ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΟΡΩΝ ΤΟΥ HERING ΣΤΙΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2009-2010 ΑΡΙΘΜ. 2479 ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΠΟΡΩΝ ΤΟΥ HERING ΣΤΙΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ ΔΟΜΝΙΚΗΣ Κ. ΓΕΡΑΣΙΜΙΔΟΥ ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΡΟΔΡΟΜΟΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΒΡΕΤΤΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΛΕΝΤΙΝΗ ΤΖΙΟΥΦΑ, ΑΝ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΡΟΔΡΟΜΟΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΒΡΕΤΤΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΛΕΝΤΙΝΗ ΤΖΙΟΥΦΑ, ΑΝ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΑΚΡΙΒΙΑΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΕΥΓΕΝΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΛΟΥΙΖΑ ΑΝΔΡΙΟΠΟΥΛΟΥ-ΟΙΚΟΝΟΜΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ

Στο σύζυγο μου Μάριο και στην κόρη μου Ανδριάνα

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 1 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 Στοιχεία εμβρυολογίας του ήπατος 5 1.2 Βασική ανατομική του ήπατος 10 1.3 Ιστολογία του ηπατικού παρεγχύματος 12 1.4 Λειτουργική μονάδα του ήπατος 14 1.5 Το χοληφόρο δένδρο 19 1.6 Οι πόροι του Hering : Ανατομική δομή, λειτουργία και εστία προγονικών κυττάρων του ήπατος 21 1.7 Μητρικά και προγονικά κύτταρα του ήπατος (liver stem cells and progenitor cells) 24 1.8 Ιστολογικές αλλοιώσεις χρόνιας ηπατίτιδας C 27 1.9 Ιστολογικές αλλοιώσεις μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος (NAFLD) και στεατοηπατίτιδας (NASH) 31 1.10 Ιστολογικές αλλοιώσεις πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης 34 1.11 Αντιδραστικές αλλοιώσεις των ενδοηπατικών χοληφόρων πόρων σε παθήσεις του ήπατος 38 1.12 Αντιγόνα των οποίων η έκφραση διερευνήθηκε στην παρούσα διατριβή 41

2. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 Σκοπός της μελέτης 49 2.2 Υλικό και μέθοδοι 2.2.1 Ιστολογικό υλικό 50 2.2.2 Ιστοχημικές χρώσεις 51 2.2.3 Ανοσοϊστοχημικές χρώσεις 52 2.2.4 Ιστολογική εκτίμηση περιπτώσεων χρόνιας ηπατίτιδας C 55 2.2.5 Ιστολογική εκτίμηση περιπτώσεων NAFLD και NASH 57 2.2.6 Ιστολογική εκτίμηση περιπτώσεων πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης 59 2.2.7 Αξιολόγηση των ευρημάτων των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων 61 2.2.8 Στατιστική ανάλυση 67 2.3 Αποτελέσματα 2.3.1 Κλινικά και ιστολογικά ευρήματα 70 2.3.2 Ανοσοϊστοχημικά ευρήματα 81 2.3.3 Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων 116 2.4 Συζήτηση 131 2.5 Συμπεράσματα 145 3. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 147 4. ΑΓΓΛΙΚΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 149 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 151

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το ήπαρ είναι όργανο ζωτικής σημασίας, η λειτουργία και οι ιδιαιτερότητες του οποίου έχουν αποτελέσει αντικείμενο έρευνας πληθώρας μελετών. Το ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια στρέφεται στην παρουσία προγονικών κυττάρων στο ήπαρ, τα οποία δύνανται να λειτουργήσουν ως πηγή αναγέννησης σε καταστάσεις βλάβης του παρεγχύματος. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν τους πόρους του Hering ως εστία προγονικών κυττάρων του ηπατικού παρεγχύματος. Εντούτοις, οι τελευταίοι λόγω δυσχερούς διάκρισης κατά την ιστολογική εξέταση, διαλάθουν της προσοχής και δεν έχουν μέχρι σήμερα μελετηθεί επαρκώς. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της συμμετοχής των πόρων του Hering σε χρόνιες παθολογικές καταστάσεις του ήπατος, θέτοντας την υπόθεση ότι η βλάβη που υφίστανται οδηγεί σε πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων. Αυτά με τη σειρά τους συμβάλλουν στην αποκατάσταση του ηπατικού παρεγχύματος. Η εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής αυτής είναι το αποτέλεσμα μιας μακρόχρονης και επίπονης προσπάθειας, στην οποία είχα υποστηρικτές και συμπαραστάτες τους οποίους και θέλω να ευχαριστήσω από βάθος ψυχής για την βοήθεια τους. 1

Πρώτα θα ήθελα να ευχαριστήσω ολόψυχα τον επιβλέποντα της διατριβής, Αναπληρωτή Καθηγητή Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ., κ. Πρόδρομο Χυτίρογλου, γιατί μοιράστηκε μαζί μου τις γνώσεις και το πάθος του για το ήπαρ. Χάρη στην αμέριστη συμπαράσταση, την καθοδήγηση και κυρίως τις πολύτιμες συμβουλές του ολοκληρώθηκε αυτή η μελέτη. Ευχαριστώ θερμά την κ. Ελένη Βρεττού, Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ., και την κ. Βαλεντίνη Τζιούφα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ. για τις συνεχή υποστήριξη και την ανεκτίμητη βοήθεια τους όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ θερμά όλα τα μέλη του Παρασκευαστηρίου και κυρίως τις τεχνολόγους κ. Μαρία Μιτσικάρη, κ. Γεωργία Ιωσηφίδου και κ. Αφροδίτη Παγώνη που μου προσέφεραν εγκάρδια την ανεκτίμητη βοήθεια τους. Ευχαριστώ επίσης τον κ. Χαράλαμπο Μιχαλούδη, Μηχανολόγο Μηχανικό, για τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Τέλος, ευχαριστώ τον τέως Διευθυντή Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Παπαδημητρίου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντας μου την εκπόνηση της εργασίας αυτής, καθώς και τον νυν Διευθυντή Καθηγητή κ. Γεώργιο Καρκαβέλα για την ένθερμη συμπαράσταση του κατά τη διάρκεια της εργασίας αυτής. 2

1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3

4

1.1 Στοιχεία εμβρυολογίας του ήπατος Η εμβρυϊκή καταβολή του ήπατος εμφανίζεται κατά το μέσο της τρίτης εβδομάδας της κύησης και αποτελεί εκβλάστηση του έσω βλαστικού δέρματος που επενδύει το οπίσθιο άκρο του προσθίου εντέρου 1. Η εκβλάστηση αυτή, γνωστή και ως ηπατικό εκκόλπωμα ( hepatic diverticulum ) 2, αποτελείται από ταχέως αναπτυσσόμενα επιθηλιακά κυτταρικά στοιχεία που διεισδύουν στο εγκάρσιο διάφραγμα, την μεσοδερμικής προέλευσης πλάκα που αναγνωρίζεται ανάμεσα στην περικαρδιακή κοιλότητα και τον αυχένα του λεκιθικού ασκού. Κυτταρικά στοιχεία προερχόμενα τόσο από το εγκάρσιο διάφραγμα, όσο και από τη μεσεγχυματική επένδυση της κελομικής κοιλότητας, δίνουν γένεση στο συνδετικό υπόστρωμα του ήπατος. Κατά την 4 η εβδομάδα της κύησης στο μεσεγχυματικό στρώμα γύρω από το ηπατικό εκκόλπωμα έχει αναπτυχθεί ένα πλέγμα κολπωδών τριχοειδών αγγείων, που τροφοδοτείται από τη λεκιθική φλέβα και παροχετεύει αίμα από το τοίχωμα του λεκιθικού ασκού, ενώ μικρές αθροίσεις επιθηλιακών κυττάρων επεκτείνονται από το ηπατικό εκκόλπωμα προς το μεσεγχυματικό στρώμα. Καθώς αναπτύσσονται οι ομάδες των επιθηλιακών κυττάρων του ηπατικού εκκολπώματος, διαχωρίζονται σε παχιές αναστομούμενες επιθηλιακές δοκίδες οι οποίες συναντούν και διαπλέκονται με αγγεία του ηπατικού τριχοειδικού πλέγματος, αφορίζοντας έτσι τα αρχέγονα ηπατικά κολπώδη τριχοειδή. Γίνεται λοιπόν αντιληπτό ότι από την 4 η κιόλας εβδομάδα ζωής του εμβρύου τα ηπατοκύτταρα έρχονται σε στενή σχέση με τα 5

κολπώδη τριχοειδή, όπως ακριβώς παρατηρείται στο ηπατικό παρέγχυμα των ενηλίκων. Οι αναφερόμενες επιθηλιακές δοκίδες, τουλάχιστον σε αυτό το στάδιο της ανάπτυξης, αριθμούν αρκετά κύτταρα σε πάχος, σχηματίζοντας έτσι το ονομαζόμενο muralium complex, το οποίο διατηρείται ακόμα και στο παρέγχυμα των νεογνών. Κατά τον 5 ο μήνα μετά τη γέννηση το πάχος των δοκίδων μειώνεται σε δύο επιθηλιακά κύτταρα (muralium duplex), ενώ η τελική μορφή όπως παρατηρείται στο παρέγχυμα των ενηλίκων επιτυγχάνεται μετά το 5 ο έτος της ζωής. Μετά τη δημιουργία των βασικών δομών του ηπατικού παρεγχύματος, αυτό αναπτύσσεται ταχέως πέρα από τα όρια του εγκαρσίου διαφράγματος, αρχικά με τη μορφή δύο συμμετρικών λοβών, του δεξιού και του αριστερού, ενώ μετά την πλήρη ανάπτυξη μόνο μικρή επιφάνεια ελεύθερη περιτοναίου (bare area) έρχεται σε άμεση επαφή με το διάφραγμα. Το ηπατικό εκκόλπωμα αποτελεί την καταβολή τόσο του ηπατικού παρεγχύματος, δηλαδή των μελλοντικών ηπατοκυττάρων, όσο και του καλυπτηρίου επιθηλίου όλου του μήκους του χοληφόρου δένδρου, από το χοληδόχο πόρο μέχρι τους πόρους του Hering. Τη χρονική λοιπόν περίοδο κατά την οποία τα επιθηλιακά κυτταρικά στοιχεία διηθούν το εγκάρσιο διάφραγμα, παρατηρείται λέπτυνση του μίσχου που ενώνει το ηπατικό εκκόλπωμα με το δωδεκαδάκτυλο δίνοντας γένεση στο χοληδόχο πόρο, ενώ από ένα εκκόλπωμα του τελευταίου προκύπτει η χοληδόχος κύστη και ο κυστικός πόρος. 6

Χοληφόρα τριχοειδή αναγνωρίζονται ήδη από την 6 η εβδομάδα της κύησης παρά το γεγονός ότι η παραγωγή χολής δεν ξεκινά πριν τη 12 η εβδομάδα. Αυτά δεν εμφανίζουν πραγματικό τοίχωμα, αλλά αποτελούν χώρους μεταξύ παρακείμενων ηπατοκυττάρων, ανάλογη με τη δομή που παρατηρείται στο εκκριτικό τμήμα των εξωκρινών αδένων. Προσομοιάζουν δηλαδή με τα χοληφόρα τριχοειδή των ενηλίκων, διαφέρουν όμως στον αριθμό των επιθηλιακών κυττάρων που τα περιστοιχίζουν, καθώς στο ονομαζόμενο mularium multiplex γύρω από κάθε χοληφόρο τριχοειδές σε εγκάρσια διατομή μπορεί να αναγνωρίζονται μέχρι και επτά επιθηλιακά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια των πρώτων 7-8 εβδομάδων της ενδομήτριας ζωής δεν αναγνωρίζονται ενδοηπατικοί χοληφόροι πόροι. Η ανάπτυξη των ενδοηπατικών πόρων που συνδέουν τα χοληφόρα τριχοειδή με τους εξωηπατικούς χοληφόρους πόρους ξεκινά κατά την 9 η -10 η εβδομάδα της κύησης, από την αφοριστική πλάκα των ηπατοβλαστών (άωρων ηπατοκυττάρων) που περιστοιχίζουν τους κλάδους της πυλαίας φλέβας στα πυλαία διαστήματα κοντά στην πύλη του ήπατος. Αντίστοιχα προς τις θέσεις αυτές αναγνωρίζεται ένας στίχος κυττάρων που φαίνονται να περιβάλλουν τα μεσεγχυματικά στοιχεία των πρωτόγονων πυλαίων διαστημάτων, σχηματίζοντας την ονομαζόμενη «χοληφόρο πλάκα» (ductal plate) στο νοητό όριο του πυλαίου διαστήματος. Ακολουθεί ο σχηματισμός ενός δεύτερου, διακοπτόμενου στίχου επιθηλιακών κυττάρων με όμοιους μορφολογικούς χαρακτήρες με τα παραπάνω περιγραφόμενα, διπλασιάζοντας έτσι το πάχος της χοληφόρου πλάκας, ενώ από 7

τη 12 η εβδομάδα οι χοληφόρες πλάκες εμφανίζουν ανάπτυξη αυλών. Καθώς συνεχίζεται η διάπλαση του οργάνου, παρατηρείται σχηματισμός οργανωμένου δικτύου αναστομούμενων πόρων, ανάπτυξη ινώδους συνδετικού ιστού και τελικά εμφάνιση των χοληφόρων πόρων εντός των ορίων των πυλαίων διαστημάτων. Η όλη διαδικασία ξεκινά από τους μεγαλύτερους κλάδους κοντά στις πύλες και επεκτείνεται από τα μεγαλύτερα προς τα μικρότερα πυλαία διαστήματα. Εντούτοις, η πλήρης διάπλαση του χοληφόρου δένδρου δεν επιτυγχάνεται παρά μόνο μετά την πάροδο περίπου ενός μηνός από τη γέννηση. Τα παραπάνω ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση ανοσοϊστοχημικών μεθόδων που επέτρεψαν στους ερευνητές να μελετήσουν την πρόοδο της ανάπτυξης του ήπατος. Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι τα πλήρως αναπτυγμένα ηπατοκύτταρα εκφράζουν κυτοκερατίνες, ενδιάμεσα δηλαδή ινίδια των επιθηλιακών κυττάρων, διαφορετικές από αυτές που εκφράζουν τα χολαγγειοκύτταρα. Παρατηρήθηκε έκφραση των κυτοκερατινών 8 και 18, ενώ τα κύτταρα των ενδοηπατικών χοληφόρων επιπρόσθετα παρουσιάζουν έκφραση των κυτοκερατινών 7 και 19. Διαπιστώθηκε επίσης ότι κατά τις πρώτες εβδομάδες της ενδομήτριας ζωής (7-8 εβδομάδες), οπότε και δεν αναγνωρίζονται ενδοηπατικά χοληφόρα, τα άωρα μέχρι τότε ηπατοκύτταρα εκφράζουν τις κερατίνες 8, 18 και 19. Αργότερα με την εμφάνιση της χοληφόρου πλάκας η έκφραση των κυτοκερατινών επιτείνεται στα κύτταρα που την αποτελούν, ενώ τα ηπατοκύτταρα χάνουν την ιδιότητα να εκφράζουν την κυτοκερατίνη 19. Ασθενής έκφραση της κυτοκερατίνης 7 δεν 8

παρατηρείται παρά μόνο μετά την 20 η εβδομάδα της κύησης στους μεγάλους χοληφόρους πόρους. Πλήρης έκφραση της τελευταίας σε όλο το μήκος του χοληφόρου δένδρου παρατηρείται περίπου ένα μήνα μετά τη γέννηση, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι το ενδοηπατικό τμήμα του χοληφόρου συστήματος του ανθρωπίνου ήπατος δεν βρίσκεται σε πλήρη ανάπτυξη αμέσως μετά τη γέννηση. Παρά την κοινή ιστογενετική τους καταγωγή, τα ηπατοκύτταρα και τα χολαγγειοκύτταρα αποτελούν κυτταρικά στοιχεία με ξεχωριστούς μορφολογικούς, λειτουργικούς και ανοσοϊστοχημικούς χαρακτήρες που τα εντάσσουν σε διαφορετικές κατηγορίες επιθηλιακών κυττάρων. Οι μέχρι σήμερα μελέτες δεν πέτυχαν να αποδείξουν ποιοί παράγοντες οδηγούν τους ηπατοβλάστες να διαφοροποιηθούν προς ηπατοκύτταρα ή αντίστοιχα προς χολαγγειοκύτταρα. Εντούτοις σε πειραματικό επίπεδο έχει διατυπωθεί η παρατήρηση (πρώτα διατυπώθηκε από τον Bloom το 1925) ότι η επαφή με τον αναπτυσσόμενο ινώδη συνδετικό ιστό στα πρωτόγονα πυλαία διαστήματα ωθεί τα άωρα ηπατοκύτταρα να διαφοροποιηθούν προς κυτταρικά στοιχεία με χολαγγειακούς χαρακτήρες. Αντίστοιχα η επαφή με το ενδοθήλιο των αγγειακών σχηματισμών προάγει τη διαφοροποίηση προς ώριμα ηπατοκύτταρα. 9

1.2 Βασική ανατομική του ήπατος Το ήπαρ αποτελεί το μεγαλύτερο αδένα του ανθρωπίνου σώματος με ευρύ φάσμα λειτουργιών. Τρεις από τις βασικότερες λειτουργίες του αποτελούν η έκκριση και η απέκκριση χολής στο γαστρεντερικό σύστημα, η συμμετοχή στο μεταβολισμό των υδατανθράκων, των λιπιδίων και των πρωτεϊνών, καθώς και ο καθαρισμός του αίματος από μικρόβια και σωματίδια που πιθανώς εισήλθαν στην κυκλοφορία μέσω του γαστρεντερικού σωλήνα 3. Το ήπαρ βρίσκεται στο άνω μέρος της κοιλιακής χώρας ακριβώς κάτω από το διάφραγμα 4. Το μεγαλύτερό του μέρος προστατεύεται από τον θωρακικό κλωβό, ενώ το διάφραγμα το διαχωρίζει από τον υπεζωκότα, τους πνεύμονες, το περικάρδιο και την καρδιά. Η κάτω επιφάνεια, η οποία έρχεται σε στενή σχέση με την κοιλιακή μοίρα του οισοφάγου, το στόμαχο, το δωδεκαδάκτυλο, τη δεξιά κολική καμπή, το δεξιό νεφρό, το δεξιό επινεφρίδιο και τη χοληδόχο κύστη, καλύπτεται από το περισπλάχνιο πέταλο του περιτοναίου. Κάτω από το τελευταίο αναγνωρίζεται η κάψα του Glisson, μια λεπτή στιβάδα ινώδους συνδετικού ιστού, η οποία περιβάλλει το ήπαρ και εισέρχεται στο παρέγχυμα ακολουθώντας την πορεία της πυλαίας φλέβας, της ηπατικής αρτηρίας και των χοληφόρων πόρων, σχηματίζοντας τα ινώδη έλυτρα του Glisson. Στην περιοχή της πύλης η κάψα του Glisson παχύνεται και περιβάλλει την τριάδα των αγγείων που εισέρχονται στο ήπαρ (πυλαία φλέβα, ηπατική αρτηρία και κοινό χοληφόρο πόρο). 10

Το ήπαρ για λόγους τοπογραφικής ανατομικής διαχωρίζεται στο δεξιό, τον αριστερό, τον τετράπλευρο και τον κερκοφόρο λοβό. Ακολουθώντας όμως την πορεία της τριάδας των αγγείων μέσα στο παρέγχυμα αναγνωρίζουμε μια σειρά από διακλαδώσεις οι οποίες οδηγούν στην διαίρεση του ηπατικού παρεγχύματος σε δυο χειρουργικούς λοβούς (physiological lobes), το δεξιό και τον αριστερό 5. Ακολουθώντας παραπέρα τις διακλαδώσεις το παρέγχυμα διαχωρίζεται σε οριζόντιο επίπεδο σε άνω και κάτω τμήματα. Με βάση αυτό το πρότυπο διακλαδώσεων τελικά αναγνωρίζουμε οκτώ ή εννέα τμήματα, θεωρώντας τον κερκοφόρο ως ξεχωριστό λοβό. Τα εννέα αυτά τμήματα διαχωρίζονται καθώς είναι λειτουργικά αυτόνομα, το καθένα με δική του τριάδα αγγείων και παροχέτευση χολής. Ο διαχωρισμός αυτός έχει ιδιαίτερη σημασία, καθώς αιμοδυναμικές διαταραχές ενός κλάδου της πυλαίας φλέβας μπορούν να επιφέρουν τμηματικές αλλοιώσεις σε ένα τμήμα ή λοβό. Η χρηστικότητα όμως αυτού του διαχωρισμού περιορίζεται λόγω της απουσίας διαφραγματίων ινώδους συνδετικού ιστού που θα καθόριζαν τα όρια εκάστου τμήματος, καθώς και λόγω της τοπογραφίας των διακλαδώσεων της ηπατικής φλέβας. Η τελευταία, σε αντίθεση με την τριάδα των πυλαίων αγγείων, τα οποία ακολουθούν κοινή πορεία μέσα στο παρέγχυμα, διακλαδίζεται ανεξάρτητα και δεν ακολουθεί το ανωτέρω περιγραφόμενο πρότυπο τμηματικού διαχωρισμού του παρεγχύματος. 11

