Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΗΣ-2 ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Δ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ - ΓΝΘ «ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ» ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΗΛΟΝΙΔΗΣ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ - ΑΝΘ «ΘΕΑΓΕΝΕΙΟ» ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Δρ Ι. ΚΑΤΣΟΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ 2007-2008 Αρ. Διατριβής: 2026 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟΟΞΥΓΕΝΑΣΗΣ-2 ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΤΖΙΛΒΕΣ ΙΑΤΡΟΣ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΑΡΒΑΝΙΤΑΚΗΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (επιβλέπων) ΕΛΕΥΘΕΡΙΟΣ ΓΙΑΝΝΟΥΛΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΕΥΓΕΝΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΑΡΒΑΝΙΤΑΚΗΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (επιβλέπων) ΕΛΕΥΘΕΡΙΟΣ ΓΙΑΝΝΟΥΛΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΕΥΓΕΝΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙΔΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΗΛΩΝΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΒΡΕΤΤΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΤΣΑΛΗΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελειου Παναπειστημίου Θεσσαλονικης δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, άρθρ. 202 2 και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8)

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ

4

5 Στους δικούς μου ανθρώπους, σ αυτούς που έφυγαν και σ αυτούς που είναι ακόμα κοντά μου.

6

7 Όποιος είναι με την επανάσταση είναι με τη ζωή. Θωμάς Γκόρπας (1935-2003)

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΓΛΩΣΣΑΡΙΟ...13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ...21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Επιδημιολογικά δεδομένα ΚΠΕ....27 2. Ογκογένεση ΚΠΕ. 28 2.1. Ογκογονίδια..32 2.2. Ογκοκατασταλτικά γονίδια..33 2.3. Γονίδια διόρθωσης λανθασμένων ζευγών βάσεων κατά το διπλασιασμότου DNA (MMR).37 2.4. Εξωκυττάρια θεμέλιος ουσία και διακυτταρικά μόρια προσκόλλησης 38 2.5. Κυκλοοξυγενάση (COX)....38 3. Μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος......38 3.1. COX...41 4. COX-2 και καρκινογένεση....43 4.1. Πειραματικές μελέτες......44 4.2. Μελέτες σε ασθενείς με FAP.. 44 4.3. Επιδημιολογικές μελέτες.....45 5. COX-2 και καρκίνος πεπτικού.46 5.1. Οισοφαγικός καρκίνος..46 5.2. Γαστρικός καρκίνος....47 6. COX-2 και ΚΠΕ.....48 6.1. Σχέση της COX-2 με τα χαρακτηριστικά του όγκου...50 6.2. Η COX-2 ως προγνωστικός δείκτης ΚΠΕ... 52 7. COX-2 και άλλοι καρκίνοι.....53 8. COX-2 και μοριακοί μηχανισμοί καρκινογένεσης..54 8.1. COX-2, PGΕ 2 και καρκινογένεση..54 8.2. Αύξηση αγγειογένεσης..55 8.2.1 Αγγειακοί αυξητικοί παράγοντες... 57 8.3. Αναστολή της απόπτωσης..60 8.3.1. Εξωγενής οδός απόπτωσης..... 65

10 8.3.2. Ενδογενής οδός απόπτωσης...66 8.3.3. Οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών..68 8.4. Αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού...72 8.5. Αύξηση της διηθητικότητας των κυττάρων.73 8.6. Ρύθμιση της ανοσοκαταστολής. 73 8.7. Παράγοντας νέκρωσης του όγκου TNF-α 75 8.8. Η οδός EGFR. 76 8.9. Μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας TGF-β.77 8.10. Η οδός των πυρηνικών υποδοχέων PPARδ...81 9. Σταδιοποίηση του ΚΠΕ...81 10. Το CEA ως προγνωστικός δείκτης στον ΚΠΕ...82 11. Θεραπεία ΚΠΕ....83 12. Η COX-2 ως στόχος για τη θεραπεία και πρόληψη του ΚΠΕ...84 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ...91 1. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ.....93 1.1. Ασθενείς. 93 1.2. Μέθοδοι.. 96 1.3. Ιστολογική εξέταση..97 1.4. Ανοσοϊστοχημικός έλεγχος..97 1.5. Εκτίμηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης COX-2..98 1.6. Εκτίμηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης Bcl-2..98 1.7. Μέτρηση παραγόντων στον ορό...99 1.8. Μετεγχειρητική παρακολούθηση..100 1.9. Στατιστική ανάλυση...101 2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...103 2.1. Ανοσοϊστοχημική έκφραση COX-2......106 2.2. Ανοσοϊστοχημική έκφραση Bcl-2..112 2.3. Μέτρηση παραγόντων στον ορό των ασθενών...116 2.4. Σχέση COX-2 και των προσδιορισθέντων παραγόντων στον ορό.... 119

11 2.5. Προγνωστική αξία των παραγόντων στον ορό Σχέση με CEA...119 2.6. Επιβίωση..122 3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ....127 4. ΠΕΡΙΛΗΨΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ..147 5. SUMMARY-CONCLUSIONS.......151 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 155

13 ΓΛΩΣΣΑΡΙΟ Συντμήσεις-Ακρωνύμια ΚΠΕ ΜΣΑΦ ΠΟΥ 5-FU/LV 15-PGDH ACF AICD Apaf APC AR BTC BAK ΒFGF CAD CAR CDKI Καρκίνος Παχέος Εντέρου Μη Στεροειδή Αντιφλεγμονώδη Φάρμακα Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας 5-Fluorouracil/Leucovorin 5-Φθοριοουρακίλη/Λευκοβορίνη 15-Hydroxyprostaglandin Dehydrogenase Δεϋδρογενάση 15-υδροξυπροσταγλανδίνης Abberant Crypt Foci Πρόδρομες εστιακές δυσπλαστικές κρύπτες Activation-Induced Cell Death Ενεργώς επαγόμενος κυτταρικός θάνατος Apoptosis-activating factor Παράγοντας ενεργοποίησης απόπτωσης Adenomatous Polyposis Coli Αδενωματώδης πολυποδίαση παχέος εντέρου Amphiregulin Αμφιρεγκουλίνη Betacellulin Βητασελουλίνη Bcl-2 Antagonist/Killer Ανταγωνιστής/φονέας Bcl-2 Basic Fibroblast Growth Factor Βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας Caspase-Activated DNAse Δεοξυριβονουκλεάση ενεργοποιούμενη από κασπάσες Coxcackie Adenovirus Receptor Yποδοχέας για τους ιούς Coxcackie και Adenovirus Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor

14 CEA Co-Smad COX cpla2 Αναστολέας κυκλινοεξαρτώμενων κινάσων Carcinoembryonic Antigen Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο Common mediator Smad Κοινός μεσολαβητής πρωτεϊνών Smad Cyclooxygenase Κυκλοοξυγενάση Cytosolic Phospholipase Α2 Kυτταροπλασματική φωσφολιπάση Α 2 CTL Cytotoxic T Lymphocyte Κυτταροτοξικό Τ λεμφοκύτταρο Cyt c Cytochrome c Κυτόχρωμα c DD Death Domain Περιοχή επαγωγής κυτταρικού θανάτου DISC Death Induced Signaling Complex Σύμπλεγμα σηματοδότησης επαγωγής κυτταρικού θανάτου DNA Deoxyribonucleic Acid Δεοξυριβονουκλεϊνικό οξύ DNA MMR DNA Mismatch Repair Διεργασία διόρθωσης λανθασμένων ζευγών βάσεων κατά τη διάρκεια αναδιπλασιασμού του DNA DNAse Deoxyribonuclease Δεοξυριβονουκλεάση DP Prostaglandin D receptor Yποδοχέας προσταγλανδίνης D ECOG Eastern Cooperative Oncology Group Ανατολική ομάδα συνεργασίας Ογκολόγων EGF Epidermal Growth Factor Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας EGFR Epidermal Growth Factor Receptor Yποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα

15 ELISA EMT EP FADD FAP FasL FDA FGF FP GSK-3β H&E HB-EGF HETE HIF-1α HNPCC HPV Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay Ανοσοπροσροφητική ανάλυση στερεάς φάσης με σύνδεση ενζύμου Epithelial-Mesenchymal Transition Μετάβαση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο Prostaglandin Ε receptor Υποδοχέας προσταγλανδίνης E Fas-Associated Death Domain Fas σχετιζόμενη περιοχή κυτταρικού θανάτου Familiar Adenomatous Polyposis Οικογενής πολυποδίαση Fas Ligand Fas συνδέτης Food and Drug Administration Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων Fibroblast Growth Factor Ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας Prostaglandin F receptor Υποδοχέας προσταγλανδίνης F Glycogen Synthase Kinase Kινάση συνθετάσης γλυκογόνου Hematoxylin and Eosin Χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης Heparin Binding Epidermal Growth Factor-like Growth Factor, Αυξητικός παράγοντας ομόλογος επιδερμικού αυξητικού παράγοντα συνδέοντος την ηπαρίνη Hydroxyeicosatetraenoic Acid Υδροξυεικοσατετραϊνοϊκό οξύ Ηypoxia Ιnducible Factor-1α Επαγόμενος από υποξία παράγοντας- 1α Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Κληρονομούμενος μη πολυποδιασικός ορθοκολικός καρκίνος Human Papilloma Virus

16 ΙΑΡ ICE ICAD ICAM IFN IGFIIR IL inos IP I-Smad JNK LFA-1 LOH MAPK MDD Ιός ανθρωπίνων θηλωμάτων Inhibitor of Apoptosis Proteins Αναστολέας πρωτεϊνών απόπτωσης Interleukin-1 Converting Enzyme Μετατρεπτικό ένζυμο της Ιντερλευκίνης-1 Inhibitor of Caspase-Activated DNAse Αναστολέας δεοξυριβονουκλεάσης ενεργοποιούμενης από κασπάσες Intracellular Adhesion Molecule Ενδοκυττάριο μόριο προσκόλλησης Interferon Ιντερφερόνη Insulin-like Growth Factor II Receptor Τύπου ΙΙ υποδοχέας αυξητικού παράγοντα ομόλογου ινσουλίνης Interleukin Ιντερλευκίνη inducible Nitric Oxide Synthase Επαγώγιμη μορφή συνθετάσης οξειδίου του αζώτου Prostaglandin Ι receptor Υποδοχέας προσταγλανδίνης I Inhibitory Smad Aνασταλτικές πρωτεΐνες Smad c-jun N-terminal kinases c-jun αμινοτελική κινάση Lymphocyte Function Associated-Antigen-1 Σχετιζόμενο με λεμφοκυτταρική λειτουργία αντιγόνο-1 Loss Of Heterozygosity Απώλεια ετεροζυγωτίας Mitogen-Activated Protein Kinase Πρωτεϊνική κινάση ενεργοποιούμενη μέσω μιτογόνου Minimum Detectable Dose Ελάχιστη ανιχνεύσιμη δόση

17 ΜΗC MΙΝ MMP mrna MSI MVD NFκΒ NK cell ΝΟ PCNA PD-ECGF PDGF PG PGH PGHS PLA2 Major Histocompatibitility Complex Μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας Multiple Ιntestinal Νeoplasia Πολλαπλές εντερικές νεοπλασίες Matrix Metaloproteinase Μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας Messenger Ribonucleic Acid Aγγελιοφόρο ριβονουκλεϊνικό οξύ Microsatellite Instabillity Μικροδορυφορική αστάθεια Microvessel Density Μικροαγγειακή πυκνότητα Nuclear Factor κβ Πυρηνικός παράγοντας κβ Natural Killer cell Κύτταρο φυσικός φονέας Nitric Oxide Μονοξείδιο αζώτου Proliferating Cell Nuclear Antigen Πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενου κυττάρου Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor Αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας ενδοθηλιακών κυττάρων Platelet-Derived Growth Factor Αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας Prostaglandin Προσταγλανδίνη Prostaglandin Endoperoxide H Eνδοπεροξείδιο H προσταγλανδίνης PGH Synthase Συνθετάση ενδοπεροξειδίου H προσταγλανδίνης Phospholipase Α2

18 PlGF PPAR R-Smad Smac Φωσφολιπάσης Α 2 Placenta Growth Factor Πλακουντιακός αυξητικός παράγοντας Peroxisom Proliferator-Activated Receptor Ενεργοποιημένος υποδοχέας του πολλαπλασιαστή του υπεροξειδιοσωματίου Receptor-activated Smad Μέσω υποδοχέα ενεργοποιούμενες πρωτεΐνες Smad Second mitochondrial activator of caspases Δεύτερος μιτοχονδριακός ενεργοποιητής κασπασών spla 2 Secretory Phospholipase Α 2 tbid TCF TCR TGF TGF-βRII ΤLs TNF TNFR TP TRADD Eκκριτική φωσφολιπάση Α 2 Truncated Bid Ενεργό θραύσμα Bid T-Cell Factor Παράγοντας Τ κυττάρων Τ Cell Receptor Υποδοχέας Τ κυττάρων Transforming Growth Factor Μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας Transforming Growth Factor-β RII Τύπου ΙΙ υποδοχέας μετατρεπτικού αυξητικού παράγοντα-β T Lymphocytes Τ λεμφοκύτταρα Tumor Necrosis Factor Παράγοντας νέκρωσης όγκου Tumor Necrosis Factor Receptor Υποδοχέας παράγοντα νέκρωσης όγκου ΤΧΑ 2 receptor Υποδοχέας Θρομβοξάνης Α 2 TNFR-Associated Death Domain TNFR σχετιζόμενη περιοχή κυτταρικού θανάτου

19 TRAIL TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Συνδέτης επάγων απόπτωση μέσω TNF ΤΧΑ 2 Thromboxane Α 2 VEGF Θρομβοξάνη Α 2 Vascular Endothelial Growth Factor Αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας

21 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο καρκίνος του παχέος εντέρου (ΚΠΕ) παρουσιάζει αυξημένη συχνότητα σε παγκόσμια κλίμακα και ιδιαίτερα στις αναπτυγμένες χώρες, στις οποίες η συχνότητά του είναι τετραπλάσια σε σύγκριση με τις αναπτυσσόμενες χώρες. Η ευρεία γεωγραφική διακύμανση που παρατηρείται τόσο στη συχνότητα, όσο και στη θνησιμότητα, αποδίδεται σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, στις δυνατότητες πρόσβασης κάθε περιοχής στις ειδικές θεραπείες, χειρουργικές ή φαρμακευτικές και στις εφαρμοζόμενες μεθόδους πρώιμης διάγνωσης της νόσου. Η ηλικία αποτελεί παράγοντα κινδύνου, με τη συχνότητα να αυξάνει σημαντικά μετά το 50ο έτος. Η διά βίου πιθανότητα εμφάνισης ΚΠΕ στα μέσου κινδύνου άτομα (άτομα με ελεύθερο ατομικό ή οικογενειακό ιστορικό ΚΠΕ) υπολογίζεται σε 5%, ενώ στο 90% των περιπτώσεων η νόσος εμφανίζεται μετά το 50ο έτος. Ο ΚΠΕ αποτελεί αντιπροσωπευτικό πρότυπο μελέτης ογκογένεσης σε μοριακό επίπεδο, επειδή προσφέρει τη δυνατότητα λήψης βιοψιών στα διάφορα στάδια της διεργασίας μετατροπής του φυσιολογικού βλεννογόνου σε αδένωμα και διηθητικό καρκίνωμα. Από τη μελέτη της διεργασίας αυτής έχει προκύψει ότι μια προοδευτική εμφάνιση γενετικών μεταβολών σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια φαίνεται ότι βαίνει παράλληλα με μια επίσης προοδευτική κλινική και ιστολογική αλληλουχία γεγονότων, που περιλαμβάνουν την αναφερόμενη μετάπτωση του φυσιολογικού επιθηλίου του παχέος εντέρου σε αδένωμα, δυσπλασία και τελική εμφάνιση καρκίνου. Ειδικότερα, η πολυπαραγοντική και σταδιακή διαδικασία της ογκογένεσης καταδεικνύεται άμεσα σε μοριακές πειραματικές γενετικές μελέτες που βεβαιώνουν ότι η εξέλιξη του αδενώματος σε ΚΠΕ είναι αποτέλεσμα συσσώρευσης μοριακών γενετικών μεταβολών, στις οποίες εμπλέκονται κυρίως τρεις παράγοντες, ενεργοποίηση ογκογονιδίων, αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων και μεταβολές γονιδίων, τα οποία συμμετέχουν στη διεργασία διόρθωσης λανθασμένων ζευγών βάσεων που επισυμβαίνουν κατά τη διάρκεια αναδιπλασιασμού του DNA (DNA Μismatch Repair, MMR). Επίσης, μεταβολές της οδού μετάδοσης του σήματος Wingless/Wnt φαίνεται ότι παίζουν κεντρικό ρόλο στην πρόοδο του καρκίνου. Ο ακριβής προσδιορισμός τέτοιων μεταβολών παρέχει τις δυνατότητες εφαρμογής νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την πρόληψη και αντιμετώπιση του ΚΠΕ. Ειδικότερα, πρόσφατα δεδομένα εμπλέκουν την κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2) στην ογκογένεση της γαστρεντερικής οδού, συμπεριλαμβανομένου και του ΚΠΕ. Αυξημένη έκφραση της COX-2 έχει αναφερθεί σε αδενώματα και ΚΠΕ, καρκίνο στομάχου, οισοφάγο Barrett και οισοφαγικό αδενοκαρκίνωμα. Επιπλέον, η υπερέκφραση της COX-2 προκαλεί αναστολή της διεργασίας απόπτωσης και αυξάνει την διεισδυτικότητα των νεοπλασματικών κυττάρων. Η ανακάλυψη των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2,

22 με το πλεονέκτημα των λιγότερων ανεπιθύμητων ενεργειών από το γαστρεντερικό σύστημα σε σύγκριση με τα κλασικά μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ), δυνατόν να επιτρέψει τη χρήση τους ως χημειοπροφύλαξη σε ομάδες υψηλού κινδύνου, όπως περιπτώσεις οικογενούς πολυποδίασης και ιστορικού αδενωμάτων του παχέος εντέρου ή ως επικουρική θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου. Επισημαίνεται η σημαντική μείωση του κινδύνου ανάπτυξης ΚΠΕ που παρατηρήθηκε κατά τη μακροχρόνια λήψη ασπιρίνης ή άλλων ΜΣΑΦ, όπως έδειξαν τα αποτελέσματα επιδημιολογικών μελετών. Ενώ ο μόνος τρόπος που αποδειγμένα συμβάλλει στην πρόληψη του ΚΠΕ είναι ο ενδοσκοπικός έλεγχος των ασυμπτωματικών ατόμων, αποτελεί πρόκληση για τους ερευνητές η ανακάλυψη ενός αποτελεσματικού, φθηνού σε κόστος και ασφαλούς παράγοντα χημειοπροφύλαξης. Εντούτοις, ό,τι γίνεται αποδεκτό ως ασφαλές έχει σχετική σημασία και εξαρτάται από το συγκεκριμένο πληθυσμό που χορηγείται, από το μέγεθος της μείωσης του κινδύνου, μετρούμενο ως μείωση της θνησιμότητας από τη συγκεκριμένη νόσο και από την τοξικότητα της χορηγούμενης ουσίας. Στη συνάφεια αυτή, η εμφάνιση των ανεπιθύμητων εκδηλώσεων από το καρδιαγγειακό σύστημα που παρατηρήθηκαν κατά την μακροχρόνια χρήση των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2, οδήγησε στη απόσυρση του πρώτου αναστολέα COX-2 (Rofecoxib, VIOX) που έλαβε έγκριση για προληπτική χορήγηση στην οικογενή πολυποδίαση, από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (Food and Drug Administration, FDA) και περιορισμό της σχετικής έρευνας που αφορά στην παθογένεση και αντιμετώπιση του ΚΠΕ. Επιπλέον, ο επιπολασμός του ΚΠΕ διαφέρει σημαντικά μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών της γης και δεν υφίστανται δεδομένα εμπλοκής της COX-2 στην ογκογένεση του παχέος εντέρου στην Ελλάδα. Κατά συνέπεια, ο σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση του ρόλου της COX-2 στον ΚΠΕ στον Ελληνικό πληθυσμό. Η διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει δύο μέρη, το γενικό και το ειδικό. Στο γενικό μέρος περιγράφονται τα επιδημιολογικά δεδομένα και η ογκογένεση του ΚΠΕ, ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος, η εμπλοκή της COX-2 στη διεργασία της ογκογένεσης και ο ρόλος της στον ΚΠΕ σε σχέση με τους μοριακούς μηχανισμούς καρκινογένεσης που περιλαμβάνουν την αγγειογένεση, την αναστολή της απόπτωσης, την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και τη ρύθμιση της ανοσοκαταστολής, τέλος τη συμβολή της στη θεραπεία και πρόληψη του ΚΠΕ. Το ειδικό μέρος περιλαμβάνει το πρωτόκολλο της μελέτης που εστιάζεται στον ενδοσκοπικό διαγνωστικό έλεγχο των ασθενών με ΚΠΕ, τον ιστολογικό και ειδικότερα τον ανοσοϊστοχημικό έλεγχο των χειρουργικών παρασκευασμάτων για την έκφραση των πρωτεϊνών COX-2 και Bcl-2 στον καρκινικό ιστό και στον παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο και τέλος τον προσδιορισμό των Bcl-2, ΤNF-α, TGF-β1 και VEGF στον ορό πριν και σε

