση Β). Το μη επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο λειτουργεί συναγωνιστικά στην υβριδοποίηση. Από την PCR αντίδραση Α, παρουσία μεταλλαγμένου DNA, προκύπτει προϊόν επισημασμένο με διγοξιγενίνη και υβριδοποιημένο με μη επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτή (Σχ. 1.5 (α), αριστερό τμήμα, στάδιο 1). Από την αντίδραση Β, παρουσία πάλι μεταλλαγμένου DNA, προκύπτει προϊόν επισημασμένο με διγοξιγενίνη και ταυτόχρονα επισημασμένο με βιοτίνη, εξαιτίας της υβριδοποίησης με συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτή (Σχ. 1.5 (α), δεξιό τμήμα, στάδιο 1). Τα προϊόντα των αντιδράσεων ανιχνεύονται σε ταινίες, οι οποίες περιέχουν μία ζώνη δοκιμασίας με ακινητοποιημένη στρεπταβιδίνη. Για την ανίχνευση χρησιμοποιούνται νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι διγοξιγενίνης. Τα νανοσφαιρίδια χρυσού, ανεξαρτήτως γονότυπου, 28

συνδέονται με το προϊόν μέσω αλληλεπίδρασης απτενίου-αντισώματος. Ωστόσο, η ακινητοποίηση του προϊόντος στη ζώνη δοκιμασίας της ταινίας εξαρτάται από την παρουσία συμπληρωματικού ολιγονουκλεοτιδίου-ανιχνευτή επισημασμένου με βιοτίνη και, συνεπώς, από την παρουσία μεταλλαγμένου ή μη DNA στόχου (Σχ. 1.5 (α), στάδιο 2). Ο γονότυπος του δείγματος προσδιορίζεται από την παρουσία ή την απουσία έγχρωμης γραμμής σε κάθε ταινία για τις αντιδράσεις Α και Β. Η όλη διαδικασία της δοκιμασίας παρουσιάζεται στο σχήμα 1.5 (β). Η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών στα γονίδια G6PC, ACADM, GLDC, NAT2, TPMT, UGT1A1 και στο μιτοχονδριακό DNA. Σχήμα 1.5. Βασική αρχή και πειραματική διαδικασία της μεθόδου CASSOH με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. (α): Αντίδραση Α για την ανίχνευση φυσιολογικής αλληλουχίας (αριστερά). Αντίδραση Β για την ανίχνευση μεταλλαγμένης αλληλουχίας (δεξιά). Τα τρίγωνα συμβολίζουν τη θέση του πολυμορφισμού. Dig: διγοξιγενίνη, Β: βιοτίνη, GP: νανοσωματίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι διγοξιγενίνης. (β): Η μέθοδος CASSOH αποτελείται από δύο στάδια. Το δείγμα υποβάλλεται στην αντίδραση Α και Β (στάδιο 1). Κάθε προϊόν της αντίδρασης Α και Β αποτίθεται σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και προσδιορίζεται ο γονότυπος από την παρουσία ή μη έγχρωμης γραμμής στη ζώνη δοκιμασίας (στάδιο 2) [7]. 29

Στην εργασία των He et al. για την ανίχνευση σημειακών πολυμορφισμών, συνδυάστηκαν ολιγονουκλεοτίδια-φουρκέτες υψηλής ειδικότητας με τις μοναδικές οπτικές ιδιότητες των νανοσφαιριδίων χρυσού για την ανάπτυξη ταινίας τύπου ξηρών αντιδραστηρίων [9]. Ολιγονουκλεοτίδια-φουρκέτες τροποποιημένα με θειόλη στο 5 άκρο τους και με βιοτίνη στο 3 άκρου τους συζεύχθηκαν με νανοσφαιρίδια χρυσού. Ακολούθησε μία διαδικασία κάλυψης των κενών θέσεων της επιφάνειας των νανοσφαιριδίων χρυσού με datp. Η δομή φουρκέτας του ολιγονουκλεοτιδίου μαζί με τα δεοξυνουκλεοτίδια datp παρεμποδίζουν την επαφή άλλων μορίων με τις ομάδες βιοτίνης, οι οποίες είναι σε στενή γειτνίαση με την επιφάνεια των νανοσφαιριδίων χρυσού, καθιστώντας τις, έτσι, ανενεργές. Η επιτυχία της ανίχνευσης σημειακών πολυμορφισμών βασίζεται στις μοναδικές ιδιότητες αναγνώρισης και υβριδοποίησης του ολιγονουκλεοτιδίου-ανιχνευτή με το απόλυτα συμπληρωματικό DNA και το DNA με αλλαγή μιας βάσης, τα οποία δημιουργούν διαφορετικές ποσότητες ενεργών ομάδων βιοτίνης στην επιφάνεια των νανοσφαιριδίων χρυσού. Μετά τις αντιδράσεις υβριδοποίησης, τα νανοσφαιρίδια χρυσού με τις ενεργοποιημένες ομάδες βιοτίνης ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιμασίας μέσω αλληλεπίδρασης των ενεργοποιημένων ομάδων βιοτίνης με την ακινητοποιημένη στρεπταβιδίνη. Η συσσώρευση των νανοσφαιριδίων χρυσού προσδίδει χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα στις ζώνες, επιτρέποντας την οπτική ανίχνευση της ύπαρξης ή μη των πολυμορφισμών (Σχ. 1.6). 30

Σχήμα 1.6. Σχηματική απεικόνιση της αρχής οπτικής ανίχνευσης σημειακών πολυμορφισμών με ολιγονουκλεοτίδια-φουρκέτες συζευγμένων με νανοσφαιρίδια χρυσού και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Αριστερά: ενεργοποίηση ομάδων βιοτίνης μέσω υβριδοποίησης της αλληλουχίας στόχου με τα ολιγονουκλεοτίδια-φουρκέτες στην επιφάνεια των νανοσφαιριδίων χρυσού. Δεξιά: ακινητοποίηση των νανοσφαιριδίων χρυσού στη ζώνη δοκιμασίας μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνηςβιοτίνης. Μεταγενέστερα, από την ίδια ομάδα εφαρμόστηκε η ίδια μέθοδος με τη διαφορά ότι σχεδιάστηκε ένα ολιγονουκλεοτίδιο-φουρκέτα με δύο σημεία πρόσδεσης του DNA-στόχου στη θηλιά και στέλεχος με 11 βάσεις έναντι 7 που ήταν στην προηγούμενη εφαρμογή (Σχ. 1.7). Η αλλαγή αυτή οδήγησε σε αύξηση του λόγου σήματος προς υπόβαθρο της ανίχνευσης των σημειακών πολυμορφισμών μέσω δραματικής αύξησης της ειδικότητας και της σταθερότητας του ολιγονουκλεοτιδίου-φουρκέτα [10]. 31

Σχήμα 1.7. (Α) Η δομή του ολιγονουκλεοτιδίου-φουρκέτα με το βραχύ στέλεχος. (Β) Η δομή του νέου ολιγονουκλεοτιδίου-φουρκέτα με τα δύο σημεία πρόσδεσης του DNAστόχου στη θηλιά και το στέλεχος με 11 βάσεις. Οι βάσεις με μαύρο είναι οι μη συμπληρωματικές θέσεις με το φυσιολογικό DNA και οι έντονες, διπλές γραμμές στη θηλιά υποδεικνύουν την αρχή και το τέλος του σημείου πρόσδεσης του DNA-στόχου. (Γ) Η δομή του σχηματισμένου συμπλόκου ολιγονουκλεοτίδιο-φουρκέτα με το DNAστόχο. (Δ) Σχηματική απεικόνιση των ακινητοποιημένων νανοσφαιριδίων χρυσού στη ζώνη δοκιμασίας της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. (Ε) Σχηματική απεικόνιση των ακινητοποιημένων νανοσφαιριδίων χρυσού στη ζώνη ελέγχου της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. (ΣΤ) Σχηματική απεικόνιση των ακινητοποιημένων νανοσφαιριδίων χρυσού στη ζώνη δοκιμασίας της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων παρουσία φυσιολογικού DNA. SA: στρεπταβιδίνη, Au: νανοσφαιρίδια χρυσού [10]. Το 2007 αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από την ομάδα του εργαστηρίου μας, ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση προϊόντων γονοτύπησης χωρίς τη χρήση ειδικών οργάνων [11]. Η μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) για τη διάκριση των αλληλίων. Αρχικά, οι περιοχές των γονιδίων που περιλαμβάνουν τους υπό εξέταση πολυμορφισμούς ενισχύονται με αντίδραση PCR. Στη συνέχεια, τα προϊόντα ενίσχυσης υποβάλλονται σε δύο αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία για το 32

φυσιολογικό και μία για το μεταλλαγμένο αλλήλιο. Κάθε εκκινητής φέρει στο 5 άκρο του ολιγονουκλεοτίδιο (da) x και διαφέρει από τον άλλο εκκινητή μόνο στο τελευταίο νουκλεοτίδιο του 3 άκρου του. Η επέκταση των εκκινητών συνοδεύεται από την ενσωμάτωση δεοξυνουκλεοτιδίων επισημασμένων με βιοτίνη (biotin-dutp). Τα αποδιατεταγμένα προϊόντα επέκτασης αποτίθενται στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων δίπλα στα νανοσφαιρίδια χρυσού που είναι συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδιο (dτ) x. Χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές ταινίες, μία για κάθε αλλήλιο. Ακολούθως η ταινία εμβαπτίζεται στο κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης. Εξαιτίας τριχοειδών δυνάμεων το διάλυμα ανέρχεται της ταινίας, επιτρέποντας την υβριδοποίηση poly(da)/(dt), και, συνεπώς, τη σύνδεση των προϊόντων PEXT με τα νανοσφαιρίδια χρυσού. Τα υβρίδια μετακινούνται κατά μήκος της ταινίας και διέρχονται από τη ζώνη δοκιμασίας, όπου βρίσκεται ακινητοποιημένη στρεπταβιδίνη. Σε περίπτωση επέκτασης του εκκινητή, τα υβρίδια ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιμασίας μέσω αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης, σχηματίζοντας ερυθρή γραμμή από τη συσσώρευση των νανοσφαιριδίων χρυσού. Σε περίπτωση μη επέκτασης του εκκινητή, η υβριδοποίηση da/dt πραγματοποιείται αλλά τα υβρίδια δεν ακινητοποιούνται μέσω στρεπταβιδίνης στη ζώνη δοκιμασίας, οπότε και δεν συσσωρεύονται τα νανοσφαιρίδια χρυσού για την παραγωγή κόκκινου χρώματος. Στη συνέχεια, το μίγμα της αντίδρασης διέρχεται από τη ζώνη ελέγχου, όπου η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού, δεσμεύεται από το ακινητοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο (da) x σχηματίζοντας μία δεύτερη κόκκινη γραμμή. Η εμφάνιση κόκκινης γραμμής στη ζώνη ελέγχου υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας (Σχ. 1.8). Η μέθοδος εφαρμόστηκε για την ανίχνευση 6 πολυμορφισμών στο γονίδιο MBL2 (λεκτίνη δεσμευτική της μαννόζης), χρησιμοποιώντας γενωμικό DNA από 27 ασθενείς (74 πολυμορφικές θέσεις) [11]. Η ίδια μέθοδος εφαρμόστηκε και για την ανίχνευση 5 πολυμορφισμών στα γονίδια CYP2D6, CYP2C19 και TPMT [12]. Η μέθοδος αξιολογήθηκε με τη γονοτύπηση 76 πολυμορφικών θέσεων. 33

Σχήμα 1.8. Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου ανίχνευσης SNPs με γονοτυπική αντίδραση PEXT και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η μέθοδος περιλαμβάνει: α) απομόνωση γενωμικού DNA, β) εκθετική ενίσχυση των εξεταζόμενων τμημάτων με PCR, γ) γονοτυπική αντίδραση PEXT των προϊόντων ενίσχυσης, παρουσία φυσιολογικού ή μεταλλαγμένου εκκινητή και δ) οπτική ανίχνευση των προϊόντων PEXT με νανοσφαιρίδια χρυσού σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων [12]. Μεταγενέστερα, αναπτύχθηκε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση προϊόντων γονοτύπησης, που βασίζεται στην αντίδραση λιγάσης (OLR) [13]. Η αντίδραση λιγάσης χαρακτηρίζεται από υψηλή εξειδίκευση, εξαιτίας του γεγονότος ότι υπάρχουν δύο περιοχές αναγνώρισης της περιοχής του πολυμορφισμού. Η μία είναι η περιοχή που υβριδοποιείται ο αλληλο-ειδικός ανιχνευτής και η δεύτερη μία παρακείμενη περιοχή που υβριδοποιείται ένας κοινός ανιχνευτής στην αλληλουχία στόχο. Η ανίχνευση των προϊόντων γίνεται με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και χρήση νανοσωματιδίων χρυσού ως ιχνηθετών. Πιο συγκεκριμένα, προϊόντα ενίσχυσης PCR που περικλείουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις υποβάλλονται σε δύο αντιδράσεις λιγάσης. Το μίγμα της αντίδρασης λιγάσης περιέχει έναν βιοτινυλιωμένο κοινό ανιχνευτή και έναν αλληλο-ειδικό ανιχνευτή που φέρει στο 3 άκρο του ουρά (da) 20. Η θερμοσταθερή λιγάση συνδέει τα δύο γειτονικά ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας με την αλληλουχίαστόχο. Τα προϊόντα της αντίδρασης λιγάσης αποδιατάσσονται και αποτίθενται στην ταινία. Καθώς το διάλυμα ανάπτυξης ανέρχεται, τα προϊόντα της αντίδρασης λιγάσης που έχουν υβριδοποιηθεί με νανοσωματίδια χρυσού συζευγμένα με (dt) x αλληλεπιδρούν με τη στρεπταβιδίνη και ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιμασίας. Η συσσώρευση των νανοσφαιριδίων χρυσού δίνει χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού δεσμεύεται στη ζώνη ελέγχου, οπότε και σχηματίζεται δεύτερη κόκκινη 34

γραμμή (Σχ. 1.9). Η μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς στην ανίχνευση τεσσάρων πολυμορφισμών στα γονίδια CYP2D6, CYP2C19 σε σειρά κλινικών δειγμάτων. Σχήμα 1.9. Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου γονοτύπησης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών με αντίδραση OLR και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Τα ενισχυμένα με PCR τμήματα υποβάλλονται σε δύο αντιδράσεις λιγάσης, χρησιμοποιώντας έναν βιοτινυλιωμένο κοινό ανιχνευτή (C) και έναν αλληλο-ειδικό ανιχνευτή, φυσιολογικό (Ν) ή μεταλλαγμένο (Μ). Κάθε αλληλο-ειδικός ανιχνευτής περιέχει ουρά poly(da) στο 3 άκρο του. Μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας η λιγάση ενώνει τα δύο παρακείμενα ολιγονουκλεοτίδια. Τα προϊόντα της αντίδρασης λιγάσης ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιμασίας στρεπταβιδίνης (TZ) και υβριδοποιούνται με poly(dt) νανοσφαιρίδια χρυσού. Η συσσώρευση των νανοσφαιριδίων δίνει χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων ακινητοποιείται στη ζώνη ελέγχου (CZ) της ταινίας μέσω υβριδοποίησης με ολιγονουκλεοτίδια poly(da) [13]. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι μέθοδοι ανίχνευσης μεταλλάξεων και πολυμορφισμών περιλαμβάνουν αρχικά το στάδιο ενίσχυσης της περιοχής που εξετάζεται, στη συνέχεια, το στάδιο διάκρισης των αλληλίων με κάποια από τις μεθόδους γονοτύπησης και τέλος την ανίχνευση των προϊόντων γονοτύπησης. Συνήθως, η διάκριση των αλληλίων πραγματοποιείται μετά την ενίσχυση της εξεταζόμενης περιοχής. Στην επόμενη εργασία [14], με γνώμονα την απλοποίηση της μεθόδου, αλλά και τους συντομότερους χρόνους 35

αντίδρασης, εφαρμόσθηκε η μέθοδος PCR με τέσσερις εκκινητές, κατά την οποία η διάκριση των αλληλίων πραγματοποιείται ταυτόχρονα με την ενίσχυση της εξεταζόμενης περιοχής. Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με τη χρήση ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (διά γυμνού οφθαλμού) χωρίς τη χρήση ειδικών οργάνων. Αναλυτικότερα, στην πρώτη φάση της ενίσχυσης, με ένα ζεύγος εξωτερικών εκκινητών ενισχύεται η περιοχή, στην οποία βρίσκονται οι εξεταζόμενοι πολυμορφισμοί. Η δεύτερη φάση της ενίσχυσης πραγματοποιείται σε χαμηλότερη θερμοκρασία υβριδοποίησης, όπου οι εσωτερικοί αλληλο-ειδικοί εκκινητές υβριδοποιούνται σε αντίθετους κλώνους. Οι εσωτερικοί εκκινητές ζευγαρώνουν με τους εξωτερικούς εκκινητές και καθοδηγούν την ενίσχυση σε δύο κατευθύνσεις, δημιουργώντας μικρά αλληλο-ειδικά τμήματα. Οι εσωτερικοί εκκινητές έχουν σχεδιαστεί με μία μη συμπληρωματική βάση στο 3 άκρο τους και ένα μόριο βιοτίνης στο 5 άκρο τους. Τα βιοτινυλιωμένα προϊόντα υβριδοποιούνται με ανιχνευτές που φέρουν ουρά poly(da), και στη συνέχεια, αποτίθενται στη ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, το κάτω άκρο της οποίας βυθίζεται στο διάλυμα ανάπτυξης. Χρησιμοποιούνται δύο ανιχνευτές, ο ένας συμπληρωματικός στο φυσιολογικό αλλήλιο και ο δεύτερος συμπληρωματικός στο μεταλλαγμένο αλλήλιο. Καθώς το διάλυμα ανάπτυξης ανέρχεται στην ταινία, τα υβρίδια ακινητοποιούνται μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης στη ζώνη δοκιμασίας και αλληλεπιδρούν με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια (dt) σχηματίζοντας χαρακτηριστική κόκκινη ζώνη. Ακόμη μία κόκκινη γραμμή σχηματίζεται στη ζώνη ελέγχου, υποδεικνύοντας τη σωστή λειτουργία της ταινίας (Σχ. 1.10). Συμπερασματικά, εκτός του ότι πρόκειται για ένα πρωτόκολλο σύντομο και εξαιρετικά απλό, με τη χρήση της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων γίνεται επιβεβαίωση της αλληλουχίας κάτι που δεν επιτυγχάνεται με την ηλεκτροφόρηση που χρησιμοποιείται συνήθως για την ανίχνευση των προϊόντων ενίσχυσης. Η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανίχνευση δύο πολυμορφισμών στα γονίδια CYP2C19 και CYP2D6 του κυτοχρώματος P450 και αξιολογήθηκε με τη γονοτύπηση συνολικά 104 δειγμάτων. 36

Σχήμα 1.10. Σχηματική αναπαράσταση της ανίχνευσης πολυμορφισμών με αντίδραση PCR με τέσσερις εκκινητές και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Γενωμικό DNA ενισχύεται με PCR με τη χρήση τεσσάρων εκκινητών, δύο εξωτερικών και δύο εσωτερικών, βιοτινυλιωμένων στο 5 άκρο τους. Με τους εξωτερικούς εκκινητές (ExU και ExD) ενισχύεται η περιοχή που περιέχει τους εξεταζόμενους πολυμορφισμούς. Οι εσωτερικοί εκκινητές (InN και InM), ειδικοί είτε για το N είτε για το Μ αλλήλιο, ζευγαρώνουν με τους εκκινητές ExU και ExD αντίστοιχα, ώστε να παράγουν δύο μικρότερα προϊόντα (Ν-product και/ή M-product), ανάλογα με τα αλληλόμορφα που υπάρχουν στο δείγμα. Τα προϊόντα υβριδοποιούνται με ειδικούς ανιχνευτές που φέρουν ουρά poly(da) στο 3 άκρο τους. Τα υβρίδια ακινητοποιούνται μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης στη ζώνη δοκιμασίας και αλληλεπιδρούν με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με poly(dt) σχηματίζοντας χαρακτηριστική κόκκινη ζώνη. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων ακινητοποιείται μέσω αλληλεπίδρασης με poly(da) στη ζώνη ελέγχου, σχηματίζοντας δεύτερη κόκκινη ζώνη [14]. Β:Βιοτίνη, SA: Στρεπταβιδίνη, CZ: Ζώνη ελέγχου, TZ: Ζώνη δοκιμασίας. Στην πορεία, το ενδιαφέρον εστιάστηκε στην ταυτόχρονη ανίχνευση των δύο αλληλίων με τη χρήση μόνο μίας ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων και αυτό επετεύχθη στην εργασία των Konstantou et al. [15]. Η διάκριση των αλληλίων βασίζεται και εδώ στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) και η ανίχνευση πραγματοποιείται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια-(dt). Ειδικότερα, η ενισχυμένη DNA περιοχή που περιέχει 37

τις υπό εξέταση μεταλλάξεις, υποβάλλεται σε δύο αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία για κάθε αλλήλιο. Κατά την επέκταση, δεοξυνουκλεοτίδια επισημασμένα με διγοξιγενίνη (Digoxigenin-dUTP) ενσωματώνονται στο επεκταμένο τμήμα με το φυσιολογικό αλλήλιο και δεοξυνουκλεοτίδια επισημασμένα με βιοτίνη (biotin-dutp) στο επεκταμένο τμήμα με το μεταλλαγμένο αλλήλιο. Ολιγονουκλεοτίδιο-(dA) περιέχεται στο 5 άκρο των αλληλο-ειδικών εκκινητών. Τα προϊόντα της αντίδρασης PEXT αποτίθενται στην περιοχή απόθεσης του δείγματος στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, η οποία στη συνέχεια, βυθίζεται στο διάλυμα ανάπτυξης. Τα προϊόντα επέκτασης για το κάθε αλλήλιο ακινητοποιούνται στις αντίστοιχες ζώνες δοκιμασίας, μέσω αλληλεπίδρασης αντιγόνου-αντισώματος (digoxigenin/antidigoxigenin) και μέσω αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης. Οι ουρές poly(da) των προϊόντων επέκτασης υβριδοποιούνται με τις ουρές poly(dt) των νανοσφαιριδίων χρυσού δημιουργώντας χαρακτηριστικές κόκκινες γραμμές. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού ακινητοποιείται στη ζώνη ελέγχου της ταινίας (Σχ. 1.11). Η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανίχνευση δύο πολυμορφισμών στον Toll-like υποδοχέα 4 (TLR4), έναν πολυμορφισμό στο γονίδιο CYP2C19 και έναν πολυμορφισμό στο γονίδιο TPMT. 38

Σχήμα 1.11. Σχηματική απεικόνιση της αρχής λειτουργίας της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων διπλής ανίχνευσης. Το ενισχυμένο τμήμα που περιέχει τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις υποβάλλεται σε δύο αντιδράσεις PEXT με φυσιολογικό και μεταλλαγμένο εκκινητή. Διγοξιγενίνη και βιοτίνη αντίστοιχα, ενσωματώνονται κατά την επέκταση του κάθε εκκινητή. Οι εκκινητές περιέχουν στο 5 άκρο τους ουρά poly(da). Το φυσιολογικό και το μεταλλαγμένο επεκταμένο προϊόν ακινητοποιείται στις ζώνες Τ1 και Τ2 από αντίσωμα έναντι διγοξιγενίνης και από στρεπταβιδίνη αντίστοιχα. Το polya τμήμα των εκκινητών υβριδοποιείται με το poly(dt) τμήμα των νανοσφαιριδίων χρυσού σχηματίζοντας χαρακτηριστικές κόκκινες γραμμές. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού ακινητοποιείται από ολιγονουκλεοτίδια d(a) στη ζώνη ελέγχου της ταινίας [15]. Au: νανοσφαιρίδια χρυσού, S: απόθεση δείγματος, Τ1: ζώνη δοκιμασίας φυσιολογικού αλληλίου, Τ2: ζώνη δοκιμασίας μεταλλαγμένου αλληλίου, C: ζώνη ελέγχου, D: διγοξιγενίνη, Β: βιοτίνη, SA: στρεπταβιδίνη. Ταινία ξηρών αντιδραστηρίων διπλής οπτικής ανίχνευσης αναπτύχθηκε και από τους Toubanaki et al. (2009), σε συνδυασμό με την αντίδραση λιγάσης για την ανίχνευση σημειακών πολυμορφισμών. Στην εργασία αυτή αναπτύχθηκε μία εντελώς διαφορετική μορφή βιοαισθητήρα, συγκριτικά με τη μέθοδο που είχε αναπτυχθεί στο παρελθόν, όπου απαιτούνταν δύο ξεχωριστές αντιδράσεις λιγάσης και χρήση δύο βιοαισθητήρων, ένας για την ανίχνευση κάθε αλληλίου. Με τον βιοαισθητήρα αυτό είναι δυνατή η ταυτόχρονη οπτική ανίχνευση και των δύο αλληλίων, τα οποία προκύπτουν από μία μοναδική αντίδραση λιγάσης. Η αρχή της δοκιμασίας είναι η εξής: μετά την ενίσχυση με PCR του τμήματος που εξετάζεται, πραγματοποιείται μία 39

αντίδραση λιγάσης παρουσία ενός κοινού βιοτινυλιωμένου ανιχνευτή και δύο αλληλο-ειδικών επισημασμένων με τα απτένια διγοξιγενίνη και φλουορεσκεΐνη. Επομένως, τα προϊόντα που προκύπτουν από την αντίδραση λιγάσης και αντιστοιχούν στο φυσιολογικό και στο μεταλλαγμένο αλλήλιο είναι διπλά επισημασμένα με βιοτίνη και, είτε με διγοξιγενίνη είτε με φλουορεσκεΐνη αντίστοιχα. Τα προϊόντα ακινητοποιούνται από αντισώματα έναντι διγοξιγενίνης ή φλουορεσκεΐνης, τα οποία είναι ακινητοποιημένα στις δύο ζώνες δοκιμασίας της ταινίας και αλληλεπιδρούν με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων δεσμεύεται από βιοτινυλιωμένη αλβουμίνη που είναι ακινητοποιημένη στη ζώνη ελέγχου του βιοαισθητήρα. Η εμφάνιση χαρακτηριστικών ερυθρών γραμμών στις ζώνες δοκιμασίας επιβεβαιώνει το γονότυπο (Σχ. 1.12). Η συγκεκριμένη ταινία εφαρμόστηκε επιτυχώς στη γονοτύπηση του σημειακού πολυμορφισμού T387C του γονιδίου του βήτα-3 αδρενεργικού υποδοχέα (Beta-3-Adrenegic Receptors, ADRB3) [16]. Σχήμα 1.12. Αρχή γονοτύπησης πολυμορφισμών με αντίδραση λιγάσης και οπτική ανίχνευση και των δύο αλληλόμορφων μέσω μίας ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Μετά την ενίσχυση με αντίδραση PCR, πραγματοποιείται μία αντίδραση λιγάσης με τη χρήση ενός κοινού βιοτινυλιωμένου ανιχνευτή (C) και δύο αλληλο-ειδικούς ανιχνευτές (Ν και Μ) επισημασμένους με διγοξιγενίνη (D) και φλουορεσκεΐνη (F), αντίστοιχα. Τα προϊόντα λιγάσης που αντιστοιχούν στο φυσιολογικό (B-CN-D) και στο μεταλλαγμένο αλλήλιο (B-CM-F) είναι διπλά επισημασμένα. Ακινητοποιούνται στις ζώνες δοκιμασίας μέσω αντισωμάτων έναντι διγοξιγενίνης (anti-d) ή φλουορεσκεΐνης (anti-f) και ανιχνεύονται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Η 40

περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού δεσμεύεται από βιοτινυλιωμένη αλβουμίνη (BSA), ακινητοποιημένη στη ζώνη ελέγχου της ταινίας [16]. Η ταινία διπλής οπτικής ανίχνευσης εφαρμόστηκε και για την ανίχνευση της επίκτητης σωματικής μετάλλαξης JAK2V617F [17]. Η μέθοδος περιλαμβάνει αλληλο-ειδική PCR με τρεις εκκινητές για την ενίσχυση τμημάτων του γονιδίου JAK2 και οπτική ανίχνευση των προϊόντων με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η PCR πραγματοποιείται παρουσία ενός 5 εκκινητή, ενός 3 εξωτερικού εκκινητή επισημασμένου με βιοτίνη και ενός 3 εσωτερικού εκκινητή επισημασμένου με διγοξιγενίνη. Σε κάθε περίπτωση σχηματίζεται το εξωτερικό μεγάλο τμήμα, το οποίο είναι επισημασμένο με βιοτίνη. Το μικρότερο τμήμα σχηματίζεται μόνο παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλίου στο δείγμα. Τα ενισχυμένα προϊόντα υβριδοποιούνται με δύο ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές S και L που περιέχουν ουρά poly(da) στο 3 άκρο τους. Το μείγμα αποτίθεται στην ταινία, η οποία στη συνέχεια, βυθίζεται στο κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης. Τα ενισχυμένα τμήματα, μικρό S και μεγάλο L, ακινητοποιούνται στην ταινία σε διαφορετικές ζώνες (T1 και T2) από ακινητοποιημένο αντίσωμα έναντι διγοξιγενίνης και από στρεπταβιδίνη, αντίστοιχα. Έτσι, ο διαχωρισμός των S και L προϊόντων πραγματοποιείται κατά μήκος της ταινίας. Νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδιο (dt) υβριδοποιούνται με τις ουρές poly(da) των ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών και σχηματίζουν χαρακτηριστικές κόκκινες γραμμές. Η παρουσία κόκκινης γραμμής στη ζώνη δοκιμασίας Τ1 υποδεικνύει την παρουσία της μετάλλαξης JAK2V617F. Εάν εμφανίζεται κόκκινη γραμμή μόνο στη ζώνη T2, τότε το μεταλλαγμένο αλλήλιο δεν υπάρχει στο συγκεκριμένο δείγμα. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού ακινητοποιείται στη ζώνη ελέγχου μέσω υβριδοποίησης με ολιγονουκλεοτίδια (da), επιβεβαιώνοντας τη σωστή λειτουργία της ταινίας (Σχ.1.13). Εξαιτίας του ότι εξετάζεται μία επίκτητη σωματική μετάλλαξη, η οποία ανευρίσκεται σε συγκεκριμένο πληθυσμό κυττάρων και σε διαφορετικό ποσοστό κάθε φορά, ιδιαίτερη σημασία είχε η μελέτη της ευαισθησίας ανίχνευσης της ταινίας. Σύμφωνα με τη μελέτη αυτή βρέθηκε ότι με την παρούσα μέθοδο ανιχνεύεται με γυμνό μάτι η παρουσία μεταλλαγμένων αλληλίων ακόμη και σε ποσοστό ~4%. 41

Σχήμα 1.13. Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου ανίχνευσης της μετάλλαξης JAK2V617F με ταινία διπλής οπτικής ανίχνευσης και PCR τριών εκκινητών. Η PCR τριών εκκινητών (πάνω αριστερά) πραγματοποιείται με τη χρήση ενός πρόσθιου εκκινητή, ενός βιοτινυλιωμένου, εξωτερικού ανάστροφου εκκινητή και ενός αλληλοειδικού, εσωτερικού ανάστροφου εκκινητή επισημασμένο με διγοξιγενίνη. Σχηματίζεται πάντα το μεγάλο βιοτινυλιωμένο προϊόν, ενώ το μικρό προϊόν σχηματίζεται μόνο παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλίου. Τα σχηματισμένα προϊόντα υβριδοποιούνται με δύο ανιχνευτές που φέρουν ουρά poly(da) (S και L) και αποτίθενται στην ταινία. Το μικρό προϊόν ακινητοποιείται στη ζώνη T1 μέσω αντισώματος έναντι διγοξιγενίνης, ενώ το μεγάλο στη ζώνη Τ2 μέσω ακινητοποιημένης στρεπταβιδίνης (SA). Το polya τμήμα των ανιχνευτών S και L υβριδοποιείται με το poly(dt) τμήμα των νανοσφαιριδίων χρυσού σχηματίζοντας χαρακτηριστικές κόκκινες γραμμές. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού ακινητοποιείται από ολιγονουκλεοτίδια d(a) στη ζώνη ελέγχου C της ταινίας [17]. Η ταινία διπλής οπτικής ανίχνευσης εφαρμόστηκε, επίσης, και από τους Vlachou et al. (2010) για την ανίχνευση των τριών πιο κοινών παραγόντων κινδύνου θρομβοφιλίας στα γονίδια FV (Leiden factor), FII και MTHFR. Συνοπτικά, η μέθοδος περιλαμβάνει μία τριπλή PCR, για την ταυτόχρονη ενίσχυση των γονιδίων που περιλαμβάνουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, μία αντίδραση PEXT για κάθε μετάλλαξη και οπτική ανίχνευση των προϊόντων με τρεις ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων. Οι αλληλοειδικοί εκκινητές είναι επισημασμένοι είτε με βιοτίνη είτε με φλουορεσκεΐνη. Στην αντίδραση PEXT συμπεριλαμβάνεται και ένα ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής, το οποίο είναι συμπληρωματικό στο τμήμα που έχει επεκταθεί και φέρει ουρά poly(da). Η επέκταση πραγματοποιείται μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας των εκκινητών με την αλληλουχία στόχο και μόνο σε αυτή την περίπτωση υβριδοποιείται ο ανιχνευτής στην επεκταμένη 42

αλληλουχία, προσδίδοντας υψηλή ειδικότητα στην ανίχνευση. Τα προϊόντα επέκτασης ακινητοποιούνται στις δύο ζώνες δοκιμασίας της ταινίας μέσω αντισώματος έναντι φλουορεσκεΐνης και μέσω ακινητοποιημένης στρεπταβιδίνης. Νανοσφαιρίδια χρυσού που φέρουν ολιγονουκλεοτίδια poly(dt) χρησιμοποιούνται για την οπτική ανίχνευση (Σχ. 1.14) [18]. Σχήμα 1.14. Αρχή λειτουργίας και σχηματική απεικόνιση της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Οι ζώνες Τ1, Τ2 και C περιέχουν ακινητοποιημένη στρεπταβιδίνη, αντίσωμα έναντι φλουορεσκεΐνης και ολιγονουκλεοτίδια d(a) αντίστοιχα. Νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια d(t) χρησιμοποιούνται σαν ανιχνευτές για την οπτική ανίχνευση των προϊόντων γονοτυπικής αντίδρασης. Παρουσιάζονται επίσης (κάτω δεξιά), τα αποτελέσματα της ανάλυσης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για μία από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις για δείγμα φυσιολογικό (Ν), ομόζυγο μεταλλαγμένο (Μ) και ετερόζυγο (Η) [18]. Ανακεφαλαιώνοντας την εξελικτική πορεία των ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση SNPs, αρχικά χρησιμοποιήθηκε μία ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση κάθε αλληλίου ενός πολυμορφισμού. Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή ή η αντίδραση λιγάσης οδηγούν στο σχηματισμό βιοτινυλιωμένων αλληλο-ειδικών αλληλουχιών, οι οποίες ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιμασίας μέσω αλληλεπίδρασης με στρεπταβιδίνη. Εν συνεχεία, αναπτύχθηκαν οι ταινίες διπλής οπτικής ανίχνευσης με την προσθήκη μίας δεύτερης ζώνης δοκιμασίας, που αποτελείται από ακινητοποιημένο αντίσωμα έναντι διγοξιγενίνης ή φλουορεσκεΐνης. Ωστόσο, ο αριθμός των διαθέσιμων εμπορικά ζευγών 43

απτενίου-αντισώματος υψηλής συγγένειας που μπορούν να ενσωματωθούν σε μία ταινία είναι περιορισμένος, περιορίζοντας έτσι τη δυνατότητα αύξησης της πολλαπλότητας του συστήματος. Αντιθέτως, η αλληλεπίδραση μεταξύ συμπληρωματικών κλώνων DNA προσφέρει απεριόριστο αριθμό συμπληρωματικών ζευγών. Στο πλαίσιο αυτό, αναπτύχθηκε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων τετραπλής ανάλυσης, που περιλαμβάνει τέσσερις ζώνες δοκιμασίας και μία ζώνη ελέγχου [19]. Ο βιοαισθητήρας εφαρμόστηκε στη γονοτύπηση δύο SNPs, το οποίο συνεπάγεται την ταυτόχρονη ανίχνευση τεσσάρων αλληλίων. Το ενισχυμένο PCR προϊόν που περιέχει τους δύο πολυμορφισμούς υποβάλλεται σε μία αντίδραση PEXT χρησιμοποιώντας τέσσερις αλληλο-ειδικούς εκκινητές, καθένας από τους οποίους περιέχει ένα τμήμα συμπληρωματικό στο κάθε αλλήλιο της πολυμορφικής θέσης και ένα τμήμα ειδικό που επιτρέπει τη μετέπειτα ακινητοποίησή του στη ζώνη δοκιμασίας της ταινίας. Οι εκκινητές επεκτείνονται (παρουσία βιοτινυλιωμένων dntps) μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας με την αλληλουχία στόχο. Το προϊόν της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή αποτίθεται στην ταινία, και καθώς ανέρχεται το διάλυμα ανάπτυξης, οι επεκταμένοι αλληλο-ειδικοί εκκινητές υβριδοποιούνται με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια στις τέσσερις ζώνες δοκιμασίας της ταινίας και ανιχνεύονται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Οι ζώνες δοκιμασίας χρωματίζονται κόκκινες εφόσον έχει πραγματοποιηθεί η επέκταση υποδηλώνοντας την παρουσία του αντίστοιχου αλληλίου στο συγκεκριμένο δείγμα (Σχ. 1.15). Η δοκιμασία εφαρμόστηκε επιτυχώς στη γονοτύπηση 20 κλινικών δειγμάτων για δύο πολυμορφισμούς του γονιδίου MBL2 και 90 δειγμάτων για δύο πολυμορφισμούς του γονιδίου TLR4 [20]. 44

Σχήμα 1.15. Σχηματική αναπαράσταση της πολλαπλής ανίχνευσης πολυμορφισμών με μία ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Το ενισχυμένο PCR προϊόν που περιέχει τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις υποβάλλεται σε μία πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή με τέσσερις αλληλο-ειδικούς εκκινητές, καθένας από τους οποίους περιέχει στο 5 άκρο του μία μοναδική χαρακτηριστική αλληλουχία, η οποία επιτρέπει τη μετέπειτα ακινητοποίηση του στη ζώνη δοκιμασίας της ταινίας. Οι εκκινητές επεκτείνονται μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας, ενσωματώνοντας βιοτινυλιωμένα dutps. Τα προϊόντα επέκτασης ακινητοποιούνται στην ταινία μέσω υβριδοποίησης με συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια, που είναι ακινητοποιημένα στις τέσσερις ζώνες δοκιμασίας της ταινίας. Η οπτική ανίχνευση ολοκληρώνεται μέσω αλληλεπίδρασης με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Χαρακτηριστικές, κόκκινες γραμμές σε συγκεκριμένες θέσεις υποδεικνύουν στην παρουσία του αντίστοιχου αλληλίου [19]. Στα πλαίσια της προσπάθειας για την αύξηση της πολλαπλότητας ανίχνευσης, αναπτύχθηκε βιοαισθητήρας με τη βοήθεια του οποίου ανιχνεύονται ταυτόχρονα πάνω από 10 αλλήλια χωρίς τη χρήση εξειδικευμένων οργάνων [21]. Ενισχύεται σημαντικά, η πολλαπλότητα του βιοαισθητήρα, διατηρώντας παράλληλα την απλότητα του, την ειδικότητα του και την αναπαραγωγιμότητα του. Η πολλαπλή ανίχνευση επιτυγχάνεται με την απόθεση με απλό πιπετάρισμα πολλαπλών κηλίδων (~1mm). Ειδικά ολιγονουκλεοτίδιαανιχνευτές δεσμεύονται ομοιοπολικά σε σφαιρίδια πολυστυρενίου, τα οποία στη συνέχεια αποτίθενται στη μεμβράνη της ταινίας. Πραγματοποιείται μία πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή, κατά την οποία αλληλο-ειδικοί εκκινητές επεκτείνονται ταυτόχρονα, ενώ ενσωματώνονται βιοτινυλιωμένα δεοξυνουκλεοτίδια (biotin-dutps) με προϋπόθεση την απόλυτη συμπληρωματικότητα με την αλληλουχία στόχο. Δύο αλληλο-ειδικοί εκκινητές 45