1.3 Ιστολογία του ηπατικού παρεγχύματος Ανάμεσα στα πυλαία διαστήματα και τις κεντρικές φλέβες των λοβίων, εκτείνονται ακτινοειδώς δοκίδες ηπατοκυττάρων 6 συχνά αναστομούμενες, πάχους ενός ηπατοκυττάρου. Στα μικρά παιδιά οι δοκίδες αποτελούνται από δυο ηπατοκύτταρα. Τα ηπατοκύτταρα έχουν διάμετρο 30 40 μ και εμφανίζουν πολυγωνικό σχήμα. Περιέχουν άφθονη ποσότητα κυτταροπλάσματος, υποστρόγγυλους, συχνά πολυπλοειδικούς πυρήνες με ένα ή περισσότερα εμφανή πυρήνια και αδρή κατανομή της χρωματίνης 7. Τα ηπατοκύτταρα πιστεύεται ότι έχουν μέσο όρο ζωής 300 ημέρες, γεγονός που εξηγεί την σπάνια ανεύρεση μιτώσεων στο φυσιολογικό ηπατικό παρέγχυμα. Συχνά αναγνωρίζονται διπύρηνες κυτταρικές μορφές, ιδιαίτερα σε ηλικιωμένα άτομα. Τα ηπατοκύτταρα, ανάλογα με τη θέση εντόπισης στο ηπατικό λόβιο, εμφανίζουν σημαντική ετερογένεια στις μεταβολικές τους λειτουργίες 5. Μεταξύ των ηπατοκυττάρων αναγνωρίζονται τα ηπατικά κολπώδη τριχοειδή, τα οποία εμφανίζουν διάμετρο περίπου 10 μ, με δυνατότητα διάτασης μέχρι και τα 30 μ. Αυτά κατευθύνονται επίσης ακτινοειδώς προς κεντρικές φλέβες και επενδύονται από έναν ασυνεχή στοίχο κυττάρων, η πλειοψηφία των οποίων είναι ενδοθηλιακά κύτταρα 8. Τα κολπώδη τριχοειδή ξεκινούν από τα αγγεία των πυλαίων διαστημάτων και μετά από σειρά αναστομώσεων καταλήγουν στις κεντρικές φλέβες. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολπωδών τριχοειδών διαφέρουν από τα συνήθη ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς στερούνται βασικής 12

μεμβράνης και δεν εμφανίζουν μεσοκυττάριες συνδέσεις. Σχηματίζουν μια λεπτή στιβάδα πάχους 50 80 nm που παρουσιάζει πολλαπλές οπές (θυρίδες) μεγέθους 0,1-1,0 μ. Σε μικρότερους αριθμούς ανευρίσκονται ευμεγέθη φαγοκύτταρα με ωοειδείς πυρήνες, τα κύτταρα Kupffer, τα οποία ανήκουν στο δικτυοενδοθηλιακό σύστημα και μαζί με το σπλήνα συμμετέχουν στην απομάκρυνση των εξαντλημένων ερυθροκυττάρων και άλλων σωματιδίων από την κυκλοφορία. Επίσης παίζουν ρόλο στην παρουσίαση αντιγόνων στα Τ - λεμφοκύτταρα. Ο πληθυσμός των κυττάρων Kupffer είναι αυξημένος σε περιπυλαίες κυρίως θέσεις, ενώ παρουσιάζουν μεταναστευτική ικανότητα με δυνατότητα να κινούνται προς περιοχές ηπατικής βλάβης και προς επιχώριους λεμφαδένες. Μεταξύ του τοιχώματος των τριχοειδών αγγείων και των ηπατοκυττάρων αφορίζεται ο χώρος του Disse, ο οποίος περιέχει πλάσμα και από τον οποίο παροχετεύεται η λέμφος στα λεμφαγγεία των πυλαίων διαστημάτων. Μέσα στο χώρο αυτό, ανευρίσκονται τα αστεροειδή κύτταρα (κύτταρα του Ιto), που περιέχουν σταγονίδια λίπους όπου αποθηκεύεται η βιταμίνη Α, καθώς και λεπτές ίνες κολλαγόνου. Τα αστεροειδή κύτταρα εμφανίζουν κυτταροπλασματικές προσεκβολές που περιβάλλουν τα κολπώδη τριχοειδή. Αναρίθμητες επίσης προσεκβολές αναγνωρίζονται στην επιφάνεια των ηπατοκυττάρων προς τον χώρο του Disse, γεγονός που αυξάνει την συνολική επιφάνεια ανταλλαγής ουσιών μεταξύ των ηπατοκυττάρων και του πλάσματος. Μεταξύ των υπολοίπων κυττάρων που βρίσκονται στο χώρο του Disse, αναγνωρίζεται και σημαντικός αριθμός ΝΚ 13

και ΝΚΤ λεμφοκυττάρων, που θεωρείται ότι συμμετέχουν ως τοπικά ανοσολογικώς ικανά λεμφοκύτταρα. Το χοληφόρο αποχετευτικό σύστημα του ήπατος ξεκινά από τα χοληφόρα σωληνάρια τα οποία σχηματίζουν αναστομούμενο δίκτυο μεταξύ των ηπατοκυττάρων (χοληφόρα τριχοειδή). Τα χοληφόρα τριχοειδή αντιστοιχούν σε λεπτούς σωληνίσκους που σχηματίζονται από τις κυτταροπλασματικές μεμβράνες παρακείμενων ηπατοκυττάρων. Από τη συνένωση παρακείμενων χοληφόρων σωληναρίων προκύπτουν οι πόροι του Hering, οι οποίοι με τη σειρά τους μεταπίπτουν στα χολαγγειόλια στην περιοχή της αφοριστικής πλάκας. Οι πόροι του Hering επενδύονται εν μέρει από ηπατοκύτταρα και εν μέρει από αποπλατυσμένα ή κυβοειδή επιθηλιακά κύτταρα με χολαγγειακή διαφοροποίηση. 1.4 Λειτουργική μονάδα του ήπατος Ως λειτουργική μονάδα κάθε οργάνου προσδιορίζεται το μικρότερο ανατομικά αναγνωρίσιμο τμήμα του, το οποίο μπορεί ανεξάρτητο να επιτελέσει όλες τις φυσιολογικές λειτουργίες του οργάνου. Ο προσδιορισμός μιας τέτοιας μονάδας θα μπορούσε να παρέχει ερμηνεία στην παθοφυσιολογία μιας σειράς αλλοιώσεων που συχνά συνδέουν παρακείμενα πυλαία διαστήματα ή κεντρικές φλέβες. Μέχρι σήμερα κανένα από τα προτεινόμενα μοντέλα δεν μπορεί να συνδυάσει πλήρως τη διπλή 14

αγγειακή παροχή με τη διπλή αποχετευτική οδό (αιμοφόρο και χοληφόρο), γεγονός που αντικατοπτρίζει την πολυπλοκότητα τόσο στην κατασκευή όσο και στη λειτουργία του ήπατος. Η προσπάθεια κατανόησης της μικροαρχιτεκτονικής του ηπατικού παρεγχύματος έγινε αρχικά πριν 150 χρόνια περίπου από τον Kiernan (1836) 9, 10 και αποτελεί σημείο αναφοράς μέχρι και σήμερα. Ο Kiernan εισήγαγε την έννοια του πολυγωνικού ή κλασικού λοβίου 11. Αυτό αντιστοιχεί σε ένα εξάγωνο, μεγέθους περίπου 1 mm, με κεντρικά τοποθετημένη την κεντρική φλέβα, έναν αρχικό κλάδο της ηπατικής φλέβας. Τα όρια κάθε λοβίου περιγράφονται από νοητές γραμμές που ενώνουν τις γωνίες του εξαγώνου. Στις τελευταίες, υπάρχουν τα πυλαία διαστήματα, τα οποία τροφοδοτούν περισσότερα από ένα παρακείμενα ηπατικά λόβια. Κάθε πυλαίο διάστημα περιέχει τρία βασικά ανατομικά στοιχεία: έναν τελικό κλάδο της πυλαίας φλέβας, τελικούς κλάδους της ηπατικής αρτηρίας και χοληφόρους πόρους. Το πρότυπο του κλασσικού λοβίου τονίζει την πορεία των μεταβολικών διεργασιών από τα πυλαία διαστήματα προς τις κεντρικές φλέβες, καθώς και τη φορά ροής της αιματικής κυκλοφορίας και του χοληφόρου αποχετευτικού συστήματος. Αδυνατεί όμως να ερμηνεύσει την παρουσία αλλοιώσεων που συνδέουν παρακείμενα πυλαία διαστήματα. Μια παραλλαγή του κλασσικού λοβίου, το πυλαίο λόβιο, περιγράφηκε από τον Mall (1906) 12. Το πυλαίο λόβιο έχει ένα πυλαίο διάστημα στο κέντρο και τις κεντρικές φλέβες στην περιφέρεια του. Κατανοώντας τις ελλείψεις του κλασσικού λοβίου στην ερμηνεία ποικίλων παθοφυσιολογικών καταστάσεων, ο Rappaport 15

13 το 1954 εισήγαγε την έννοια του απλού και σύνθετου βοτρύου. Προσδιόρισε ως απλό βοτρύο μια μικρή μάζα παρεγχύματος, ακανόνιστου σχήματος και μεγέθους, η οποία αποτελείται από δοκίδες ηπατοκυττάρων που διατίθενται σε ένα στίχο κυττάρων και αναστομώνονται μεταξύ τους. Οι δοκίδες αυτές βρίσκονται τοποθετημένες γύρω από ένα μικρό πυλαίο διάστημα. Το απλό βοτρύο βρίσκεται ανάμεσα σε δυο ή περισσότερους τελικούς κλάδους της ηπατικής φλέβας (κεντρική φλέβα με βάση το κλασσικό λόβιο) και δεν παρουσιάζει ευδιάκριτα όρια. Λόγω της αρχιτεκτονικής του απλού βοτρύου, αυτό χωρίζεται σε ζώνες, από 1 έως 3, με αγγειακή παροχή σταδιακά μειωμένη σε ποσότητα θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου. Συνεπώς η ζώνη 3, η οποία βρίσκεται γύρω από την ηπατική φλέβα, αντιστοιχεί στην περιφέρεια της μικροκυκλοφορίας του απλού βοτρύου. Το κομβικό σημείο του Mall (nodal point of Mall) 5 αντιπροσωπεύει περιοχές όπου συναντώνται προσαγωγά αγγεία από παρακείμενα βοτρύα. Το σύνθετο βοτρύο (complex acinus) αποτελείται από τρία τουλάχιστον απλά βοτρύα και ένα τμήμα παρεγχύματος που περιβάλλει τους κλάδους της πυλαίας φλέβας, της ηπατικής αρτηρίας και του χοληφόρου πόρου πριν το διαχωρισμό τους στους τελικούς τους κλάδους. Αυτό το τμήμα του παρεγχύματος ονομάζεται βοτρυόλιο (acinulus). Τρία ή τέσσερα παρακείμενα σύνθετα βοτρύα με τα συνοδά βοτρυόλια, σχηματίζουν ένα βοτρυοειδές σύμπλεγμα (acinar agglomerate). Μετά από μια εκτεταμένη και επίπονη μελέτη σε τρισδιάστατο επίπεδο ο Matsumoto και οι συνεργάτες του 16

(1979) 14 εισήγαγαν την έννοια του πρωτογενούς και του δευτερογενούς λοβίου (primary and secondary lobule). Σε αυτή τη μελέτη επεσήμαναν τον ρόλο των αγγειωδών διαφραγματίων (vascular septa) στο ηπατικό παρέγχυμα, καθώς δημιουργούν το σκελετό για τη λοβιώδη αρχιτεκτονική του παρεγχύματος. Τα αγγειώδη διαφραγμάτια δεν αποτελούν ινώδη διαφραγμάτια όπως θα ήταν αναμενόμενο, αλλά τελικούς ή τριτογενείς κλάδους της πυλαίας φλέβας, οι οποίοι είναι ελαφρά μεγαλύτεροι σε μέγεθος από τα κολπώδη τριχοειδή και δεν περιβάλλονται από ινώδη συνδετικό ιστό. Τα αγγειώδη διαφραγμάτια καταλήγουν στα κολπώδη τριχοειδή και ονομάζονται πυλαία φλεβίδια. Κάθε πυλαίο φλεβίδιο αποτελεί την οριογραμμή ανάμεσα σε παρακείμενα λόβια. Συνεπώς, ως πρωτογενές λόβιο ορίζεται το κωνοειδούς σχήματος τμήμα ηπατικού παρεγχύματος, το οποίο σχηματίζεται από τα κολπώδη τριχοειδή που ξεκινούν από δυο παρακείμενα πυλαία φλεβίδια και περιλαμβάνει τα εν λόγω πυλαία φλεβίδια με τα κολπώδη τριχοειδή τους, ηπατικά αρτηρίδια, χοληφόρα σωληνάρια και πόρους του Hering. Ως δευτερογενές λόβιο ορίζονται 6 ή 8 πρωτογενή λόβια σε διάταξη ενός εξαγώνου, που ουσιαστικά αντιστοιχεί στο κλασσικό λόβιο. Κατ αυτόν τον τρόπο, το ηπατικό παρέγχυμα, διαχωριζόμενο από πυλαία φλεβίδια, αποτελείται από πρωτογενή και δευτερογενή λόβια. Οι μελέτες έδειξαν επίσης ότι οι περιοχές οι οποίες οριοθετούν το λόβιο αντιστοιχούν σε δύο σαφώς αναγνωρίσιμες ζώνες με βάση την αρχιτεκτονική των αγγείων, τη διαφραγματική και την πυλαία ζώνη. Η πυλαία ζώνη αντιστοιχεί σε μια περιοχή 17

με τη μορφή δρέπανου (sickle zone) η οποία έρχεται σε στενή επαφή με τον κλάδο της πυλαίας φλέβας και αιματώνεται από φλεβίδια, τα οποία ξεκινούν απευθείας από τον ως άνω κλάδο ή από τμήματα των πυλαίων φλεβιδίων που βρίσκεται πολύ κοντά στην έκφυσή τους από τον κλάδο της πυλαίας. Αυτά τα φλεβίδια διαχωρίζονται άμεσα σε κλάδους κολπωδών τριχοειδών, οι οποίοι εκτείνονται αρχικά εγκαρσίως προς την κεντρική φλέβα. Κατόπιν αλλάζουν πορεία και κατευθύνονται ακτινοειδώς προς την τελευταία. Η διαφραγματική ζώνη αντιστοιχεί στην περιοχή των πυλαίων φλεβιδίων. Tα κολπώδη τριχοειδή που ξεκινούν από αυτή την περιοχή δε διαγράφουν εγκάρσια πορεία, παρά εκτείνονται απευθείας ακτινοειδώς προς την κεντρική φλέβα. Ο Matsumoto επεσήμανε ότι η δρεπανοειδής πορεία αιμάτωσης του λοβίου θα μπορούσε να ερμηνεύσει σειρά παθολογικών διεργασιών, όπως η λιπώδης διήθηση και η περιπυλαία νέκρωση. Ο Ekataksin και οι συνεργάτες 15, 16 του με τη σειρά τους περιέγραψαν την μονάδα ηπατικής μικροκυκλοφορίας (hepatic microcirculatory subunit HMS), η οποία αντιπροσωπεύει μια πυραμοειδή ομάδα κολπωδών τριχοειδών. Η ομάδα αυτή εμφανίζει ευρεία βάση προς την πλευρά της πυλαίας φλέβας και τροφοδοτείται από ένα μόνο φλεβίδιο, το οποίο διασπά την αφοριστική πλάκα. Η κορυφή της πυραμοειδούς μονάδας βρίσκεται στο κέντρο του λοβίου, στην κεντρική φλέβα. Έδειξαν επίσης ότι το πρώτο τμήμα του χοληφόρου δένδρου, δηλαδή οι πόροι του Hering, έρχονται σε στενή σχέση με το τροφοφόρο φλεβίδιο της ομάδας αυτής. Έτσι παρατήρησαν ότι η παροχή αίματος γίνεται προς τα ηπατοκύτταρα διαμέσου των κολπωδών 18

τριχοειδών με την πυραμοειδή διαμόρφωση, ενώ η χολή αποχετεύεται μέσω των πόρων του Hering με αντίθετη φορά ακολουθώντας ανάλογη πυραμοειδή πορεία. Παρατήρησαν επίσης την παρουσία ενός ηπατικού αρτηριολίου, του οποίου όμως η σχέση με το τροφοφόρο φλεβίδιο και τους πόρους του Hering δεν έχει πλήρως καθορισθεί. Συνεπώς η ομάδα των ηπατοκυττάρων που σχετίζεται με αυτή τη μονάδα (HMS), φέρει όλα τα απαραίτητα δομικά στοιχεία μιας ηπατικής μονάδας για να λειτουργήσει αυτόνομα. Ο σχηματισμός αυτός, τα ηπατοκύτταρα και η μονάδα ηπατικής κυκλοφορίας, ονομάστηκαν choleohepaton, το οποίο θεωρείται η πρωταρχική ανατομολειτουργική μονάδα του ήπατος. 1.5 Το χοληφόρο δένδρο Σύμφωνα με τις μέχρι σήμερα μελέτες, την απαρχή του χοληφόρου συστήματος σε όλα τα θηλαστικά αποτελούν τα χοληφόρα τριχοειδή, τα οποία στην πραγματικότητα είναι μεσοκυττάριοι χώροι, διαμέτρου 0,5 2,5 μ, μεταξύ παρακείμενων ηπατοκυττάρων. Το τοίχωμά τους σχηματίζεται από τις κυτταρικές μεμβράνες των ηπατοκυττάρων, οι οποίες προβάλλουν με τη μορφή μικρολαχνών στον αυλό τους. Τα χοληφόρα τριχοειδή μεταπίπτουν στους πόρους του Hering. Οι τελευταίοι στην περιοχή γύρω από την αφοριστική πλάκα μεταπίπτουν στα χολαγγειόλια, τα οποία διαθέτουν τόσο 19

ενδολόβιο όσο και ενδοπυλαίο τμήμα. Αυτά με τη σειρά τους εκβάλλουν στους μεσολόβιους πόρους. Σε κάθε πυλαίο διάστημα ανευρίσκονται συνήθως δύο μεσολόβιοι χοληφόροι πόροι, οι οποίοι επαλείφονται από κυβοειδές επιθήλιο και παρουσιάζουν διάμετρο 15-20 μm, ενώ περιβάλλονται από τον ινώδη συνδετικό ιστό των πυλαίων διαστημάτων. Οι μεσολόβιοι πόροι μετά από σειρά διακλαδώσεων εκβάλλουν σε μεγαλυτέρου μεγέθους πόρους, τους διαφραγματικούς πόρους, που ξεπερνούν τα 100 μm σε διάμετρο. Αυτοί επαλείφονται από κυλινδρικά κύτταρα με βασικά τοποθετημένους πυρήνες, αναγνωρίζονται περιφερικότερα των πυλαίων διαστημάτων και περιβάλλονται από πυκνό ινώδη συνδετικό ιστό. Οι μεγαλύτεροι χοληφόροι πόροι της περιοχής των πυλών σχηματίζονται από την αναστόμωση των διαφραγματικών πόρων και έχουν διάμετρο 1-1,5 mm. Επενδύονται επίσης από κυλινδρικό επιθήλιο και καταλήγουν στον κοινό ηπατικό πόρο. Εκτεταμένες μελέτες με τη χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου ανέδειξαν την παρουσία ποικιλίας διακλαδώσεων στην πορεία των χοληφόρων πόρων της περιοχής των πυλών καθώς και την παρουσία εγκολπώσεων (pouches) στο τοίχωμα τους, μέσα στις οποίες η χολή κατά την απέκκριση της από το χοληφόρο σύστημα πιθανώς αποθηκεύεται ή και τροποποιείται. Τα επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων πόρων έχουν τόσο εκκριτικό, όσο και απορροφητικό ρόλο. Περίπου το 40% του συνόλου της απεκκρινόμενης χολής προέρχεται από το επιθήλιο των χοληφόρων πόρων. 20

Το χοληφόρο δένδρο περιλαμβάνει επίσης αδενικά στοιχεία 5, τα οποία αναγνωρίζονται γύρω από τους εξωηπατικούς χοληφόρους πόρους, τους πόρους των πυλών και από τμήματα των μεγαλυτέρων διαφραγματικών πόρων. Αναγνωρίζονται δύο είδη περιπορικών αδένων, οι ενδοτοιχωματικοί και οι εξωτοιχωματικοί. Οι ενδοτοιχωματικοί αδένες επικοινωνούν άμεσα με τον αυλό των χοληφόρων πόρων, ενώ οι εξωτοιχωματικοί σχηματίζουν διακλαδιζόμενα λόβια με εκφορητικούς πόρους, οι οποίοι καταλήγουν τελικά στον αυλό των χοληφόρων πόρων. Οι τελευταίοι είναι οροβλεννοεκκριτικοί αδένες. 1.6 Οι πόροι του Hering: Ανατομική δομή, λειτουργία και εστία προγονικών κυττάρων του ήπατος Μετά την παραγωγή της από το αυλικό άκρο των ηπατοκυττάρων μέσα στα χοληφόρα τριχοειδή, η χολή διοχετεύεται σε μεγαλύτερου διαμετρήματος σωληνίσκους, τους πόρους του Hering. Αυτοί αντιστοιχούν σε λεπτούς σωληνώδεις σχηματισμούς που ενώνουν το ενδολόβιο χοληφόρο σύστημα με το χοληφόρο δένδρο 17. Το τοίχωμά τους διαθέτει βασική μεμβράνη και επενδύεται εν μέρει από ηπατοκύτταρα και εν μέρει από αποπλατυσμένα ή κυβοειδή κύτταρα με χολαγγειακή διαφοροποίηση. 21