23 δύο χρονικές στιγμές μετά τη χειρουργική επέμβαση. Μετά τη λεπτομερή καταγραφή των αποτελεσμάτων της μελέτης με τις αντίστοιχες ιστολογικές εικόνες, ακολουθεί η συζήτηση, στην οποία αναλύονται τα ευρήματα, συσχετίζονται με τα δεδομένα της βιβλιογραφία και καταγράφονται τα συμπεράσματα. Ακολουθεί η περίληψη στην ελληνική και αγγλική γλώσσα και στο τέλος παρατίθεται η βιβλιογραφία. Το ερευνητικό μέρος της μελέτης εκπονήθηκε στο Ενδοσκοπικό Εργαστήριο της Γαστρεντερολογικής Κλινικής του Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο» και στο Συμεωνίδειο Ερευνητικό Κέντρο. Οι ασθενείς προέρχονταν από το Εξωτερικό Ιατρείο της Γαστρεντερολογικής Κλινικής και από την Α Χειρουργική Κλινική του αναφερομένου Νοσοκομείου. Θεωρώ καθήκον μου να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες και την ευγνωμοσύνη μου σε όλους όσους συνέβαλαν στην εκπόνηση αυτής της Διατριβής. Ευχαριστώ θερμά τον Ομότιμο Καθηγητή Ιατρικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κ. Κωνσταντίνο Αρβανιτάκη, επιβλέποντα της διδακτορικής μου διατριβής, για την εμπιστοσύνη που επέδειξε στο πρόσωπο μου με την ανάθεση της διδακτορικής διατριβής, για την επιστημονική καθοδήγηση, την ανεκτίμητη βοήθεια κατά τη διάρκεια της μελέτης και την κριτική ανασκόπηση του κειμένου της διατριβής. Σημαντική ήταν η συμβολή του Καθηγητή κ. Ελευθέριου Γιαννούλη, και του Καθηγητή κ. Νικολάου Ευγενίδη, ως μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, στη διεξαγωγή και ολοκλήρωση της μελέτης, τους οποίους ευχαριστώ θερμά για την συμπαράστασή τους. Στον Διευθυντή της Γαστρεντερολογικής Κλινικής του Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο» κ. Ιωάννη Κάτσο, χάρη στην παρότρυνση και τη συμπαράσταση του οποίου κατέστη δυνατή η διεξαγωγή της μελέτης, εκφράζω βαθύτατα τις ευχαριστίες μου. Στην Παθολογοανατόμο κ. Φρίντα Πατακιούτα, Διευθύντρια του Παθολογοανατομικού Εργαστηρίου του Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο», απευθύνω τις θερμές ευχαριστίες μου για τον προσδιορισμό και την εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της COX-2 και της Bcl-2. Από το ίδιο εργαστήριο σημαντική ήταν η βοήθεια της ειδικευόμενης ιατρού κ. Νικολέττας Παστέλη και της τεχνολόγου κ. Μαρίας Καλαντζή. Στην ερευνήτρια του Συμεωνίδειου Ερευνητικού Ινστιτούτου κ. Τούλα Γαλακτίδου, για την ουσιαστική συμβολή της στην περάτωση του εργαστηριακού μέρους, εκφράζω θερμές ευχαριστίες. Επισημαίνω και τη βοήθεια που προσέφερε όλο το προσωπικό του Ερευνητικού Ινστιτούτου, ιδιαίτερα ο κ. Κ. Λαζόπουλος.

24 Τους συναδέλφους χειρουργούς της A Χειρουργικής Κλινικής, όπως και όλο το ιατρικό και νοσηλευτικό προσωπικό της Γαστρεντερολογικής Κλινικής του Α.Ν.Θ., ευχαριστώ θερμά. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω στον Καθηγητή Παθολογίας-Γαστρεντερολογίας κ. Ιωάννη Κουντουρά για τις πολύτιμες υποδείξεις του στα θέματα των μηχανισμών ογκογένεσης και για τη συνεχή ενθάρρυνση και υποστήριξή του. Στον Αναπληρωτή Καθηγητή Ιατρικής Φυσικής-Ηλεκτρονικής κ. Δημήτριο Κουφογιάννη εκφράζω τις ευχαριστίες μου για τις συμβουλές του στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Ομοίως, εκφράζω τις ευχαριστίες μου στη Λέκτορα του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής κ. Βασιλική Κωτούλα για τη βοήθειά της στην Ελληνική απόδοση των όρων μοριακής βιολογίας. Θεωρώ επίσης υποχρέωσή μου να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στα ακόλουθα μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής για την τιμή που μου έκαναν να αποδεχθούν την πρόσκληση: Στυλιανή Χαραλαμπίδου-Βρανίτσα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας, Γεώργιο Ηλωνίδη, Καθηγητή Παθολογίας και Διευθυντή της Δ Παθολογικής Κλινικής από τον 9/2006, υπό τη διεύθυνση του οποίου συνεχίστηκε και ολοκληρώθηκε η παρούσα διατριβή, Ελένη Βρεττού, Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής και Κωνσταντίνο Τσαλή, Αναπληρωτή Καθηγητή Χειρουργικής. Τέλος, ευχαριστίες οφείλω στο Επιστημονικό Συμβούλιο, στο Συμβούλιο Διοίκησης και στο Διοικητή του Α.Ν.Θ. κ. Κ. Χρίστογλου για την κάλυψη της δαπάνης της μελέτης.

