ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΥΛΙΚΩΝ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΒΑΘΜΩΤΗΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΥΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ Αστερία Ζήτρου Χηµικός ΑΠΘ Επίβλεψη: Αν. Καθηγήτρια Α. Παππά-Λουίζη

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φυσικής Χηµείας και Ηλεκτροχηµείας του Τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, υπό την άµεση επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Αδριανής Παππά-Λουίζη, την οποία ευχαριστώ θερµά για την υπόδειξη του θέµατος, τη συνεχή επιστηµονική καθοδήγηση, το αµείωτο ενδιαφέρον κατά τη διάρκεια της έρευνας και την πολύτιµη βοήθειά της. Θερµές ευχαριστίες θέλω να εκφράσω στον καθηγητή κ. Παναγιώτη Νικήτα και στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Βικτώρια Σαµανίδου, µέλη της τριµελούς εισηγητικής επιτροπής, για τις εποικοδοµητικές παρατηρήσεις και συµβουλές τους. Θέλω να εκφράσω την ευγνωµοσύνη µου στην οικογένειά µου για την αγάπη και την συµπαράστασή τους στη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών. Τέλος, να ευχαριστήσω την συνάδελφο και φίλη Ιωάννα Γεωργοπούλου για την βοήθειά της στο στήσιµο της παρουσίασης και ιδιαίτερα τον σύντροφό µου ηµήτρη Γράνη για την υποστήριξή του και τη δηµιουργία του εξωφύλλου.

I. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ. 1 II. ΓΕΝΙΚΟ-ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2 II.1 Γενικά για την βαθµωτή έκλουση στην Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC) 2 II.2 Βαθµωτή έκλουση µε µεταβολή της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης 7 II.3 Χηµική δοµή και σηµασία των προσδιοριζόµενων ενώσεων... 9 i) 1,4-διϋδροπυριδίνες.. 9 ii) Αµινοξέα 13 III. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ.. 16 IV. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑΤΑΞΗ - ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΣ ΣΤΑΘΕΡΕΣ ΤΑΧΥΤΗΤΕΣ ΡΟΗΣ. 18 IV.1.Πειραµατικά απoτελέσµατα των 1,4-διϋδροπυριδινών σε σταθερές ταχύτητες ροής... 22 IV.2 Πειραµατικά απoτελέσµατα των αµινοξέων σε σταθερές ταχύτητες ροής.. 23 V. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΕΝΩΣΕΩΝ ΚΑΤΩ ΑΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ 24 V.1. Ανάλυση αποτελεσµάτων των 1,4-διϋδροπυριδινών.. 25 V.2 Ανάλυση αποτελεσµάτων των αµινοξέων 34 VI. ΕΝ ΕΙΚΤΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ..... 38 VII. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 44 ΒΙΒΙΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. 46 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ.. 50 ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΠΟΥ ΠΡΟΕΚΥΨΑΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. 52

I. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στην παρούσα εργασία προσπαθήσαµε να προβλέψουµε την χρωµατογραφική έκλουση ενώσεων από στήλες αντίστροφης φάσης κάτω από συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης. Προς το σκοπό αυτό: 1. Bρήκαµε τις εξισώσεις που περιγράφουν θεωρητικά το χρόνο έκλουσης κάθε χρωµατογραφούµενης ένωσης κάτω από συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής µιας κινητής φάσης σταθερής σύστασης και 2. Eφαρµόσαµε τις εξισώσεις αυτές στα πειραµατικά δεδοµένα έκλουσης ενώσεων µε βιολογικό ή φαρµακευτικό ενδιαφέρον υπό συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής διαφόρων τύπων (βηµατικών, γραµµικών, πολυγραµµικών, παραβολικών και ακόµη περισσότερο πολύπλοκων µεταβολών). Τελικός στόχος της εργασίας αυτής ήταν η βελτιστοποίηση ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού κάτω από συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης που όµως για να γίνει µε επιτυχία πρέπει προηγουµένως να υπάρχει η δυνατότητα µιας αξιόπιστης πρόβλεψης της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς των ενώσεων υπό τις συνθήκες αυτές. 1

II. ΓΕΝΙΚΟ-ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ II.1 Γενικά για τη βαθµωτή έκλουση στην Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC). Η Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) είναι µια διαχωριστική τεχνική µε πολλές εφαρµογές τα τελευταία χρόνια, καθώς θεωρείται η πλέον κατάλληλη για τον ακριβή και επαναλήψιµο προσδιορισµό ενός µεγάλου φάσµατος χηµικών ενώσεων, τόσο οργανικών όσο και ανόργανων. Στην HPLC, το δείγµα εισάγεται στην αρχή της στήλης και µε τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά µετακινούνται µε τη µορφή ζωνών και τελικά εκλούονται το ένα µετά το άλλο. Οι προσδιοριζόµενες ενώσεις κατανέµονται µεταξύ στατικής και κινητής φάσης µε αποτέλεσµα να µετακινούνται µε διαφορετικές ταχύτητες κατά µήκος της στήλης. H διαφορετική ταχύτητα µετακίνησης των συστατικών αποτελεί τη βάση κάθε χρωµατογραφικού διαχωρισµού. Στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης τα λιγότερο πολικά συστατικά αλληλεπιδρούν περισσότερο µε τη σχετικά µη πολική επιφάνεια της στατικής φάσης και έτσι εκλούονται αργότερα από τα πολικά συστατικά του δείγµατος. Επίσης η έκλουση µιας ένωσης εξαρτάται από την πολικότητα της κινητής φάσης και γενικά ο χρόνος συγκράτησης ή έκλουσης αυξάνει µε την αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης. Ο χρόνος που χρειάζεται ένα συστατικό για να εξέλθει από τη στήλη και να φτάσει στον ανιχνευτή ονοµάζεται χρόνος συγκράτησης t R (retention time). Συνήθως ο χρόνος συγκράτησης κανονικοποιείται µε βάση τη σχέση: k = (t R t 0 )/t 0 (II.1) 2

όπου k ο παράγοντας συγκράτησης και t 0 ο νεκρός χρόνος, δηλαδή ο χρόνος συγκράτησης συστατικού που εξέρχεται από τη στήλη χωρίς να συγκρατηθεί. Ένα δείγµα που χρειάζεται να αναλυθεί µε HPLC χρησιµοποιώντας κινητή φάση σταθερής σύστασης, δηλαδή ισοκρατική έκλουση, αποτελείται συχνά από ενώσεις που διαφέρουν πολύ ως προς το χρόνο έκλουσής τους και µπορεί ο διαχωρισµός τους να µην είναι ικανοποιητικός, δηλαδή να απαιτείται πολύς χρόνος για το διαχωρισµό τους. Ο παράγοντας συγκράτησης k των ενώσεων που εκλούονται στο τέλος του χρωµατογραφήµατος θα πρέπει να είναι χαµηλότερος από 10 ώστε ο χρόνος ανάλυσης του δείγµατος να είναι σε αποδεκτά όρια. Έτσι λοιπόν, στην ισοκρατική έκλουση, αφού έχει επιλεχθεί η κατάλληλη στήλη για µία ανάλυση, στη συνέχεια προσδιορίζονται και η σύσταση της κινητής φάσης, η κατάλληλη ταχύτητα ροής και τέλος, η θερµοκρασία της στήλης που απαιτούνται για έναν καλό διαχωρισµό. Οι συνθήκες αυτές διατηρούνται σταθερές καθ όλη τη διάρκεια της ανάλυσης και συχνά τα αποτελέσµατα είναι τα επιθυµητά. Σε πολλές περιπτώσεις όµως πιο σύνθετων δειγµάτων και όταν οι συνθήκες καθορίζονται ώστε να είναι ικανοποιητική η έκλουση των ενώσεων που εµφανίζουν ισχυρή συγκράτηση, οι ενώσεις µε µικρή συγκράτηση εκλούονται στην αρχή του χρωµατογραφήµατος κοντά στο νεκρό χρόνο. Το αντίθετο συµβαίνει όταν οι συνθήκες καθορίζονται ώστε να είναι ικανοποιητικός ο διαχωρισµός των ενώσεων που εµφανίζουν µικρή συγκράτηση. Σε αυτή την περίπτωση οι ενώσεις που συγκρατούνται ισχυρά εκλούονται σε πολύ µεγάλο χρόνο, µε αποτέλεσµα να εµφανίζουν πολύ µικρές και ευρείες κορυφές που πολλές φορές είναι κάτω από το όριο ανίχνευσης και ο χρόνος ανάλυσης να είναι πολύ µεγάλος. Πολλές φορές λοιπόν για να πετύχουµε ικανοποιητικό διαχωρισµό κατά τη λήψη του χρωµατογραφήµατος οι συνθήκες λειτουργίας που καθορίζουν τη συγκράτηση θα πρέπει να µεταβάλλονται. Αυτό επιτυγχάνεται µεταβάλλοντας σταδιακά τις συνθήκες του διαχωρισµού, µε τους εξής τρόπους: 3