Οι πόροι του Hering περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 1867 από τον Ewald K. Hering, o οποίος αναγνώρισε μέσα από την μελέτη της απέκκρισης κυανού του Βερολίνου σε πειραματικά μοντέλα θηλαστικών, την παρουσία πόρων που συνδέουν το σύστημα των χοληφόρων τριχοειδών με το σύστημα των χοληφόρων πόρων και τους οποίους ονόμασε ηπατικά τριχοειδή 18. Παρότι η ανεύρεση των λεπτότατων αυτών πόρων με το οπτικό μικροσκόπιο είναι εξαιρετικά δυσχερής 19, εντούτοις είναι εύκολα αναγνωρίσιμοι με τη χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και μεθόδων ανοσοϊστοχημείας. Η ευκολία στην αναγνώρισή τους μέσω ανοσοϊστοχημικών χρώσεων οφείλεται στην παρουσία στο τοίχωμα τους κυττάρων με χολαγγειολική διαφοροποίηση τα οποία εκφράζουν τις κυτοκερατίνες 7 και 19. Στα όρια των πυλαίων διαστημάτων οι πόροι του Hering μεταπίπτουν στα χολαγγειόλια, τα οποία διαπερνώντας την αφοριστική πλάκα εκβάλλουν στους μεσολόβιους χοληφόρους πόρους. Οι πόροι του Hering ανευρίσκονται κυρίως σε περιπυλαίες θέσεις ή μέχρι τα 2/3 της έκτασης του λοβίου, ενώ ελάχιστοι αναγνωρίζονται σε θέσεις γύρω από τις κεντρικές φλέβες 10. Παρότι η κατανομή τους φαίνεται διάσπαρτη και ακανόνιστη, εντούτοις παρουσιάζει περιοδικότητα η οποία, όπως έχει αποδειχθεί, ανέρχεται σε έναν πόρο του Hering ανά 10μm μήκους χοληφόρου πόρου 20, γεγονός που συμφωνεί με τις παρατηρήσεις του Matsumoto σχετικά με τη δομή τoυ πρωτογενούς και δευτερογενούς λοβίου. Επιπρόσθετες μελέτες έδειξαν ότι η χολή μέσω του σύνθετου δικτύου χοληφόρων τριχοειδών, το οποίο 22

αναγνωρίζεται εντός του ηπατικού λοβίου με τη μορφή πλέγματος, καταλήγει σε συγκεκριμένο πόρο του Hering 16. Η παροχέτευση της χολής προς τα πυλαία διαστήματα σε πειραματικά μοντέλα επιμύων φαίνεται να διευκολύνεται από συσταλτική ικανότητα που εμφανίζει το τοίχωμα των πόρων του Hering 20. Η σύγχρονη άποψη είναι ότι το πραγματικό όριο μετάπτωσης μεταξύ των ηπατοκυττάρων και του χοληφόρου αποχετευτικού συστήματος δεν βρίσκεται στην αφοριστική πλάκα, όπως είχε υποτεθεί παλαιότερα, αλλά κατά μήκος των πόρων του Hering 21, λαμβάνοντας την όψη ακτινοειδών προσεκβολών με κατεύθυνση προς το κέντρο του ηπατικού λοβίου. Συνεπώς, αποτελούν το πιο απομακρυσμένο τμήμα του χοληφόρου δέντρου που επενδύεται, έστω και κατά ένα μέρος, από χολαγγειολικού τύπου κύτταρα. Η στενή σχέση των πόρων του Hering με την χολαγγειολική υπερπλασία, όπως παρατηρείται σε ποικιλία οξειών και χρόνιων ηπατοπαθειών, μελετήθηκε με τη βοήθεια ανοσοϊστοχημικών χρώσεων 22 και τρισδιάστατης απεικόνισης του παρεγχύματος. Τα ευρήματα από τις μελέτες αυτές ενισχύουν την άποψη ότι οι κυτταρικοί σχηματισμοί που συνθέτουν την καλούμενη χολαγγειολική αντίδραση (υπερπλασία) αντιστοιχούν σε έντονα υπερπλασσόμενους και διακλαδιζόμενους πόρους του Hering, ενώ σε περιπτώσεις με εκσεσημασμένη απώλεια ηπατοκυττάρων, παρατηρείται αναγέννηση κυττάρων με χαρακτήρες ηπατοκυττάρων, χολαγγειοκυττάρων ή ενδιάμεσους από κύτταρα των πόρων του Hering. Φαίνεται λοιπόν ότι οι πόροι του Hering αποτελούνται ή περιέχουν ηπατικά προγονικά 23

κύτταρα, τα οποία σε καταστάσεις βαρειάς βλάβης του παρεγχύματος λειτουργούν ως πηγή αναγέννησης 23. 1.7 Μητρικά και προγονικά κύτταρα του ήπατος (Liver stem cells and progenitor cells) Με βάση τον κλασσικό ορισμό τους από τους Potten και Loeffler 24, τα μητρικά κύτταρα των ιστών και οργάνων είναι μικρού μεγέθους και εμφανίζουν πέντε ιδιαίτερα χαρακτηριστικά γνωρίσματα. Πρόκειται δηλαδή για: 1) αδιαφοροποίητα κύτταρα, 2) αυτο-διατηρούμενα, με δυνατότητα να ανανεώνονται (selfmaintaining, self-renewing), 3) πολυδύναμα και ικανά να παράγουν πολλαπλές γενεές απογόνων κυττάρων, 4) ικανά να αναγεννήσουν ιστούς και 5) ευπροσάρμοστα (flexible), ικανά να παρουσιάζουν τους παραπάνω χαρακτήρες 25. Μέσα από τη διενέργεια πολυάριθμων και περίπλοκων πειραματικών μοντέλων που πραγματοποιήθηκαν σε ζωικά πρότυπα καθώς και από παρατηρήσεις σε ανθρώπινους ιστούς 26, προέκυψε συμφωνία μεταξύ των ερευνητών σχετικά με την παρουσία μητρικών κυττάρων στο ήπαρ, παρά τη διχογνωμία σχετικά με τις ιδανικότερες μεθόδους μελέτης ή ακόμα και με την ίδια τη φύση των κυττάρων αυτών 27, 28. Η λειτουργία και ακόμα η επιβίωση αυτών των πολυδύναμων κυττάρων είναι άμεσα συνυφασμένη και ουσιαστικά ελέγχεται από το μικροπεριβάλλον στο οποίο αναγνωρίζονται. Το 24

τελευταίο συχνά αναφέρεται ως «stem cell niche» 29, 30 και προσδιορίζεται ως η ανατομική δομή γύρω από τα μητρικά κύτταρα που τους παρέχει ερεθίσματα με τη μορφή επιφανειακών μορίων, ρυθμίζοντας έτσι τον ρυθμό πολλαπλασιασμού τους, προσδιορίζοντας την εξέλιξη των απογόνων τους και αποτρέποντας το θάνατο και την εξαφάνιση τους 31. Πρόκειται δηλαδή για μια πολυσύνθετη και δυναμική μονάδα που απαρτίζεται από ποικιλία κυτταρικών (όπως τα στρωματικά κύτταρα και τα αγγεία που τροφοδοτούν το σύστημα με φλεγμονώδη κύτταρα) και ακυτταρικών στοιχείων (όπως διαλυτών ή μη πρωτεϊνών και νευρικών ερεθισμάτων). Οι απόγονοι των μητρικών κυττάρων του ήπατος ονομάζονται προγονικά κύτταρα και διατηρούν τη δυνατότητα διαφοροποίησης τόσο προς ηπατοκύτταρα όσο και προς χολαγγειοκύτταρα 32, ανάλογα με το ερέθισμα που προκάλεσε την ενεργοποίηση τους. Εκφράζουν δηλαδή την ιδιότητα του ήπατος να προσαρμόζεται και να ανταποκρίνεται σε στρεσσογόνες συνθήκες 33. Η διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων λαμβάνει χώρα όταν η καταστροφή των ώριμων κυττάρων υπερβεί το «όριο ανοχής» του παρεγχύματος, οπότε και γίνεται εμφανής η παρουσία κυτταρικών μορφών ενδιάμεσων στα ηπατοκύτταρα και στα χολαγγειοκύτταρα. Η κατεύθυνση προς την οποία τελικά θα διαφοροποιηθούν τα προγονικά κύτταρα εξαρτάται απόλυτα από το βαθμό και το είδος των ώριμων κυττάρων που έχει κυρίως προσβάλλει ο βλαπτικός μηχανισμός. Συνεπώς το ηπατικό παρέγχυμα εμφανίζει ετερογένεια (heterogeneity), καθώς διαθέτει τη δυνατότητα επιλογής του 25

είδους της αναγεννητικής απάντησης, ανάλογα με το βλαπτικό παράγοντα, αλλά και πλαστικότητα (plasticity), καθώς τα μητρικά κύτταρα που περιέχει διαθέτουν τη μοναδικότητα να παράγουν διαφορετικού τύπου κυτταρικές σειρές 34. Με βάση την υπόθεση που διατύπωσε ο Sell αναγνωρίζονται τρείς οδοί σύμφωνα τις οποίες μπορεί να αναγεννηθεί το ήπαρ ανάλογα με το είδος του βλαπτικού παράγοντα που επιδρά και την επέκταση της βλάβης : 1) μέσω πολλαπλασιασμού των ώριμων ηπατοκυττάρων, 2) μέσω διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων που ανευρίσκονται στο ενδοηπατικό χοληφόρο δέντρο και 3) μέσω διαφοροποίησης προγονικών κυττάρων που προέρχονται από τα μητρικά κύτταρα της περιπυλαίας ζώνης και συνεπώς από το «stem cell niche». Η απάντηση σε ερεθίσματα μέσω πολλαπλασιασμού των ώριμων ηπατοκυττάρων, όπως παρατηρείται σε τμηματική ηπατεκτομή, είναι άμεση και μπορεί να αφορά μεγάλο αριθμό κυττάρων. Μελέτες έδειξαν ότι υγιή ώριμα ηπατοκύτταρα μπορούν να πολλαπλασιαστούν κατ επανάληψη (περισσότερες από 18 φορές), διατηρώντας αναλλοίωτα τα χαρακτηριστικά τους και την ικανότητα περαιτέρω πολλαπλασιασμού 26. Τις πρώτες ώρες μετά την οξεία ηπατική βλάβη, η παρουσία στοιχείων αναγέννησης είναι πολύ περιορισμένη και συνήθως αντικατοπτρίζεται από την ανεύρεση ολιγάριθμων μικρών κυττάρων με ωοειδή πυρήνα κοντά στα πυλαία διαστήματα, που προφανώς προέρχονται από πόρους του Hering 33, 35. Η διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων που αναγνωρίζονται σε αυτούς, ενεργοποιείται σε προχωρημένα 34 26

στάδια αναγέννησης του παρεγχύματος 36 όταν υπάρχει αναστολή του πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων, κυρίως σε καταστάσεις κεντρολοβιακής βλάβης 34, 37. Κατ αναλογία, η ενεργοποίηση των μητρικών κυττάρων του μικροπεριβάλλοντος της περιπυλαίας ζώνης είναι η απάντηση του παρεγχύματος σε βλάβες με αυτήν την εντόπιση ή σε βλάβες με πολύ εκτεταμένη απώλεια παρεγχυματικών κυττάρων που φθάνει ως την αφοριστική πλάκα. Πρόσφατα πειραματικά και κλινικά δεδομένα στηρίζουν την άποψη ότι σε καταστάσεις εκσεσημασμένης ηπατικής βλάβης κυκλοφορούντα μητρικά κύτταρα του μυελού των οστών μπορούν να παίξουν ρόλο ηπατικών μητρικών κυττάρων. Οι μηχανισμοί που διέπουν την εγκατάσταση και διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων στο ήπαρ βρίσκονται υπό διερεύνηση 38. 1.8 Ιστολογικές αλλοιώσεις χρόνιας ηπατίτιδας C Οι ιστολογικές αλλοιώσεις που παρατηρούνται στη χρόνια λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) εμφανίζουν χαρακτήρες παρόμοιους με αυτούς άλλων χρόνιων ηπατιτίδων και παρουσιάζουν ποικιλία τόσο στην ένταση όσο και στην εξέλιξη τους. Αναγνωρίζονται λοιπόν σε συνδυασμό, φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις και ποικίλες μορφές ηπατοκυτταρικής εκφύλισης, απόπτωση και νέκρωση 39. 27

Στη χρόνια ηπατίτιδα, τα φλεγμονώδη κυτταρικά στοιχεία που συναντώνται στα πυλαία διαστήματα και στα λόβια περιλαμβάνουν κυρίως λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα. Ως ενδολόβια νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα ορίζεται η παρουσία αθροίσεων κυττάρων φλεγμονής στο παρέγχυμα που συνοδεύεται από εκφύλιση και απώλεια ηπατοκυττάρων. Συχνά αναγνωρίζονται αποπτωτικά σωμάτια. Σε ορισμένες περιπτώσεις αναγνωρίζεται συρρέουσα νέκρωση, δηλαδή νέκρωση ικανού αριθμού παρακείμενων ηπατοκυττάρων, συνήθως γύρω από κεντρικές φλέβες. Η διαβρωτική νέκρωση (piecemeal necrosis νεότερος όρος: interface hepatitis) αποτελεί συχνό εύρημα στις χρόνιες ηπατίτιδες και αντιστοιχεί σε νεκροφλεγμονώδη δραστηριότητα στην περιοχή της αφοριστικής πλάκας. Σε περιπτώσεις έντονης βλάβης του παρεγχύματος, αναγνωρίζονται μικρές ομάδες ηπατοκυττάρων με τη μορφή αδενοειδών ή σωληνωδών σχηματισμών στον ινώδη συνδετικό ιστό και τα φλεγμονώδη στοιχεία των πυλαίων διαστημάτων. Αυτές οι «ροζέτες» πιθανολογείται ότι αντιπροσωπεύουν τις προσπάθειες αναγέννησης του παρεγχύματος από εναπομείναντα ηπατοκύτταρα ή από προγονικά κύτταρα. Τέλος, σε βαριές περιπτώσεις, παρατηρείται «γεφυροποιός» νέκρωση, δηλαδή συρρέουσα νέκρωση που συνδέει κεντρικές φλέβες με πυλαία διαστήματα. Μπορεί επίσης να παρατηρηθεί πανλοβιακή ή πολυλοβιακή νέκρωση. Η παράταση της χρόνιας φλεγμονής οδηγεί σταδιακά σε ίνωση του ηπατικού παρεγχύματος. Αυτή αντικατοπτρίζει την εξέλιξη και τη βαρύτητα της νόσου, ενώ γίνεται εμφανής από τα 28

αρχικά ακόμα στάδια με την εναπόθεση συνδετικού ιστού στα πυλαία διαστήματα και σε περιπυλαίες θέσεις. Καθώς η νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα στις περιοχές αυτές σχετίζεται με κολλαγονοποίηση του χώρου του Disse και εναπόθεση ουσιών που προέρχονται από ενεργοποίηση των αστεροειδών κυττάρων (κύτταρα του Ito) 40, η ίνωση στα πρώτα στάδια της νόσου λαμβάνει τη μορφή «αραχνοΰφαντων» ταινιών ινώδους συνδετικού ιστού, που περιβάλλουν τις ηπατικές δοκίδες. Με την εξέλιξη της νόσου οι ταινίες αυτές επιτείνονται και σχηματίζουν ινώδεις γέφυρες που συνδέουν παρακείμενα πυλαία διαστήματα. Η προσπάθεια του παρεγχύματος για επούλωση κεντρολοβιακών περιοχών νέκρωσης έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ταινιών ινώδους συνδετικού ιστού, ενώ επαναλαμβανόμενα επεισόδια νέκρωσης που αφορούν τη ζώνη 3 του λοβίου οδηγούν στη δημιουργία διαφραγματίων που τείνουν να ενώσουν πυλαία διαστήματα με κεντρικές φλέβες 41 ή ακόμα και κεντρικές φλέβες μεταξύ τους. Η προοδευτική ίνωση σε συνδυασμό με την αναγεννητική δραστηριότητα του παρεγχύματος οδηγεί στην ανάπτυξη όζων που περιβάλλονται από ινώδη διαφραγμάτια, δηλαδή στην κίρρωση. Οι αλλοιώσεις που περιγράφηκαν παραπάνω είναι όμοιες με αυτές που παρουσιάζει οποιαδήποτε χρόνια ηπατίτιδα και εμφανίζουν ποικιλία τόσο στην ένταση όσο και στην δυνατότητα εξέλιξής τους. Εντούτοις, στην λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C, αναγνωρίζονται συνήθως ορισμένες χαρακτηριστικές αλλοιώσεις, οι οποίες παρότι δεν είναι ειδικές της νόσου, πιθανολογούν την παρουσία του HCV. H παρουσία 29

λεμφοκυτταρικών αθροίσεων στα πυλαία διαστήματα, ή ακόμα και οργανωμένων λεμφοζιδίων με εμφανή βλαστικά, κέντρα αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα της χρόνιας ηπατίτιδας C. Ανάλογες αθροίσεις μπορεί να παρατηρηθούν σε λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας B ή σε περιπτώσεις αυτοάνοσης ηπατίτιδας, η συχνότητά τους όμως είναι μεγαλύτερη στην ηπατίτιδα C. Επίσης ενδεικτική αλλοίωση της λοίμωξης από τον HCV αποτελεί η ανεύρεση εκφυλιστικών αλλοιώσεων στο επιθήλιο των χοληφόρων πόρων των πυλαίων διαστημάτων, που αντιπροσωπεύεται από κενοτοπίωση, πολυστιβάδωση και συνωστισμό των επιθηλιακών κυττάρων. Οι παραπάνω αλλοιώσεις συχνά συνοδεύονται από διήθηση του επιθηλίου από λεμφοκύτταρα. Χρήσιμο στοιχείο αξιολόγησης που μπορεί να συμβάλει στη διαφορική διάγνωση τέτοιων αλλοιώσεων σε σύγκριση με την βλάβη των χοληφόρων πόρων, όπως αυτή παρατηρείται στην πρωτοπαθή χολική κίρρωση, είναι η διατήρηση της βασικής μεμβράνης των πόρων που υφίστανται τη βλάβη. Η λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C συνοδεύεται από στεάτωση, συνήθως μικτού μικρο- και μεγαλοκενοτοπιώδους τύπου, σε ποσοστό που φθάνει έως το 72% των ασθενών. Η στεάτωση αυτή συνήθως είναι ήπιου έως μέτριου βαθμού. Βαρύτερη στεάτωση παρατηρείται σε λοίμωξη με το γονότυπο 3 του HCV, ή σε συνύπαρξη στεατοηπατίτιδας, αλκοολικής νόσου ή άλλων μεταβολικών νοσημάτων. Ήπια εναπόθεση αιμοσιδηρίνης σε ηπατοκύτταρα των κολπωδών τριχοειδών είναι συχνό εύρημα. Τέλος, ας σημειωθεί ότι η γεφυροποιός νέκρωση στη χρόνια ηπατίτιδα C αποτελεί σπάνιο εύρημα. 30

1.9 Ιστολογικές αλλοιώσεις μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος (NAFLD) και στεατοηπατίτιδας (NASH) Μέχρι σήμερα η ιστολογική εκτίμηση, κυρίως με τη μορφή βιοψιών δια βελόνης, αποτελεί τη βάση της διάγνωσης της μη σχετιζόμενης με το αλκοόλ λιπώδους νόσου του ήπατος (nonalcoholic fatty liver disease - NAFLD). Αυτή έχει δύο μορφές: την απλή στεάτωση ή λιπώδες ήπαρ ( simple steatosis or fatty liver ) και τη μη σχετιζόμενη με το αλκοόλ στεατοηπατίτιδα (nonalcoholic steatohepatitis - NASH) που αποτελεί την εξελικτική μορφή της NAFLD, θεωρείται πλέον η συχνότερη μορφή χρόνιας ηπατικής νόσου στις δυτικές χώρες και αποτελεί εκδήλωση/επιπλοκή του μεταβολικού συνδρόμου που οφείλεται σε αντίσταση των ιστών στην ινσουλίνη 42. Οι αλλοιώσεις που συνθέτουν το μορφολογικό φάσμα της NAFLD προσομοιάζουν με αυτές που παρατηρούνται στην αλκοολική νόσο του ήπατος, αφορούν όμως άτομα που αποδεδειγμένα δεν πραγματοποιούν κατάχρηση αλκοόλ. Αν και συχνά υπάρχουν αλλοιώσεις που εντοπίζονται σε πυλαίες ή περιπυλαίες θέσεις, η νόσος πρωταρχικά αφορά τη ζώνη 3 του παρεγχύματος. Ιδιαίτερα κατά τα αρχικά στάδια της νόσου οι αλλοιώσεις που αναγνωρίζονται είναι αναστρέψιμες, καθώς όμως εγκαθίσταται ίνωση του παρεγχύματος η δυνατότητα επανόρθωσης των αλλοιώσεων μειώνεται. Καθώς η διάκριση ανάμεσα στην απλή στεάτωση και στην NASH συχνά παρουσιάζει δυσκολίες, ορίσθηκε ότι για τη διάγνωση της στεατοηπατίτιδας απαιτείται κατ ελάχιστον η 31

