Η ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΤΟ ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΟ ΣΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΩΟΘΥΛΑΚΙΚΗΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΤΩΝ ΩΟΘΗΚΩΝ

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Α ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ-ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ:ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Β.Κ.ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ Πανεπ. έτος 2010-2011 Αριθμός 2779 Η ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΤΟ ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΟ ΣΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΩΟΘΥΛΑΚΙΚΗΣ ΦΑΣΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΤΩΝ ΩΟΘΗΚΩΝ ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ ΜΑΙΕΥΤΗΡΑΣ-ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΠΟΝΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΖΕΒΕΛΕΚΗΣ ΦΙΛΙΠΠΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΡΟΥΣΣΟΣ ΔΑΥΙΔ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΠΟΝΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΖΕΒΕΛΕΚΗΣ ΦΙΛΙΠΠΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΡΟΥΣΣΟΣ ΔΑΥΙΔ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΗΛΙΑΡΑΣ ΔΗΜΟΣΘΕΝΗΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΟΛΥΜΠΙΑΝΑΚΗΣ ΕΥΣΤΡΑΤΙΟΣ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΟΥΛΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΕΠΙΚ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ

7 Στον πατέρα μου

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος. 11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13 Α. Εμβρυολογία.. 15 Το σύστημα των πόρων του θήλεος 15 Η μήτρα... 17 Β. Αγγείωση της μήτρας 17 Γ. Ιστολογία 18 Δομή του ενδομητρίου 18 Ιστολογία του ενδομητρίου σε ένα φυσιολογικό κύκλο 21 1. Παραγωγική ή ωοθυλακική φάση 23 2. Εκκριτική ή ωχρινική φάση. 25 3. Εμμηνορυσιακή φάση.. 26 Δ. Η ιστολογία του ενδομητρίου σε διεγερμένους κύκλους στο πλαίσιο της εξωσωματικής γονιμοποίησης... 27 Ε. Μηχανισμός δράσης των στεροειδών ορμονών 35 Ζ. Στεροειδείς υποδοχείς του ενδομητρίου 38 1. Η έκφραση των στεροειδών υποδοχέων του ενδομητρίου σε φυσιολογικό κύκλο 42 1α. Η έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων (ER) στο ενδομήτριο... 42 1β. Η έκφραση των υποδοχέων της προγεστερόνης (PR) στο ενδομήτριο... 44 Η. Παρακρινείς και αυτοκρινείς παράγοντες... 45 ΣΤ. Οι μεταβολές των ορμονικών υποδοχέων: αναπάντητα ερωτήματα... 46 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 49 Α. Σκοπός μελέτης... 51 Β. Υλικό και μέθοδοι... 52 Πληθυσμός ασθενών... 52 Κατανομή ασθενών... 53 Πρωτόκολλο διέγερσης... 53 Ορμονική εκτίμηση... 53 Υπερηχογραφική εκτίμηση... 54 Υποστήριξη ωχρινικής φάσης... 54 Ενδομήτρια βιοψία και ιστολογική εκτίμηση... 54

10 Ανοσοϊστοχημεία... 54 Μέτρα έκβασης... 55 Στατιστική ανάλυση... 55 Γ. Αποτελέσματα... 57 Δ. Συζήτηση... 61 Ε. Περίληψη... 63 Summary... 64 Βιβλιογραφία... 65

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Παρά την εξέλιξη των τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής το ποσοστό εμφύτευσης σε IVF κύκλους παραμένει χαμηλό σε σύγκριση με φυσιολογικούς (Macklon and Fauser, 2000). Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται είτε στην ποιότητα του εμβρύου που μεταφέρεται, είτε στην ενδομήτρια δεκτικότητα. Κατά τη διάρκεια της IVF θεραπείας, λόγω των υψηλών δόσεων διέγερσης με γοναδοτροπίνες, η ωοθήκη παράγει πολλαπλά ωοθυλάκια, οδηγώντας σε επίπεδα οιστραδιόλης και προγεστερόνης ορού πάνω από το φυσιολογικό. Αυτό πιθανόν ευθύνεται για τις ανωμαλίες του ενδομητρίου που έχουν περιγραφεί μετά από διέγερση ωοθηκών (Bourgain and Devroey, 2003).Οι περισσότερες μελέτες σε κύκλους διέγερσης αφορούν στην ωχρινική φάση. Μέχρι σήμερα υπάρχουν περιορισμένες διαθέσιμες πληροφορίες στη βιβλιογραφία σχετικά με τους ενδομήτριους ορμονικούς υποδοχείς στην ωοθυλακική φάση των ασθενών που υποβάλλονται σε διέγερση. Μια σειρά από ερωτήματα που αφορούν την ιστολογία του ενδομητρίου κατά την ωοθυλακική φάση παραμένουν αναπάντητα,όπως: Υπάρχουν διαφορές στην έκφραση των υποδοχέων των στεροειδών ορμονών στο στρώμα και στους αδένες του ενδομητρίου στη διάρκεια της ωοθυλακικής φάσης κατά τη διέγερση των ωοθηκών και σε ποια χρονική στιγμή αυτές εκδηλώνονται; H έκφραση των υποδοχέων των στεροειδών ορμονών συνδέεται με την έκθεση του ενδομητρίου στην οιστραδιόλη και στην προγεστερόνη στη διάρκεια της διέγερσης; Τα ερωτήματα αυτά αποτέλεσαν το αντικείμενο μελέτης της διατριβής αυτής και έγινε προσπάθεια να απαντηθούν κατά το δυνατό πληρέστερα. Θεωρώ υποχρέωσή μου να ευχαριστήσω θερμά τους καθηγητές κ.κ. Ιωάννη Μπόντη και Βασίλειο Ταρλατζή για την εμπιστοσύνη που έδειξαν στο πρόσωπο μου με την ανάθεση της διδακτορικής διατριβής, για την συμπαράσταση και το συνεχές ενδιαφέρον καθώς και για την πολύτιμη βοήθειά τους με τις επιστημονικές γνώσεις τους, που συνέβαλαν στην επιτυχή ολοκλήρωση της έρευνάς μου. Ευχαριστώ επίσης και τα δύο άλλα εκλεκτά μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, τους Καθηγητές κ. Φίλιππο Τζεβελέκη και

12 κ.δαυίδ Ρούσσο, για την υποστήριξη και τις συμβουλές τους σε όλη τη διάρκεια της διατριβής μου. Ένα πολύ μεγάλο και θερμό ευχαριστώ στον Επίκουρο Καθηγητή και φίλο, μέλος της επταμελούς επιτροπής, κ. Ευστράτιο Κολυμπιανάκη για την πολύτιμη βοήθεια με τις επιστημονικές του γνώσεις στο σχεδιασμό της μελέτης, στη συγγραφή της διατριβής, αλλά και για την ηθική υποστήριξή του όλο αυτό το διάστημα. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της επταμελούς επιτροπής, τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Δημήτριο Γουλή για τις καθοριστικές του παρατηρήσεις και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Δημοσθένη Μηλιαρά για τον πολύτιμο χρόνο που αφιέρωσε στην εκτίμηση των παθολογοανατομικών παρασκευασμάτων, συμβάλοντας με αυτόν τον τρόπο στην αρτιότητα και επιστημονική αξιοπιστία της μελέτης. Θα ήθελα ακόμη να επισημάνω την πολύτιμη βοήθεια του Επίκουρου Καθηγητή κ. Θεόδωρου Θεοδωρίδη στην ολοκλήρωση του κλινικού μέρους της διατριβής μου, κατά τη διάρκεια της απουσίας μου στο εξωτερικό για μετεκπαίδευση. Ευχαριστίες οφείλω επίσης, και στην τεχνολόγο εργαστηρίου του τμήματος Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής της Α Μ-Γ κ.αναστασία Τζαμτζόγλου για τη βοήθεια της στην ε- πιλογή των ασθενών. Κλείνοντας, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον πατέρα μου γιατρό Μαιευτήρα- Γυναικολόγο κ. Σπύρο Κύρου και να του αφιερώσω αυτή τη διατριβή.

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 15 Α. ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑ Το σύστημα των πόρων του θήλεος Κατά το αμετάπλαστο στάδιο της διαπλάσεως του γεννητικού συστήματος, τα έμβρυα και των δύο φύλων παρουσιάζουν δύο ζεύγη πόρων (μέχρι την 8η εβδομάδα),τους πόρους του Wolff ή μεσονεφρικούς, οι οποίοι εκτείνονται από τον μεσόνεφρο ως την κλοάκη και τους πόρους του Müller ή παραμεσονεφρικούς, οι οποίοι είναι παράλληλοι με τους πρώτους στο μεγαλύτερο μέρος της διαδρομής τους και εκβάλλουν επίσης στην κλοάκη (Βurnett LS, 1985). Οι πόροι του Wolff αναπτύσονται ταυτόχρονα με το μεσόνεφρο και λειτουργούν προσωρινά ως εκκριτικοί πόροι του μεσονέφρου σε έμβρυα μήκους 4-5 mm. Η ανάπτυξη τους συμπίπτει με την εμφάνιση των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων στο λεκιθικό ασκό και με την πρώτη ένδειξη ανάπτυξης των αδιαφοροποίητων γονάδων. Από τους ιδίους πόρους εκπηγάζει αργότερα στο σημείο εισόδου στην αμάρα ένας ουρητηρικός κάλυκας ή εκκόλπωμα, που αναπτύσσεται τελικά σε ουρητήρα, νεφρική πύελο και νεφρικά αθροιστικά σωληνάρια (Tindal,1987). Περί την 5 η έως 6 η εβδομάδα της ενδομήτριας ανάπτυξης, όταν το μήκος του εμβρύου ανέρχεται στα 10 mm και κατά το χρόνο που εμφανίζονται τα 5 επάρματα γύρω από τον ουρογεννητικό κόλπο, εμφάνιζεται μια επιμήκης αυλάκωση στη ραχιαία πλευρά του σπλαχνικού κοιλώματος, πρός τα εκτός και παράλληλα προς τη μεσονεφρική πάχυνση του σπλαχνικού επιθηλίου. Από την αυλάκωση αυτή σχηματίζεται ο πόρος του Müller που αναγνωρίζεται πλήρως σε έμβρυα 6-7 ε- βδομάδων. Οι παραμεσονεφρικοί πόροι (πόροι του Müller) αναπτύσσονται ως κοιλωματικά εγκολπώματα στον μεσόνεφρο, σε μια θέση που αντιστοιχεί στο μελλοντικό κοιλιακό στόμιο της σάλπιγγας της μήτρας. Πιστεύεται ότι ο σχηματισμός τους επάγεται από τον μεσονεφρικό πόρο. Οι παραμεσονεφρικοί πόροι αυξάνονται ουριαία και μπορεί να δέχονται στοιχεία από τους μεσονεφρικούς πόρους, παραμένουν ανοικτοί στο αυχενικό άκρο τους, ενώ προς τα κάτω σχηματίζουν μια σκληρή υποδοχή. Κατά το χρόνο που οι πόροι του Müller επιμηκύνονται προς την ουριαία περιοχή, κλίνουν προς τα εμπρός και προς τη μέση γραμμή και διασταυρώνονται με τους μεσονεφρικούς πόρους από εμπρός, για να ενωθούν τελικά στη μέση γραμμή σε ένα συμπαγή πυρήνα κυττάρων, στο μητροκολπικό αρχέγονο όργανο (uterovaginal primordium) ή μητροκολεϊκό σωλήνα. Οι μεσονεφρικοί και οι παραμε-