σχεδιάζονται για κάθε πολυμορφική θέση. Επομένως, για την ανίχνευση 5 SNPs στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή χρησιμοποιούνται 10 αλληλοειδικοί εκκινητές (10-απλή αντίδραση). Τα προϊόντα επέκτασης ακινητοποιούνται στις κηλίδες της ταινίας μέσω υβριδοποίησης με τις αντίστοιχες αλληλουχίες στα σφαιρίδια πολυστυρενιού και ανιχνεύονται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης (Σχ. 1.16). Η οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μία δοκιμασία ταχείας υβριδοποίησης, κατά την οποία στάδια όπως η υβριδοποίηση, η έκπλυση της περίσσειας των αντιδραστηρίων και η ανίχνευση με έγχρωμα σωματίδια επιτυγχάνεται μέσω της συνεχούς ροής του διαλύματος ανάπτυξης. Ο σχεδιασμός αυτός της ταινίας επιτρέπει τη απόθεση πολλαπλών κηλίδων σε μικρή περιοχή, διότι τα σφαιρίδια πολυστυρενίου παγιδεύονται στους πόρους της μεμβράνης και παραμένουν σταθερά στη θέση εφαρμογής χωρίς να διαχέονται. Επιπλέον, προσφέρει καλύτερη ανιχνευσιμότητα συγκριτικά με την υβριδοποίηση με ολιγονουκλεοτίδια ακινητοποιημένα απευθείας στη μεμβράνη, αφού τα υβρίδια που σχηματίζονται εκτίθενται στην επιφάνεια των σφαιριδίων και όχι στο εσωτερικό των πόρων της μεμβράνης. Είναι κατανοητό ότι ο αριθμός των κηλίδων δοκιμασίας, και ως εκ τούτου ο αριθμός των αλληλόμορφων που ανιχνεύονται, μπορεί να αυξηθεί, απλώς, με αύξηση των διαστάσεων της διαγνωστικής μεμβράνης. Πρόκειται για την πρώτη πλατφόρμα με την οποία γίνεται εφικτή η ταυτόχρονη οπτική ανίχνευση τουλάχιστον 10 αλληλόμορφων σε έναν βιοαισθητήρα. 46

Σχήμα 1.16. Σχηματική αναπαράσταση της αρχής της ταυτόχρονης πολλαπλής ανίχνευσης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. (Α) Ενίσχυση με αντίδραση PCR των γονιδίων που περιέχουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Τα προϊόντα επέκτασης υποβάλλονται σε πολλαπλή αντίδραση PEXT με αλληλο-ειδικούς εκκινητές. Οι εκκινητές επεκτείνονται μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας ενσωματώνοντας biotin-dutps κατά την επέκταση. Το προϊόν επέκτασης αποτίθεται κατευθείαν στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. (Β) Οι επεκταμένοι εκκινητές υβριδοποιούνται με τον αντίστοιχο ειδικό ανιχνευτή και συνδέονται με τα νανοσφαιρίδια χρυσού μέσω αντισώματος έναντι βιοτίνης. Σε περίπτωση μη επέκτασης του εκκινητή, υβριδοποιείται με το αντίστοιχο ολιγονουκλεοτίδιο ανιχνευτή, αλλά δεν συνδέεται με τα νανοσφαιρίδια χρυσού. Η εμφάνιση ερυθρών κηλίδων στην αριστερή ή στη δεξιά πλευρά της μεμβράνης υποδεικνύει την παρουσία στο δείγμα φυσιολογικού ή μεταλλαγμένου αλληλίου αντίστοιχα. Δύο κηλίδες ελέγχου από βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια συζευγμένα με μικροσφαιρίδια δεσμεύουν την περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού [21]. 47

ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί και οι μεταλλάξεις συνιστούν μία νέα γενιά μοριακών δεικτών για τη διαφορική διάγνωση, την πρόγνωση και την πρόβλεψη της θεραπευτικής ανταπόκρισης. Στον τομέα των ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων ο αριθμός των εφαρμογών για την ανίχνευση πολυμορφισμών και μεταλλάξεων είναι περιορισμένος. Τα Εργαστήρια Αναλυτικής Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών και του Πανεπιστημίου Πατρών έχουν μακρά εμπειρία στον τομέα της ανάπτυξης συστημάτων τύπου ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων, μεταλλάξεων και μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη και αξιολόγηση μεθόδων πολλαπλής ανίχνευσης μεταλλάξεων/πολυμορφισμών που σχετίζονται με σειρά κληρονομούμενων νοσημάτων όπως: (i) α- θαλασσαιμία, (ii) β- θαλασσαιμία, (iii) θρομβοφιλία και (iv) νόσος του Wilson με πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. Στο πλαίσιο της αξιολόγησης των παραπάνω μεθόδων, αναπτύχθηκε επίσης μέθοδος ανίχνευσης μεταλλάξεων στα γονίδια της α- σφαιρίνης με τη μέθοδο «Ανάλυσης καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (High Resolution Melting Analysis, HRMA). 48

Κεφάλαιο 2 Ανάπτυξη ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης για την ανίχνευση 5 μεταλλάξεων στο γονίδιο της β-σφαιρίνης 2.1. Εισαγωγή Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι κληρονομικές διαταραχές της σφαιρίνης που αποτελεί το πρωτεϊνικό συστατικό της αιμοσφαιρίνης (Hb). Οι μεταλλάξεις στα γονίδια των σφαιρινών διακρίνονται σε αυτές που προκαλούν ποιοτικές ανωμαλίες (παρερμηνεύσιμες μεταλλάξεις, μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου ανάγνωσης), όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία και σε αυτές που προκαλούν ποσοτικές ανωμαλίες. Ο όρος θαλασσαιμία χρησιμοποιείται για να περιγράψει διαταραχές που σχετίζονται με σημαντική μείωση του ρυθμού σύνθεσης μίας ή και περισσοτέρων σφαιρινικών αλυσίδων. Επιπλέον, υπάρχουν και μεταλλάξεις που οδηγούν στη σύνθεση μειωμένων ποσοτήτων αιμοσφαιρίνης με δομικές ανωμαλίες που συνιστούν την ομάδα των θαλασσαιμικών αιμοσφαιρινοπαθειών. Υπάρχουν πολλά γονίδια που κωδικοποιούν τις σφαιρίνες. Τα γονίδια αυτά βρίσκονται είτε στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 11 (σύμπλεγμα β- σφαιρίνης) είτε στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 16 (σύμπλεγμα α- σφαιρίνης) (Σχ. 2.1). Τα σημαντικότερα γονίδια σφαιρίνης στον άνθρωπο είναι τα 2 γονίδια β-σφαιρίνης και τα 4 γονίδια α-σφαιρίνης. Παρά τη διαφορά στον αριθμό των α και β γονιδίων, η αναλογία α/β της πρωτεΐνης που προκύπτει από αυτά τα γονίδια εξισορροπείται για να δώσει λόγο 1. Σε φυσιολογική κατάσταση, παράγονται ίσες ποσότητες α και β αλυσίδων, έτσι ώστε να μπορούν να συνδυαστούν στοιχειομετρικά και να σχηματίσουν τα σωστά τετραμερή της αιμοσφαιρίνης [22, 23]. 49

Σχήμα 2.1. Το προγονικό γονίδιο σφαιρίνης διπλασιάστηκε στα α και β γονίδια σφαιρίνης πριν από 500 εκατομμύρια χρόνια. Στη συνέχεια, τα δύο συμπλέγματα α και β σφαιρίνης εξελίχτηκαν και σήμερα εμφανίζονται σαν δύο συμπλέγματα που περιέχουν ενεργά γονίδια ( ) και μη ενεργά ή ψευδογονίδια ( ). Και στις δύο οικογένειες τα γονίδια είναι διευθετημένα έτσι, ώστε η κατεύθυνση μεταγραφής τους από 5 προς 3 να είναι για όλα η ίδια. Τα γονίδια που χρησιμοποιούνται σε πρώιμο στάδιο της ανάπτυξης βρίσκονται στο 5 άκρο της οικογένειας και εκείνα που χρησιμοποιούνται τελευταία στο 3 άκρο [22]. Οι α και β-θαλασσαιμία είναι ετερογενείς κληρονομούμενες αναιμίες που προκύπτουν από ελαττωματική σύνθεση των α και β-σφαιρινικών υπομονάδων της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων HbA (α 2 β 2 ) και αποτελούν την πιο κοινή αυτοσωμική υπολειπόμενη γενετική ασθένεια στον άνθρωπο. Όπως και στην περίπτωση άλλων αιμοσφαιρινοπαθειών, οι θαλασσαιμίες είναι κοινές σε περιοχές όπου η ελονοσία υπήρξε ενδημική κάποια στιγμή στην ανθρώπινη ιστορία, π.χ. Νότια Ασία, λεκάνη της Μεσογείου, Ισημερινή Αφρική, αν και με τη μετανάστευση των πληθυσμών γίνονται όλο και πιο συχνές σε πρώην μη αυτόχθονες χώρες. Εκτιμάται ότι, σε παγκόσμιο επίπεδο, πάνω από το 1% των ζευγαριών παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο να αποκτήσουν προσβεβλημένο παιδί και σε ετήσια βάση γεννιούνται πάνω από 330.000 προσβεβλημένα βρέφη (83% διαταραχές δρεπανοκυτταρικής αναιμίας, 17% θαλασσαιμίες). Η γενετική της β-θαλασσαιμίας είναι πολύπλοκη εξαιτίας του μεγάλου αριθμού (>200) μεταλλάξεων που οδηγούν σε πλήρη ή μερική αναστολή της σύνθεσης 50

των β-σφαιρινικών αλυσίδων. Η πλήρης αναστολή παραγωγής των β- σφαιρινών χαρακτηρίζεται ως β 0 -θαλασσαιμία. Εάν οι μεταλλάξεις επιτρέπουν την παραγωγή μικρών λειτουργικών ποσοτήτων β-σφαιρινών, τότε η δυσλειτουργία χαρακτηρίζεται ως β + -θαλασσαιμία. Κλινικά οι β-θαλασσαιμίες χωρίζονται σε 3 κατηγορίες : Μείζων θαλασσαιμία (thalassaemia major) ή αναιμία του Cooley: Οι ασθενείς με αυτό τον τύπο θαλασσαιμίας έχουν την ανάγκη από συχνές μεταγγίσεις αίματος προκειμένου να επιβιώσουν. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι β 0 - και β + -θαλασσαιμίες (δύο β + γονίδια; β + /β 0 ; β 0 /β 0 ) [24]. Ενδιάμεση θαλασσαιμία (thalassaemia intermedia): Ο όρος αυτός χρησιμοποιείται για το χαρακτηρισμό των ατόμων με σημαντική αναιμία που είναι συμπτωματικοί αλλά δεν χρειάζονται μεταγγίσεις αίματος. Ο τύπος αυτός εμφανίζεται συνήθως σε άτομα με γονότυπο β + /β +. Η ενδιάμεση θαλασσαιμία χαρακτηρίζεται από πιο ήπιες μεταλλάξεις. Ένα άτομο που είναι σύνθετος ετεροζυγώτης με α-θαλασσαιμία και β + -θαλασσαιμία συγκαταλέγεται σε αυτή την κατηγορία [24]. Ελάσσων ή ετερόζυγη θαλασσαιμία (thalassaemia minor): Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα ετερόζυγα άτομα με β-θαλασσαιμία. Τα άτομα αυτά φέρουν ένα φυσιολογικό β-γονίδιο και ένα που φέρει μια μετάλλαξη που οδηγεί είτε σε αναστολή είτε σε μερική αναστολή της σύνθεσης της β-σφαιρίνης (φυσιολογικό β A γονίδιο/θαλασσαιμικό γονίδιο (β 0 ή β + )). Γενικά τα άτομα αυτής της κατηγορίας είναι συνήθως ασυμπτωματικά [24]. Οι πιο συχνές σοβαρές καταστάσεις, η μείζων θαλασσαιμία (thalassaemia major) ή η αναιμία του Cooley, η δρεπανοκυτταρική αναιμία (Sickle cell anaemia) και η HbE/β-θαλασσαιμία απαιτούν δια βίου θεραπεία και κλινική παρακολούθηση, και ως εκ τούτου, έχουν σημαντικές επιπτώσεις στην παγκόσμια θνησιμότητα και νοσηρότητα, ιδίως στις αναπτυσσόμενες χώρες [25]. Παρά το γεγονός ότι οι αιμοσφαιρινοπάθειες έχουν μελετηθεί εκτενώς τόσο σε βιοχημικό, αιματολογικό όσο και σε μοριακό επίπεδο, συνεχίζουν να παραμένουν μία διαγνωστική πρόκληση, ιδίως σε πολυεθνικές κοινότητες. Η έγκαιρη ανίχνευση και ο χαρακτηρισμός των αιμοσφαιρινοπαθειών είναι 51

απαραίτητα, έτσι ώστε να παρέχεται η κατάλληλη καθοδήγηση σε οικογένειες και ζευγάρια, που παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο να αποκτήσουν παιδί με νόσο. Σε πολλές χώρες έχουν υιοθετηθεί πρακτικές για τον περιορισμό των γεννήσεων προσβεβλημένων παιδιών, αλλά και τη μείωση των θανάτων παιδιών με νόσο. Οι πρακτικές αυτές περιλαμβάνουν την αναγνώριση των ζευγαριών φορέων που έχουν αυξημένο κίνδυνο να αποκτήσουν προσβεβλημένο παιδί, σε συνδυασμό με τη διαθεσιμότητα επιλογών, όπως η προγεννητική διάγνωση, για τη μείωση του κινδύνου αυτού. Αν και η μοριακή διαγνωστική είναι σημαντικός παράγοντας στην κατανόηση και την ανίχνευση των αιμοσφαιρινοπαθειών, η γονοτύπηση του DNA δεν πρέπει ποτέ να θεωρηθεί ως η μέθοδος πρώτης επιλογής στη διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών. Μια προσεκτική προσέγγιση τριών σταδίων, που περιλαμβάνει (1) πλήρη εξέταση αίματος (2) ειδικές αιματολογικές εξετάσεις (π.χ. ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης) ακολουθούμενες από (3) γονοτυπική ανάλυση του DNA, παρέχει τον πλέον αποτελεσματικό τρόπο για την ανίχνευση μεταλλάξεων του γονιδίου, καθώς και αλληλεπιδράσεων μεταξύ γονιδίων που μπορούν να επηρεάσουν το συνολικό φαινότυπο. Αναμφισβήτητα, η μοριακή γονοτυπική ανάλυση είναι σημαντική για την οριστική διάγνωση φορέων και ασθενών και είναι, επίσης, απαραίτητη για όλες τις σύγχρονες εφαρμογές της προγεννητικής διάγνωσης. Έχει αναπτυχθεί πληθώρα μεθόδων για την ανίχνευση των μεταλλάξεων στο γονίδιο της β σφαιρίνης, όπως η αλληλο-ειδική PCR, ο αλληλο-ειδικός ολιγονουκλεοτιδικός υβριδισμός, η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα με βαθμίδωση αποδιατακτικών παραγόντων κ.ά.. Σχεδόν όλες οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σήμερα βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ενώ κυκλοφορούν και κάποια εμπορικά διαθέσιμα κιτ [26, 27]. Τα βασικά βήματα στα περισσότερα πρωτόκολλα μοριακής ανάλυσης περιλαμβάνουν, αρχικά, την απομόνωση/καθαρισμό του δείγματος DNA, ένα στάδιο ενίσχυσης της εξεταζόμενης γενετικής περιοχής (συνήθως με PCR) και, τέλος, την ανίχνευση/γονοτύπηση των προϊόντων ενίσχυσης. Για την πλειοψηφία των σταδίων προετοιμασίας και ενίσχυσης του δείγματος απαιτείται σχετικά φθηνός εξοπλισμός (π.χ. συσκευές φυγοκέντρησης, υδατόλουτρα ή μπλοκ θέρμανσης, πιπέτες ακριβείας και ένας συμβατικός 52

θερμικός κυκλοποιητής). Ωστόσο, οι περισσότερες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη διάγνωση και τη γονοτύπηση των κλινικών δειγμάτων περιλαμβάνουν τη χρήση ακριβού και εξειδικευμένου εξοπλισμού, όπως είναι για παράδειγμα, η ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας, η PCR πραγματικού χρόνου και, φυσικά, η αλληλούχιση DNA χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένο αναλυτή. Εναλλακτικά, σε άλλες μεθόδους όπως η αλληλο-ειδική PCR (ARMS-PCR), η PCR με περιοριστικά ένζυμα (RE-PCR), απαιτείται ηλεκτροφόρηση η οποία είναι χρονοβόρα, περιλαμβάνει τη χρήση επικίνδυνων για την υγεία χημικών αντιδραστηρίων και στερείται υψηλής ευαισθησίας. Στους περισσότερους πληθυσμούς, όπου οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι ενδημικές, υπάρχουν συνήθως 10-15 συχνότερα εμφανιζόμενες μεταλλάξεις. Έτσι, με τις γονοτυπικές μεθόδους θα πρέπει ιδανικά να ανιχνεύεται ένα ευρύ φάσμα μεταλλάξεων σε κάθε δείγμα. Με άλλα λόγια, θα πρέπει να υπάρχει δυνατότητα πολλαπλής ανάλυσης με μία μόνο μέθοδο. Υπάρχουν μερικά εμπορικά διαθέσιμα διαγνωστικά κιτ που ικανοποιούν αυτή την απαίτηση, αλλά είναι είτε πολύ υψηλού κόστους (arrayed primer extension reaction, APEX), είτε περιλαμβάνουν χρονοβόρα πρωτόκολλα με πολλά στάδια προσθήκης αντιδραστηρίων, επωάσεων και εκπλύσεων (Globin Strip assays, ViennaLab Diagnostics). Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφεται η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και αξιολόγηση μίας απλής, σύντομης, αξιόπιστης και χαμηλού κόστους πολλαπλής μοριακής δοκιμασίας πλάγιας ροής, η οποία αποκλείει την ανάγκη χρήσης εξειδικευμένων οργάνων καθώς και ειδικά εκπαιδευμένου τεχνικού προσωπικού. Η δοκιμασία αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε στην ανίχνευση των 15 συχνότερα εμφανιζόμενων μεταλλάξεων στο γονίδιο της β σφαιρίνης που αντιπροσωπεύουν το >90% των αλληλόμορφων που προκαλούν τη νόσο σε πληθυσμούς της λεκάνης της Μεσογείου [28, 29]. Οι μεταλλάξεις που αναλύθηκαν είναι οι εξής: IVSI-110 G>A (HBB:c.93-21G>A), κωδικόνιο (CD)39 C>T (HBB:c.118C>T), IVSI-1 G>A (HBB:c.92+1G>A), IVSI-6 T>C (HBB:c.92+6T>C), IVSII-745 C>G (HBB:c.316-106C>G), IVSII-1 G>A (HBB:c.315+1G>A), frameshift (μετατόπιση πλαισίου ανάγνωσης) codon 6 (FSC6) GAG>G G (HBB:c.20delA), 101 C>T (HBB:c. 151C>T), FSC5 53

CCT>C (HBB:c.17 18delCT), IVSI-5 G>A (HBB:c.92+5G>A), FSC8 AAG>G (HBB:c.25 26delAA), 87 C>G (HBB:c. 137C>G), IVSII-848 C>A (HBB:c.316-3C>A), termination codon (κωδικόνιο τερματισμού) nt +6 C>G (HBB:c.*+6C>G), και HbS (cd6 GAG>GTG, HBB:c.20A>T) [29]. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι 5 από αυτές τις μεταλλάξεις, οι οποίες είναι: 101 C>T (HBB:c. 151C>T), FSC5 CCT>C (HBB:c.17 18delCT), FSC8 AAG>G (HBB:c.25 26delAA), IVSII-848 C>A (HBB:c.316-3C>A), termination codon nt +6 C>G (HBB:c.*+6C>G). Καθ όλο το υπόλοιπο κεφάλαιο θα χρησιμοποιείται η συμβατική ονοματολογία των μεταλλάξεων. 2.2. Οργανολογία & Μέθοδοι 2.2.1. Οργανολογία Αναλυτικός ζυγός, Sartorius Επωαστήρες με ανακίνηση Titramax 1000 και Unimax 1000 (Heidolph) Θάλαμος κάθετης νηματικής ροής για PCR (Telstar mini-v/ PCR) Θερμικός κυκλοποιητής MiniCycler PTC-0150 (MJ Research) Θερμικός κυκλοποιητής Omni-E (Hybaid) Κοπτικό γραφείου (Q-Connect) Μικροφυγόκεντρος, Micro 20 (Hettich, GmbH) Πεχάμετρο με μικροηλεκτρόδιο συνδυασμού υάλου καλομέλανος (Orion Research) Πιπέττες ακριβείας, Nichiryo Συσκευή ανάδευσης, Vortex Συσκευή ηλεκτροφόρησης, Sub-Cell GT (Biorad) Τράπεζα υπεριώδους φωτός UV (Vilbert Lourmat) Υδατόλουτρο (Tectron BIO) Φασματοφωτόμετρο, Hitachi U-2000 54

Φούρνος μικροκυμάτων, Moulinex Φυγόκεντρος, Rotofix 32 (Hettich Gmbh) Ψηφιακή κάμερα KODAK DC 120 (συνοδευόμενη από το λογισμικό πρόγραμμα Gel Analyzer) Scanner Hewlett-Packard, ScanJet 3400C 2.2.2. Κλινικά δείγματα Τα δείγματα ολικού αίματος που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη αυτή διατέθηκαν από το Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών με έδρα το Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο στο Νοσοκομείο Παίδων Αγία Σοφία. Οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις στο γονίδιο της β-σφαιρίνης σε κάθε δείγμα είχαν, προηγουμένως, χαρακτηριστεί με ποικιλία μεθόδων, όπως η αποδιατακτική υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (denaturating High Performance Liquid Chromatography-dHPLC), η αλληλοειδική PCR (Amlification Refractory Mutation System, ARMS-PCR), η PCR πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR) και η άμεση αλληλούχιση (sequencing). 2.2.3. Μέθοδοι Σύζευξη NH 2 -ολιγονουκλεοτιδίων με σφαιρίδια πολυστυρενίου που φέρουν στην επιφάνεια τους ομάδες -COOH Για την παρασκευή συζεύγματος σφαιριδίων πολυστυρενίου με ολιγονουκλεοτίδια, χρησιμοποιήθηκαν άχρωμα σφαιρίδια πολυστυρενίου, διαμέτρου 2 μm, που φέρουν καρβοξυλομάδες στην επιφάνειά τους. Αναλυτικότερα, σε 12,8 μl εναιωρήματος σφαιριδίων 5,6x10 6 μl -1 (7,2. 10 7 σφαιρίδια) προστίθενται 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος MES 0,1 Μ (ph 4,5) και το διάλυμα φυγοκεντρείται σε 13000 rpm για 2 min. Τα σφαιρίδια ανασυσταίνονται σε 160 μl ρυθμιστικού διαλύματος MES 0,1 Μ (ph 4,5) με έντονη ανακίνηση και προστίθενται σε αυτά 400 pmol του κατάλληλου ολιγονουκλεοτιδίου, που φέρει μία αμινομάδα στο 5 άκρο του. Στη συνέχεια, προστίθενται 5 μl, προσφάτως παρασκευασμένου υδατικού διαλύματος EDC 320 g/l σε διάλυμα MES 0,1 Μ, και το μείγμα επωάζεται για 30 min σε 55

θερμοκρασία περιβάλλοντος υπό συνεχή, έντονη ανακίνηση. Η προσθήκη διαλύματος EDC (5 μl) επαναλαμβάνεται με φρέσκο διάλυμα και το μείγμα αφήνεται να αντιδράσει για ακόμα 30 min υπό συνεχή, έντονη ανακίνηση. Μετά το τέλος του δεύτερου μισάωρου προστίθεται 2 μl Tween-20 συγκέντρωσης 100 ml/l και το διάλυμα φυγοκεντρείται σε 13000 rpm για 2 min. Αφαιρείται το υπερκείμενο και ακολουθούν δύο διαδοχικές εκπλύσεις (13000 rpm, 2 min) με 100 μl διαλύματος Tris-EDTA (ΤΕ) που περιέχει και 2 ml/l Tween-20. Τέλος, τα σφαιρίδια ανασυσταίνονται σε 64 μl διαλύματος ΤΕ. Αν υποθέσουμε ότι δεν υπάρχει απώλεια σφαιριδίων στα στάδια των εκπλύσεων, η συγκέντρωση του τελικού εναιωρήματος των σφαιριδίων είναι 1,1x10 6 μl -1. Σήμανση των προσδεμένων ολιγονουκλεοτιδίων στα σφαιρίδια πολυστυρενίου με βιοτίνη. Για την κατασκευή της ζώνης ελέγχου χρησιμοποιούνται σφαιρίδια πολυστυρενίου συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια (τυχαία αλληλουχία) μετά από επέκταση των ολιγονουκλεοτιδίων με τελική μεταφοράση (Terminal deoxynucleotidyl Transferase, TdT) παρουσία biotin-dutps. Συγκεκριμένα, 128 μl συζευγμένων σφαιριδίων (14,1x10 7 σφαιρίδια) καθαρίζονται εις διπλούν με 200 μl Η 2 Ο και ανασυστήνονται τελικώς σε 20 μl Η 2 Ο. Η αντίδραση επέκτασης με ένζυμο τελική μεταφοράση πραγματοποιείται σε τελικό όγκο 40 μl και περιέχει: 14,1x10 7 των συζευγμένων σφαιριδίων, ρυθμιστικό διάλυμα της τελικής μεταφοράσης (200 mm κακοδυλικό νάτριο, 25 mm Tris, 0.01 % (v/v) Triton X-100, 1 mm CoCl 2, ph 7.2), 0,5 mm dntps, 25 μμ biotin-dutps και 50 U ενζύμου. Μετά από επώαση για 1 ώρα στους 37 ο C, για την απομάκρυνση της περίσσειας των biotin-dutps, τα σφαιρίδια εκπλένονται με φυγοκέντρηση (13000 rpm για 2 min) εις διπλούν με 100 μl H 2 O και 2 μl Tween-20 100 ml/l. Τέλος, τα σφαιρίδια ανασυστήνονται σε 512 μl Tris-EDTA (τελική συγκέντρωση 2,8x10 5 μl -1 ). 56

Ενζυμική προσθήκη δεοξυνουκλεοτιδίων στο 3 άκρο των εκκινητών της αντίδρασης PEXT παρουσία biotin-dutp Οι εκκινητές της αντίδρασης PEXT ιχνηθετούνται με βιοτίνη μέσω της αντίδρασης επέκτασης με τελική μεταφοράση και biotin-dutp. Οι βιοτινυλιωμένοι εκκινητές χρησιμοποιούνται στη συνέχεια για τον έλεγχο της σωστής λειτουργίας των συζευγμένων σφαιριδίων πολυστυρενίου. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε τελικό όγκο 20 μl και περιέχει 100 pmol εκκινητών, ρυθμιστικό διάλυμα της τελικής μεταφοράσης (200 mm κακοδυλικό νάτριο, 25 mm Tris, 0.01 % (v/v) Triton X-100, 1 mm CoCl2, ph 7.2), 0,5 mm dntps, 25 μμ biotin-dutps και 50 U του ενζύμου. Η επέκταση πραγματοποιείται στους 37 ο C για 1 ώρα. Μετά το τέλος της αντίδρασης προστίθενται 2 μl EDTA 0,5 M για την απενεργοποίηση του ενζύμου. Κατασκευή ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων (40mm x 70mm), όπως αναφέρθηκε και στο πρώτο κεφάλαιο, περιλαμβάνει το χάρτη εμβάπτισης, το χάρτη απόθεσης (υαλοβάμβακα) των νανοσφαιριδίων χρυσού και του δείγματος, το χάρτη απορρόφησης και τη διαγνωστική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Όλα τα τμήματα της ταινίας συγκρατούνται πάνω σε μία αυτοκόλλητη πλαστική κάρτα. Αρχικά, τοποθετείται η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (25 mm σε μήκος), και κάτω από αυτή τοποθετείται ο χάρτης απόθεσης από υαλοβάμβακα (15 mm σε μήκος), ώστε να την καλύπτει κατά 2 mm. Στη συνέχεια, τοποθετείται ο χάρτης εμβάπτισης (15 mm σε μήκος) έτσι, ώστε να καλύπτει το χάρτη απόθεσης κατά 2 mm. Τέλος, τοποθετείται ο χάρτης απορρόφησης (15 mm σε μήκος), πάνω από τη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, καλύπτοντας την κατά 2 mm. Με κοπτικό γραφείου, κόβονται οι ταινίες σε πλάτος 4 mm. Στη συνέχεια, 0,5 μl εναιωρήματος σφαιριδίων (5,5x10 5 σφαιρίδια) συζευγμένων με ολιγονουκλεοτίδια αποτίθενται πάνω στη μεμβράνη προς σχηματισμό κηλίδων δοκιμασίας. Ίσος όγκος εναιωρήματος, που περιέχει 1,4x10 5 σφαιρίδια συζευγμένα με βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια, αποτίθενται στο πάνω άκρο της ταινίας για το σχηματισμό της κηλίδας ελέγχου. Η ταινία αφήνεται να 57

στεγνώσει για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου και φυλάσσεται σε ξηρό μέρος. Απομόνωση γενωμικού DNA. Η απομόνωση γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε από περιφερικό αίμα με το αυτοματοποιημένο ρομποτικό σύστημα Biorobot M48 Workstation (Qiagen, Hilden, Germany) και το εμπορικά διαθέσιμο kit MagAttract DNA Blood midi M48 Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που συνιστά ο κατασκευαστής. Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου HBB Τμήμα του γονιδίου της β-σφαιρίνης (1896 bp) που περιείχε τις εξεταζόμενες 5 μεταλλάξεις ενισχύθηκε με αντίδραση PCR. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl και περιείχε 1 U πολυμεράσης Kappa Fast 2G, 1x ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 2 mm MgCl 2 και 200 μμ από κάθε dntp, 0,25 μμ από κάθε εκκινητή HBB-F και HBB-R και 100 ng γενωμικού DNA. Το πρόγραμμα της αντίδρασης PCR ήταν το εξής: 95 o C για 2 min, ακολουθούν 35 κύκλοι των 95 o C για 15 s, 60 o C για 15 s, 72 o C για 30 s και τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. 10/πλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) Η πολλαπλή (10/πλή) αντίδραση επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο αντίδρασης 20 μl που περιείχε 1x ρυθμιστικό διάλυμα (20 mm Tris-HCl (ph 8.8), 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 10 mm KCl, 0,1 % Triton X-100), 4 mm MgSO 4, 1 U Vent (exo-) DNA πολυμεράση, 100 fmol ενισχυμένου προϊόντος PCR, 5 pmol από καθέναν από τους 10 εκκινητές και 10 μm από καθένα από τα datp, dctp, dgtp, 5 μμ dttp και 5 μμ biotin-dutp. Το πρόγραμμα της δεκαπλής PEXT ήταν το εξής: 95 o C για 5 min, ακολουθούμενο από 10 κύκλους των 95 o C για 15 s, 60 o C για 15 s, 72 o C για 15 s. Για όλα τα προϊόντα επέκτασης εκκινητή ακολούθησε ένα στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 10 min και αμέσως τοποθέτηση τους στον πάγο. 58

Οπτική ανίχνευση των προϊόντων ενίσχυσης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων 3 μl από το αποδιατεταγμένο προϊόν επέκτασης αναμείχθηκε με διάλυμα ανάπτυξης (2x SSC, ph 7.0, 200 ml/l φορμαμίδιο, 30 g/l BSA, 20 ml/l γλυκερόλη, 5 ml/l Tween-20 και 5 g/l SDS) ίσου όγκου. Το μείγμα αποτέθηκε στο πάνω μέρος του χάρτη απόθεσης, πάνω από τα νανοσφαιρίδια χρυσού (κοντά στη μεμβράνη). Στη συνέχεια, ο χάρτης εμβάπτισης της ταινίας τοποθετείται σε ένα σωληνάριο που περιέχει 300 μl διαλύματος ανάπτυξης, το οποίο ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας. Η οπτική ανίχνευση πραγματοποιείται και ολοκληρώνεται μέσα σε 15 min. Στην αντίδραση PCR όσο και στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή συμπεριλήφθησαν αρνητικά δείγματα ελέγχου. Για την εύκολη ερμηνεία των αποτελεσμάτων, η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων διαμορφώθηκε κατά τέτοιο τρόπο ώστε οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα πέντε φυσιολογικά αλλήλια να βρίσκονται στην αριστερή πλευρά της μεμβράνης, ενώ οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα πέντε μεταλλαγμένα αλλήλια να βρίσκονται στη δεξιά πλευρά της μεμβράνης. Ο γονότυπος προσδιορίζεται από το χρώμα του κάθε ζεύγους κηλίδων. Για οποιοδήποτε πολυμορφισμό, ένα δείγμα φυσιολογικό θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ ένα ομόζυγα μεταλλαγμένο θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα του ζεύγους. Και οι δύο κηλίδες θα εμφανίσουν κόκκινο χρώμα αν το δείγμα προέρχεται από ετερόζυγο δείγμα για τη συγκεκριμένη πολυμορφική θέση. 2.3. Αποτελέσματα και Συζήτηση 2.3.1. Αρχή της δοκιμασίας Η βασική αρχή της πολλαπλής ανίχνευσης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων που αναπτύχθηκε παρουσιάζεται στο σχήμα 2.2. Η μέθοδος αποτελείται από τα εξής τρία στάδια: (i) ενίσχυση με αντίδραση PCR τμήματος 1896 bp του γονιδίου HBB στην περιοχή μεταξύ των νουκλεοτιδίων 5.246.545 και 5.248.440 στο χρωμόσωμα 11p15.4, το οποίο περιλαμβάνει όλες τις γνωστές 59

μεταλλάξεις που αφορούν τη β-θαλασσαιμία, συμπεριλαμβανομένων και των 5 μεταλλάξεων που εξετάζονται σε αυτή τη μελέτη. (ii) 10/πλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή απευθείας στο ενισχυμένο PCR προϊόν (χωρίς προηγούμενο καθαρισμό) χρησιμοποιώντας αλληλο-ειδικούς εκκινητές (δύο για κάθε αλλήλιο) και παράλληλα νουκλεοτίδια επισημασμένα με βιοτίνη. Η βιοτίνη ενσωματώνεται στο προϊόν κατά την επέκταση του εκκινητή. Το 3 άκρο κάθε εκκινητή είναι συμπληρωματικό σε συγκεκριμένο αλλήλιο του γονιδίου HBB, ενώ το 5 άκρο του περιέχει μία μοναδική αλληλουχία που επιτρέπει τη μετέπειτα ακινητοποίηση του στη ζώνη δοκιμασίας της ταινίας μέσω υβριδοποίησης με συμπληρωματικό ακινητοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο σε σφαιρίδια πολυστυρενίου. Κάθε αλληλο-ειδικός εκκινητής επεκτείνεται μόνο στην περίπτωση που είναι απόλυτα συμπληρωματικός στην αλληλουχία στόχο. Στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή χρησιμοποιήθηκε πολυμεράση, η οποία στερείται οποιασδήποτε δράσης 5 >3 και 3 >5 εξωνουκλεάσης. (iii) πολλαπλή ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η ανίχνευση πραγματοποιείται με γυμνό μάτι μέσα σε λίγα μόλις λεπτά. Το προϊόν επέκτασης αποτίθεται στην ταινία, της οποίας εν συνεχεία, το κάτω άκρο βυθίζεται στο κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης. Καθώς το διάλυμα ανέρχεται της ταινίας, τα προϊόντα δεσμεύονται από ακινητοποιημένα συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια συζευγμένα με σφαιρίδια πολυστυρενίου στις συγκεκριμένες κηλίδες δοκιμασίας και ανιχνεύονται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Τα νανοσφαιρίδια χρυσού προσδένονται μόνο στους εκκινητές που έχουν επεκταθεί μέσω αλληλεπίδρασης απτενίου/αντισώματος (βιοτίνη/αντίσωμα έναντι βιοτίνης) και τα υβρίδια παράγουν χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα υποδηλώνοντας την παρουσία του αντίστοιχου αλληλίου στο δείγμα. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού δεσμεύεται στη ζώνη ελέγχου της ταινίας σχηματίζοντας ακόμη μία κόκκινη κηλίδα, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία του συστήματος. Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να έχουν παρόμοιες θερμοκρασίες τήξης (Τ m ), χρησιμοποιώντας το λογισμικό Primer Premier 5 (Πίν. 2.1). Στο σχήμα 2.2. παρουσιάζεται μία τυπική ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. 60

Σχήμα 2.2. Φωτογραφία μίας τυπικής ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Το βέλος υποδεικνύει τη φορά της ροής του διαλύματος ανάπτυξης. 1 - Χάρτης εμβάπτισης. 2 Χάρτης απόθεσης. 3 Διαγνωστική μεμβράνη. 4 Χάρτης απορρόφησης. TS = κηλίδα δοκιμασίας, CS = κηλίδα ελέγχου. Οι 5 κηλίδες αριστερά αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα, ενώ οι 5 κηλίδες δεξιά αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Η μονή κηλίδα στο πάνω μέρος της ταινίας είναι η κηλίδα ελέγχου, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας. 2.3.2. Μελέτες βελτιστοποίησης Πραγματοποιήθηκαν εκτεταμένες μελέτες βελτιστοποίησης των αντιδράσεων PCR και PEXT, για την επίτευξη της πολλαπλής ανίχνευσης μεταλλάξεων. Συγκεκριμένα, έγινε βελτιστοποίηση της αντίδρασης PCR, έτσι ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη δυνατή απόδοση της αντίδρασης. Επιπρόσθετα, με τις βελτιστοποιήσεις και την τελική επιλογή της πολυμεράσης επιχειρήθηκε να μειωθεί ο χρόνος και το κόστος της αντίδρασης. H απόδοση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή επηρεάζεται από μία σειρά παραγόντων, όπως η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών, η ενεργότητα του ενζύμου, η ποσότητα των εκκινητών, η συγκέντρωση των dntps και η ποσότητα του PCR προϊόντος στην αντίδραση PEXT. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν μελέτες βελτιστοποίησης των παραπάνω παραγόντων προκειμένου να επιτευχθεί ο καλύτερος διαχωρισμός των αλληλόμορφων. Τα αποτελέσματα των μελετών βελτιστοποίησης παρουσιάζονται στο σχήμα 2.3. 61

Σχήμα 2.3. Μελέτες βελτιστοποίησης της πολλαπλής αντίδρασης επέκτασης εκκινητή. (Α) Επίδραση της ποσότητας των αλληλο-ειδικών εκκινητών, (Β) Επίδραση συγκέντρωσης dntps, (Γ) Επίδραση της ποσότητας (fmol) του PCR προϊόντος στην ΡΕΧΤ (Δ) Επίδραση της ενεργότητας του ενζύμου, (Ε) Επίδραση θερμοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητών. Οι συνθήκες και οι συγκεντρώσεις που επιλέχθηκαν τελικά είναι οι εξής: ποσότητα αλληλο-ειδικών εκκινητών 1 pmol ο κάθε ένας, συγκέντρωση dntps 10 μμ το κάθε ένα, ποσότητα PCR προϊόντος στην PEXT 100 fmol, ενεργότητα ενζύμου 1 U ανά αντίδραση και θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 60 ο C. Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω, τα ιχνηθετημένα με βιοτίνη προϊόντα επέκτασης της αντίδρασης PEXT υβριδοποιούνται σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και ανιχνεύονται μέσω νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Η ειδική υβριδοποίηση των προϊόντων και η μετακίνηση των σφαιριδίων χρυσού επάνω στη διαγνωστική μεμβράνη εξασφαλίζεται με τη χρήση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος ανάπτυξης. Επομένως, το διάλυμα ανάπτυξης αποτελεί σημαντικό παράγοντα για τη σωστή λειτουργία της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Ο ρόλος του διαλύματος είναι πολλαπλός εφόσον πρέπει να διευκολύνει την απελευθέρωση των σφαιριδίων χρυσού από τον υαλοβάμβακα, να δημιουργεί συγκεκριμένη ταχύτητα ροής ώστε να υπάρχει επαρκής χρόνος για τις υβριδοποιήσεις και, τέλος, να εμποδίζει τη μη ειδική αλληλεπίδραση των σφαιριδίων χρυσού με τα σφαιρίδια του πολυστυρενίου που έχουν αποτεθεί στη μεμβράνη. Για το λόγο αυτό μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν τα κύρια συστατικά του διαλύματος ανάπτυξης (Σχ. 2.4). 62