παρουσία τριών αναγνωριζόμενων αλλοιώσεων: στεάτωσης, αεροσφαιροειδούς εκφύλισης των ηπατοκυττάρων και ενδολόβιας νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας 43, 44. Με τον όρο στεάτωση χαρακτηρίζεται η παρουσία λιπώδους εκφύλισης, η ανεύρεση δηλαδή λιποσταγονιδίων στο κυτταρόπλασμα των ηπατοκυττάρων 45, με τη βαρύτητα της οποίας φαίνεται να σχετίζεται η κατανομή των αλλοιώσεων της NAFLD 46. Με τον όρο αεροσφαιροειδής εκφύλιση 47, 48 χαρακτηρίζονται οι αλλοιώσεις των ηπατοκυττάρων που εμφανίζουν βλάβη ορατή με το οπτικό μικροσκόπιο με τη μορφή διόγκωσης, απόκτησης υποστρόγγυλου σχήματος και χαρακτηριστικής διάταξης ενδοκυττάριων οργανιδίων. Παρά το ότι κύτταρα με αεροσφαιροειδή εκφύλιση αναγνωρίζονται σε ποικίλες παθήσεις του ήπατος, εντούτοις η παρουσία τους σε κεντρολοβιακές θέσεις στηρίζει τη διάγνωση. Η παρουσία κυττάρων με αεροσφαιροειδή εκφύλιση συχνά σχετίζεται με το σχηματισμό σωματίων Mallory (Mallory bodies ή Mallory hyalin). Τα τελευταία συνήθως είναι μικρά και ατελώς σχηματισμένα στη NASH και δεν εμφανίζουν την τυπική ροπαλοειδή μορφολογία που παρατηρείται στην αλκοολική ηπατίτιδα (κεντρολοβιακές θέσεις) ή σε χρόνια χολόσταση (περιπυλαίες θέσεις). Ο όρος ενδολόβια νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα 47 που χρησιμοποιείται στη στεατοηπατίτιδα και σε άλλες ηπατοπάθειες, αντικατοπτρίζει την παρουσία κυττάρων φλεγμονής, μεμονωμένων ή σε αθροίσεις στα λόβια, σε συνδυασμό με εκφύλιση και απώλεια ηπατοκυττάρων. Τα κύτταρα φλεγμονής περιλαμβάνουν πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα, 32

λεμφοκύτταρα (κυρίως CD3+ T- λεμφοκύτταρα) και μακροφάγα. Οι αθροίσεις εντοπίζονται κυρίως στη ζώνη 3 του λοβίου και είναι συνήθως αραιές (<2 εστίες ανά 200Χ ΟΠ). Παρατηρείται επίσης ενεργοποίηση των κυττάρων Kupffer. Επιπλέον, συνήθως παρατηρούνται ήπιες φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις στα πυλαία διαστήματα, Δευτερεύοντα ρόλο στη διάγνωση της στεατοηπατίτιδας έχει η παρουσία αποπτωτικών κυττάρων, παρά το γεγονός ότι ο βαθμός στεάτωσης επηρεάζει σημαντικά την έκταση της απόπτωσης. Μια άλλη αλλοίωση που μπορεί να παρατηρηθεί σε περιπτώσεις στεατοηπατίτιδας είναι η ανεύρεση μεγαμιτοχονδρίων με διάσπαρτη κατανομή που δε φαίνεται να σχετίζεται με το βαθμό ίνωσης της νόσου ή την παρουσία κυττάρων με αεροσφαιροειδή εκφύλιση. Μελέτες έδειξαν ότι η παρουσία τους υποδηλώνει βλάβη ή προσπάθεια προσαρμογής των μιτοχονδρίων σε ερεθίσματα. Άλλες αλλοιώσεις που μπορεί να παρατηρηθούν περιλαμβάνουν την παρουσία λιποφαγοκοκκιωμάτων, λιπωδών κύστεων, πυρήνων γλυκογόνου και εναποθέσεων αιμοσιδηρίνης σε κύτταρα Kupffer, ενδοθηλιακά κύτταρα και περιπυλαία ηπατοκύτταρα. Τον σημαντικότερο ρόλο στην εξέλιξη της NASH διαδραματίζει ο βαθμός της ίνωσης με τη χαρακτηριστική για τη στεατοηπατίτιδα περιδοκιδώδη κατανομή στη ζώνη 3 τουλάχιστον κατά τα αρχικά στάδια. Σε αυτά η ίνωση εμφανίζεται με τη μορφή εναπόθεσης κολλαγόνων ινών κατά μήκος των κολπωδών τριχοειδών, χωρίς συνήθως την παρουσία αλλοιώσεων σε περιπυλαίες θέσεις (στάδιο ίνωσης 1). Μπορεί 49, 33

επίσης να παρατηρηθεί κεντρική υαλοειδής σκλήρυνση, όπως στην αλκοολική ηπατίτιδα. Με την εξέλιξη της νόσου, η ίνωση αφορά πυλαίες και περιπυλαίες θέσεις (στάδιο 2), ενώ η παρουσία γεφυροποιού ίνωσης ορίζει το στάδιο 3. Η εγκατεστημένη κίρρωση χαρακτηρίζεται ως στάδιο 4. 1.10 Ιστολογικές αλλοιώσεις πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης (PBC) Πρόκειται για χρόνια φλεγμονώδη νόσο του ήπατος, που προκαλεί εκφύλιση και καταστροφή των μικρών ενδοηπατικών χοληφόρων πόρων, με αποτέλεσμα αδυναμία απέκκρισης της χολής, ανάπτυξη ινώδους συνδετικού ιστού και τελικά κίρρωση. Η ακριβής αιτιολογία της νόσου δεν είναι πλήρως κατανοητή 50, εντούτοις θεωρείται ότι είναι αυτοάνοση, λόγω της παρουσίας αντιμιτοχονδριακών αυτοαντισωμάτων (ΑΜΑ) 51. Οι αρχικές αλλοιώσεις είναι εστιακές και τμηματικές με αποτέλεσμα μεγάλη ποικιλία στην ιστολογική εικόνα μεταξύ βιοψιών σε ασθενείς με PBC, καθώς και δυσκολία διάγνωσης στα πρώιμα στάδια, επειδή μπορεί να μη συμπεριλαμβάνονται οι χαρακτηριστικές αλλοιώσεις των χοληφόρων πόρων 45. Κατά τα πρώιμα στάδια της νόσου παρατηρείται χρόνια φλεγμονώδης διήθηση των πυλαίων διαστημάτων με συμμετοχή άφθονων λεμφοκυττάρων και πλασματοκυττάρων και μεταξύ τους ουδετερόφιλων και ηωσινόφιλων πολυμορφοπυρήνων 34

λευκοκυττάρων. Τα λεμφοκύτταρα ορισμένες φορές συρρέουν σε σχηματισμό λεμφοζιδίων με βλαστικά κέντρα. Η παρουσία μεμονωμένων, διάσπαρτων ή σε μικρές αθροίσεις ιστιοκυττάρων με επιθηλιοειδείς χαρακτήρες είναι επίσης συχνό εύρημα. Αυτά μπορεί να ανευρίσκονται σε σχηματισμό μη τυροειδοποιούμενων κοκκιωμάτων, σε στενή σχέση με χοληφόρους πόρους ή και σε ενδολόβιες θέσεις 5. Η καταστροφή των μικρού μεγέθους χοληφόρων πόρων με διάμετρο έως 100 μm αποτελεί την πρώτη ιστολογικά ανιχνεύσιμη αλλοίωση της νόσου. Τα επιθηλιακά κύτταρα αυτών εμφανίζονται διογκωμένα, με ηωσινόφιλη χροιά ή κενοτοπιώδες κυτταρόπλασμα και ασάφεια του αυλικού άκρου. Οι πυρήνες συχνά είναι πυκνωτικοί. Το επιθήλιο μπορεί να εμφανίζει επίσης υπερπλαστικές αλλοιώσεις, πολυστιβάδωση και φλεγμονώδεις διηθήσεις κυρίως από λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα. Αυτές, σε συνδυασμό με τη βλάβη της βασικής μεμβράνης, προκαλούν ρήξη του χοληφόρου πόρου. Οι παραπάνω αλλοιώσεις των χοληφόρων πόρων συνθέτουν την καλούμενη «ανθηρή βλάβη» (florid duct lesion) 52 ή καταστρεπτική χολαγγειίτιδα (suppurative destructive cholangitis) 53, η οποία αποτελεί διαγνωστικό εύρημα της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης, που όμως παρατηρείται σε σχετικά περιορισμένο αριθμό βιοψιών. Η υπόθεση ότι το επιθήλιο των χοληφόρων πόρων εμφανίζει ετερογένεια μέσω ποικιλίας στην έκφραση σε μόρια προσκόλλησης, σε απάντηση σε κυτοκίνες και σε αυξητικούς παράγοντες, μπορεί να προσφέρει ικανοποιητική ερμηνεία στην 35

ιδιαίτερη προτίμηση της νόσου για καταστροφή αποκλειστικά των μικρού μεγέθους χοληφόρων πόρων μέσω της στοχευμένης ανοσοκατευθυνόμενης βλάβης 51. Επιπρόσθετα στοιχεία υποστηρίζουν την άποψη ότι η καταστροφή των χοληφόρων πόρων δεν αφορά τίποτα περισσότερο από «παράπλευρη απώλεια» του μηχανισμού αυτοανοσίας που προκαλεί την πάθηση 54. Η σταδιακή απώλεια χοληφόρων πόρων οδηγεί με την πάροδο του χρόνου σε χολαγγειολική υπερπλασία. Η βλάβη στα λόβια γίνεται εμφανής από την παρουσία διάσπαρτων λεμφοκυττάρων και αφρωδών ιστιοκυττάρων στα κολπώδη τριχοειδή, καθώς και μεμονωμένων αποπτωτικών ηπατοκυττάρων με τη μορφή οξύφιλων σωματίων. Παρατηρείται επίσης υπερπλασία των κυττάρων Kupffer. Έχει παρατηρηθεί καταστροφή και απώλεια πόρων του Hering που φαίνεται να ευθύνεται, εν μέρει τουλάχιστον, για την ενδολόβια φλεγμονή 55. Και σε ορισμένες περιπτώσεις για ηπατοκυτταρική υπερπλασία με πάχυνση των ηπατικών δοκίδων (πάχος 2 ηπατοκυττάρων). Η υπερπλασία αυτή μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό όζων με αποτέλεσμα ηπατομεγαλία και πυλαία υπέρταση 56. Καθώς η νόσος εξελίσσεται, παύει να περιορίζεται στα όρια των πυλαίων διαστημάτων και παρατηρείται επέκταση της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας στο παρέγχυμα γύρω από αυτά. Έτσι, αναπτύσσεται ποικίλου βαθμού, αλλά συνήθως ήπια διαβρωτική νέκρωση, που προσομοιάζει με αυτήν που παρατηρείται στη χρόνια ηπατίτιδα. Επιπρόσθετα, διακρίνονται αλλοιώσεις χρόνιας χολόστασης, συνήθως σε συνδυασμό με προϊούσα ίνωση και ανάπτυξη κίρρωσης. Στις τελευταίες 36

συμπεριλαμβάνεται η παρουσία διογκωμένων περιπυλαίων ηπατοκυττάρων με κοκκιώδες ελαφροχρωματικό κυτταρόπλασμα που περιέχει κοκκία χαλκού και σε προχωρημένες περιπτώσεις σωμάτια Mallory. Αναγνωρίζονται επίσης χολοστατικές ηπατοκυτταρικές ροζέτες, ξανθωματικά κύτταρα και χολικά «έμφρακτα». Η χολαγγειολική υπερπλασία συνήθως εξαφανίζεται με την εξέλιξη της νόσου και την ανάπτυξη περιδοκιδώδους ίνωσης. Σε προχωρημένες περιπτώσεις η εξαφάνιση των χοληφόρων πόρων είναι ιδιαίτερα εμφανής, ενώ η επίταση της ηπατοκυτταρικής βλάβης και της φλεγμονώδους διήθησης σε περιπυλαίες θέσεις έχουν ως αποτέλεσμα τη σταδιακή ανάπτυξη ίνωσης με σχηματισμό διαφραγματίων 57. Αυτά κατά κανόνα εκτείνονται μεταξύ παρακείμενων πυλαίων διαστημάτων. Οι νεκροφλεγμονώδεις αλλοιώσεις γύρω από τα διαφραγμάτια προσομοιάζουν με αυτές γύρω από τα πυλαία διαστήματα. Τα διαφραγμάτια εμφανίζουν πυκνή σύσταση σε κεντρικές θέσεις και είναι οιδηματώδη στην περιφέρεια, με αποτέλεσμα να εμφανίζουν εικόνα διαυγούς άλω στα όρια με τα ηπατοκύτταρα. Το κιρρωτικό ήπαρ της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης εμφανίζει μακροσκοπικά μεγάλο μέγεθος και μικροοζώδη αρχιτεκτονική λόγω της επικράτησης των χολοστατικών χαρακτηριστικών της νόσου και της έντονης ίνωσης με πυλαιο-πυλαίες συνδέσεις. 37

1.11 Αντιδραστικές αλλοιώσεις των ενδοηπατικών χοληφόρων πόρων σε παθήσεις του ήπατος Σε καταστάσεις ηπατικής βλάβης, αναγνωρίζεται συχνά αύξηση του πληθυσμού των επιθηλιακών κυττάρων στην περιφέρεια της αφοριστικής πλάκας, η οποία χαρακτηρίζεται ως χολαγγειολική αντίδραση 18, 58. Παρά το γεγονός ότι ο όρος αυτός δεν είναι πλήρως δόκιμος, εντούτοις έχει γίνει διεθνώς αποδεκτό και υποδηλώνει μια σειρά φαινομένων τα οποία θεωρείται ότι έχουν σαν κύριο στόχο την αναγέννηση του ηπατικού παρεγχύματος και την αποκατάσταση των κατεστραμμένων ηπατοκυττάρων και χοληφόρων πόρων, λειτουργώντας ως πιθανός συνδετικός κρίκος ανάμεσα στα τελευταία. Εκτεταμένες έρευνες συγκλίνουν στο ότι το επιθηλιακό στοιχείο των αντιδράσεων αυτών μπορεί να προέρχεται από διάφορες πηγές, δηλαδή από τις τελικές διακλαδώσεις του χοληφόρου δένδρου 59, από προγονικά κύτταρα του ήπατος, από μητρικά κύτταρα της κυκλοφορίας 60 ή από ηπατοκύτταρα (με χολαγγειακή μεταπλασία) 61, 74. Μέσα από την μελέτη αυτών των αλλοιώσεων προέκυψαν στοιχεία που υποδηλώνουν την παρουσία πολυδύναμων κυττάρων 63, 34, τα οποία έχουν τη δυνατότητα διαφοροποίησης τόσο προς ώριμα ηπατοκύτταρα 64, όσο και προς επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων πόρων σε καταστάσεις με βλάβη του ηπατικού παρεγχύματος. Στις περιοχές χολαγγειολικής αντίδρασης παρατηρείται αυξημένος αριθμός (υπερπλασία) των μικρών χοληφόρων (χολαγγειολίων) στην περιοχή της αφοριστικής πλάκας, η οποία 38

συνοδεύεται κατά τα αρχικά τουλάχιστον στάδια, από οίδημα και διηθήσεις με πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα. Όταν η χολαγγειολική αντίδραση είναι έντονη, τα υπερπλαστικά χολαγγειόλια παρέχουν την εικόνα αναστομούμενων σωληνίσκων. Εκτός από τις παθήσεις των ενδοηπατικών και εξωηπατικών χοληφόρων, των οποίων η χολαγγειολική αντίδραση αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα, συχνά σε συνδυασμό με χολόσταση, η αντίδραση αυτή μπορεί να παρατηρηθεί σε μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό σε μεγάλη ποικιλία ηπατοπαθειών. Στις χρόνιες ιογενείς ηπατίτιδες, στην αλκοολική ηπατίτιδα και στη NASH οι χολαγγειολικές αντιδράσεις είναι κατά κανόνα ήπιες, εκτός εάν η νόσος έχει φθάσει στο στάδιο της κίρρωσης. Ιδιαίτερη σημασία έχει δοθεί στην παρουσία ενδιάμεσων κυττάρων (intermediate hepatobiliary cells) στις χολαγγειολικές αντιδράσεις 23, δηλαδή κυττάρων που συνδυάζουν χαρακτήρες ηπατοκυττάρων και κυττάρων των χοληφόρων πόρων, σε καταστάσεις όπου υπάρχει σημαντικής βαρύτητας βλάβη του ηπατικού παρεγχύματος. Αυτά είναι κύτταρα με διάμετρο μεγαλύτερη των κυττάρων των πόρων του Hering, αλλά μικρότερη των ηπατοκυττάρων. Μελέτες των ενδιάμεσων κυττάρων έδειξαν στοιχεία που υποδηλώνουν χαρακτήρες τόσο ηπατοκυττάρων όσο και χολαγγειοκυττάρων, όπως η ταυτόχρονη έκφραση αντιγόνων των ηπατοκυττάρων και των χολαγγειολίων και η παρουσία δομικών χαρακτηριστικών, όπως ο σχηματισμός βασικής μεμβράνης που χαρακτηρίζει τα χολαγγειοκύτταρα και χοληφόρου τριχοειδούς που χαρακτηρίζει τα ηπατοκύτταρα. Τόσο με τη χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου όσο και με την 39

τρισδιάστατη μελέτη και ανακατασκευή του ηπατικού παρεγχύματος προέκυψαν δεδομένα που συνηγορούν ότι αυτά τα κύτταρα προέρχονται από την ενεργοποίηση πολυδύναμων μητρικών κυττάρων 65, 36, τα οποία βρίσκονται στο χοληφόρο δένδρο και ειδικότερα στους πόρους του Hering 63, 55, 21. Σε ορισμένα μάλιστα πρότυπα μελέτης, φαίνεται ότι παρόμοιες δυνατότητες έχουν και μητρικά κύτταρα της κυκλοφορίας που προέρχονται από το μυελό των οστών 60. Στην προσπάθεια των μελετητών να κατανοήσουν την υπερπλασία των μικρών χοληφόρων πόρων στις χολαγγειολικές αντιδράσεις και να πραγματοποιήσουν διαφορική διάγνωση ανάμεσα στην εξωηπατική από την ενδοηπατική χολόσταση 53, ορισμένοι συγγραφείς διέκριναν τη χολαγγειολική υπερπλασία σε τυπική και άτυπη (typical and atypical ductular proliferation) 18. Θεωρήθηκε ότι τα τυπικά χολαγγειόλια χαρακτηρίζονται από αυλό, ο οποίος επενδύεται από κυβοειδή κύτταρα και προέρχονται από την διαφοροποίηση προϋπαρχόντων χολαγγειολίων σε καταστάσεις απόφραξης του χοληδόχου πόρου ή άλλων μεγάλων χοληφόρων. Αντίστοιχα τα άτυπα χολαγγειόλια περιγράφηκαν σαν λεπτοί επιμήκεις σχηματισμοί, οι οποίοι στερούνται ευδιάκριτου αυλού, επενδύονται από αποπλατυσμένο επιθήλιο και εκτείνονται ακανόνιστα εντός του ηπατικού παρεγχύματος σε παθήσεις με χρόνια χολόσταση. Η παρουσία πολυδύναμων προγονικών κυττάρων σχετίσθηκε στενά με την άτυπη χολαγγειολική υπερπλασία. Λόγω όμως της πολυπλοκότητας των μηχανισμών που οδηγούν στη βλάβη του παρεγχύματος, της υποκειμενικής φύσης της εκτίμησης της 40

χολαγγειολικής υπερπλασίας και του γεγονότος ότι τα σύγχρονα απεικονιστικά μέσα αναδεικνύουν σχετικά εύκολα την παρουσία εξωηπατικής απόφραξης, πολλοί σύγχρονοι μελετητές συνιστούν την αποφυγή των όρων τυπική και άτυπη χολαγγειολική υπερπλασία 18. 1.12 Αντιγόνα των οποίων η έκφραση διερευνήθηκε στην παρούσα διατριβή: α) Κυτοκερατίνη 7 Τα ενδιάμεσα ινίδια (intermediate filaments) αποτελούν μια ξεχωριστή κατηγορία κυτταροπλασμικών ινιδίων, ενδιαμέσου μεγέθους μεταξύ των μικροσωληνίσκων (microtubules) και των μικροϊνιδίων (microfilaments), με διάμετρο μεταξύ 7 και 11 nm. Με τη βοήθεια ανοσολογικών, βιοχημικών και μοριακών τεχνικών διαπιστώθηκε ότι στα κύτταρα και στους ιστούς τα ενδιάμεσα ινίδια αντιπροσωπεύονται από πέντε διαφορετικές ομάδες πρωτεϊνών που συντελούν στην οργάνωση και σταθερότητα των κυττάρων: τη δεσμίνη στα κύτταρα των μυών, τα νευροϊνίδια στα νευρικά κύτταρα, τα ινίδια της γλοίας, τη βιμεντίνη στα μεσεγχυματογενή κύτταρα, και τις κερατίνες ή κυτοκερατίνες στα επιθηλιακά κύτταρα 66, 67. Οι κυτοκερατίνες αποτελούν τη μεγαλύτερη υποκατηγορία των ενδιάμεσων ινιδίων και διαχωρίζονται σε δυο υποομάδες: 41