16 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ σονεφρικοί πόροι είναι εγκλεισμένοι σε περιτοναϊκές πτυχές από τις οποίες αργότερα σχηματίζονται οι πλατείς σύνδεσμοι της μήτρας. (Καλογερόπουλος 1996). Ενα είδος από τους πόρους θα παραμείνει και θα δώσει γένεση σε ειδικούς πόρους και αδένες ενώ ο άλλος εξαφανίζεται στη διάρκεια του τρίτου εμβρυικού μήνα, με εξαίρεση την παρουσία μη λειτουργικών υπολλειμάτων (Sellmann et al., 1967). Οι σημαντικότεροι παράγοντες οι οποίοι καθορίζουν ποιός από τους πόρους θα παραμείνει ή θα εξαλειφθεί είναι η αντιμυλλέριος ορμόνη (Antimullerian Hormone - AMH ή Mullerian Inhibiting Substance MIS) και η τεστοστερόνη. Η αντιμυλλέριος ορμόνη είναι μια διμερής γλυκοπρωτεΐνη που παράγεται κυρίως από τα κύτταρα Sertoli των όρχεων και σε μικρό ποσοστό από τις ωοθήκες (από τα κύτταρα του ωοφόρου δίσκου του ωοθυλακίου). To γονίδιο της ΑΜΗ εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 19. Κύρια δράση της είναι η υποστροφή του πόρου του Müller στα άρρενα έμβρυα κατά την 8η - 10η εβδομάδα της εμβρυϊκής ζωής, από όπου προέρχονται φυσιολογικά η μήτρα, οι σάλπιγγες και το άνω τριτημόριο του κόλπου. Η αντιμυλλέριος ορμόνη προάγει την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων των πόρων του Müller. Η απόπτωση είναι προοδευτική, έχει κεφαλοoυριαία κατεύθυνση στους πόρους του Müller και το κεφαλικό μέρος του πόρου, από το οποίο προέρχονται οι σάλπιγγες, είναι το πιο ευαίσθητο στη δράση της ΑΜΗ. Στους πόρους ανευρίσκονται δύο τύποι υποδοχέων της ΑΜΗ (τύπος I και ΙΙ). Για την υποστροφή των πόρων απαραίτητη είναι η έκφραση και των δύο υποδοχέων. Η έλλειψη τεστοστερόνης οδηγεί από την μεριά της στην υποστροφή των μεσονεφρικών πόρων. Οι παραμεσονεφρικοί πόροι συμπλησιάζουν μεταξύ τους και αρχίζουν να συμφύονται πριν ακόμη φθάσουν στον ουρογεννητικό κόλπο. Ο αυλός τους σχηματίζει ενιαίο γεννητικό σωλήνα ουραία και η συνένωση ολοκληρώνεται συνήθως στις 10 εβδομάδες. Από τις μοίρες των παραμεσονεφρικών πόρων που δεν συνενώνονται αναπτύσσονται οι σάλπιγγες (ωαγωγοί), ενώ από τις μοίρες που συνενώνονται σχηματίζεται η μήτρα και τουλάχιστον ένα μέρος του κολεού κατά τη 22η εβδομάδα της κύησης. Η ώριμη σάλπιγγα εμφανίζει τέσσερις μοίρες που από τα έξω προς τα έσω είναι: η χοάνη (ή κώδωνας), η λήκυθος, ο ι- σθμός και η μητριαία μοίρα (Moore et al.,1967).

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 17 Η Μήτρα Κατά τη θηλεοποίηση των γεννητικών πόρων, οι πόροι του Müller παραμένουν και αυξάνουν. Συγχωνεύονται από κάτω προς τα επάνω, ενώ τα εφαπτόμενα τοιχώματα καταρρέουν για να σχηματισθεί μία και μόνη κοιλότητα. Το τελικό άκρο του σωλήνα αυτού καταλήγει στον ουρογεννητικό κόλπο, ενώ το κεφαλικό, ελεύθερο τμήμα, σχηματίζει τους ωαγωγούς ( Μπόντης, 2002). Η συγχώνευση αρχίζει κατά τη 7 η ή 8 η εβδομάδα αλλά δεν συμπληρώνεται πριν τη 12 η εβδομάδα της εμβρυϊκής ζωής. Είναι δυνατόν να λεχθεί ότι η μήτρα υπάρχει κατά την έναρξη της όψιμης εμβρυϊκής περιόδου και ότι αρχίζουν να διακρίνονται το σώμα και ο τράχηλος. Το ενδομήτριο (ο βλεννογόνος), το μυομήτριο (ο μυϊκός χιτώνας) και το περιμήτριο (ο ορογόνος) διαφοροποιούνται και τότε εμφανίζεται ο πυθμένας. Το μητριαίο τοίχωμα είναι ήδη πολύ παχύ μετά την 12η εβδομάδα. Γενικά πιστεύεται ότι ο τράχηλος αναπτύσσεται από τον παραμεσονεφρικό πόρο αλλά έχει υπoστηριχθεί ότι ο βλεννογόνος του προέρχεται από τον ουρογεννητικό κόλπο. Η διαφοροποίηση του τραχήλου από το σώμα της μήτρας αναγνωρίζεται γύρω στις 10 εβδομάδες, αλλά ο τράχηλος δε διαχωρίζεται πλήρως από τον κόλπο πριν από τη 12 η εβδομάδα. Το σώμα και ο τράχηλος αποκτούν αδένες. Πρωτογενείς ενδομήτριοι αδένες εμφανίζονται κατά τη 16 η εβδομάδα και οι ενδοτραχηλικοί αδένες στην 28 η εβδομάδα. Κατά την 20η εβδομάδα πιστεύεται ότι πραγματοποιείται η διαφοροποίηση του μητριαίου τοιχώματος σε ενδομήτριο προερχόμενο από το παραμεσονεφρικό επιθήλιο το οποίο υπαλείφει τις ανεξάρτητες και τις ενωμένες μοίρες των παραμεσονεφρικών πόρων (Κεραμέως-Φόρογλου, 1987). Β. ΑΓΓΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΜΗΤΡΑΣ Η αγγείωση της μήτρας πραγματοιείται απο τις 2 μητραίες αρτηρίες οι οποίες αποτελούν κλάδους των έσω λαγονίων αρτηριών. Στο κάτωθεν τμήμα της μήτρας, η μητραία αρτηρία διακλαδίζεται στην κολπική αρτηρία και στο ανερχόμενο τμήμα της διακλαδίζεται στις τοξοειδής αρτηρίες. Οι τοξοειδείς αρτηρίες κινούνται παράλληλα στην ενδομήτρια κοιλότητα και αναστομώνονται μεταξύ τους σχηματίζοντας ένα αγγειακό δίκτυο γύρω της.

18 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μικρές φυγόκεντρες διακλαδώσεις (ακτινωτές αρτηρίες) ξεκινούν από τα τοξοειδή αγγεία, κάθετα στην ενδομήτρια κοιλότητα και καταλήγουν στο μυομήτριο. Όταν οι αρτηρίες αυτές εισέρχονται στο ενδομήτριο, μικρές διακλαδώσεις (οι βασικές αρτηρίες) εκτείνονται πλάγια προς την βασική μεμβράνη. Αυτές οι βασικές αρτηρίες δεν ανταποκρίνονται στις ορμονικές αλλαγές. Οι ακτινωτές αρτηρίες, οι οποίες είναι ευαίσθητες στα ορμονικά ερεθίσματα, συνεχίζουν στην επιφάνεια του ενδομητρίου και λόγω της εμφάνισής τους αποκαλούνται σπειροειδείς αρτηρίες. Οι ενδομήτριοι αδένες και το στρώμα αγγειώνονται από αιμοφόρα αγγεία τα οποία εκβάλουν από τις σπειροειδείς αρτηρίες σε όλα τα επίπεδα του ενδομητρίου. Τα αιμοφόρα αγγεία καταλήγουν στο φλεβικό πλέγμα και στις τοξοειδείς φλέβες του μυομητρίου και στις μητριαίες φλέβες. Αυτή η μοναδική αγγειακή αρχιτεκτονική είναι απαραίτητη ώστε να επιτρέπει τη συνεχή ενδομήτρια ανάπτυξη και αποφολίδωση. Γ. ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ Δομή του ενδομητρίου Το τοίχωμα της μήτρας αποτελείται από τρείς χιτώνες, τον βλεννογόνο, τον μυικό και τον ορογόνο. Ο βλεννογόνος της μήτρας ονομάζεται και ενδομήτριο και καλύπτει την κοιλότητα του σώματος και του ισθμού μεταπίπτοντας στον βλεννογόνο της τραχηλικής κοιλότητας και συνδέεται στενά με τον μυικό χιτώνα, χωρίς την παρεμβολή υποβλεννογόνιου χιτώνα. Η ιστoλογική σύσταση του ενδομητρίου είναι μία επιφάνεια επιθηλίου, αδένες και ένα στρώμα συνδετικού ιστού με ένα περίτεχνο αγγειακό δίκτυο. H ιστολογική του εικόνα παρουσίαζει διαφορές κατά την διάρκεια ενός καταμήνιου κύκλου. Οι μεταβολές αυτές έχουν σχέση με την λειτουργία των ωοθηκών και διαρκούν 28 ημέρες. Το τέλος των μεταβολών αυτών εκδηλώνεται με αιμορραγία, που αποτελεί την έμμηνο ρύση. Οι ιστολογικές μεταβολές του ενδομητρίου στη διάρκεια του καταμηνίου κύκλου, ταξινομούνται σε διαδοχικές φάσεις : 1) παραγωγική ή ωοθυλακική φάση, 2) εκκριτική ή ωχρινική φάση και 3) αιμορροική φάση. Αμέσως μετά την έναρξη της ήβης, το επιθήλιο του βλεννογόνου της μήτρας εμφανίζεται ως μονόστιβο κυλινδρικό και κατά τόπους κροσσωτό.