Σχήμα 2.4. Μελέτες βελτιστοποίησης των συστατικών του διαλύματος ανάπτυξης. (Α) Επίδραση του άλατος του ρυθμιστικού διαλύματος SSC (1 SSC=15 mμ κιτρικό νάτριο και 150 mμ χλωριούχο νάτριο) (Β) Επίδραση της συγκέντρωσης γλυκερόλης, (Γ) Επίδραση της συγκέντρωσης φορμαμιδίου (Δ) Επίδραση της συγκέντρωσης επιφανειοδραστικού SDS. Οι συγκεντρώσεις που επιλέχθηκαν τελικά είναι οι εξής: συγκέντρωση άλατος ρυθμιστικού διαλύματος SSC 2x, συγκέντρωση γλυκερόλης 20 ml/l, συγκέντρωση φορμαμιδίου 200 ml/l και συγκέντρωση επιφανειοδραστικού SDS 5 g/l. 2.3.3. Ειδικότητα της μεθόδου Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι κάθε εκκινητής που έχει επεκταθεί υβριδοποιείται μόνο στο αντίστοιχο συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιοανιχνευτή πάνω στη μεμβράνη και όχι σε οποιοδήποτε άλλο ακινητοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο, πραγματοποιήθηκε το ακόλουθο πείραμα: χρησιμοποιήθηκαν δύο δείγματα DNA, ένα φυσιολογικό δείγμα και για τις 5 εξεταζόμενες μεταλλάξεις και ένα ετερόζυγο συνθετικό δείγμα και για τις 5 εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Το συνθετικό δείγμα προέκυψε με ανάμιξη ίσων ποσοτήτων προϊόντων PCR από 5 ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα, ένα από την κάθε μετάλλαξη, και το δείγμα αυτό χρησιμοποιήθηκε σαν ετερόζυγο και για τους 10 αλληλο-ειδικούς εκκινητές. Οι αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκαν είτε μόνο με τους 5 αλληλο-ειδικούς εκκινητές για τα φυσιολογικά αλληλόμορφα είτε μόνο με τους 5 αλληλο-ειδικούς εκκινητές για 63

τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Τα αποτελέσματα της μελέτης παρουσιάζονται στο σχήμα 2.5. Όπως φαίνεται και στο σχήμα, θετικά σήματα (κόκκινες κηλίδες) εμφανίζονται μόνο στις θέσεις που περιέχουν τους αντίστοιχους ακινητοποιημένους ανιχνευτές για τα φυσιολογικά αλληλόμορφα, είτε παρουσία φυσιολογικού δείγματος είτε παρουσία ετερόζυγου δείγματος. Κόκκινες κηλίδες, σε θέσεις όπου είναι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, εμφανίστηκαν μόνο στην περίπτωση του ετερόζυγου συνθετικού δείγματος. Η επέκταση των εκκινητών για τα φυσιολογικά αλληλόμορφα στην αντίδραση με το συνθετικό δείγμα οφείλεται στο γεγονός ότι τα δείγματα που αναμίχθηκαν είναι ομόζυγα μεταλλαγμένα για μια και μόνο μετάλλαξη, ενώ για τις υπόλοιπες μεταλλάξεις είναι ομόζυγα φυσιολογικά. Έτσι, στο συνθετικό δείγμα, εκτός των μεταλλαγμένων αλληλόμορφων βρίσκονται και φυσιολογικά αλληλόμορφα. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη μελέτη παρουσιάζονται στον πίνακα 2.1. Σχήμα 2.5. Ειδικότητα της μεθόδου. Χρησιμοποιήθηκαν δύο δείγματα DNA, ένα φυσιολογικό και για τις 5 μεταλλάξεις και ένα ετερόζυγο συνθετικό δείγμα και για τις 5 μεταλλάξεις. Οι αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκαν είτε μόνο παρουσία των εκκινητών για τα φυσιολογικά αλληλόμορφα είτε μόνο παρουσία των εκκινητών για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Τα προϊόντα αναλύθηκαν με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. 64

2.3.4. Επαναληψιμότητα της μεθόδου Μελετήθηκε η συνολική επαναληψιμότητα της δοκιμασίας, συμπεριλαμβανομένης της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο σχήμα 2.6. Τρία δείγματα (ομοζυγώτη φυσιολογικού, ετεροζυγώτη για τη μετάλλαξη FSC- 5 και ομοζυγώτη μεταλλαγμένου για την ίδια μετάλλαξη) υποβλήθηκαν σε τρεις ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή. Για τον προσδιορισμό της επαναληψιμότητας μόνο της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (εντός προσδιορισμού), κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε μια αντίδραση επέκτασης εκκινητή και τα προϊόντα της αντίδρασης ανιχνεύτηκαν 5 φορές σε ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων (Σχ. 2.6 αριστερά). Για τον προσδιορισμό της επαναληψιμότητας της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (μεταξύ των προσδιορισμών), κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε 3 αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή και κάθε αντίδραση μετρήθηκε εις διπλούν σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων (Σχ. 2.6 δεξιά). Όπως παρουσιάζεται και στο σχήμα η επαναληψιμότητα της μεθόδου είναι πολύ ικανοποιητική. 65

Σχήμα 2.6. Επαναληψιμότητα εντός προσδιορισμού και μεταξύ προσδιορισμών της προτεινόμενης μεθόδου. Οι μεταλλάξεις που αναλύθηκαν σε αυτές τις ταινίες είναι οι εξής: -101, IVSII-848, term+6, FSC-5, FSC-8. Τα ειδικά σφαιρίδια για τα φυσιολογικά και τα μεταλλαγμένα αλλήλια έχουν αποτεθεί με αυτή τη σειρά των μεταλλάξεων από κάτω προς τα πάνω. 2.3.5. Αξιολόγηση της μεθόδου Η μέθοδος πολλαπλής γονοτύπησης που αναπτύχθηκε στην παρούσα εργασία εφαρμόστηκε σε κλινικά δείγματα για την ταυτόχρονη ανίχνευση 5 μεταλλάξεων σε τμήμα του γονιδίου της β-σφαιρίνης 1896 bp. Αναλύθηκαν 45 χαρακτηρισμένα κλινικά δείγματα και άλλα 39 δείγματα άγνωστου γονότυπου και τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με τις μεθόδους αναφοράς (DGGE, ARMS-PCR, real-time PCR και αλληλούχιση DNA) για όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν αποδεικνύοντας την κλινική χρησιμότητα της γονοτύπησης φορέων και ασθενών με ακρίβεια. Ενδεικτικά αποτελέσματα της γονοτύπησης 30 κλινικών δειγμάτων με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και 66

ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, παρουσιάζονται στο σχήμα 2.7. Στα πλαίσια της συνολικής μελέτης που πραγματοποιήθηκε, έγινε η γονοτύπηση 12 δειγμάτων με 30/πλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και τα αποτελέσματα ήταν σε πλήρη συμφωνία με αυτά που προέκυψαν από τρεις ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή για κάθε δείγμα [29]. Για την εύκολη ερμηνεία των αποτελεσμάτων η ταινία διαμορφώθηκε κατά τέτοιο τρόπο, ώστε οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα 5 φυσιολογικά αλληλόμορφα αποτέθηκαν στην αριστερή πλευρά της μεμβράνης, ενώ οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα 5 μεταλλαγμένα αλληλόμορφα αποτέθηκαν στη δεξιά πλευρά της μεμβράνης. Ο γονότυπος για κάθε αλλήλιο προσδιορίζεται παρατηρώντας κάθε ζεύγος κηλίδων. Για οποιοδήποτε συγκεκριμένο πολυμορφισμό, ένα δείγμα φυσιολογικού ομοζυγώτη θα δώσει κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο θα δώσει κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα του ζεύγους. Θα εμφανιστεί κόκκινο και στις δύο κηλίδες αν το δείγμα προέρχεται από ετεροζυγώτη για αυτή την πολυμορφική περιοχή. Σχήμα 2.7. Ενδεικτικά αποτελέσματα γονοτύπησης 30 κλινικών δειγμάτων για τις μεταλλάξεις -101, IVSII-848, term+6, FSC5 και FSC8 με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Τα σφαιρίδια πολυστυρενίου για τα φυσιολογικά και τα μεταλλαγμένα αλλήλια έχουν αποτεθεί με αυτή τη σειρά από κάτω προς τα πάνω. Οι 5 κηλίδες αριστερά αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα, ενώ οι 5 κηλίδες δεξιά αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Η μονή κηλίδα στο πάνω μέρος της ταινίας είναι η κηλίδα ελέγχου, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας. 67

Σε πολύ κοντινή απόσταση από την περιοχή του γονιδίου που βρίσκεται η μετάλλαξη μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης FSC8 AAG> G δύναται να υπάρχουν και άλλες μεταλλάξεις, όπως η μετάλλαξη που προκαλεί δρεπανοκυτταρική αναιμία HbS (GAG>GTG) και οι μεταλλάξεις μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης FSC5 CCT>C και FSC6 GAG>G-G. Κατά τη γονοτύπηση των δειγμάτων σε δείγμα που φέρει κάποια από τις τρεις αυτές μεταλλάξεις, λόγω έλλειψης απόλυτης συμπληρωματικότητας δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί επέκταση των αλληλο-ειδικών εκκινητών για τη μετάλλαξη FSC8, επομένως, δε θα σχηματιζόταν έγχρωμη κηλίδα στον βιοαισθητήρα. Ως εκ τούτου, ο ακριβής γονότυπος (ομόζυγα φυσιολογικός, ετερόζυγος, ομόζυγα μεταλλαγμένος) για τη συγκεκριμένη μετάλλαξη δε θα μπορούσε να προσδιοριστεί μέσω της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Για το λόγω αυτό, για τη μετάλλαξη FSC8 επιλέχθηκαν ανάστροφοι αλληλο-ειδικοί εκκινητές, οι οποίοι υβριδοποιούνται στην περιοχή του γονιδίου δεξιά της μετάλλαξης, όπου η υβριδοποίηση τους δεν παρεμποδίζεται από την παρουσία άλλων μεταλλάξεων. Το ίδιο συμβαίνει και με τη μετάλλαξη FSC5, όπου σε αυτή την περίπτωση αντιθέτως επιλέχθηκαν πρόσθιοι αλληλο-ειδικοί εκκινητές (Σχ. 2.8). Σχήμα 2.8. Σχηματική παράσταση του γονιδίου ΗΒΒ και των σχετικών θέσεων των εκκινητών και των 5 εξεταζόμενων μεταλλάξεων. Με κόκκινα βέλη υποδεικνύονται οι 2 εκκινητές της PCR, HBB-F και HBB-R. Με μικρότερα βέλη υποδεικνύονται οι 5 εξεταζόμενες μεταλλάξεις και η θέση των αλληλο-ειδικών εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την αντίδραση PEXT. Για την ανίχνευση της κάθε μετάλλαξης χρησιμοποιούνται δύο εκκινητές οι οποίοι διαφέρουν μόνο σε μία βάση στο 3 άκρο τους που καθορίζει και το αλληλόμορφο με το οποίο είναι συμπληρωματικοί. Όλοι οι εκκινητές για την PEXT φέρουν στο 5 άκρο τους ειδική αλληλουχία αναγνώρισης. Για τη μετάλλαξη FSC8 επιλέχθηκαν ανάστροφοι 3-5 αλληλο-ειδικοί εκκινητές, η υβριδοποίηση των οποίων δεν παρεμποδίζεται από την παρουσία άλλων μεταλλάξεων. Το ίδιο συμβαίνει και με τη μετάλλαξη FSC5, όπου σε αυτή την περίπτωση, αντιθέτως, επιλέχθηκαν πρόσθιοι 5-3 αλληλο-ειδικοί εκκινητές. 68

2.4. Συμπεράσματα Η εξέταση των φορέων θαλασσαιμίας βασίζεται στον πλήρη αιματολογικό έλεγχο και στην ανάλυση της αιμοσφαιρίνης. Ωστόσο, για την οριστική διάγνωση φορέων και ασθενών, καθώς και για την προγεννητική διάγνωση, η γονοτυπική ανάλυση είναι θεμελιώδους σημασίας για τη διαχείριση της πορείας της νόσου, τη γενετική συμβουλευτική και την πρόληψη [27]. Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη μιας απλής, χαμηλού κόστους και ταχείας μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση 5 μεταλλάξεων στο γονίδιο της β-σφαιρίνης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται σε τρία βασικά βήματα. Το πρώτο βήμα περιλαμβάνει αντίδραση PCR για την ενίσχυση τμήματος 1896 bp του γονιδίου της β σφαιρίνης, που περιλαμβάνει τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Το δεύτερο βήμα περιλαμβάνει 10πλή αντίδραση επέκτασης αλληλο-ειδικών εκκινητών (δύο εκκινητές για κάθε μετάλλαξη) και χρήση του μη καθαρισμένου ενισχυμένου PCR προϊόντος σαν αλληλουχία στόχο. Το πλεονέκτημα αυτού του σημείου της μεθόδου είναι ότι αποκλείει στάδια καθαρισμού μετά την αντίδραση PCR, ελαχιστοποιώντας έτσι το χρόνο της διαδικασίας και τον κίνδυνο μεταφοράς επιμολύνσεων. Κατά την αντίδραση επέκτασης εκκινητή ενσωματώνονται μόρια βιοτίνης στους επεκταμένους αλληλο-ειδικούς εκκινητές, οι οποίοι αντιπροσωπεύουν μόνο τα αλλήλια που είναι παρόντα στο κάθε δείγμα. Το τρίτο βήμα περιλαμβάνει μία δοκιμασία με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων κατά την οποία η ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης πραγματοποιείται με γυμνό μάτι εντός λίγων λεπτών. Για την οπτική ανίχνευση χρησιμοποιούνται νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Με τη βελτιστοποίηση των συνθηκών των επιμέρους σταδίων επιτεύχθηκε η καλύτερη οπτική διάκριση των αλληλόμορφων. Εξαιτίας της υψηλής ανιχνευσιμότητας που προσφέρουν τα νανοσφαιρίδια χρυσού, απαιτούνται πολύ λίγοι κύκλοι για την αντίδραση επέκτασης εκκινητή, ενώ παράλληλα επιτυγχάνεται υψηλή ειδικότητα και απουσία μη ειδικής επέκτασης των αλληλο-ειδικών εκκινητών. Ολόκληρο το πρωτόκολλο της μεθόδου που αναπτύχθηκε, συμπεριλαμβανομένης της αντίδρασης PCR, της 69

αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και της οπτικής ανίχνευσης με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων διαρκεί ~2 ώρες. Η μέθοδος αξιολογήθηκε με την ανάλυση δειγμάτων ασθενών και φορέων. Τα αποτελέσματα και της ανάλυσης δειγμάτων άγνωστου γονότυπου βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με τους γονότυπους που είχαν προκύψει με μεθόδους αναφοράς. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε είναι απλή, γρήγορη, χαμηλού κόστους και δεν απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό και πρόσθετα στάδια καθαρισμού των προϊόντων ενίσχυσης. Απαιτείται μόνο ένας συμβατικός θερμικός κυκλοποιητής. Επιπροσθέτως, η συνεχής ροή του διαλύματος ανάπτυξης κατά μήκος της ταινίας μέσω τριχοειδών δυνάμεων εξασφαλίζει την αποτελεσματική έκπλυση της περίσσειας των αντιδραστηρίων, εξαλείφοντας με αυτό τον τρόπο τις επιπλέον προσθήκες αντιδραστηρίων, επωάσεις και εκπλύσεις, που αποτελούν βασικά στάδια άλλων μεθόδων γονοτύπησης, ενώ τα αποτελέσματα μπορούν να αξιολογηθούν σχεδόν αμέσως με γυμνό μάτι, χωρίς τη χρήση οποιουδήποτε οργάνου. Το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε μπορεί να προσαρμοστεί και να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των πιο κοινών μεταλλάξεων σε διάφορες πληθυσμιακές ομάδες, όπου οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι ενδημικές, έχοντας κατά νου ότι σπάνια απαιτείται να ανιχνευθούν περισσότερες των 10-15 μεταλλάξεων. Έτσι, η προτεινόμενη μέθοδος αντιπροσωπεύει ένα δυνητικά χρήσιμο εργαλείο για δοκιμασίες στο σημείο φροντίδας του ασθενούς ή σε κέντρα με περιορισμένους πόρους, όπως συνήθως συναντώνται στις υπανάπτυκτες περιοχές του κόσμου όπου οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι ιδιαίτερα διαδεδομένες. Τέλος, η αρχή της μεθόδου θα μπορούσε να προσαρμοστεί για την ταχεία γονοτύπηση μεταλλάξεων σε οποιοδήποτε γονίδιο, για παράδειγμα στο πλαίσιο της φαρμακογονιδιωματικής και της εξατομικευμένης ιατρικής. Τα δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της μεθόδου και την αξιολόγηση της παρέχονται από το νοσοκομείο, όπου ένα αυτοματοποιημένο ρομποτικό σύστημα χρησιμοποιείται για την ανάλυση ρουτίνας. Ωστόσο, πρέπει να επισημανθεί ότι υπάρχουν εμπορικά διαθέσιμες 70

DNA πολυμεράσες που επιτρέπουν την ενίσχυση με αντίδραση PCR κατευθείαν από πλήρες αίμα, αποφεύγοντας έτσι το στάδιο απομόνωσης του γενωμικού DNA. Κατά συνέπεια, ο συνδυασμός της αντίδρασης PCR κατευθείαν από ολικό αίμα με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων μπορεί να αποτελέσει τη βάση για ένα σύστημα στο σημείο φροντίδας του ασθενούς. 71

Πίνακας 2.1. Εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Ολιγονουκλεοτίδιο Αλληλουχίες 5 3 Εκκινητές για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΒ HBB-FW: nt 70406-70432 HBB-RV: nt 72268-72301 CCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACT GTTTGCAGCCTCACCTTCTTTCATGGAGTTTAAG Αλληλο-ειδικοί εκκινητές της αντίδρασης ΡΕΧΤ FSC5 (N) (HBB:c.17_18delCT) FSC5 (M) (HBB:c.17_18delCT) FSC8 (N) (HBB:c.25_26delAA) FSC8 (M) (HBB:c.25_26delAA) -101 (Ν) (HBB:c.-151C>T) -101 (M) (HBB:c.-151C>T) IVSII-848 (Ν) (HBB:c.316-3C>A) IVSII-848 (M) (HBB:c.316-3C>A) TCAAAATCTCAAATACTCAAATCACCGAATTCTCTC CACCATGGTGCATCTGACTCC CTACAAACAAACAAACATTATCAACCGAATTCTCTC CACCATGGTGCATCTGACTCG TCATTTACCAATCTTTCTTTATACCCGAATTCTCTC CACAGGGCAGTAACGGCAGACT ATACTAACTCAACTAACTTTAAACCCGAATTCTCTC ACAGGGCAGTAACGGCAGACC TACATTACCAATAATCTTCAAATCCCGAATTCTCTC GGCTGTCATCACTTAGACCTCATCC ATCATACATACATACAAATCTACACCGAATTCTCTC GGCTGTCATCACTTAGACCTCATCT CTTTTTCAATCACTTTCAATTCATCCGAATTCTCTC GTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCAC CTATCTATCTAACTATCTATATCACCGAATTCTCTC CATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCAA 72

term+6 (Ν) (HBB:c.*+6C>G) term+6 (Μ) (HBB:c.*+6C>G) TAACATTACAACTATACTATCTACCCGAATTCTCTC GGAACCTTTAATAGAAATTGGACAGCAAGAAAG TCATCAATCAATCTTTTTCACTTTCCGAATTCTCTC GGAACCTTTAATAGAAATTGGACAGCAAGAAAC Ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές (anti-tags) FSC5 (N) B00 NH2 TGATTTGAGTATTTGAGATTTTGA FSC5 (M) B01 NH2 TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG FSC8 (N) 900 NH2 GTATAAAGAAAGATTGGTAAATGA FSC8 (M) 901 NH2 GTTTAAAGTTAGTTGAGTTAGTAT -101 (Ν) C00 NH2 GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA -101 (M) C01 NH2 TGTAGATTTGTATGTATGTATGAT IVSII-848 (Ν) G00 NH2 ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG IVSII-848 (M) G01 NH2 TGATATAGATAGTTAGATAGATAG term+6 (Ν) H00 NH2 GTAGATAGTATAGTTGTAATGTTA term+6 (Μ) H01 NH2 AAAGTGAAAAAGATTGATTGATGA * Στον παραπάνω πίνακα η χαρακτηριστική αλληλουχία αναγνώρισης (tag) καθενός εκκινητή της ΡΕΧΤ φαίνεται με μπλε χρώμα, ενώ με πλάγια γραφή σημειώνεται μια αλληλουχία spacer. Με έντονη μαύρη γραφή σημειώνεται η αλληλο-ειδική περιοχή των γονοτυπικών εκκινητών. 73

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΗΒΒ (NCBI Reference Sequence: NC_000011.9) ORIGIN 1 acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 61 tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 121 ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 181 atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg cactgactct 241 ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag 301 aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag 361 gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac 421 aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat 481 cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt ttctttcccc ttcttttcta 541 tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg tacagtttag aatgggaaac 601 agacgaatga ttgcatcagt gtggaagtct caggatcgtt ttagtttctt ttatttgctg 661 ttcataacaa ttgttttctt ttgtttaatt cttgctttct ttttttttct tctccgcaat 721 ttttactatt atacttaatg ccttaacatt gtgtataaca aaaggaaata tctctgagat 781 acattaagta acttaaaaaa aaactttaca cagtctgcct agtacattac tatttggaat 841 atatgtgtgc ttatttgcat attcataatc tccctacttt attttctttt atttttaatt 901 gatacataat cattatacat atttatgggt taaagtgtaa tgttttaata tgtgtacaca 961 tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa aaaatgcttt cttcttttaa 1021 tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat 1081 aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg 1141 ggttaaggca atagcaatat ctctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat 1201 gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt 1261 atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt 1321 catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca 1381 tcactttggc aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg 1441 tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1501 attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1561 ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgc // 74

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ ΠΙΝΑΚΑΣ ΤΩΝ 15 ΣΥΧΝΟΤΕΡΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΗΒΒ ΣΤΟΝ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΠΛΗΘΥΣΜΟ ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΚΔΗΛΩΣΗ ΣΧΕΤΙΚΗ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΣΤΟΝ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΠΛΗΘΥΣΜΟ HGVS nomenclature IVSI-110 G>A β + -θαλασσαιμία 43% HBB:c.93-21G>A CD39 C>T β 0 -θαλασσαιμία 19% HBB:c.118C>T IVSI-1 G>A β 0 -θαλασσαιμία 14% HBB:c.92+1G>A IVSI-6 T>C β + -θαλασσαιμία 8% HBB:c.92+6T>C HbS GAG>GTG δρεπανοκυτταρική αναιμία 8% HBB:c.20A>T IVSII-745 C>G β + -θαλασσαιμία 7% HBB:c.316-106C>G FSC6 GAG>G-G β 0 -θαλασσαιμία 3% HBB:c.20delA IVSII-1 G>A β 0 -θαλασσαιμία 2% HBB:c.315+1G>A -87 C>G β + -θαλασσαιμία 2% HBB:c.-137C>G FSC5 CCT>C β 0 -θαλασσαιμία 1% HBB:c.17_18delCT IVSI-5 G>A β+-θαλασσαιμία 1% HBB:c.92+1G>A FSC8 AAG> G β 0 -θαλασσαιμία <1% HBB:c.25_26delAA IVSII-848 C>A β + -θαλασσαιμία <1% HBB:c.316-3C>A 101 C>T β + -θαλασσαιμία <1% HBB:c.-151C>T term+6 C>G β + -θαλασσαιμία <1% HBB:c.*+6C>G 75

Κεφάλαιο 3 Ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης για τη γονοτύπηση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων του γονιδίου HBA2 με αντίδραση επέκτασης εκκινητή 3.1. Εισαγωγή Όπως αναφέρθηκε και στο δεύτερο κεφάλαιο, οι θαλασσαιμίες είναι κληρονομικές ανωμαλίες παραγωγής αιμοσφαιρίνης, στις οποίες η πρωτογενής επιπλοκή είναι μία ποσοτική ανεπάρκεια είτε της β-σφαιρίνης που οδηγεί στη β-θαλασσαιμία, είτε της α-σφαιρίνης που οδηγεί στην α- θαλασσαιμία. Όπως η β, έτσι και η α-θαλασσαιμία κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο. Έχουν περιγραφεί παγκοσμίως πολλές διαφορετικές διαταραχές σε επίπεδο DNA, οι οποίες προκαλούν α- θαλασσαιμία. Η πλειοψηφία των διαταραχών αυτών είναι ελλείμματα, με αποτέλεσμα την απομάκρυνση ολόκληρης ή μέρους της συστοιχίας των α- γονιδίων στην τελομερική περιοχή του χρωμοσώματος 16 (16p 13.3). Πιο σπάνιες είναι οι σημειακές μεταλλάξεις ή τα μικρά ελλείμματα στα δύο α- γονίδια σφαιρίνης (αναφέρονται και ως μη ελλειμματικές μεταλλάξεις, nondeletional mutations) [30, 31]. Οι μη ελλειμματικές μεταλλάξεις μπορεί να οδηγήσουν σε μια πιο σοβαρή μείωση στη σύνθεση των α-αλυσίδων από τα ελλείμματα των χρωμοσωμάτων. Οι μεταλλάξεις που προκαλούν μικρή απώλεια στη σύνθεση των α-αλυσίδων αναφέρονται ως μεταλλάξεις α + (ή α- θαλασσαιμία-2), ενώ εκείνες που προκαλούν ολοκληρωτική απώλεια της σύνθεσης των α-σφαιρινικών αλυσίδων αναφέρονται ως μεταλλάξεις α 0 (ή α- θαλασσαιμία-1). Η ύπαρξη οποιουδήποτε τύπου μετάλλαξης, που οδηγεί σε δυσλειτουργία του ενός ή και των δύο α γονιδίων μπορεί να προκαλέσει ελαφρά μείωση του όγκου και του μεγέθους των ερυθρών αιμοσφαιρίων, η οποία δεν είναι κλινικά σημαντική. Απώλεια της λειτουργίας τριών α γονιδίων οδηγεί στην αιμοσφαιρινοπάθεια H, την πιο σοβαρή μορφή της α- 76

θαλασσαιμίας που είναι συμβατή με τη ζωή [32]. Η απώλεια και των τεσσάρων α-γονιδίων είναι ασύμβατη με τη ζωή, καθώς το έμβρυο είτε αποβιώνει ενδομητρίως, είτε αναπτύσσει ύδρωπα και αποβιώνει μετά τον τοκετό. Ο εμβρυϊκός ύδρωπας οφείλεται συνήθως στην συγκληρονόμηση δύο μεταλλάξεων α 0 -θαλασσαιμίας και, επομένως, στην ολοκληρωτική απουσία παραγωγής α-αλυσίδων. Υπάρχουν περισσότερες από 40 σημειακές μεταλλάξεις και μικρά ελλείμματα που προκαλούν α-θαλασσαιμία. Οι αλλαγές αυτές εντοπίζονται πιο συχνά στο HBA2 γονίδιο και λιγότερο στο HBA1. Πολλές από τις σημειακές μεταλλάξεις και τα μικρά ελλείμματα έχουν περιγραφεί και επηρεάζουν το μάτισμα του mrna, την επεξεργασία του mrna και τη μετάφραση του mrna. Προκαλούν, επίσης, τη σύνθεση ασταθών α-αλυσίδων αιμοσφαιρίνης. Στον πίνακα 3.1 παρουσιάζονται όλες οι γνωστές μη ελλειμματικές αλλαγές που προκαλούν α-θαλασσαιμία. Από αυτές οι πιο κοινές μη ελλειμματικές αλλαγές είναι η IVS1(Hph), οι μεταλλάξεις στην ουρά πολυαδενυλίωσης polya (AATAAG), Turkish polya (AATGAA) και PolyA; AATAAA->AATA- -, οι μεταλλάξεις του κωδικονίου τερματισμού, που οδηγούν σε μία επιμήκη α- αλυσίδα, όπως η Hb Constant Spring, η Hb Icaria, η Hb Koya Dora, η Hb Seal Rock και η Hb Pakse και οι μεταλλάξεις που προκαλούν τη σύνθεση υπερασταθών αιμοσφαιρινών, όπως η Hb Quong Sze, η Hb Suan Dok, η Hb Petah Tikvah, η Hb Adana, η Hb Aghia Sophia [33, 34]. Η α-θαλασσαιμία είναι πολύ συχνή σε άτομα που κατάγονται από τη ΝΑ Ασία, τη Μεσόγειο και την Αφρική. Η συχνότητα των φορέων θαλασσαιμικών αλληλόμορφων ποικίλλει από 10-20% σε περιοχές της υποσαχάριας Αφρικής, >40% σε πληθυσμούς της Μ. Ανατολής και της Ινδίας και φτάνει μέχρι το 80% στη βόρεια Παπούα-Νέα Γουινέα και απομονωμένες ομάδες στην ΝΑ Ινδία [35]. Στην Ελλάδα, το 7% του γενικού πληθυσμού είναι φορείς α + - θαλασσαιμίας (έλλειμμα 3.7 kb, α 3.7 ) και άλλο 1% είναι φορείς κάποιου α 0 - ελλείμματος ή, πιο σπάνια, μετάλλαξης που αδρανοποιεί ένα α γονίδιο (nondeletional). Οι φορείς των μεταλλάξεων στα α-γονίδια είναι δύσκολο να διαγνωσθούν καθώς οι αιματολογικές τους παράμετροι είναι συνήθως εντός φυσιολογικών ορίων και, επίσης, δεν παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της HbA2 ή της 77

HbF. Η ανάπτυξη όμως των σύγχρονων μοριακών τεχνικών συνέβαλε σημαντικά στη διάγνωσή τους, καθώς και στη συσχέτιση γονοτύπουφαινοτύπου. Για την ανίχνευση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων (nondeletional) στο γονίδιο της α σφαιρίνης, η αλληλούχιση κατά Sanger είναι η μέθοδος αναφοράς. Εν τούτοις, στα κλινικά εργαστήρια, η ανίχνευση γνωστών μεταλλάξεων σε πληθυσμούς με συγκεκριμένο φάσμα μεταλλάξεων πραγματοποιείται κυρίως χρησιμοποιώντας γνωστές, καθιερωμένες μεθόδους, όπως είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με περιοριστικά ένζυμα (RE-PCR), η αλληλοειδική αντίδραση πολυμεράσης (ARMS), η αλληλο-ειδική ανίχνευση των μεταλλάξεων του ενισχυμένου DNA βασιζόμενη στην υβριδοποίηση των PCR προϊόντων με αλληλο-ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές (ASO) [36]. Πιο πρόσφατα, το pyrosequencing [37] και η ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMA) [38], αναπτύχθηκαν για την ανίχνευση και τη γονοτύπηση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων του γονιδίου της α σφαιρίνης. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μέθοδος, η οποία επιτρέπει την απευθείας ανίχνευση διά γυμνού οφθαλμού των 13 συχνότερων μη ελλειμματικών μεταλλάξεων του γονιδίου της α σφαιρίνης σε πληθυσμούς γύρω από τη Μεσόγειο και τη Μέση Ανατολή, με τη χρήση ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων [39]. Στο παρόν κεφάλαιο περιγράφεται η ανάπτυξη και η βελτιστοποίηση της μεθόδου όσον αφορά στις 10 από τις 13 γνωστές μεταλλάξεις, οι οποίες συναντώνται στο α2 γονίδιο της σφαιρίνης. Οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις ανήκουν στις μη ελλειμματικές (non-deletional) που προκαλούν α + - ή α 0 -θαλασσαιμία, ανάλογα με το αν συνυπάρχουν με άλλες μεταλλάξεις, ελλειμματικές ή μη. Συγκεκριμένα, οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις αποτελούν είτε αντικατάσταση βάσης, είτε ελλείμματα μερικών βάσεων. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε περιλαμβάνει: (i) ενίσχυση με αντίδραση PCR ενός τμήματος του HBA2 γονιδίου (χωρίς την ταυτόχρονη ενίσχυση του HBA1 γονιδίου), που περιέχει όλες τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις με τη χρήση ενός απλού θερμικού κυκλοποιητή, (ii) πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή, μόνο 10 κύκλων, ακολουθούμενη από (iii) οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης, εντός λίγων λεπτών, με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. 78

Πίνακας 3.1. Μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που προκαλούν α-θαλασσαιμία [33] 79

Πίνακας 3.1. Μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που προκαλούν α-θαλασσαιμία (συνέχεια) Del: deletion (έλλειμμα), Dup: duplication (διπλασιασμός), ins: insertion (ένθεση), cd: codon (κωδικόνιο), PA: poly(a) signal (περιοχή πολυαδενυλίωσης), term: termination codon (κωδικόνιο τερματισμού), init: initiation codon (κωδικόνιο έναρξης). * Τα ομόλογα γονίδια α-σφαιρίνης, α1 και α2 στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 16, ονομάζονται HBA1 και HBA2 αντίστοιχα, σύμφωνα με την ονοματολογία κατά HUGO. 80

3.2. Οργανολογία & Μέθοδοι 3.2.1. Οργανολογία Η οργανολογία αναγράφεται στο κεφάλαιο 2 (2.2.1). 3.2.2. Κλινικά δείγματα 75 δείγματα γενωμικού DNA υγειών και ασθενών με α-θαλασσαιμία διατέθηκαν από το Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών με έδρα το Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο στο Νοσοκομείο Παίδων Αγία Σοφία. Η απομόνωση γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε από περιφερικό αίμα με το αυτοματοποιημένο ρομποτικό σύστημα Biorobot M48 Workstation (Qiagen, Hilden, Germany) και το εμπορικά διαθέσιμο kit MagAttract DNA Blood midi M48 Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που συνιστά ο κατασκευαστής. Η γονοτύπηση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στο HBA2 γονίδιο πραγματοποιήθηκε με αλληλοειδική PCR (Amlification Refractory Mutation System, ARMS-PCR), αλληλοειδικό ολιγονουκλεοτιδικό υβριδισμό (ASO), αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με περιοριστικά ένζυμα, και άμεση αλληλούχιση (sequencing), όπως έχει περιγραφεί [40]. Οι μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που αναλύθηκαν σε αυτή την εργασία παρουσιάζονται στον πίνακα 3.2. 81

Πίνακας 3.2. Οι μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που εξετάστηκαν στην παρούσα διατριβή. Γονίδιο/ταινία Γονότυπος (Συμβατική ονοματολογία) Ονοματολογία HGVS Hb Adana c.179g>a Hb Icaria c.427t>a HBA2/ταινία 1 Hb Agrinio c.89t>c IVS1 (Hph) c.95+2_95+6deltgagg PolyA c*.+94a>g Initiation codon c.2t>c IVS1-116 c.96-2a>g HBA2/ταινία 2 Hb Questembert c.394t>c Turkish polya c*.+92a>g Constant Spring c.427t>c 3.2.3. Σχεδίαση εκκινητών Όλοι οι PCR εκκινητές και οι αλληλο-ειδικοί εκκινητές για την πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη σχεδιάστηκαν in silico με τα λογισμικά προγράμματα PrimerPremier5 και PrimerPlex2 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA). Από τη στιγμή που οι μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που αφορούν στα γονίδια α σφαιρίνης μπορούν να εδράζονται είτε στο HBA1 είτε στο HBA2 γονίδιο (NG_000006), χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά ζεύγη εκκινητών για την επιλεκτική ενίσχυση καθενός από τα γονίδια HBA1 και HBA2 που χαρακτηρίζονται από υψηλή ομολογία. Στην παρούσα διατριβή εξετάζεται μόνο το γονίδιο HBA2. Το προϊόν ενίσχυσης του γονιδίου HBA2 (1087 bp) που περικλείει τις 10 εξεταζόμενες μεταλλάξεις, χρησιμοποιήθηκε, στη συνέχεια, σαν αλληλουχία- 82

στόχος για τη γονοτύπηση με αντίδραση επέκτασης εκκινητή παρουσία αλληλο-ειδικών εκκινητών [39]. Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές και ανιχνευτές στα πλαίσια της παρούσας μελέτης συντέθηκαν από την εταιρεία VBC Genomics (Wien, Austria) και παρουσιάζονται στον πίνακα 3.3. στο τέλος του κεφαλαίου. 3.2.4. Γονοτύπηση 10 μεταλλάξεων στο γονίδιο ΗΒΑ2 με πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων Οι 10 μεταλλάξεις που αναλύθηκαν στην παρούσα διατριβή είναι οι εξής: Initiation Codon, Hb Agrinio, IVS1-116, Hb Adana, Hb Questembert, Hb Icaria, Hb Constant Spring, polya, Turkish polya. Η δοκιμασία γονοτύπησής τους περιλαμβάνει (i) ενίσχυση με PCR ενός τμήματος 1087 bp του γονιδίου HBA2 (Gene Bank Accession Number NG_000006.1), το οποίο περιλαμβάνει τις παραπάνω μη ελλειμματικές μεταλλάξεις, (ii) μία 10απλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή με αλληλουχία-στόχο το μη καθαρισμένο ενισχυμένο PCR προϊόν, παρουσία αλληλο-ειδικών εκκινητών και δεοξυνουκλεοτιδίων επισημασμένων με βιοτίνη. Χρησιμοποιούνται δύο εκκινητές για κάθε μετάλλαξη, ένας συμπληρωματικός στο φυσιολογικό αλληλόμορφο και ένας συμπληρωματικός στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. (iii) ανίχνευση των επεκταμένων προϊόντων PEXT με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. Η σύζευξη των NH 2 -ολιγονουκλεοτιδίων με τα καρβοξυλιωμένα σφαιρίδια πολυστυρενίου (διαμέτρου 2μm) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε στο κεφάλαιο 2 (2.2.2). Το ίδιο ισχύει και για τη σήμανση των προσδεμένων ολιγονουκλεοτιδίων στα σφαιρίδια πολυστυρενίου με βιοτίνη. Το πρωτόκολλο περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο 2. Όσον αφορά τη σύζευξη των νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα έναντι βιοτίνης, ισχύει το ίδιο πρωτόκολλο που περιγράφεται στο κεφάλαιο 2 με τη διαφορά ότι η τελική ανασύσταση γίνεται σε 50 μl διαλύματος (BSA 1 g/l σε διάλυμα βόρακα 2 mm που περιέχει 1 g/l NaN 3 ) (2.2.3.). 83