τύπου Ι (όξινες) και τύπου ΙΙ (ουδέτερες και βασικές). Τα επιθηλιακά κύτταρα μπορούν να ταξινομηθούν με βάση την παρουσία κυτοκερατινών, οι οποίες εκφράζονται με τη μορφή πολυπεπτιδίων ανά ζεύγη, καθένα από τα οποία αποτελείται από μια κυτοκερατίνη τύπου Ι και μια κυτοκερατίνη τύπου ΙΙ 67, 68. Η κυτοκερατίνη 7 αναγνωρίζεται σε αρκετούς ιστούς, όπως στο κυλινδρικό και αδενικό επιθήλιο των πνευμόνων, του μαστού και του τραχήλου της μήτρας, στα αθροιστικά σωληνάρια του νεφρού, στο μεταβατικό επιθήλιο της ουροδόχου κύστης και στο μεσοθήλιο, ενώ απουσιάζει από το γαστρεντερικό επιθήλιο, τα άπω και εγγύς σωληνάρια του νεφρού και τα μυοεπιθηλιακά κύτταρα 69. Η έκφρασή της στους παραπάνω ιστούς και ιδιαίτερα σε συνδυασμό με την έκφραση άλλων αντιγόνων, προσφέρει σημαντική βοήθεια στην καθημέρα πράξη, τόσο στη διαφορική διάγνωση πρωτοπαθών και μεταστατικών νεοπλασμάτων, όσο και καλοήθων αλλοιώσεων 70, 71, 72, 73. Στο φυσιολογικό ηπατικό παρέγχυμα η έκφραση της κυτοκερατίνης 7 περιορίζεται στους χοληφόρους πόρους, ενώ απουσιάζει από τα ηπατοκύτταρα 67. Εντούτοις, από τη μελέτη παθήσεων του ηπατικού παρεγχύματος, έχει διαπιστωθεί ότι τόσο τα προγονικά και τα ενδιάμεσα κύτταρα που αναγνωρίζονται σε περιοχές χολαγγειολικής αντίδρασης, όσο και ποικίλος αριθμός ηπατοκυττάρων μπορούν να εκφράσουν την συγκεκριμένη κυτοκερατίνη 74, 75, 76. Διαπιστώθηκε επίσης ότι ο βαθμός και η κατά περιοχές έκφραση της κυτοκερατίνης αυτής είναι συνυφασμένες με την παθογένεια της νόσου και το στάδιο εξέλιξης της 74, 77, 78. 42

β) Επιθηλιακός παράγοντας προσκόλλησης EpCAM Ο επιθηλιακός παράγοντας προσκόλλησης EpCAM είναι μια επιθηλιακή γλυκοπρωτεϊνη 40 kda η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο GA733-2 79 και προάγει την προσκόλληση των κυττάρων μέσω δράσης ανεξάρτητης της αντλίας ασβεστίου (Ca 2 + -independent) 80. Στο παρελθόν είχε αναγνωρισθεί πολλές φορές από ανεξάρτητες μελέτες ως πρωτεΐνη γονιδίου που σχετίζεται με νεοπλάσματα. Σε διάφορες μελέτες είχε δοθεί στο αντιγόνο αυτό το όνομα του εκάστοτε αντισώματος που το αναγνώριζε, με αποτέλεσμα η ίδια γλυκοπρωτεϊνη στη βιβλιογραφία να αποκαλείται EGP34, 17-1A, EGP-2, HEA125, GA733-2, ESA, KSA, KS1-4, MK-1 και TROP-1. Λόγω των δυσκολιών που αντιμετωπίζονται από τη χρήση πολλαπλών ονομάτων για την ίδια πρωτεΐνη, προτάθηκε η αποκλειστική χρήση του ονόματος EpCAM 81 καθώς αντιπροσωπεύει την δυνατότητα της πρωτεΐνης να δρα ως μόριο προσκόλλησης ειδικό για τα επιθηλιακά κύτταρα, αλλά και ως μόριο ενεργοποίησης. Στην ίδια πρόταση συμπεριλήφθηκε και η αναφορά του δείκτη κυτταρικής διαφοροποίησης για τον EpCAM, δηλαδή CD326. O EpCAM είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου I, η οποία δεν προσομοιάζει δομικά με καμία από τις τέσσερις μεγάλες οικογένειες μορίων προσκόλλησης (κατχερίνες, ιντεγκρίνες, σελεκτίνες και ανοσοσφαιρίνες). Έχουν όμως αναφερθεί στοιχεία που υποδηλώνουν ομοιότητες με τυπικά μόρια προσκόλλησης, τα οποία αναγνωρίζονται συνδεδεμένα με μικροϊνίδια ακτίνης 82. Καθώς πολυάριθμες μελέτες ανέδειξαν την 43

υπερέκφραση του εν λόγω παράγοντα σε ποικιλία νεοπλασμάτων 82, μελετήθηκε διεξοδικά η πιθανή χρήση του ως στόχου σε υποψήφιες θεραπείες νεοπλασμάτων, οι οποίες βασίζονται σε αντισώματα 83, 84. Οι περισσότεροι επιθηλιακής προέλευσης ιστοί είναι θετικοί στον παράγοντα EpCAM, με εξαίρεση τα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας, τα γαστρικά οξεοπαραγωγά κύτταρα, τα μυοεπιθηλιακά κύτταρα, τα φλοιώδη επιθηλιακά κύτταρα του θύμου και τα ηπατοκύτταρα 85, 86. Εντούτοις, σε μελέτες που αφορούσαν το ηπατικό παρέγχυμα εμβρύων παρατηρήθηκε θετικότητα τόσο των ηπατοκυττάρων όσο και των χοληφόρων πόρων 86. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στο γεγονός ότι ομάδες κυττάρων με χαρακτήρες ενδιάμεσους μεταξύ ηπατοκυττάρων και επιθηλιακών κυττάρων των χοληφόρων πόρων που σχετίζονται με αναγεννητικές διεργασίες του παρεγχύματος, εμφανίζουν θετικότητα στον παράγοντα. Αντίθετα, τα ώριμα ηπατοκύτταρα είναι αρνητικά στη χρώση για τον EpCAM 86. Νεότερες μελέτες απέδωσαν τη θετική χρωστική αντίδραση του παράγοντα στο ηπατικό παρέγχυμα των εμβρύων, στην παρουσία αυξημένου αριθμού ηπατοβλαστών, δηλαδή διδύναμων προγονικών κυττάρων με δυνατότητα διαφοροποίησης προς ηπατοκύτταρα και χολαγγειοκύτταρα και όχι στη θετικότητα ώριμων ηπατοκυττάρων 85. Με βάση τα παραπάνω προέκυψε ότι κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των προγονικών κυττάρων του ήπατος προς ηπατοκύτταρα, η έκφραση, σε επίπεδο ανοσοϊστοχημείας, του EpCAM φθίνει παράλληλα με τη σταδιακή μορφολειτουργική τους διαφοροποίηση 85. Αντίθετα, η θετικότητα των επιθηλιακών 44

κυττάρων των χοληφόρων πόρων παραμένει, με εξαίρεση το επιθήλιο των μεγάλων χοληφόρων πόρων 86. Το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε επιπλέον στη διαπίστωση ότι σε περιοχές όπου παρατηρείται βλάβη του ηπατικού παρεγχύματος των ενηλίκων με αναγεννητική δραστηριότητα του τελευταίου, αναγνωρίζεται εκ νέου έκφραση του EpCAM στα αναγεννώμενα/πολλαπλασιαζόμενα ηπατοκύτταρα 87, 88. Αυτό πιθανόν οφείλεται σε ανάπλαση του παρεγχύματος από προγονικά κύτταρα που βρίσκονται τους πόρους του Hering 89. Μετά την πλήρη διαφοροποίηση των κυττάρων σε λειτουργικώς ώριμα ηπατοκύτταρα, η έκφραση του παράγοντα χάνεται και πάλι. 45

46

2. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 47

48

2.1 Σκοπός της μελέτης Διερευνήσαμε τη συμμετοχή των πόρων του Hering σε χρόνιες παθολογικές καταστάσεις του ήπατος. Ο λόγος για τον οποίο επελέγη η μικρότερη αυτή μονάδα του αποχετευτικού συστήματος της χολής ως αντικείμενο διατριβής είναι διπλός: πρώτον, κατά την ιστολογική εξέταση οι πόροι του Hering διακρίνονται δυσχερώς και ως εκ τούτου τυχόν σημαντικές μεταβολές τους δεν έχουν μέχρι τώρα μελετηθεί. Δεύτερον, έχει πρόσφατα καταδειχθεί η παρουσία προγονικών κυττάρων στους πόρους του Hering, γεγονός που τους καθιστά σημαντικότατο παράγοντα παρεγχυματικής αναγέννησης σε οξέα και χρόνια νοσήματα του ήπατος. Η υπόθεση της μελέτης μας είναι ότι η βλάβη που υφίστανται οι πόροι του Hering στις χρόνιες παθολογικές καταστάσεις οδηγεί σε πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων, που συμβάλλει στην αποκατάσταση του ηπατικού παρεγχύματος. Γι αυτό επελέγησαν για μελέτη τρεις χρόνιες παθήσεις με διαφορετικούς μηχανισμούς ηπατικής βλάβης, η χρόνια ηπατίτιδα C, η μη αλκοολική λιπώδης νόσος και η πρωτοπαθής χολική κίρρωση. 49

2.2 Υλικό και μέθοδοι 2.2.1 Ιστολογικό υλικό Με σκοπό τη διερεύνηση των λεπτότερων πόρων του χοληφόρου συστήματος και ειδικότερα των πόρων του Hering, τόσο στο φυσιολογικό ηπατικό παρέγχυμα, όσο και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, μελετήσαμε μια σειρά παρασκευασμάτων φυσιολογικού ηπατικού παρεγχύματος, και παρεγχύματος ασθενών με χρόνιες ηπατοπάθειες 90, 91. Το υλικό προέρχεται από το Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. και περιλαμβάνει συνολικά 103 περιπτώσεις βιοψιών ήπατος δια βελόνης, οι οποίες ελήφθησαν κατά το χρονικό διάστημα 2001 2007. Από τις 103 βιοψίες, 25 αφορούν περιπτώσεις πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης, 30 μη αλκοολικής στεατοηπατίτιδας (NASH) και 37 χρόνιας ηπατίτιδας C. Περιλαμβάνονται επίσης 11 βιοψίες χωρίς αξιόλογες μικροσκοπικές αλλοιώσεις που χρησιμοποιήθηκαν σαν ομάδα σύγκρισης και ελέγχου των ευρημάτων των υπό μελέτη χρόνιων ηπατοπαθειών. Η επιλογή όλων των περιστατικών έγινε τυχαία όσον αφορά το φύλο και την ηλικία των ασθενών. Συμπεριλήφθηκαν αποκλειστικά βιοψίες που υπερέβαιναν τα κατώτατα αυστηρώς αποδεκτά όρια επάρκειας του 1,5 εκ συνολικού μήκους των ιστικών κυλίνδρων 93, 92 και των τουλάχιστον 11 πυλαίων διαστημάτων ανά βιοψία 94, 95. Κατά την επιλογή των περιστατικών της χρόνιας ηπατίτιδας C, 50

περιλήφθηκαν 10 περιπτώσεις σταδίου ίνωσης 1, 10 περιπτώσεις σταδίου ίνωσης 2, 10 περιπτώσεις σταδίου ίνωσης 3 και 7 περιπτώσεις σταδίου ίνωσης 4. 2.2.2 Ιστοχημικές χρώσεις Σε όλες τις βιοψίες ήπατος που εξετάζονται στο Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης πραγματοποιούνται χρώσεις αιματοξυλίνης- ηωσίνης, καθώς και 4 τουλάχιστον ιστοχημικές χρώσεις (Masson, Gomori, PAS-διαστάση και αιμοσιδηρίνης). Για τους σκοπούς της διατριβής αυτής, έγινε προσεκτική επανεκτίμηση όλων των χρώσεων αρχείου των περιστατικών αυτών, με έμφαση στη μορφολογία των χοληφόρων πόρων, των χολαγγειολίων και των πόρων του Hering. Με την ιστοχημική χρώση Masson 96 αναδεικνύονται οι κολλαγόνες ίνες τύπου Ι και ΙΙΙ, καθώς και τα σωμάτια Mallory που συναντώνται συχνά στην αλκοολική νόσο του ήπατος και την NASH. Με την ιστοχημική χρώση Gomori 96 (reticulin silver) αναδεικνύονται οι κολλαγόνες ίνες τύπου ΙΙΙ και IV, καθώς και το πάχος των ηπατικών δοκίδων. Με τη χρώση PAS διαστάσης 96 μελετάται η τυχόν παρουσία παθολογικών πρωτεϊνών (π.χ. βολίων α1-αντιθρυψίνης) και εναποθέσεων χολοχρωστικών και κηροειδούς. Με την ιστοχημική χρώση αιμοσιδηρίνης 96 51

αναδεικνύεται η παρουσία εναποθέσεων σιδήρου με τη μορφή φερριτίνης και αιμοσιδηρίνης. Οι παραπάνω ιστοχημικές χρώσεις εφαρμόζονται σε τομές παραφίνης πάχους περίπου 4 μ, μετά από μονιμοποίηση των ιστοτεμαχίων σε διάλυμα φορμόλης. Ακολουθεί επεξεργασία σε θερμαινόμενα διαλύματα φορμόλης για 150 και 120, και σε ανιόντα διαλύματα αλκοόλης 70 0, 80 0, 96 0, 96 0 και 100 0. Οι τομές παραμένουν για 60 σε καθένα από τα πρώτα δύο διαλύματα αλκοόλης, και 120 αντίστοιχα σε καθένα από τα υπόλοιπα τρία διαλύματα. Έπειτα τα ιστοτεμάχια τοποθετούνται σε διάλυμα ακετόνης για 45 και σε δύο διαλύματα ξυλόλης για 45 και 60 αντίστοιχα. Η διαδικασία της μονιμοποίησης ολοκληρώνεται με εμβάθυνση των ιστών σε υγρή παραφίνη (120 και 90 ). Ακολουθεί τοποθέτηση των ιστοτεμαχίων σε κύβους παραφίνης και λήψη τομών. Η αποπαραφίνωση των τομών γίνεται σε κλίβανο για 60. Οι χρώσεις πραγματοποιούνται με βάση την κλασσική μεθοδολογία 96. 2.2.3 Ανοσοϊστοχημικές χρώσεις Οι ανοσοϊστοχημικές χρώσεις αποτελούν εφαρμογή ανοσολογικών μεθόδων στη μελέτη ιστών και κυτταρικών πληθυσμών και έγιναν με τη μέθοδο αβιδίνης στρεπταβιδίνης ( avidin biotin peroxidase complex, ABC ) 97. Για την ανίχνευση του παράγοντα προσκόλλησης των επιθηλιακών κυττάρων 52

EpCAM χρησιμοποιήθηκε το λυοφιλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα μυός Novocastra NCL-ESA, κλώνος VU-1D9 με αραίωση 1: 100, ενώ για την ανίχνευση της κυτοκερατίνης 7 χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα Dako M7018 OV-TL 12/30 με αραίωση 1:50. Η μέθοδος χρώσεως συνοπτικά έχει ως εξής: χρησιμοποιούνται τομές παραφίνης πάχους 4 μ, οι οποίες τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρα πλακίδια επιστρωμένα με κατάλληλο μέσο συγκόλλησης ιστών. Ακολουθεί αποπαραφίνωση σε κλίβανο στους 60 ο C και σε διαλύματα ξυλόλης (2Χ10 ), επανυδάτωση των τομών μέσω διαβαθμισμένων αλκοολών (100 0, 96 0 και 70 0 ) και εξουδετέρωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης με την εφαρμογή διαλύματος μεθανόλης και υπεροξειδίου του υδρογόνου 0,5 % v/v για 10 λεπτά. Κατόπιν οι τομές ξεπλένονται σε τρεχούμενο νερό. Για την ολοκλήρωση των χρώσεων κυτοκερατίνης 7 οι τομές τοποθετούνται σε διάλυμα κιτρικού οξέος με ph 6.0 σε φούρνο μικροκυμάτων όπου θερμαίνονται για 21 λεπτά (3Χ 7 ) με σκοπό την αποκάλυψη των επιτόπων (epitope retrieval). Ακολουθεί εξουδετέρωση της ενδογενούς βιοτίνης (power block) και επώαση με αραιωμένο πρωτοταγές αντίσωμα για 2-12 ώρες. Κατόπιν οι τομές ξεπλένονται με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα TBS. Ακολουθεί επώαση με κατάλληλο βιοτινυλιωμένο δευτεροταγές αντίσωμα (link label). Στη συνέχεια οι τομές ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS και επωάζονται σε τετραϋδροχλωρική 3,3 διαμινοβενζιδίνη (DAB) για 10, μετά από την οποία ξεπλένονται με νερό. Ακολουθεί χρωματισμός με αιματοξυλίνη. 53

Για την παρασκευή των χρώσεων του παράγοντα των επιθηλιακών κυττάρων EpCAM μετά τη λήψη των τομών παραφίνης, ακολουθήθηκε τυποποιημένη-αυτοματοποιημένη μεθοδολογία με τη χρήση του μηχανήματος Bond Vision Biosystems, όπως αυτή παρέχεται από την προμηθεύτρια εταιρεία. Σύμφωνα με αυτήν πραγματοποιήθηκε αποπαραφίνωση και έπειτα προεργασία των τομών με πρωτεολυτικό ένζυμο 1 για 10. Ακολούθησε επώαση με το αντίσωμα για 20 και ξέπλυμα με ρυθμιστικό διάλυμα TBS. Έπειτα πραγματοποιήθηκε επώαση με βιοτινυλιωμένο δευτεροταγές αντίσωμα, ξέπλυμα με TBS και εφαρμογή του συμπλόκου αβιδίνης στρεπταβιδίνης. Η διαδικασία ολοκληρώθηκε με την εφαρμογή DAB για 10, ξέπλυμα των τομών και χρωματισμός με αιματοξυλίνη. Τελικά, όλες οι τομές υφίστανται αφυδάτωση σε ανιούσα σειρά αλκοολών (70 0, 96 0 και 100 0 ), διαφανοποίηση με ξυλόλη, επικάλυψη και καθαρισμός των τομών. Όλες οι χρώσεις που πραγματοποιήθηκαν για τους σκοπούς της διατριβής αυτής, έγιναν σε άβαφες τομές που είχαν εναπομείνει κατά την αρχική διαγνωστική εκτίμηση των βιοψιών, χωρίς δηλαδή να απολεσθεί ιστολογικό υλικό. 54

2.2.4 Ιστολογική εκτίμηση περιπτώσεων χρόνιας ηπατίτιδας C Στις περιπτώσεις χρόνιας ηπατίτιδας C, η βαθμολόγηση των αναγνωριζόμενων αλλοιώσεων αποτελεί τον ακριβέστερο τρόπο αξιολόγησης της βαρύτητας της νόσου και της δραστηριότητας που αυτή επιδεικνύει. Υπάρχουν διάφορα ημιποσοτικά συστήματα βαθμολόγησης, με τα οποία εκτιμάται ξεχωριστά η ενεργός δραστηριότητα της φλεγμονής και το στάδιο εξέλιξης της νόσου 98. Χρησιμοποιήσαμε το τροποποιημένο σύστημα HAI, με το οποίο βαθμολογούνται τρία χαρακτηριστικά γνωρίσματα της χρόνιας ηπατίτιδας: η διαβρωτική/γεφυροποιός νέκρωση, η ενδολόβια νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα και η φλεγμονή των πυλαίων διαστημάτων. Η διαβρωτική/γεφυροποιός νέκρωση βαθμολογείται με κλίμακα 11 βαθμών (0-10), ενώ η ενδολόβια νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα και η φλεγμονή των πυλαίων διαστημάτων με κλίμακα 5 βαθμών (0-4) αντίστοιχα. Επομένως, το άθροισμα της βαθμολογίας των παραπάνω παραμέτρων στο κάθε υπό μελέτη περιστατικό εμφανίζει εύρος αριθμητικής τιμής από 0 έως 18 και παρέχει τον ιστολογικό βαθμό ενεργού δραστηριότητας (HAI) της φλεγμονής στη δεδομένη χρονική στιγμή της βιοψίας. Με βάση το HAI οι υπό μελέτη βιοψίες χρόνιας ηπατίτιδας C διαχωρίστηκαν σε τρείς ομάδες. Η πρώτη ομάδα (HAI-1) περιελάμβανε βιοψίες με HAI από 0 έως 8 (ομάδα ήπιας ενεργού δραστηριότητας), η δεύτερη ομάδα (HAI-2) βιοψίες με HAI από 9 έως 12 (ομάδα μέτριας ενεργού δραστηριότητας) και η τρίτη 55

ομάδα (HAI-3) βιοψίες με HAI από 13 έως και 18 (ομάδα έντονης ενεργού δραστηριότητας). Επιπρόσθετα όλες οι βιοψίες σταδιοποιήθηκαν ως προς τον βαθμό της ίνωσης με βάση την κατάταξη 5 βαθμών σύμφωνα με το σύστημα METAVIR 100 και την κατάταξη των Hytiroglou et al. 99. Έτσι λοιπόν ως στάδιο 1 ορίσθηκε η ήπια ίνωση που μπορεί να χαρακτηρίζεται από διεύρυνση ορισμένων πυλαίων διαστημάτων και παρουσία βραχέων ινωδών διαφραγματίων με αφετηρία τα πυλαία διαστήματα. Αντίστοιχα, ως στάδιο ίνωσης 2 χαρακτηρίσθηκαν οι περιπτώσεις στις οποίες οι αλλοιώσεις αφορούσαν τα περισσότερα πυλαία διαστήματα με συνύπαρξη πυλαιοπυλαίων ινωδών συνδέσεων. Ως στάδιο ίνωσης 3 χαρακτηρίσθηκαν οι περιπτώσεις στις οποίες παρατηρήθηκε σαφής διαταραχή της αρχιτεκτονικής δομής του παρεγχύματος με παρουσία πυλαιοπυλαίων και πυλαιοκεντρικών ινωδών διαφραγματίων χωρίς όμως σαφή παρουσία κίρρωσης. Το στάδιο ίνωσης 4 αντιστοιχεί στην εγκατεστημένη κίρρωση. 56