µεταβάλλοντας τη θερµοκρασία µεταβάλλοντας την ταχύτητα ροής µεταβάλλοντας τη σύσταση της κινητής φάσης, δηλαδή την ποσότητα του οργανικού διαλύτη, και µεταβάλλοντας το ph της κινητής φάσης. Ο προγραµµατισµός της ταχύτητας ροής περιορίζεται από τη µέγιστη πίεση λειτουργίας της αντλίας και έχει µικρό πλεονέκτηµα όταν χρησιµοποιούνται στήλες µε υλικό πλήρωσης που αποτελείται από µικρού µεγέθους σωµατίδια. Παρ όλο που οι µονολιθικές στήλες εµφανίζουν µικρότερη αντίσταση στη ροή και κατά συνέπεια είναι πιο κατάλληλες για λειτουργία µε προγραµµατισµένη ταχύτητα ροής, οι παράγοντες συγκράτησης είναι ανεξάρτητοι από την ταχύτητα ροής. Έτσι η βελτίωση στο διαχωρισµό είναι περιορισµένη σε σύγκριση µε τεχνικές που βασίζονται στη σταδιακή µείωση των παραγόντων συγκράτησης κατά τη διάρκεια της έκλουσης. Ο διαχωρισµός µπορεί να βελτιωθεί εφαρµόζοντας ταυτόχρονα βαθµωτή έκλουση µε µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης και προγραµµατισµό της ταχύτητας ροής. Ο χρόνος συγκράτησης στην HPLC συνήθως µειώνεται µε την αύξηση της θερµοκρασίας. Παρ όλα αυτά ο προγραµµατισµός της θερµοκρασίας χρησιµοποιείται σπάνια στην HPLC σε αντίθεση µε την αέρια χρωµατογραφία. Ένας λόγος είναι ο µεγάλος χρόνος απόκρισης της θερµοκρασίας στο εσωτερικό των συµβατικών στηλών σε σχέση µε τη µεταβολή της θερµοκρασίας στο φούρνο θερµαινόµενου αέρα της στήλης. Αυτό µπορεί να οδηγήσει σε µικρή επαναληψιµότητα των χρόνων συγκράτησης σε αναλύσεις µικρού χρόνου που απαιτούν απότοµες µεταβολές της θερµοκρασίας. Αυτός ο περιορισµός δεν αφορά τριχοειδείς στήλες HPLC που παρουσιάζουν γρήγορη µεταφορά θερµότητας. Επίσης, πολλά υλικά πλήρωσης στηλών δεν είναι αρκετά σταθερά σε υψηλές θερµοκρασίες. Συνήθως απαιτείται µεγάλη µεταβολή της θερµοκρασίας κατά τη µέτρηση για να µειωθεί αισθητά η συγκράτηση των ενώσεων που εκλούονται αργά. Έτσι, ο προγραµµατισµός της θερµοκρασίας 4

µπορεί να έχει αποτελέσµατα συγκρίσιµα µε εκείνα της βαθµωτής έκλουσης µε µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης σε µικρό σχετικά εύρος ισχύος έκλουσης. Η βαθµωτή έκλουση µε µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης παραµένει η πιο διαδεδοµένη τεχνική προγραµµατισµού στην HPLC από την εµφάνισή της το 1952. Σταδιακή αύξηση της ισχύος της κινητής φάσης µε την προσθήκη οργανικού διαλύτη, οδηγεί σε µείωση του παράγοντα συγκράτησης µικρών µορίων κατά δύο και τρεις τάξεις µεγέθους σε µία µέτρηση µε βαθµωτή έκλουση αυτού του είδους. Αποτέλεσµα είναι η µικρότερη διάρκεια ανάλυσης, η καλύτερη ανάλυση κορυφών και οι πιο συµµετρικές κορυφές για ενώσεις µε µεγάλη συγγένεια ως προς τη στατική φάση σε σχέση µε την ισοκρατική έκλουση. Το πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης µε µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης µπορεί είτε να αποτελείται από αρκετά διαδοχικά ισοκρατικά βήµατα είτε από γραµµική ή πολυγραµµική µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης. Μπορεί επίσης να είναι συνδυασµός βηµατικής και γραµµικής µεταβολής ή τέλος, οποιαδήποτε µεταβολή. Το προφίλ µιας βαθµωτής έκλουσης µε µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης ορίζεται από τρεις παραµέτρους: το εύρος της, δηλαδή την αρχική και τελική συγκέντρωση του οργανικού τροποποιητή το χρόνο του κάθε βήµατος και το σχήµα της Τα χαρακτηριστικά αυτά επηρεάζουν το χρόνο που λαµβάνεται το χρωµατογράφηµα και την απόσταση µεταξύ των κορυφών και πρέπει να λαµβάνονται υπ όψη κατά την ανάπτυξη των διαχωρισµών µε βαθµωτή έκλουση. Λόγω του µεγάλου αριθµού πειραµατικών µεταβλητών που χρειάζεται να ληφθούν υπ όψη, η ανάπτυξη µεθόδου µε βαθµωτή έκλουση είναι πιο πολύπλοκη από την ανάπτυξη µίας ισοκρατικής µεθόδου. Επιπλέον είναι δυσκολότερο να περιγραφεί η συµπεριφορά συγκράτησης στην περίπτωση της 5

βαθµωτής έκλουσης ποσοτικά. Οι διαστάσεις της στήλης και η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης επηρεάζουν τη συγκράτηση µε πιο πολύπλοκο τρόπο από ότι στην ισοκρατική έκλουση. Η αποτελεσµατική χρήση της τεχνικής της βαθµωτής έκλουσης είναι ευκολότερη εάν είναι κατανοητές οι θεωρητικές αρχές που τη διέπουν. Η καθ αυτή επίδραση ενός προγράµµατος βαθµωτής έκλουσης στο διαχωρισµό ενός δείγµατος εξαρτάται από την επίδραση της σύστασης της κινητής φάσης στη συγκράτηση. Για την περιγραφή της συγκράτησης στη χρωµατογραφία µε βαθµωτή έκλουση, πρέπει να είναι γνωστή η εξάρτηση του στιγµιαίου παράγοντα συγκράτησης. Για το σκοπό αυτό µπορεί να χρησιµοποιηθεί είτε κάποια εξίσωση βασισµένη στο ακριβές µοντέλο συγκράτησης είτε κάποια εµπειρική εξίσωση, αρκεί να περιγράφει µε ακρίβεια τα πειραµατικά δεδοµένα [1]. 6

II.2 Βαθµωτή έκλουση µε µεταβολή της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε η ταχύτητα ροής για τη µείωση του χρόνου ανάλυσης, τον έλεγχο του εύρους των κορυφών και τη βελτίωση του διαχωρισµού, παρ όλο που, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, δεν είναι τόσο αποτελεσµατική µέθοδος όσο οι µεταβολές στη συγκέντρωση της κινητής φάσης. Σε αρκετές εργασίες έχουν χρησιµοποιηθεί διαφορετικές αλλά σταθερές ταχύτητες ροής µε σκοπό τη βελτιστοποίηση του διαχωρισµού των κορυφών σε ένα χρωµατογράφηµα που λαµβάνεται ισοκρατικά [2,3] ή σε συνθήκες βαθµωτής µεταβολής του διαλύτη [4-6]. Ο προγραµµατισµός της ροής ή η βαθµωτή έκλουση µε µεταβολή της ταχύτητας ροής έχει επίσης προταθεί ως λύση στο γενικό πρόβληµα ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού και είναι πράγµατι ένας τρόπος για ταχύτερους διαχωρισµούς που όµως αυξάνει το διαχωρισµό των ενώσεων ενός δείγµατος που εκλούονται στην αρχή του χρωµατογραφήµατος εις βάρος εκείνων που εκλούονται στο τέλος [7,8]. Σε αυτή τη µέθοδο, η σύσταση της κινητής φάσης δε µεταβάλλεται κατά την έκλουση, δηλαδή χρησιµοποιούµε ισοκρατική έκλουση, αλλά η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης µεταβάλλεται (συνήθως αυξάνει) είτε συνεχόµενα είτε βηµατικά µε το χρόνο. Ο προγραµµατισµός της ροής χρησιµοποιείται σπάνια [9-13], ενώ αυτός ο τρόπος βαθµωτής µεταβολής συνδυάζεται µερικές φορές µε βαθµωτή µεταβολή του διαλύτη [14-19] και µε προγραµµατισµό της θερµοκρασίας [20-22]. Μέχρι τώρα, στις περισσότερες µελέτες δοκιµαζόταν εµπειρικά η µεταβολή της ταχύτητας ροής ως µέσο για τη βελτιστοποίηση των διαχωρισµών λαµβάνοντας εµπειρικά υπ όψη ότι αύξηση της ταχύτητας ροής επιφέρει τις ακόλουθες µεταβολές: 1. µικρότερου εύρους κορυφές 2. µικρότερα εµβαδά κορυφών 3. χειρότερο διαχωρισµό 4. µικρότερους χρόνους διαχωρισµού και 5. αυξηµένη πίεση της αντλίας 7

Από την άλλη µεριά, σε µερικές δηµοσιεύσεις µε θεωρητική επεξεργασία των πειραµατικών αποτελεσµάτων που πάρθηκαν κάτω από συνθήκες διαφορετικών ταχυτήτων ροής, δόθηκε έµφαση στη µεταβολή του εύρους των κορυφών ή του διαχωρισµού µε τη µεταβολή της ταχύτητας ροής και όχι στην πρόβλεψη του χρόνου συγκράτησης των ενώσεων [4,5,9,14,22]. Παρ όλα αυτά θα ήταν επιθυµητό να προβλέπονταν µε αξιοπιστία οι µετατοπίσεις των κορυφών σε ένα χρωµατογράφηµα ως συνάρτηση της ταχύτητας ροής γιατί η πρόβλεψη αυτή θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί ως µέθοδος για την ταυτοποίηση των κορυφών και να κάνει δυνατή τη βελτιστοποίηση ενός διαχωρισµού κάτω από συνθήκες ταυτόχρονων βαθµωτών µεταβολών, όπως για παράδειγµα ταυτόχρονης µεταβολής της ταχύτητας ροής και της συγκέντρωσης του οργανικού διαλύτη της κινητής φάσης. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν οι θεµελιώδεις εξισώσεις που περιγράφουν την έκλουση ενώσεων κάτω από συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής και εξετάστηκε η ισχύς των εξισώσεων αυτών στην πρόβλεψη των πειραµατικών δεδοµένων που πάρθηκαν εφαρµόζοντας µία ποικιλία προφίλ µεταβολών της ταχύτητας ροής µε το χρόνο. Οι ενώσεις που µελετήθηκαν στην εργασία αυτή ανήκουν σε δύο διαφορετικές οµάδες που έχουν ιδιαίτερο φαρµακευτικό ή βιολογικό ενδιαφέρον. Οι οµάδες αυτές είναι: i) των 1,4-διϋδροπυριδινών και ii) των αµινοξέων. 8