Ενίσχυση με αντίδραση PCR τμήματος του γονιδίου HBA2 Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl, που περιείχε 1 U πολυμεράσης Kapa 2G Fast DNA polymerase (Kapabiosystems, Cambridge, MA, USA), 1x ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ από κάθε dntp, 0,25 μμ από κάθε εκκινητή από τους 5 - TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3 (forward, πρόσθιος) και 5 - CTCCATTGTTGGCACATTCCG-3 (reversre, ανάστροφος), 75 ml/l DMSO και ~100 ng γενωμικού DNA. Οι συνθήκες του προγράμματος της αντίδρασης PCR είναι οι εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 95 o C για 30 s, 60 o C για 30 s, 72 o C για 30 s. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Στην αντίδραση PCR συμπεριλήφθησαν αρνητικά δείγματα ελέγχου. Πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή Η ανίχνευση των 10 μεταλλάξεων του γονιδίου HBA2 (20 αλλήλια) πραγματοποιήθηκε με δύο 10απλές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, κάθε μία εκ των οποίων κάλυπτε 5 μεταλλάξεις (10 αλλήλια). Οι πολλαπλές (10απλές) αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκαν σε μίγμα αντίδρασης όγκου 20 μl που περιείχε 1 U AmpliTaq DNA πολυμεράση, Stoffel fragment (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1x ρυθμιστικό διάλυμα (10 mm Tris- HCl, 10 mm KCl, ph 8,3), 4 mm MgCl 2, ~100 fmol ενισχυμένου προϊόντος PCR, 1 pmol από καθέναν από τους 10 αλληλο-ειδικούς εκκινητές, και 10 μm από κάθε ένα από τα datp, dctp, dgtp, 5 μμ dttp και 5 μμ biotin-dutp. Το πρόγραμμα της δεκαπλής αντίδρασης PEXT ήταν το εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min, ακολουθούμενη από 10 κύκλους στους 95 o C για 15 s, 60 o C για 15 s, 72 o C για 15 s. Όλα τα προϊόντα επέκτασης, στο τέλος, υποβλήθηκαν σε ένα τελικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 10 min και αμέσως μετά τοποθετήθηκαν απευθείας στον πάγο πριν αναλυθούν με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. 84

Κατασκευή ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Όπως αναφέρθηκε και στο προηγούμενο κεφάλαιο, η ταινία αποτελείται από το χάρτη εμβάπτισης, το χάρτη εναπόθεσης (υαλοβάμβακας) των νανοσφαιριδίων χρυσού και του δείγματος, το χάρτη απορρόφησης και τη διαγνωστική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Κάθε ένα τμήμα της ταινίας, τοποθετείται πάνω σε αυτοκόλλητο πλαστικό στήριγμα, από το οποίο και συγκρατείται, όπως περιγράφηκε στο δεύτερο κεφάλαιο 2 (2.2.3). Στη συνέχεια, 0,7 μl εναιωρήματος σφαιριδίων (7,7x10 5 σφαιρίδια) συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια αποτέθηκαν πάνω στη μεμβράνη προς σχηματισμό κηλίδων δοκιμασίας. Ίσος όγκος εναιωρήματος, που περιέχει 2,0x10 5 σφαιρίδια συζευγμένα με βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια, αποτίθενται στο πάνω μέρος της ταινίας για το σχηματισμό της κηλίδας ελέγχου. Η ταινία αφήνεται να στεγνώσει για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου και φυλάσσεται σε ξηρό μέρος. Οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων Η οπτική ανίχνευση των προϊόντων των 10απλών αντιδράσεων επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκε με δύο ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων 10απλής ανίχνευσης. 3 μl από το αποδιατεταγμένο προϊόν επέκτασης αναμείχθηκε με διάλυμα ανάπτυξης (2x SSC, ph 7,0, 250 ml/l φορμαμίδιο, 30 g/l BSA, 20 ml/l γλυκερόλη, 5 ml/l Tween-20 και 5 g/l SDS) ίσου όγκου. Το μείγμα αποτέθηκε στο πάνω μέρος του χάρτη απόθεσης, πάνω από τα νανοσφαιρίδια χρυσού (κοντά στη μεμβράνη). Στη συνέχεια, ο χάρτης εμβάπτισης της ταινίας τοποθετείται σε ένα σωληνάριο που περιέχει 300 μl διαλύματος ανάπτυξης, το οποίο ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας. Η οπτική ανίχνευση πραγματοποιείται και ολοκληρώνεται μέσα σε 15 min. Για την εύκολη ερμηνεία των αποτελεσμάτων, η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων διαμορφώθηκε κατά τέτοιο τρόπο ώστε οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα πέντε φυσιολογικά αλλήλια να βρίσκονται στην αριστερή πλευρά της μεμβράνης, ενώ οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα πέντε μεταλλαγμένα αλλήλια να βρίσκονται στη δεξιά πλευρά της 85

μεμβράνης. Ο γονότυπος προσδιορίζεται από το χρώμα του κάθε ζεύγους κηλίδων. Για οποιοδήποτε συγκεκριμένο πολυμορφισμό, ένα φυσιολογικό δείγμα θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ ένα ομόζυγα μεταλλαγμένο θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα του ζεύγους. Και οι δύο κηλίδες θα εμφανίσουν κόκκινο χρώμα αν το δείγμα προέρχεται από ετερόζυγο δείγμα για τη συγκεκριμένη πολυμορφική θέση. Παρασκευή συνθετικού τμήματος του γονιδίου της α σφαιρίνης που περιέχει μία μετάλλαξη Εξαιτίας της έλλειψης διαθέσιμων δειγμάτων ετερόζυγων και ομόζυγα μεταλλαγμένων, παρασκευάστηκε συνθετικό τμήμα DNA που περιείχε τη μετάλλαξη Hb Questembert με τη μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης χρησιμοποιώντας PCR τριών σταδίων (PCR-A, PCR-B και PCR-AB) με αλληλουχία-στόχο γενωμικό DNA. Παρασκευή τμημάτων Α και Β Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl που περιείχε 1 U ενζύμου Kapa 2G Fast DNA polymerase, 1 ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ dntps, 0,25 μμ από κάθε εκκινητή (Πίν. 3.3), 75 ml/l DMSO και 100 ng γενωμικού DNA, φυσιολογικού ως προς τη μετάλλαξη που θέλουμε να εισάγουμε. Το πρόγραμμα της αντίδρασης PCR είναι το εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 95 o C για 30 s, 55 ο C (για το προϊόν Β) 60 ο C (για το προϊόν Α) για 30 s, 72 o C για 30 s. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Για την παρασκευή του τμήματος Α χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές: 5N: 5 -GCAGGATGTTCCTGTCCTTCC-3 (forward) και QUEST-R(M): 5 - GTGCTCACAGGAGCCAGGAACT-3 (reverse). Για την παρασκευή του τμήματος Β χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές QUEST-F(M): 5 - AGTTCCTGGCTCCTGTGAGCAC-3 (forward) και P3: 5 - CTCCATTGTTGGCACATTCCG-3 (reverse). Τα προϊόντα των PCR-A και PCR-B απομονώθηκαν από πηκτή αγαρόζης 1% και καθαρίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του εμπορικά διαθέσιμου kit της Macherey-Nagel, NucleoSpin 86

Extract II. Στη συνέχεια, τα προϊόντα ποσοτικοποιήθηκαν μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, με το πρόγραμμα Gel Analyser. Σύνδεση των τμημάτων Α και Β Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl που περιείχε 1 U ενζύμου Kapa 2G Fast, 1x ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ dntps και ισομοριακές ποσότητες (~200 fmol) από τα τμήματα Α και Β. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR ήταν οι εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min και ακολουθούν 40 κύκλοι των 95 o C για 30 s, 45 ο C για 30 s, 72 o C για 30 s. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Ενίσχυση του προϊόντος A-B που περιέχει την επιθυμητή μετάλλαξη Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl, που περιείχε 1 U ενζύμου Kapa 2G Fast DNA polymerase, 1x ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ dntps, 0,25 μμ από κάθε έναν από τους εκκινητές, 75 ml/l DMSO και ~600 fmol από το προϊόν Α-Β. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR ήταν οι εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min και ακολουθούν 35 κύκλοι των 95 o C για 30 s, 60 o C για 30 s, 72 o C για 30 sec. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές 5Ν: 5 -GCAGGATGTTCCTGTCCTTCC-3 (forward) και P3: 5 -CTCCATTGTTGGCACATTCCG-3 (reverse) (Πίν. 3.3). Το ενισχυμένο τμήμα που περιέχει τη μετάλλαξη κλωνοποιήθηκε σε πλασμιδιακό φορέα (pdrive Cloning Vector) με το εμπορικά διαθέσιμο kit κλωνοποίησης της Qiagen (PCR cloning kit) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 87

3.3. Αποτελέσματα 3.3.1. Αρχή της δοκιμασίας Το προϊόν ενίσχυσης με PCR (1087bp) του γονιδίου HBA2 υποβάλλεται σε πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή λίγων κύκλων (10), χωρίς να έχει προηγηθεί καθαρισμός του. Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή πραγματοποιείται παρουσία αλληλο-ειδικών εκκινητών, δύο για κάθε αλλήλιο (ένα συμπληρωματικό στο φυσιολογικό αλληλόμορφο και ένα συμπληρωματικό στο μεταλλαγμένο), και παρουσία δεοξυνουκλεοτιδίων επισημασμένων με βιοτίνη, τα οποία και ενσωματώνονται στο προϊόν επέκτασης. Οι αλληλο-ειδικοί εκκινητές αποτελούνται από δύο μέρη, το 3 άκρο, το οποίο είναι συμπληρωματικό στο αντίστοιχο αλλήλιο στην αλληλουχία-στόχο, και το 5 άκρο, το οποίο περιλαμβάνει μία μοναδική αλληλουχία που επιτρέπει τη μετέπειτα ακινητοποίηση του εκκινητή στην αντίστοιχη κηλίδα δοκιμασίας της ταινίας, μέσω υβριδοποίησης με συμπληρωματικό ακινητοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο. Η επέκταση από την DNA πολυμεράση, η οποία στερείται δράση εξωνουκλεάσης 5 >3, πραγματοποιείται μόνο στην περίπτωση που ο εκκινητής είναι απόλυτα συμπληρωματικός με την αλληλουχία-στόχο. Στο τέλος, τα προϊόντα επέκτασης ανιχνεύονται εντός 15 min με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. Το μίγμα που προκύπτει από την αντίδραση επέκτασης εκκινητή αποτίθεται στην ταινία, της οποίας το κάτω άκρο βυθίζεται στο κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης. Καθώς το διάλυμα ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας, τα προϊόντα επέκτασης ακινητοποιούνται μέσω υβριδοποίησης με συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια σε συγκεκριμένες θέσεις πάνω στη μεμβράνη και ανιχνεύονται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Τα προϊόντα που έχουν επεκταθεί φέρουν ομάδες βιοτίνης και συνδέονται με τα νανοσφαιρίδια χρυσού μέσω αλληλεπίδρασης βιοτίνης/αντι-βιοτίνης, προσδίδοντας στις κηλίδες χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα και υποδηλώνοντας την παρουσία του αντίστοιχου αλληλίου στο δείγμα. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων ακινητοποιείται στην κηλίδα ελέγχου της ταινίας από ακινητοποιημένα βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια, σχηματίζοντας ακόμη μία κόκκινη κηλίδα, η οποία επιβεβαιώνει τη σωστή 88

λειτουργία της ταινίας. Η σχηματική αναπαράσταση της προτεινόμενης μεθόδου πολλαπλής γονοτύπησης παρουσιάζεται στο σχήμα 3.1. Σχήμα 3.1. Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου πολλαπλής γονοτύπησης. (Α) Ενίσχυση με αντίδραση PCR τμήματος 1087 bp του γονιδίου HBA2, που περιλαμβάνει τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. (Β) Πολλαπλή αντίδραση PEXT (10 κύκλων) παρουσία αλληλο-ειδικών εκκινητών (δύο για κάθε μετάλλαξη) και biotin-dutps, τα οποία ενσωματώνονται στο προϊόν επέκτασης, μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας του εκκινητή με την αλληλουχία-στόχο. (Γ) Ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εντός 15 min με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Καθώς το διάλυμα ανάπτυξης ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας, τα προϊόντα επέκτασης υβριδοποιούνται με συμπληρωματικά ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια στις αντίστοιχες κηλίδες δοκιμασίας και ανιχνεύονται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Οι 5 κηλίδες αριστερά αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα, ενώ οι 5 κηλίδες δεξιά αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Η μονή κηλίδα στο πάνω μέρος της ταινίας είναι η κηλίδα ελέγχου, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας. 3.3.2. Μελέτες βελτιστοποίησης των αντιδράσεων PCR και PEXT Πραγματοποιήθηκαν εκτεταμένες μελέτες βελτιστοποίησης, ώστε να μεγιστοποιηθεί η απόδοση της αντίδρασης PCR για την ενίσχυση του, πλούσιου σε νουκλεοτίδια GC, τμήματος 1087 bp του γονιδίου HBA2. Μελετήθηκε η συγκέντρωση Mg 2+, η συγκέντρωση του DMSO, η ενεργότητα του ενζύμου, οι συγκέντρωση των εκκινητών και οι συνθήκες του προγράμματος της αντίδρασης PCR. Επιπλέον, μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν την ειδικότητα και την απόδοση της γονοτυπικής αντίδρασης. Οι παράμετροι αυτές περιλαμβάνουν τη συγκέντρωση του Mg 2+, τη θερμοκρασία και το χρόνο 89

υβριδοποίησης των εκκινητών, τη συγκέντρωση των εκκινητών και των dntps, την ποσότητα του προϊόντος PCR, που χρησιμοποιείται σαν αλληλουχία-στόχος. Η επίδραση κάθε παραμέτρου μελετήθηκε σε μία σειρά αντιδράσεων επέκτασης εκκινητή, που περιέχουν ενισχυμένο DNA-στόχο είτε από δείγμα φυσιολογικού ομοζυγώτη είτε από δείγμα που φέρει κάποια από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις και διάφορες ποσότητες/τιμές της παραμέτρου που μελετάται. Τα αποτελέσματα από τις μελέτες βελτιστοποίησης που πραγματοποιήθηκαν, παρουσιάζονται στο σχήμα 3.2. Οι συνθήκες που επιλέχθηκαν τελικά για την πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή είναι οι εξής: συγκέντρωση ιόντων Mg 2+ 4mM, συγκέντρωση αλληλο-ειδικών εκκινητών 1 pmol ο κάθε ένας, θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 60 ο C και χρόνος υβριδοποίησης 15 s, συγκέντρωση dntps 10 μμ από κάθε ένα από τα datp, dgtp, dctp και 5 μμ από τα dttp και biotin-dutp και ~100 fmol (2-3 μl) του μη καθαρισμένου προϊόντος PCR. Σχήμα 3.2. Μελέτες βελτιστοποίησης της πολλαπλής αντίδρασης PEXT. (Α) Συγκέντρωση αλληλο-ειδικών εκκινητών, (Β) χρόνος υβριδοποίησης εκκινητών, (Γ) συγκέντρωση dntps, (Δ) Θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών, (Ε) Συγκέντρωση Mg 2+, (ΣΤ) ποσότητα DNA-στόχου. Οι τελικές συνθήκες είναι οι εξής: συγκέντρωση αλληλο-ειδικών εκκινητών 1 pmol ο κάθε ένας, χρόνος υβριδοποίησης εκκινητών 15 s, 90

συγκέντρωση dntps 10 μμ, θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 60 ο C, συγκέντρωση Mg 2+ 4mM και ~100 fmol (2-3 μl) PCR προϊόντος. Οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν είτε με φυσιολογικά είτε με ετερόζυγα δείγματα. 3.3.3. Ειδικότητα της μεθόδου Προκειμένου να διαπιστωθεί ότι κάθε επεκταμένος εκκινητής υβριδοποιείται μόνο με συγκεκριμένο ακινητοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο ανιχνευτή στη μεμβράνη και όχι με οποιονδήποτε άλλο ανιχνευτή, πραγματοποιήθηκε το ακόλουθο πείραμα: δύο δείγματα, ένα φυσιολογικό και ένα συνθετικό δείγμα που περιέχει όλες τις μεταλλάξεις, υποβλήθηκαν σε δύο αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία παρουσία εκκινητών συμπληρωματικών στα φυσιολογικά αλλήλια και μία παρουσία εκκινητών συμπληρωματικών στο μεταλλαγμένα αλλήλια. Το συνθετικό δείγμα παρασκευάστηκε με ανάμειξη ισομοριακών ποσοτήτων προϊόντων PCR από δείγματα που περιείχαν τουλάχιστον μία από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Επομένως, το συνθετικό δείγμα αποτελεί ένα δείγμα ετερόζυγο για όλες τις μεταλλάξεις και ένα στόχο για όλους τους εκκινητές. Τα αποτελέσματα της μελέτης ειδικότητας παρουσιάζονται στο σχήμα 3.3 (Α). Οι φυσιολογικοί εκκινητές επεκτείνονται παρουσία και των δύο δειγμάτων, ενώ οι μεταλλαγμένοι εκκινητές δεν επεκτείνονται παρουσία φυσιολογικού δείγματος. Οι μεταλλαγμένοι εκκινητές επεκτείνονται και δίνουν σήμα μόνο παρουσία συνθετικού μεταλλαγμένου δείγματος. 3.3.4. Επαναληψιμότητα της μεθόδου Η συνολική επαναληψιμότητα της πολλαπλής δοκιμασίας γονοτύπησης (συμπεριλαμβανομένης της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων) αξιολογήθηκε αναλύοντας 9 φορές (τρία PEXT προϊόντα αναλύθηκαν εις τριπλούν) PCR προϊόντα από γενωμικό DNA, που ελήφθη από τρία άτομα με διαφορετικούς γονότυπους (ομόζυγο φυσιολογικό, ετερόζυγο και ομόζυγο μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη Hb Icaria). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν (Σχ. 3.3 (Β)) η επαναληψιμότητα της μεθόδου είναι πολύ ικανοποιητική. 91

Σχήμα 3.3. Ειδικότητα (Α) και επαναληψιμότητα (Β) της δοκιμασίας πολλαπλής γονοτύπησης. (Α) Ένα φυσιολογικό και ένα συνθετικό μεταλλαγμένο δείγμα υποβλήθηκαν σε δύο αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία παρουσία φυσιολογικών εκκινητών και μία παρουσία μεταλλαγμένων εκκινητών. Το συνθετικό δείγμα παρασκευάστηκε αναμειγνύοντας ίσες ποσότητες προϊόντων PCR από δείγματα που περιείχαν τουλάχιστον μία από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Επομένως, το συνθετικό δείγμα αποτελεί ένα δείγμα ετερόζυγο για όλες τις μεταλλάξεις και ένα στόχο για όλους τους εκκινητές. Οι φυσιολογικοί εκκινητές επεκτείνονται παρουσία και των δύο δειγμάτων, ενώ οι μεταλλαγμένοι εκκινητές επεκτείνονται και δίνουν σήμα μόνο παρουσία συνθετικού μεταλλαγμένου δείγματος. (Β) Η συνολική επαναληψιμότητα της δοκιμασίας πολλαπλής γονοτύπησης συμπεριλαμβάνει την αντίδραση επέκτασης εκκινητή και την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Οι μεταλλάξεις που αναλύθηκαν σε αυτές τις ταινίες είναι οι εξής: PolyA, IVS1 (Hph), Hb Agrinio, Hb Icaria, Hb Adana. Τα ειδικά σφαιρίδια για τα φυσιολογικά και τα μεταλλαγμένα αλλήλια έχουν αποτεθεί με αυτή τη σειρά των μεταλλάξεων από κάτω προς τα πάνω. Τρία άτομα με διαφορετικούς γονότυπους (ομόζυγο φυσιολογικό, ετερόζυγο και ομόζυγο μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη Hb Icaria) χρησιμοποιήθηκαν γι αυτή τη μελέτη. 3.3.5. Αξιολόγηση της μεθόδου Η μέθοδος που αναπτύχθηκε αξιολογήθηκε με την ανάλυση δειγμάτων γενωμικού DNA με γνωστούς γονότυπους για την παρουσία δέκα μεταλλάξεων εντός του τμήματος 1087 bp του γονιδίου HBA2. Τα δείγματα που αναλύθηκαν για τις μεταλλάξεις του γονιδίου HBA2 περιλαμβάνουν 54 ομόζυγα μεταλλαγμένα, ετερόζυγα για τουλάχιστον μία μετάλλαξη από τις 10 92

εξεταζόμενες ή διπλά ετερόζυγα και 21 φυσιολογικούς ομοζυγώτες. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων ήταν σε πλήρη συμφωνία με τα αποτελέσματα από μεθόδους αναφοράς (ARMS-PCR, real-time PCR και άμεση αλληλούχιση) αποδεικνύοντας την ακρίβεια της μεθόδου. Ενδεικτικά αποτελέσματα γονοτύπησης από μία σειρά δειγμάτων παρουσιάζονται στο σχήμα 3.4. Σχήμα 3.4. Αποτελέσματα γονοτύπησης μεταλλάξεων του γονιδίου ΗΒΑ2 σε δείγματα γενωμικού DNA. Για την ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου HBA2 είναι απαραίτητες δύο 10απλές αντιδράσεις PEXT και δύο ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων (10 μεταλλάξεις, 20 αλλήλια). Η θέση κάθε ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ειδικού για κάθε μετάλλαξη, παρουσιάζεται στο σκίτσο στην αριστερά πλευρά της εικόνας. Οι 5 κηλίδες αριστερά αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα, ενώ οι 5 κηλίδες δεξιά αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Η μονή κηλίδα στο πάνω μέρος της ταινίας είναι η κηλίδα ελέγχου, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε αξιολογήθηκε και ως εναλλακτική μέθοδος, που επιτρέπει όχι μόνο την ανίχνευση αλλά και τη γονοτύπηση των νουκλεοτιδικών αλλαγών, σε δείγματα που έχουν αναλυθεί με μεθόδους μη ειδικές για την αλληλουχία, όπως η ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMA), και παρουσιάζουν εικόνα διαφορετική από αυτή των ομόζυγων φυσιολογικών δειγμάτων. Πιο συγκεκριμένα, η προτεινόμενη δοκιμασία γονοτύπησης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων χρησιμοποιήθηκε για τη γονοτύπηση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων των 93

γονιδίων α-σφαιρίνης, HBA1 και ΗΒΑ2, που προηγουμένως είχαν αναλυθεί με τη μέθοδο HRMA (Κεφ. 4). Όταν σε ένα τμήμα ενισχυμένου DNA υπάρχουν περισσότερες της μίας μεταλλάξεις ή οι μεταλλάξεις βρίσκονται σε στενή γειτνίαση μεταξύ τους και είναι δύσκολο να ανιχνευθούν με τη μέθοδο HRMA, τότε η ανάγκη για επαλήθευση των αποτελεσμάτων με μέθοδο γονοτύπησης είναι επιτακτική. Ενδεικτικά αποτελέσματα γονοτύπησης της προτεινόμενης δοκιμασίας με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και ανάλυση των ίδιων ενισχυμένων με PCR τμημάτων (F1, F2 και F3), με αυτά που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση καμπύλης τήξης, παρουσιάζονται στο σχήμα 3.5. Σχήμα 3.5. Το ενισχυμένο τμήμα του γονιδίου HBA2 (1087 bp) χρησιμοποιήθηκε σαν αλληλουχία στόχος σε μία δεύτερη αντίδραση PCR για την ενίσχυση, ξεχωριστά, τριών τμημάτων (F1, F2 και F3), που περιέχουν τις 10 μη ελλειμματικές μεταλλάξεις του γονιδίου HBA2. Το μήκος των τμημάτων επιλέχθηκε να είναι περίπου στα 200 bp και οι αναλύσεις καμπύλης τήξης των τμημάτων πραγματοποιήθηκαν με το όργανο LightScanner (Idaho Technology). Στα ίδια τρία τμήματα (για κάθε δείγμα) πραγματοποιήθηκε γονοτύπηση με αντίδραση PEXT και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, χρησιμοποιώντας αλληλο-ειδικούς εκκινητές για τις μεταλλάξεις που περιλαμβάνονται σε κάθε τμήμα και μία ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για κάθε τμήμα. Στα σκίτσα αριστερά των ταινιών φαίνεται ο αριθμός και οι μεταλλάξεις που περιλαμβάνονται σε κάθε τμήμα. 94

3.4. Συζήτηση Στα κλινικά εργαστήρια, η ανίχνευση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων των γονιδίων της α-σφαιρίνης, σε πληθυσμούς που συναντώνται συγκεκριμένες μεταλλάξεις, πραγματοποιείται με γνωστές, καθιερωμένες μεθόδους. Ωστόσο, οι μέθοδοι αυτές στοχεύουν μία μόνο μετάλλαξη κάθε φορά και καθίστανται αρκετά χρονοβόρες για αναλύσεις ρουτίνας. Πιο συμφέρουσες από άποψη χρόνου και κόστους, ειδικά όταν πρόκειται για δείγματα που εξετάζονται για μεγάλο εύρος μεταλλάξεων, όπως στα γονίδια σφαιρίνης, είναι οι μέθοδοι που ανιχνεύουν κάποια νουκλεοτιδική αλλαγή αναλύοντας την καμπύλη τήξης ενός συγκεκριμένου ενισχυμένου PCR προϊόντος. Αυτές οι μέθοδοι, ωστόσο, δεν παρέχουν οριστική διάγνωση, με αποτέλεσμα να είναι αναγκαία η γονοτύπηση με άλλες μεθόδους, που προσδιορίζουν ακριβώς τη νουκλεοτιδική αλλαγή. Στο κεφάλαιο αυτό παρουσιάζεται μία απλή, εύκολη στην εφαρμογή και χαμηλού κόστους μέθοδος για τη γονοτύπηση των 10 μη ελλειμματικών μεταλλάξεων του γονιδίου HBA2 της α-σφαιρίνης, χρησιμοποιώντας ως εργαλεία τις αντιδράσεις PCR και PEXT σε συνδυασμό με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Εν συντομία, και όπως έχει ήδη αναφερθεί, η μέθοδος περιλαμβάνει αντίδραση PCR για την ενίσχυση ενός τμήματος 1087 bp του γονιδίου HBA2, με χρήση ενός απλού θερμικού κυκλοποιητή, πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή λίγων κύκλων (10), χρησιμοποιώντας το μη καθαρισμένο ενισχυμένο PCR προϊόν σαν αλληλουχία-στόχο, για την ιχνηθέτηση του προϊόντος με μόρια βιοτίνης και τέλος οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εντός λίγων λεπτών με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Ο γονότυπος για κάθε αλλήλιο προσδιορίζεται εύκολα παρατηρώντας κάθε ζεύγος κηλίδων. Για κάθε μετάλλαξη, ένα δείγμα φυσιολογικού ομοζυγώτη θα δώσει κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο θα δώσει κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα του ζεύγους. Θα εμφανιστεί κόκκινο και στις δύο κηλίδες αν το δείγμα προέρχεται από ετεροζυγώτη για αυτή τη μετάλλαξη. Συνολικά, το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε, συμπεριλαμβανομένης της αντίδρασης PCR, της αντίδρασης 95

επέκτασης εκκινητή και της οπτικής ανίχνευσης με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, διαρκεί περίπου 2 h. 3.5. Συμπεράσματα Η γονοτυπική μέθοδος που περιγράφεται στο παρόν κεφάλαιο για την ανίχνευση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στο γονίδιο HBA2, οι οποίες προκύπτουν είτε από σημειακές μεταλλάξεις είτε από μικρά ελλείμματα ή ενθέσεις, χαρακτηρίζεται από τα εξής πλεονεκτήματα: (i) διάκριση των αλληλόμορφων βάσει αλληλουχίας με αντίδραση επέκτασης εκκινητή, χρησιμοποιώντας απαραιτήτως πολυμεράση με έλλειψη δράσης εξωνουκλεάσης. Κατά συνέπεια, η γονοτύπηση είναι οριστική και δεν απαιτείται περαιτέρω ανάλυση των δειγμάτων ή επαλήθευση των αποτελεσμάτων με άλλη μέθοδο. (ii) η διάκριση των αλληλίων πραγματοποιείται σε στερεή επιφάνεια (στη διαγνωστική μεμβράνη) μέσω υβριδοποιήσεων, εν ροή, των αλληλουχιών που έχουν προκύψει από τη γονοτυπική αντίδραση και αντιπροσωπεύουν κάθε αλλήλιο ξεχωριστά. (iii) η ανίχνευση των αλληλόμορφων επιτυγχάνεται δια γυμνού οφθαλμού (iv) δεν υπάρχει ανάγκη για πολλαπλές προσθήκες αντιδραστηρίων, επωάσεις και εκπλύσεις της περίσσειας αυτών. (v) δεν υπάρχει ανάγκη για χρήση υψηλού κόστους και εξειδικευμένου εξοπλισμού, αντιδραστηρίων και άρτια εκπαιδευμένου προσωπικού. Η προτεινόμενη δοκιμασία είναι κατάλληλη για μικρά εργαστήρια μοριακής διάγνωσης, μικρού προϋπολογισμό και με μικρό έως μεσαίου όγκου αριθμό δειγμάτων. Επιπλέον, η μέθοδος αυτή αποτελεί ένα πολύ απλό και χρήσιμο εργαλείο για επαλήθευση μεθόδων σάρωσης γονιδίων, όταν υπάρχει ανάγκη ταυτοποίησης των νουκλεοτιδικών αλλαγών. 96

Πίνακας 3.3. Εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Ολιγονουκλεοτίδιο Ονομασία Αλληλουχία (5' 3') Εκκινητές για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ2 Forward (5' εκκινητής) Reverse (3' εκκινητής) Forward (5' εκκινητής) P1 P3 5N TGGAGGGTGGAGACGTCCTG CTCCATTGTTGGCACATTCCG GCAGGATGTTCCTGTCCTTCC Εκκινητές για τη μεταλλαξιγόνο PCR Forward (5' εκκινητής) Reverse (3' εκκινητής) HbaEXT- QUEST- F(M) QUEST- R(M) AGTTCCTGGCTCCTGTGAGCAC GTGCTCACAGGAGCCAGGAACT Αλληλο-ειδικοί εκκινητές της αντίδρασης ΡΕΧΤ Ολιγονουκλεοτίδιο Ονομασία Αλληλουχία (5 3 ) Φυσιολογικός εκκινητής για Initiation codon ICN(F) ATACAATCTAACTTCACTATTACAACAGACT CAGAGAGAACCCACCAT Μεταλλαγμένος εκκινητής για Initiation codon 500(1M) CTCTACTCCACCCCCATCCACATTCCGAATT CTCTCACAGACTCAGAGAGAACCCACCAC Φυσιολογικός εκκινητής για Hb Agrinio 600(2N) CACAGTCATCATAGTATATAGGGGCTTATAT CGAGTCTGTATGGTGCGGAGGCCCT Μεταλλαγμένος εκκινητής για Hb Agrinio F00(2M) CAATATACCAATATCATCATTTACCCGAATT CTCTCGTATGGTGCGGAGGCCCC Φυσιολογικός εκκινητής για HBA2: IVS1 (Hph) 100(3N) ATTATTCACTTCAAACTAATCTACCCGAATT CTCTCAGCAGGGGAGGGAGCCTCA Μεταλλαγμένος εκκινητής για HBA2: IVS1 (Hph) HbaEXT- HbaEXT- HbaEXT- HbaEXT- D00(3M) CAATTCATTTACCAATTTACCAATCCGAATT CTCTCAGCAGGGGAGGGAGCCTCT 97

Φυσιολογικός εκκινητής για IVS1-116 800(4N) CTTTTCATCAATAATCTTACCTTTCCGAATTC TCTCTCACTCTGCTTCTCCCCGCA Μεταλλαγμένος εκκινητής για IVS1-116 501(4M) GTGGCGATGGGTGCAGCGGTATCCCCGAA TTCTCTCTCACTCTGCTTCTCCCCGCG Φυσιολογικός εκκινητής για Hb Adana Μεταλλαγμένος εκκινητής για Hb Adana Φυσιολογικός εκκινητής για Hb Questembert HbaEXT-A00 (7N) HbaEXT-601 (7M) HbaEXT-B00 (9N) TACACAATCTTTTCATTACATCATCCGAATTC TCTCCCCAGGTTAAGGGCCACGG CTATCTTTAAACTACAAATCTAACCCGAATT CTCTCCCCAGGTTAAGGGCCACGA TCAAAATCTCAAATACTCAAATCACCGAATT CTCTCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTT Μεταλλαγμένος εκκινητής για Hb Questembert HbaEXT-B01 (9M) CTACAAACAAACAAACATTATCAACCGAATT CTCTCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTC Φυσιολογικός εκκινητής για Hb Icaria G00(10N) CTTTTTCAATCACTTTCAATTCATCCGAATTC TCTCCGTGCTGACCTCCAAATACCGTT Μεταλλαγμένος εκκινητής για Hb Icaria 801(10M) CTTTAATCCTTTATCACTTTATCACCGAATTC TCTCCGTGCTGACCTCCAAATACCGTA Μεταλλαγμένος εκκινητής για Constant Spring HbaEXT- HbaEXT- HbaEXT- HbaEXT- HbaEXT- 301(11M) AGTGTGCAGACCTTAGGTGAGCTACCGAAT TCTCTCCGTGCTGACCTCCAAATACCGTC Φυσιολογικός εκκινητής για PolyA HbaEXT (12N) LUA44 TCATTTACCAATCTTTCTTTATACGCTGCTG CCCACTCAGACT Μεταλλαγμένος εκκινητής για PolyA HbaEXT (12M) LUA47 CTTCTCATTAACTTACTTCATAATGCTGCTG CCCACTCAGACC Φυσιολογικός εκκινητής για Turkish polya HbaEXT (13N) LUA12 TACACTTTCTTTCTTTCTTTCTTTGGCCCTTC CTGGTCTTTGAATA Μεταλλαγμένος εκκινητής για Turkish polya HbaEXT (13M) LUA14 CTACTATACATCTTACTATACTTTGGCCCTT CCTGGTCTTTGAATG Ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές (anti-tags) Probe-LUA83 LUA83 ΝΗ 2 -TGTAATAGTGAAGTTAGATTGTAT 98

Probe-500 Anti-500 ΝΗ 2 -AATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAG Probe-600 Anti-600 ΝΗ 2 -CCCCTATATACTATGATGACTGTG Probe-F00 Anti-F00 ΝΗ 2 -GTAAATGATGATATTGGTATATTG Probe-100 Anti-100 ΝΗ 2 -GTAGATTAGTTTGAAGTGAATAAT Probe-D00 Anti-D00 ΝΗ 2 -ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG Probe-A00 Anti-A00 ΝΗ 2 -ATGATGTAATGAAAAGATTGTGTA Probe-601 Anti-601 ΝΗ 2 -GTTAGATTTGTAGTTTAAAGATAG Probe-800 Anti-800 ΝΗ 2 -AAAGGTAAGATTATTGATGAAAAG Probe-501 Anti-501 ΝΗ 2 -GGATACCGCTGCACCCATCGCCAC Probe-B00 Anti-B00 ΝΗ 2 -TGATTTGAGTATTTGAGATTTTGA Probe-B01 Anti-B01 ΝΗ 2 -TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG Probe-G00 Anti-G00 ΝΗ 2 -ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG Probe-801 Anti-801 ΝΗ 2 -TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG Probe-301 Anti-301 ΝΗ 2 -TAGCTCACCTAAGGTCTGCACACT Probe-LUA44 LUA44 ΝΗ 2 -GTATAAAGAAAGATTGGTAAATGA Probe-LUA47 LUA47 ΝΗ 2 -ATTATGAAGTAAGTTAATGAGAAG Probe-LUA12 LUA12 ΝΗ 2 -AAAGAAAGAAAGAAAGAAAGTGTA Probe-LUA14 LUA14 ΝΗ 2 -AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG * Στον παραπάνω πίνακα η χαρακτηριστική αλληλουχία αναγνώρισης (tag) καθενός εκκινητή της ΡΕΧΤ φαίνεται με μπλε χρώμα, ενώ με πλάγια γραφή σημειώνεται μια αλληλουχία spacer. Με έντονη μαύρη γραφή σημειώνεται η αλληλο-ειδική περιοχή των γονοτυπικών εκκινητών. Στους εκκινητές για τη μεταλλαξιγόνο PCR, υπογραμμίζεται με κόκκινο η βάση που θέλουμε να εισάγουμε στο συνθετικό μεταλλαγμένο δείγμα. 99

Για τις μεταλλάξεις Hb Icaria και Constant Spring, όπου πρόκειται για αλλαγή μίας βάσης στο ίδιο νουκλεοτίδιο, ο συμπληρωματικός εκκινητής στο φυσιολογικό αλληλόμορφο είναι κοινός και για τις δύο μεταλλάξεις. 100

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΗBA2 (Gene Bank Accession Number NG_000006.1) Gene: 33710..34573 mrna: join (33710..33870, 33988..34192, 34335..34573) 33481 gcgccgctac cgccctgccc ccgggcgagc gggatgggcg ggagtggagt ggcgggtgga 33541 gggtggagac gtcctggccc ccgccccgcg tgcaccccca ggggaggccg agcccgccgc 33601 ccggccccgc gcaggccccg cccgggactc ccctgcggtc caggccgcgc cccgggctcc 33661 gcgccagcca atgagcgccg cccggccggg cgtgcccccg cgccccaagc ataaaccctg 33721 gcgcgctcgc gggccggcac tcttctggtc cccacagact cagagagaac ccaccatggt 33781 gctgtctcct gccgacaaga ccaacgtcaa ggccgcctgg ggtaaggtcg gcgcgcacgc 33841 tggcgagtat ggtgcggagg ccctggagag gtgaggctcc ctcccctgct ccgacccggg 33901 ctcctcgccc gcccggaccc acaggccacc ctcaaccgtc ctggccccgg acccaaaccc 33961 cacccctcac tctgcttctc cccgcaggat gttcctgtcc ttccccacca ccaagaccta 34021 cttcccgcac ttcgacctga gccacggctc tgcccaggtt aagggccacg gcaagaaggt 34081 ggccgacgcg ctgaccaacg ccgtggcgca cgtggacgac atgcccaacg cgctgtccgc 34141 cctgagcgac ctgcacgcgc acaagcttcg ggtggacccg gtcaacttca aggtgagcgg 34201 cgggccggga gcgatctggg tcgaggggcg agatggcgcc ttcctctcag ggcagaggat 34261 cacgcgggtt gcgggaggtg tagcgcaggc ggcggctgcg ggcctgggcc gcactgaccc 34321 tcttctctgc acagctccta agccactgcc tgctggtgac cctggccgcc cacctccccg 34381 ccgagttcac ccctgcggtg cacgcctccc tggacaagtt cctggcttct gtgagcaccg 34441 tgctgacctc caaataccgt taagctggag cctcggtagc cgttcctcct gcccgctggg 34501 cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accggccctt cctggtcttt gaataaagtc 34561 tgagtgggca gcagcctgtg tgtgcctggg ttctctctat cccggaatgt gccaacaatg 34621 gaggtgttta cctgtctcag accaaggacc tctctgcagc tgcatggggc tggggaggga 101

Κεφάλαιο 4 Ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας για την ανίχνευση μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στα γονίδια HBA1 και HBA2 της α-σφαιρίνης 4.1. Εισαγωγή Όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο 3, η α-θαλασσαιμία είναι μία από τις πιο κοινές μονογονιδιακές ασθένειες και προκαλείται από την απουσία ή την μειωμένη σύνθεση α-αλυσίδων σφαιρίνης στο μόριο της αιμοσφαιρίνης. Ανακεφαλαιώνοντας, οι α-αλυσίδες σφαιρίνης κωδικοποιούνται από δύο γονίδια α-σφαιρίνης υψηλής ομολογίας (HBA1 και HBA2), τα οποία βρίσκονται στο χρωμόσωμα 16 (16p 13.3). Σε επίπεδο DNA, η α-θαλασσαιμία προκαλείται κυρίως από ελλείμματα με αποτέλεσμα την απομάκρυνση ολόκληρης ή μέρους της συστοιχίας των α-γονιδίων, και πιο σπάνια από νουκλεοτιδικές αλλαγές (σημειακές μεταλλάξεις και μικρά ελλείμματα/ενθέσεις) είτε στο HBA1 είτε στο HBA2 γονίδιο. Πρόκειται για τις λεγόμενες μη ελλειμματικές μεταλλάξεις (non-deletional mutations). Οι μεταλλάξεις αυτές είτε αναστέλλουν είτε μειώνουν τα φυσιολογικά επίπεδα σύνθεσης α- σφαιρίνης από το αντίστοιχο γονίδιο που εντοπίζεται η μετάλλαξη, ή, εναλλακτικά, οδηγούν στη σύνθεση ασταθών α-αλυσίδων σφαιρίνης. Όταν η σύνθεση της α-σφαιρίνης μειώνεται στο 25% ή και λιγότερο, οι ασθενείς είναι πιθανό να υποφέρουν από μία μετρίως σοβαρή αιμολυτική αναιμία, που σχετίζεται με περίσσεια αλυσίδων β-σφαιρίνης στη μορφή β4 τετραμερών (αναφέρονται ως HbH), και, ως εκ τούτου, η κατάσταση αυτή ονομάζεται αιμοσφαιρινοπάθεια H. Όταν η σύνθεση της α-σφαιρίνης μειώνεται ακόμη περισσότερο ή καταργείται εντελώς, δημιουργείται μία ακόμη σοβαρότερη αναιμία, ενδομητρίως, που σχετίζεται με περίσσεια αλυσίδων γ-σφαιρίνης στη μορφή γ4 τετραμερών (αναφέρονται ως Hb Bart s), και ως εκ τούτου η κατάσταση αυτή ονομάζεται σύνδρομο Hb Bart s εμβρυϊκού ύδρωπα. 102