Πίνακας 1: Κατάταξη των βιοψιών με βάση το στάδιο ίνωσης. Ίνωση Βαθμός Απουσία ίνωσης 0 Ήπια ίνωση: ίνωση στα πυλαία διαστήματα χωρίς 1 σχηματισμό ινωδών διαφραγματίων Μέτρια ίνωση: ινώδη διαφραγμάτια που εκτείνονται από τα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών 2 λοβίων, χωρίς διαταραχή της αρχιτεκτονικής Έντονη ίνωση: ινώδη διαφραγμάτια που εκτείνονται από τα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων και φθάνουν σε τελικές ηπατικές φλέβες ή σε άλλα 3 πυλαία διαστήματα, με διαταραχή αρχιτεκτονικής ενδεικτική μετάπτωσης σε κίρρωση Κίρρωση 4 2.2.5 Ιστολογική εκτίμηση περιπτώσεων NAFLD και NASH Για την αξιολόγηση των αλλοιώσεων της NAFLD και NASH χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ιστολογικής βαθμολόγησης Nonalcoholic steatohepatitis activity score (NAS) 101 και το αντίστοιχο σύστημα σταδιοποίησης της ίνωσης. Το NAS κάθε περίπτωσης αποτελεί το άθροισμα της βαθμολογίας των τριών επιμέρους αλλοιώσεων και συγκεκριμένα της στεάτωσης, της ενδολόβιας φλεγμονής και της αεροσφαιροειδούς εκφύλισης των 57

ηπατοκυττάρων. Η στεάτωση βαθμολογείται σε κλίμακα 4 βαθμών (0-3) με βάση την αναλογία των ηπατοκυττάρων που περιέχουν λιποσταγονίδια. Ο βαθμός 0 χρησιμοποιείται όταν η στεάτωση δεν αφορά περισσότερα ηπατοκύτταρα από το 5% του συνόλου. Ο βαθμός 1 αντιστοιχεί σε στεάτωση που αφορά το 1/3 των ηπατοκυττάρων της υπό μελέτη βιοψίας, ο βαθμός 2 σε στεάτωση που αφορά το 1/3-2/3 των ηπατοκυττάρων και ο βαθμός 3 σε στεάτωση που αφορά ποσοστό μεγαλύτερο των 2/3 των ηπατοκυττάρων. Η ενδολόβια φλεγμονή βαθμολογείται σε κλίμακα 4 βαθμών (0-3) ως εξής: Ο βαθμός 0 χρησιμοποιείται όταν δεν ανευρίσκονται εστίες φλεγμονής στα λόβια. Ο βαθμός 1 αντιστοιχεί σε παρουσία λιγότερων από 2 εστίες ανά 200Χ οπτικό πεδίο, ο βαθμός 2 σε παρουσία 2-4 εστιών ανά 200Χ οπτικό πεδίο και ο βαθμός 3 αφορά την παρουσία περισσότερων από 4 εστιών ανά 200Χ οπτικό πεδίο. Η αεροσφαιροειδής εκφύλιση βαθμολογείται σε κλίμακα 3 βαθμών (0-2) ως εξής: Ο βαθμός 0 αντιστοιχεί σε απουσία κυττάρων με αεροσφαιροειδή εκφύλιση, ενώ ο βαθμός 1 σε παρουσία ολιγάριθμων ηπατοκυττάρων. Ο βαθμός 2 χρησιμοποιείται όταν η αεροσφαιροειδής εκφύλιση αφορά πολλά εμφανή ηπατοκύτταρα. Επομένως το NAS κάθε περίπτωσης μπορεί να φθάνει έως 8. Η ίνωση βαθμολογείται σε κλίμακα 5 σταδίων (0-4) ως εξής: Ο βαθμός 0 χρησιμοποιείται όταν δεν ανευρίσκεται ίνωση στο παρέγχυμα. Ο βαθμός 1 αφορά την ίνωση που εντοπίζεται 58

στα πυλαία διαστήματα χωρίς σχηματισμό ινωδών διαφραγματίων, ο βαθμός 2 αφορά την παρουσία ινωδών διαφραγματίων που εκτείνονται από τα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων, χωρίς διαταραχή της αρχιτεκτονικής. Ο βαθμός 3 αφορά την παρουσία ινωδών διαφραγματίων που εκτείνονται από τα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων και φθάνουν σε τελικές ηπατικές φλέβες ή σε άλλα πυλαία διαστήματα, με διαταραχή αρχιτεκτονικής ενδεικτική μετάπτωσης σε κίρρωση, ενώ ο βαθμός 4 αντιστοιχεί στην κίρρωση. 2.2.6 Ιστολογική εκτίμηση περιπτώσεων πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης Μέχρι σήμερα έχουν παρουσιαστεί ποικίλα συστήματα βαθμολόγησης 102 και ταξινόμησης 103 της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης. Με βάση το επικρατέστερο 103, ταξινομήσαμε τα περιστατικά σε 4 στάδια εξέλιξης της νόσου: το στάδιο 1 ή πυλαίο στάδιο χαρακτηρίζεται από πυλαία φλεγμονή και καταστρεπτική χολαγγειϊτιδα που εκδηλώνεται με τη μορφή της «ανθηρής βλάβης» των χοληφόρων πόρων. Συχνά η φλεγμονή είναι κοκκιωματώδης. Οι αλλοιώσεις περιορίζονται στα όρια των πυλαίων διαστημάτων, ενώ αυτές που τυχόν παρατηρούνται στα λόβια είναι περιορισμένες. Στο στάδιο 2 ή περιπυλαίο στάδιο παρατηρείται επίταση της φλεγμονώδους διήθησης και επέκταση αυτής πέραν των 59

ορίων των πυλαίων διαστημάτων. Χαρακτηριστικά παρατηρείται χολαγγειολική αντίδραση και συχνά ήπια διαβρωτική νέκρωση. Παρατηρείται επίσης εξαφάνιση χοληφόρων πόρων και ανάπτυξη βραχέων ινωδών διαφραγματίων που διεισδύουν στο παρέγχυμα. Στα περιπυλαία ηπατοκύτταρα μπορεί να ανευρεθούν κοκκία χαλκού. Το χαρακτηριστικό γνώρισμα του σταδίου 3 ή στάδιο διαφραγματίων είναι η ανάπτυξη γεφυροποιού ίνωσης που κατευθύνεται από πυλαία διαστήματα προς παρακείμενα πυλαία διαστήματα. Η παρουσία καταστρεπτικής κοκκιωματώδους χολαγγειϊτιδας είναι λιγότερο έντονη συγκριτικά με το προηγούμενο στάδιο, όμως η εξαφάνιση των χοληφόρων πόρων είναι περισσότερο εμφανής. Το περιπυλαίο παρέγχυμα δείχνει εντονότερα χολοστατικό με παρουσία εναποθέσεων χαλκού, ηπατοκυττάρων με υδρωπική εκφύλιση και κατά θέσεις σωματίων Mallory, καθώς και σταγονιδίων χολής στο κυτταρόπλασμα. Το στάδιο 4 αντιπροσωπεύει την κίρρωση. Το ηπατικό παρέγχυμα εμφανίζει διαταραχή της αρχιτεκτονικής δομής με έντονη ίνωση συνοδευόμενη από οζώδη αναγέννηση. Οι χοληφόροι πόροι στην πλειοψηφία τους απουσιάζουν, ενώ μπορεί να αναγνωρισθούν εστίες κοκκιωματώδους χολαγγειϊτιδας. Το παρέγχυμα εμφανίζει έντονα τα σημεία χολόστασης. 60

2.2.7 Αξιολόγηση των ευρημάτων των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων α) χρώσεις για την κυτοκερατίνη 7 Στις χρώσεις αυτές πραγματοποιήθηκε η καταμέτρηση των πόρων του Hering, αξιολογήθηκε η χολαγγειολική αντίδραση στην παρυφή των πυλαίων διαστημάτων και εκτιμήθηκε η παρουσία ηπατοκυτταρικής αντίδρασης (hepatocellular stress -HS). Ως μάρτυρες της ποιότητας της χρώσης χρησίμευσαν τα επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων πόρων των πυλαίων διαστημάτων. Η καταμέτρηση του αριθμού των πόρων του Hering στις 103 βιοψίες έγινε «τυφλά», χωρίς δηλαδή να γνωρίζει ο εξεταστής κλινικές πληροφορίες ή ιστολογικά στοιχεία. Η εξέταση έγινε με τη χρήση οπτικού μικροσκοπίου στη χρώση για την κυτοκερατίνη 7 σε όλο το μήκος των ιστικών κυλίνδρων. Η αναγνώριση των πόρων του Hering έγινε με βάση τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά. Για τους σκοπούς της μελέτης, ως πόροι του Hering θεωρήθηκαν: α) λεπτοί σωληνώδεις σχηματισμοί εντός των λοβίων που αποτελούνται από κύτταρα ωοειδούς ή κυβοειδούς σχήματος με υψηλή πυρηνοκυτταροπλασματική αναλογία και θετικότητα στην κυτοκερατίνη 7 β) γραμμοειδείς σχηματισμοί εντός των λοβίων αποτελούμενοι από κύτταρα με τα ως άνω χαρακτηριστικά, χωρίς σαφή σωληνώδη μορφολογία 61

γ) μικρές ομάδες ή και μεμονωμένα κύτταρα εντός των λοβίων, με τα ως άνω χαρακτηριστικά. Περιπτώσεις στις οποίες προέκυπτε αμφιβολία ως προς την πραγματική φύση των αναγνωριζόμενων θετικών κυττάρων, αυτά αποκλείονταν από την καταμέτρηση. Ιδιαίτερη σημασία δόθηκε στην απόσταση των καταμετρούμενων πόρων του Hering από τα πυλαία διαστήματα. Καταμετρήθηκαν αποκλειστικά κύτταρα που ανευρίσκονταν σε απόσταση τουλάχιστον μεγαλύτερη του ενός ηπατοκυττάρου από τα όρια των πυλαίων διαστημάτων. Κύτταρα που εμφάνιζαν θετικότητα στην χρώση για την κυτοκερατίνη 7, αλλά βρισκόταν σε άμεση επαφή με τα όρια των πυλαίων διαστημάτων θεωρήθηκαν ότι αφορούν χολαγγειόλια στα πλαίσια υπερπλασίας και δεν καταμετρήθηκαν ως πόροι του Hering. Επίσης έγινε καταμέτρηση των πυλαίων διαστημάτων κάθε βιοψίας. Για τους σκοπούς της μελέτης καταμετρήθηκαν μόνο τα σαφώς αναγνωριζόμενα πυλαία διαστήματα. Στη συνέχεια έγινε αναγωγή του αριθμού των πόρων του Hering ανά μονάδα μήκους της κάθε βιοψίας ( CoH/cm ) και ανά αριθμό πυλαίων διαστημάτων ( CoH/PT ) που αναγνωρίσθηκαν σε κάθε βιοψία. Εκτός από τους πόρους του Hering, η μελέτη των βιοψιών με τη χρώση για την κυτοκερατίνη 7 αποκάλυψε την προσπάθεια του παρεγχύματος για αναγέννηση με τη μορφή της περιγραφόμενης στο Γενικό Μέρος χολαγγειολικής αντίδρασης (DR). Αναγνωρίζονται δηλαδή στην περιφέρεια των πυλαίων διαστημάτων και σε ποικίλους αριθμούς χολαγγειόλια μικρής διαμέτρου, κύτταρα μεμονωμένα ή σε σειρά με χαρακτήρες 62

χολαγγειοκυττάρων, καθώς και κύτταρα με ενδιάμεσους στα χολαγγειοκύτταρα και στα ηπατοκύτταρα χαρακτήρες. Τα τελευταία εμφανίζουν κατά κανόνα ηπιότερη χρωστικότητα στην κυτοκερατίνη 7, από ότι τα επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων πόρων. Η χολαγγειολική αντίδραση βαθμολογήθηκε σε κλίμακα τεσσάρων βαθμών. Σύμφωνα με αυτήν, ο βαθμός DR 0 ισοδυναμεί με μηδενική χολαγγειολική αντίδραση, ενώ ο βαθμός DR 1 με εστιακή χολαγγειολική αντίδραση στην περιφέρεια των πυλαίων διαστημάτων. Ο βαθμός DR 2 δηλώνει την παρουσία χολαγγειολικής αντίδρασης που καταλαμβάνει ποσοστό έως 50% της περιμέτρου του συνόλου των πυλαίων διαστημάτων. Τέλος, ο βαθμός DR 3 δηλώνει την παρουσία χολαγγειολικής αντίδρασης σε έκταση μεγαλύτερη ή ίση με το 50% της περιμέτρου του συνόλου των πυλαίων διαστημάτων ή την παρουσία χολαγγειολικής αντίδρασης σε όλη την περίμετρο ορισμένων πυλαίων διαστημάτων. 63

Πίνακας 2: Διαβάθμιση της χολαγγειολικής αντίδρασης. Χολαγγειολική Αντίδραση (DR) Βαθμός 0 Βαθμός 1 Βαθμός 2 Βαθμός 3 Απούσα Εστιακή (Ήπια) Μέτρια : <50% της περιμέτρου του συνόλου των πυλαίων διαστημάτων Έντονη : 50% της περιμέτρου του συνόλου των πυλαίων διαστημάτων ή 100% της συνολικής περιμέτρου ορισμένων πυλαίων διαστημάτων Κατά τη διάρκεια της αξιολόγησης των βιοψιών με τη χρώση για την κυτοκερατίνη 7, εκτός από την θετικότητα των χοληφόρων πόρων, των πόρων του Hering και της εκάστοτε χολαγγειολικής υπερπλασίας, διαπιστώθηκε σε αρκετές περιπτώσεις ποικίλης έντασης, αλλά συνήθως ήπια θετικότητα ώριμων ηπατοκυττάρων. Η ασυνήθης αυτή χρωστική αντίδραση των ηπατοκυττάρων παρατηρείται με μεγαλύτερη συχνότητα γύρω από ή σε άμεση σχέση με την περιφέρεια των πυλαίων διαστημάτων και φαίνεται να σχετίζεται με παρουσία χολαγγειολικής αντίδρασης, ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής και ηπατοκυτταρικής βλάβης. Για τους λόγους αυτούς ονομάσαμε την αντίδραση αυτή «ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρές» (hepatocellular stress HS) και την αξιολογήσαμε για τους σκοπούς της μελέτης μας με βάση κλίμακα τεσσάρων 64

βαθμών. Ορίσαμε ως βαθμό 0 την απουσία θετικότητας των ώριμων ηπατοκυττάρων στην κυτοκερατίνη 7, ενώ ως βαθμό 1 την παρουσία ήπιας θετικότητας σε μικρό αριθμό ηπατοκυττάρων. Ο βαθμός 2 αντιπροσωπεύει την παρουσία θετικότητας σε μικρές ομάδες ώριμων ηπατοκυττάρων που δεν υπερβαίνουν τα 6-8 ηπατοκύτταρα γύρω από τα πυλαία διαστήματα, ενώ ο βαθμός 3 τη θετική αντίδραση ηπατοκυττάρων που αναγνωρίζονται με τη μορφή μεγάλων ομάδων ή νησίδων γύρω από τα πυλαία διαστήματα. Πίνακας 3: Διαβάθμιση της ηπατοκυτταρικής αντίδρασης στο στρές. Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρές (HS) Βαθμός 0 Βαθμός 1 Βαθμός 2 Βαθμός 3 Απούσα Ήπια : Μικρός αριθμός ώριμων ηπατοκυττάρων Μέτρια : Μικρές ομάδες ώριμων ηπατοκυττάρων που δεν υπερβαίνουν τα 6-8 ηπατοκύτταρα γύρω από τα πυλαία διαστήματα Έντονη : Μεγάλες ομάδες ή νησίδες γύρω από τα πυλαία διαστήματα 65

β) Χρώσεις για τον παράγοντα προσκόλλησης των επιθηλιακών κυττάρων (EpCAM) Κατά την εξέταση των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων για τον EPCAM επιβεβαιώθηκε η γνωστή από άλλες μελέτες θετικότητα των επιθηλιακών κυττάρων που επενδύουν τους μικρούς και μέσου μεγέθους χοληφόρους πόρους, αλλά διαπιστώθηκε και θετικότητα των πόρων του Hering. Επιπλέον, σε περιπτώσεις με χολαγγειολική αντίδραση παρατηρήθηκε θετικότητα ποικίλου αριθμού κυττάρων με ενδιάμεσους χαρακτήρες, καθώς και ηπατοκυττάρων σε παρακείμενες θέσεις. Η αντίδραση αυτή αφορούσε κυρίως μεμβρανική θετικότητα των κυττάρων και εμφάνιζε ποικιλία στην κατανομή, με μεγαλύτερη ένταση στα κύτταρα γύρω από την χολαγγειολική υπερπλασία. Η χρωστική αντίδραση εμφάνιζε συνήθως προοδευτική εξασθένηση στα όρια των ομάδων αυτών. Συχνά ανευρίσκονταν μεμονωμένα ηπατοκύτταρα ή μικρές ομάδες ηπατοκυττάρων σε κεντρικότερες περιοχές του λοβίου που σε ορισμένες περιπτώσεις συνοδευόταν από πόρους του Hering. Για την αποτελεσματικότερη αξιολόγηση της έκφρασης του EpCAM στις βιοψίες διαμορφώσαμε κλίμακα τεσσάρων βαθμών με βάση την έκταση της χρωστικής αντίδρασης των ηπατοκυττάρων και ενδιαμέσων κυττάρων. Συγκεκριμένα, ορίσαμε ως βαθμό 0 την απουσία θετικότητας και ως βαθμό 1 την παρουσία ολιγάριθμων κυττάρων γύρω από 1 έως 2 πυλαία διαστήματα. Ως βαθμός 2 ορίσθηκε η ανεύρεση μικρών ομάδων θετικών κυττάρων (3 έως 6 κυττάρων) γύρω από αρκετά πυλαία 66

διαστήματα ή ινώδη διαφραγμάτια. Τέλος, ως βαθμός 3 ορίσθηκε η παρουσία μεγαλύτερων ομάδων θετικών κυττάρων γύρω από τα πυλαία διαστήματα και ινώδη διαφραγμάτια. 2.2.8 Στατιστική ανάλυση Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση όλων των ιστολογικών και ανοσοϊστοχημικών παραμέτρων με σκοπό την συσχέτιση των μεγεθών τους. Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πακέτο SPSS 16 for Windows. Ανάλογα με τον τύπο των δεδομένων ακολουθήθηκαν οι παρακάτω στατιστικές μέθοδοι: Ανάλυση Μεταβλητότητας (Analysis of Variance ANOVA) Έλεγχος σημαντικότητας ανεξαρτήτων δειγμάτων (Independent T-tests) Μη παραμετρικός έλεγχος κατά Kruskal Wallis Έλεγχος σταθερότητας της μεταβλητότητας (Homogeneity Test) Έλεγχος σημαντικότητας κατά Pearson X 2 Για να εξακριβωθεί κατά πόσο οι τιμές μιας συνεχούς τυχαίας μεταβλητής εξαρτώνται από τις τιμές κάποιου παράγοντα διενεργήθηκε έλεγχος μεταβλητότητας επαναλαμβανομένων μετρήσεων (ANOVA). Ο παράγοντας που μελετάται είναι μια ανεξάρτητη μεταβλητή η οποία εξετάζεται σε διάφορα επίπεδα. 67

Με τη μέθοδο ANOVA ελέγχεται η διαφορά των μέσων τιμών των εξεταζομένων παραγόντων. Ως επίπεδο σημαντικότητας ορίζουμε το α=5% (ή 1- α=95%) και αναγνωρίζουμε μικρές μόνο διακυμάνσεις στα όρια του (π.χ. 0,054). Ο δείκτης των αποτελεσμάτων του ελέγχου που μας ενδιαφέρει είναι η σημαντικότητα (p-value), η οποία δηλώνει την πιθανότητα σφάλματος δευτέρου είδους (Type II errors) στις μεθόδους και τους ελέγχους που διενεργούμε. Με τον όρο σφάλμα δευτέρου είδους εννοούμε την πιθανότητα να γίνει αποδεκτή μια υπόθεση που στην πραγματικότητα είναι εσφαλμένη. Στην πράξη, συγκρίνουμε το p-value με το επίπεδο σημαντικότητας α που έχουμε αρχικά ορίσει και εφόσον είναι χαμηλότερο δεχόμαστε ότι υπάρχει εξάρτηση μεταξύ των εξεταζομένων παραγόντων. Προκειμένω να διαπιστώσουμε αν τηρούνται οι προϋποθέσεις για τη διενέργεια του ελέγχου ANOVA, έγινε έλεγχος επάρκειας. Ένας από τους βασικούς ελέγχους επάρκειας αφορά την ομοιογένεια των μεταβλητοτήτων μεταξύ των εξεταζόμενων δειγμάτων (Homogeneity Test). Οι υπόλοιπες βασικές προϋποθέσεις είναι να εξετάζονται α) τυχαίες και ανεξάρτητες τιμές, β) που ακολουθούν κανονική κατανομή με μέση τιμή 0. Όταν έστω και μια υπόθεση παραβιάζεται, τότε τα αποτελέσματα των σχετικών ελέγχων θα πρέπει να γίνονται αποδεκτά με επιφύλαξη. Ειδικότερα για τον έλεγχο της ισότητας των μεταβλητοτήτων, διεξάγεται σχετικό στατιστικό πείραμα κατά 68