II.3 Χηµική δοµή και σηµασία των προσδιοριζόµενων ενώσεων i) 1,4-διϋδροπυριδίνες Οι διϋδροπυριδίνες είναι µόρια µε πυριδινικό δακτύλιο ο οποίος έχει ηµικορεστεί µε δύο υποκαταστάτες αντικαθιστώντας έναν απλό δεσµό. Οι περισσότερες από αυτές υφίστανται φωτοαποικοδόµηση στο φως της ηµέρας και στην ακτινοβολία UV. Οι 1,4-διϋδροπυριδίνες ανήκουν στην οµάδα των ανταγωνιστών ασβεστίου και λέγονται αλλιώς αναστολείς διόδου ασβεστίου. Οι ενώσεις αυτές χρησιµοποιούνται ευρέως ως φάρµακα. Μετά τη χορήγησή τους, υφίστανται συνήθως ενζυµατική οξείδωση στους πυριδινικούς µεταβολίτες τους, οι οποίοι δεν είναι φαρµακολογικά ενεργοί. Η κύρια χρήση των φαρµάκων αυτών είναι για την αντιµετώπιση προβληµάτων καρδιάς και του κυκλοφορικού συστήµατος, όπως υψηλή αρτηριακή πίεση και στηθάγχη. Οι πρώτοι ανταγωνιστές ασβεστίου ήταν η νιφεδιπίνη (Adalat ) και η βεραπαµίλη (Cordilox ), που δεν ανήκει στην οικογένεια των 1,4-διϋδροπυριδινών. Οι διάφοροι ανταγωνιστές ασβεστίου δρουν σε διαφορετικά µέρη της καρδιάς και του κυκλοφορικού συστήµατος και χρησιµοποιούνται για διάφορες παθήσεις. Αυτό τις διαφοροποιεί από άλλες οµάδες φαρµάκων όπου όλες οι ενώσεις της οµάδας έχουν παρόµοια δράση και χρησιµοποιούνται κυρίως για τις ίδιες παθήσεις. Οι ενώσεις αυτές δρουν µπλοκάροντας την κίνηση του ασβεστίου διαµέσου των κυτταρικών τοιχωµάτων. Ένας ανταγωνιστής εµποδίζει την είσοδο του ασβεστίου στο κύτταρο και κατά αυτόν τον τρόπο µεταβάλλει τον τρόπο λειτουργίας του κυττάρου. Στην περίπτωση της καρδιάς, µπλοκάροντας το ασβέστιο, µειώνεται η συστολή του καρδιακού µυός και ελαττώνεται ο αριθµός των ηλεκτρικών σηµάτων που παράγονται στην καρδιά ώστε να ρυθµιστεί ο καρδιακός παλµός. Οι ανταγωνιστές ασβεστίου χαλαρώνουν επίσης τον τόνο του καρδιακού µυός στα αιµοφόρα αγγεία ώστε αυτά να διαστέλλονται. 9

Στην παρούσα εργασία µελετήθηκαν οι πέντε 1,4-διϋδροπυριδίνες που απεικονίζονται παρακάτω στο Σχήµα ΙΙ.1. H N H N Cl Cl Φελοδιπίνη (FEL) Λασιδιπίνη (LAC) H N NH 2 H N Cl N 2 Αµλοδιπίνη (AML) Νιµοδιπίνη (NIM) 10

H N N 2 Νιτρενδιπίνη (NIT) Σχήµα II.1. 1,4-διϋδροπυριδίνες που µελετήθηκαν στην παρούσα εργασία Η νιµοδιπίνη (ΝΙΜ) κυκλοφόρησε πρώτα ως Nimotop από τη Bayer (Leverkusen, Nordrhein-Westfalen, Γερµανία). Αναπτύχθηκε αρχικά για την αντιµετώπιση της υψηλής αρτηριακής πίεσης. ε χρησιµοποιείται όµως συχνά γι αυτή την ένδειξη, αλλά έχει επιδείξει καλά αποτελέσµατα στην πρόληψη µίας σηµαντικής εµπλοκής αιµορραγίας του υποαραχνοειδούς που λέγεται αγγειοσπασµός. Αυτή είναι τώρα η κύρια χρήση της. Η αµλοδιπίνη (AML) κυκλοφόρησε αρχικά ως Norvasc και Istin από την Pfizer (New York City, ΗΠΑ) Είναι ευρείας δράσης και χρησιµοποιείται ως αντιυπερτασικό και για την αντιµετώπιση της στηθάγχης. Όπως και άλλοι ανταγωνιστές ασβεστίου, η αµλοδιπίνη δρα χαλαρώνοντας το λείο µυ στα αρτηριακά τοιχώµατα, ελαττώνοντας την περιφερειακή αντίσταση και µε τον τρόπο αυτό µειώνει την πίεση του αίµατος. Στη στηθάγχη, µειώνει την ροή του αίµατος στο µυοκάρδιο. Η φελοδιπίνη (FEL) κυκλοφόρησε αρχικά ως Plendil από την AstraZeneca (London, Ηνωµένο Βασίλειο) και χρησιµοποιείται για τον έλεγχο της υψηλής αρτηριακής πίεσης. H λασιδιπίνη (LAC) που πρωτοκυκλοφόρησε ως Lacipil από την Glaxo (GSK, Brentford, London, Ηνωµένο Βασίλειο) και η νιτρενδιπίνη (NIT) ως Baypress από την Bayer, έχουν ένδειξη µόνο για την αγωγή της αρτηριακής υπέρτασης. [23-25]. 11

ι δραστικές αυτές ενώσεις µπορούν να χορηγηθούν είτε από στόµατος είτε παρεντερικά και σε διάφορες φαρµακευτικές µορφές: ταµπλέτες, κάψουλες, σκόνες, εναιωρήµατα, διαλύµατα, σιρόπια, κλπ, καθώς και υγρά ενέσιµα. Οι 1,4-διϋδροπυριδίνες, όπως φαίνεται στο σχήµα ΙΙ.1, έχουν ένα διϋδροπυριδινικό δακτύλιο που µπορεί να οξειδωθεί κι έτσι µπορούν να ανιχνευθούν ηλεκτροχηµικά. Έχουν αναφερθεί µέχρι σήµερα πολλές µέθοδοι προσδιορισµού των 1,4 διϋδροπυριδινών κατά τον προσδιορισµό τους µε HPLC: MS ανίχνευση [26], UV ανίχνευση [27-30], αµπεροµετρική [31,32] ή και φθορισµοµετρική [33,34]. Η πλειοψηφία των εργασιών που αναφέρονται στον προσδιορισµό των 1,4-διϋδροπυριδινών είχαν ως στόχο τη βελτιστοποίηση των συνθηκών της ανίχνευσής τους και κυρίως την ανίχνευσή των 1,4-διϋδροπυριδινών σε βιολογικά υγρά σε διάφορες φαρµακοκινητικές µελέτες. Για τον ταυτόχρονο διαχωρισµό τους µε HPLC έχουν χρησιµοποιηθεί υδατικές κινητές φάσεις τροποποιηµένες µε έναν οργανικό διαλύτη, ακετονιτρίλιο ή µε µεθανόλη, ή µε δύο οργανικούς διαλύτες, ακετονιτρίλιο- µεθανόλη και σε διάφορες τιµές ph µεταξύ 3 και 7 και ταχύτητες ροής µεταξύ 0,8 και 2 ml/min [27,28,31,32]. Για την ηλεκτροχηµική ανίχνευση, έχει χρησιµοποιηθεί ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα στα 1000-1100mV ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl. Μελέτη σε διάφορες τιµές ph έδειξε ότι σε ph>8 παρατηρείται υδρολυτική αποικοδόµηση της νιτρενδιπίνης και της νισολδιπίνης [35]. Για την UV ανίχνευση έχουν χρησιµοποιηθεί διαφορετικά µήκη κύµατος: 230, 250 και 238 nm. Αποδείχτηκε ότι οι 1,4-διϋδροπυριδίνες διαχωρίζονται καλύτερα µε C 18 στήλες από ότι µε C 8 [27] και οποιαδήποτε από αυτές τις ενώσεις µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως εσωτερικό πρότυπο στην ταυτόχρονη ανίχνευση των υπολοίπων της οµάδας των 1,4-διϋδροπυριδινών. Τέλος, έχουν ταυτοποιηθεί και τα προϊόντα µεταβολισµού των 1,4- διϋδροπυριδινών για να είναι δυνατός ο προσδιορισµός της τελικής ποσότητας που απορροφάται µετά τη χορήγηση των 1,4-διϋδροπυριδινών [29,35]. 12