Η αιμοσφαιρινοπάθεια Η και ο Hb Bart s εμβρυϊκός ύδρωπας αποτελούν τις κλινικά πιο σοβαρές μορφές α-θαλασσαιμίας [30, 34]. Οι μεταλλάξεις στο α2 γονίδιο σφαιρίνης είναι συνήθως πιο σοβαρές από μεταλλάξεις στο α1 γονίδιο σφαιρίνης, αφού παράγονται περισσότερες αλυσίδες αιμοσφαιρίνης από το α2 γονίδιο από ότι από το α1 γονίδιο [37]. Γενικώς, εξαιτίας του υψηλού επιπολασμού της α-θαλασσαιμίας σε πολλούς πληθυσμούς ανά τον κόσμο, σε συνδυασμό με τα σοβαρά κλινικά χαρακτηριστικά ορισμένων περιπτώσεων α-θαλασσαιμίας, πολλές χώρες παγκοσμίως εφαρμόζουν διαγνωστικά προγράμματα για τον εντοπισμό φορέων, έτσι ώστε να δίνεται η δυνατότητα σε ζευγάρια-φορείς να διενεργούν προγεννητικό έλεγχο, προκειμένου να αποκτήσουν υγιή παιδιά [41]. Στους φορείς α-θαλασσαιμίας, βάση των αιματολογικών και βιοχημικών αναλύσεων, υπάρχει αρχικά υποψία ύπαρξης της νόσου, αλλά η οριστική διάγνωση φορέων και ασθενών επιτυγχάνεται με την ανάλυση του DNA [42, 43]. Έχει περιγραφεί μεγάλος αριθμός μεταλλάξεων που προκαλούν α- θαλασσαιμία, ωστόσο σε κάθε συγκεκριμένο πληθυσμό που εμφανίζεται η α- θαλασσαιμία, οι υπεύθυνες μεταλλάξεις των αλληλόμορφων φτάνουν στις 10-20. Για το χαρακτηρισμό των μεγάλων ελλειμμάτων, που ως επί το πλείστον προκαλούν α-θαλασσαιμία, έχουν αναπτυχθεί πρωτόκολλα που βασίζονται στην αντίδραση PCR, η λεγόμενη Gap-PCR, με την προϋπόθεση ότι έχουν αναγνωριστεί τα σημεία κοπής των ελλειμμάτων και έχουν σχεδιαστεί ειδικοί εκκινητές. Η Gap-PCR βασίζεται στη μη δυνατότητα των εκκινητών που είναι συμπληρωματικοί ως προς αλληλουχίες DNA που βρίσκονται μακριά, να ενισχύσουν το προϊόν, εκτός εάν ένα έλλειμμα τους φέρει κοντά [36]. Ο χαρακτηρισμός των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στα γονίδια HBA1 και HBA2 πραγματοποιείται, κυρίως, με την αλληλούχιση κατά Sanger, που αποτελεί και μέθοδο αναφοράς, ή με διάφορες άλλες μεθόδους, που βασίζονται στην αντίδραση PCR και στοχεύουν κάθε φορά στην ανίχνευση συγκεκριμένης μετάλλαξης, με αποτέλεσμα να είναι πολύ χρονοβόρες [36]. Η ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (High Resolution Melting Curve Analysis, HRMA) αποτελεί μια πρόσφατη καινοτομία για την ανίχνευση νουκλεοτιδικών αλλαγών σε μία αλληλουχία-στόχο [44]. Η ανάλυση βασίζεται στο προφίλ τήξης ενός προϊόντος ενίσχυσης PCR, όπου 103

αλληλουχίες DNA που διαφέρουν έστω και σε ένα νουκλεοτίδιο έχουν δυνητικά διακριτές καμπύλες τήξης. Η ανάλυση στηρίζεται στη χρήση χρωστικών που φθορίζουν κατά την ενσωμάτωση τους στο δίκλωνο DNA ή στη χρήση ειδικών επισημασμένων ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών. Πλεονέκτημα της μεθόδου αποτελεί το γεγονός ότι δεν απαιτείται καθαρισμός και διαχωρισμός των προϊόντων PCR σε πηκτές και στήλες, ωστόσο απαιτείται η χρήση εξειδικευμένου εξοπλισμού και λογισμικού για την ανάλυση των καμπυλών τήξης. Ο σχεδιασμός και η εφαρμογή της μεθόδου σε διάφορα γονίδια στόχους αποτελεί μία πρόκληση, όσο η μέθοδος γίνεται ολοένα και περισσότερο γνωστή και αποδεκτή. Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφεται η ανάπτυξη ενός πρωτοκόλλου HRM για τον έλεγχο των γονιδίων ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2 της α-σφαιρίνης και την ανίχνευση νουκλεοτιδικών αλλαγών, οι οποίες αποτελούν τη γενετική βάση της α-θαλασσαιμίας σε πληθυσμούς της Μεσογείου και της Μέσης Ανατολής [45]. 4.2. Υλικά και Μέθοδοι 4.2.1. Κλινικά δείγματα Συνολικά, 80 δείγματα γενωμικού DNA, μεταξύ των οποίων 62 δείγματα που φέρουν κάποια από τις μη ελλειμματικές μεταλλάξεις των α γονιδίων (Πίν. 4.1) και 18 δείγματα που προέρχονται από φυσιολογικά άτομα, παραχωρήθηκαν από το Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών με έδρα το Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο στο Νοσοκομείο Παίδων Αγία Σοφία. Η απομόνωση γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε από περιφερικό αίμα με το αυτοματοποιημένο ρομποτικό σύστημα Biorobot M48 Workstation (Qiagen, Hilden, Germany) και το εμπορικά διαθέσιμο kit MagAttract DNA Blood midi M48 Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που συνιστά ο κατασκευαστής. Οι μεταλλάξεις των α γονιδίων σε κάθε δείγμα έχουν προηγουμένως χαρακτηριστεί με συνδυασμό μεθόδων, όπως είναι η αλληλοειδική PCR (Amlification Refractory Mutation System, ARMS-PCR), ο αλληλοειδικός ολιγονουκλεοτιδικός υβριδισμός (ASO), η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με περιοριστικά ένζυμα, και η άμεση αλληλούχιση (sequencing), όπως έχουν 104

προηγουμένως περιγραφεί [36]. Συνθετικά δείγματα που φέρουν μερικές από τις μεταλλάξεις, όπως Hb Heraklion (HBA1:c.112_114delCCC), Hb Adana (HBA1:c.179G>A), Hb Questembert (a1) (HBA1:c.394T>C) και Hb Questembert (a2) (HBA2:c.394T>C), κατασκευάστηκαν, εξαιτίας της έλλειψης αντίστοιχων κλινικών δειγμάτων. Πίνακας 4.1. Λίστα δειγμάτων με μη ελλειμματικές μεταλλάξεις α-σφαιρίνης, που εξετάστηκαν σε αυτήν την εργασία. Γονίδιο */ Τμήμα HBA1 Τμήμα F2 HBA2 Τμήμα F1 HBA2 Τμήμα F2 HBA2 Τμήμα F3 Γονότυπος (Ονομασία) Hb Aghia Sophia(N/M) Ονομασία HGVS Αριθμός δειγμάτων αα/αα Ag Sophia c.187_189delgtg 4 Hb Taybe(N/M) α Hph α/αα Taybe Hb Taybe(N/M) c.118_120delacc -α 3.7 /αα Taybe 2 IVS1 Hph(N/M) α Hph α/αα IVS1 Hph(N/M) α Hph α/αα Taybe c.95+2_95+6deltgagg 1 IVS1 Hph(M/M) α Hph α/α Hph α Hb Agrinio(N/M) α Agr α/αα Hb Agrinio(M/M) α Agr α/α Agr α Initiation Codon(M/M) α In. Codon α/α In. Codon α IVS1 (Hph)/Agrinio(M/M) α Hph α/α Agrinio α IVSI-116(N/M) α IVSI-116 α/αα Hb Adana(N/M) α Adana α/αα HB Adana(M/M) -α 3.7 /α Adana α Hb Icaria(N/M) α Ic α/αα c.89t>c c.2t>c 1 c.95+2_95+6deltgagg/ c.89t>c c.96-2a>g 1 c.179g>a c.427t>a 2 Hb Constant Spring(N/M) c.427t>c 1 2 6 1 7 5 1 3 1 105

Σύνολο δειγμάτων α Const. Spring α/αα PolyA(N/M) α polya α/αα PolyA(N/M) α polya α/α Hph α PolyA(M/M) -α 3.7 /α polya α PolyA(M/M) α polya α/α polya α Turkish polya(n/m) α Turk. polya α/αα Turkish polya(m/m) --med/α Turk polya α polya/icaria(m/m) α polya α/α Ic α c.*+94a>g c.*+92a>g c.*+94a>g/c.427t>a 3 Ο συμβολισμός "α Τ α" ή "αα Τ " αντιπροσωπεύει γονίδια με σημειακή μετάλλαξη στο α2 ή στο α1 γονίδιο, αντίστοιχα, του ίδιου αλληλόμορφου. Το φυσιολογικό αλληλόμορφο με τα δύο α γονίδια συμβολίζεται "αα". Ο συμβολισμός "-α" αντιπροσωπεύει έλλειμμα ενός α-γονιδίου, ο "--" έλλειμμα και των δύο α-γονιδίων από το ίδιο αλληλόμορφο. * Τα ομόλογα γονίδια α-σφαιρίνης, α1 και α2 στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 16, ονομάζονται HBA1 και HBA2 αντίστοιχα, σύμφωνα με την ονοματολογία κατά HUGO. 5 3 3 5 4 1 62 4.2.2. Σχεδίαση εκκινητών Όλοι οι εκκινητές της αντίδρασης PCR που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη σχεδιάστηκαν in silico με το λογισμικό πρόγραμμα PrimerPremier5 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA). Καθώς οι μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που αφορούν στα γονίδια της α σφαιρίνης μπορεί να βρίσκονται είτε στο HBA1 είτε στο HBA2 γονίδιο (NG_000006) (Σχ. 4.1), χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά ζεύγη εκκινητών (P1/P2 και P1/P3, αντίστοιχα) για την επιλεκτική ενίσχυση καθενός από τα HBA1 και HBA2 γονίδια που χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό ομολογίας. Τα προϊόντα ενίσχυσης των γονιδίων HBA1 και HBA2 (1087 bp) χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια, ως αλληλουχία-στόχος σε μία δεύτερη αντίδραση PCR για την ενίσχυση τριών επιμέρους τμημάτων (F1, F2 και F3), τα οποία περιλαμβάνουν τις 13 εξεταζόμενες μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που προκαλούν α- θαλασσαιμία σε πληθυσμούς της Μεσογείου και της Μέσης Ανατολής. Το 106

μήκος των τμημάτων επιλέχθηκε να είναι περίπου στα 200 bp, έτσι ώστε, να συνδυάζεται ο επιτυχής διαχωρισμός των μεταλλάξεων από την ανάλυση καμπύλης τήξης, με τον μικρότερο δυνατό αριθμό προϊόντων ενίσχυσης. Οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις σε κάθε τμήμα τοποθετήθηκαν όσο το δυνατόν πιο κοντά στο κέντρο του τμήματος. Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται στον πίνακα 4.3. Σχήμα 4.1. Σχηματική αναπαράσταση των γονιδίων α1 και α2, οι σχετικές θέσεις των 13 εξεταζόμενων μεταλλάξεων και οι θέσεις υβριδοποίησης των εκκινητών. Οι κόκκινες κουκίδες υποδεικνύουν τη θέση των 13 μεταλλάξεων, 5 στο α1 γονίδιο και 10 στο α2 γονίδιο (οι Hb Adana και Hb Questembert είναι κοινές και για τα δύο γονίδια). Οι εξωτερικοί εκκινητές P1 και P2 χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του α1 γονιδίου, ενώ οι εκκινητές P1 και P3 για την ενίσχυση του α2 γονιδίου. Ξεχωριστά, μικρότερα τμήματα, F1, F2 και F3, για το α1 και/ή για το α2 γονίδιο ενισχύθηκαν με μία δεύτερη αντίδραση PCR με τα ζεύγη εκκινητών R1/R2 (F1 για το α2 γονίδιο), R3/R4 (F2 και για τα δύο γονίδια) και R5/R6 (F3 για το α1 γονίδιο) και R5/R7 (F3 για το α2 γονίδιο). Το τμήμα F1(α2) περιλαμβάνει τρεις μεταλλάξεις (Initiation Codon, Hb Agrinio και IVS1(Hph)). Το τμήμα F2(α1) περιλαμβάνει τέσσερις HBA1 μεταλλάξεις (Hb Aghia Sophia, Hb Adana, Hb Heraklion και Hb Taybe) και το τμήμα F2(α2) δύο ΗΒΑ2 μεταλλάξεις (IVS1-116 και Hb Adana). Το τμήμα F3(α1) περιλαμβάνει μία μετάλλαξη (Hb Questembert) και το τμήμα F3(α2) πέντε μεταλλάξεις (Hb Questembert, Hb Icaria, Hb Constant Spring, polya και Turkish polya). 4.2.3. Ενίσχυση με αντίδραση PCR Αρχικά, ενισχύθηκαν τμήματα 1087 bp για κάθε ένα από τα γονίδια ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2, που περιλαμβάνουν όλες τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, χρησιμοποιώντας τα ζεύγη εκκινητών P1/P2 και P1/P3 αντίστοιχα. Η πρώτες αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 50 μl, που περιείχε 1 U πολυμεράσης Kapa 2G Fast DNA polymerase (Kapabiosystems, Cambridge, 107

MA, USA), 1x ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ από κάθε dntp, 0,20 μμ από κάθε εκκινητή, 75 ml/l DMSO και 100 ng γενωμικού DNA. Οι συνθήκες του προγράμματος της αντίδρασης PCR είναι οι εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min, ακολουθούμενη από 25 κύκλους στους 95 o C για 15 s και στους 60 o C για 15 s. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Στη συνέχεια, τα παραπάνω προϊόντα ενίσχυσης χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγεία για την ενίσχυση μικρότερων τμημάτων F1, F2 και F3 για το α1 και/ή το α2 γονίδιο, με μία δεύτερη αντίδραση PCR, χρησιμοποιώντας τα ζεύγη εκκινητών R1/R2 (F1 για το α2 γονίδιο), R3/R4 (F2 και για τα δύο γονίδια) και R5/R6 (F3 για το α1 γονίδιο) και R5/R7 (F3 για το α2 γονίδιο). Οι δεύτερες αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 50 μl, που περιείχε 1 U πολυμεράσης Kapa 2G Fast DNA polymerase, 1x ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ από κάθε dntp, 0,50 μμ από κάθε εκκινητή, 75 ml/l DMSO και 1 μl προϊόντος ενίσχυσης της πρώτης αντίδρασης PCR, σαν αλληλουχίαστόχο. Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε με αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 95 o C για 15 s και στους 68 o C για 15 s και τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Ακολούθως, 9 μl από κάθε προϊόν PCR αναμίχθηκαν με 1 μl χρωστικής LCGreen Plus+Melting Dye 10x (Idaho Technology) και το μίγμα υποβλήθηκε σε ένα σύντομο πρόγραμμα, ώστε να επιτευχθεί η ενσωμάτωση της χρωστικής στο δίκλωνο DNA και η δημιουργία των ετεροδιμερών. Το πρόγραμμα είναι το εξής: 98 o C για 2 min, και εν συνεχεία, 3 κύκλοι των 95 o C για 15 s και 68 o C για 15 s, και τελική αποδιάταξη στους 95 o C για 2 min και ψύξη (soak) στους 25 o C. Και στις δύο αντιδράσεις PCR συμπεριλήφθησαν αρνητικά δείγματα ελέγχου. Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν στο θερμικό κυκλοποιητή Thermal Cycler Dice Gradient TP600. 4.2.4. Παρασκευή ανασυνδυασμένων συνθετικών τμημάτων DNA του γονιδίου της α σφαιρίνης Για τρεις από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις (Hb Heraklion, Hb Adana (α1) και Hb Questembert (α1 και α2)) δεν υπήρχαν διαθέσιμα δείγματα ομόζυγα μεταλλαγμένα. Για το λόγο αυτό, παρασκευάστηκαν συνθετικά προϊόντα με τις 108

συγκεκριμένες μεταλλάξεις με τη μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης [12]. Τα συνθετικά μεταλλαγμένα τμήματα προέκυψαν από αντίδραση PCR τριών σταδίων (PCR-A, PCR-B και PCR-AB) με αλληλουχίαστόχο γενωμικό DNA, όπως περιγράφηκε στο κεφάλαιο 3 (3.2.4). Στον πίνακα 4.2 παρουσιάζονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή κάθε τμήματος και για την τελική ενίσχυση του προϊόντος ΑΒ, καθώς και τα μεγέθη των διαφόρων τμημάτων, για κάθε μία από τις μεταλλάξεις Hb Heraklion, Hb Adana (α1) και Hb Questembert (α1). Οι συνθήκες των αντιδράσεων PCR είναι ίδιες με αυτές που αναφέρονται στο κεφάλαιο 3 (3.2.4). Οι οποιεσδήποτε διαφορές στην ενίσχυση κάθε τμήματος για κάθε μία από τις μεταλλάξεις συνοψίζονται στο πίνακα 4.2. Οι αντιδράσεις (PCR-A, PCR-B και PCR-AB) για την παρασκευή μεταλλαγμένου τμήματος για τη μετάλλαξη Hb Questembert (α2), καθώς και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφονται αναλυτικά στο κεφάλαιο 3 (3.2.4). Πίνακας 4.2. Εκκινητές και συνθήκες κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης. Μετάλλαξη Hb Heraklion Hb Adana (α1) Αντίδραση PCR PCR-A (164bp) PCR-B (201bp) Ενίσχυση προϊόντος ΑΒ (350bp) PCR-A (236bp) PCR-B (139bp) Ενίσχυση προϊόντος ΑΒ (353bp) Όνομα εκκινητή Αλληλουχία 5 3 Συνθήκες PCR HerAdFW AGTATGGTGCGGAGGCCCTG 5% DMSO, HER-R(M) GGTGGTGAAGGACAGGAACATCCT 55 o C Υβριδοποίηση εκκινητών HER-F(M) CTGTCCTTCACCACCAAGACCTACTTCC 5% DMSO, HerAdREV GCTCACCTTGAAGTTGACCGGGT 55 o C Υβριδοποίηση εκκινητών HerAdFW AGTATGGTGCGGAGGCCCTG 5% DMSO, HerAdREV GCTCACCTTGAAGTTGACCGGGT 60 o C Υβριδοποίηση εκκινητών HerAdFW AGTATGGTGCGGAGGCCCTG 5% DMSO, ADANA-R(M) CACCTTCTTGTCGTGGCCCTTA 55 o C Υβριδοποίηση εκκινητών ADANA-F(M) TAAGGGCCACGACAAGAAGGTG 5% DMSO, HerAdREV GCTCACCTTGAAGTTGACCGGGT 55 o C Υβριδοποίηση εκκινητών HerAdFW AGTATGGTGCGGAGGCCCTG 5% DMSO, HerAdREV GCTCACCTTGAAGTTGACCGGGT 55 o C Υβριδοποίηση 109

Hb Questembert (α1) PCR-A (462bp) PCR-B (200bp) Ενίσχυση προϊόντος ΑΒ (640bp) εκκινητών 5N GCAGGATGTTCCTGTCCTTCC 7,5% DMSO, QUEST-R(M) GTGCTCACAGGAGCCAGGAACT 60 o C Υβριδοποίηση εκκινητών QUEST-F(M) AGTTCCTGGCTCCTGTGAGCAC 10% DMSO, P2 CTGGCACGTTTGCTGAGGGAA 55 o C Υβριδοποίηση εκκινητών 5N GCAGGATGTTCCTGTCCTTCC 7,5% DMSO, P2 CTGGCACGTTTGCTGAGGGAA 60 o C Υβριδοποίηση εκκινητών 4.2.5. Ανάλυση καμπύλης τήξης Οι αναλύσεις καμπύλης τήξης πραγματοποιήθηκαν στο όργανο LightScanner Instrument (Idaho Technology). Κατά τη διαδικασία τήξης μετράται ο φθορισμός σε καθορισμένο εύρος θερμοκρασίας (60 o C με 95 o C), με ρυθμό αύξησης της θερμοκρασίας 0,1 o C/s. Για την ανάλυση των μετρήσεων χρησιμοποιήθηκε λογισμικό πρόγραμμα ειδικά σχεδιασμένο για το συγκεκριμένο όργανο. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων περιλαμβάνει τα εξής τρία βήματα: 1) Κανονικοποίηση (Normalization) των δεδομένων τήξης επιλέγοντας δύο περιοχές, μία πριν και μία μετά την κύρια πτώση του φθορισμού, θέτοντας το μέγιστο σήμα φθορισμού ως το 100% και το ελάχιστο ως το 0%, αντίστοιχα. 2) Θερμοκρασιακή μετατόπιση (Temperature shift) των καμπυλών τήξης στο σημείο, όπου ολόκληρο το δίκλωνο DNA έχει αποδιαταχτεί πλήρως. 3) Το τελευταίο στάδιο της ανάλυσης περιλαμβάνει την ομαδοποίηση των δειγμάτων με βάση τις σχηματικές διαφορές των καμπυλών τήξης. Παρουσιάζονται οι καμπύλες διαφοράς φθορισμού συναρτήσει της θερμοκρασίας, οι οποίες προκύπτουν μετά από αφαίρεση καμπύλης αναφοράς, συνήθως φυσιολογικού ομοζυγώτη, από τις καμπύλες φθορισμού. 110

Πίνακας 4.3. Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές στην παρούσα εργασία. Γονίδιο/ Τμήμα HBA1 HBA2 Τμήμα F1(α2) Τμήμα F2(α1/α2) Τμήμα F3(α1) F3(α2) Όνομα P1 (forward) P2 (reverse) P3 (reverse) R1 (forward) R2 (reverse) R3 (forward) R4 (reverse) R5 (forward) R6 (reverse) R7 (reverse) Αλληλουχία (5 >3 ) Εκκινητές αντίδρασης PCR 5 -TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3 5 -CTGGCACGTTTGCTGAGGGAA-3 Μήκος τμήματος (bp) 1087 5 -CTCCATTGTTGGCACATTCCG-3 1087 5'-CCGGCACTCTTCTGGTCCC-3 5 -TGAGGGTGGCCTGTGGGT-3 5'-ACAGGCCACCCTCAACCGT-3 5 -TTGGGCATGTCGTCCACGT-3 5'-CCTGCGGTGCACGCCTC-3 5 -TGAGGGAAAAAACTCAGGCACA-3 201 208 212 5 -ATAGAGAGAACCCAGGCACACACA-3 209 4.3. Αποτελέσματα Οι μη ελλειμματικές μεταλλάξεις που προκαλούν α-θαλασσαιμία και εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται στον πίνακα 4.4. Το πρωτόκολλο που σχεδιάστηκε επιβεβαιώνει την επιλεκτική ενίσχυση καθενός από τα γονίδια υψηλής ομολογίας ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2 με μία πρώτη αντίδραση PCR, αξιοποιώντας τις μικρές διαφορές των δύο γονιδίων στην 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή, ακολουθούμενη από μία δεύτερη αντίδραση PCR, για την ενίσχυση μικρότερων τμημάτων κατάλληλου μήκους, για ανάλυση καμπύλης τήξης. Το προϊόν ενίσχυσης 1087 bp του γονιδίου ΗΒΑ2 111

χρησιμοποιήθηκε ως αλληλουχία-στόχος για την ενίσχυση των τμημάτων F1(α2), F2(α2) και F3(α2), που περιλαμβάνουν 10 γνωστές μεταλλάξεις του γονιδίου ΗΒΑ2, ενώ το τμήμα 1087 bp του γονιδίου ΗΒΑ1 χρησιμοποιήθηκε ως αλληλουχία-στόχος για την ενίσχυση των τμημάτων F2(α1) και F3(α1), που περιλαμβάνουν 5 γνωστές μεταλλάξεις του γονιδίου ΗΒΑ1. Το μήκος των μικρών τμημάτων κυμάνθηκε μεταξύ 201-212 bp με τις νουκλεοτιδικές αλλαγές να τοποθετούνται περίπου στο μέσο της αλληλουχίας. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης καμπύλης τήξης όλων των τμημάτων παρουσιάζονται στα σχήματα 4.2 και 4.3. Όλες οι μεταλλάξεις που αναλύθηκαν ήταν διαθέσιμες σε ετερόζυγη κατάσταση και κάποιες από αυτές ήταν, επίσης, διαθέσιμες σε ομόζυγη μεταλλαγμένη κατάσταση ή σαν σύνθετοι ετεροζυγότες (δύο διαφορετικές μεταλλάξεις εντός του ίδιου τμήματος). Δείγματα, σύνθετοι ετεροζυγώτες για μεταλλάξεις σε διαφορετικά τμήματα του ίδιου γονιδίου, θεωρήθηκαν ως ετεροζυγώτες για κάθε μία μετάλλαξη για το κάθε τμήμα ξεχωριστά, όσον αφορά στην ανάλυση καμπύλης τήξης. Για παράδειγμα, δείγμα γονότυπου α polya α/α Hph α είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη polya στο τμήμα F3(α2) και ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hph στο τμήμα F1(α2). Το τμήμα F1(α2), που περιλαμβάνει τρεις μεταλλάξεις (Initiation codon, Hb Agrinio και IVS1 (Hph)), ενισχύθηκε με τους εκκινητές R1/R2. Ενδεικτικά αποτελέσματα της ανάλυσης καμπύλης τήξης του συγκεκριμένου τμήματος για δείγματα ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα για τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις, παρουσιάζονται στο σχήμα 4.2 (Α). Όπως φαίνεται από τις καμπύλες τήξης, υπάρχει σαφής διάκριση μεταξύ των φυσιολογικών δειγμάτων και των ετερόζυγων δειγμάτων για τις δύο από τις τρεις μεταλλάξεις (Hb Agrinio και IVS1 (Hph)), καθώς και για ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη Initiation Codon. Ωστόσο, δείγματα ομόζυγα μεταλλαγμένα για τις μεταλλάξεις Hb Agrinio και IVS1 (Hph) ομαδοποιούνται με φυσιολογικά δείγματα από το λογισμικό πρόγραμμα, αποκλείοντας έτσι τη διαφοροποίηση τους. Από την άλλη μεριά, δείγματα που φέρουν δύο μεταλλάξεις διακρίνονται ξεκάθαρα από δείγματα που φέρουν μόνο μία από τις μεταλλάξεις αυτές (Σχ. 4.2 (Β)). Αυτό, πιθανώς, συμβαίνει εξαιτίας του ότι δείγματα διπλά ετερόζυγα (φέρουν δύο μεταλλάξεις στο ίδιο τμήμα του ίδιου γονιδίου) έχουν δύο 112

περιοχές αποσταθεροποίησης του δίκλωνου DNA αντί για μία, όπως στην περίπτωση ενός απλού ετεροζυγώτη. Το τμήμα F2(α1) περικλείει τέσσερις HBA1 μεταλλάξεις (Hb Aghia Sophia, Hb Adana, Hb Heraklion, Hb Taybe) και το τμήμα F2(α2), δύο HBA2 μεταλλάξεις (IVS1-116 και Hb Adana). Η μετάλλαξη Hb Adana έχει βρεθεί και στα δύο γονίδια HBA1 και HBA2. Τα τμήματα F2(α1) και F2(α2) ενισχύθηκαν από τα αντίστοιχα τμήματα 1087 bp των γονιδίων HBA1 και HBA2, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας το ίδιο ζεύγος εκκινητών (R3/R4), εξαιτίας της υψηλής ομολογίας των δύο γονιδίων στην περιοχή αυτή. Από την ανάλυση καμπύλης τήξης, υπάρχει σαφής διαχωρισμός μεταξύ ετερόζυγων και ομόζυγα μεταλλαγμένων συνθετικών δειγμάτων για τις μεταλλάξεις Hb Heraklion και Hb Adana (α1), καθώς και μεταξύ ετεροζυγωτών για τις μεταλλάξεις Hb Aghia Sophia και Hb Taybe (Σχ. 4.2 (Γ)). Εξαιτίας της χαμηλής συχνότητας των δύο τελευταίων μεταλλάξεων στον ελληνικό πληθυσμό, δεν υπήρχαν διαθέσιμα ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα. Δύο από τα τρία μικρά ελλείμματα (3 bp) στο γονίδιο HBA1, τα οποία βρίσκονται πολύ κοντά το ένα στο άλλο (Hb Heraklion και Hb Taybe), διακρίνονται εντυπωσιακά, βάσει της διαφοράς της θερμοκρασίας τήξης (T m ) των ετεροζυγωτών για τις δύο αυτές μεταλλάξεις (Σχ. 4.2 (Δ)). Αναλόγως, δείγματα ετερόζυγα για τις δύο μεταλλάξεις του γονιδίου ΗΒΑ2 (IVS1-116 και Hb Adana) διακρίνονται ξεκάθαρα από δείγματα φυσιολογικά για τις αντίστοιχες μεταλλάξεις (Σχ. 4.2 (Ε)). Ομόζυγα μεταλλαγμένο δείγμα για τη μετάλλαξη Hb Adana στο γονίδιο ΗΒΑ2 διακρίνεται από φυσιολογικό δείγμα, αν μικρή η διαφορά φθορισμού. Για τη μετάλλαξη IVS1-116 στο γονίδιο ΗΒΑ2, ήταν διαθέσιμο μόνο ένα ετερόζυγο δείγμα. 113

Σχήμα 4.2. Καμπύλες τήξης διαφοράς φθορισμού (μετά από κανονικοποίηση και θερμοκρασιακή μετατόπιση) αντιπροσωπευτικών δειγμάτων για κάθε εξεταζόμενη μετάλλαξη και στα δύο γονίδια. (Α) Το τμήμα F1(α2) περιλαμβάνει τρεις ΗΒΑ2 μεταλλάξεις (Initiation Codon, Hb Agrinio και IVS1 (Hph)). Δύο ετεροζυγότες για τις μεταλλάξεις Hb Agrinio και IVS1 (Hph), καθώς και ένα δείγμα ομόζυγο για τη μετάλλαξη Initiation Codon, διαχωρίστηκαν επιτυχώς από φυσιολογικά δείγματα. (Β) Δείγμα που φέρει ταυτοχρόνως τις μεταλλάξεις Hb Agrinio και IVS1 (Hph), διακρίνεται εμφανώς από δείγματα που φέρουν μόνο μία από τις μεταλλάξεις αυτές. (Γ) Το τμήμα F2(α1) περιλαμβάνει τέσσερις HBA1 μεταλλάξεις (Hb Aghia Sophia, Hb Adana, Hb Heraklion, Hb Taybe). Επετεύχθη σαφής διαφοροποίηση μεταξύ των διαφόρων μεταλλάξεων και σε ετερόζυγα κλινικά δείγματα και σε συνθετικά ετερόζυγα και ομόζυγα δείγματα. (Δ) Ετερόζυγα δείγματα που φέρουν διαφορετικά μικρά ελλείμματα (3 bp) στο γονίδιο α1 (Hb Heraklion και Hb Taybe), πολύ κοντά το ένα στο άλλο, διακρίνονται εντυπωσιακά από τη διαφορά στο T m. (Ε) Δείγματα ετερόζυγα για τις μεταλλάξεις του τμήματος F2(α2) διαχωρίζονται σαφώς από φυσιολογικά δείγματα. Δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη Hb Adana στο γονίδιο α2 διακρίνεται από φυσιολογικά δείγματα. (ΣΤ) Το τμήμα F3(α1) περιλαμβάνει μία μετάλλαξη (Hb Questembert). Ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα συνθετικά δείγματα για αυτή τη μετάλλαξη διαχωρίζονται επιτυχώς. Το τμήμα F3(α1), το οποίο περιλαμβάνει μία μόνο μετάλλαξη (Hb Questembert) ενισχύθηκε με το ζεύγος εκκινητών R5/R6. Η καμπύλες τήξης ετερόζυγων και ομόζυγα μεταλλαγμένων συνθετικών δειγμάτων για τη μετάλλαξη αυτή διαφοροποιούνται ξεκάθαρα, όπως φαίνεται και στο σχήμα 4.2 (ΣΤ). Το τμήμα F3(α2), το οποίο περιλαμβάνει πέντε μεταλλάξεις (Hb 114

Questembert, Hb Icaria, Hb Constant Spring, polya και Turkish PolyA), ενισχύθηκε με το ζεύγος εκκινητών R5/R7. Στα σχήματα 4.3 (Α), 4.3 (Β) και 4.3 (Γ) παρουσιάζονται οι καμπύλες διαφοράς φθορισμού που προέκυψαν από ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για κάθε μία από τις τρεις μεταλλάξεις (Hb Questembert, polya και Turkish PolyA), ενώ στο σχήμα 4.3 (Δ) παρουσιάζονται οι καμπύλες διαφοράς φθορισμού για δείγματα ετερόζυγα για τις μεταλλάξεις Hb Icaria και Hb Constant Spring, οι οποίες αντιπροσωπεύουν την αλλαγή μιας βάσης στο ίδιο νουκλεοτίδιο. Όπως φαίνεται, οι μεταλλάξεις Hb Questembert, polya και Turkish PolyA διακρίνονται εμφανώς, είτε σε ετερόζυγα είτε σε ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα. Αναλόγως, οι μεταλλάξεις Hb Icaria και Hb Constant Spring διακρίνονται σαφώς σε ετερόζυγα δείγματα. Ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τις μεταλλάξεις Hb Icaria και Hb Constant Spring δεν ήταν διαθέσιμα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που συνοψίζονται και στον πίνακα 4.4, όλα τα ετερόζυγα δείγματα διαχωρίζονται από τα ομόζυγα φυσιολογικά δείγματα. Δεν ήταν διαθέσιμα ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για όλες τις μεταλλάξεις, ειδικά για αυτές τις μεταλλάξεις που εμφανίζονται με χαμηλή συχνότητα στον ελληνικό πληθυσμό. Για αυτές τις μεταλλάξεις που εξετάστηκαν, όλα τα ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα διαχωρίστηκαν από τα ομόζυγα φυσιολογικά, με εξαίρεση τα ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα με τις μεταλλάξεις Hb Agrinio και IVS1 (Hph). Η μετάλλαξη Hb Adana σε ομόζυγη κατάσταση στο γονίδιο ΗΒΑ2 διαχωρίζεται επιτυχώς από φυσιολογικά δείγματα, μολονότι μικρή η διαφορά φθορισμού (Σχ. 4.2 (Ε)). 115

Σχήμα 4.3. Καμπύλες τήξης διαφοράς φθορισμού (μετά από κανονικοποίηση και θερμοκρασιακή μετατόπιση) αντιπροσωπευτικών δειγμάτων για κάθε μετάλλαξη στο τμήμα F3(α2), που περιλαμβάνει πέντε ΗΒΑ2 μεταλλάξεις (Hb Questembert, Hb Icaria, Hb Constant Spring. polya και Turkish polya). (A) Καμπύλες διαφοράς φθορισμού από κλινικά και συνθετικά ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τη μετάλλαξη Hb Questembert. Σαφής διαχωρισμός και των ετερόζυγων και των ομόζυγα μεταλλαγμένων δειγμάτων. (Β, Γ) Ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τις μεταλλάξεις polya και Turkish polya μπορούν να ανιχνευθούν μόνο αν αναλυθούν χωρίς την παρουσία άλλων μεταλλάξεων στο ίδιο τμήμα. (Δ) Καμπύλες διαφοράς φθορισμού δειγμάτων ετερόζυγων για τις μεταλλάξεις Hb Icaria και Hb Constant Spring (αλλαγή μίας βάσης στο ίδιο νουκλεοτίδιο). Σαφής διαχωρισμός των δύο μεταλλάξεων σε ετερόζυγα δείγματα. 4.4. Συζήτηση Ο έλεγχος για μη ελλειμματικές μεταλλάξεις της α-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης, που προκύπτουν από σημειακές μεταλλάξεις ή μικρά ελλείμματα/ενθέσεις, έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, ιδίως σε περιοχές όπου η α-θαλασσαιμία είναι διαδεδομένη. Αυτό οφείλεται στην αυξανόμενη ένδειξη ότι η κληρονόμηση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων συχνά σχετίζεται με υψηλότερο βαθμό νοσηρότητας και θνησιμότητας από ότι ο τύπος θαλασσαιμίας που προκαλείται από μεγάλα ελλείμματα [34, 37]. Οι περισσότερες από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων και βασίζονται στην αντίδραση PCR, είναι ειδικές για την αλληλουχία, επομένως, είναι κατάλληλες για ανίχνευση γνωστών 116

μεταλλάξεων. Αυτές οι μέθοδοι, ωστόσο, στοχεύουν σε μία συγκεκριμένη μετάλλαξη κάθε φορά, με αποτέλεσμα να είναι εξαιρετικά χρονοβόρες. Ο αλληλοειδικός ολιγονουκλεοτιδικός υβριδισμός (ASO), η αποτύπωση κηλίδας (dot-blot) και η ανάστροφη αποτύπωση κηλίδας (reverse dot-blot), η αλληλοειδική αντίδραση PCR (ARMS), η αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT), η ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα (RFLP) και η μέθοδος του pyrosequencing είναι κάποιες από τις μεθόδους που έχουν εφαρμοστεί στην ανίχνευση μη ελλειμματικών μεταλλάξεων που προκαλούν α-θαλασσαιμία [36, 37, 43, 46]. Η μέθοδος της ανάλυσης καμπύλης τήξης (HRMA), που εισήχθη προσφάτως, αποτελεί μία απλή μέθοδο για τη γονοτύπηση και την ανίχνευση μεταλλάξεων [44]. Η μέθοδος δεν είναι ειδική για την αλληλουχία, αλλά παρέχει τη δυνατότητα ανίχνευσης οποιασδήποτε αλλαγής στην καμπύλη τήξης, που μπορεί να προέρχεται από την παρουσία οποιασδήποτε αλλαγής στην αλληλουχία, γνωστής ή άγνωστης. Η μέθοδος HRMA χρησιμοποιείται κυρίως ως μέθοδος σάρωσης διαλογής (screening method), οπότε η γονοτύπηση πρέπει να ολοκληρωθεί με κάποια άλλη μέθοδο (κυρίως με αλληλούχιση κατά Sanger). Δεν απαιτείται διαχωρισμός ή άλλη επεξεργασία των δειγμάτων μετά την ενίσχυση με αντίδραση PCR. Οι καμπύλες τήξης προκύπτουν από τη μέτρηση του φθορισμού κάποιας χρωστικής, που ενσωματώνεται στο δίκλωνο DNA. Οι ετεροζυγώτες για κάποια μετάλλαξη ανιχνεύονται από την αλλαγή του σχήματος της καμπύλης τήξης, ενώ οι ομοζυγώτες διακρίνονται από την αλλαγή στη θερμοκρασία τήξης (T m ). Οι περισσότερες μεταλλάξεις σε ομόζυγα μεταλλαγμένη κατάσταση μπορούν να ανιχνευθούν χωρίς να απαιτείται ανάμειξη του δείγματος με φυσιολογικό DNA [47]. Μέχρι σήμερα, υπάρχουν περιορισμένες αναφορές σχετικά με τη χρήση της μεθόδου HRM για την ανίχνευση μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στα γονίδια της α-σφαιρίνης και οι περισσότερες περιγράφουν πρωτόκολλα για την ανίχνευση μεταλλάξεων κοινές στον κινεζικό πληθυσμό, με τη χρήση είτε του οργάνου Light Cycler είτε του οργάνου LightScanner [48, 49]. Κάποιες από τις αναφορές αυτές στοχεύουν σε μερικές συγκεκριμένες μεταλλάξεις, περιορίζοντας έτσι την κλινική τους χρησιμότητα ως εργαλείο ανίχνευσης μεταλλάξεων της α-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης. Άλλες αναφορές που καλύπτουν ευρύτερο φάσμα μεταλλάξεων για το συγκεκριμένο πληθυσμό, περιορίζονται στο διαχωρισμό μόνο ετερόζυγων δειγμάτων από φυσιολογικά 117