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 19 Ο βλεννογόνος του τραχήλου στο πρόσθιο και στο οπίσθιο τοίχωμα του εμφανίζει πτυχές που μοιάζουν με κλάδους φοίνικα, γι αυτό και ονομάζονται φοινικοειδές πτυχές. Το επιθήλιο του είναι μονόστιβο κυλινδρικό και τα κύτταρα που το αποτελούν είναι εκκριτικά, βλεννογόνα κύτταρα. Κοντά στο έξω στόμιο της μήτρας και ειδικότερα στην εξωτερική επιφάνεια του ενδοκολεϊκού μέρους του τραχήλου, το επιθήλιο γίνεται πολύστιβο πλακώδες. Το χόριο του ενδομητρίου είναι πολύ παχύ και περιέχει τους μητριαίους αδένες. Ο συνδετικός ιστός που αποτελεί το χόριο, είναι πλούσιος σε κύτταρα, μακροφάγα, πλασμοκύτταρα και κοκκώδη λευκά αιμοσφαίρια. Κάτω από το επιθήλιο, μέσα στο χόριο, βρίσκονται επίσης και άφθονα συνδετικογενή κύτταρα τα οποία ονομάζονται φθαρογενή. Οι μητριαίοι αδένες είναι απλοί σωληνοειδείς αδένες και ανάλογα με το στάδιο του καταμηνίου κύκλου εμφανίζονται ελικοειδείς. Το επιθήλιό τους αποτελείται από μια στοιβάδα κυλινδρικών κροσσωτών και άκροσσων κυττάρων που εκκρίνουν κυρίως βλέννα και γλυκογόνο. Από το επιθήλιο του πυθμένα των μητραίων αδένων γίνεται η ανάπλαση του επιθηλίου της μήτρας. Οι αρτηρίες του ενδομητρίου που προέρχονται από το αρτηριακό δίκτυο του μυομητρίου, εμφανίζουν στην αρχή ευθεία πορεία, στη συνέχεια όμως φέρονται και αυτές ελικοειδώς προς την επιφάνεια του βλεννογόνου όπου αναστομώνονται μεταξύ τους (Ferenczy et al.,1979). Το δίκτυο αυτό τροφοδοτεί τους αδένες και τον συνδετικό ιστό της ε- πιφανειακής μοίρας του ενδομητρίου. Το ενδομήτριο με την επίδραση των ωοθηκικών ορμονών διαφοροποιείται έτσι ώστε να αποτελείται από τρείς στοιβάδες. Η επιφανεική στιβάδα προς την κοιλότητα της μήτρας ονομάζεται συμπαγής και αποτελείται από το επιθήλιο, τις επιπολής μοίρες των μητριαίων αδένων και από τα φθαρτογενή κύτταρα του χορίου. Κάτω από την επιφανειακή στιβάδα βρίσκεται η σπογγώδης, η ο- ποία αποτελείται από το μέσο τμήμα του χορίου και περιλαμβάνει τα σώματα των αδένων και τον χαλαρό συνδετικό ιστό που τα περιβάλλει. Τέλος, η βασική στιβάδα του ενδομητρίου περιλαμβάνει την βαθύτερη στοιβάδα του χορίου με τους πυθμένες των μητριαίων αδένων.

20 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Από τις τρείς αυτές στιβάδες, οι δύο πρώτες αποπίπτουν και αναγεννώνται κατά τις φάσεις του καταμηνίου κύκλου. Γι αυτό και περιγράφονται οι δύο μαζί ως λειτουργική στιβάδα. Αντίθετα η βασική στιβάδα, η οποία έχει και δική της αιμάτωση, παραμένει σταθερή στη διάρκεια του έμμηνου κύκλου και χρησιμέυει για την αναγέννηση των επιφανειακών στιβάδων. Η επιφάνεια του επιθηλίου έχει διπλή λειτουργία: να εξασφαλίσει την εμφύτευση και να παρέχει άμυνα κατά των λοιμώξεων. Το αδενικό επιθήλιο υπόκειται αναγέννηση και αναδόμηση στο πρώτο μισό του κύκλου και εκκριτική μεταμόρφωση μετά την ωοθυλακιορρηξία με συσσώρευση γλυκογόνου και άλλων μεταβολικών στοιχείων. Στο τέλος της ωχρινικής φάσης η έκκριση μειώνεται. Τα επιθηλιακά κύτταρα είναι η μέγιστη πηγή παρακρρινών μορίων τα οποία παίρνουν μέρος στην εμφύτευση και στην εμμηνορυσία. Το στρώμα αποτελείται από ινοβλαστικά κύτταρα, αγγεία και μια ποικιλία Τ-λεμφοκυττάρων, μεγάλα ενδομητριακά κοκκιώδη (LGL) λεμφοκύτταρα με φαινότυπο φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ), μακροφάγα, σιτευτικά κύτταρα (mast cells) και μικρό ποσοστό Β λεμφικών κυττάρων. Οι συναθροίσεις λεμφοκυττάρων βρίσκονται κυρίως στην βασική μεμβράνη, δεν απορρίπτονται κατά την εμμηνορυσία (Tabibzadeh,1994) και δομούνται από Τ και Β λεμφοκύτταρα περιβαλλόμενα από μονοκύτταρα (Yeaman et al.,1997). Tα μεγάλα ενδομητριακά κοκκιώδη λεμφοκύτταρα (LGL) εμφανίζονται στην εκκριτική φάση και αυξάνονται στην διάρκεια των πρώτων εβδομάδων της εγκυμοσύνης. Η εκφύλιση των ινοβλαστικών κυττάρων ξεκινάει περίπου την 23 η ημέρα του κύκλου και αφορά τα κύτταρα τα οποία περιβάλλουν τις ελικοειδής αρτηρίες (Buckley and Fox, 1989), βαθμιαία διαχέεται σε όλο το στρώμα και είναι χαρακτηριστική σε περίπτωση εγκυμοσύνης. Τα εκφυλισμένα κύτταρα είναι κυκλικά, περιέχουν γλυκογόνο και έ- χουν χαρακτηριστικά μυικών ινοβλαστικών κυττάρων (Oliver et al.,1999). Aνάμεσα σε διάφορες άλλες ουσίες παράγουν και προλακτίνη ( Bergeron et al.,2000). Αν δεν συμβεί γονιμοποίηση, η λειτουργική στιβάδα πέφτει. Την απόπτωση αυτή συνοδεύει αιμορραγία,που αποτελεί την εμμηνορρυσία (Bourgain et al,2002).

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 21 Ιστολογία του ενδομητρίου σε ένα φυσιολογικό κύκλο Ο κλασσικός γεννητικός κύκλος των 28 ημερών δεν είναι και τόσο συχνός όσο πιστεύεται. Μερικές γυναίκες εμφανίζουν εμμηνορρυσία κάθε 21 ημέρες και άλλες ξεπερνούν τις 34 ημέρες. Οι μεταβολές του ενδομητρίου κατά τη διάρκεια του εμμηνορρυσιακού κύκλου μπορεί να διακριθούν σε τέσσερις κύριες φάσεις. Την παραγωγική φάση, κατά την οποία γίνεται αναγέννηση και αναδόμηση του ενδομητρίου, που είχε αποπέσει εν μέρει κατά την προηγούμενη έμμηνη ρύση. Την εκκριτική φάση, όπου το αναγεννημένο ενδομήτριο προετοιμάζεται να δεχθεί το γονιμοποιημένο ωάριο. Την ισχαιμική φάση, 2-3 μέρες πριν την έναρξη της επόμενης εμμήνου ρύσεως και τέλος τη φάση της εμμηνορρυσίας, κατά την οποία η λειτουργική στιβάδα του ενδομητρίου, που δεν υποδέχθηκε το γονιμοποιημένο ωάριο, εκφυλίζεται και αποπίπτει (Σχ.1). Σχ. 1. Μεταβολές του ενδομητρίου κατά τη διάρκεια του εμμηνορυσιακού κύκλου, σε σχέση με τον ωοθηκικό κύκλο.