ii) Αµινοξέα Η βιολογική αξία των αµινοξέων είναι αδιαµφισβήτητη αφού µεταβολή της συγκέντρωσής τους στους ζωντανούς οργανισµούς µπορεί να επιφέρει διάφορες παθήσεις, για παράδειγµα νευρολογικές διαταραχές ή εµφάνιση κληρονοµικών µεταβολικών νοσηµάτων, οι οποίες µπορούν να οδηγήσουν ακόµη και σε θάνατο. Για το λόγο αυτό, από πολύ νωρίς η επιστήµη έχει στρέψει το ενδιαφέρον της προς την µελέτη των αµινοξέων και µέχρι σήµερα έχουν γίνει εκτενείς µελέτες για τον προσδιορισµό τους σε βιολογικά υγρά. H σπουδαιότητα του προσδιορισµού των αµινοξέων αποδεικνύεται από το γεγονός ότι για τις συγκεκριµένες ενώσεις έχουν κατασκευαστεί ειδικά όργανα για την ανάλυσή τους, γνωστά ως «αναλυτές αµινοξέων», τα οποία όµως είναι ακριβά και δύσχρηστα σε δουλειά ρουτίνας και σε περιπτώσεις όπου δεν είναι απαραίτητος ο προσδιορισµός όλων των αµινοξέων. Έτσι, σήµερα εξέχουσα θέση στον προσδιορισµό των αµινοξέων κατέχει η υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), η οποία είναι οικονοµική, ευέλικτη και εύχρηστη τεχνική [36-45]. Στην HPLC εφαρµόζονται κυρίως δυο µέθοδοι χρωµατογραφικού διαχωρισµού. Η µία υλοποιείται µε τη χρήση στηλών ιοντοανταλλαγής η οποία είναι και πιο συνηθισµένη λόγω της πολικότητας που εµφανίζουν τα αµινοξέα ενώ η δεύτερη, µε στήλες αντίστροφης φάσης κατά την οποία συνήθως τα αµινοξέα πριν το διαχωρισµό τους µετατρέπονται σε κατάλληλα παράγωγα για να διαχωριστούν ευκολότερα (pre-column derivatization) [46-48]. Για τον ταυτόχρονο διαχωρισµό των αµινοξέων, ειδικά στα βιολογικά υγρά, είναι απαραίτητη η χρήση της µεθόδου της βαθµωτής έκλουσης (gradient elution) [49-51], τόσο στην περίπτωση που χρησιµοποιούνται στήλες ιοντοανταλλαγής όσο και αντίστροφης φάσης. Προβληµατική όµως είναι και η ανίχνευση των αµινοξέων γιατί τα περισσότερα από αυτά δεν παρουσιάζουν µια ιδιαίτερα χρωµοφόρο ή ηλεκτροενεργή οµάδα µε αποτέλεσµα να µην είναι δυνατή στις περισσότερες περιπτώσεις η άµεση ανίχνευση των αµινοξέων και να απαιτείται παραγωγοποίηση αυτών µε κατάλληλα αντιδραστήρια όπως Ο-φθαλαλδεϋδη (PA),6-αµινο-κινολο-Ν-υδροξυσουκινιµιδικό καρβαµίδιο (AQC) κλπ. 13

Στην παρούσα µεταπτυχιακή εργασία µελετήθηκαν εννέα αµινοξέα τα οποία µπορούν να διαχωρίζονται και να ανιχνεύονται άµεσα, χωρίς παραγωγοποίηση, χρησιµοποιώντας στήλες αντίστροφης φάσης για το διαχωρισµό και UV ανίχνευση. Τα αµινοξέα αυτά απεικονίζονται στο Σχήµα ΙΙ.2. : CH 3 H 2 N CH C H H 2 N C C H H 2 N CH C H CH 2 CH 2 CH 2 H H H H β-(3,4-διυδροξυφαινυλ- α-µεθυλο-dopa (me-dopa) φαινυλαλανίνη (phe) αλανίνη) (dopa) H H H 2 N CH C H 2 N CH C H 2 N CH C H CH 2 CH 2 CH 2 2 N H H H τυροσίνη (tyr) µετα-τυροσίνη (m-tyr) 3-Ν-τυροσίνη (n-tyr) 14

CH 3 H 2 N C C H H 2 N CH C H H 2 N CH C H CH 2 CH 2 CH 2 HN H HN H µεθυλο-τυροσίνη (me-tyr) 5-υδροξυ-τρυπτοφάνη (5htp)τρυπτοφάνη (trp) Σχήµα ΙΙ.2. : Αµινοξέα που µελετήθηκαν στην παρούσα εργασία. 15

III. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μία οποιαδήποτε συνεχόµενη βαθµωτή µεταβολή της ταχύτητας ροής ή της σύστασης της κινητής φάσης, µπορεί να προσεγγιστεί από µία αντίστοιχη βηµατική µεταβολή που αποτελείται από ένα µεγάλο αριθµό, n, απειροελάχιστων µικρών βηµάτων δt, που το καθένα χαρακτηρίζεται από σταθερή στιγµιαία ταχύτητα ροής ή σύσταση κινητής φάσης. Αυτό αποτελεί µία λογική προσέγγιση, αφού όταν n οι δύο βαθµωτές µεταβολές ταυτίζονται, ανεξάρτητα από το σχήµα τους. Συνεπώς, µπορούµε να θεωρήσουµε ένα προφίλ βηµατικό, της µεταβολής της ταχύτητας ροής F µε το χρόνο t. Μια σηµαντική διαφορά του προφίλ αυτού και ενός βηµατικού προφίλ του κλάσµατος του οργανικού τροποποιητή στην κινητή φάση νερού - οργανικού διαλύτη, φ, µε το χρόνο, t, είναι ότι οποιαδήποτε µεταβολή του F φτάνει σχεδόν ακαριαία την ένωση που προσδιορίζεται, ενώ δε συµβαίνει το ίδιο για µεταβολές του φ [52-55]. Για το λόγο αυτό, εάν κάθε βήµα της µεταβολής του F σε συνάρτηση µε το t διαρκεί δt, τότε η απόσταση δl i που διανύει η ένωση στη στήλη υπό την επίδραση του βήµατος i th δίνεται από τη σχέση: Lδt LF t LF t L v t iδ iδ δ i = iδ = = = (ΙΙΙ.1) t λ t ( 1+ k ) R i 01 επειδή η ένωση που προσδιορίζεται µετακινείται µε σταθερή ταχύτητα v i = L/t Ri, όπου L το µήκος της χρωµατογραφικής στήλης, t Ri o ισοκρατικός χρόνος συγκράτησης της ένωσης όταν F = F i. Ο χρόνος αυτός µπορεί να εκφραστεί και ως t Ri = λ/f i, όπου λ η κλίση του γραµµικού διαγράµµατος του t Ri συναρτήσει του 1/F. Επιπλέον, ο χρόνος συγκράτησης t Ri σχετίζεται µε τον παράγοντα συγκράτησης k, µέσω της εξίσωσης: t Ri = t 0(i) (1+k), αφού εξ ορισµού k = (t Ri t 0(i) )/t 0(i), όπου t 0(i) είναι ο νεκρός χρόνος της στήλης όταν F = F i. Σηµειώνεται ότι ο νεκρός χρόνος σχετίζεται επίσης µε την ταχύτητα ροής µε τη σχέση t 0(i) = V 0 /F i, όπου V 0 ο νεκρός όγκος της στήλης. Αφού ο όγκος αυτός είναι 16

ανεξάρτητος της ταχύτητας ροής, εύκολα καταλήγουµε στη σχέση t 0(i) = t 01 /F i, όπου t 01 ο νεκρός χρόνος που αντιστοιχεί σε F = 1 σε αυθαίρετες µονάδες. Η ένωση εκλούεται όταν το άθροισµα των δl i γίνεται ίσο µε L. Οπότε από την εξίσωση (ΙΙΙ.1) συµπεραίνουµε ότι η ένωση εκλούεται όταν πληρούται η συνθήκη: δl L i n δt n Fi i= 1 01( 1+ k ) i= 1 δt = Fi = λ t 1 (ΙΙΙ.2) όπου n ο ελάχιστος αριθµός όρων του συνόλου για τον οποίο ισχύει η ανισότητα. Είναι φανερό ότι όταν πληρούται η εξίσωση (III.2), ο χρόνος έκλουσης της ένωσης t R δίνεται από τη σχέση: t R n = δt = nδt i= 1 (ΙΙΙ.3) Από την εξίσωση (ΙΙΙ.2) προκύπτει η βασική εξίσωση της έκλουσης κάτω από µεταβλητές ταχύτητες ροής σε µορφή ολοκληρώµατος. Έτσι έχουµε [7,9]: t 1 R t R λ 0 Fdt = t 01 1 ( 1+ k ) 0 Fdt = 1 (ΙΙΙ.4) 17

IV. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑΤΑΞΗ - ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΣ ΣΤΑΘΕΡΕΣ ΤΑΧΥΤΗΤΕΣ ΡΟΗΣ Για να ελεγχθούν οι παραπάνω εξισώσεις περιγραφής της έκλουσης ενώσεων κάτω από συνθήκες µεταβλητής ταχύτητας ροής, χρησιµοποιήθηκαν διάφοροι τύποι βαθµωτής µεταβολής της ταχύτητας ροής για το διαχωρισµό πέντε 1,4-διϋδροπυριδινών που αναφέρθηκαν στην εισαγωγή, σε συγκέντρωση 20 µg/ml, : αµλοδιπίνη (AML), νιτρενδιπίνη (NIT), νιµοδιπίνη (NIM), φελοδιπίνη (FEL) και λασιδιπίνη (LAC), οι οποίες ήταν προσφορά της εταιρίας Pharmathen SA, καθώς και εννέα αµινοξέων σε συγκέντρωση 10 µg/ml: β-(3,4- διϋδροξυφαινυλ)-l-αλανίνη (dopa, 99%), L-τυροσίνη (tyr, 99%), L-α-µεθυλdopa (me-dopa), DL-µ-τυροσίνη (m-tyr, 98%), DL-α-µεθυλ-τυροσίνη (me-tyr, 98%), 5-υδροξυ-τρυπτοφάνη (5htp), L-φαινυλαλανίνη (phe, 99%), 3-νιτρο-Lτυροσίνη (n-tyr, 99%) και L-τρυπτοφάνη (trp, Sigma Grade). Τα αµινοξέα ήταν της Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Germany. Η ανίχνευση έγινε σε ανιχνευτή UV (Shimadzu, Model SPD-10A) στα 250 nm για τις 1,4- διϋδροπυριδίνες και στα 200 nm για τα αµινοξέα. Στην ανίχνευση των 1,4- διϋδροπυριδινών χρησιµοποιήθηκε επιπλέον σε σειρά ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής. Το ηλεκτρόδιο εργασίας αποτελούνταν από υαλώδη άνθρακα και το δυναµικό ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl ήταν 1000 mv. Όλα τα πειράµατα διεξήχθησαν διατηρώντας τη θερµοκρασία της στήλης σταθερή στους 25 ο C χρησιµοποιώντας ειδικό φούρνο για στήλες Shimadzu CT-10ASVP. Το πρόγραµµα καταγραφής των χρωµατογραφηµάτων γράφτηκε στο εργαστήριο Φυσικοχηµείας σε γλώσσα Visual Basic. Χρησιµοποιήθηκε κάρτα ανάγνωσης δεδοµένων PCL-812PG (ADVANTECH, ΗΠΑ). Το σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας που χρησιµοποιήθηκε αποτελούνταν από αντλία Shimadzu LC-20AD και σύριγγα εισαγωγής του δείγµατος µοντέλο 7125 µε loop 20 µl (Rheodyne, Cotati, CA). Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικά ρυθµιστικά διαλύµατα φωσφορικών (ph 2.5) τροποποιηµένα µε διάφορα κλάσµατα όγκου φ, ακετονιτριλίου (ΜeCN). Η ολική ιονική ισχύς ήταν σταθερή στο Ι = 0.02 Μ. Στο διαχωρισµό των ενώσεων που µελετήθηκαν 18