δείγματα και όχι ομόζυγα μεταλλαγμένων, που προκαλούν και σοβαρότερη κλινική κατάσταση α-θαλασσαιμίας. Ο διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται για κάποιες από τις μεταλλάξεις ξεχωριστά, ενώ άλλες ανιχνεύονται σαν ομάδα μεταλλάξεων, που ωστόσο, αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν η μία από την άλλη, περιορίζοντας και πάλι την κλινική χρησιμότητα της μεθόδου. Στο κεφάλαιο αυτό, περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου HRMA για την ταχεία ανίχνευση 13 πιο κοινών μη ελλειμματικών μεταλλάξεων, που προκαλούν α- θαλασσαιμία, σε πληθυσμούς γύρω από τη Μεσόγειο και τη Μέση Ανατολή [45]. Για το σχεδιασμό και τη βελτιστοποίηση του περιγραφόμενου πρωτοκόλλου λήφθηκαν υπόψη οι εγγενείς δυσκολίες που προκύπτουν από αλληλουχίες πλούσιες σε GC νουκλεοτίδια, όπως είναι τα δύο γονίδια α- σφαιρίνης, και από την υψηλή ομολογία των γονιδίων αυτών. Το όργανο LightScanner (Idaho Technology), υψηλής διακριτικής ικανότητας, σχεδιάστηκε ειδικά για την ανάλυση καμπύλης τήξης δίκλωνων μορίων. Κατά τη δοκιμασία σάρωσης διαλογής γνωστών και άγνωστων μεταλλάξεων χρησιμοποιείται η χρωστική LCGreen Plus, μία χρωστική που πλεονεκτεί στο γεγονός ότι δεν παρεμποδίζει την ενίσχυση κατά την ενσωμάτωση της στα προϊόντα PCR, και επίσης, δεν ανακατανέμεται στο δίκλωνο μόριο DNA κατά τη διάρκεια της αποδιάταξης του [47, 50]. Το συγκεκριμένο όργανο έχει μικρή διακύμανση της θερμοκρασίας τήξης, T m, κατά μήκος της πλάκας, υψηλότερη διακριτική ικανότητα και ταχύτητα σε σχέση με άλλα όργανα, τα οποία χρησιμοποιούν πλακίδια για την ανάλυση [51-53]. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε στο παρόν κεφάλαιο περιλαμβάνει: (1) ενίσχυση ενός τμήματος 1087 bp για κάθε ένα από τα γονίδια α1 και α2, όπου περικλείονται και οι 13 εξεταζόμενες μεταλλάξεις, χρησιμοποιώντας έναν κοινό πρόσθιο εκκινητή και δύο διαφορετικούς ανάστροφους εκκινητές ειδικούς για το α1 και το α2 γονίδιο, αντίστοιχα, (2) ενίσχυση τριών τμημάτων του γονιδίου α2, που περιλαμβάνουν 10 γνωστές μεταλλάξεις και δύο τμημάτων του γονιδίου α1 που περιλαμβάνουν 5 γνωστές μεταλλάξεις, χρησιμοποιώντας σαν αλληλουχία-στόχο το προϊόν ενίσχυσης 1087 bp για το α2 και α1 γονίδιο, αντίστοιχα, (3) ανάλυση καμπύλης τήξης των τμημάτων που περιέχουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Το μήκος των τμημάτων επιλέχθηκε να είναι στην περιοχή των 201-212 bp, σε μία προσπάθεια να 118

περιοριστεί ο αριθμός των τμημάτων προς ανάλυση για κάθε δείγμα, χωρίς να διακυβεύεται η ευαισθησία και η ειδικότητα του προτεινόμενου πρωτοκόλλου της μεθόδου HRMA. Άλλωστε, η επιλογή τμημάτων προς ανάλυση αρκετά περιορισμένου μεγέθους, είναι πιθανόν να προκαλέσει προβλήματα, όπως λιγότερη ευελιξία στην επιλογή των εκκινητών και/ή δυσκολίες στο διάκριση των διμερών των εκκινητών από τα επιθυμητά προϊόντα ενίσχυσης κατά τη διάρκεια της ανάλυσης HRM. Παρά την πολυπλοκότητα των πλούσιων σε GC νουκλεοτίδια αλληλουχιών των γονιδίων ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2, διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς όλες οι μεταλλάξεις σε ετερόζυγη κατάσταση και στα δύο γονίδια με ευαισθησία 100%, χρησιμοποιώντας κατάλληλα σχεδιασμένους εκκινητές και βελτιστοποιημένες συνθήκες της αντίδρασης PCR (Mg 2+, DMSO, συγκέντρωση εκκινητών και συνθήκες PCR προγράμματος). Οι περισσότερες μεταλλάξεις σε ομόζυγα μεταλλαγμένη κατάσταση (8 από τις 10 διαθέσιμες) και στα δύο γονίδια, ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2, διαχωρίστηκαν, επίσης, επιτυχώς από τα φυσιολογικά δείγματα. Μία από τις μεταλλάξεις σε ομόζυγη κατάσταση, που δεν ανιχνεύθηκε, είναι η μετάλλαξη Hb Agrinio, η οποία ανήκει στην τάξη των ανθρώπινων μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) που χαρακτηρίζονται από διαφορές στη θερμοκρασία τήξης όπου θεωρητικά ανιχνεύονται και υποστηρίζουν τη διαφοροποίηση των ομόζυγα μεταλλαγμένων δειγμάτων από τα φυσιολογικά, ειδικά όταν το μέγεθος των τμημάτων προς ανάλυση είναι <100 bp [47, 54]. Η αδυναμία να διαφοροποιηθεί αυτή η μετάλλαξη με το προτεινόμενο πρωτόκολλο HRM πιθανόν να οφείλεται στο μεγαλύτερο μέγεθος του τμήματος (~200 bp) που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη. Η δεύτερη μετάλλαξη σε ομόζυγα μεταλλαγμένη κατάσταση που δεν ανιχνεύθηκε είναι η μετάλλαξη IVS1 (Hph). Πρόκειται για ένα μικρό έλλειμμα (5 bp), το οποίο ανήκει σε μία κατηγορία μεταλλάξεων (μικρά ελλείμματα/ενθέσεις), που χαρακτηρίζονται ως οι πιο δύσκολες να ανιχνευθούν και να διαφοροποιηθούν ακόμη και με την ανάλυση HRM, όπου η ανίχνευση επηρεάζεται από το μήκος του τμήματος που αναλύεται και από τη εκάστοτε αλληλουχία του συγκεκριμένου τμήματος [54]. Ένα από τα αξιοσημείωτα σημεία του προτεινόμενου πρωτοκόλλου HRM, είναι η ανίχνευση της μετάλλαξης Hb Questembert, αντικατάσταση μίας βάσης (T>C) στο κωδικόνιο 131 είτε του ΗΒΑ1 είτε του HBA2 γονιδίου. Το τμήμα F3, το οποίο περιλαμβάνει και την 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή, διαφέρει στην 119

αλληλουχία μεταξύ των δύο α γονιδίων. Παρόλο που η αντικατάσταση της βάσης είναι ίδια στην κωδικοποιούσα περιοχή και για τα δύο γονίδια, οι καμπύλες τήξης για ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα είναι διαφορετικές στα δυο διαφορετικά γονίδια (Σχ. 4.2 (ΣΤ), 4.3 (Α)). Η παρατήρηση αυτή δείχνει ότι τόσο η αλληλουχία, όσο και η σύνθεση των νουκλεοτιδίων είναι καθοριστικοί παράγοντες της σταθερότητας του δίκλωνου DNA. Επιπλέον, τέσσερις ΗΒΑ1 μεταλλάξεις στο τμήμα F2(α1), συμπεριλαμβανομένων ετεροζυγωτών και ομοζυγωτών για τις μεταλλάξεις Hb Adana και Hb Heraklion, και μόνο ετεροζυγωτών για τις μεταλλάξεις Hb Aghia Sophia και Hb Taybe (έξι διαφορετικές καμπύλες τήξης), διαφοροποιούνται ξεκάθαρα από ομόζυγα φυσιολογικά δείγματα αλλά και μεταξύ τους, όταν αναλύονται ταυτόχρονα (Σχ. 4.2 (Γ)). Ωστόσο, η διάκριση των ετεροζυγωτών και ομοζυγωτών για τις μεταλλάξεις polya και Turkish polya στο τμήμα F3(α2) επιτυγχάνεται μόνο όταν τα δείγματα, για κάθε μετάλλαξη, αναλύονται ξεχωριστά, χωρίς την παρουσία δειγμάτων που φέρουν άλλες μεταλλάξεις (Σχ. 4.3 (Β) και (Γ)). Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στις περιορισμένες δυνατότητες του λογισμικού προγράμματος να διακρίνει αλλαγές στην αλληλουχία που παρουσιάζουν παρόμοια καμπύλη τήξης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, πρακτικά μπορούν να ανιχνευθούν όλες οι μεταλλάξεις σε ετερόζυγη κατάσταση από την ανάλυση καμπύλης τήξης, αλλά όχι όλες σε ομόζυγα μεταλλαγμένη κατάσταση. Θερμοδυναμικές παράμετροι μεταξύ γειτονικών νουκλεοτιδίων οδηγούν σε όμοιες καμπύλες τήξης μεταξύ ομόζυγα φυσιολογικών και ομόζυγα μεταλλαγμένων δειγμάτων. Σε αυτή την περίπτωση, η προσθήκη ενός δείγματος ελέγχου γνωστού γονότυπου (συνήθως ομόζυγα φυσιολογικού), πριν την αντίδραση PCR, μπορεί να οδηγήσει στη διαφοροποίηση των καμπυλών τήξης, και επομένως, στην ανίχνευση των ετερόζυγων, των ομόζυγα μεταλλαγμένων και των φυσιολογικών γονότυπων, με το ποσοστό του φυσιολογικού DNA αναφοράς να παίζει βασικό ρόλο στη διαφοροποίηση των διαφορετικών γονότυπων [55]. Μια πρόσφατη καινοτομία στην ανίχνευση των ομόζυγα μεταλλαγμένων δειγμάτων είναι η χρήση εσωτερικών θερμοκρασιακών βαθμονομητών, που βοηθούν στην αύξηση της ακρίβειας της ανίχνευσης των ομοζυγωτών, μειώνοντας τις τυπικές αποκλίσεις των θερμοκρασιών τήξης, T m [56]. Η χρήση 120

μη επισημασμένων ανιχνευτών είναι ένας άλλος τρόπος για τον προσδιορισμό του γονότυπου ομόζυγων μεταλλαγμένων δειγμάτων, με σημαντικά υψηλή ευαισθησία, βασιζόμενη στην ειδικότητα του ανιχνευτή και της ασύμμετρης αντίδρασης PCR [57-59]. Μία εναλλακτική προσέγγιση για εύκολη και γρήγορη γονοτύπηση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στα γονίδια της α-σφαιρίνης, των οποίων ο διαχωρισμός δεν επετεύχθη με την ανάλυση HRM, είναι η γονοτύπηση με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο 3. Όπως αναφέρθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο, η δοκιμασία εφαρμόζεται στα ίδια προϊόντα ενίσχυσης που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση καμπύλης τήξης, όταν (i) ένα δείγμα είναι ύποπτο (από τα κλινικά ευρήματα) να είναι ομόζυγα μεταλλαγμένο και δεν ανιχνεύεται από την ανάλυση HRM. Για παράδειγμα, οι μεταλλάξεις Hb Agrinio και IVS1 (Hph) (στο τμήμα F1(α2)) σε ομόζυγα μεταλλαγμένη κατάσταση, που δεν ανιχνεύονται με την ανάλυση HRM, μπορούν εύκολα να γονοτυπηθούν με αντίδραση PEXT και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, χρησιμοποιώντας το ίδιο ενισχυμένο τμήμα F1 (Σχ. 3.5, F1). (ii) Διαφορετικές νουκλεοτιδικές αλλαγές, που παρουσιάζουν παρόμοιες καμπύλες τήξης, δεν μπορούν να διαφοροποιηθούν όταν αναλύονται ταυτόχρονα με δείγματα διαφορετικών γονότυπων. Για παράδειγμα ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τις μεταλλάξεις polya και Turkish polya, στην περιοχή πολυαδενυλίωσης (τμήμα F3(α2)), μπορούν να ανιχνευθούν μόνο όταν αναλύονται χωρίς την παρουσία δειγμάτων που φέρουν άλλες μεταλλάξεις (Σχ. 4.3 (Β), (Γ)). Αντιθέτως, οι μεταλλάξεις αυτές ανιχνεύονται επιτυχώς με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων (Σχ. 3.5, F3). Σε γενικές γραμμές, η παρουσία περισσότερων της μίας μεταλλάξεων στο ίδιο τμήμα απαιτεί την ταυτόχρονη ανάλυση δειγμάτων διαφορετικών, γνωστών γονότυπων, προκειμένου να επιτευχθεί η διαφοροποίηση τους με την ανάλυση HRM. Ωστόσο, πρέπει να υπάρχει ένα όριο στο αριθμό των μεταλλάξεων που είναι παρούσες σε ένα τμήμα, διότι αυτό, στις περισσότερες περιπτώσεις, απαιτεί το σχεδιασμό τμημάτων μεγαλύτερου μεγέθους, καθιστώντας έτσι την ταυτόχρονη ανίχνευση και διαφοροποίηση των διαφόρων μεταλλάξεων δύσκολη ή ακόμη και αδύνατη. Ο περιορισμός αυτός, ωστόσο, δεν ισχύει για όλες τις μεταλλάξεις, καθώς 121

εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του τμήματος, τη μετάλλαξη και τις θερμοδυναμικές παραμέτρους των γειτονικών βάσεων. Για παράδειγμα, οι μεταλλάξεις του α1 γονιδίου στο τμήμα F2 (Hb Aghia Sophia, Hb Adana, Hb Heraklion, Hb Taybe) ανιχνεύονται επιτυχώς όταν αναλύονται ταυτόχρονα με δείγματα γνωστού γονότυπου (Σχ. 4.2 (Γ)). Εν κατακλείδι, οι 13 μη ελλειμματικές μεταλλάξεις της α-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης, πιο συχνά εμφανιζόμενες σε μεσογειακούς πληθυσμούς, ανιχνεύθηκαν επιτυχώς με ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας, με τη χρήση του οργάνου LightScanner και της χρωστικής LCGreen Plus. Τα σημαντικότερα αποτελέσματα του προτεινόμενου πρωτοκόλλου HRM για την ανίχνευση των μη ελλειμματικών μεταλλάξεων της α-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης, συγκριτικά με τις υπάρχουσες αναφορές μπορούν να συνοψιστούν ως εξής: (1) Σαφής και αδιαμφισβήτητη διαφοροποίηση και των 13 ετεροζυγωτών από φυσιολογικά δείγματα, αλλά και μεταξύ τους στο ίδιο τμήμα. (2) Διαφοροποίηση των κοινών μεταλλάξεων των γονιδίων ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2 (Hb Adana και Hb Questembert) σε ετερόζυγη και ομόζυγα μεταλλαγμένη κατάσταση, λόγω της ειδικής ενίσχυσης των τμημάτων των γονιδίων ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2, ξεχωριστά. (3) Διαχωρισμός, για πρώτη φορά, ομόζυγα μεταλλαγμένων δειγμάτων από φυσιολογικά, για τις περισσότερες μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων των Initiation Codon, Hb Heraklion, Hb Adana (και στα δύο γονίδια), Hb Questembert (και στα δύο γονίδια), polya και Turkish polya. Παρά το γεγονός ότι δεν επετεύχθη η διάκριση όλων των ομόζυγα μεταλλαγμένων δειγμάτων από τα φυσιολογικά δείγματα, αυτό δεν θα πρέπει να θεωρείται πρόβλημα από κλινικής άποψης, δεδομένου ότι όλα τα αποτελέσματα του μοριακού ελέγχου πρέπει να αξιολογούνται παράλληλα με τα αιματολογικά και τα κλινικά ευρήματα σε κάθε περίπτωση. Επιπλέον, από κλινικής άποψης, κάθε δείγμα που παρουσιάζει μία καμπύλη τήξης διαφορετική από αυτή ενός φυσιολογικού δείγματος, πρέπει να αναλυθεί με εναλλακτικές μεθόδους, που υποστηρίζουν την οριστική γονοτύπηση των νουκλεοτιδικών αλλαγών [36, 42, 43]. Η ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας είναι δυνητικά μία μέθοδος υψηλής απόδοσης και ευαισθησίας, γρήγορη, με χαμηλό λειτουργικό κόστος, η οποία παρέχει τη δυνατότητα αυτοματοποίησης σε μεγάλο βαθμό και 122

μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο για την ανίχνευση δειγμάτων με μη ελλειμματικές μεταλλάξεις στα γονίδια της α-σφαιρίνης. 123

Πίνακας 4.4. Συνοπτική παρουσίαση των αποτελεσμάτων της HRM ανάλυσης και των μεταλλάξεων που περιλαμβάνονται σε κάθε ένα από τα γονίδια ΗΒΑ1 και ΗΒΑ2. Τμήμα/ Γονίδιο Τμήμα 2 (HBA1) Τμήμα 3 (HBA1) Τμήμα 1 (HBA2) Τμήμα 2 (HBA2) Τμήμα 3 (HBA2) Μετάλλαξη Hb Aghia Sophia (c.187_189delgtg) Hb Adana (α1) (c.179g>a) Hb Heraklion (c.112_114delccc) Hb Taybe (c.118_120delacc) Hb Questembert (α1) (c.394t>c) Initiation Codon (c.2t>c) Hb Agrinio (c.89t>c) IVS1 (Hph) (c.95+2_95+6deltgagg) IVS1-116 (c.96-2a>g) Hb Adana(α2) (c.179g>a) Hb Questembert (a2 ) (c.394t>c) Hb Icaria (c.427t>a) Hb Constant Spring (c.427t>c) polya (c.*+94a>g) Turkish polya (c.*+92a>g) Αποτελέσματα HRMA Το F2 ενισχύθηκε από το α1 (1087 bp) τμήμα με το ζεύγος εκκινητών R3/R4 Ετερόζυγα και ομόζυγα δείγματα για τις μεταλλάξεις Hb Aghia Sophia και Hb Adana διακρίνονται εμφανώς από φυσιολογικά δείγματα (Σχ. 4.2 (Γ)) Ετεροζυγότες για τις μεταλλάξεις Hb Aghia Sophia και Hb Taybe διακρίνονται εμφανώς από φυσιολογικά δείγματα (Σχ. 4.2 (Γ)) Οι μεταλλάξεις Hb Heraklion και Hb Taybe (ελλείμματα 3bp ), που βρίσκονται πολύ κοντά η μία με την άλλη, διακρίνονται εμφανώς από τη διαφορά στο T m των ετεροζυγωτών (Σχ. 4.2 (Δ)) Δεν ήταν διαθέσιμα ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τις μεταλλάξεις Hb Aghia Sophia και Hb Taybe. Το F3 ενισχύθηκε από το α1 (1087 bp) τμήμα με το ζεύγος εκκινητών R5/R6 Ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα συνθετικά δείγματα διακρίνονται επιτυχώς (Σχ. 4.2 (ΣΤ)) Το F1 ενισχύθηκε από το α2 (1087 bp) τμήμα με το ζεύγος εκκινητών R1/R2 Ετεροζυγότες για τις μεταλλάξεις Hb Agrinio και IVS1 (Hph) διακρίνονται επιτυχώς (Σχ. 4.2 (A)) Ομόζυγο μεταλλαγμένο δείγμα για τη μετάλλαξη Initiation Codon διακρίνεται επιτυχώς (Σχ. 4.2 (A)) Ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα είτε για τη μετάλλαξη Hb Agrinio είτε για την IVS1 (Hph) δεν διακρίνονται από τα φυσιολογικά Σύνθετοι ετεροζυγώτες για τις μεταλλάξεις IVS1 (Hph) και Hb Agrinio διακρίνονται σαφώς από δείγματα που φέρουν μόνο μία από τις μεταλλάξεις αυτές (Σχ. 4.2 (B)) Το F2 ενισχύθηκε από το α2 (1087 bp) τμήμα με το ζεύγος εκκινητών R3/R4 Ετερόζυγα δείγματα για τις μεταλλάξεις IVS1-116 και Hb Adana διακρίνονται εμφανώς από φυσιολογικά δείγματα (Σχ. 4.2 (E)) Η μετάλλαξη Hb Adana σε ομόζυγα μεταλλαγμένη κατάσταση διαχωρίζεται επιτυχώς από φυσιολογικά δείγματα, μολονότι η διαφορά του φθορισμού είναι μικρή (Σχ. 4.2 (E)) Δεν ήταν διαθέσιμα ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τη μετάλλαξη IVS1-116 Το F3 ενισχύθηκε από το α2 (1087 bp) τμήμα με το ζεύγος εκκινητών R5/R7 Ετερόζυγα και ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τις μεταλλάξεις Hb Questembert, polya και Turkish polya διαχωρίζονται εμφανώς (Σχ. 4.3 (A), 4.3 (B) και 4.3 (Γ)) Δείγματα ετερόζυγα για τις μεταλλάξεις Hb Icaria και Hb Constant Spring (αλλαγή μίας βάσης στο ίδιο νουκλεοτίδιο) διαχωρίζονται εμφανώς (Σχ.4.3 (Δ)) Δεν ήταν διαθέσιμα ομόζυγα μεταλλαγμένα δείγματα για τις μεταλλάξεις Hb Icaria και Hb Constant Spring 124

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΗBA1 (Gene Bank Accession Number NG_000006.1) Gene: 37514..38385 mrna: join (37514..37674, 37792..37996, 38146..38385) 37321 ggcgggagtg gagtggcggg tggagggtgg agacgtcctg gcccccgccc cgcgtgcacc 37381 cccaggggag gccgagcccg ccgcccggcc ccgcgcaggc cccgcccggg actcccctgc 37441 ggtccaggcc gcgccccggg ctccgcgcca gccaatgagc gccgcccggc cgggcgtgcc 37501 cccgcgcccc aagcataaac cctggcgcgc tcgcggcccg gcactcttct ggtccccaca 37561 gactcagaga gaacccacca tggtgctgtc tcctgccgac aagaccaacg tcaaggccgc 37621 ctggggtaag gtcggcgcgc acgctggcga gtatggtgcg gaggccctgg agaggtgagg 37681 ctccctcccc tgctccgacc cgggctcctc gcccgcccgg acccacaggc caccctcaac 37741 cgtcctggcc ccggacccaa accccacccc tcactctgct tctccccgca ggatgttcct 37801 gtccttcccc accaccaaga cctacttccc gcacttcgac ctgagccacg gctctgccca 37861 ggttaagggc cacggcaaga aggtggccga cgcgctgacc aacgccgtgg cgcacgtgga 37921 cgacatgccc aacgcgctgt ccgccctgag cgacctgcac gcgcacaagc ttcgggtgga 37981 cccggtcaac ttcaaggtga gcggcgggcc gggagcgatc tgggtcgagg ggcgagatgg 38041 cgccttcctc gcagggcaga ggatcacgcg ggttgcggga ggtgtagcgc aggcggcggc 38101 tgcgggcctg ggccctcggc cccactgacc ctcttctctg cacagctcct aagccactgc 38161 ctgctggtga ccctggccgc ccacctcccc gccgagttca cccctgcggt gcacgcctcc 38221 ctggacaagt tcctggcttc tgtgagcacc gtgctgacct ccaaataccg ttaagctgga 38281 gcctcggtgg ccatgcttct tgccccttgg gcctcccccc agcccctcct ccccttcctg 38341 cacccgtacc cccgtggtct ttgaataaag tctgagtggg cggcagcctg tgtgtgcctg 38401 agttttttcc ctcagcaaac gtgccaggca tgggcgtgga cagcagctgg gacacacatg 125

ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΗBA2 (Gene Bank Accession Number NG_000006.1) Gene: 33710..34573 mrna: join (33710..33870, 33988..34192, 34335..34573) 33481 gcgccgctac cgccctgccc ccgggcgagc gggatgggcg ggagtggagt ggcgggtgga 33541 gggtggagac gtcctggccc ccgccccgcg tgcaccccca ggggaggccg agcccgccgc 33601 ccggccccgc gcaggccccg cccgggactc ccctgcggtc caggccgcgc cccgggctcc 33661 gcgccagcca atgagcgccg cccggccggg cgtgcccccg cgccccaagc ataaaccctg 33721 gcgcgctcgc gggccggcac tcttctggtc cccacagact cagagagaac ccaccatggt 33781 gctgtctcct gccgacaaga ccaacgtcaa ggccgcctgg ggtaaggtcg gcgcgcacgc 33841 tggcgagtat ggtgcggagg ccctggagag gtgaggctcc ctcccctgct ccgacccggg 33901 ctcctcgccc gcccggaccc acaggccacc ctcaaccgtc ctggccccgg acccaaaccc 33961 cacccctcac tctgcttctc cccgcaggat gttcctgtcc ttccccacca ccaagaccta 34021 cttcccgcac ttcgacctga gccacggctc tgcccaggtt aagggccacg gcaagaaggt 34081 ggccgacgcg ctgaccaacg ccgtggcgca cgtggacgac atgcccaacg cgctgtccgc 34141 cctgagcgac ctgcacgcgc acaagcttcg ggtggacccg gtcaacttca aggtgagcgg 34201 cgggccggga gcgatctggg tcgaggggcg agatggcgcc ttcctctcag ggcagaggat 34261 cacgcgggtt gcgggaggtg tagcgcaggc ggcggctgcg ggcctgggcc gcactgaccc 34321 tcttctctgc acagctccta agccactgcc tgctggtgac cctggccgcc cacctccccg 34381 ccgagttcac ccctgcggtg cacgcctccc tggacaagtt cctggcttct gtgagcaccg 34441 tgctgacctc caaataccgt taagctggag cctcggtagc cgttcctcct gcccgctggg 34501 cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accggccctt cctggtcttt gaataaagtc 34561 tgagtgggca gcagcctgtg tgtgcctggg ttctctctat cccggaatgt gccaacaatg 34621 gaggtgttta cctgtctcag accaaggacc tctctgcagc tgcatggggc tggggaggga 126

Κεφάλαιο 5 Ανάπτυξη ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης για τη γονοτύπηση γενετικών παραγόντων που σχετίζονται με τη θρομβοφιλία 5.1. Εισαγωγή Θρομβοφιλία θεωρείται η διαταραχή της ισορροπίας του αιμοστατικού μηχανισμού που ευνοεί τη θρόμβωση. Γενετικοί παράγοντες, επίκτητες αλλαγές στο μηχανισμό πήξης του αίματος ή συνηθέστερα, συνδυασμός και γενετικών και επίκτητων παραγόντων μπορεί να οδηγήσει σε προδιάθεση για θρόμβωση ή θρομβοφιλία. Εκτός όμως από τις κληρονομικές και επίκτητες διαταραχές της αιμόστασης, στην εμφάνιση επεισοδίου θρόμβωσης συμβάλλουν και περιβαλλοντικοί παράγοντες. Από τα παραπάνω, γίνεται αντιληπτό ότι η θρομβοφιλία αποτελεί μία πολυπαραγοντική διαταραχή. Οι γενετικοί παράγοντες που μπορεί να προκαλέσουν θρομβοεμβολικά επεισόδια περιλαμβάνουν μεταλλάξεις σε διάφορες, καλά χαρακτηρισμένες περιοχές των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διαδικασία πήξης, στη διαδικασία ινωδόλυσης και στο μεταβολισμό της ομοκυστεΐνης. Οι τρεις πιο κοινοί γενετικοί παράγοντες κινδύνου, που συνδέονται με θρομβοεμβολικά επεισόδια είναι η μετάλλαξη G1691A στο γονίδιο του παράγοντα πήξης V, γνωστή και ως FV Leiden, η μετάλλαξη G20210A στο γονίδιο του παράγοντα πήξης ΙΙ (προθρομβίνη) και η μετάλλαξη C677T στο γονίδιο της μεθυλενοτετραϋδροφιλικής αναγωγάσης (methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) [60, 61]. Οι τρεις αυτοί γενετικοί παράγοντες κινδύνου αποτελούν μέρος των εξετάσεων προσυμπτωματικού ελέγχου για κληρονομική θρομβοφιλία σε ασθενείς με θρομβοεμβολικά επεισόδια. 127

Εκτός από τους τρεις πιο κοινούς γενετικούς παράγοντες κινδύνου, που συνδέονται με θρομβοεμβολικά επεισόδια, ένα επιπλέον πάνελ βιοδεικτών που προδιαθέτουν για θρομβοεμβολικά επεισόδια περιλαμβάνει τη μετάλλαξη H1299R στο γονίδιο του παράγοντα πήξης V, τη μετάλλαξη A1298C στο γονίδιο της μεθυλενοτετραϋδροφιλικής αναγωγάσης (MTHFR), τη μετάλλαξη V34L στο γονίδιο του παράγοντα σταθεροποίησης του ινώδους (Factor XIII), καθώς και τον πολυμορφισμό 4G/5G στο γονίδιο του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (plasminogen activator inhibitor type-1, PAI- 1). Το 1996 ανακαλύφθηκε ένας σύνθετος απλότυπος στο εξόνιο 13 του γονιδίου του παράγοντα πήξης V (A4070G ή H1299R), γνωστός και ως R2. Ο απλότυπος R2 έχει βρεθεί ότι περιλαμβάνει πάνω από 12 πολυμορφισμούς σε όλο το γονίδιο, που είναι γνωστοί ως HR2. Οι επτά από αυτούς τους πολυμορφισμούς αφορούν αλλαγή σε αμινοξύ του παράγοντα V και οδηγούν σε τροποποιημένη πρωτεΐνη. Ο πολυμορφισμός R2 σχετίζεται με μειωμένα επίπεδα του παράγοντα V και μειωμένα επίπεδα ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C. Η συσχέτιση του με τη φλεβική θρόμβωση έχει αμφισβητηθεί, δεδομένου ότι ορισμένες μελέτες αναφέρουν αύξηση κινδύνου θρόμβωσης, ενώ σε άλλες η συσχέτιση αυτή παρατηρείται μόνο όταν συν-κληρονομείται ως σύνθετη ετεροζυγωτία με τη μετάλλαξη FV Leiden [62]. Το ένζυμο μεθυλενοτετραϋδροφιλική αναγωγάση (MTHFR) παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό της ομοκυστεΐνης, καταλύοντας τη μετατροπή του 5,10- μεθυλένο-τετραϋδροφυλλικού οξέος σε 5-μεθυλ-τετραϋδροφυλλικό οξύ, το οποίο αποτελεί το δότη της μεθυλομάδας στην επαναμεθυλίωση της ομοκυστεΐνης προς μεθειονίνη με τη βιταμίνη B 12 ως συμπαράγοντα. Σοβαρή ανεπάρκεια του ενζύμου MTHFR οδηγεί σε ομοκυστινουρία, μια σπάνια γενετική ανωμαλία του μεταβολισμού που χαρακτηρίζεται από ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα ομοκυστεΐνης στο αίμα και στα ούρα. Μέτρια μειωμένες συγκεντρώσεις του ενζύμου MTHFR, που συχνά συνδέονται με την κοινή θερμοευαίσθητη μορφή του ενζύμου αυτού, μπορούν να οδηγήσουν σε υπερομοκυστεϊναιμία, η οποία χαρακτηρίζεται από ήπια έως μέτρια αύξηση των συγκεντρώσεων ολικής ομοκυστεΐνης στο πλάσμα. Η υπερομοκυστεϊναιμία έχει συσχετιστεί με διάφορες αγγειακές παθήσεις 128

συμπεριλαμβανομένης της στεφανιαίας νόσου και της φλεβική και αρτηριακής θρόμβωσης. Εκτός από τη μετάλλαξη C677T στο γονίδιο MTHFR και η μετάλλαξη A1298C στο ίδιο γονίδιο προκαλεί έκπτωση της ενζυμικής δραστικότητας του σε μικρότερο βαθμό από ότι η πρώτη μετάλλαξη [63, 64]. Ο παράγοντας XIII ή παράγοντας σταθεροποίησης του ινώδους, είναι ένα ένζυμο του συστήματος της πήξης, το οποίο χρησιμεύει στη σταθεροποίηση του δικτύου του ινώδους. Μεταλλάξεις στο γονίδιο του παράγοντα XIII έχει βρεθεί ότι συνδέονται με την προστασία έναντι ορισμένων καρδιαγγειακών παθήσεων. Ο πιο κοινός πολυμορφισμός V34L μειώνει τη σταθερότητα του θρόμβου τροποποιώντας τη δομή του δικτύου του ινώδους, δρώντας προστατευτικά και μειώνοντας τον κίνδυνο θρομβώσεων. Ταυτόχρονα έχει παρατηρηθεί ότι προστατεύει από έμφραγμα του μυοκαρδίου, εν το βάθη φλεβική θρόμβωση και ισχαιμικό επεισόδιο. Ο πολυμορφισμός V34L είναι αποτέλεσμα της αντικατάστασης μίας βάσης (G>T) στη θέση 103, στο εξόνιο 2 του γονιδίου FXIIIA1, το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6p24-25 [65]. Ο αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (PAI-1), ο πιο σημαντικός αναστολέας ενεργοποίησης του πλασμινογόνου in vivo, παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ενδο-αγγειακής ινωδόλυσης, και επίσης, εμπλέκεται και στην επιδιόρθωση ιστών. Το γονίδιο PAI-1 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 7 και περιέχει 8 εσόνια και 9 εξόνια. Ένας πολυμορφισμός, ένθεση/έλλειμμα (4G/5G) μίας γουανίνης, στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου PAI-1 στο νουκλεοτίδιο -675, παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της έκφρασης του αναστολέα PAI-1, και, επομένως, στα επίπεδα συγκέντρωσης του αναστολέα PAI-1 στο πλάσμα. Το αλλήλιο 5G δημιουργεί μία επιπλέον θέση δέσμευσης για έναν αναστολέα της μεταγραφής, το οποίο οδηγεί σε διαφορές στην έκφραση του γονιδίου PAI-1. Το αλλήλιο 4G έχει συσχετιστεί με μεγαλύτερες συγκεντρώσεις του αναστολέα στο πλάσμα και με φλεβική θρομβοεμβολή και στεφανιαία νόσο [66, 67, 68]. Μεμονωμένα, οι μεταλλάξεις αυτές, έχουν μικρή ή καμία επίδραση στη φλεβική θρόμβωση, αλλά πιθανόν να δρουν συνεργικά με άλλους γενετικούς ή επίκτητους παράγοντες κινδύνου αυξάνοντας την προδιάθεση, ή στην περίπτωση του παράγοντα XIII δρώντας προστατευτικά. 129

Σήμερα, στα περισσότερα από τα νοσοκομεία και διαγνωστικά εργαστήρια χρησιμοποιείται η μέθοδος PCR-RFLP (αντίδραση PCR σε συνδυασμό με ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα) και η αλληλο-ειδική αντίδραση PCR για την ανίχνευση των μεταλλάξεων αυτών, καθώς είναι εύκολο να στηθούν και να εκτελεστούν. Επίσης, μέθοδοι όπως η πολλαπλή αλληλο-ειδική αντίδραση PCR (MAS-PCR) [69], καθώς και η τεχνολογία ανίχνευσης προϊόντων επέκτασης σε σφαιρίδια μέσω του συστήματος Luminex xmap [70] έχουν αναπτυχθεί πρόσφατα για την ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με θρομβοφιλία. Η σημασία των διαγνωστικών εξετάσεων είναι υψηλή, δεδομένου ότι μπορούν να εντοπίσουν ασθενείς με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής σε θρομβοεμβολικά επεισόδια, καθώς και άλλα μέλη της οικογένειας με διαταραχές σχετικές με θρομβοφιλία. Σε πρόσφατη ερευνητική εργασία που εκπονήθηκε από μέλος της ομάδας μας (Νίκος Φούντογλου Διατριβή Ειδίκευσης [71]), αναπτύχθηκε ταχεία, απλή και χαμηλού κόστους μέθοδος για την οπτική ανίχνευση (διά γυμνού οφθαλμού) των τριών πιο κοινών γενετικών παραγόντων κινδύνου, που συνδέονται με θρομβοεμβολικά επεισόδια και περιλαμβάνουν τη μετάλλαξη G1691A στο γονίδιο του παράγοντα πήξης V, γνωστή και ως FV Leiden, τη μετάλλαξη G20210A στο γονίδιο του παράγοντα πήξης ΙΙ (προθρομβίνη) και τη μετάλλαξη C677T στο γονίδιο της μεθυλενοτετραϋδροφιλικής αναγωγάσης (MTHFR) με τη χρήση ενός νέου βιοαισθητήρα, τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Η δοκιμασία περιλαμβάνει μία πολλαπλή αντίδραση PCR, μία πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης μέσω ενός απλού βιοαισθητήρα. Η οπτική ανίχνευση εξαλείφει την ανάγκη χρήσης εξειδικευμένου εξοπλισμού και ειδικού τεχνικού προσωπικού και επιτυγχάνεται εντός 30 min μετά από την αντίδραση PCR. Ο βιοαισθητήρας στηρίζεται στη διαδικασία της συνεχούς ροής, ενώ τα αντιδραστήρια είναι αποτεθειμένα σε ξηρή μορφή στη μεμβράνη της ταινίας. Το άκρο του βιοαισθητήρα εμβαπτίζεται στο κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης, το διάλυμα ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας μέσω τριχοειδών δυνάμεων, επαναδιαλύει τα αντιδραστήρια και βοηθάει στην ακινητοποίηση και την ανίχνευση των προϊόντων της γονοτυπικής αντίδρασης χωρίς την ανάγκη για επιπλέον στάδια επωάσεων και εκπλύσεων. Στο παρόν κεφάλαιο 130

περιγράφεται η ανάπτυξη και η βελτιστοποίηση μεθόδου για την ανίχνευση των τεσσάρων λιγότερο κοινών μεταλλάξεων που σχετίζονται με θρομβοφιλία και είναι οι FV H1299R, FXIII V34L, MTHFR A1298C και PAI-1 4G/5G. Στη μεμβράνη της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων έχουν αποτεθεί 9 κηλίδες, ένα ζεύγος κηλίδων για κάθε μετάλλαξη (μία κηλίδα για κάθε αλλήλιο) και μία μονή κηλίδα (κηλίδα ελέγχου), η οποία επιβεβαιώνει τη σωστή λειτουργία του συστήματος. Μία κηλίδα χρωματίζεται κόκκινη, όταν είναι παρόν το αντίστοιχο αλληλόμορφο στο δείγμα. Επομένως, ο γονότυπος για κάθε γενετικό τόπο αποδίδεται οπτικά από τη θέση των κόκκινων κηλίδων που εμφανίζονται στην ταινία. 5.2. Οργανολογία & Μέθοδοι 5.2.1. Οργανολογία Η οργανολογία αναγράφεται στο κεφάλαιο 2 (2.2.1). 5.2.2. Κλινικά δείγματα Τα δείγματα ολικού αίματος που χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη διατέθηκαν από το Εργαστήριο Αιματολογίας της Μονάδας Μοριακής Βιολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Τα δείγματα απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα ασθενών, ως μέρος ενός γενικότερου προγράμματος για την ταυτοποίηση των εν λόγω μεταλλάξεων μέσω της χρήσης εμπορικά διαθέσιμου kit γονοτύπησης CVD StripAssay της εταιρείας ViennaLab Diagnostics (Vienna, Austria). 5.2.3. Μέθοδοι Σύζευξη NH 2 -ολιγονουκλεοτιδίων με σφαιρίδια πολυστυρενίου που φέρουν στην επιφάνεια τους ομάδες -COOH Για τη σύζευξη ολιγονουκλεοτιδίων με σφαιρίδια πολυστυρενίου, χρησιμοποιήθηκαν άχρωμα σφαιρίδια πολυστυρενίου, διαμέτρου 2 μm 131