22 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ H μικροσκοπική εμφάνιση των κυκλικών αλλαγών στη δομή του ενδομητρίου έχει ήδη περιγραφεί και μέχρι σήμερα η χρονολόγηση του βασιζόμενη στα κριτήρια το Νοyes, η οποία εφαρμόσθηκε σε 8000 ενδομήτριες βιοψίες υπογόνιμων γυναικών αποτελεί την πιό αξιόπιστη ενδομήτρια αξιολόγηση (Noyes et al.,1950) Σχ.2. Υπάρχουν βέβαια διαμάχες οσον αφορά την εγκυρότητα της χρονολόγησης του ενδομητρίου. Η ακρίβεια της χρονολόγησης μελετήθηκε με βάση ορισμένους παράγοντες :1) την μέθοδο καθορισμού της μέρας της ωορρηξίας, 2) τον χρόνο της βιοψίας, 3) η μεταβλητότητα μεταξύ των παρατηρητών και 4) το κατάλληλο δείγμα και τις τεχνικές μονιμοποίησης. Για τον καθορισμό της ημέρας της ωορρηξίας σε συνάρτηση με την ιστολογική χρονολόγηση, ο Noyes et al. (1950) συσχέτισε 300 βιοψίες με την επόμενη εμμηνορρυσιακή περίοδο (ΝΜΡ) και 40 βιοψίες με την βασική θερμοκρασία σώματος (ΒΒΤ), με βελτιωμένη συσχέτιση χρησιμοποιώντας την τελευταία μέθοδο (από 38% έως 78%). Οι κυκλικές αλλαγές του ενδομητρίου συμπίπτουν με τις κυκλικές αλλαγές οι οποίες συμβαίνουν στην ωοθήκη. Η ακριβή χρονολόγηση της ενδομήτριας ιστολογίας μπορεί να αποδειχθεί εφαρμόζοντας συγκεκριμένα κριτήρια για τον καθορισμό της χρονολογικής ημέρας του κύκλου, ορίζοντας ως σημείο αναφοράς την ημέρα της αύξησης της LH (Acosta et al, 2000;Li et al.,1987) και την χρονική στιγμή της βιοψίας (Castelbaum et al., 1994). H έξαρση της αύξησης της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) φαίνεται να είναι ο πιο αξιόπιστος δείκτης της επικείμενης ωοθυλακιορρηξίας, λαμβάνοντας χώρα 24-36 ώρες πριν από την ρήξη του ωοθηλακίου (Hoff et al,1983). Η αύξηση της LH συμβαίνει περίπου στις 3 π.μ, αρχίζοντας ανάμεσα στα μεσάνυχτα και στις 8 π.μ στα δύο τρίτα των γυναικών (Cahill DJ et al.,1998). Η ημέρα κατά την οποία αρχίζει η αύξηση της LH περιγράφεται ως ημέρα LH+0 και η ημέρα της ωοθυλακιορρηξίας ως ημέρα 14 ενός κύκλου 28 ημερών.

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 23 Σχ. 2. Χρονολόγηση του ενδομητρίου με βάση τις επιθηλιακές και στρωματικές αλλαγές. 1. Παραγωγική ή ωοθυλακική φάση Η παραγωγική φάση ακολουθεί την εμμηνορρυσία και χαρακτηρίζεται από την αναγέννηση και την ανάπτυξη της λειτουργικής στοιβάδας του ενδομητρίου που έχει αποπέσει. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του πάχους του ενδομητρίου στη διάρκεια αυτής της φάσης. Το μήκος της παραγωγικής φάσης ποικίλει, με διακύμανση από 9-23 ημέρες (Johannisson,1985) και η ηλικία φαίνεται να επηρεάζει το μήκος του κύκλου (οι νεώτερες γυναίκες έχουν παραγωγική φάση μεγαλύτερης διάρκειας από τις γυναίκες μεγαλύτερης ηλικίας).

24 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Το ωοθηκικό οιστρογόνο είναι η κυρίαρχη ορμόνη στη διάρκεια αυτής της φάσης του κύκλου και είναι εξαρτώμενη της ωοθηλακιοτρόπου ορμόνης η οποία ελευθερώνεται από την αδενουπόφυση. Η ωοθηλακιορρηξία,συνήθως περιγράφεται ως ημέρα LH+1 και λαμβάνει χώρα περίπου 10-12 ώρες μετά την εκκριτική αιχμή της LH (World Health Organization task force investigators,1980). Η φάση αυτή χαρακτηρίζεται από την γρήγορη αναγέννηση του βλεννογόνου και των πολλαπλασιασμό των κυττάρων του. Η αναγέννηση γίνεται από την βασική στοιβάδα, που περιέχει τους πυθμένες των μητριαίων αδένων. Η ανάπλαση αυτή του ενδομητρίου συμπίπτει με την ωρίμανση του ωοθηλακίου και την έκκριση οιστρογόνων, γι αυτό και ονομάζεται ωοθηλακική φάση. Με την επίδραση των οιστρογόνων που παράγονται από τη θήκη του ωοθυλακίου, τα διάμεσα κύτταρα της βασικής στοιβάδας του ενδομητρίου αναπαράγονται, ενώ τα επιθηλιακά κύτταρα αναπτύσσονται από τα υπολείμματα των αδένων. Έτσι γίνεται η πλήρης επιθηλιοποίηση του ενδομητρίου. Κατά την παραγωγική φάση το ενδομήτριο έχει εμφάνιση λεία και ωχρή και το πάχος του είναι μόνο 1-2mm. To καλυπτικό επιθήλιο είναι χαμηλό με κύτταρα κυλινδρικά και οι αδένες είναι βραχείς, ευθείς και στενοί. Οι τελευταίοι καλύπτονται από κυβοειδές επιθήλιο, χωρίς να έχουν καμιά ένδειξη εκκριτικής δραστηριότητας. Το στρώμα είναι συμπυκνωμένο και αποτελείται από κύτταρα που οι πυρήνες τους καταλαμβάνουν σχεδόν ολόκληρο το κύτταρο. Με την αυξανόμενη επίδραση των οιστρογόνων τα κύτταρα του ενδομητρίου πολλαπλασιάζονται γρήγορα και ο βλεννογόνος διπλασιάζεται σχεδόν σε πάχος, για να φθάσει περίπου τα 3mm κατά την ωοθυλακιορρηξία. Το καλυπτικό επιθήλιο ψηλώνει, ενώ τα αδενικά επιθήλια τοποθετούνται ανώμαλα δίνοντας στην επιφάνεια μια πτυχωτή εμφάνιση. Το στρώμα αυξάνεται σε πάχος, χωρίς να χάνει τη συμπύκνωσή του. Οι αδένες γίνονται πιο πλατείς, αρχίζουν να παρουσιάζουν ελικοειδή πορεία, αλλά παραμένουν χωρίς εκκριτική δραστηριότητα. O ρυθμός επιμήκυνσης των αδένων στη διάρκεια της δεύτερης εβδομάδας του κύκλου (μετά την 7 η ημέρα από την αρχή της εμμηνορυσίας) γίνεται ταχύτερος από τον ρυθμό αύξησης του πάχους του στρώματος, γι αυτό το λόγο οι αδένες υποχρεώνονται να πάρουν <<σκολιά>> πορεία. Η αγγειογέννεσης συνδράμει στην επίτευξη της εμφύτευσης. Οι ελικοειδής αρτηρίες την στιγμή της εμφύτευσης περιβάλονται απο μυοινοβλαστι-

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 25 κά κύτταρα τα οποία αναφέρονται ότι αποτελούν την πηγή των εκφυλισμένων στρωματικών κυττάρων (Oliver et al.,1999). 2. Εκκριτική ή ωχρινική φάση Στην εκκριτική φάση, που αρχίζει αμέσως μετά την ωοθυλακιορρηξία, εμφανίζεται μία ολοένα αυξανόμενη εκκριτική δραστηριότητα, που οφείλεται στην επίδραση της προγεστερόνης, δηλαδή της ορμόνης που παράγεται στο ωχρό σωμάτιο, αν και το οιστρογόνο είναι επίσης παρόν. Το μήκος της εκκριτικής φάσης ποικίλει ανάμεσα στις 8 και 17 η- μέρες, αλλά συνήθως διαρκεί 14 ημέρες. Κατά το στάδιο αυτό, το ενδομήτριο παρουσιάζει έντονη εκκριτική λειτουργία. Η πάχυνση του ενδομητρίου στην περίοδο αυτή καθυστερεί για λίγο, αλλά συμβαίνουν σημαντικές αλλαγές στην υφή του. Οι αδένες υπερτρέφονται, επιμηκύνονται, και σε κάθετη τομή παίρνουν αστεροειδές σχήμα, ενώ το καλυπτικό επιθήλιο γίνεται υψηλότερο. Η μετανάστευση των πυρήνων των κυττάρων προς τον αυλό του αδένα και η ανάπτυξη της διαυγούς περιοχής, πλούσια σε γλυκογόνο, είναι τα χαρακτηριστικά ιστολογικά στοιχεία της εκκριτικής φάσης. Μία εβδομάδα μετά την ωοθυλακιορρηξία το ενδομήτριο φθάνει στο υψηλότερο σημείο της μορφολογικής του ανάπτυξης και της εκκριτικής του δραστηριότητας. Κατά το χρόνο αυτό ο βλεννογόνος έχει πάχος 5-7mm, που είναι το διπλάσιο της παραγωγικής φάσης. Οι αδένες διαστέλλονται και γίνονται πολυέλικτοι. Η παρουσία της εκκριτικής δραστηριότητας σε διάφορα στάδια είναι εμφανής στα επιθηλιακά κύτταρα. Σε μερικά από αυτά ποσότητες γλυκογόνου έχουν μεταφερθεί στο βάθος του αυλού των αδένων, ενώ οι πυρήνες τους έχουν ξαναγυρίσει στις θέσεις τους, κοντά στη βασική μεμβράνη. Εκτός από το γλυκογόνο, λιπίδια, πολυσακχαρίτες και άλλα μεταβολικά στοιχεία μπορεί να εμφανιστούν. Το στρώμα αυξάνεται σε πάχος, αλλά αυτό οφείλεται σε οίδημα με αποτέλεσμα να είναι χαλαρότερο από ότι σε προηγούμενα στάδια. Τα κύτταρα του στρώματος μεγεθύνονται σημαντικά και το κυτταρόπλασμα τους αυξάνεται σε ποσότητα. Τα σπειροειδή αρτηρίδια διογκώνονται και μερικοί από τους επιφανειακούς τους κλάδους συνδέονται απευθείας με τους φλεβικούς κόλπους κοντά στην επιφάνεια. Οι αρτηριοφλεβικές αναστομώσεις μαζί με την διόγκωση των τριχοει-