χρησιµοποιήθηκαν στήλες αντίστροφης φάσης. Συγκεκριµένα χρησιµοποιήθηκε η στήλη ΜΖ-Kromasil C 18 5µm (250mm x 4.6mm) για το διαχωρισµό των 1,4- διϋδροπυριδινών, και η MZ-Aqua Perfect C 18 των ίδιων διαστάσεων για τα αµινοξέα. Για τον υπολογισµό της εξάρτησης του νεκρού χρόνου από την ταχύτητα ροής, µετρήθηκαν πειραµατικά οι χρόνοι έκλουσης του νερού σε διάφορες ταχύτητες ροής, στις δύο στήλες που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη. Τα αποτελέσµατα δίνονται στους πίνακες IV.1. και IV.2. Πίνακας IV.1. Εξάρτηση του t 0 από την ταχύτητα ροής, F, και από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F για τη στήλη Kromasil που χρησιµοποιήθηκε στη µελέτη των 1,4- διϋδροπυριδινών. Ταχύτητα ροής F (ml/min) 1/F t 0 (min) 0,5 2 4,201 1 1 2,144 1,5 0,667 1,491 2 0,5 1,213 Πίνακας IV.2. Εξάρτηση του t 0 από την ταχύτητα ροής, F, και από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F για τη στήλη Aqua Perfect που χρησιµοποιήθηκε στη µελέτη των αµινοξέων. Ταχύτητα ροής F (ml/min) 1/F t 0 (min) 0,2 5 12,7 0,5 2 5,1 1 1 2,58 1,5 0,667 1,7 19

Προφανώς όταν το t 0 ισούται µε µηδέν η ταχύτητα ροής θα τείνει στο άπειρο, και το αντίστροφο 1/F θα ισούται µε µηδέν, δηλαδή το διάγραµµα t 0 1/F θα πρέπει να περνάει από την αρχή των αξόνων. Έτσι από την εξίσωση που περιγράφει τη γραµµική εξάρτηση του t 0 από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F, t 0(i) =t 01 /F i, υπολογίζεται εύκολα η κλίση λ, που είναι το t 01, δηλαδή ο νεκρός χρόνος στη ροή 1mL/min. Αυτό φαίνεται στα παρακάτω διαγράµµατα. t0 (min) 5 4 3 2 1 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1/F (min/ml) Σχήµα IV.1 Εξάρτηση του t 0 από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F για τη στήλη Kromasil. 20

t0 (min) 14 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 1/F (min/ml) Σχήµα IV.2 Εξάρτηση του t 0 από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F για τη στήλη Aqua Perfect. Η εξάρτηση του χρόνου συγκράτησης (min) από την ταχύτητα ροής βρέθηκε ίση µε t 0(i) = 2.133 / F i για τη στήλη Kromasil και t 0(i) = 2.543 / F i για την Aqua Perfect. Όλοι οι υπολογισµοί έγιναν σε φύλλα Excel σε 3 GHz Pentium µονάδα επεξεργασίας µε Windows XP. 21

IV.1.Πειραµατικά απoτελέσµατα των 1,4-διϋδροπυριδινών σε σταθερές ταχύτητες ροής. Στον Πίνακα IV.3 φαίνονται οι µέσοι όροι των χρόνων συγκράτησης των 1,4-διϋδροπυριδινών, των ισοκρατικών µετρήσεων που πάρθηκαν σε κινητή φάση µε κλάσµα οργανικού τροποποιητή φ MeCN 0.5, 0.6 και 0.7 µε σταθερές ταχύτητες ροής F, 0.5, 1, 1.5 και 2 ml/min. Πίνακας IV.3 Χρόνοι έκλουσης των 1,4-διϋδροπυριδινών (σε min) σε συνθήκες ισοκρατικής έκλουσης µε διαφορετικές και σταθερές ταχύτητες ροής. Ταχύτητα ροής F φ MeCN AML NIT NIM FEL LAC 0,5 - - - - - 0,5 0,6 5,877 16,94 19,32 25,69 46,78 (ml/min) 0,7 5,966 11,14 12,13 15,32 23,31 0,5 3,965 16,88 20,34 28,23 63,07 1 (ml/min) 0,6 3,240 8,451 9,582 12,68 22,82 0,7 3,064 5,528 6,025 7,591 11,47 0,5 2,805 12,18 14,761 20,63 47,11 1,5 0,6 2,210 5,966 6,785 8,999 16,29 (ml/min) 0,7 2,070 3,847 4,199 5,307 8,099 0,5 2,095 8,919 10,816 15,13 34,26 2 0,6 1,714 4,601 5,246 6,965 12,66 (ml/min) 0,7 1,587 2,921 3,191 4,030 6,137 22

IV.2 Πειραµατικά απoτελέσµατα των αµινοξέων σε σταθερές ταχύτητες ροής. Στον Πίνακα IV.4 φαίνονται οι µέσοι όροι των χρόνων συγκράτησης των αµινοξέων, των ισοκρατικών µετρήσεων που πάρθηκαν σε κινητή φάση µε κλάσµα οργανικού τροποποιητή φ MeCN 0, 0.01 και 0.06 και µε ταχύτητα ροής F = 1 ml/min. Πίνακας IV.4. Χρόνοι έκλουσης των αµινοξέων (σε min) σε συνθήκες ισοκρατικής έκλουσης µε ταχύτητα ροής 1 ml/min. ένωση φ ΜeCN 0 0,01 0,06 dopa 10,30 7,69 3,95 tyr 17,29 12,07 4,67 me-dopa 28,16 17,30 5,11 m-tyr 21,66 15,06 5,69 me-tyr 46,70 28,09 6,86 5-htp 48,37 30,80 7,72 phe 34,04 23,54 8,44 n-tyr 74,37 48,11 13,05 trp 124,1 77,66 20,94 23

V. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΕΝΩΣΕΩΝ ΚΑΤΩ ΑΠΟ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΡΟΗΣ Για να προβλέψουµε το χρόνο έκλουσης t R των ενώσεων στα δείγµατά µας κάτω από συνθήκες µεταβλητής ταχύτητας ροής, εφαρµόσαµε τις εξισώσεις (ΙΙΙ.3) ή και (ΙΙΙ.4). Η πρόβλεψη µπορεί να γίνει για οποιοδήποτε προφίλ προγραµµατισµένης µεταβλητής ταχύτητας ροής για συγκεκριµένη συγκέντρωση κινητής φάσης, χρησιµοποιώντας την εξίσωση (ΙΙΙ.3), ενώ για τη χρησιµοποίηση της εξίσωσης (III.4) είναι απαραίτητο να λύνεται το ολοκλήρωµα. Σε κάθε περίπτωση, µπορεί η λύση των εξισώσεων αυτών να στηριχθεί στις τιµές του παράγοντα συγκράτησης k ή στις τιµές της κλίσης λ των χρόνων συγκράτησης ως προς το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F. Εδώ θα πρέπει να τονιστεί ότι ένα µόνο πειραµατικό σηµείο ισοκρατικής έκλουσης σε µία ταχύτητα ροής είναι αρκετό για τον υπολογισµό των k και λ, αφού: α) οι τιµές k είναι εξ ορισµού ανεξάρτητες της ταχύτητας ροής και β) η σχέση µεταξύ χρόνου συγκράτησης της ένωσης και της ταχύτητας ροής βρίσκεται από τη σχέση t R = λ/f που θα πρέπει να περνάει από την αρχή των αξόνων. Τέλος, ένας άλλος τρόπος πρόβλεψης των χρόνων έκλουσης των ενώσεων, είναι από την εφαρµογή της εξίσωσης εξάρτησης του παράγοντα συγκράτησης k ως προς τη συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση, φ, lnk = a cφ/(1+bφ) (V.5) δηλαδή, αν δεν είναι γνωστά τα k ή λ για το κλάσµα οργανικού τροποποιητή φ στο οποίο έχουµε πάρει ένα χρωµατογράφηµα υπό συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής, αλλά γνωρίζουµε τους χρόνους έκλουσης και το νεκρό χρόνο t 0 σε άλλες τιµές όγκου οργανικού τροποποιητή φ, µπορούµε να προσαρµόσουµε τις τιµές αυτές στην εξίσωση (V.5) και να υπολογίσουµε τις παραµέτρους a, b και c. Στη συνέχεια µπορούµε να υπολογίσουµε το k µε τη 24