(Polysciences), που φέρουν καρβοξυλομάδες στην επιφάνειά τους. Το πρωτόκολλο σύζευξης περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο 2 (2.2.3). Σήμανση των ολιγονουκλεοτιδίων ακινητοποιημένων στην επιφάνεια των σφαιρίδιων πολυστυρενίου με βιοτίνη Για την κατασκευή της ζώνης ελέγχου χρησιμοποιούνται σφαιρίδια πολυστυρενίου συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια (τυχαία αλληλουχία), μετά από επέκταση των ολιγονουκλεοτιδίων παρουσία biotin-dutps. Το πρωτόκολλο περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο 2 (2.2.3). Σύζευξη νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα έναντι βιοτίνης Η σύζευξη των νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα έναντι βιοτίνης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο κεφάλαιο 2 με τη διαφορά ότι η τελική ανασύσταση γίνεται σε 50 μl διαλύματος (BSA 1 g/l σε διάλυμα βόρακα 2 mm που περιέχει 1 g/l NaN 3 ) (2.2.3). Κατασκευή ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων Η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων (40mm x 70mm), η οποία περιλαμβάνει το χάρτη εμβάπτισης, το χάρτη απόθεσης (υαλοβάμβακα) των νανοσφαιριδίων χρυσού και του δείγματος, το χάρτη απορρόφησης, τη διαγνωστική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και μία αυτοκόλλητη πλαστική κάρτα, συναρμολογήθηκε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο 2 (2.2.3). Στη συνέχεια, 0,5 μl εναιωρήματος σφαιριδίων πολυστυρενίου (5,5x10 5 σφαιρίδια) συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια αποτέθηκαν πάνω στη μεμβράνη προς σχηματισμό κηλίδων δοκιμασίας (Σχ. 5.1). Ειδικότερα, σφαιρίδια συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια, που αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα, αποτέθηκαν στην αριστερή πλευρά της μεμβράνης, ενώ σφαιρίδια συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια, που αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, αποτέθηκαν στην δεξιά πλευρά της μεμβράνης. Τα ειδικά σφαιρίδια για κάθε μετάλλαξη έχουν αποτεθεί με την εξής σειρά των μεταλλάξεων από κάτω προς τα πάνω: FV H1299R, FXIII, MTHFR A1298C και PAI-1. Τέλος, 0,8 μl εναιωρήματος, που περιέχει 2,24x10 5 σφαιρίδια 132

πολυστυρενίου συζευγμένα με βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια, αποτίθεται στο πάνω μέρος της ταινίας για το σχηματισμό της κηλίδας ελέγχου. Η ταινία αφήνεται να στεγνώσει για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου και φυλάσσεται σε ξηρό μέρος. Πολλαπλή αντίδραση ενίσχυσης Πραγματοποιήθηκε τετραπλή αντίδραση PCR για την ενίσχυση των περιοχών των γονιδίων, στις οποίες εντοπίζονται οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις οι οποίες είναι οι εξής: τμήμα 331 bp στο γονίδιο PAI-1, που περιλαμβάνει τη μετάλλαξη 4G/5G, τμήμα 453 bp στο γονίδιο MTHFR, που περιλαμβάνει τη μετάλλαξη Α1298C, τμήμα 532 bp στο γονίδιο FXIII, που περιλαμβάνει τη μετάλλαξη V34L και τμήμα 661 bp στο γονίδιο FV, που περιλαμβάνει τη μετάλλαξη H1299R. Για την ενίσχυση σχεδιάστηκαν ειδικά 4 ζεύγη εκκινητών, ένα για κάθε γενετική περιοχή (Πίν. 5.1). Όλοι οι εκκινητές της PCR που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη σχεδιάστηκαν in silico με τα λογισμικά προγράμματα PrimerPremier5 και PrimerPlex2 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) και συντέθηκαν από την εταιρεία VBC Genomics (Wien, Austria). Για την πολλαπλή αντίδραση ενίσχυσης των τεσσάρων τμημάτων χρησιμοποιήθηκε το εμπορικά διαθέσιμο Kapa 2G Fast Multiplex PCR kit (Kapa Biosystems) με 100 ng γενωμικού DNA σε τελικό όγκο 25 μl. Το μείγμα της αντίδρασης περιείχε 1 U πολυμεράσης, 3 mm MgCl 2, 0,2 mμ από κάθε dntp, 0,3 μμ από κάθε εκκινητή για το γονίδιο FV, 0,2 μμ από κάθε εκκινητή για το γονίδιο FXIII, 0,6 μμ από κάθε εκκινητή για το γονίδιο MTHFR και 0,5 μμ από κάθε εκκινητή για το γονίδιο PAI-1. Το πρόγραμμα της πολλαπλής αντίδρασης PCR ήταν το εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 C για 3 min, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 95 C για 15 s, 65 C για 30 s, 72 C για 30 s και ένα στάδιο τελικής επέκτασης στους 72 ο C για 3 min. Στις αντιδράσεις PCR συμπεριλήφθησαν αρνητικά δείγματα ελέγχου για να επιβεβαιωθεί η απουσία επιμόλυνσης. Πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή Μικρή ποσότητα (~100 fmol) του PCR προϊόντος (χωρίς προηγούμενο καθαρισμό ή επεξεργασία) υποβλήθηκε σε μία πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή για τον προσδιορισμό του γονότυπου των τεσσάρων 133

μεταλλάξεων ταυτοχρόνως (συνολικά 8 αλλήλια). Η πολλαπλή αντίδραση γονοτύπησης πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 20 μl, που περιείχε 1x ρυθμιστικό διάλυμα (20 mm Tris-HCl (ph 8.8), 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 10 mm KCl, 0,1 % Triton X-100), 4 mm MgSO 4 (τελική συγκέντρωση), 1 U Vent (exo-) DNA πολυμεράση (New England Biolabs), 100 fmol προϊόντος PCR (3 μl), 2,5 pmol από καθέναν από τους 8 αλληλο-ειδικούς εκκινητές και 10 μm από καθένα από τα datp, dctp, dgtp, 5 μμ dttp και 5 μμ biotin-dutp. Το πρόγραμμα της πολλαπλής αντίδρασης PEXT ήταν το εξής: αρχική αποδιάταξη στους 98 o C για 2 min, ακολουθούμενη από 10 κύκλους στους 98 o C για 30 s, 65 o C για 30 s, 72 o C για 15 s. Για όλα τα προϊόντα επέκτασης εκκινητή ακολούθησε ένα στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 5 min και αμέσως τοποθέτηση τους στον πάγο. Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές και ανιχνευτές στα πλαίσια της μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής παρουσιάζονται στον πίνακα 5.2. Οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων 3 μl του αποδιατεταγμένου προϊόντος επέκτασης αναμείχθηκε με διάλυμα ανάπτυξης (2x SSC, ph 7,0, 250 ml/l φορμαμίδιο, 30 g/l BSA, 20 ml/l γλυκερόλη, 5 ml/l Tween-20 και 5 g/l SDS) ίσου όγκου. Το μείγμα αποτέθηκε στο πάνω μέρος του χάρτη απόθεσης, πάνω από το σημείο που είχαν αποτεθεί τα νανοσφαιρίδια χρυσού (3,5 μl). Στη συνέχεια, ο χάρτης εμβάπτισης της ταινίας τοποθετείται σε ένα σωληνάριο που περιέχει 300 μl διαλύματος ανάπτυξης, το οποίο ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας. Η οπτική ανίχνευση πραγματοποιείται και ολοκληρώνεται μέσα σε 15 min. Η εμφάνιση κόκκινης κηλίδας υποδηλώνει την παρουσία του αντίστοιχου αλληλόμορφου (φυσιολογικού ή/και μεταλλαγμένου). 134

Σχήμα 5.1. Σχηματική απεικόνιση της δοκιμασίας γονοτύπησης μεταλλάξεων που σχετίζονται με κληρονομική θρομβοφιλία. (Α) Ταυτόχρονη ενίσχυση των επιθυμητών τμημάτων γενωμικού DNA με πολλαπλή αντίδραση PCR. (B) Γονοτύπηση με πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή, χωρίς προηγούμενο καθαρισμό ή επεξεργασία των προϊόντων PCR. (Γ) Άμεση οπτική ανίχνευση των προϊόντων γονοτυπικής αντίδρασης (δια γυμνού οφθαλμού) με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. 5.3. Αποτελέσματα και Συζήτηση 5.3.1. Αρχή της δοκιμασίας Η μέθοδος που αναπτύχθηκε στο παρόν κεφάλαιο για την ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με την κληρονομική θρομβοφιλία, συνοψίζεται στο σχήμα 5.1 και περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (i) Ταυτόχρονη ενίσχυση των επιθυμητών τμημάτων των υπεύθυνων γονιδίων με πολλαπλή αντίδραση PCR, χρησιμοποιώντας ως στόχο γενωμικό DNA, (ii) Πολλαπλή γονοτυπική αντίδραση επέκτασης εκκινητή, χωρίς προηγούμενο καθαρισμό ή επεξεργασία των προϊόντων PCR, (iii) Άμεση οπτική ανίχνευση των προϊόντων της γονοτυπικής αντίδρασης (διά γυμνού οφθαλμού) με νανοσφαιρίδια χρυσού σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. Από την πολλαπλή αντίδραση PCR προέκυψαν τέσσερα τμήματα με μεγέθη 331 bp για το γονίδιο PAI-1, 453 bp για το γονίδιο MTHFR, 532 bp για το γονίδιο FXIII και 661 bp για το γονίδιο FV (Σχ. 5.1 (Α)). Για τη γονοτυπική αντίδραση επέκτασης εκκινητή χρησιμοποιήθηκαν 4 ζεύγη αλληλο-ειδικών εκκινητών, ένα για κάθε γενετικό τόπο (ένας εκκινητής για κάθε αλληλόμορφο). Για κάθε γενετικό τόπο, οι αλληλο-ειδικοί εκκινητές που 135

χρησιμοποιήθηκαν διέφεραν μόνο ως προς το τελευταίο νουκλεοτίδιο, με τον ένα εκκινητή να έχει το τελικό 3 νουκλεοτίδιο συμπληρωματικό στο φυσιολογικό αλληλόμορφο και τον άλλο εκκινητή να έχει το τελικό 3 νουκλεοτίδιο συμπληρωματικό στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. Επιπλέον, κάθε αλληλο-ειδικός εκκινητής φέρει στο 5 άκρο του μία χαρακτηριστική ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία (tag). Λόγω της υψηλής ακρίβειας της Vent (exo-) DNA πολυμεράσης στην εισαγωγή νουκλεοτιδίων, η επέκταση πραγματοποιείται κάτω από συνθήκες απόλυτης συμπληρωματικότητας μεταξύ των αλληλο-ειδικών εκκινητών και της αντίστοιχης αλληλουχίαςστόχου. Πραγματοποιήθηκε ιχνηθέτηση των προϊόντων επέκτασης με βιοτίνη, μέσω ενσωμάτωσης σε αυτά νουκλεοτιδίων biotin-dutp (Σχ. 5.1 (Β)). Η οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης πραγματοποιήθηκε μέσω ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης (Σχ. 5.1 (Γ)). Εκτός από τη μονή κηλίδα ελέγχου που τοποθετείται στο πάνω μέρος της μεμβράνης του αισθητήρα, οι 8 κηλίδες δοκιμασίας διατάσσονται σε πίνακα 4x2, στον οποίο κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει μία πολυμορφική περιοχή. Πιο συγκεκριμένα, με κατεύθυνση από το κάτω μέρος της ταινίας προς το επάνω, οι πολυμορφικές περιοχές είναι οι εξής: FV H1299R, FXIII, MTHFR A1298C, και PAI-1. Οι κηλίδες στα αριστερά και στα δεξιά της κάθε σειράς αντιστοιχούν στα φυσιολογικά και στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, αντίστοιχα. Σε κάθε κηλίδα, τα σφαιρίδια πολυστυρενίου είναι συζευγμένα με ειδικές ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες (anti-tags), οι οποίες υβριδοποιούνται μόνο με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες (tags) στο 5 άκρο των αλληλο-ειδικών εκκινητών. Για την ανίχνευση, νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης και μικρή ποσότητα του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης αποτέθηκαν στην ταινία και το κάτω μέρος αυτής εμβαπτίστηκε στο κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης. Υπό την επίδραση τριχοειδών δυνάμεων, το διάλυμα ανέρχεται κατά μήκος της διαγνωστικής μεμβράνης και οι επεκταμένοι εκκινητές ακινητοποιούνται στην αντίστοιχη κηλίδα δοκιμασίας, μετατρέποντας έτσι την κηλίδα κόκκινη λόγω της πρόσδεσης και της συσσώρευσης των νανοσωματιδίων χρυσού. Ακινητοποιούνται, επίσης, και οι μη επεκταμένοι εκκινητές μέσω της αλληλουχίας στο 5 άκρο τους (tag), αλλά δεν ανιχνεύονται εξαιτίας της έλλειψης μορίων βιοτίνης. Κατά συνέπεια, η 136

εμφάνιση κόκκινων κηλίδων δοκιμασίας υποδηλώνει την παρουσία των αντίστοιχων αλληλόμορφων στο δείγμα. Ο γονότυπος προσδιορίζεται από το χρώμα του κάθε ζεύγους κηλίδων. Για οποιαδήποτε μετάλλαξη, ένα δείγμα φυσιολογικό θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ ένα ομόζυγα μεταλλαγμένο δείγμα θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα του ζεύγους. Και οι δύο κηλίδες θα εμφανίσουν κόκκινο χρώμα αν πρόκειται για ετερόζυγο δείγμα για τη συγκεκριμένη πολυμορφική περιοχή. Στο σημείο αυτό, θα πρέπει να επισημανθεί ότι η συγκεκριμένη αναπτυχθείσα δοκιμασία και για τους επτά παράγοντες κινδύνου θρομβοφιλίας (FV Leiden, FII, MTHFR C677T, FV H1299R, MTHFR A1298C, FXIII V34L και PAI-1 4G/5G) διαφέρει ριζικά από προηγούμενη εργασία, που έχει αναπτυχθεί για την ανίχνευση των τριών πιο κοινών παραγόντων κινδύνου θρομβοφιλίας στα γονίδια FV (Leiden factor), FII και MTHFR [18], και προσφέρει τα εξής σημαντικά πλεονεκτήματα: (Α) Στην παρούσα δοκιμασία χρησιμοποιούνται μόνο δύο ταινίες πολλαπλής ανίχνευσης, μία για τους τρεις πιο κοινούς παράγοντες κινδύνου θρομβοφιλίας και μία για τους τέσσερις πιο σπάνιους, έναντι τριών ταινιών που απαιτούνται για τη γονοτύπηση κάθε δείγματος στην αναφορά 18, μία ταινία για κάθε μετάλλαξη. (Β) Στην εργασία [18], κάθε δείγμα υποβάλλεται σε τρεις ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία για κάθε μετάλλαξη, αντί για μία πολλαπλή γονοτυπική αντίδραση επέκτασης εκκινητή που πραγματοποιείται στην παρούσα εργασία για τις ίδιες μεταλλάξεις. (Γ) Στην εργασία [18], τα νανοσφαιρίδια χρυσού είναι συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια poly(dt), ενώ το αντίσωμα έναντι βιοτίνης, που χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία, έχει λειτουργική δράση σύνδεσης των νανοσφαιριδίων χρυσού με τα μόρια βιοτίνης στα επεκταμένα προϊόντα. (Δ) Στην εργασία [18], η διαγνωστική μεμβράνη περιέχει ζώνες ακινητοποιημένων μορίων (στρεπταβιδίνη, αντίσωμα έναντι φλουορεσκεΐνης), μία διαμόρφωση που περιορίζει τη δυνατότητα για πολλαπλή ανίχνευση. Αντιθέτως, στην παρούσα εργασία, στη διαγνωστική μεμβράνη είναι αποτεθειμένα μικροσφαιρίδια συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια (anti-tags), παρέχοντας έτσι ένα μέσο για την ενίσχυση της πολλαπλότητα της δοκιμασίας. (Ε) Οι επεκταμένοι εκκινητές, στην εργασία [18], ήταν επισημασμένοι με απτένια αντί για ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν 137

στην παρούσα εργασία, περιορίζοντας και πάλι την πολλαπλότητα του συστήματος. 5.3.2. Μελέτες βελτιστοποίησης Οι παράμετροι που επηρεάζουν την απόδοση κάθε σταδίου της προτεινόμενης διαγνωστικής δοκιμασίας ερευνήθηκαν, προκειμένου να επιτευχθεί αφενός η πολλαπλότητα του προσδιορισμού και αφετέρου η αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης των αλληλόμορφων για όλες τις μεταλλάξεις. Αρχικά πειράματα βελτιστοποίησης της αντίδρασης PCR έδειξαν ότι το Multiplex PCR kit Kapa 2G Fast είναι καταλληλότερο σε σχέση με το PCR kit Kapa 2G Fast, καθώς είναι ειδικό για εφαρμογές σε αντιδράσεις πολλαπλής ενίσχυσης. Πραγματοποιήθηκαν, επίσης, μελέτες όσον αφορά στην επίδραση της θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών, στην επίδραση της συγκέντρωσης των ιόντων μαγνησίου και της συγκέντρωσης των εκκινητών, καθώς και στην επίδραση της παρουσίας ή απουσίας DMSO στην αντίδραση PCR. Μελέτες βελτιστοποίησης της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας σαν στόχο ενισχυμένα προϊόντα PCR από κλινικά δείγματα διαφόρων γονότυπων. Μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας υβριδοποίησης των αλληλο-ειδικών εκκινητών, η επίδραση της συγκέντρωσης των αλληλο-ειδικών εκκινητών, η επίδραση της συγκέντρωσης των ιόντων Mg 2+ και η επίδραση της συγκέντρωσης των dntps. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο σχήμα 5.2. Στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή είναι απαραίτητη η χρήση πολυμερασών που έχουν έλλειψη σε επιδιορθωτική δράση. Τέτοιου είδους πολυμεράση είναι Vent(exo-) DNA polymerase, η οποία και επιλέχθηκε για την αντίδραση PEXT, καθώς επιτρέπει τη διάκριση μη συμπληρωματικών βάσεων σταματώντας την επέκταση του DNA. Η θερμοκρασία υβριδοποίησης των αλληλο-ειδικών εκκινητών μελετήθηκε στην περιοχή θερμοκρασιών 55-68 ο C (Σχ. 5.2 (Α)). Επιλέχθηκε η θερμοκρασία των 65 ο C ως βέλτιστη, ώστε να επιτευχθεί υψηλότερη ειδικότητα, χωρίς να επηρεάζεται η απόδοση της αντίδρασης. Η επίδραση της ποσότητας των 8 αλληλο-ειδικών εκκινητών μελετήθηκε στην 138

περιοχή των 1-10 pmol για κάθε εκκινητή. Από τη μελέτη προέκυψε ότι η ένταση των κηλίδων μέχρι τα 2,5 pmol παραμένει σταθερή, αλλά μειώνεται με υψηλότερη ποσότητα εκκινητών (Σχ. 5.2 (Β)). Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στο γεγονός ότι όταν αυξάνει η συγκέντρωση του εκκινητή, το προϊόν επέκτασης συναγωνίζεται για την ίδια θέση δέσμευσης στη μεμβράνη με μεγαλύτερη ποσότητα ελεύθερου (μη επεκταμένου) εκκινητή. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η ποσότητα των 2,5 pmol για κάθε εκκινητή. Η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ επηρεάζει την κινητική και την ειδικότητα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, δεδομένου ότι αποτελεί συμπαράγοντα του ενζύμου. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στην περιοχή συγκεντρώσεων 2-6 mm. Η αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων μαγνησίου οδήγησε στην αύξηση της απόδοσης της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, με αύξηση της έντασης των κηλίδων στη διαγνωστική ταινία. Η αύξηση αυτή δεν συνοδεύτηκε από εμφάνιση μη ειδικών κηλίδων στη διαγνωστική ταινία (Σχ. 5.2 (Γ)). Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η συγκέντρωση ιόντων Mg 2+ 4 mm. Η επίδραση της συγκέντρωσης των dntps μελετήθηκε στην περιοχή συγκεντρώσεων 2,5-20 μμ το κάθε ένα. Η απόδοση της αντίδρασης PEXT, και επομένως, η ένταση των κηλίδων αυξήθηκε με αύξηση της συγκέντρωσης των dntps μέχρι τα 10 μμ. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις dntps η ένταση των κηλίδων παρέμεινε ίδια, ενώ εμφανίστηκαν σήματα μη ειδικών προϊόντων επέκτασης (Σχ. 5.2 (Δ)). Για το λόγο αυτό ως βέλτιστη επιλέχθηκε η συγκέντρωση dntps των 10 μμ. Προκειμένου να εξαλειφθεί η εμφάνιση μη ειδικών σημάτων στην ταινία, προστέθηκε φορμαμίδιο στο διάλυμα ανάπτυξης. Το φορμαμίδιο, σε κατάλληλη συγκέντρωση, συμβάλλει στην ελάττωση των μη ειδικών αλληλεπιδράσεων που μπορεί να αναπτυχθούν στην περιοχή της διαγνωστικής μεμβράνης. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στη περιοχή συγκεντρώσεων 0-250 ml/l (Σχ. 5.2 (Ε)). Σε συγκεντρώσεις φορμαμιδίου μεγαλύτερες των 150 ml/l οι μη ειδικές αλληλεπιδράσεις ελαχιστοποιούνται έως και εξαφανίζονται, με ελάχιστη μείωση των ειδικών σημάτων. Ως βέλτιστη συγκέντρωση φορμαμιδίου επιλέχθηκαν τα 250 ml/l. 139

Σχήμα 5.2. Μελέτες βελτιστοποίησης της δοκιμασίας πολλαπλής γονοτύπησης με αντίδραση PEXT και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Επίδραση των εξής παραγόντων: (Α) θερμοκρασίας υβριδοποίησης των αλληλο-ειδικών εκκινητών στην 8-απλή αντίδραση PEXT, (Β) ποσότητας αλληλο-ειδικών εκκινητών, (Γ) συγκέντρωσης Mg 2+, (Δ) συγκέντρωσης dntps, (E) συγκέντρωσης φορμαμιδίου στο διάλυμα ανάπτυξης. Οι τελικές συνθήκες είναι οι εξής: θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 60 ο C, συγκέντρωση αλληλο-ειδικών εκκινητών 2,5 pmol ο κάθε ένας, συγκέντρωση Mg 2+ 4mM, συγκέντρωση dntps 10 μμ, και συγκέντρωση φορμαμιδίου στο διάλυμα ανάπτυξης 250 ml/l. Η θέση κάθε ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ειδικού για κάθε μετάλλαξη, παρουσιάζεται στο σκίτσο στην αριστερή πλευρά της εικόνας. 5.3.3. Αξιολόγηση της μεθόδου Για την αξιολόγηση της μεθόδου, πραγματοποιήθηκε σειρά μελετών όσον αφορά στην ευαισθησία, στην ειδικότητα, στην επαναληψιμότητα και στην ακρίβεια της μεθόδου. Η ευαισθησία της γονοτυπικής δοκιμασίας αξιολογήθηκε πραγματοποιώντας σειρά αντιδράσεων επέκτασης εκκινητή παρουσία διαφορετικών ποσοτήτων προϊόντος PCR, στην περιοχή 0,05 έως 6 μl. Τα προϊόντα των αντιδράσεων επέκτασης εκκινητή αναλύθηκαν με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο σχήμα 5.3 (Α). Ποσότητα 0,2 μl προϊόντος PCR βρέθηκε να είναι επαρκής, ώστε να δημιουργήσει ορατές κηλίδες για τον καθορισμό του γονότυπου. Παρά το γεγονός ότι ακόμη και η μικρή ποσότητα των 0,2 μl του μίγματος της αντίδρασης PEXT παρέχει ορατές κηλίδες για σωστή γονοτύπηση, η ποσότητα του προϊόντος PCR που επιλέχθηκε για την ανάλυση με το βιοαισθητήρα ήταν ~2-3 μl. 140

Προκειμένου να αξιολογηθεί η ειδικότητα τόσο της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή όσο και της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων και να σχηματιστούν κόκκινες κηλίδες, ειδικά, στην κατάλληλη θέση της μεμβράνης, δύο προϋποθέσεις πρέπει να πληρούνται: (i) επέκταση μόνο των αλληλο-ειδικών εκκινητών με απόλυτη συμπληρωματικότητα με την αλληλουχία στόχο, κατά την αντίδραση επέκτασης εκκινητή (ii) μη διασταυρούμενη αντίδραση των αλληλουχιών στο 5 άκρο των εκκινητών (tags) με τις ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες (anti-tags) που συνδέονται με τα σφαιρίδια πολυστυρενίου που έχουν αποτεθεί στη μεμβράνη. Για τη μελέτη ειδικότητας χρησιμοποιήθηκαν τα εξής δείγματα: (1) Ένα δείγμα φυσιολογικό ως προς όλες τις μεταλλάξεις, (2) ένα δείγμα ετερόζυγο για τις μεταλλάξεις MTHFR A1298C, FXIII V34L και φυσιολογικό για τις FV H1299R, PAI-1 4G/5G και (3) ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο για τις μεταλλάξεις MTHFR A1298C, PAI-1 4G/5G και φυσιολογικό για τις FV H1299R, FXIII V34L. Τα προϊόντα PCR για κάθε δείγμα υποβλήθηκαν σε τρεις αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή. Η πρώτη αντίδραση επέκτασης πραγματοποιήθηκε παρουσία μόνο των συμπληρωματικών στα φυσιολογικά αλληλόμορφα εκκινητών. Η δεύτερη αντίδραση επέκτασης πραγματοποιήθηκε παρουσία μόνο των συμπληρωματικών στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα εκκινητών. Τέλος, κάθε ένα από τα τρία δείγματα υποβλήθηκε σε μία ακόμη αντίδραση επέκτασης εκκινητή, παρουσία όλων των αλληλο-ειδικών εκκινητών. Τα προϊόντα επέκτασης αναλύθηκαν στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο σχήμα 5.3 (Β). Από το σχήμα παρατηρείται ότι παρουσία των αλληλο-ειδικών εκκινητών για τα φυσιολογικά αλληλόμορφα εμφανίζονται κόκκινες κηλίδες μόνο στις θέσεις που αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλλήλια (αριστερή στήλη ταινίας). Αντιθέτως, παρουσία των αλληλο-ειδικών εκκινητών για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα δεν θα έπρεπε να παρατηρείται εμφάνιση καμίας κηλίδας, εφόσον δεν υφίσταται απόλυτη συμπληρωματικότητα για την επέκταση των συγκεκριμένων εκκινητών, γεγονός που δεν επιβεβαιώνεται από το σχήμα. Παρατηρούμε την εμφάνιση κηλίδων στις μη ειδικές θέσεις για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα για τις μεταλλάξεις FV H1299R, MTHFR A1298C και PAI-1 4G/5G. Τέλος, παρουσία όλων των αλληλο-ειδικών εκκινητών (φυσιολογικών και μεταλλαγμένων) εμφανίζονται μόνο οι ειδικές για τις 141

συγκεκριμένες θέσεις κηλίδες (αριστερή στήλη ταινίας). Προκειμένου να αποτραπεί η μη ειδική επέκταση των αλληλο-ειδικών εκκινητών και η μη ειδική υβριδοποίηση με τα ολιγονουκλεοτίδια στα σφαιρίδια πολυστυρενίου, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή με αλλαγή στη θερμοκρασία υβριδοποίησης και ανάλυση των προϊόντων επέκτασης σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων με μεγαλύτερη συγκέντρωση φορμαμιδίου. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν ήταν τα ίδια. Ερμηνεύοντας τα αποτελέσματα, παρατηρούμε τη μη ειδική επέκταση κάποιων από τους αλληλο-ειδικούς εκκινητές για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα και αυτό πάντα απουσία αλληλοειδικών εκκινητών για τα φυσιολογικά αλληλόμορφα. Παρουσία όλων, φυσιολογικοί και μεταλλαγμένοι εκκινητές συναγωνίζονται για τις ίδιες θέσεις υβριδοποίησης στην αλληλουχία στόχο, με τους ειδικούς εκκινητές να επικρατούν στις αντίστοιχες θέσεις, γεγονός που ενισχύει την αποφυγή της μη ειδικής επέκτασης. Το ίδιο παρατηρείται και για τα άλλα δύο δείγματα, όπου εμφανίζεται μη ειδικό σήμα παρουσία μόνο των αλληλο-ειδικών εκκινητών για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα και μόνο για τη μετάλλαξη FV H1299R. Το μη ειδικό σήμα, όπως και στην περίπτωση του φυσιολογικού δείγματος, εξαφανίζεται παρουσία όλων των αλληλο-ειδικών εκκινητών (Σχ.5.3 (Β)). Τα αποτελέσματα που αφορούν την επαναληψιμότητα της μεθόδου παρουσιάζονται στο σχήμα 5.3 (Γ). Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με δύο δείγματα, ένα φυσιολογικό για όλες τις μεταλλάξεις και ένα μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη PAI-1 και φυσιολογικό για τις άλλες τρεις μεταλλάξεις (FV H1299R, MTHFR A1298C και FXIII V34L). Η πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανίχνευση στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πραγματοποιήθηκε, επίσης, εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαιώνουν την πολύ καλή επαναληψιμότητα του συστήματος γονοτυπικού προσδιορισμού για την πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. 142

Σχήμα 5.3. Ευαισθησία (Α), ειδικότητα (Β) και επαναληψιμότητα (Γ) της δοκιμασίας πολλαπλής γονοτύπησης. (Α) Επίδραση της ποσότητας του PCR προϊόντος στην αντίδραση PEXT. (Β) Για τη μελέτη ειδικότητας χρησιμοποιήθηκε ένα δείγμα φυσιολογικό ως προς όλες τις μεταλλάξεις (1), ένα δείγμα ετερόζυγο για τις μεταλλάξεις MTHFR A1298C, FXIII V34L (2) και ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο για τις μεταλλάξεις MTHFR A1298C, PAI-1 4G/5G (3). Τα προϊόντα PCR για κάθε δείγμα υποβλήθηκαν σε τρεις αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή. Μία παρουσία μόνο των συμπληρωματικών στα φυσιολογικά αλληλόμορφα εκκινητών, η δεύτερη παρουσία μόνο των συμπληρωματικών στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα εκκινητών και μία ακόμη αντίδραση επέκτασης εκκινητή παρουσία όλων των αλληλο-ειδικών εκκινητών. (Γ) Η συνολική επαναληψιμότητα της δοκιμασίας πολλαπλής γονοτύπησης συμπεριλαμβάνει την αντίδραση επέκτασης εκκινητή και την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με δύο δείγματα, ένα φυσιολογικό για όλες τις μεταλλάξεις και ένα μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη PAI-1 και φυσιολογικό για τις άλλες τρεις μεταλλάξεις. Η πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανίχνευση στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πραγματοποιήθηκε, επίσης, εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Η θέση κάθε ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ειδικού για κάθε μετάλλαξη, παρουσιάζεται στο σκίτσο στην αριστερή πλευρά της εικόνας. 143

Η ακρίβεια της μεθόδου αξιολογήθηκε με ανάλυση 48 δειγμάτων γνωστού γονότυπου και 15 άγνωστου γονότυπου. Όλα τα δείγματα αυτά είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί για όλες τις μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο kit της εταιρείας ViennaLab Diagnostics, CVD StripAssay. Η αρχή της δοκιμασίας του συγκεκριμένου kit περιλαμβάνει μία πολλαπλή αντίδραση PCR, ακολουθούμενη από υβριδοποίηση (reverse dotblot) των βιοτινυλιωμένων προϊόντων PCR με αλληλο-ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι είναι ακινητοποιημένοι υπό μορφή ζωνών σε ταινία τύπου ξηρών αντιδραστηρίων. Η ανίχνευση των υβριδίων πραγματοποιείται μέσω προσθήκης συζεύγματος στρεπταβιδίνης με αλκαλική φωσφατάση και επακόλουθη ενζυμική αποφωσφορυλίωση χρωμοφόρου υποστρώματος. Το σύστημα αυτό δεν στηρίζεται στη διαδικασία της συνεχούς ροής και περιλαμβάνει πολλαπλά στάδια επωάσεων και εκπλύσεων, γεγονός που το καθιστά ιδιαίτερα χρονοβόρο. Τα αποτελέσματα γονοτύπησης της προτεινόμενης μεθόδου έρχονται σε πλήρη συμφωνία με αυτά που προέκυψαν από το kit για όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν και παρουσιάζονται στο σχήμα 5.4. Το σύμβολο Ν/Ν αναφέρεται σε φυσιολογικό δείγμα, το σύμβολο Μ/Ν σε ετερόζυγο ή διπλά ετερόζυγο δείγμα και το σύμβολο Μ/Μ αναφέρεται σε ομόζυγα μεταλλαγμένο δείγμα. 144

Σχήμα 5.4. Αποτελέσματα γονοτύπησης δειγμάτων γενωμικού DNA. Η θέση κάθε ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ειδικού για κάθε μετάλλαξη, παρουσιάζεται στο σκίτσο στην κάτω πλευρά της εικόνας. Οι κηλίδες στην αριστερή πλευρά της μεμβράνης αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα. Οι κηλίδες στη δεξιά πλευρά της μεμβράνης αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Η μονή κηλίδα στο πάνω μέρος της μεμβράνης αντιστοιχεί στην κηλίδα ελέγχου, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας. Ο γονότυπος προσδιορίζεται από το χρώμα του κάθε ζεύγους κηλίδων. Για οποιαδήποτε μετάλλαξη, ένα δείγμα φυσιολογικό θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ ένα ομόζυγα μεταλλαγμένο δείγμα θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα του ζεύγους. Και οι δύο κηλίδες θα εμφανίσουν κόκκινο χρώμα αν πρόκειται για ετερόζυγο δείγμα για τη συγκεκριμένη πολυμορφική περιοχή. 5.4. Συμπεράσματα Η μέθοδος που αναπτύχθηκε στο παρόν κεφάλαιο περιλαμβάνει τα εξής τρία στάδια: μία πολλαπλή αντίδραση PCR, μία πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και μία ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. Η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων επιτρέπει τη γρήγορη οπτική ανίχνευση, διά 145

γυμνού οφθαλμού, εντός 15 min, χωρίς την ανάγκη χρήσης εξειδικευμένου, ακριβού εξοπλισμού και ειδικά εκπαιδευμένου προσωπικού. Ο συνολικός χρόνος για την εμφάνιση ενός γονοτυπικού αποτελέσματος, μετά την πραγματοποίηση των τριών σταδίων της μεθόδου, διαρκεί, περίπου, μόνο 3 h. Πρόκειται για ένα διαγνωστικό εργαλείο, το οποίο χαρακτηρίζεται από ακρίβεια, ειδικότητα, επαναληψιμότητα και ευαισθησία, με επιπρόσθετα πλεονεκτήματα την απλότητα, την ταχύτητα και το χαμηλό κόστος, και ως εκ τούτου πληροί όλα τα απαραίτητα χαρακτηριστικά προκειμένου να ενταχθεί στη ρουτίνα ενός σύγχρονου εργαστηρίου μοριακής διαγνωστικής. 146

Πίνακας 5.1. Εκκινητές πολλαπλής αντίδρασης PCR που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Μετάλλαξη Όνομα εκκινητή Αλληλουχία (5 3 ) Μήκος PCR προϊόντος (bp) FV H1299R FVH1299R-F- NEW (forward) FVH1299R-R (reverse) CAGCCAGGTGACCCTCTCT TGTCATCTGGTCGAGGTCTG 661 MTHFR A1298C MTHFRA1298 C-F (forward) MTHFRA1298 C-R (reverse) CCTCCAGACCAAAGAGTTACAT CACTCCAGCATCACTCACTT 453 FXIIIA1 V34L F13A1-F (forward) F13A1-R (reverse) ATGTGTTGCTCAAGTGCTATCA TGAGAGGCAGAAAGACAAAGC 532 PAI-1 4G/5G PAI1-F (forward) PAI1-R (reverse) TCAGCCAGACAAGGTTGTTG CAGGTCACTGTGGAGTTATCAA 331 147

Πίνακας 5.2. Εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Αλληλο-ειδικοί εκκινητές της αντίδρασης ΡΕΧΤ *Ολιγονουκλεοτίδιο Όνομα Αλληλουχία (5 3 ) Φυσιολογικός εκκινητής για FVH1299R N(LUA65) CTTTTCATCAATAATCTTACCTTTCCCATT TCTCCAGACCTCAGCCA Μεταλλαγμένος εκκινητής για FVH1299R M(LUA85) ATACTACATCATAATCAAACATCACCCAT TTCTCCAGACCTCAGCCG Φυσιολογικός εκκινητής για MTHFRA1298C MTHFRA1298 C-N(LUA 77) CAATTAACTACATACAATACATACGGGAG GAGCTGACCAGTGAAGA Μεταλλαγμένος εκκινητής για MTHFRA1298C MTHFRA1298 C-M(LUA 83) ATACAATCTAACTTCACTATTACAGGGAG GAGCTGACCAGTGAAGC Φυσιολογικός εκκινητής για FXIIIA1 N(LUA37) CTTTTCATCTTTTCATCTTTCAATCACAGT GGAGCTTCAGGGCG Μεταλλαγμένος εκκινητής για FXIIIA1 M(LUA94) CTTTCTATCTTTCTACTCAATAATCACAG TGGAGCTTCAGGGCT Φυσιολογικός εκκινητής για PAI-1 Μεταλλαγμένος εκκινητής για PAI-1 FVH1299R- FVH1299R- F13A1- F13A1- PAI1- N(LUA10) PAI1- M(LUA28) ATCATACATACATACAAATCTACAGAGAG TCTGGACACGTGGGGG CTACAAACAAACAAACATTATCAAGAGAG TCTGGACACGTGGGGA Ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές (anti-tags) Ολιγονουκλεοτίδιο Όνομα Αλληλουχία (5 3 ) LUA 65 anti-800 ΝΗ 2 -AAAGGTAAGATTATTGATGAAAAG LUA 85 IC-M ΝΗ 2 -TGATGTTTGATTATGATGTAGTAT LUA 77 LUA 77 ΝΗ 2 -GTATGTATTGTATGTAGTTAATTG LUA 83 IC-N ΝΗ 2 -TGTAATAGTGAAGTTAGATTGTAT LUA 37 LUA 37 ΝΗ 2 -ATTGAAAGATGAAAAGATGAAAAG 148

LUA94 anti-adana M ΝΗ 2 -ATTATTGAGTAGAAAGATAGAAAG LUA10 anti-c01 ΝΗ 2 -TGTAGATTTGTATGTATGTATGAT LUA28 anti-b01 ΝΗ 2 -TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG * Στον παραπάνω πίνακα η χαρακτηριστική αλληλουχία αναγνώρισης (tag) καθενός εκκινητή της ΡΕΧΤ είναι με μπλε χρώμα, ενώ με έντονη μαύρη γραφή σημειώνεται η αλληλο-ειδική περιοχή των γονοτυπικών εκκινητών. 149