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 25

27 1. Επιδημιολογικά δεδομένα ΚΠΕ Ο ΚΠΕ είναι ο τέταρτος σε σειρά συχνότητας καρκίνος (μετά τον καρκίνο του προστάτη, μαστού και πνεύμονα) μεταξύ των πρωτοδιαγνωσθέντων καρκίνων στις ΗΠΑ και αποτελεί το 9% των νέων περιπτώσεων καρκίνου στους άνδρες με το αντίστοιχο ποσοστό στις γυναίκες να είναι 11%. (1) Γενικά, η συχνότητα της νόσου ποικίλλει ευρέως μεταξύ των πληθυσμών. Υψηλότερη συχνότητα παρατηρείται στις αναπτυγμένες χώρες, Βόρεια Αμερική, Αυστραλία και Ν. Ζηλανδία, ενδιάμεση στην Ευρώπη και χαμηλή στην Ασία, Νότια Αμερική και Νότια Αφρική, ιδιαίτερα στις υποσαχάριες χώρες. (1) Ειδικά στις αναπτυγμένες χώρες αποτελεί τη δεύτερη κύρια αιτία θανάτου. (2) Επιπλέον, χώρες, στις οποίες η συχνότητα του ΚΠΕ ήταν χαμηλή πριν το 1950, παρουσιάζουν σημαντική αύξηση που πιθανόν μεταξύ των άλλων προδιαθεσικών παραγόντων, να αντανακλά υιοθέτηση των διαιτητικών συνηθειών της Δύσης. Σύμφωνα με υπολογισμούς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ), σε ετήσια βάση εμφανίζονται 945000 νέες περιπτώσεις ΚΠΕ, ενώ καταγράφονται 492000 θάνατοι. (3) Παρά την παρατηρούμενη αύξηση των νέων περιπτώσεων, τα ποσοστά θανάτου από τον ΚΠΕ παρουσιάζουν μείωση σε χώρες όπως ο Καναδάς, οι ΗΠΑ και σε χώρες της Ευρώπης, πιθανόν λόγω εφαρμογής προγραμμάτων πρόληψης, έγκαιρης διάγνωσης και βελτίωσης των χειρουργικών τεχνικών. (4) Η συνολική πενταετής επιβίωση υπολογίζεται ότι φθάνει σε ποσοστό 60% στις ΗΠΑ, ενώ στις λιγότερο αναπτυγμένες χώρες το ποσοστό είναι μικρότερο από 40%. (3) Στην Ελλάδα, σύμφωνα με τα στοιχεία της Εθνικής Στατιστικής Υπηρεσίας, στο σύνολο του πληθυσμού ο ΚΠΕ είναι δεύτερος σε συχνότητα μετά τον καρκίνο του πνεύμονα. Κατά τα έτη 1999 και 2000 επί συνόλου 156338 και 160179 νεοπλασμάτων με βάση τη διάγνωση εξόδου από νοσοκομείο, οι νέες περιπτώσεις καρκίνου πνεύμονα ανήλθαν σε 18404 (11,8%) και 16905 (10,5%), ενώ για ΚΠΕ καταγράφηκαν 12845 (8,2%) και 13247 (8,3%) νέες περιπτώσεις, αντιστοίχως. (5) Σύμφωνα με τις εκτιμήσεις για τη συχνότητα και τη θνησιμότητα από ΚΠΕ στις 25 χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης κατά το έτος 2006, για την Ελλάδα αναφέρονται 31 και 21,3 περιπτώσεις ανδρών και γυναικών, αντιστοίχως, ανά 100000 κατοίκους. Οι αντίστοιχοι αριθμοί για τις 25 χώρες ανέρχονται σε 59 και 35,6 ανά 100000 κατοίκους. Εντούτοις, επειδή δεν υφίσταται προς το παρόν επίσημη βάση καταγραφής των περιπτώσεων καρκίνου στην Ελλάδα, ο υπολογισμός στηρίχθηκε σε στοιχεία γειτονικών χωρών (Ιταλία, Βουλγαρία, Σλοβενία). (6) Ποσοστό 5-10% των περιπτώσεων του ΚΠΕ αναπτύσσεται σε άτομα με σύνδρομο κληρονομούμενου καρκίνου, τις δύο κυρίες μορφές του οποίου αποτελούν η οικογενής πολυποδίαση (Familiar Adenomatous Polyposis, FAP) και ο κληρονομούμενος μη πολυποδιασικός ορθοκολικός καρκίνος (Hereditary Nopolyposis Colorectal Cancer, HNPCC). Επισημαί-

28 νεται ότι η πλειονότητα των περιπτώσεων θεωρούνται σποραδικές και σε ποσοστό περίπου 20% ανευρίσκεται οικογενής προδιάθεση, χωρίς να πληρούνται τα κριτήρια των συνδρόμων κληρονομούμενου καρκίνου. (7) Τα εισαγωγικά αυτά επιδημιολογικά δεδομένα υποστηρίζουν την αναγκαιότητα της συνέχισης της σε βάθος έρευνας των μηχανισμών ογκογένεσης της νόσου. 2. Ογκογένεση ΚΠΕ Είναι γενικά αποδεκτό ότι ο ΚΠΕ αναπτύσσεται, στην πλειονότητα των περιπτώσεων, σε προϋπάρχον καλόηθες αδένωμα, στο οποίο προοδευτικά αναπτύσσεται δυσπλασία, για να εμφανιστούν τελικά εστίες διηθητικού καρκινώματος. Η διαδικασία αυτή αντιπροσωπεύει την αλληλουχία εξωφυτικό αδένωμα-καρκίνωμα. (8) Σπάνια οι όγκοι παχέος εντέρου εγείρονται de novο σε μη αδενωματώδες επιθήλιο, παρόλο που και στις τελευταίες περιπτώσεις δυνατόν να αναπτύσσονται σε προϋπάρχονται επίπεδα αδενώματα και η ανάπτυξη του καρκίνου ακολουθεί την αλληλουχία de novo επίπεδο αδένωμα-καρκίνωμα. (9) Τελευταία υποστηρίζεται ότι η ύπαρξη πρόδρομων εστιακών δυσπλαστικών κρυπτών (Aberrant Crypt Foci, ACF) προηγείται της εμφάνισης αδενωματωδών στοιχείων και στις δύο οδούς καρκινογένεσης. Οι εν λόγω κρύπτες παρουσιάζουν σημαντική πάχυνση του επιθηλίου και μεταβολές στο στόμιο του αυλού τους, στοιχεία που τις διαφοροποιούν σαφώς από τις παρακείμενες, φυσιολογικής εμφάνισης κρύπτες. Οι προνεοπλασματικές αυτές βλάβες είναι δυνατόν να εντοπιστούν με τη μεγεθυντική χρωμοενδοσκόπηση. (10) Άλλος τύπος ογκογένεσης παχέος εντέρου αφορά στο ενοχοποιούμενο φαινόμενο της μικροδορυφορικής αστάθειας. (11,12,13) Κατά συνέπεια, κατά κύριο λόγο υφίσταται η αλληλουχία αδενώματος που εξελίσσεται σε καρκίνο και ενδείξεις που υποστηρίζουν αυτή την αλληλουχία προκύπτουν από επιδημιολογικές, κλινικές, ιστολογικές και μοριακές μελέτες. (9) Επιδημιολογικές μελέτες υποδηλώνουν ότι η συχνότητα των αδενωμάτων συσχετίζεται γεωγραφικά με τη συχνότητα ΚΠΕ. Πράγματι, η συχνότητα των αδενωμάτων παρουσιάζει αύξηση σε μετανάστες από περιοχές χαμηλού κινδύνου μετά την εγκατάστασή τους σε περιοχές υψηλού επιπολασμού ΚΠΕ. Επιπλέον, οι δύο αυτές καταστάσεις αυξάνουν με την ηλικία και φαίνεται ότι τα αδενώματα προηγούνται τουλάχιστον 5-10 έτη της ανάπτυξης καρκίνου. Ειδικότερα, στο σύνδρομο οικογενούς πολυποδίασης τα καλοήθη αδενώματα εμφανίζονται 10-12 έτη πριν από την ανάπτυξη καρκίνου, αλλά και σε περιπτώσεις σποραδικών αδενωμάτων