λύση της εξίσωσης (V.5) για τη δεδοµένη πειραµατική τιµή του φ. Προϋπόθεση είναι η συγκέντρωση της κινητής φάσης που θέλουµε να υπολογίσουµε τον παράγοντα συγκράτησης, να είναι κοντά στο εύρος φ των τιµών που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό των a, b και c. Παρακάτω δίνεται η ανάλυση των αποτελεσµάτων έκλουσης των ενώσεων που µελετήσαµε κάτω από διαφορετικές συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής. V.1. Ανάλυση αποτελεσµάτων των 1,4-διϋδροπυριδινών Αντίστοιχα µε την εξάρτηση του t 0 από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής, µελετήθηκε και η εξάρτηση του t Ri από το 1/F i. Στους παρακάτω πίνακες και διαγράµµατα φαίνεται η εξάρτηση του χρόνου έκλουσης t Ri από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F i για τα τρία κλάσµατα οργανικού τροποποιητή που χρησιµοποιήθηκαν, καθώς και η κλίση λ που προκύπτει από αυτήν την εξάρτηση. tr (min) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 LAC FEL NIM NIT AML 1/Fi (min/ml) Σχήµα V.1. Εξάρτηση του χρόνου έκλουσης από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής σε κινητή φάση µε φ MeCN = 0,5. 25

tr (min) 50 40 30 20 10 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1/Fi (min/ml) LAC FEL NIM NIT AML Σχήµα V.2. Εξάρτηση του χρόνου έκλουσης από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής σε κινητή φάση φ MeCN = 0,6. tr (min) 25 20 15 10 5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1/Fi (min/ml) LAC FEL NIM NIT AML Σχήµα V.3. Εξάρτηση του χρόνου έκλουσης από το αντίστροφο της ταχύτητας ροής σε κινητή φάση φ MeCN = 0,7. 26

Πίνακας V.1. Τιµές της κλίσης λ και του R 2 που προκύπτουν από τις εξισώσεις των διαγραµµάτων γραµµικής εξάρτησης του χρόνου συγκράτησης t R από το 1/F. Ένωση φ MeCN = 0,5 φ MeCN = 0,6 φ MeCN = 0,7 R 2 λ R 2 λ R 2 λ AML 0,9871 4,062 0,9853 3,042 0,9986 3,015 NIT 0,9795 17,38 0,9977 8,536 0,9991 5,591 NIM 0,9757 21,00 0,9977 9,722 0,999 6,091 FEL 0,9703 29,24 0,9977 12,92 0,999 7,689 LAC 0,9524 65,87 0,9976 23,46 0,9987 11,69 Παρατηρούµε από τα διαγράµµατα και από τους αντίστοιχους πίνακες ότι η εξάρτηση του χρόνου συγκράτησης t R σε διάφορες σταθερές συστάσεις κινητής φάσης ως προς το αντίστροφο της ταχύτητας ροής 1/F i είναι γραµµική, και περνάει από την αρχή των αξόνων, αφού όταν η ταχύτητα ροής τείνει στο άπειρο, οπότε το 1/F i θα τείνει στο µηδέν, τότε θα πρέπει και το t R να τείνει στο µηδέν. Έτσι, µπορούµε γνωρίζοντας το χρόνο έκλουσης για µία τιµή σταθερής ταχύτητας ροής, να υπολογίσουµε την κλίση λ δηλαδή τον χρόνο έκλουσης της ένωσης t R σε ροή 1 ml/min και συνεπώς το χρόνο έκλουσης σε οποιαδήποτε ταχύτητα ροής αφού t Ri = λ/f i ή t Ri = t R1 /F i. Στο σύστηµα των 1,4-διϋδροπυριδινών που µελετήσαµε σε τέσσερις ταχύτητες ροής για κάθε σύσταση κινητής φάσης, αποδείχτηκε σε καθεµία από τις ενώσεις αυτές και για κάθε κινητή φάση µε διαφορετικό κλάσµα οργανικού τροποποιητή ότι οι τιµές k που προέκυψαν είναι αρκετά σταθερές µε την ταχύτητα ροής. Έτσι, χρησιµοποιήθηκαν οι µέσοι όροι <k> και οι κλίσεις λ που προέκυψαν στη λύση των εξισώσεων (ΙΙΙ.3) ή (ΙΙΙ.4) για την πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης των 1,4-διϋδροπυριδινών κάτω από συνθήκες βαθµωτής ταχύτητας ροής. 27

Οι τιµές των µέσων όρων <k> και των κλίσεων λ των τιµών t R ως προς 1/F που χρησιµοποιήθηκαν τελικά στις εξισώσεις (ΙΙΙ.3) και (ΙΙΙ.4) φαίνονται στον πίνακα V.2 Πίνακας V.2. Μέσοι όροι των παραγόντων συγκράτησης των 1,4-διϋδροπυριδινών <k> και κλίσεων λ των χρόνων συγκράτησης τους συναρτήσει του 1/F σε διαφορετικές συστάσεις κινητής φάσης. Ένωση φ ΜeCN = 0,5 φ MeCN = 0,6 φ MeCN = 0,7 <k> λ <k> λ <k> λ AML 0,932 4,062 0,514 3,042 0,445 3,015 NIT 7,280 17,38 3,111 8,536 1,662 5,591 NIM 9,020 21,00 3,678 9,722 1,903 6,091 FEL 12,98 29,24 5,207 12,92 2,665 7,689 LAC 30,61 65,86 10,25 23,46 4,57 11,69 Xρησιµοποιώντας τις τιµές αυτές του πίνακα V.2 στις εξισώσεις (ΙΙΙ.3) ή (ΙΙΙ.4), µπορούµε να προβλέψουµε το χρόνο συγκράτησης των διϋδροπυριδινών κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες βαθµωτής µεταβολής της ταχύτητας ροής. Επίσης, από τις τιµές των χρόνων συγκράτησης <k> του πίνακα V.2 βρήκαµε υπολογιστικά τις παραµέτρους a, b και c της εξίσωσης (V.5) (βλ. πίνακα V.3). Συνεπώς, µπορούµε να υπολογίσουµε τον παράγοντα συγκράτησης k για οποιοδήποτε φ στην περιοχή µεταξύ φ=0,5 και φ=0,7 και να τον εφαρµόσουµε στις εξισώσεις (III.3) ή (III.4) για να προβλέψουµε τους χρόνους συγκράτησης κάτω από συνθήκες µεταβαλλόµενης ταχύτητας ροής. 28

Πίνακας V.3. Τιµές των a, b και c της εξίσωσης (V.5) που περιγράφουν τη χρωµατογραφική συµπεριφορά των 1,4-διϋδροπυριδινών. Ένωση a b c AML 12,78 8,349 133,6 NIT 18,46 4,943 114,5 NIM 19,09 4,772 114,4 FEL 19,59 4,715 114,4 LAC 21,98 4,149 114,2 Για τη µελέτη της πρόβλεψης του χρόνου συγκράτησης κάτω από συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής, χρησιµοποιήθηκαν τόσο γραµµικές όσο και βηµατικές µεταβολές της ταχύτητας ροής σε διάφορες κινητές φάσεις µε φ MeCN 0.5, 0.6 και 0.7. Ο τρόπος µεταβολής της ροής δίνεται στα σχήµατα V.4 και V.5, ενώ τα πειραµατικά αποτελέσµατα, καθώς και οι θεωρητικές προβλέψεις που προέκυψαν από τις εξισώσεις (III.3) ή (III.4) δίνονται στους πίνακες V.4 και V.5. 29

2,5 F (ml/min) 2,0 1,5 1,0 1 2 3 4 7 5 8 9 6 10 0,5 0,0 0 10 20 30 40 50 60 t (min) Σχήµα V.4. ιάφοροι τύποι γραµµικής µεταβολής της ταχύτητας ροής που χρησιµοποιήθηκαν για το διαχωρισµό των 1,4-διϋδροπυριδινών. 2 1,5 I II III F (ml/min) 1 0,5 0 5 10 15 20 t (min) Σχήµα V.5. ιάφοροι τύποι βηµατικής µεταβολής της ταχύτητας ροής που χρησιµοποιήθηκαν για το διαχωρισµό των 1,4-διϋδροπυριδινών. 30

Οι πειραµατικές τιµές των χρόνων έκλουσης των ενώσεων κάτω από συνθήκες µεταβολής της ταχύτητας ροής που αντιστοιχούν στο σχήµα V.4 καθώς και οι θεωρητικές προβλέψεις και η ποσοστιαία απόκλιση αυτών δίνονται στον Πίνακα V.4. 31

Πίνακας V.4. Σύγκριση πειραµατικών και θεωρητικών τιµών χρόνου συγκράτησης στη γραµµική µεταβολή ταχύτητας ροής. ένωση 1 (φ MeCN = 0,7) 2 (φ MeCN = 0,7) t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα AML 2,332 2,28 2,2 3,168 3,16 0,3 NIT 3,686 3,58 2,9 4,765 4,70 1,4 NIM 3,946 3,84 2,7 5,037 4,96 1,5 FEL 4,785 4,66 2,6 5,869 5,78 1,5 LAC 6,902 6,70 2,9 7,971 7,82 1,9 µέσος όρος 2,7 1,3 ένωση 3 (φ MeCN = 0,7) 4 (φ MeCN = 0,6) t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα AML 3,935 3,88 1,4 4,704 4,76 1,2 NIT 6,013 5,98 0,5 9,999 10,02 0,2 NIM 6,375 6,34 0,5 10,94 10,96 0,2 FEL 7,450 7,40 0,7 13,26 13,26 0,0 LAC 9,791 9,68 1,1 19,53 19,48 0,3 µέσος όρος 0,9 0,4 ένωση 5 (φ MeCN = 0,6) 6 (φ MeCN = 0,5) t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα AML 3,513 3,54 0,8 6,530 6,84 4,7 NIT 11,87 11,94 0,6 20,75 21,48 3,5 NIM 13,23 13,30 0,5 23,76 24,60 3,5 FEL 15,98 16,02 0,3 29,93 30,93 3,3 LAC 22,11 22,00 0,5 51,24 52,44 2,4 µέσος όρος 0,5 3,5 ένωση 7 (φ MeCN = 0,6) 8 (φ MeCN = 0,6) t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα AML 4,780 4,86 1,7 5,308 5,32 0,2 NIT 10,35 10,36 0,1 11,79 11,88 0,8 NIM 11,33 11,36 0,3 12,99 13,10 0,9 FEL 13,76 13,80 0,3 15,96 16,10 0,9 LAC 20,97 21,00 0,2 24,15 24,32 0,7 µέσος όρος 0,5 0,7 ένωση 9 (φ MeCN = 0,5) 10 (φ MeCN = 0,5) t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα t(πειρ) t(θεωρ) % σφάλµα AML 6,568 6,87 4,6 6,836 7,20 5,3 NIT 20,98 21,78 3,8 22,88 23,88 4,4 NIM 24,05 24,96 3,8 26,36 27,54 4,5 FEL 30,33 31,41 3,6 33,57 35,04 4,4 LAC 54,64 56,61 3,6 59,12 61,62 4,2 µέσος όρος 3,9 4,6 32