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΜΕΡΟΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΕΞΟΝΙΟΥ 13 ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ FACTOR V (Gene Bank Accession Number NG_ 011806.1) A>G (Position 50422) rs1800595 ATGCCCATTTCTCCAGACCTCAGCC[A/G]TACAACCCTTTCTCTAGACTTCAGC 50041 gccagacaaa cctctctcca gacctcagcc acacgactct ctctccagaa ctcattcaga 50101 gaaacctttc cccagccctc ggtcagatgc ccatttctcc agacctcagc catacaaccc 50161 tttctccaga cctcagccat acaacccttt ctttagacct cagccagaca aacctctctc 50221 cagaactcag tcagacaaac ctttctccag ccctcggtca gatgcccctt tctccagacc 50281 tcagccatac aaccctttct ctagacttca gccagacaaa cctctctcca gaactcagcc 50341 atatgactct ctctccagaa ctcagtcaga caaacctttc cccagccctc ggtcagatgc 50401 ccatttctcc agacctcagc catacaaccc tttctctaga cttcagccag acaaacctct 50461 ctccagaact cagtcaaaca aacctttccc cagccctcgg tcagatgccc ctttctccag 50521 accccagcca tacaaccctt tctctagacc tcagccagac aaacctctct ccagaactca 50581 gtcagacaaa cctttcccca gacctcagtg agatgcccct ctttgcagat ctcagtcaaa 50641 ttccccttac cccagacctc gaccagatga cactttctcc agaccttggt gagacagatc 50701 tttccccaaa ctttggtcag atgtcccttt ccccagacct cagccaggtg actctctctc 50761 cagacatcag tgacaccacc cttctcccgg atctcagcca gatatcacct cctccagacc 150

ΜΕΡΟΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ FACTOR XIII (Gene Bank Accession Number NG_008107.1) G>T (Position 7130) rs5985 CCTGCCCACAGTGGAGCTTCAGGGC[G/T]TGGTGCCCCGGGGCGTCAACCTGCA 6781 tgttttgaca catacaaaaa tctccccaag atccttgggg aactgtattc catcattaga 6841 ctaatccttg ctgccacttc tcagttttta tttatgcaaa cggcaaaatg tgttgctcaa 6901 gtgctatcac acacagatat atctgtttct ctattttgga atccttgtct caaatgttac 6961 tcactttaca tgccttttct gttgtcttct tttttttttt tttctgaagg accttgtaaa 7021 gtcaaaaatg tcagaaactt ccaggaccgc ctttggaggc agaagagcag ttccacccaa 7081 taactctaat gcagcggaag atgacctgcc cacagtggag cttcagggcg tggtgccccg 7141 gggcgtcaac ctgcaaggta tgagcatacc ccccttcccc accactctgg gtccaggcac 7201 agccgggccc tggcccctct tccctgcagg taaacatcct ctgtctccac tggggttccc 7261 acaaaaggaa gccccctgcc aatctctggt tttataaagg aagaaagcaa aagctttctt 7321 ttaagtggtg aaagcaccga agacccagag ccttgtccca gttctgcccc ttactgacct 7381 tgtaacctca gagaagttgc tttgtctttc tgcctctcaa ctatttcctc tacaaaacca 7441 gagtgctgga ttagctaggg cctcttccag ccctactgct caatgcttta gagaattttc 7501 tctagctgga atattccact tccaaaatat tgtggctgtt ttgattgtct ggcttgcacc 151

ΜΕΡΟΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ MTHFR (Gene Bank Accession Number NG_013351.1) A>C (Position 16685) rs1801131 TGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAG[A/C]AAGTGTCTTTGAAGTCTTCGTTCTT 16321 caaagagtta catctaccgt acccaggagt gggacgagtt ccctaacggc cgctggtgag 16381 ggcctgcaga ccttccttgc aaatacatct ttgttcttgg gagcgggagg gcagaagaag 16441 tttgcatgct tgtggttgac ctgggaggag tcaggggcag aatttacagg aatggcctcc 16501 tgggcatgtg gtggcactgc cctctgtcag gagtgtgccc tgacctctgg gcacccctct 16561 gccaggggca attcctcttc ccctgccttt ggggagctga aggactacta cctcttctac 16621 ctgaagagca agtcccccaa ggaggagctg ctgaagatgt ggggggagga gctgaccagt 16681 gaagaaagtg tctttgaagt cttcgttctt tacctctcgg gagaaccaaa ccggaatggt 16741 cacaaagtga gtgatgctgg agtggggacc ctggttcatc ccctgcccct ggcctgaccc 16801 cagctgcagg ccaggctgcg gggctgtgac ttccccatcc tgtgccctcc cctccatgct 16861 gtggacatgg caaagggaga agggtaagtt gggagacctc cacctggaag ggcttaggga 16921 ggcaaagaca ggctgggtct ttgttggggg ccgtgagagg gactcagggt gccaaacctg 16981 atggtcgccc cagccagctc accgtctctc ccaggtgact tgcctgccct ggaacgatga 17041 gcccctggcg gctgagacca gcctgctgaa ggaggagctg ctgcgggtga accgccaggg 152

ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΟΥ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ PAI-1 (Gene Bank Accession Number NG_013213.1) 4G/5G (Position 4332-4333) rs1799889 ACAGAGAGAGTCTGGACACGTGGGG[A/G]GTCAGCCGTGTATCATCGGAGGCGG 3901 atcatcccga aaccatccca ccctggtctg tgaaaaaatt gtcttccatg aaaccagtcc 3961 ctggtgccaa aaacgttgag gaccactgct ccacagaatc tatcggtcac tcttcctccc 4021 ctcaccccct tgccctaaaa gcacaccctg caaacctgcc atgaattgac actctgtttc 4081 tatccctttt ccccttgtgt ctgtgtctgg aggaagagga taaaggacaa gctgccccaa 4141 gtcctagcgg gcagctcgaa gaagtgaaac ttacacgttg gtctcctgtt tccttaccaa 4201 gcttttacca tggtaacccc tggtcccgtt cagccaccac caccccaccc agcacacctc 4261 caacctcagc cagacaaggt tgttgacaca agagagccct caggggcaca gagagagtct 4321 ggacacgtgg ggagtcagcc gtgtatcatc ggaggcggcc gggcacatgg cagggatgag 4381 ggaaagacca agagtcctct gttgggccca agtcctagac agacaaaacc tagacaatca 4441 cgtggctggc tgcatgccct gtggctgttg ggctgggccc aggaggaggg aggggcgctc 4501 tttcctggag gtggtccaga gcaccgggtg gacagccctg ggggaaaact tccacgtttt 4561 gatggaggtt atctttgata actccacagt gacctggttc gccaaaggaa aagcaggcaa 153

Κεφάλαιο 6 Δοκιμασία πολλαπλής γονοτύπησης με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων μεταλλάξεων που σχετίζονται με τη νόσο του Wilson 6.1. Εισαγωγή Η ηπατοφακοειδής εκφύλιση ή νόσος του Wilson (WND-ATP7B) είναι μία διαταραχή που αφορά το μη φυσιολογικό μεταβολισμό του χαλκού και συνδέεται με σταδιακή νόσο του ήπατος. Η νόσος του Wilson είναι μία κληρονομική γενετική διαταραχή, η οποία κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο. Η νόσος χαρακτηρίζεται από μειωμένη ενσωμάτωση του χαλκού στο ένζυμο σερουλοπλασμίνη και μειωμένη απέκκριση του μετάλλου στη χολή. Η συσσώρευση του χαλκού εμφανίζεται κυρίως στον ηπατικό ιστό και στον εγκέφαλο, προκαλώντας σταδιακή βλάβη στα όργανα αυτά. Η νόσος του Wilson περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1912. Εμφανίζεται με επιπολασμό περίπου 1:30.000, με συχνότητα εμφάνισης γονιδίων 0,56% και συχνότητα φορέων 1 στους 90, ο οποίος είναι παρόμοιος μεταξύ πολλών εθνικών πληθυσμών [72]. Το γονίδιο ATP7B (ATP7B; ΜΙΜ#277900), υπεύθυνο για τη νόσο του Wilson, κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη, αδεσινοτριφωσφατάση τύπου P, η οποία είναι η κύρια ρυθμιστική πρωτεΐνη της ομοιόστασης του χαλκού. Αλλαγές στη δομή και τη λειτουργία της πρωτεΐνης, οι οποίες συνοδεύονται με συσσώρευση του χαλκού στο ήπαρ, είναι αποτέλεσμα διαφόρων μεταλλάξεων στο γονίδιο ATP7B που προκαλούν αλλαγές στην αλληλουχία των αμινοξέων της πρωτεΐνης. Πολυάριθμες μελέτες της νόσου του Wilson έχουν αποκαλύψει ότι το φάσμα των μεταλλάξεων, που εμφανίζονται στο γονίδιο ATP7B, εξαρτάται από τον κάθε πληθυσμό [73]. 154

Η διάγνωση της νόσου του Wilson βασίζεται στην αξιολόγηση των συμπτωμάτων και των βιοχημικών αναλύσεων. Ωστόσο, στην περίπτωση ασυμπτωματικών ασθενών με ασαφείς βιοχημικούς δείκτες είναι δύσκολο να επιτευχθεί η διάγνωση της νόσου. Για το λόγο αυτό, ο γενετικός έλεγχος αποτελεί τη μέθοδο επιλογής για την ακριβή διάγνωση [74]. Γενετικές μελέτες είναι ιδιαίτερα σημαντικές για την επιβεβαίωση της διάγνωσης και την αναγνώριση επηρεασμένων μελών της οικογένειας, αλλά σε προσυμπτωματικό στάδιο. Αδελφοί και αδελφές ασθενών με νόσο του Wilson θα πρέπει να ελεγχθούν, καθώς έχουν 1 στις 4 πιθανότητες να έχουν, επίσης, τη νόσο. Γενετικός έλεγχος των παιδιών ασθενών, που έχουν μία στις 200 πιθανότητες να αναπτύξουν τη νόσο, γενικά δεν συνιστάται. Οι μοριακές, γενετικές μελέτες περιλαμβάνουν άμεση αλληλούχιση του γονιδίου ATP7B για ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με τη νόσο [75]. Ωστόσο, έχει αναπτυχθεί πληθώρα και άλλων μεθόδων που βασίζονται στην αντίδραση PCR, όπως η ανάλυση πολυμορφισμού μονόκλωνης αλυσίδας DNA (Single Strand Conformation Polymorphism-SSCP), η αλληλο-ειδική αντίδραση PCR (ARMS), η αποδιατακτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (dhplc), η μέθοδος BI-PASA (bidirectional PCR amplification of specific alleles), η ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMA) κ.α., για την ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου ATP7B [76-81]. Οι περισσότερες από αυτές τις μεθόδους, συνήθως, στοχεύουν μία συγκεκριμένη μετάλλαξη κάθε φορά, με αποτέλεσμα να είναι ιδιαίτερα χρονοβόρες ή απαιτούν τη χρήση εξειδικευμένου εξοπλισμού και επικίνδυνων χημικών ουσιών. Η τεχνολογική πρόοδος κατά τα τελευταία χρόνια έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη εξελιγμένων συστημάτων υψηλής απόδοσης (όπως οι μικροσυστοιχίες DNA), που επιτρέπουν των προσδιορισμό του γονότυπου εκατοντάδων χιλιάδων μεταλλάξεων/πολυμορφισμών ταυτόχρονα [82]. Ενώ τα συστήματα αυτά είναι απαραίτητα για την διεξαγωγή μελετών συσχετισμού μεγάλης κλίμακας, τελικά, σε εργαστήρια ρουτίνας μοριακής διάγνωσης έχει νόημα η ανάλυση μόνο μερικών μεταλλάξεων ανά ασθενή. Κατά συνέπεια, η ανάπτυξη βιοαισθητήρων ανάλυσης DNA κερδίζει ολοένα και περισσότερο έδαφος. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, οι ταινίες τύπου ξηρών αντιδραστηρίων υπό τη μορφή δοκιμασιών πλάγιας ροής, έχουν αναπτυχθεί 155

για την γονοτύπηση σημειακών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs). Το βασικό πλεονέκτημα αυτών των βιοαισθητήρων είναι ότι επιτρέπουν οπτική ανίχνευση του αναλύτη μέσα σε λίγα λεπτά χωρίς τη χρήση ειδικών οργάνων. Επιπλέον, είναι μιας χρήσεως και η μορφή τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων εξαλείφει την ανάγκη πρόσθετων σταδίων προσθήκης αντιδραστηρίων, επωάσεων και εκπλύσεων, επειδή τα αντιδραστήρια αποτελούν αναπόσπαστο τμήμα του αισθητήρα. Η υβριδοποίηση με αλληλοειδικά ολιγονουκλεοτίδια, η αντίδραση επέκτασης εκκινητή και η αντίδραση λιγάσης έχουν χρησιμοποιηθεί για την γονοτύπηση διαφόρων αλληλόμορφων, σε συνδυασμό με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων [19, 21, 16]. Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφεται η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και αξιολόγηση μίας απλής, σύντομης, αξιόπιστης και χαμηλού κόστους πολλαπλής μοριακής δοκιμασίας πλάγιας ροής, η οποία αποκλείει την ανάγκη χρήσης εξειδικευμένων οργάνων, καθώς και ειδικά εκπαιδευμένου τεχνικού προσωπικού. Η δοκιμασία αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε στην ανίχνευση των 10 συχνότερα εμφανιζόμενων μεταλλάξεων στο γονίδιο ATP7B, που αντιπροσωπεύουν περίπου το 80% των αλληλόμορφων που προκαλούν τη νόσο στον ελληνικό πληθυσμό. Οι μεταλλάξεις που αναλύθηκαν είναι οι εξής: p.his1069gln (c.3207c>a), p.arg969gln (c.2906g>a), p.leu936x (c.2807t>a), p.gln289x (c.865c>t), c.2530dela, p.ter1466arg (c.4396t>c), c.845delt, c.2299insc, p.ile1148thr (c.3443t>c) και c.1708-1g>a [εργασία υπό δημοσίευση]. Στο κεφάλαιο αυτό, περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου γονοτυπικού προσδιορισμού των 5 πιο σπάνια εμφανιζόμενων μεταλλάξεων στο γονίδιο ATP7B, οι οποίες είναι οι: p.ter1466arg (c.4396t>c), c.845delt, c.2299insc, p.ile1148thr (c.3443t>c) και c.1708-1g>a. 6.2. Οργανολογία & Μέθοδοι 6.2.1. Οργανολογία Η οργανολογία περιγράφεται στο κεφάλαιο 2 (2.2.1). 156

6.2.2. Κλινικά δείγματα Δείγματα γενωμικού DNA υγειών ατόμων και ασθενών παραχωρήθηκαν από το Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών με έδρα το Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο στο Νοσοκομείο Παίδων Αγία Σοφία. Η απομόνωση γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε από περιφερικό αίμα με το αυτοματοποιημένο ρομποτικό σύστημα Biorobot M48 Workstation (Qiagen, Hilden, Germany) και το εμπορικά διαθέσιμο kit MagAttract DNA Blood midi M48 Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που συνιστά ο κατασκευαστής. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο ATP7B χαρακτηρίστηκαν με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή με βαθμίδωση αποδιατακτικών παραγόντων (DGGE) και όλα τα θετικά δείγματα επιβεβαιώθηκαν με άμεση αλληλούχιση στο αυτόματο όργανο ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, USA). 6.2.3. Σχεδίαση εκκινητών Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ως εκκινητές στην πολλαπλή αντίδραση PCR και στην πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή, καθώς και οι ανιχνευτές στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, σχεδιάστηκαν in silico με τα λογισμικά προγράμματα PrimerPremier5 και PrimerPlex2 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA). Τα ολιγονουκλεοτίδια συντέθηκαν από την εταιρεία VBC Genomics (Wien, Austria) και παρουσιάζονται στους πίνακες 6.1 και 6.2. στο τέλος του κεφαλαίου. 6.2.4. Γονοτύπηση 5 μεταλλάξεων στο γονίδιο ATP7B Η γονοτυπική δοκιμασία περιλαμβάνει τα εξής στάδια: (i) Μία πολλαπλή αντίδραση PCR για την ενίσχυση των τμημάτων του γονιδίου ATP7B (Gene Bank Accession Number NM_000053.3), που περιλαμβάνουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, (ii) μία δεκαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή με στόχο το μη καθαρισμένο προϊόν της πολλαπλής αντίδρασης PCR, παρουσία αλληλο-ειδικών εκκινητών (δύο εκκινητές για κάθε μετάλλαξη, ένας για κάθε αλληλόμορφο) και τροποποιημένων νουκλεοτιδίων biotin-dutps και (iii) 157

οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εκκινητή με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης. 6.2.5. Πολλαπλή ενίσχυση με αντίδραση PCR τμημάτων του γονιδίου ATP7B Η πολλαπλή αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl, που περιείχε 1x Qiagen Multiplex PCR Master Mix (Hilden, Germany), το οποίο περιλαμβάνει βελτιστοποιημένες συγκεντρώσεις πολυμεράσης HotStarTaq DNA Polymerase, MgCl 2 (6 mm), dntps και ρυθμιστικό διάλυμα PCR, ειδικά σχεδιασμένο για πολλαπλή αντίδραση PCR, 1x Q Buffer, 2 μm από κάθε έναν από τους εκκινητές (Πίν. 6.1) και 2 μl γενωμικού DNA. Οι συνθήκες του προγράμματος της αντίδρασης PCR είναι οι εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 15 min, ακολουθούμενη από 36 κύκλους στους 94 o C για 45 s, 55 o C για 90 s, 72 o C για 60 s. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 8 min. Η ενίσχυση με αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε στον θερμικό κυκλοποιητή TC-512 της εταιρείας Techne Inc (Burlington, NJ). 6.2.6. Πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή Η δεκαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκε σε μίγμα αντίδρασης όγκου 20 μl, που περιείχε 20 mm Tris-HCl, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 10 mm KCl, 0,1 % Triton X-100 ph 8,8, 1 U Vent(exo-) DNA polymerase, 0,4 μl προϊόντος PCR, 5 pmol από κάθε έναν από τους αλληλο-ειδικούς εκκινητές (Πίν. 6.2), 4 mm MgSO 4 και 10 μm από καθένα από τα datp, dctp, dgtp, 5 μm dttp και 5 μm biotin-dutp. Το πρόγραμμα της πολλαπλής αντίδρασης PEXT ήταν το εξής: αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 5 min, ακολουθούμενη από 10 κύκλους στους 95 o C για 15 s, 65 o C για 15 s, 72 o C για 15 s. Όλα τα προϊόντα επέκτασης εκκινητή υποβλήθηκαν σε ένα τελικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 10 min και τοποθετήθηκαν αμέσως στον πάγο, πριν ακολουθήσει η ανάλυση στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Οι αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκαν στους θερμικούς κυκλοποιητές MiniCycler PTC-0150 (MJ Research) και TaKaRa (Sanyo E&E Europe BV). 158

6.2.7. Κατασκευή ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων Η πολλαπλή ταινία ξηρών αντιδραστηρίων (4mm x 70mm) αποτελείται από το χάρτη εμβάπτισης, το χάρτη εναπόθεσης (υαλοβάμβακας) των νανοσφαιριδίων χρυσού και του δείγματος, το χάρτη απορρόφησης και τη διαγνωστική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Κάθε ένα τμήμα της ταινίας, τοποθετείται πάνω σε αυτοκόλλητο πλαστικό στήριγμα, από το οποίο και συγκρατείται, όπως περιγράφηκε στο κεφάλαιο 2 (2.2.3). 6.2.8. Σύζευξη NH 2 -ολιγονουκλεοτιδίων με σφαιρίδια πολυστυρενίου που φέρουν στην επιφάνεια τους ομάδες -COOH Για τη σύζευξη ολιγονουκλεοτιδίων με σφαιρίδια πολυστυρενίου, χρησιμοποιήθηκαν άχρωμα σφαιρίδια πολυστυρενίου, διαμέτρου 2 μm (Polysciences), που φέρουν καρβοξυλομάδες στην επιφάνειά τους. Το πρωτόκολλο σύζευξης περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο 2 (2.2.3). 6.2.9. Σήμανση των ολιγονουκλεοτιδίων ακινητοποιημένων στην επιφάνεια των σφαιριδίων πολυστυρενίου με βιοτίνη Για την κατασκευή της ζώνης ελέγχου χρησιμοποιούνται σφαιρίδια πολυστυρενίου συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια (τυχαία αλληλουχία), μετά από επέκταση των ολιγονουκλεοτιδίων παρουσία biotin-dutps. Το πρωτόκολλο περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο 2 (2.2.3). 6.2.10. Σύζευξη νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα έναντι βιοτίνης Η σύζευξη των νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα έναντι βιοτίνης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο κεφάλαιο 2 με τη διαφορά ότι η τελική ανασύσταση γίνεται σε 50 μl διαλύματος (BSA 1 g/l σε διάλυμα βόρακα 2 mm που περιέχει 1 g/l NaN 3 ) (2.2.3). 159

6.2.11. Οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων 3 μl από το αποδιατεταγμένο προϊόν επέκτασης αναμείχθηκε με διάλυμα ανάπτυξης (2x SSC, ph 7,0, 250 ml/l φορμαμίδιο, 30 g/l BSA, 20 ml/l γλυκερόλη, 5 ml/l Tween-20 και 5 g/l SDS) ίσου όγκου. Το μείγμα αποτέθηκε στο πάνω μέρος του χάρτη απόθεσης, πάνω από το σημείο που είχαν αποτεθεί τα νανοσφαιρίδια χρυσού. Στη συνέχεια, ο χάρτης εμβάπτισης της ταινίας (κάτω μέρος) τοποθετείται σε ένα σωληνάριο που περιέχει 300 μl διαλύματος ανάπτυξης, το οποίο ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας. Η οπτική ανίχνευση πραγματοποιείται και ολοκληρώνεται μέσα σε 15 min. 6.2.12. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Όπως έχει αναφερθεί και σε προηγούμενα κεφάλαια, η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων διαμορφώθηκε κατά τέτοιο τρόπο ώστε οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα πέντε φυσιολογικά αλλήλια να βρίσκονται στην αριστερή πλευρά της μεμβράνης, ενώ οι ακινητοποιημένοι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα πέντε μεταλλαγμένα αλλήλια να βρίσκονται στη δεξιά πλευρά της μεμβράνης. Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν σαν ανιχνευτές στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται στον πίνακα 6.2. Ο γονότυπος για κάθε μετάλλαξη προσδιορίζεται από το χρώμα του κάθε ζεύγους κηλίδων. Για οποιαδήποτε μετάλλαξη, ένα δείγμα φυσιολογικό θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ ένα ομόζυγα μεταλλαγμένο δείγμα θα εμφανίσει κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα του ζεύγους. Και οι δύο κηλίδες θα εμφανίσουν κόκκινο χρώμα αν πρόκειται για ετερόζυγο δείγμα για τη συγκεκριμένη πολυμορφική περιοχή. 160

6.3. Αποτελέσματα και Συζήτηση 6.3.1. Αρχή της δοκιμασίας Για την οπτική ανίχνευση των 5 μεταλλάξεων του γονιδίου ATP7B (10 αλλήλια) τα τμήματα γενωμικού DNA που περιλαμβάνουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, αρχικά, ενισχύθηκαν με μία πολλαπλή (5απλή) αντίδραση PCR. Από την αντίδραση PCR προέκυψαν τμήματα που περιέχουν τις 5 πιο σπάνιες μεταλλάξεις του γονιδίου ATP7B (p.ter1466arg (c.4396 T>C), c.845delt, c.2299insc, p.ile1148thr (c.3443t>c) και c.1708-1g>a), οι οποίες εμφανίζονται με συχνότητα 11% στον ελληνικό πληθυσμό [71]. Εν συνεχεία, τα προϊόντα της πολλαπλής αντίδρασης PCR υποβλήθηκαν σε μία πολλαπλή (10απλή) αντίδραση επέκτασης εκκινητή και τα προϊόντα της αντίδρασης αυτής αναλύθηκαν σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης (10 αλλήλια). Στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή χρησιμοποιήθηκαν δύο αλληλο-ειδικοί εκκινητές για κάθε μετάλλαξη, ένας συμπληρωματικός στο φυσιολογικό αλληλόμορφο και ένας συμπληρωματικός στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. Κάθε αλληλο-ειδικός εκκινητής υβριδοποιείται με την αλληλουχία στόχο παρακείμενα στη μετάλλαξη και έχει στο 3 άκρο του ένα νουκλεοτίδιο συμπληρωματικό στη βάση του πολυμορφισμού. Η διάκριση των γονότυπων βασίζεται στην ικανότητα της DNA πολυμεράσης να ενσωματώνει νουκλεοτίδια με υψηλή ακρίβεια, εξαιτίας της έλλειψης επιδιορθωτικής δράσης (5 >3 και 3 >5 δράση εξωνουκλεάσης). Επεκτείνονται μόνο οι εκκινητές με απόλυτη συμπληρωματικότητα στο 3 άκρο τους. Κατά την επέκταση του εκκινητή, στο προϊόν ενσωματώνονται μόρια βιοτίνης, μέσω της χρήσης επισημασμένων biotin-dutps μαζί με τα dntps. Όλοι οι αλληλο-ειδικοί εκκινητές έχουν στο 5 άκρο τους μία μοναδική αλληλουχία (tag), που επιτρέπει τη μετέπειτα ακινητοποίηση τους στην αντίστοιχη κηλίδα δοκιμασίας της ταινίας, μέσω υβριδοποίησης με συμπληρωματικά ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια (anti-tags). Το προϊόν επέκτασης αποτίθεται στην ταινία, της οποίας το κάτω άκρο, στη συνέχεια, εμβαπτίζεται στο κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης. Καθώς το διάλυμα ανέρχεται κατά μήκος της ταινίας τα προϊόντα επέκτασης δεσμεύονται στις κατάλληλες κηλίδες δοκιμασίας από ακινητοποιημένα, συμπληρωματικά 161

ολιγονουκλεοτίδια και ανιχνεύονται με νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Τα νανοσφαιρίδια χρυσού προσδένονται μόνο στα επεκταμένα προϊόντα μέσω αλληλεπίδρασης βιοτίνης/αντι-βιοτίνης και τα υβρίδια σχηματίζουν χαρακτηριστικές κόκκινες κηλίδες, υποδηλώνοντας την παρουσία του αντίστοιχου αλληλίου στο δείγμα. Η περίσσεια των νανοσφαιριδίων χρυσού ακινητοποιείται στη ζώνη ελέγχου της ταινίας σχηματίζοντας άλλη μία κόκκινη κηλίδα, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία του συστήματος. 6.3.2. Μελέτες βελτιστοποίησης αντίδρασης PEXT Πραγματοποιήθηκαν μελέτες βελτιστοποίησης των παραμέτρων που επηρεάζουν την απόδοση και την ειδικότητα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, όπως η θερμοκρασία υβριδοποίησης των αλληλο-ειδικών εκκινητών, η συγκέντρωση των αλληλο-ειδικών εκκινητών και η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+. Επίδραση της θερμοκρασίας υβριδοποίησης Η θερμοκρασία υβριδοποίησης των αλληλο-ειδικών εκκινητών καθορίζει την αυστηρότητα στην υβριδοποίηση του εκκινητή, και επομένως αποτελεί σημαντικό παράγοντα της ειδικότητας της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή. Πραγματοποιήθηκε μελέτη θερμοκρασίας στην περιοχή 55-68 ο C, σε δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη c.1708-1g>a και φυσιολογικό για τις υπόλοιπες τέσσερεις μεταλλάξεις. Από τα αποτελέσματα της μελέτης φαίνεται ότι η ειδικότητα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή (απουσία μη ειδικών σημάτων) δεν επηρεάζεται από τη θερμοκρασία υβριδοποίησης στην περιοχή που μελετήθηκε, ενώ η απόδοση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή (ένταση κηλίδων) αυξάνεται ελαφρώς με την αύξηση της θερμοκρασίας μέχρι τους 60 ο C και παραμένει πρακτικά σταθερή με περαιτέρω αύξηση μέχρι τους 68 ο C. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η θερμοκρασία των 65 ο C (Σχ. 6.1 (Α)). 162

Επίδραση συγκέντρωσης αλληλο-ειδικών εκκινητών Η μελέτη βελτιστοποίησης της ποσότητας των αλληλο-ειδικών εκκινητών πραγματοποιήθηκε προκειμένου να επιτευχθεί η μέγιστη απόδοση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και να αποφευχθεί ο σχηματισμός μη ειδικών προϊόντων επέκτασης. Πραγματοποιήθηκε μία σειρά από αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή παρουσία ισομοριακών ποσοτήτων και των 10 εκκινητών στην περιοχή 1-10 pmol ανά αντίδραση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν, η ένταση των ειδικών σημάτων παραμένει σχεδόν σταθερή μέχρι τα 7,5 pmol, ενώ τα μη ειδικά σήματα μειώνονται μέχρι που εξαφανίζονται ολοκληρωτικά. Η μείωση των μη ειδικών σημάτων αποδίδεται στον συναγωνισμό μεταξύ των μη-ειδικά επεκταμένων εκκινητών και των μηεπεκταμένων, που είναι σε περίσσεια, για την υβριδοποίηση με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές. Η ποσότητα των 5 pmol για κάθε αλληλο-ειδικό εκκινητή (0,25 μm τελική συγκέντρωση) επιλέχθηκε ως βέλτιστη (Σχ. 6.1 (Β)). Επίδραση συγκέντρωσης ιόντων Mg 2+ Τα ιόντα μαγνησίου αποτελούν συμπαράγοντα της πολυμεράσης με αποτέλεσμα να επηρεάζουν την ενζυμική δραστικότητα. Χαμηλή συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου μειώνει την απόδοση της αντίδρασης, ενώ πολύ υψηλή συγκέντρωση προάγει τη μη ειδική επέκταση των αλληλο-ειδικών εκκινητών. Μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης των ιόντων μαγνησίου στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή στην περιοχή 2-4 mm, σε δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη c.1708-1g>a και φυσιολογικό για τις υπόλοιπες τέσσερεις μεταλλάξεις. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+, ενισχύεται και η ένταση των σημάτων. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η συγκέντρωση των 4 mm. Δεν χρησιμοποιήθηκε μεγαλύτερη συγκέντρωση Mg 2+, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί τυχόν μη ειδική επέκταση των αλληλο-ειδικών εκκινητών, που θα δυσκόλευε την ερμηνεία των αποτελεσμάτων (Σχ. 6.1 (Γ)). 163

Σχήμα 6.1. Μελέτες βελτιστοποίησης της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή στη δοκιμασία πολλαπλής γονοτύπησης. Επίδραση των εξής παραγόντων: (Α) θερμοκρασίας υβριδοποίησης των αλληλο-ειδικών εκκινητών στη 10-απλή αντίδραση PEXT, (Β) ποσότητας αλληλο-ειδικών εκκινητών, (Γ) συγκέντρωσης ιόντων Mg 2+. Οι τελικές συνθήκες είναι οι εξής: θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 65 ο C, συγκέντρωση αλληλο-ειδικών εκκινητών 5 pmol ο κάθε ένας, συγκέντρωση ιόντων Mg 2+ 4mM. Η θέση κάθε ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ειδικού για κάθε μετάλλαξη, παρουσιάζεται στην αριστερή πλευρά της εικόνας. 6.3.3. Μελέτες βελτιστοποίησης της οπτικής ανίχνευσης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων Ειδικότητα της μεθόδου Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι κάθε επεκταμένος εκκινητής υβριδοποιείται μόνο με το αντίστοιχο ακινητοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτή επάνω στη μεμβράνη και όχι με οποιονδήποτε άλλο ακινητοποιημένο ανιχνευτή, πραγματοποιήθηκαν τα εξής πειράματα: δύο δείγματα, ένα φυσιολογικό για όλες τις μεταλλάξεις (1) και ένα συνθετικό δείγμα που περιέχει όλες τις μεταλλάξεις (2), υποβλήθηκαν σε δύο αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία παρουσία εκκινητών συμπληρωματικών στα φυσιολογικά αλλήλια και μία παρουσία εκκινητών συμπληρωματικών στο μεταλλαγμένα αλλήλια. Το συνθετικό δείγμα παρασκευάστηκε αναμειγνύοντας ίσες ποσότητες προϊόντων PCR από δείγματα που περιείχαν τουλάχιστον μία από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Επομένως, το συνθετικό δείγμα αποτελεί ένα δείγμα ετερόζυγο για όλες τις μεταλλάξεις και ένα στόχο για όλους τους εκκινητές. Τα προϊόντα αναλύθηκαν σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και τα αποτελέσματα της μελέτης παρουσιάζονται στο σχήμα 6.2 (Α). Όπως φαίνεται, κόκκινες κηλίδες (θετικά σήματα) εμφανίζονται μόνο στις θέσεις που αντιστοιχούν στα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές για τα φυσιολογικά 164

αλληλόμορφα, είτε παρουσία του φυσιολογικού δείγματος είτε παρουσία του συνθετικού ετερόζυγου δείγματος. Κόκκινες κηλίδες στις θέσεις που αντιστοιχούν στα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα εμφανίστηκαν μόνο παρουσία του συνθετικού ετερόζυγου δείγματος. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν επιβεβαιώνουν την ειδικότητα της προτεινόμενης γονοτυπικής μεθόδου. Επαναληψιμότητα της μεθόδου Εξετάστηκε η συνολική επαναληψιμότητα της πολλαπλής δοκιμασίας γονοτύπησης (συμπεριλαμβανομένης της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων) και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο σχήμα 6.2 (Β). Τρία δείγματα με διαφορετικούς γονότυπους (ομόζυγο φυσιολογικό, ετερόζυγο για τη μετάλλαξη p.ter1466arg (c.4396 T>C) και ομόζυγο μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη c.1708-1g>a υποβλήθηκαν, το κάθε ένα, σε τρεις ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή και αναλύθηκαν εις τριπλούν με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν η επαναληψιμότητα της μεθόδου είναι πολύ ικανοποιητική. 165

Σχήμα 6.2. Ειδικότητα (Α) και επαναληψιμότητα (Β) της δοκιμασίας πολλαπλής γονοτύπησης. (Α) Για τη μελέτη ειδικότητας ένα δείγμα φυσιολογικό (1) και ένα συνθετικό ετερόζυγο δείγμα (2) υποβλήθηκαν σε δύο αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία παρουσία φυσιολογικών εκκινητών και μία παρουσία μεταλλαγμένων εκκινητών. Το συνθετικό δείγμα παρασκευάστηκε αναμειγνύοντας ίσες ποσότητες προϊόντων PCR από δείγματα που περιείχαν τουλάχιστον μία από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Επομένως, το συνθετικό δείγμα αποτελεί ένα δείγμα ετερόζυγο για όλες τις μεταλλάξεις και ένα στόχο για όλους τους εκκινητές. Οι φυσιολογικοί εκκινητές επεκτείνονται παρουσία και των δύο δειγμάτων, ενώ οι μεταλλαγμένοι εκκινητές επεκτείνονται και δίνουν σήμα μόνο παρουσία συνθετικού μεταλλαγμένου δείγματος. (Γ) Η συνολική επαναληψιμότητα της δοκιμασίας πολλαπλής γονοτύπησης συμπεριλαμβάνει την αντίδραση επέκτασης εκκινητή και την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τρία δείγματα, ένα φυσιολογικό για όλες τις μεταλλάξεις, ένα δείγμα ετερόζυγο για τη μετάλλαξη p.ter1466arg (c.4396 T>C) και ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο για τη μετάλλαξη c.1708-1g>a. Η πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και η ανίχνευση στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πραγματοποιήθηκε, επίσης, εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Η θέση κάθε ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ειδικού για κάθε μετάλλαξη, παρουσιάζεται στο σκίτσο στην αριστερή, πάνω πλευρά της εικόνας. 166

Αξιολόγηση της μεθόδου Η μέθοδος πολλαπλής γονοτύπησης που αναπτύχθηκε στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκε με την ανάλυση 26 δειγμάτων γνωστού γονότυπου και 20 μη χαρακτηρισμένων δειγμάτων. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων ήταν σε πλήρη συμφωνία με τα αποτελέσματα από μεθόδους αναφοράς. Χαρακτηριστικά παραδείγματα των γονοτυπικών αποτελεσμάτων, που καλύπτουν όλες τις μεταλλάξεις, παρουσιάζονται στο σχήμα 6.3, όπου το σύμβολο Ν/Ν αναφέρεται σε φυσιολογικό δείγμα, το σύμβολο Μ/Ν σε ετερόζυγο ή διπλά ετερόζυγο δείγμα και το σύμβολο Μ/Μ αναφέρεται σε ομόζυγα μεταλλαγμένο δείγμα. Για την εύκολη ερμηνεία των αποτελεσμάτων, τα σφαιρίδια πολυστυρενίου με τα ολιγονουκλεοτίδιαανιχνευτές διαμορφώθηκαν με τέτοιο τρόπο πάνω στη μεμβράνη, ώστε οι ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα είναι αποτεθειμένοι στην αριστερή πλευρά της μεμβράνης, ενώ οι ειδικοί ανιχνευτές για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα είναι αποτεθειμένοι στη δεξιά πλευρά της μεμβράνης. Ο γονότυπος για κάθε μετάλλαξη προσδιορίζεται παρατηρώντας κάθε ζεύγος κηλίδων. Για κάθε μετάλλαξη, σε ένα δείγμα φυσιολογικό θα εμφανιστεί κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ σε ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο θα εμφανιστεί κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα. Και οι δύο κηλίδες θα εμφανίσουν κόκκινο χρώμα στην περίπτωση ενός ετερόζυγου δείγματος για τη συγκεκριμένη μετάλλαξη. 167

Σχήμα 6.3. Αποτελέσματα γονοτύπησης μεταλλάξεων του γονιδίου ATP7B σε δείγματα γενωμικού DNA. Για την ανίχνευση των λιγότερο κοινών μεταλλάξεων του γονιδίου ATP7B είναι απαραίτητη μία 5απλή αντίδραση PCR, μία 10απλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και μία ταινία ξηρών αντιδραστηρίων πολλαπλής ανίχνευσης (5 μεταλλάξεις, 10 αλλήλια). Η θέση κάθε ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, ειδικού για κάθε μετάλλαξη, παρουσιάζεται στο σκίτσο στην αριστερά πλευρά της εικόνας. Οι 5 κηλίδες αριστερά αντιστοιχούν στα φυσιολογικά αλληλόμορφα, ενώ οι 5 κηλίδες δεξιά αντιστοιχούν στα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Η μονή κηλίδα στο πάνω μέρος της ταινίας είναι η κηλίδα ελέγχου, που υποδεικνύει τη σωστή λειτουργία της ταινίας. Για κάθε μετάλλαξη, σε ένα δείγμα φυσιολογικό θα εμφανιστεί κόκκινο χρώμα μόνο στην αριστερή κηλίδα, ενώ σε ένα δείγμα ομόζυγα μεταλλαγμένο θα εμφανιστεί κόκκινο χρώμα μόνο στη δεξιά κηλίδα. Και οι δύο κηλίδες θα εμφανίσουν κόκκινο χρώμα στην περίπτωση ενός ετερόζυγου δείγματος για τη συγκεκριμένη μετάλλαξη. 6.4. Συμπεράσματα Έχει αναπτυχθεί ποικιλία μεθόδων για την ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου ATP7B. Οι πλειοψηφία των μεθόδων αυτών βασίζεται είτε στη χρήση ενζύμων (DNA πολυμεράσες, λιγάσες, νουκλεάσες) σε συνδυασμό με μία ποικιλία συστημάτων ανίχνευσης, είτε στην υβριδοποίηση με συμπληρωματικούς για τη μετάλλαξη ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές. Στο παρόν κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής, περιγράφεται η ανάπτυξη μίας δοκιμασίας για τη γονοτύπηση 5 μεταλλάξεων, που εντοπίζονται στον ελληνικό πληθυσμό, που εμφανίζονται στο σχετικό με τη νόσο Wilson γονίδιο ATP7B, με ταινία πλάγιας ροής, τύπου ξηρών αντιδραστηρίων. Η μέθοδος βασίζεται σε τρία απλά βήματα, τα οποία είναι τα εξής: (i) πολλαπλή ενίσχυση 168