29 το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ πολύποδα-καρκίνου είναι τουλάχιστον 4 έτη ή περισσότερο, ανάλογα με το βαθμό της δυσπλασίας. (9) Από τα υφιστάμενα κλινικοπαθολογικά δεδομένα, οι ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση, οι οποίοι έχουν πολλαπλά αδενώματα (εκατοντάδες έως χιλιάδες), αναπτύσσουν αναπόφευκτα ΚΠΕ. Επίσης, οι ενδοσκοπικές επεμβατικές μελέτες έδειξαν ότι η ενδοσκοπική αφαίρεση των αδενωμάτων οδήγησε σε μείωση της συχνότητας ΚΠΕ. Παρομοίως, η εφαρμογή ορθοσιγμοειδοσκόπησης στην καθημερινή πρακτική και η αφαίρεση των ανευρισκομένων πολυπόδων προκάλεσε μείωση της συχνότητας και της θνησιμότητας καρκίνου του ορθού. Οι παθολογοανατομικές μελέτες δείχνουν ότι σε ιστοτεμάχια νεοπλασματικού ιστού είναι συχνή η παρουσία υπολειμματικών αδενωματωδών στοιχείων. Αντίθετα, παρουσία μικρών καρκινικών εστιών είναι εξαιρετικά σπάνια σε φυσιολογικό βλεννογόνο παχέος εντέρου και πολύ συχνή σε αδενώματα, δεδομένα που υποδηλώνουν την ύπαρξη αλληλουχίας μετάπτωσης αδενωμάτων σε ΚΠΕ. (9) Η πλέον καθοριστική απόδειξη της αναφερόμενης αλληλουχίας προκύπτει από μοριακές μελέτες που δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα πολυπόδων με εξαλλαγή εμφανίζουν το ίδιο ακριβώς πρότυπο μοριακών μεταβολών με τα γειτονικά αδενωματώδη κύτταρα. Τα τελευταία αποκτούν στη συνέχεια επιπρόσθετες μεταλλάξεις, οι οποίες διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο για την επακόλουθη εκδήλωση της κακοήθους συμπεριφοράς τους. (14) Όσον αφορά στους γενικούς μηχανισμούς ογκογένεσης, είναι γνωστό ότι κληρονομικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες παίζουν σπουδαίο ρόλο στην καρκινογένεση. Αμφότεροι οδηγούν σε έκφραση ογκογονιδίων ή σε απρόσφορη έκφραση φυσιολογικών γονιδίων, των οποίων τα παράγωγα παρέχουν τον κακοήθη φαινότυπο. Οι μεταλλάξεις των γονιδίων δυνατόν να είναι κληρονομικές (germline mutations) ή επίκτητες (somatic mutations), μέσω δράσης περιβαλλοντικών παραγόντων ή αποτυχίας των ενδογενών κυτταρικών μηχανισμών του αναδιπλασιασμού ή της μεταγραφής του DNA. (13,14) Μια προοδευτική εμφάνιση γενετικών μεταβολών σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια φαίνεται ότι βαίνει παράλληλα με μια επίσης προοδευτική κλινική και ιστολογική αλληλουχία γεγονότων που περιλαμβάνουν μετάπτωση του φυσιολογικού επιθηλίου του παχέος εντέρου σε ανάπτυξη αδενώματος, δυσπλασίας με τελικό αποτέλεσμα την εμφάνιση καρκίνου. Παρόμοια προοδευτική διεργασία πιθανολογείται στη μετάπτωση του φυσιολογικού πλακώδους επιθηλίου του οισοφάγου σε μεταπλαστικό επιθήλιο Barrett και μέσω δυσπλασίας στην ανάπτυξη αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου. (12,13,14) Ειδικότερα, η πολυπαραγοντική και σταδιακή διαδικασία της ογκογένεσης καταδεικνύεται άμεσα σε μοριακές πειραματικές γενετικές μελέτες

30 που βεβαιώνουν ότι η εξέλιξη του αδενώματος σε ΚΠΕ είναι αποτέλεσμα συσσώρευσης μοριακών γενετικών μεταβολών, στις οποίες εμπλέκονται κυρίως τρεις παράγοντες, ενεργοποίηση ογκογονιδίων, αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων και μεταβολές σε γονίδια, τα οποία συμμετέχουν στη διεργασία διόρθωσης λαθών που επισυμβαίνουν κατά τη διάρκεια αναδιπλασιασμού του DNA. (1,15) Το γεγονός ότι οι ιστολογικές αλλαγές στην ανάπτυξη του ΚΠΕ εμφανίζονται συγχρόνως με τις μεταβολές σε μοριακό επίπεδο, επέτρεψε τη λεπτομερή μελέτη της παθογένειάς του, περισσότερο από τους άλλους τύπους καρκίνου. Όπως προκύπτει από τις σχετικές μελέτες, ο ΚΠΕ είναι το αποτέλεσμα προοδευτικής διαδικασίας που εξελίσσεται σε πολλαπλά στάδια σε μορφολογικό και μοριακό επίπεδο, ενώ το καθοριστικό γεγονός είναι η απώλεια της γονιδιακής σταθερότητας. (16,17) Με βάση το γενετικό πρότυπο που περιγράφηκε για να εξηγηθεί η σταδιακή διαδικασία μετάπτωσης του φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου σε διηθητικό καρκίνωμα, φαίνεται ότι ο ΚΠΕ αναπτύσσεται γενικά σε 2 στάδια που περιλαμβάνουν το σχηματισμό αδενώματος, ονομαζόμενο στάδιο έναρξης όγκου (tumor initiation) και την εξέλιξη αδενώματος σε καρκίνο, ονομαζόμενο στάδιο προόδου όγκου (tumor progression). (9) Στη διεργασία αυτή εμπλέκονται μεταλλάξεις που αφορούν περισσότερα του ενός γονίδια, ενώ η αλληλουχία τους καθορίζει τελικά την εμφάνιση καρκίνου. (Σχήμα 1) β-catenin COX-2 K-ras ή(έναρξη) (πρόοδος) APC DPC4/SMAD4 p53 Φυσιολογικός ACF Πρώιμο Ενδιάμεσο Προχωρημένο Καρκίνωμα βλεννογόνος αδένωμα αδένωμα αδένωμα MSH2, MLH1, PMS2 κλπ Σχήμα 1. Πρότυπο καρκινογένεσης με συμμετοχή των απενεργοποιημένων ογκοκατασταλτικών γονιδίων (φυσιολογική γραφή) και των ενεργοποιημένων ογκογονιδίων (έντονη γραφή). Τα μεταλλαγμένα γονίδια της οδού APC στο άνω τμήμα της εικόνας, της οδού MMR στο κάτω τμήμα. ACF: Πρόδρομες εστιακές δυσπλαστικές κρύπτες. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες, οι οποίες είτε καταστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, είτε επάγουν την απόπτωση (κυτταρικό θάνατο) και απενεργοποιούνται στον ΚΠΕ. Τα ογκογονίδια αποτελούν ενεργοποιημένες μορφές πρωτοογκογονιδίων, τα οποία