26 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ δών γύρω από τους αδένες και κάτω από το καλυπτικό επιθήλιο προκαλούν την υπεραιμία του ενδομητρίου, που αυξάνεται προοδευτικά μετά την ωοθυλακιορρηξία. Εφόσον υπάρξει εγκυμοσύνη η εξέλιξη του ενδομητρίου συνεχίζεται προκειμένου να μετατραπεί σε φθαρτό. Εάν δεν συμβεί εγκυμοσύνη, αρχίζει η φάση της υποστροφής του ενδομητρίου. Στην περίπτωση αυτή το ενδομήτριο χάνει την ορμονική του υποστήριξη και αρχίζει να δείχνει σημεία υποστροφής. Μερικές μέρες πριν από την έναρξη της εμμηνορρυσίας, εξαφανίζεται το οίδημα και η κυκλοφορία του αίματος μειώνεται, με αποτέλεσμα οι αδένες και οι σπειροειδείς αρτηρίες να αρχίζουν να συμπίπτουν, τότε αρχίζει η διήθηση του ενδομητρίου με πολυμορφοπύρηνα και λεμφοκύτταρα. Στο τέλος της εκκριτικής φάσης και 2-3 μέρες πριν από την έναρξη της επόμενης εμμήνου ρύσεως, οι ελικοειδείς αρτηρίες του ενδομητρίου, λόγω της πτώσεως των οιστρογόνων στο αίμα, συσπώνται έντονα με αποτέλεσμα να προκαλείται ισχαιμία του βλεννογόνου. Ο συνδετικός ιστός του χορίου διηθείται από λευκοκύτταρα και γίνεται συμπαγέστερος. Στην βασική όμως στοιβάδα, η κυκλοφορία του αίματος εξακολουθεί να γίνεται κανονικά (Sperrof and Fritz, 2005). 3. Εμμηνορρυσιακή φάση Το στάδιο αυτό χαρακτηρίζεται από την απόπτωση της λειτουργικής στιβάδας του ενδομητρίου και την εμφάνιση αιμορραγίας που διαρκεί 3-5 μέρες. Η αποχώρηση της προγεστερόνης συνοδεύεται από αύξηση της παραγωγής της κυτοκίνης στο περιαγγειακό διάστημα η οποία συνεπάγεται αύξηση των λυτικών ενζύμων όπως των MMPs (matrix metalloproteases), με αποτέλεσμα την νέκρωση των καλυπτικών κυττάρων του ενδομητρίου, την διάσπαση της επιφάνειας του και την αιμορραγία (review by Kelly et al.,2001). Aπό την 3 η ημέρα του εμμηνορρυσιακού κύκλου αρχίζει η αναγέννηση του ενδομητρίου από τη βασική στοιβάδα, που σ όλο το διάστημα του γεννητικού κύκλου είχε παραμείνει αδρανής, ενώ η πλήρη αποκατάστασή του ολοκληρώνεται την 5 η ημέρα. Η έναρξη της φάσης αυτής συμπίπτει με την αρχή ωρίμανσης ενός ωοθηλακίου στην ωοθήκη (Σχ.3). Στην περίπτωση κυήσεως, λόγω της συνεχιζόμενης αναπτύξεως του ωχρού σωματίου, ο βλεννογόνος της μήτρας διατηρείται στο πάχος

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 27 που είχε κατά την εκκριτική φάση και είναι έτοιμος να υποδεχθεί το γονιμοποιημένο ωάριο. Σχ. 3. Εμμηνορυσιακός κύκλος. Δ. Η ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΟΥ ΣΕ ΔΙΕΓΕΡΜΕΝΟΥΣ ΚΥΚΛΟΥΣ ΣΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ ΤΗΣ ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗΣ Η εμφύτευση απαιτεί συγχρονισμό της ωρίμανσης του ενδομητρίου και της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη είναι ωοθηκικές στεροειδείς ορμόνες οι οποίες ρυθμίζουν τις σύνθετες αλλαγές που υφίσταται το ενδομήτριο κατά την διάρκεια του εμμηνορρυσιακού κύκλου. Παρά την εξέλιξη των τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής το ποσοστό εμφύτευσης παραμένει χαμηλό. Αυτό θα μπορούσε να ο- φείλεται είτε στην ποιότητα του εμβρύου που μεταφέρεται, είτε στο ενδομήτριο που θα υποδεχθεί το έμβρυο αυτό. Σ αυτή την υπόθεση

28 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ συνηγορεί το ότι το ποσοστό εμφύτευσης σε IVF κύκλους είναι μικρότερο σε σύγκριση με φυσιολογικούς (Macklon and Fauser, 2000). Το ενδομήτριο στη διάρκεια της διέγερσης των ωοθηκών υφίσταται ποιοτικά το ίδιο ερέθισμα, με οιστρογόνα και προγεστερόνη, μ αυτό ενός φυσιολογικού κύκλου. Ωστόσο, ποσοτικά το ερέθισμα είναι πολύ μεγαλύτερο. Κατά τη διάρκεια της IVF θεραπείας, λόγω των υψηλών δόσεων διέγερσης με γοναδοτροπίνες, η ωοθήκη παράγει πολλαπλά ωοθυλάκια, οδηγώντας σε επίπεδα οιστραδιόλης και προγεστερόνης ορού πάνω από το φυσιολογικό. Αυτό πιθανόν ευθύνεται για τις ανωμαλίες του ενδομητρίου που έχουν περιγραφεί μετά από διέγερση ωοθηκών (Bourgain and Devroey,2003). Πολύ λίγες πληροφορίες υπάρχουν σε σχέση με το αν οι ανωμαλίες που παρατηρούνται στο ενδομήτριο κατά την ωχρινική φάση έχουν ήδη ξεκινήσει στην παραγωγική φάση, πριν την τελική ωρίμανση των ωαρίων με την χορήγηση της HCG. Μια και η βιολογική δράση των στεροειδών ορμονών είναι υπό τον έλεγχο των υποδοχέων τους, έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρoν να μελετηθεί ο τρόπος με τον οποίο ρυθμίζεται η έκφραση των υποδοχέων αυτών κατά τη διάρκεια της διέγερσης. Παρά το γεγονός ότι η ιστολογική εκτίμηση της ποιότητας του ενδομητρίου πραγματοποιείται με πολλές μεθόδους όπως, η ανάλυση της έκφρασης των πινοποδίων (Bentin-Ley et al.,1999), η εκτίμηση των πρωτεϊνών σε εκκρίματα από ενδομήτριο (Damario et al.,2001) καθώς και η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης του ενδομητρίου (Mirkin et al.,2005), η ιστολογική εκτίμηση (χρονολόγηση) είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος. Στους IVF κύκλους, η ημέρα χορήγησης της hcg περιγράφεται αντίστοιχα ως ημέρα αύξησης της LH σε φυσιολογικούς κύκλους (LH+0) και η ημέρα της λήψης ωαρίων (OPU) α- ντίστοιχη της ημέρας 14 ενός φυσιολογικού κύκλου (ημέρα ωοθυλακιορρηξίας ή LH+2) (Develioglou et al.,1999). Mε βάση ιστολογικές μελέτες έχει διαπιστωθεί ότι η ωοθηκική διέγερση στο πλαίσιο της IVF προκαλεί αλλαγές στην ανάπτυξη της ωχρινικής φάσης ( Bourgain and Devroey,2003). Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών ποικίλουν ανάλογα με τον χρόνο της ενδομητρικής βιοψίας, τα διάφορα πρωτόκολλα διέγερσης των ωοθηκών και την χορήγηση ή μη υποστήριξης στη διάρκεια της ωχρινικής φάσης. Όλες οι μελέτες, εκτός από δύο, έχουν πραγματοποιηθεί στη διάρκεια της ωχρινικής φάσης και οδηγούν στα ίδια συμπεράσματα. Στη

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 29 διάρκεια της ωοθυλακιορρηκτικής και μετα-ωοθυλακιορρηκτικής περιόδου παρατηρείται ωρίμανση του ενδομητρίου, η οποία συνοδεύεται από μία φυσιολογική μορφή του ενδομητρίου στην πρώιμη ωχρινική φάση, ενώ στη μέση και όψιμη ωχρινική φάση είναι συχνή η μη αρμονική ανάπτυξη αδένων και στρώματος. Βασιζόμενοι στις παρατηρήσεις αυτές αρκετές μελέτες πραγματοποιήθηκαν ερευνώντας τη χρησιμότητα της ωχρινικής υποστήριξης σε διεγερμένους κύκλους, όπως ακριβώς η περίπτωση μιάς πρόσφατης μετανάλυσης η οποία έδειξε ότι όλα τα είδη της ωχρινικής υποστήριξης μπορούν να επιφέρουν ρύθμιση στην επιβράδυνση της ανάπτυξης των αδένων στη διάρκεια της μέσης ωχρινικής περιόδου (Pritts and Atwood,2002). Στον Πίνακα 1 παρουσιάζονται μελέτες στις οποίες εκτιμήθηκε ι- στολογικά το ενδομήτριο στη διάρκεια της ωοθυλακικής και ωχρινικής φάσης σε κύκλους IVF. Χρόνος ενδομητρικής βιοψίας Προ της ωθηλακιορρηξίας Μελέτη Marchini et al., 1991 Πρωτόκολλο διέγερσης Βουσερελίνη/ εμμηνοπαυσιακή γοναδοτρο πίνη (hmg) Ωχρινική υποστήριξη Καμία Βιοψίες 21 σε διεγερμένο κύκλο Αποτελέσματα 21 με ενδομήτριο σε πρώιμη εκκριτική φάση OPU (ημέρα λήψης ωαρίων) Lass et al., 1998 Kolibianakis et al., 2002 Bourgain et al., 2002 Ομάδα ελέγχου σε φυσιολογικό κύκλο Βουσερελίνη ή Ναφερελίνη/ FSH ή ανασυνδιασμένη FSH (rec FSH) Ανταγωνιστής/ recfsh Βουσερελίνη/ hmg Ομάδα ελέγχου σε φυσιολογικό κύκλο Δεν αναφέρεται Κολπική Προγεστερόνη και χοριακή γοναδοτροπίνη Δεν αναφέρεται 20 σε φυσιολογικό κύκλο 33 σε διεγερμένο κύκλο 55 σε διεγερμένο κύκλο 20 σε διεγερμένο κύκλο 10 σε φυσιολογικό κύκλο 18 με παραγωγικό ενδομήτριο, 2 με εκκριτικό ενδομήτριο 15 με ενδομήτριο σε φάση OPU, 15 με υπερώριμο ενδομήτριο, 3 με ανώριμο ενδομήτριο 55 με υπερώριμο ενδομήτριο (μέσος όρος 2.5 ημέρες υπερωριμότητας) 19 με υπερώριμο ενδομήτριο την ημέρα της OPU