Levene, και τα αποτελέσματα ερμηνεύονται με παρόμοιο τρόπο όπως και στην ανάλυση μεταβλητότητας (ANOVA). Στις περιπτώσεις που ο έλεγχος επάρκειας του προτύπου δεν ισχύει, δηλαδή οι μεταβλητότητες των εξεταζομένων παραμέτρων δεν είναι περίπου ίδιες σε όλα τα επίπεδα όπως ορίσαμε παραπάνω, διενεργούμε τον μη παραμετρικό έλεγχο Kruskal Wallis, καθώς αυτός δεν παρουσιάζει τις ίδιες υποθέσεις και περιορισμούς με τον έλεγχο ANOVA. Η μέθοδος αυτή ελέγχει μεσαίες και όχι μέσες τιμές, ενώ παρουσιάζει μικρότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων. Και σε αυτόν τον έλεγχο το μέγεθος που δείχνει την εξάρτηση της μιας μεταβλητής από την άλλη, είναι ο δείκτης p- value. Όσο μικρότερη η τιμή του p-value, τόσο μεγαλύτερη είναι η εξάρτηση της μίας μεταβλητής από την άλλη. Με τη μεθοδολογία Pearson Χ 2 εξετάσθηκαν δεδομένα των οποίων οι εξεταζόμενοι παράγοντες αφορούσαν διακριτά ή ασυνεχή μεγέθη (π.χ. παράμετρος DR αξιολόγηση σε κλίμακα 4 βαθμών). Το μέγεθος που δείχνει την εξάρτηση της μιας μεταβλητής με την άλλη είναι πάλι το p-value. 69

2.3 Αποτελέσματα 2.3.1 Κλινικά και ιστολογικά ευρήματα Από τους συνολικά 103 ασθενείς, οι 63 ήταν γυναίκες (ποσοστό 61,2%) και οι 40 ήταν άνδρες (ποσοστό 38,8%). Σε 85 ασθενείς ήταν γνωστή η ηλικία και κυμαινόταν από 23 έως 73 ετών, με μέση ηλικία 50,1 έτη. Τα βασικά δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται συνοπτικά στον πίνακα 4 και αναλυτικά στους Πίνακες 5-7, μαζί με τις κλινικές πληροφορίες και τα ευρήματα της ιστολογικής εξέτασης των βιοψιών ήπατος. Πίνακας 4 : Βασικά δημογραφικά στοιχεία των ασθενών της μελέτης. Βιοψίες χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις Χρόνια Ηπατίτιδα C Μη Αλκοολική Λιπώδης Νόσος Πρωτοπαθής Χολική Κίρρωση Άνδρες 3 20 13 4 (μέση ηλικία) (40,6) ( 49,7) (43,4) (52) Γυναίκες 8 17 17 21 (μέση ηλικία) (45,6) (53,4) (54,4) (53,8) Σύνολο 11 37 30 25 (μέση ηλικία) (43,7) (51,5) (49,7) (53,5) 70

Οι 11 βιοψίες χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις είχαν μέγεθος 1,5 3,1 εκ. (μέσο μήκος: 2,2 εκ.). Το μέγεθος των βιοψιών με χρόνια ηπατίτιδα C, ο βαθμός ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής και το στάδιο της ίνωσης φαίνονται στον Πίνακα 5. Το μέγεθος των βιοψιών με NAFLD, ο βαθμός ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής και το στάδιο της ίνωσης φαίνονται στον Πίνακα 6. Τέλος, το μέγεθος των βιοψιών με πρωτοπαθή χολική κίρρωση και το στάδιο της νόσου φαίνονται στον Πίνακα 7. Πίνακας 5: Δημογραφικά χαρακτηριστικά, κλινικές πληροφορίες και ιστολογικά ευρήματα περιπτώσεων χρόνιας ηπατίτιδας C. Αρ. Πρωτ. Ηλικία /Φύλο Κλινικές πληροφορίες Μήκος Βιοψιών (εκ) HΑΙ Στάδιο Ίνωσης 5938/03 Χρόνια ηπατίτιδα C 1.5 8 1 5329/03 56/ 2.4 9 1 6050/03 SGOT: 180, SGPT: 220 1.8 9 1 295/04 26/ 2.5 5 1 5071/03 3.5 5 1 5566/05 37/ SGOT: 41, SGPT: 97 1.9 4 1 2616/06 35/ Επίμονη τρανσαμινασαιμία, 2.2 4 1 71

HCV από 7ετίας 6218/05 44/ HCV από 7μήνου 2.7 4 1 4744/06 39/ HCV από 5ετίας 3.9 4 1 4651/06 39/ 1.8 4 1 1352/03 69/ 2 8 2 2718/03 60/ Χρόνια HCV, αγωγή από έτους 3.6 6 2 2987/03 Χρόνια HCV, HCVRNA (+), Αύξηση τρανσαμινασών 1.6 10 2 1575/05 55/ Χρόνια γονότυπος 1β HCV, 1.7 10 2 Χρόνια HCV, 24058/0 5 28/ Μεσογειακή Αναιμία, 1.5 10 2 Μεταγγίσεις 1630/06 Χρόνια HCV από 13 έτη 3.1 7 2 3066/06 59/ Χρόνια HCV 2.1 4 2 Χρόνια HCV από 3432/06 57/ 7ετίας, ΣΔ τύπος 1, ΑΥ, 3.3 11 2 Θυρεοειδοπάθεια 2860/05 58/ Χρόνια HCV 1.9 6 2 2289/05 48/ Χρόνια HCV από 9 ετών, 2.8 8 2 τρανσαμινάσες κ.φ. 807/03 2.4 10 3 HCV RNA (+), 4398/03 Αύξηση τρανσαμινασών 2.5 11 3 72

5118/03 2.1 5 3 Anti-HCV (+), HCV 6046/03 63/ RNA (-), Αύξηση 2.2 9 3 τρανσαμινασών 4356/05 66/ 3.6 13 3 2175/06 68/ Χρόνια HCV από 12 ετίας, Θυρεοειδοπάθεια, Οστεοπόρωση, Πολυαρθρίτιδα 1.8 7 3 2917/05 46/ Χρόνια HCV από 2 ετίας, γονότυπος 1 2.3 9 3 3062/05 48/ Χρόνια HCV 2.2 9 3 2779/05 Χρόνια HCV 3.2 10 3 1248/05 56/ 2.1 11 3 4239/02 51/ Χρόνια HCV, HCV RNA(+), τρανσαμινασαιμία 2.3 13 4 Χρόνια HCV, HCV 4740/02 68/ RNA(+), τρανσαμινασαιμία 2 12 4 4915/03 Χρόνια HCV 1.5 9 4 690/04 Χρόνια HCV 1.5 9 4 2878/03 Χρόνια HCV, ΣΔ 2.2 9 4 Χρόνια HCV από 43 3948/05 61/ ετίας, πρόσφατα 2.3 13 4 anti-hcv(+) 2778/05 Χρόνια HCV 3 9 4 73

Πίνακας 6: Δημογραφικά χαρακτηριστικά, κλινικές πληροφορίες και ιστολογικά ευρήματα περιπτώσεων NAFLD. Αρ. Πρωτ. Ηλικία /Φύλο Κλινικές πληροφορίες 942/03 37/ SH SGOT: 180, SGPT: 216, χοληστερίνη 265, λιπώδες ήπαρ, παχυσαρκία, θυρεοειδεκτομή, 2106/05 43/ HBsAg/anti HCV(-) Μήκος Βιοψιών (εκ) NAS Στάδιο Ίνωσης 1.6 4 1 3 5 0 5441/01 49/ 2.3 4 1 Τρανσαμινασαιμία από 5ετίας, ΣΔ, Καρκίνωμα 5613/05 53/ μαστού, ΧΜΘ 3 6 3 Αύξηση τρανσαμινασών από 2ετίας, ήπια αύξηση αλκαλικής 5199/03 56/ φωσφατάσης 2 3 1 Τρανσαμινασαιμία από 6ετίας, κεντρική 3122/04 51/ παχυσαρκία 1.7 5 1 Τρανσαμινασαιμία, επεισόδια συστηματικής 2049/04 36/ αναφυλαξίας 3.1 4 0 Τρανσαμινασαιμία από 8μήνου, SGOT: 65, SGPT:158, 5367/04 51/ αλκαλική φωσφατάση 300 2.5 6 2 74

Τρανσαμινασαιμία, ΣΔ, 4157/05 60/ Παχυσαρκία, Υποθυρεοειδισμός 2.2 6 2 Τρανσαμινασαιμία από 2048/04 58/ 2ετίας 2.6 6 2 3447/05 53/ SH 2.2 4 2 5390/04 50/ Τρανσαμινασαιμία από 5 ετίας, HBsAg(-), HCV(-) 1.8 1 1 Τρανσαμινασαιμία από έτους, SGOT:81, SGPT:115, ALP:177, γ- GT:116, 5439/04 58/ HBsAg(-), HCV(-), ΣΔ 1.6 6 2 419/05 32/ SH 2.1 3 0 1814/05 37/ SGOT: 67, SGPT: 164, γ- GT: 30, Έλεγχος ιών (-) 2.1 6 2 3532/03 48/ Υπερλιπιδαιμία 2 7 2 2590/05 2.1 5 2 Τρανσαμινασαιμία, Δυσλιπιδαιμία, λιπώδες 6314/04 ήπαρ, ΣΔ 1.7 6 2 2859/04 42/ Τρανσαμινασαιμία από 10 ετίας, Παχυσαρκία 2.2 7 2 6296/05 41/ Τρανσαμινασαιμία 3.6 4 1 5887/05 41/ Τρανσαμινασαιμία, Λιπώδες ήπαρ 2.6 5 1 1075/06 41/ Τρανσαμινασαιμία, κεντρική παχυσαρκία 2 7 2 2543/06 36/ Τρανσαμινασαιμία 2.5 5 1 3130/05 73/ ΣΔ,Υπερλιπιδαιμία 2.5 7 4 Τρανσαμινασαιμία από 1681/06 31/ 2ετίας, λιπώδης διήθηση 2.4 5 0 75

37/06 45/ 6527/05 63/ 6902/05 65/ 1195/05 73/ 5718/05 68/ ήπατος, SGOT:κ.φ., SGPT: 80, γ-gt:53 Τρανσαμινασαιμία, Υποθυρεοειδισμός Τρανσαμινασαιμία, Υπερλιπιδαιμία, ΑΥ, ΣΔ, Σπληνομεγαλία Τρανσαμινασαιμία, ΑΥ, Αύξηση αποφρακτικών ενζύμων, SH, Καρκίνωμα μαστού Τρανσαμινασαιμία,Υπερχο ληστερολαιμία, κεντρική παχυσαρκία 3 7 3 3.7 4 3 2.4 7 4 1.6 4 3 3.2 7 3 Πίνακας 7: Δημογραφικά χαρακτηριστικά, κλινικές πληροφορίες και ιστολογικά ευρήματα περιπτώσεων πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης. Αρ. Πρωτ. Ηλικία/ Φύλο Κλινικές πληροφορίες Μήκος Βιοψιών (εκ) Στάδιο 4309/05 70/ 4,5 I 2610/04 60/ 3,9 I Αύξηση τρανσαμινασών από 1940/04 36/ 9μήνου, γ-gt, ALP, ASMA(+) 4 I 5694/05 70/ 3271/01 30/ PBC από 6ετίας 2,7 I Αύξηση τρανσαμινασών και 2,8 I 76

αντιπυρηνικών αντισωμάτων 1084/01 65/ 1,5 I Raynaud από 10ετίας, αυξημένες τρανσαμινάσες, γ-gt, ALP, 5661/05 AMA(+ασθενώς), ANA(+), 4,2 I 49/ ASMA(+) Αυξημένες τρανσαμινάσες, γ-gt, 359/04 3,8 I 53/ ALP Σκληρόδερμα από 25ετίας, πνευμονική υπέρταση από 1857/06 12ετίας, αύξηση χολοστατικών 2,1 I 70/ ενζύμων, τρανσαμινασών 1599/04 42/ 4,7 I Τρανσαμινασαιμία, μέτρια αύξηση χολοστατικών ενζύμων, 5957/04 ΣΔ, παχυσαρκία, ΑΝΑ(+), 2,5 I 62/ ΑΜΑ(+) Αύξηση χολοστατικών ενζύμων από 2ετίας, αρνητικός 4394/03 απεικονιστικός έλεγχος για 2,5 I εξωηπατική απόφραξη 49/ χοληφόρων PBC από 12ετίας, αυξημένες 6010/04 2,9 I 54/ ALT, γ-gt,ama (+) 5440/04 47/ 4,4 III Τρανσαμινασαιμία, αύξηση 2300/05 χολοστατικών ενζύμων, ΑΜΑ 3,6 III 50/ 1:106,ΑΝΑ 1:320, ASMA(-) 2685/06 58/ PBC από ετών 2,8 III Υποτροπιάζοντα επεισόδια 1098/07 επιγαστρικού άλγους με ρίγος και 3.3 III 52/ δεκατική πυρετική κίνηση, αύξηση 77

2609/05 41/ 6011/02 3218/05 47/ 6469/04 70 1730/04 52/ τρανσαμινασών και χολοστατικών ενζύμων, ΑΜΑ(+),ΑΝΑ(+) Αύξηση χολοστατικών ενζύμων, διαλείπουσα αύξηση αμινοτρανσφερασών, ΑΜΑ (+), Μ2 (+) Αύξηση χολοστατικών ενζύμων, ΑΜΑ(+) PBC από 5ετίας, τρανσαμινασαιμία Χολοστατικό σύνδρομο, αυξημένη ALP, γ-gt, ANA(+),ANCA(+) Αύξηση τρανσαμινασών, γ-gt, αλκαλικής φωσφατάσης, ΑΜΑ(+) 3 I 4 I 1,9 III 2,5 III 4 III 3687/01 67/ 2,6 IV 2737/07 47/ 2.9 I 2702/07 44/ 2.6 III Ο Πίνακας 8 περιλαμβάνει τη συσχέτιση του σταδίου ίνωσης με την ηλικία των ασθενών ( σε δύο κατηγορίες: 45 ετών και > 45 ετών ) με χρόνια ηπατίτιδα C, ενώ στον Πίνακα 9 γίνεται συσχέτιση του HAI με το στάδιο της ίνωσης. 78

Πίνακας 8: Συσχέτιση σταδίου ίνωσης και ηλικίας ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα C. 45 ετών > 45 ετών Σύνολο Στάδιο ίνωσης Ι 6 1 7 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 1 7 8 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 0 6 6 Στάδιο ίνωσης ΙV 0 3 3 Σύνολο 7 17 24/37 Πίνακας 9: Συσχέτιση του βαθμού ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής (ΗΑΙ) με το στάδιο ίνωσης ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα C. Στάδιο Ίνωσης Ήπια (ΗΑΙ 0-8) Μέτρια (ΗΑΙ 9-12) Έντονη (ΗΑΙ 13-18) Σύνολο Στάδιο Ι 8 2 0 10 Στάδιο ΙΙ 6 4 0 10 Στάδιο ΙΙΙ 2 7 1 10 Στάδιο ΙV 0 5 2 7 Ακολουθούν αντίστοιχοι Πίνακες για την NAFLD. Στον Πίνακα 10 συσχετίζεται το στάδιο της ίνωσης με την ηλικία των ασθενών και στον Πίνακα 11 το NAS με το στάδιο ίνωσης. 79

Πίνακας 10: Συσχέτιση του σταδίου ίνωσης με την ηλικία ασθενών με NAFLD. 45 ετών > 45 ετών Σύνολο Στάδιο ίνωσης 0 4 0 4 Στάδιο ίνωσης Ι 4 2 6 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 3 6 9 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 1 6 7 Στάδιο ίνωσης ΙV 0 2 2 Σύνολο 12 16 28/30 Πίνακας 11: Συσχέτιση του NAS με το στάδιο ίνωσης ασθενών με NAFLD. Ίνωση NAS 4 NAS 5 Στάδιο 0 2 2 Στάδιο Ι 5 3 Στάδιο ΙΙ 1 10 Στάδιο ΙΙΙ 2 3 Στάδιο ΙV 0 2 Σύνολο 10 20 80

Στον Πίνακα 12 γίνεται συσχέτιση του σταδίου εξέλιξης Της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης με την ηλικία των ασθενών. Πίνακας 12: Συσχέτιση του σταδίου εξέλιξης της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης με την ηλικία των ασθενών. Στάδιο Ι Στάδιο ΙΙ Στάδιο ΙΙΙ Στάδιο ΙV Σύνολο 45 ετών 4 0 1 0 5 > 45 ετών 11 0 7 1 18 Σύνολο 15 0 8 1 24/25 2.3.2. Ανοσοϊστοχημικά ευρήματα α) Χρώσεις για την κυτοκερατίνη 7 Στις ανοσοϊστοχημικές χρώσεις για την κυτοκερατίνη 7, αναγνωρίσθηκαν και καταμετρήθηκαν οι πόροι του Hering σε όλες 81

τις βιοψίες ήπατος που μελετήθηκαν (Εικόνες 1-4). Παράλληλα καταμετρήθηκαν τα πυλαία διαστήματα και προσδιορίσθηκε ο λόγος του αριθμού των πόρων του Hering προς τον αριθμό των τελευταίων (CoH/PT), καθώς και ανά εκατοστό βιοψίας (CoH/cm). Επιπρόσθετα αξιολογήθηκε η παρουσία χολαγγειολικής αντίδρασης και στρεσσογόνου αντίδρασης των ηπατοκυττάρων καθώς και η βαρύτητα τους. Εικόνα 1:Ανοσοϊστοχημική χρώση για κυτοκερατίνη 7 σε βιοψία ήπατος χωρίς ουσιώδεις ιστολογικές αλλοιώσεις. Εντός των λοβίων αναδεικνύονται αρκετοί πόροι του Hering (βέλη) με τη μορφή μεμονωμένων κυττάρων ή γραμμοειδών σχηματισμών ( Χ400). 82

Εικόνα 2: Με την ανοσοϊστοχημική χρώση για κυτοκερατίνη 7 αναγνωρίζονται αρκετοί πόροι του Hering (βέλη) σε περίπτωση χρόνιας ηπατίτιδας C με μέτρια δραστηριότητα της φλεγμονής (ΗΑΙ 10) ( Χ200). Εικόνα 3: Ανοσοϊστοχημική χρώση για κυτοκερατίνη 7 σε περίπτωση NAFLD. Αναδεικνύεται η παρουσία πόρων του Hering (μαύρο βέλος), και η έντονη χολαγγειολική αντίδραση (κόκκινο βέλος) στα όρια του πυλαίου διαστήματος (Χ200). 83

Εικόνα 4: Ανοσοϊστοχημική χρώση για κυτοκερατίνη 7 σε πρωτοπαθή χολική κίρρωση σταδίου Ι. Διακρίνονται ολιγάριθμοι πόροι του Hering (μαύρο βέλος) και μικρός χοληφόρος πόρος (κόκκινο βέλος) σε παρακείμενο πυλαίο διάστημα (Χ400). Τα ευρήματα της ανοσοϊστοχημικής διερεύνησης για την κυτοκερατίνη 7 φαίνονται αναλυτικά στον Πίνακα 13 (βιοψίες ήπατος χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις), Πίνακα 14 (βιοψίες ήπατος με χρόνια ηπατίτιδα C), Πίνακα 15 (βιοψίες ήπατος με NAFLD) και Πίνακα 16 (βιοψίες ήπατος με πρωτοπαθή χολική κίρρωση). Ο 84

αριθμός των πόρων του Hering ανά πυλαίο διάστημα (CoH/PT) και ανά μονάδα μήκους βιοψίας (CoH/cm) στα στάδια εξέλιξης των νόσων αυτών φαίνεται στους Πίνακες 17 (χρόνια ηπατίτιδα C), 18 (NAFLD) και 19 (πρωτοπαθής χολική κίρρωση). Πίνακας 13: Ευρήματα βιοψιών χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις Χρώσεις για την κυτοκερατίνη 7. Αρ. Αρ. CoH/ Πρωτ. CoH Πυλ.Διαστ. Αρ. Πυλ. CoH / DR HS Διαστ. Cm 1737/05 86 21 4,09 34,4 0 0 4491/03 147 25 5,8 81,66 0 0 5455/02 15 18 0,83 8,33 0 0 5456/02 121 30 4,03 40,33 0 0 4183/03 19 17 1,11 9,04 0 0 373/02 8 15 0,53 6,66 0 0 5294/02 9 14 0,64 5 0 0 800/01 31 24 1,29 12,4 0 0 5601/06 45 33 1,36 19,56 0 0 5620/06 44 43 1,02 14,19 0 0 1909/07 11 11 1 4.78 0 0 85

Πίνακας 14: Ευρήματα βιοψιών χρόνιας ηπατίτιδας C Χρώσεις για την κυτοκερατίνη 7. Αρ. Αρ. CoH/ Πρωτ. CoH Πυλ.Διαστ. Αρ. Πυλ. Διαστ. CoH / Cm DR HS 5938/03 93 17 5.47 62 1 0 5329/03 88 41 2.14 36.66 0 0 6050/03 74 37 2 41.11 0 0 295/04 79 47 1.68 31.6 0 0 5071/03 123 85 1.44 35.14 1 0 5566/05 29 38 0.76 15.26 1 0 2616/06 15 27 0.55 6.81 0 0 6218/05 60 59 1.01 22.22 1 0 4744/06 132 60 2.2 33.84 0 0 4651/06 21 54 0.38 11.66 0 1 1352/03 134 53 2.52 67 1 0 2718/03 131 66 1.98 36.38 0 0 2987/03 213 65 3.27 133.12 2 0 1575/05 30 20 1.5 17.64 2 0 4058/05 140 31 4.51 93.33 0 1 1630/06 137 65 2.1 44.19 2 0 3066/06 40 29 1.37 19.04 0 0 3432/06 165 82 2.01 50 1 1 2860/05 50 36 1.38 26.31 1 0 2289/05 246 87 2.82 87.85 2 1 807/03 78 45 1.73 32.5 1 1 4398/03 189 54 3.5 75.6 3 0 5118/03 33 27 1.22 15.71 1 0 6046/03 36 62 0.58 16.36 0 1 4356/05 334 Ν/Α Ν/Α 92.77 3 3 2175/06 218 70 3.11 121.11 2 0 86