31 προάγουν τον πολλαπλασιασμό ή την ανάπτυξη του όγκου. (15,18) (Πίνακας 1) Πίνακας 1. Oγκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια εμπλεκόμενα στους όγκους της γαστρεντερικής οδού Παχύ έντερο Οισοφάγος Στόμαχος Oγκογονίδια Κ-ras + + c-myc + + + c-erb B1 + c-erb B2 + + + hst-1 + + trk + c-raf + c-scr + c-myb + + c-kit + β-catenin + + c-yes c-mos c-fos Ογκοκατασταλτικά γονίδια P53 + + + APC + + + DCC + + + MCC + + DPC4 + DPC4/SMAD4 + Γονίδια διόρθωσης λαθών DNA hmsh2, hmlh1 + + + ΜYH +

32 2.1. Ογκογονίδια Έχουν απομονωθεί περισσότερα από 80 ογκογονίδια, ο αριθμός των οποίων προοδευτικά αυξάνει και τα παράγωγα που κωδικοποιούν παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση. (18) Τα παράγωγα αυτά περιλαμβάνουν τουλάχιστον 4 κατηγορίες πρωτεϊνών: αυξητικούς παράγοντες, πρωτεϊνικές κινάσες με ή χωρίς υποδοχείς, πρωτεΐνες που μεταφέρουν σήματα στο εσωτερικό του κυττάρου και πυρηνικούς πρωτεϊνικούς παράγοντες μεταγραφής (Nuclear Factor κβ, NFκB). (15) To K-ras ογκογονίδιο, η μεταβολή του οποίου μελετήθηκε περισσότερο σε νεοπλάσματα παχέος εντέρου, υφίσταται συχνά μεταλλάξεις, γεγονός που του προσδίδει την ικανότητα να προκαλεί μεταμόρφωση κυττάρων. Μεταλλάξεις K-ras απαντούν μόνο στο 9% των μικρών αδενωμάτων, σε σύγκριση με το 58% των αδενωμάτων διαμέτρου >1 cm και το 47% των καρκινωμάτων, δεδομένα που δείχνουν ότι το K-ras δρα σε ενδιάμεσο στάδιο της ογκογένεσης του παχέος εντέρου. Επιπλέον, το K-ras παίζει ρόλο στην ανάπτυξη μεταστάσεων. (19) Από την άλλη πλευρά, ένας μεγάλος αριθμός αδενωμάτων και καρκινωμάτων δεν εκδηλώνει K-ras μεταλλάξεις υποδηλώνοντας ότι άλλα γενετικά συμβάντα παίζουν επίσης ρόλο στην ογκογένεση. (13,14) Για τη μεταμόρφωση του K-ras ογκογονιδίου απαιτούνται επιπρόσθετες γενετικές μεταβολές όπως υπερέκφραση ογκογονιδίων (cyclin D, Myc) ή μεταλλάξεις του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53. Αυτή η συνεργασία ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών ογκογονιδίων στην K-ras μεταμόρφωση αντιπροσωπεύει ένα πρότυπο της πολυσταδιακής εξέλιξης της ογκογένεσης. (20) Από πρακτικής πλευράς, Κ-ras μεταλλάξεις δυνατόν να ανιχνευθούν σε πολύποδες παχέος εντέρου, έκπλυμα υποκλυσμού που πιθανόν να είναι ειδικό περιφερικής νεοπλασίας παχέος εντέρου ή σε DNA πλάσματος ασθενών με ΚΠΕ. (21,22) Η γενετική ανάλυση του DNA του πλάσματος φαίνεται ότι αποτελεί πρακτικό δείκτη με δυνητικές κλινικές εφαρμογές. (21) Tο Κ-ras επάγει την έκφραση του γονιδίου της γαστρίνης, η οποία ως ογκογόνος αυξητικός παράγοντας, φαίνεται να παίζει ρόλο στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου. (23,24) Ορισμένοι ΚΠΕ, αλλά και σειρές καρκινικών κυττάρων παράγουν γαστρίνη, εκφράζουν υποδοχείς γαστρίνης και υφίστανται μιτογόνο απάντηση σε εξωγενή χορήγηση γαστρίνης. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα γαστρίνης ορού ασθενών με ΚΠΕ μειώνονται σημαντικά μετά εκτομή του όγκου, ευρήματα που δείχνουν ότι η γαστρίνη δυνατόν να εφαρμοστεί ως χρήσιμος προγνωστικός παράγοντας στους ασθενείς αυτούς. (25,26,27) Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν την ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ υπεργαστριναιμίας ασθενών με ΚΠΕ και λοίμωξης από Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού, υποδηλώνοντας ότι το βακτηρίδιο δυνατόν να αποτελεί παράγοντα κινδύνου για ανάπτυξη ΚΠΕ μέσω αύξησης της γαστρίνης του πλά-

33 σματος. (28,29) Κατά συνέπεια, η θεραπεία εκρίζωσης της λοίμωξης δυνητικά αναστέλλει την ανάπτυξη ΚΠΕ. (30) Εξάλλου, η γαστρίνη φαίνεται ότι προάγει την έκφραση της COX-2 σε νεοπλασματικά κύτταρα ΚΠΕ ανθρώπου, υποδηλώνοντας μια επιπρόσθετη αυξητική δράση της ορμόνης στην ανάπτυξη και πρόοδο του όγκου μέσω επαγωγής της COX-2. (31,32,33) Επιπλέον, η ορμόνη αυξάνει την έκφραση της κυκλίνης D1 (cyclin D1) και του πυρηνικού αντιγόνου PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen, πυρηνικό αντιγόνο του πολλαπλασιαζόμενου κυττάρου) προάγοντας την καρκινογένεση. (32) Αναφορικά με τη γονιδιακή θεραπεία έναντι του καρκίνου, πρόσφατα έχει αναγνωρισθεί ο ανθρώπινος υποδοχέας για τους ιούς coxcackie και adenovirus CAR (Coxcackie Adenovirus Receptor), ο οποίος αντιπροσωπεύει την πρωτογενή κυτταρική εστία προσκόλλησης του ιού κατά τη διάρκεια της λοίμωξης. Επειδή οι γενετικά τροποποιημένοι αδενοϊοί διερευνώνται σήμερα ως αντι-ογκογόνοι παράγοντες, έχει βρεθεί ότι η μετάδοση σήματος μέσω της Ras/MAΡK οδού ρυθμίζει την CAR έκφραση, μεταβάλλοντας την είσοδο του αδενοϊού εντός κυττάρων ΚΠΕ του ανθρώπου. Επιπλέον, η χορήγηση αναστολέων της Ras/MAΡK οδού οδηγεί σε σημαντική αύξηση της έκφρασης του CAR στις κυτταρικές σειρές, καταλήγοντας σε σημαντική πρόσληψη, πολλαπλασιασμό και κυτταροπαθητική δράση των αδενοϊών. Η αναστολή αυτής της οδού παρέχει ένα τρόπο αύξησης της CAR έκφρασης στα καρκινικά κύτταρα, ο οποίος φαίνεται να βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της βασιζόμενης σε αδενοϊούς θεραπείας κατά του καρκίνου. (34) 2.2. Ογκοκατασταλτικά γονίδια Η φυσιολογική τους λειτουργία είναι η καταστολή ανάπτυξης του όγκου. Η αδρανοποίηση των βιολογικών τους δράσεων σε νεοπλάσματα παχέος εντέρου, όπως οι ατελείς μεταθέσεις, η μεθυλίωση των γονιδιακών εκκινητών (απώλεια μεταγραφικής ικανότητας), η εξάλειψη ή απώλεια εναπομείναντος αλληλίου στην ετερόζυγη κατάσταση (απώλεια ετεροζυγωτίας, Loss Οf Ηeterozygosity, LOH) λόγω μεταλλάξεων ή ελλειμμάτων αλληλομόρφων γονιδίων, προάγουν την καρκινογένεση. (1,12,13,18) Στον πίνακα 2 αναγράφονται τα ογκοκατασταλτικά γονίδια και τα χρωμοσώματα, στα οποία εδράζονται. APC (Adenomatous Polyposis Coli, γονίδιο αδενωματώδους πολυποδίασης παχέος εντέρου): Το ογκοκατασταλτικό αυτό γονίδιο συμμετέχει στη ρύθμιση πολλών κυτταρικών λειτουργιών, που περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση, την απόπτωση, την προσκόλληση και την μετανάστευση των κυττάρων, καθώς και στο διαχωρισμό των χρωματοσωμάτων, μέσω της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί, η οποία συνδέεται με διάφορες ενδοκυττάριες πρωτεΐνες, όπως β-κατενίνη (β-catenin), γ-