30 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Χρόνος ενδομητρικής βιοψίας OPU+2 Μελέτη Noci et al., 1997 Bourgain et al., 2002 Πρωτόκολλο διέγερσης Βουσερελίνη υποδόρια/fsh Βουςερελίνη/ hmg Ωχρινική υποστήριξη Καμία Καμία Βιοψίες 12 σε διεγερμένο κύκλο 7 σε διεγερμένο κύκλο Αποτελέσματα 11 με υπερωριμότητα του στρώματος του ενδομητρίου 7 με ενδομήτριο σε φάση OPU+2 (=LH+4) OPU+3 Barash et al., 1992 Ομάδα ελέγχου σε φυσιολογικό κύκλο Βουσερελίνη/ hmg hmg/hcg Δεν αναφέρεται 10 σε φυσιολογικό κύκλο 20 σε διεγερμένο κύκλο 5 σε διεγερμένο κύκλο 25 με φυσιολογική μορφή του ενδομητρίου την ημέρα 16-17, 2 με ατροφικό ενδομήτριο OPU+4 hcg+6 hcg:λήψη χοριακής γοναδοτροπίνης Hadi et al., 1994 Macrow et al., 1994 Ragni et al., 1999 Αντισυλληπτικό χάπι/ γοναδοτροπίνη Γκοσερελίνη/ hmg Ομάδα ελέγχου σε φυσιολογικό κύκλο Γκοσερελίνη/ hmg Ομάδα ελέγχου σε φυσιολογικό κύκλο Τριπτορελίνη/ FSH Καμία Καμία 15 κολπική Προγεστερόνη 15 ενδομυική Προγεστερόνη 2 σε φυσιολογικό κύκλο 9 σε διεγερμένο κύκλο 22 σε φυσιολογικό κύκλο 11 σε διεγερμένο κύκλο 11 σε φυσιολογικό κύκλο 30 σε διεγερμένο κύκλο Καμία διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου Καμία διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου 30 με ενδομήτριο σε φάση hcg+6

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 31 Χρόνος ενδομητρικής βιοψίας Μελέτη Πρωτόκολλο διέγερσης Ωχρινική υποστήριξη Βιοψίες Αποτελέσματα hcg+7 Seif et al., 1992 Bourgain et al., 1994 Kolb et al., 1997 Basir et al., 2001 Βουσερελίνη υποδόρια /hmg Βουσερελίνη υποδόρια /hmg Λευπρολίδη/ FSH Βουσερελίνη/ hmg 15 Καμία 15 hcg 10 Καμία 41 hcg 28 κολπική Προγεστερόνη 12 ενδομυική Προγεστερόνη Καμία Δεν αναφέρεται 30 σε διεγερμένο κύκλο 51 σε διεγερμένο κύκλο 7 σε διεγερμένο κύκλο 20 σε φυσιολογικό κύκλο 26 σε διεγερμένο κύκλο 5 με ανεπαρκές δείγμα, 3 με ανώριμα αδενικά κύτταρα, 14 με στρωματική υπερωριμότητα Σε κύκλους χωρίς υποστήριξη: 70% ενδομήτριο το οποίο δεν αντιστοιχεί στη φάση hcg+7 Σε κύκλους με ωχρινική υποστήριξη: 80 % ενδομήτριο σε φάση hcg+7 Υπερωριμότητα κατά 1.8 ημέρες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου 15 με έλλειψη συγχρονισμού στην ωρίμανση των αδενικών και στρωματικών κυττάρων, 11με συγχρονισμό στην ωρίμανση των αδενικών και στρωματικών κυττάρων, Ομάδα ελέγχου σε φυσιολογικό κύκλο 12 σε φυσιολογικό κύκλο 12 με αδενικά κύτταρα σε φάση hcg+7

32 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Χρόνος ενδομητρικής βιοψίας hcg+8 hcg+11-13 Μελέτη Meyer et al., 1999 Balasch et al., 1991 Πρωτόκολλο διέγερσης Λευπρολίδη/ FSH Ομάδα ελέγχου σε φυσιολογικό κύκλο Βουσερελίνη/ hmg Ωχρινική υποστήριξη 9 Καμία 11 ενδομυική προγεστερόνη Βιοψίες 20 σε διεγερμένο κύκλο 20 σε φυσιολογικό κύκλο 21 hcg 21 σε διεγερμένο κύκλο Αποτελέσματα 1 με υπερώριμο ενδομήτριο, 7 με φυσιολογικό ενδομήτριο, 12 με έλλειψη συγχρονισμού στην ωρίμανση των αδενικών και στρωματικών κυττάρων 3 με υπερώριμο ενδομήτριο, 12 με φυσιολογικό, 5 με έλλειψη συγχρονισμού στην ωρίμανση των αδενικών και στρωματικών κυττάρων 19 με φυσιολογικό ενδομήτριο, 2 με ανώριμο ενδομήτριο Πίνακας 1: Η ιστολογία του ενδομητρίου σε διεγερμένους κύκλους με GnRH αγωνιστές ή ανταγωνιστές /γοναδοτροπίνες (τροποποιημένη από τους Bourgain και Devroey,2003). Οι περισσότερες από τις παραπάνω μελέτες αφορούν διέγερση με πρωτόκολλο GnRH αγωνιστές /hmg. Σ αυτό το συγκεκριμένο πρωτόκολλο άμεση επίδραση του αγωνιστή στο ενδομήτριο είναι πιθανή, μια και ο αγωνιστής και ο υποδοχέας του βρίσκονται στον ενδομήτριο ιστό (Ιmai et al.,1994;raga et al.,1998) και ο GnRH mrna εκφράζεται στον υπέρτατο βαθμό του κατά την εκκριτική φάση. Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών ποικίλουν με βάση την χρονική στιγμή στην οποία έλαβε χώρα η βιοψία. Στην μόνη μελέτη στην οποία πραγματοποιήθηκαν βιοψίες κατά την προ ωοθυλακιορρικτική φάση, βρέθηκαν έντονα παραγωγικό ενδομήτριο και πρόωρες εκκριτικές αλλαγές (Marchini et al.,1991).

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 33 -Κατά την ωοθυλακιορρηκτική φάση, παρατηρήθηκε γενικά ενδομήτρια ωρίμανση. Όταν η βιοψία πραγματοποιήθηκε την ημέρα της ωοληψίας (ΟPU) στις ασθενείς με υποψία ενδομήτριου πολύποδα, το 45.5% των κύκλων παρουσίασε προχωρημένη ωρίμανση κατά 2-4 ημέρες (Lass et al.,1998). Mία άλλη μελέτη περιγράφει ασύμφωνη στρωματική ωρίμανση με πρώιμο οίδημα και αγγειακή υπερτροφία στο 91% των βιοψιών δύο μέρες μετα την ωοληψία (OPU+2) (Noci et al.,1997). -Στην πρώιμη και μέση ωχρινική φάση παρουσίαστικαν αλλαγές στην εικόνα του ενδομήτρίου. Σε μελέτες 72-ώρες και 4 μέρες μετά το ΟPU, η ανάπτυξη των αδένων δεν παρουσίασε διαφορά σε διεγερμένους σε σύγκριση με φυσιολογικούς κύκλους ελέγχου (Βarash et al.,1992;macrow et al, 1994). Tην 6 η ημέρα μετά την χορήγηση της χοριακής γοναδοτροπίνης σε κύκλους με ωχρινική υποστήριξη είτε με ενδομυική ή κολπική προγεστερόνη, παρατηρήθηκε φυσιολογική ιστολογία του ενδομητρίου, η οποία αντιστοιχούσε στην αναμενόμενη σε 6 μέρες μετά την ωορρηξία, χωρίς να υπάρχει συσχέτιση με βάση την οδό χορήγησης της προγεστερόνης (Ragni et al.,1999). -Oι βιοψίες στα μέσα της ωχρινικής φάσης έδειξαν αδενικό και στρωματικό δυσσυγχρονισμό με καθυστέρηση της αδενικής ανάπτυξης (Seif et al.,1992; Meyer et al.,1999; Basir et al.,2001). -Στην μελέτη στην οποία πραγματοποιήθηκαν βιοψίες στην όψιμη ωχρινική φάση, 11-13 ημέρες μετά την χορήγηση χοριακής γοναδοτροπίνης, παρατηρήθηκε φυσιολογική ενδομήτρια αναπτυξη (Balasch et al.,1991). To σύνολο των μελετών αυτών έδειξαν μια τάση για προχωρημένη ωρίμανση του ενδομητρίου κατά την ωοθηλακιορρηκτική φάση και μετα- ωοθυλακιορρηκτική φάση, συνοδευόμενη από μια φυσιολογική εικόνα του ενδομητρίου κατά την πρώιμη ωχρινική φάση και επακόλουθη αδενική καθυστέρηση με αδενο-στρωματική δυσυγχρονία στη μέση και όψιμη ωχρινική φάση. Παρόλαυτά, τα αποτελέσματα των άνωθεν μελετών είναι δύσκολο να συγκριθούν. Υπήρξε διάφορα στα είδη των αγωνιστών και στον τρόπο χορήγησης τους καθώς και στην λήψη ή μη ωχρινικής υποστήριξης. Οι μέθοδοι ανάλυσης της ενδομήτριας βιοψίας ποικίλαν από απλή μέθοδο χρονολόγησης σε πολύπλοκη μορφομετρική ανάλυση, ενώ η εφαρμογή των κριτηρίων χρονολόγησης δεν ήταν όμοια με τα αυθεντικά κριτήρια του Noyes.