2917/05 58 39 1.48 25.21 2 0 3062/05 256 57 4.49 116.36 3 3 2779/05 490 95 5.15 153.12 1 0 1248/05 285 45 6.33 135.71 2 2 4239/02 64 Ν/Α Ν/Α 27.82 1 0 4740/02 33 Ν/Α Ν/Α 16.5 2 2 4915/03 48 Ν/Α Ν/Α 32 1 1 690/04 44 Ν/Α Ν/Α 29.33 2 1 2878/03 12 Ν/Α Ν/Α 5.45 0 1 3948/05 73 19 3.8 31.73 2 2 2778/05 283 Ν/Α Ν/Α 94.33 2 0 Ν/Α: δυσχερής ο ακριβής προσδιορισμός λόγω παρουσίας έντονης ίνωσης ή κίρρωσης. Πίνακας 15: Ευρήματα βιοψιών στεατοηπατίτιδας Χρώσεις για την κυτοκερατίνη 7. Αρ. CoH Αρ. CoH/ CoH / Cm DR HS Πρωτ. Πυλ.Διαστ. Αρ. Πυλ. Διαστ. 942/03 300 35 8.5 187.5 2 0 2106/05 18 28 0.64 6 0 1 5441/01 20 14 1.42 8.69 0 1 5613/05 215 60 3.58 71.66 0 1 5199/03 22 18 1.22 11 0 0 3122/04 46 22 2.09 27.05 0 0 2049/04 62 39 1.58 20 0 0 5367/04 369 115 3.2 147.6 2 0 4157/05 111 38 2.92 50.45 1 1 2048/04 105 45 2.33 40.38 1 0 3447/05 115 40 2.87 52.27 1 0 5390/04 4 13 0.307 2.22 0 0 5439/04 50 31 1.61 31.25 0 0 87

419/05 7 21 0.33 3.33 0 0 1814/05 127 54 2.35 60.47 1 0 3532/03 28 31 0.9 14 0 0 2590/05 250 66 3.78 119.04 1 0 6314/04 73 29 2.51 42.94 0 1 2859/04 158 56 2.82 71.81 1 0 6296/05 45 58 0.77 12.5 1 0 5887/05 87 47 1.85 33.46 1 0 1075/06 262 36 7.27 131 2 1 2543/06 21 33 0.63 8.4 0 0 3130/05 141 51 2.76 56.4 1 1 1681/06 33 51 0.64 13.75 0 0 37/06 387 84 4.6 129 2 0 6527/05 132 51 2.58 35.67 2 1 6902/05 116 57 2.03 48.33 2 3 1195/05 281 60 4.68 175.62 1 1 5718/05 115 65 1.76 35.93 2 1 Πίνακας 16: Ευρήματα βιοψιών πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης Χρώσεις για την κυτοκερατίνη 7. Αρ. Πρωτ. CoH Αρ. Πυλ.Διαστ. CoH/ Αρ. Πυλ. Διαστ. CoH / Cm DR HS 4309/05 118 81 1,45 26,22 1 1 2610/04 89 59 1,508 22,82 0 1 1940/04 47 62 0,75 11,75 0 1 5694/05 34 43 0,79 12,59 0 1 3271/01 51 53 0,96 18,21 1 0 1084/01 5 21 0,23 3,33 0 0 5661/05 35 47 0,744 8,33 0 1 359/04 52 79 0,65 13,68 0 1 1857/06 20 24 0,83 9,52 0 0 1599/04 28 78 0,35 5,95 1 3 88

5957/04 28 42 0,66 11,2 0 1 4394/03 23 48 0,47 9,2 1 2 6010/04 11 11 1 3,79 0 3 5440/04 29 60 0,48 6,59 0 0 2300/05 24 75 0,32 6,66 0 1 2685/06 14 34 0,41 5 1 0 1098/07 89 80 1.11 26.96 2 3 2609/05 20 49 0.4 6.66 0 3 6011/02 78 41 1.9 19.5 0 0 3218/05 2 29 0,068 1,05 0 0 6469/04 39 47 0,82 15,6 3 1 1730/04 38 81 0,46 9,5 0 3 3687/01 49 Ν/Α Ν/Α 18,84 2 1 2737/07 46 35 1.31 15.86 0 1 2702/07 33 37 0.89 12.69 3 2 Πίνακας 17: Αριθμός πόρων του Hering ανά πυλαίο διάστημα και μονάδα μήκους βιοψιών με χρόνια ηπατίτιδα C. CoH/ Αρ. Πυλ. Διαστ. CoH / Cm Mέση τιμή Τυπική Απόκλιση Μέση Τιμή Τυπική Απόκλιση Στάδιο ίνωσης Ι 1,76 1,46 29,63 16,28 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 2,34 0,98 57,48 37,61 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 3,06 1,97 78,44 52,76 Στάδιο ίνωσης ΙV 3,8 Ν/Α 33,88 28,37 Συνολικά 2,41 1,54 51,15 40,68 89

Πίνακας 18: Αριθμός πόρων του Hering ανά πυλαίο διάστημα και μονάδα μήκους βιοψιών με NAFLD. CoH/ Αρ. Πυλ. Διαστ. CoH / Cm Mέση Τιμή Τυπική Τυπική Μέση Τιμή Απόκλιση Απόκλιση Στάδιο ίνωσης Ι 1,66 2,23 27,82 51,15 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 2,96 1,62 69,2 43,79 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 3,44 1,27 89,57 61,36 Στάδιο ίνωσης ΙV 2,39 0,51 52,36 5,7 Συνολικά 2,48 1,88 54,92 52,56 Πίνακας 19: Αριθμός πόρων του Hering ανά πυλαίο διάστημα και μονάδα μήκους βιοψιών με πρωτοπαθή χολική κίρρωση. CoH/ Αρ. Πυλ. Διαστ. Τυπική Mέση Τιμή Απόκλιση CoH / Cm Τυπική Μέση Τιμή Απόκλιση Στάδιο Νόσου Ι 0,9 0,52 12,41 6,65 Στάδιο Νόσου ΙΙΙ 0,56 0,34 10,5 8,03 Στάδιο Νόσου IV N/A N/A N/A N/A Συνολικά 0,79 0,48 12,06 7,02 90

Ο αριθμός των πόρων του Hering ανά πυλαίο διάστημα (CoH/PT) και ανά μονάδα μήκους βιοψίας (CoH/cm) στα στάδια του ΗΑΙ για την χρόνια ηπατίτιδα C φαίνεται στον Πίνακα 20. Πίνακας 20: Αριθμός πόρων του Hering ανά πυλαίο διάστημα (CoH/PT) και ανά μονάδα μήκους βιοψίας (CoH/cm) στα στάδια του ΗΑΙ βιοψιών με χρόνια ηπατίτιδα C. CoH/ Αρ. Πυλ. Διαστ. Mέση Τιμή CoH / Cm Τυπική Τυπική Απόκλιση Μέση Τιμή Απόκλιση ΗΑΙ Ι (0-8) 1,87 1,24 39,75 30,86 ΗΑΙ ΙΙ ((9-12) 2,97 1,71 61,35 47,7 ΗΑΙ ΙΙΙ (13-18) 3,8 Ν/Α 50,77 36,42 Συνολικά 2,41 1,54 51,15 40,68 Όπως ήταν αναμενόμενο, στο σύνολο των 11 βιοψιών ήπατος χωρίς ουσιώδεις ιστολογικές αλλοιώσεις, δεν αναδείχθηκε χολαγγειολική αντίδραση. Σε 11 από τις 37 περιπτώσεις χρόνιας ηπατίτιδας C επίσης δεν παρατηρήθηκε χολαγγειολική αντίδραση, ενώ σε 12 περιπτώσεις, η αντίδραση ήταν ήπια. Σε 11 βιοψίες ο 91

βαθμός της αντίδρασης ήταν μέτριος και σε 3 βιοψίες έντονος. Όσον αφορά τις περιπτώσεις στεατοηπατίτιδας, 13 βιοψίες εμφάνισαν μηδενική αντίδραση, 10 ηπίου και 7 μετρίου βαθμού. Καμία περίπτωση μη αλκοολικής λιπώδους νόσου δεν εμφάνισε έντονη χολαγγειολική αντίδραση. Στην πρωτοπαθή χολική κίρρωση, 16 δεν εμφάνιζαν χολαγγειολική αντίδραση, ενώ 5 είχαν ήπια, 2 μέτρια και 2 έντονη. Τα ευρήματα αυτά φαίνονται συνοπτικά στον Πίνακα 21. Πίνακας 21: Βαθμός χολαγγειολικής αντίδρασης στις διαγνωστικές κατηγορίες της μελέτης. Βαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Βιοψίες χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις 11 0 0 0 Χρόνια Ηπατίτιδα C 11 12 11 3 Στεατοηπατίτιδα 13 10 7 0 Πρωτοπαθής χολική κίρρωση 16 5 2 2 92

Οι εικόνες 5-8 δείχνουν χαρακτηριστικά παραδείγματα χολαγγειολικής αντίδρασης. Εικόνα 5: Βιοψία ήπατος χωρίς ουσιώδεις ιστολογικές αλλοιώσεις. Με την ανοσοϊστοχημική χρώση για κυτοκερατίνη 7 αναδεικνύονται πόροι του Hering (μαύρο βέλος), καθώς και μικροί χοληφόροι πόροι (κόκκινο βέλος) στις άκρες των πυλαίων διαστημάτων. Δεν παρατηρείται χολαγγειολική αντίδραση, ενώ τα ηπατοκύτταρα στο σύνολο τους είναι αρνητικά. ( Χ400) 93

Εικόνα 6: HCV - Κυτοκερατίνη 7. Διακρίνονται κύτταρα με χαρακτήρες πόρων του Hering (μαύρο βέλος), πολυάριθμα χολαγγειόλια (λεπτό βέλος) και έντονη διαβρωτική νέκρωση σε περιοχή με οζώδη παρυφή (περίπτωση με έντονη ίνωση). Μικρός αριθμός ηπατοκυττάρων εμφανίζουν θετικότητα στη χρώση (κόκκινο βέλος). ( Χ400) Εικόνα 7: NAFLD με έντονη ίνωση - Κυτοκερατίνη 7. Διακρίνονται ολιγάριθμοι πόροι του Hering (μαύρο βέλος) και υπερπλασία χολαγγειολίων (κόκκινο βέλος), που φαίνεται εστιακά να μεταπίπτουν σε ενδιαμέσου τύπου κύτταρα και στη συνέχεια σε ώριμα ηπατοκύτταρα με θετική χρωστική αντίδραση. ( Χ400) 94

Εικόνα 8: Ανοσοϊστοχημική χρώση για κυτοκερατίνη 7 σε πρωτοπαθή χολική κίρρωση σταδίου ΙΙΙ. Εντονότατη χολαγγειολική αντίδραση και παρουσία θετικών ενδιαμέσου τύπου (μαύρο βέλος) και ώριμων ηπατοκυττάρων (λεπτό βέλος). Πόροι του Hering σχεδόν απουσιάζουν από ενδολόβιες θέσεις. (Χ400) Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρες δεν παρατηρήθηκε σε καμία από τις ιστολογικώς φυσιολογικές βιοψίες, καθώς και σε 23 από τις βιοψίες χρόνιας ηπατίτιδας C. Από τις υπόλοιπες 14 βιοψίες χρόνιας ηπατίτιδας C, 9 παρουσίασαν ήπια αντίδραση, 3 μέτρια και 2 έντονη. Όσον αφορά τις περιπτώσεις στεατοηπατίτιδας, συνολικά 11 βιοψίες εμφάνισαν θετικότητα, εκ των οποίων οι 10 ήπια και η 1 έντονη. Σχετικά με τις περιπτώσεις πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης, σε 18 από τις 25 βιοψίες 95

παρατηρήθηκε ηπατοκυτταρική αντίδραση. Σε 11 βιοψίες ήταν ήπια, σε 2 μέτρια και σε 5 έντονη. Τα ευρήματα αυτά φαίνονται συνοπτικά στον πίνακα 22. Πίνακας 22: Βαθμός ηπατοκυτταρικής αντίδρασης στις διαγνωστικές κατηγορίες της μελέτης. Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρές Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Βιοψίες χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις 11 0 0 0 Χρόνια Ηπατίτιδα C 23 9 3 2 Στεατοηπατίτιδα 19 10 0 1 Πρωτοπαθής χολική κίρρωση 7 11 2 5 96

Οι εικόνες 9-11 δείχνουν χαρακτηριστικά παραδείγματα ηπατοκυτταρικής αντίδρασης. Εικόνα 9: Ανοσοϊστοχημική χρώση για κυτοκερατίνη 7 σε χρόνια ηπατίτιδα C με έντονη ίνωση. Θετική χρώση σε ικανό αριθμό ηπατοκυττάρων (μαύρο βέλος). Αναγνωρίζονται επίσης αρκετά χολαγγειόλια (κόκκινο βέλος) και ενδιάμεσες μορφές (λεπτό βέλος). ( Χ200) 97

Εικόνα 10: NAFLD με κίρρωση - Κυτοκερατίνη 7. Έντονη θετικότητα ενδιαμέσου τύπου (μαύρο βέλος) και ώριμων ηπατοκυττάρων (κόκκινο βέλος) στην παρυφή των όζων. Οι πόροι του Hering απουσιάζουν από τους κιρρωτικούς όζους( Χ200). Εικόνα 11: Πρωτοπαθής χολική κίρρωση σταδίου ΙΙΙ Κυτοκερατίνη 7. Παρατηρείται καταστροφή των χοληφόρων πόρων με σχηματισμό ουλώδους ιστού και σταδιακή μείωση της έντασης της χρωστικής αντίδρασης από τα χολαγγειόλια προς τα ώριμα ηπατοκύτταρα. (Χ200) 98

Ο βαθμός χολαγγειολικής αντίδρασης στα στάδια εξέλιξης της χρόνιας ηπατίτιδας C και στάδια του ΗΑΙ φαίνονται στους Πίνακες 23 και 24 αντίστοιχα. Πίνακας 23: Συσχέτιση βαθμού χολαγγειολικής αντίδρασης και σταδίου ίνωσης βιοψιών με χρόνια ηπατίτιδα C. Χολαγγειολική αντίδραση Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Στάδιο ίνωσης Ι 6 4 0 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 3 3 4 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 1 3 3 3 Στάδιο ίνωσης ΙV 1 2 4 0 Πίνακας 24: Συσχέτιση βαθμού χολαγγειολικής αντίδρασης και σταδίου ΗΑΙ βιοψιών με χρόνια ηπατίτιδα C. Χολαγγειολική αντίδραση Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 ΗΑΙ Ι 6 7 3 0 ΗΑΙ ΙΙ 5 4 7 2 ΗΑΙ ΙΙΙ 0 1 1 1 99

Ο βαθμός ηπατοκυτταρικής αντίδρασης στο στρες στα στάδια εξέλιξης της χρόνιας ηπατίτιδας C και στα στάδια του ΗΑΙ φαίνεται στους Πίνακες 25 και 26 αντίστοιχα. Πίνακας 25: Συσχέτιση βαθμού ηπατοκυτταρικής αντίδρασης και σταδίου ίνωσης βιοψιών με χρόνια ηπατίτιδα C. Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρες Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Στάδιο ίνωσης Ι 9 1 0 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 7 3 0 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 5 2 1 2 Στάδιο ίνωσης ΙV 2 3 2 0 Πίνακας 26 : Συσχέτιση βαθμού ηπατοκυτταρικής αντίδρασης και σταδίου ΗΑΙ βιοψιών με χρόνια ηπατίτιδα C. Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρες Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 ΗΑΙ Ι 14 2 0 0 ΗΑΙ ΙΙ 8 7 2 1 ΗΑΙ ΙΙΙ 1 0 1 1 100

Ο βαθμός χολαγγειολικής αντίδρασης στα στάδια εξέλιξης της NAFLD φαίνονται στους Πίνακες 27 και 28. Πίνακας 27: Συσχέτιση βαθμού χολαγγειολικής αντίδρασης και σταδίου ίνωσης βιοψιών με NAFLD. Xολαγγειολική αντίδραση Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Στάδιο ίνωσης Ι 9 2 1 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 3 6 2 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 1 1 3 0 Στάδιο ίνωσης ΙV 0 1 1 0 Πίνακας 28: Συσχέτιση βαθμού χολαγγειολικής αντίδρασης και NAS βιοψιών με NAFLD. Xολαγγειολική αντίδραση Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 NAS I 5 3 2 0 NAS II 8 7 5 0 101

Ο βαθμός ηπατοκυτταρικής αντίδρασης στο στρες στα στάδια εξέλιξης της NAFLD φαίνεται στους Πίνακες 29 και 30. Πίνακας 29: Συσχέτιση βαθμού ηπατοκυτταρικής αντίδρασης και σταδίου ίνωσης βιοψιών με NAFLD. Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρες Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Στάδιο ίνωσης Ι 10 2 0 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙ 8 3 0 0 Στάδιο ίνωσης ΙΙΙ 1 4 0 0 Στάδιο ίνωσης ΙV 0 1 0 1 Πίνακας 30: Συσχέτιση βαθμού ηπατοκυτταρικής αντίδρασης και NAS βιοψιών με NAFLD. Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρες Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 NAS I 7 3 0 0 NAS II 12 7 0 1 102

Ο βαθμός χολαγγειολικής αντίδρασης στα στάδια εξέλιξης της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης φαίνεται στον Πίνακα 31. Πίνακας 31: Συσχέτιση βαθμού χολαγγειολικής αντίδρασης και σταδίου νόσου βιοψιών με πρωτοπαθή χολική κίρρωση. Χολαγγειολική αντίδραση Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Στάδιο νόσου Ι 12 4 0 0 Στάδιο νόσου ΙΙ 0 0 0 0 Στάδιο νόσου ΙΙΙ 4 1 1 2 Στάδιο νόσου ΙV 0 0 1 0 Ο βαθμός ηπατοκυτταρικής αντίδρασης στο στρες στα στάδια εξέλιξης της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης φαίνεται στον πίνακα 3. 103

Πίνακας 32: Συσχέτιση βαθμού ηπατοκυτταρικής αντίδρασης και σταδίου νόσου βιοψιών με πρωτοπαθή χολική κίρρωση. Ηπατοκυτταρική αντίδραση στο στρες Bαθμός 0 Bαθμός 1 Bαθμός 2 Bαθμός 3 Στάδιο νόσου Ι 4 8 1 3 Στάδιο νόσου ΙΙ 0 0 0 0 Στάδιο νόσου ΙΙΙ 3 2 1 2 Στάδιο νόσου ΙV 1 0 0 0 β) Χρώσεις για τον παράγοντα EpCAM Σε όλες τις βιοψίες που εξετάσθηκαν, παρατηρήθηκε θετικότητα των επιθηλιακών κυττάρων των χοληφόρων πόρων όλων των μεγεθών, περιλαμβανομένων και των πόρων του Hering, στον EpCAM. Επιπλέον, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων χρόνιων παθήσεων του ήπατος παρατηρήθηκε θετικότητα ποικίλου αριθμού ηπατοκυττάρων και ενδιάμεσων 104

κυττάρων σε περιπυλαίες θέσεις (εικόνες 12-15). Μόνο 2 από τις 11 βιοψίες χωρίς ιστολογικά ανιχνεύσιμες αλλοιώσεις παρουσίαζαν περιορισμένη θετικότητα ηπατοκυττάρων στον EpCAM. Εικόνα 12: Ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα EpCAM σε βιοψία χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις. Διακρίνονται σπάνια θετικά ηπατοκύτταρά (μαύρο βέλος), ενώ η θετικότητα των χοληφόρων πόρων (κόκκινο βέλος) αποτελεί εσωτερικό μάρτυρα για τη χρώση. (Χ400) Αντίθετα, στις βιοψίες με χρόνια ηπατίτιδα C παρατηρήθηκε θετικότητα σε 29 από τις 37 περιπτώσεις. Από 105

αυτές, 6 είχαν περιορισμένο αριθμό θετικών κυττάρων, 2 μέτριο και 21 μεγάλο αριθμό. Εικόνα 13: Χρόνια ηπατίτιδα C. Εντονότατη θετική χρώση για τον επιθηλιακό παράγοντα EpCAM, που αφορά μεγάλες ομάδες ηπατοκυττάρων κυρίως γύρω από πυλαία διαστήματα. Παρατηρείται επίσης θετικότητα των χοληφόρων πόρων (βέλος). ( Χ200) Όσον αφορά τις περιπτώσεις μη αλκοολικής λιπώδους νόσου, παρατηρήθηκε θετικότητα ηπατοκυττάρων σε 19 από τις 30 περιπτώσεις. Σε 11 βιοψίες η θετικότητα αφορούσε 106

περιορισμένο αριθμό κυττάρων, σε 1 βιοψία μέτριο αριθμό και σε 7 βιοψίες μεγάλο αριθμό. Εικόνα 14: Ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα EpCAM σε περίπτωση NAFLD με έντονη ίνωση. Τόσο τα ενδιαμέσου τύπου, όσο και τα ώριμα ηπατοκύτταρα εμφανίζουν έντονη θετικότητα στην παρυφή οζώδους σχηματισμού. ( Χ400) Θετικά ηπατοκύτταρα ανευρέθηκαν σε 20 από τις 25 συνολικά περιπτώσεις πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης. Δεκαπέντε βιοψίες παρουσίασαν θετικότητα μικρού αριθμού 107

κυττάρων, 2 βιοψίες μετρίου αριθμού και 3 βιοψίες μεγάλου αριθμού. Εικόνα 15: Ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα EpCAM σε περίπτωση πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης. Παρατηρείται θετικότητα μεγάλου αριθμού ηπατοκυττάρων με ποικιλία στην ένταση. (Χ400) Τα ευρήματα αυτά φαίνονται συνοπτικά παρακάτω (Πίνακας 33): 108