Τα αποτελέσµατα των πειραµατικών µετρήσεων µε βηµατική µεταβολή της ταχύτητας ροής που αντιστοιχούν στο σχήµα V.5 δίνονται στον πίνακα V.5, όπου φαίνεται ότι η θεωρητική πρόβλεψη είναι εξίσου ικανοποιητική. Πίνακας V.5. Σύγκριση πειραµατικών και θεωρητικών τιµών χρόνου συγκράτησης στη βηµατική µεταβολή ταχύτητας ροής. ένωση I (φ MeCN = 0,6) IΙ (φ MeCN = 0,6) IΙΙ (φ MeCN = 0,6) % % % t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) σφάλµα σφάλµα σφάλµα AML 2,850 2,82 1,1 3,244 3,22 0,7 3,243 3,22 0,7 NIT 6,591 6,50 1,4 7,564 7,50 0,8 8,759 8,76 0,0 NIM 7,409 7,32 1,2 8,371 8,32 0,6 9,970 9,96 0,1 FEL 9,615 9,48 1,4 10,58 10,48 0,9 12,19 12,16 0,2 LAC 16,90 16,66 1,4 17,87 17,66 1,2 19,46 19,32 0,7 µέσος όρος 1,3 0,9 0,4 ένωση I (φ MeCN = 0,5) IΙ (φ MeCN = 0,5) III (φ MeCN = 0,5) % % % t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) σφάλµα σφάλµα σφάλµα AML 3,356 3,42 1,9 3,968 4,12 3,8 3,983 4,12 3,4 NIT 12,22 12,44 1,8 13,19 13,44 1,9 14,81 15,10 2,0 NIM 14,64 14,92 1,9 15,61 15,92 2,0 17,22 17,58 2,1 FEL 20,15 20,54 1,9 21,14 21,54 1,9 22,77 23,20 1,9 LAC 44,56 45,60 2,3 45,66 46,60 2,1 47,54 48,28 1,6 µέσος όρος 2,0 2,3 2,2 Από την ανάλυση των παραπάνω αποτελεσµάτων προέκυψε το συµπέρασµα ότι η πρόβλεψη που προκύπτει από την εφαρµογή των εξισώσεων (III.3) ή (III.4) για τους χρόνους έκλουσης των 1,4-διϋδροπυριδινών είναι πολύ ικανοποιητική και µάλιστα εξίσου ικανοποιητική αν χρησιµοποιήσουµε τις τιµές k ή λ του πίνακα V.2 ή τις τιµές a, b και c του πίνακα V.3. 33

V.2 Ανάλυση αποτελεσµάτων των αµινοξέων Στην περίπτωση των αµινοξέων, χρησιµοποιήσαµε τα πειραµατικά δεδοµένα του πίνακα IV.4 τα οποία προσαρµόσαµε στην εξίσωση (V.5) για να υπολογίσουµε τα a, b και c. Στη συνέχεια, από την εξίσωση (V.5), υπολογίσαµε τους παράγοντες συγκράτησης k που αντιστοιχούν στα κλάσµατα του οργανικού τροποποιητή φ=0,063 και φ=0,068 που χρησιµοποιήθηκαν στα συστήµατα βαθµωτής έκλουσης µε µεταβολή της ταχύτητας ροής. Οι τιµές των a, b και c που προέκυψαν δίνονται στον πίνακα V.6. Πίνακας V.6. Τιµές των a, b και c της εξίσωσης (V.5) που προέκυψαν για τα αµινοξέa από τα πειραµατικά δεδοµένα του πίνακα IV.4. Ένωση a b c dopa 1,116 99,93 46,99 tyr 1,728 95,79 92,09 me-dopa 2,339 24,63 74,13 m-tyr 1,981 25,59 50,58 me-tyr 2,986 22,36 85,28 5htp 3,093 22,04 83,99 phe 2,552 22,02 58,63 n-tyr 3,503 14,69 65,93 trp 3,968 8,649 52,39 Οι τιµές της κλίσης λ των t R ως προς 1/F προέκυψαν από ένα µόνο πειραµατικό σηµείο, αφού όπως αναφέρθηκε παραπάνω µία τιµή του χρόνου έκλουσης σε κάθε φ είναι αρκετή αφού το γραµµικό διάγραµµα t R 1/F περνάει από την αρχή των αξόνων. Οι τιµές αυτές λ καθώς και ο µέσος όρος των παραγόντων συγκράτησης <k> δίνονται στον πίνακα V.7. 34

Πίνακας V.7. Τιµές παραγόντων συγκράτησης k και κλίσης λ των χρόνων έκλουσης συναρτήσει του 1/F των αµινοξέων για διάφορες συστάσεις κινητής φάσης ένωση φ MeCN = 0,06 φ ΜeCN = 0,063 φ ΜeCN = 0,068 <k> λ <k> λ <k> λ dopa 0,529 3,890 0,516 3,854 0,505 3,827 tyr 0,882 4,786 0,784 4,536 0,705 4,335 me-dopa 1,066 5,254 0,924 4,892 0,810 4,602 m-tyr 1,244 5,707 1,112 5,370 1,006 5,100 me-tyr 1,756 7,009 1,519 6,406 1,328 5,919 5htp 2,087 7,852 1,829 7,194 1,615 6,651 phe 2,306 8,408 2,081 7,836 1,898 7,370 ntyr 4,066 12,883 3,621 11,752 3,261 10,836 trp 7,155 20,740 6,295 18,550 5,651 16,913 Αντίστοιχα µε τις 1,4-διϋδροπυριδίνες στο σχήµα V.6. φαίνονται οι τύποι βαθµωτής µεταβολής της ταχύτητας ροής που χρησιµοποιήθηκαν για την έκλουση του µίγµατος των εννέα αµινοξέων. 2.5 2.0 a F (ml/min) 1.5 1.0 b c d e 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 30 t (min) Σχήµα V.6. ιάφοροι τύποι βαθµωτής µεταβολή της ταχύτητας ροής που χρησιµοποιήθηκαν για την ανίχνευση των αµινοξέων. 35

Τα πειραµατικά αποτελέσµατα των χρόνων έκλουσης σε σύγκριση µε τις θεωρητικές προβλέψεις από την εφαρµογή των εξισώσεων (III.3) ή (III.4) δίνονται παρακάτω. 36

Ένωση Πίνακας V.8. Σύγκριση πειραµατικών και θεωρητικών τιµών χρόνου συγκράτησης στη γραµµική βαθµωτή ταχύτητα ροής σε διάφορους τρόπους µεταβολής της ταχύτητας ροής όπως φαίνεται στο σχήµα V.5. a (φ = 0,063) b (φ = 0,06) c (φ = 0,068) d (φ = 0,06) e (φ = 0,06) % % % % % t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) t(πειρ) t(θεωρ) σφάλµα σφάλµα σφάλµα σφάλµα σφάλµα dopa 2,552 2,56 0,3 3,772 3,80 0,7 3,637 3,74 2,8 9,077 9,08 0,0 8,918 8,88 0,4 m-tyr 3,651 3,66 0,2 7,956 8,10 1,8 7,685 7,93 3,2 12,55 12,44 0,9 14,00 13,66 2,4 tyr 3,037 3,04 0,1 5,441 5,60 2,9 4,724 5,10 8,0 10,79 10,74 0,4 11,16 10,98 1,6 medopa 3,288 3,30 0,4 6,694 6,96 4,0 5,884 6,27 6,5 11,63 11,72 0,8 12,43 12,46 0,2 metyr 4,438 4,46 0,5 10,4 10,52 1,1 9,823 10,03 2,1 14,60 14,60 0,0 18,76 18,48 1,5 5htp 5,068 5,1 0,6 12,31 12,38 0,6 11,36 11,55 1,7 15,83 15,64 1,2 21,52 21,08 2,0 phe 5,609 5,62 0,2 12,87 12,9 0,2 12,69 12,83 0,2 16,76 16,76 0,0 22,37 22,32 0,2 n-tyr 8,155 8,14 0,2 15,85 15,88 0,2 16,06 16,09 3,4 21,38 21,22 0,7 25,90 25,66 0,9 trp 11,57 11,58 0,1 21,020 21,12 0,5 20,04 19,36 3,2 27,45 27,26 0,7 30,8 30,56 0,8 µέσος όρος 0,3 1,3 3,2 0,5 1,1 37