34 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Θα πρέπει να σημειωθεί, ότι ενώ υπάρχουν αρκετές μελέτες της εκτίμησης του ενδομητρίου κατά τη διάρκεια της ωχρινικής φάσης, δεν υπάρχουν αρκετά δεδομένα για την ιστολογία του ενδομητρίου κατά την ωοθυλακική φάση, με εξαίρεση τις μελέτες των Marchini et al (1991) και Papanikolaou et al (2005). Στη μελέτη των Marchini et al.,1991 η οποία πραγματοποιήθηκε στην όψιμη ωοθυλακική φάση έγινε σύγκριση της ιστολογίας και της δομής του ενδομητρίου πριν τη χορήγηση hcg σε 21 γυναίκες οι οποίες υποβλήθηκαν σε διέγερση για IVF χρησιμοποιώντας για πρωτόκολλο έναν αγωνιστή/hmg, με το προ-ωοθυλακιορρηκτικό ενδομήτριο 20 γυναικών, σε φυσιολογικό κύκλο, οι οποίες παρουσίαζαν προβλήματα υπογονιμότητας. Διαπιστώθηκαν πρώιμες εκκριτικές αλλαγές στη διάρκεια της όψιμης παραγωγικής φάσης ακόμη και πριν παρατηρηθεί αύξηση της προγεστερόνης στον ορό. Ειδικότερα αναφέρθηκε αύξηση των υποπυρινικών κενοτοπίων και της διαμέτρου των αδένων, αλλαγή στο πηλίκο κροσσωτά κύτταρα/μη κροσσωτά υπέρ των κροσσωτών κυττάρων, καθώς και αξιοσημείωτη ανάπτυξη της επιφάνειας και των κυτταροπλασματικών οργανιδίων των επιθηλιακών κυττάρων σε ένα διεγερμένο ενδομήτριο σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Παρά τα πρόωρα εκκριτικά φαινόμενα σημειώθηκαν 6 εγκυμοσύνες στον ίδιο διεγερμένο κύκλο όπως και στη βιοψία,υποδηλώνοντας ότι η πρόγνωση της αναπαραγωγής παραμένει η ίδια. Στη δεύτερη μελέτη των Papanikolaou et al.(2005) ερευνήθηκε η επίδραση της διέγερσης των ωοθηκών κατά την IVF, στη διάρκεια της όψιμης ωοθυλακικής φάσης, στην ιστολογική δομή του ενδομητρίου και στην έκφραση των οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων. 11 γυναίκες οι οποίες παρουσίαζαν προβλήματα υπογονιμότητας έλαβαν μέρος σε πρόγραμμα IVF και δέχθηκαν ωοθηκική διέγερση με ανταγωνιστή GnRH/ανασυνδιασμένη FSH. Η ιστολογική εξέταση των βιοψιών σε φυσιολογικό και διεγερμένο κύκλο δεν έδειξε εκκριτικές αλλαγές. Όμως σε διεγερμένους κύκλους η έκφραση της προγεστερόνης στους αδένες και στο στρώμα αυξάνεται, σε σχέση με τους φυσιολογικούς κύκλους ενώ των οιστρογόνων μειώνεται στους αδένες. Στους IVF κύκλους οι μετρήσεις της προγεστερόνης, αν και παραμένουν σε φυσιολογικές τιμές, είναι συγκριτικά υψηλότερες από ότι σε μη διεγερμένους κύκλους.

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 35 Αν και η μελέτη αυτή δεν έδειξε πρώιμη εκκριτική δραστηριότητα του διεγερμένου ενδομητρίου πριν τη χορήγηση hcg, η έκφραση των οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων στο ενδομήτριο είναι όμοια μ αυτήν η οποία περιγράφεται στις πρώτες ημέρες της ωχρινικής φάσης ενός φυσιολογικού κύκλου. Οι αυξημένες συγκεντρώσεις της οιστραδιόλης στην όψιμή ωοθυλακική φάση μπορεί να είναι υπεύθυνες για το προφίλ των στεροειδών υποδοχέων. Ε. MΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ Η εξειδικευμένη αντίδραση των ιστών στη δράση των στεροειδών ορμονών οφείλεται στην παρουσία των ενδοκυττταρικών ορμονικών υποδοχέων. Διάφορα είδη ιστών όπως το ήπαρ, οι νεφροί και η μήτρα αντιδρούν με παρόμοιο τρόπο. Ο μηχανισμός περιλαμβάνει :1) τη διάχυση της στεροειδής ορμόνης διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, 2) τη δέσμευση της στεροειδής ορμόνης στον πρωτεινικό υποδοχέα, 3) την αλληλεπίδραση του συμπλέγματος ορμόνης-υποδοχέα με το πυρηνικό DNA, 4) τη σύνθεση του αγγελιοφόρου RNA (mrna), 5) τη μεταφορά του mrna στα ριβοσώματα, και τέλος 6) τη σύνθεση της πρωτείνης στο κυτταρόπλασμα. (Σχ.4 ). Oι στεροειδείς ορμονικοί υποδοχείς πρωταρχικά επηρεάζουν την γονιδιακή μεταγραφή αλλά ταυτόχρονα ρυθμίζουν μετά-μεταγραφικά και μη genomic events. Ρυθμίζουν την γονιδιακή μεταγραφή μέσω διαφόρων μηχανισμών χωρίς όμως να απαιτείται πάντα άμεση αλληλεπίδραση με το DNA. Από την στιγμή που οι στεροειδείς ορμόνες συνδεθούν με τον α- ντίστοιχο ορμονικό υποδοχέα ακολουθεί μεταμόρφωση ή ενεργοποίηση του υποδοχέα. Η μεταμόρφωση αφορά αλλαγές στη διαμόρφωση του συμπλέγματος ορμόνης-υποδοχέα και οδηγεί στη δημιουργία μιας θέσης δέσμευσης (binding site) απαραίτητης για τη δέσμευση του συμπλέγματος με τη χρωματίνη. Φυσιολογικά, ο υποδοχέας ενώνεται με πρωτείνες οξείας φάσης (heat shock proteins) οι οποίες σταθεροποιούν και προστατεύουν τον υποδοχέα διατηρώντας το σχήμα του έτσι, ώστε η περιοχή δέσμευσης του DNA (DNA binding region) να παραμένει αναενεργής. Ενεργοποίηση του υποδοχέα πραγματοποιείται με δέσμευση της ορμόνης η οποία προκαλεί αποσύνδεση του συμπλέγματος υποδοχέα και πρωτεινών ο- ξείας φάσης (heat shock proteins).

36 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Το σύμπλεγμα ορμόνη-υποδοχέα δεσμεύεται σε ειδική θέση του DNA και ακολουθεί έναρξη της μεταγραφής της RNA πολυμεράσης. H μεταγραφή οδηγεί στη μετάφραση και μέσω του mrna γίνεται η σύνθεση των πρωτεινών στα ριβοσώματα. Η πρωταρχική δράση των στεροειδών ορμονών είναι η ρύθμιση της ενδοκυτταρικής πρωτεινικής σύνθεσης διαμέσου του μηχανισμού του υποδοχέα. Οι στεροειδείς ορμόνες μεταφέρονται ταχέως δια μέσου της κυτταρικής μεμβράνης μέσω απλής διάχυσης. Oι υπεύθυνοι παράγοντες για τη μεταφορά αυτή είναι άγνωστη, φαίνεται όμως ότι η συγκέντρωση της ελεύθερης ορμόνης καθορίζει την κυτταρική λειτουργία. Από τη στιγμή που η στεροειδής ορμόνη, μέσα στο κύτταρο, συνδέεται με τον αντίστοιχο υποδοχέα ακολουθεί μεταμόρφωση ή ενεργοποίηση του υποδοχέα. Η μεταμόρφωση αφορά αλλαγές στη διαμόρφωση του συμπλέγματος ορμόνης-υποδοχέα, αποκαλύπτοντας ή δημιουργώντας με τον τρόπο μια θέση δέσμευσης του συμπλέγματος με τη χρωματίνη. Σε μη παρουσία της στεροειδής ορμόνης, ο υποδοχέας συνδέεται με πρωτείνες οξείας φάσης (heat shock proteins), οι οποίες προστατεύουν τον υποδοχέα και διατηρούν το διαμορφωμένο σχήμα του έτσι, ώστε να διατηρείται η περιοχή δέσμευσης του DNA (DNA binding region) ανενεργή. Δέσμευση του υποδοχέα από την αντίστοιχη πρωτείνη, προκαλεί ρήξη του συμπλέγματος υποδοχέα και πρωτεινών οξείας φάσης (heat shock proteins) και επακόλουθη ενεργοποίηση του υποδοχέα (Speroff and Fritz,2005). Το σύμπλεγμα ορμόνης-υποδοχέα δεσμεύεται σε συγκεκριμένες θέσεις του DNA (hormone-responsive elements). Η δέσμευση αυτή οδηγεί στην έναρξη της μεταγραφής της RNA πολυμεράσης και με τη σειρά της στη μετάφραση κατά την οποία η mrna μεσολαβεί στην πρωτεινική σύνθεση στα ριβοσώματα. Η κύρια δράση των στεροειδών ορμονών είναι η ρύθμιση της ενδοκυτταρικής πρωτεινικής σύνθεσης δια μέσου του μηχανισμού του υποδοχέα. Η βιολογική δράση του συμπλέγματος ορμόνης-υποδοχέα διατηρείται μόνο και όσον καταλαμβάνει το σύμπλεγμα αυτό την πυρηνική θέση. Το ποσοστό αποσύνδεσης της ορμόνης από τον υποδοχέα καθώς και η ημίσια ζωή του συμπλέγματος της χρωματίνης παίζουν ρόλο στη βιολογική απάντηση καθώς τα στοιχεία ορμονικής απόκρισης (hormone-responsive elements) υπό φυσιολογικές συνθήκες καταλαμβάνουν μικρή έκταση (Webb et al.,1992). Επομένως η διάρκεια έκθε-

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 37 σης της ορμόνης είναι, τόσο σημαντική, όσο η δόση. Ένας από τους λόγους ότι μικρές ποσότητες οιστρογόνου χρειάζονται να είναι παρούσες στην κυκλοφορία είναι η μακρά ημίσια ζωή του συμπλέγματος οιστρογόνου-υποδοχέα. Πράγματι, ο σημαντικότερος παράγοντας ο ο- ποίος συντελεί στο να διαφέρουν μεταξύ τους τα διάφορα είδη οιστρογόνων (οιστραδιόλη,οιστρόνη,οιστριόλη) είναι το χρονικό διάστημα κατά το οποίο το σύμπλεγμα ορμόνη-υποδοχέα απασχολεί τον πυρήνα. Το υψηλό ποσοστό αποσύνδεσης του ισχνού οιστρογόνου (οιστρίολη) μπορεί να αντισταθμιστεί με συνεχή χορήγηση του για να επιτευχθεί παράταση της πυρινικής δέσμευσης και επομένως μεγαλύτερη δράση. Ενώ, η κορτιζόλη και η προγεστερόνη πρέπει να κυκλοφορούν σε μεγάλες συγκεντρώσεις τα αντίστοιχα συμπλέγματα των υποδοχέων έ- χουν μικρή ημίσια ζωή στον πυρήνα. Μία σημαντική δράση του οιστρογόνου είναι η τροποποίηση της ιδίας δράσης του καθώς και της δράσης και άλλων στεροειδών ορμονών επηρεάζοντας τις συγκεντρώσεις των υποδοχέων. Συγκεκριμένα ενισχύουν την ανταπόκριση του ιστού στόχου για το ίδιο το οιστρογόνο, αλλά και για την προγεστίνη και τα ανδρογόνα, αυξάνοντας την συγκέντρωση του υποδοχέα των οιστρογόνων καθώς και ενδοκυτταρικών προγεστενικών και ανδρογονικών υποδοχέων. Από την άλλη μεριά, η προγεστερόνη και η κιτρική κλομιφαίνη περιορίζουν την ανταπόκριση του ιστού στο οιστρογόνο, μειώνοντας με την πάροδο του χρόνου και τη συγκέντρωση των οιστρογονικών υποδοχέων. Η σύνθεση των στεροειδών υποδοχέων, παίρνει μέρος στο κυτταρόπλασμα, αλλά ειδικά η σύνθεση των οιστρογονικών και προγεστενικών υποδοχέων πρέπει να συνοδεύεται με ταχύτατη μεταφορά τους στον πυρήνα (Gerace 1992). Η πυρηνική μεμβράνη περιέχει 3000 με 4000 πόρους. Ένα κύτταρο το οποίο συνθέτει DNA εισάγει περίπου 1 εκατομύριο μόρια ιστόνης (histone) από το κυτταρόπλασμα κάθε 3 λεπτά. Για ένα κύτταρο το οποίο παρουσιάζει ταχεία ανάπτυξη, 3 νέα ριβοσώματα μεταφέρονται κάθε λεπτό στην άλλη κατεύθυνση. Ένα κύτταρο μπορεί να 10.000 εώς 20.000 διαφορετικές πρωτείνες. Η ερώτηση είναι πώς γνωρίζουν ποιά κατεύθυνση πρέπει να ακολουθήσουν; Η απάντηση είναι πως αυτές οι πρωτείνες έχουν σήματα εντοπισμού. Στην περίπτωση των πρωτεινών των υποδοχέων των στεροειδών ορμονών η σηματοδοτική αλληλουχία βρίσκεται στην περιοχή άρθρωσης (hinge region).

38 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Σχ.4. Μηχανισμός δράσης των στεροειδών ορμονών (Speroff and Fritz,2005). Ζ. ΣΤΕΡΟΕΙΔΕΙΣ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΟΥ Οι στεροειδείς υποδοχείς είναι πυρηνικοί ορμονικοί υποδοχείς, οι οποίοι ανήκουν στην υπεροικογένεια των στεροειδών υποδοχέων και λειτουργούν ως συνδετικοί-ρυθμιστικοί παράγοντες μεταγραφής (ligand-regulated transcription factors) (Evans,1988). Η δομή τους αποτελείται από 6 διαφορετικές περιοχές : η αμινο τελική περιοχή (Nterminal A/B domain) η οποία χρησιμεύει ως ενεργοποιητική περιοχή - transactivation domain (AF-1) και είναι η πιό ανοσοενεργή περιοχή του μορίου (Van Laar et al.,1989); η C περιοχή, η οποία αντιστοιχεί σε ένα υψηλό συντηρημένο δακτύλιο Zn (conserved zinc-finger) περιοχής δέσμευσης του DNA (DBD), που καθορίζει τη γονιδιακή εξειδίκευση και συμμετέχει επίσης στο διμερισμό του υποδοχέα (Ηärd et al.,1990); περιοχή D, υπεύθυνη για την δέσμευση του hsp90 και τον πυρηνικό εντοπισμό; περιοχή E, η περιοχή δέσμευσης -the hormone (or ligand) binding domain (HBD) η οποία συμμετέχει στο διμερισμό, την ενεργοποίηση -transactivation (AF-2) και τη δέσμευση του hsp90; και τέλος, η περιοχή F φαινεται να έχει μια ειδική τροποποιητική φάση στην hormone-anti-hormone δράση (Kumar et al.,1987; Misrahi et al.,1987;

ΚΥΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ 39 Katszenellebogen,1996; Moutsatsou and Sekeris,1997; Kacsoh,2000a) (Σχ.5). Σχ. 5. Σχηματική παρουσίαση της δομής του στεροειδού υποδοχέα. Ο ER έχει βραχύ ενώ ο PR μακρύ A/B περιοχή. Διάφορα ισόμορφα των υποδοχέων έχουν περιγραφεί, με διαφορετικές λειτουργίες. Δύο γονίδια των ΕR, αντίστοιχα στο χρωμόσωμα 6 (Enmark et al.,1997) και στο χρωμόσωμα 14 (Gustafsson,1999) κωδικοποιούν για 2 υψηλούς ομόλογους υποδοχείς, ΕRα και ΕRβ (Κuiper et al,1996) (Σχ 6). Η ύπαρξη και άλλων ειδών ΕR έχει ήδη περιγραφεί (Μoutsatsou et al.,1998) ανάμεσα στους οποίους και ένας υποδοχέας συνδεδεμένος με τη μεμβράνη (membrane bound receptor) (Govind and Thampan,2001). Σχ. 6. Σύγκριση των αρχικών δομών των ΕRα και ΕRβ.Οι αριθμοί ορίζουν τις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων, το % ορίζει την ομολογία μεταξύ των δύο υποδοχέων. Δύο ισόμορφα προερχόμενα από ένα μόνο γονίδιο σαν αποτέλεσμα της αντιγραφής από δύο alternative promotors των υποδοχέων της προγεστερόνης (PR), γνωστοί ως PRα και PRβ. Ο PRβ έχει ακριβώς την

40 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ίδια δομή με τον PRα αλλά με αμινοτελική προέκταση από περίπου 164 αμινοξέα (Vegeto et al.,1990). Η λειτουργία των στεροειδών υποδοχέων ρυθμίζεται από τις πρωτείνες οξείας φάσης (heat shock proteins) (hsp). Αυτές οι hsp δρούν σαν μοριακοί σύνδεσμοι (chaperon), αποτρέποντας λανθασμένες αλλλοεπιδράσεις των πρωτεινών και συμμετέχουν στην συνάθροιση των πρωτεινών χωρίς να αποτελούν μέρος της τελικής πρωτείνης (Renoir et al.,1990; Tabibzadeh and Broome,1999). Οι PRα και PRβ συνδέονται με το hsp90 και οι κυτταροπλασμικοί ΕRα και ΕRβ με διάφορα hsp. Για να ασκήσουν την δράση τους οι ορμονικοί υποδοχείς πρέπει να μεταφερθούν μετά την σύνθεση τους στον πυρήνα διαμέσου των πόρων της πυρηνικής μεμβράνης (nuclear pore complex). H μεταφορά αυτή ρυθμίζεται από το σήμα πυρηνικής εντόπισης -Nuclear localization signal (NLS) το οποίο βρίσκεται στη D περιοχή του υποδοχέα. Στο κυτταρόπλασμα, ο υποδοχέας ενεργοποιείται από τον συνδέτη του (ligand). Πρόσδεση στο αγωνιστικό ή ανταγωνιστικό ligand οδηγεί σε διαφορετικές αλλοστερικές αλλαγές στους ορμονικούς υποδοχείς και τους κάνει ικανούς να ασκούν θετική ή αρνητική επίδραση στην έκφραση των στόχων (target) γονιδίων (Beato and Klug,2000). Μετά την αποκοπή από τους συνοδούς (chaperones), ο συνδέτης ο οποίος κατέχει τον υποδοχέα είναι έτοιμος για το διμερισμό διμερή και τη σύνδεση με το DNA σε συγκεκριμένες θέσεις αντιγραφής, στα στοιχεία ορμονικής απόκρισης (HRE) (Tsai and O Malley, 1994) (Σχ.7). Σχ.7.Ο μηχανισμός δράσης των στεροειδών ορμονών.