VI. ΕΝ ΕΙΚΤΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ 0.5 0.4 1 3 4 (A) 0.3 2 AU 0.2 5 6 0.1 7 8 9 0.0 0.4 1 3 4 (B) AU 0.3 0.2 2 5 6 0.1 7 8 9 0.0 10 20 30 40 t (min) Σχήµα VI.1. Χρωµατογράφηµα µε ανίχνευση UV των αµινοξέων σε (Α) σταθερή ταχύτητα ροής 0,5 ml/min και (Β) µε προγραµµατισµό ταχύτητας ροής που αντιστοιχεί στο διάγραµµα e του σχήµατος V.6. Το κλάσµα του οργανικού τροποποιητή ακετονιτριλίου ήταν φ=0,06. ΟΙ κορυφές αντιστοιχούν σε (1) dopa, (2) tyr, (3) medopa, (4) m-tyr, (5) me-tyr, (6) 5htp, (7) phe, (8) n-tyr, (9) trp. Οι διακεκοµµένες γραµµές αντιστοιχούν στους χρόνους έκλουσης που προβλέπουν οι εξισώσεις (ΙΙΙ.3) ή (ΙΙΙ.4) Στο χρωµατογράφηµα (Β) του σχήµατος VI.1 παρατηρούµε ότι η εφαρµογή µιας βαθµωτής έκλουσης µε πολύπλοκη µεταβολή της ταχύτητας ροής, δηλαδή αρχική οµαλή µείωση της ταχύτητας ροής, στη συνέχεια απότοµη αύξηση και στην κατάλληλη χρονική στιγµή διατήρηση της ροής σε σταθερή τιµή, επιφέρει σηµαντική βελτίωση στο διαχωρισµό. Ο διαχωρισµός φαίνεται να έχει βελτιωθεί σηµαντικά ακόµα και από συνθήκες µικρής σταθερής ταχύτητας ροής 0,5 ml/min που φαίνεται στο χρωµατογράφηµα (Α) του ίδιου σχήµατος. 38

0.18 0.14 (Β) 0.1 AU 0.06 0.02 (A) -0.02 0 10 20 30 40 50 60 t (min) Σχήµα VI.2. Χρωµατογράφηµα µε ανίχνευση UV των 1,4-διϋδροπυριδινών σε (Α) σταθερή ταχύτητα ροής 1 ml/min και (Β) µε προγραµµατισµό ταχύτητας ροής που αντιστοιχεί στο διάγραµµα Ι του σχήµατος V.5. Το κλάσµα του οργανικού τροποποιητή ακετονιτριλίου ήταν φ=0,5. Η σειρά έκλουσης των ενώσεων είναι AML, NIT, NIM, FEL και LAC. Παρατηρούµε στο χρωµατογράφηµα (B) του σχήµατος VI.2, ότι µε την εφαρµογή του προφίλ µε βηµατική µεταβολή της ταχύτητας ροής δεν επέρχεται ουσιαστική αλλαγή στο διαχωρισµό των ενώσεων. Παρ όλα αυτά, ο χρόνος διαχωρισµού µειώνεται. Η ταχύτητα ροής αυξάνεται απότοµα από 1 ml/min σε 1,5 ml/min και στη συνέχεια διατηρείται σταθερή. 39

1000 800 (Β) 600 I (na) 400 200 (A) 0-200 0 5 10 15 20 25 t (min) Σχήµα VI.3. Χρωµατογράφηµα µε ηλεκτροχηµική ανίχνευση των 1,4-διϋδροπυριδινών σε (Α) σταθερή ταχύτητα ροής 1 ml/min και (Β), µε προγραµµατισµό ταχύτητας ροής που αντιστοιχεί στo διάγράµµα Ι του σχήµατος V.5. Το κλάσµα του οργανικού τροποποιητή ακετονιτριλίου ήταν φ=0,6. Η σειρά έκλουσης των ενώσεων είναι AML, NIT, NIM, FEL και LAC. Στο σχήµα VI.3 παρατηρούµε ότι οι ενώσεις εκλούονται πιο κοντά η µία στην άλλη στο χρωµατογράφηµα (Β), όµως δεν υπάρχει ουσιαστική διαφορά στο διαχωρισµό και στα εµβαδά των κορυφών. Όπως και στο προηγούµενο σχήµα, η ταχύτητα ροής αυξάνεται απότοµα σε κάποια δεδοµένη χρονική στιγµή και στη συνέχεια διατηρείται σταθερή. 40

0,35 0,25 (B) AU 0,15 0,05 (A) -0,05 0 5 10 15 20 25 30 t (min) Σχήµα VI.4. Χρωµατογράφηµα µε ανίχνευση UV των 1,4-διϋδροπυριδινών σε (A) σταθερή ταχύτητα ροής 0,5 ml/min και (B) µε προγραµµατισµό ταχύτητας ροής που αντιστοιχεί στο διάγραµµα 3 του σχήµατος V.4. Το κλάσµα του οργανικού τροποποιητή ακετονιτριλίου ήταν φ=0,7. Η σειρά έκλουσης των ενώσεων είναι AML, NIT, NIM, FEL και LAC. Στο χρωµατογράφηµα (B) του σχήµατος VI.4 η αύξηση της ταχύτητας ροής είναι γραµµική µέχρι µια δεδοµένη χρονική στιγµή και στη συνέχεια διατηρείται σταθερή. Οι ενώσεις εκλούονται σε πολύ µικρότερο χρόνο από ότι µε σταθερή ταχύτητα ροής, οι κορυφές είναι πιο οξείες και ο διαχωρισµός είναι πολύ ικανοποιητικός. 41

0.58 0.48 (C) 0.38 AU 0.28 (B) 0.18 0.08 (A) -0.02 0 5 10 15 20 25 30 t (min) Σχήµα VI.5. Χρωµατογράφηµα µε ανίχνευση UV των 1,4-διϋδροπυριδινών σε (A) σταθερή ταχύτητα ροής 1 ml/min και (B) και (C) µε προγραµµατισµό ταχύτητας ροής που αντιστοιχεί στα διαγράµµατα 3 και 7 του σχήµατος V.4 αντίστοιχα. Το κλάσµα του οργανικού τροποποιητή ακετονιτριλίου ήταν φ=0,6. Η σειρά έκλουσης των ενώσεων είναι AML, NIT, NIM, FEL και LAC. Στα χρωµατογραφήµατα (Β) και (C) του σχήµατος VI.5, η ταχύτητα ροής αυξάνει γραµµικά µέχρι µία δεδοµένη χρονική στιγµή και στη συνέχεια διατηρείται σταθερή. Οι ενώσεις εκλούονται σε µικρότερο χρόνο και οι κορυφές είναι πιο οξείες. 42

0.4 (C) 0.3 AU 0.2 (Β) 0.1 (A) 0 0 5 10 15 20 25 t (min) Σχήµα VI.6. Χρωµατογράφηµα µε ανίχνευση UV των 1,4-διϋδροπυριδινών σε (A) σταθερή ταχύτητα ροής 0,5 ml/min (B) µε προγραµµατισµό ταχύτητας ροής που αντιστοιχεί στο διάγραµµα 3 του σχήµατος V.4 και (C) σε σταθερή ταχύτητα ροής 2 ml/min. Το κλάσµα του οργανικού τροποποιητή ακετονιτριλίου ήταν φ=0,7. Η σειρά έκλουσης των ενώσεων είναι AML, NIT, NIM, FEL και LAC. Στο χρωµατογράφηµα του σχήµατος VI.6 φαίνεται χαρακτηριστικά ότι µε την εφαρµογή του συγκεκριµένου προφίλ γραµµικής µεταβολής της ταχύτητας ροής, η έκλουση των ενώσεων γίνεται όπως θα γινόταν εάν εφαρµόζαµε µία σταθερή ταχύτητα ροής κινητής φάσης ανάµεσα στα 0,5 ml/min και 2 ml/min. 43

VII. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 1. Οι θεωρητικές εξισώσεις (ΙΙΙ.3) ή (ΙΙΙ.4) που προέκυψαν στην εργασία αυτή προβλέπουν πολύ ικανοποιητικά µε ένα µέσο εκατοστιαίο σφάλµα 1,5% τους χρόνους έκλουσης των ενώσεων που µελετήθηκαν κάτω από οποιαδήποτε µορφή µεταβολής της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης σταθερής σύστασης. 2. H πρόβλεψη αυτή µπορεί να γίνει εξίσου ικανοποιητικά είτε από τις τιµές του παράγοντα συγκράτησης, k, των ενώσεων στη σύσταση αυτή της κινητής φάσης, είτε από την κλίση, λ, των τιµών των χρόνων συγκράτησης ως προς το αντίστροφο της ταχύτητας ροής. Σηµειώνεται ότι τόσο οι τιµές του k όσο και του λ απαιτούν πειραµατικά ένα µόνο χρωµατογράφηµα στην επιθυµητή σύσταση της κινητής φάσης σε οποιαδήποτε σταθερή ταχύτητα ροής, ή τη γνώση της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς των ενώσεων σε µια περιοχή σύστασης κινητής φάσης, δηλαδή τις τιµές των a, b, και c της εξίσωσης (V.5). 3. Η πολύ καλή πρόβλεψη της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς των ενώσεων κάτω από συνθήκες οποιασδήποτε µεταβολής της ταχύτητας ροής που προέκυψε στην εργασία αυτή µας δίνει την δυνατότητα: α) ταυτοποίησης των ενώσεων και β) βελτιστοποίησης των διαχωρισµών. Σηµειώνεται ότι µόνο πολύπλοκες µεταβολές της ταχύτητας ροής µπορούν να οδηγήσουν σε µια βέλτιστη ανακατανοµή των ενώσεων µέσα στο χρωµατογράφηµα που να επιτρέπει τον διαχωρισµό των ενώσεων υπό µορφή οµοιόµορφων κορυφών στον ελάχιστο χρόνο. 4. Τα θετικά αποτελέσµατα της εργασίας αυτής θα αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη στο µέλλον µιας θεωρίας για βαθµωτή 44