34 κατενίνη (γ-catenin), κινάση της συνθετάσης γλυκογόνου (Glycogen Synthase Kinase, GSK-3β), αξίνη (axin), τουμπουλίνη (tubulin), EB1 και hdlg. (35) Πίνακας 2. Χρωμοσωμική εντόπιση ογκοκατασταλτικών γονιδίων Γονίδιο Χρωμόσωμα Adenomatous Polyposis Coli (APC) 5q p53 17p DCC 18q SMAD4 (DPC4, MADH4) 18q TGF-β1 RII 3 Σημαντική πρόοδος στην κατανόηση της λειτουργίας του APC σημειώθηκε με τη μελέτη της αντίδρασης της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί, με τις πρωτεΐνες GSK-3β και β-catenin, κάθε μία από τις οποίες αποτελεί σημαντικό στοιχείο της οδού μετάδοσης σήματος Wingless/Wnt. H GSK-3β μετά τη σύνδεσή της, φωσφορυλιώνει τη β-catenin και axin. Η φωσφορυλίωση καθιστά τη β-catenin στόχο αποδόμησης. Μετάλλαξη του APC διαταράσσει τη δημιουργία του συμπλέγματος, με τελικό αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της β-catenin στο κυτταρόπλασμα. Η ελεύθερη β-catenin μεταφέρεται στον πυρήνα, όπου συνδέεται με μεταγραφικούς παράγοντες (παράγοντας Τ-κυττάρου, T-Cell Factor, TCF) και συγκεκριμένα με τον TCF-4. Η ενεργοποίηση αυτής της οδού προκαλεί την επαγωγή των ογκογονιδίων c-myc και κυκλίνης D1, καθώς και ματριλισίνης (matrilysin), c-jun και fra-1, τα οποία είναι απαραίτητα για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. (Σχήμα 2) Ένα άλλο γονίδιο-στόχος είναι το PPARδ (Peroxisom Proliferator-Activated Receptor δ, ενεργοποιημένος υποδοχέας του πολλαπλασιαστή του υπεροξειδιοσωματίου), το οποίο ρυθμίζεται και από τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ). (36) Ένας επιπρόσθετος τρόπος δράσης του γονιδίου APC στηρίζεται στην ιδιότητα του να ρυθμίζει τις πρωτεΐνες του κυτταρικού σκελετού, στις οποίες περιλαμβάνονται η ακτίνη (F-actin) και μικροσωληνίσκοι, με τελικό αποτέλεσμα τη ρύθμιση των μηχανισμών προσκόλλησης, μετανάστευσης και μιτωτικής δραστηριότητας. (37)

35 Κυτταρική μεμβράνη Οδός μετάδοσης Wnt Μετάλλαξη APC ή β-catenin Συγκέντρωση β-catenin Αποδόμηση β-catenin Πυρήνας Σχήμα 2. Η οδός μετάδοσης σήματος APC/β-catenin. Η σύνδεση των πρωτεϊνών APC και GSK-3β με τη βοήθεια της αξίνης, έχουν ως αποτέλεσμα την αποδόμηση της β-κατενίνης. Στην περίπτωση μετάλλαξης στα γονίδια APC ή β-catenin, διαταράσσεται η διαδικασία αυτή. Αυξημένα επίπεδα β-catenin μεταφέρονται στον πυρήνα, όπου συνδέονται με τον μεταγραφικό παράγοντα TCF-4 και προκαλούν επαγωγή ογκογονιδίων (Τροποποίηση από Chung DC, Gastroenterology 2000). Η αδρανοποίηση του APC αποτελεί έναυσμα για έναρξη της ογκογένεσης. Μετάλλαξη ή απώλεια του APC καθιστά τους ασθενείς με σύνδρομο FAP επιρρεπείς στην ανάπτυξη καρκίνου. Η μετάλλαξή του ευθύνεται για την εμφάνιση των συνδρόμων FAP και Gardner. Μεταλλάξεις του APC απαντούν σε περισσότερο από τα 2/3 των σποραδικών καρκίνων και αδενωμάτων του παχέος εντέρου. (1,12,13,15,18) Επιπλέον, μεταβολές του APC γονιδίου οδηγούν σε διαταραχή της φυσιολογικής διαδικασίας διακυτταρικής προσκόλλησης μέσω μεταβολών που σχετίζονται με τις κατενίνες και του μορίου προσκόλλησης Ε-καντερίνη (E-cadherin), η οποία αποτελεί διαμεμβρανική πρωτεΐνη συνδέουσα τις κατενίνες. Το σύμπλεγμα E-cadherin/catenin παίζει σπουδαίο ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής ιστικής αρχιτεκτονικής υφής. Μεταλλάξεις των συστατικών αυτών προκαλεί απώλεια της διακυτταρικής προσκόλλησης και προδιαθέτει στην ανάπτυξη νεοπλασίας. Απώλεια της έκφρασης της E-cadherin στον ΚΠΕ σχετίζεται με απώλεια της διαφοροποίησης του όγκου. (38) Επιπλέον, η απώλεια της μεμβρανικής έκφρασης της E-cadherin και η αύξηση της πυρηνικής έκφρασης της β-catenin αποτελούν δυσμενείς προγνωστικούς παράγοντες στον ΚΠΕ. (39)

36 O συνδέτης Fas (Fas ligand, FasL) έχει χαρακτηρισθεί ως «συνδέτης θανάτου» σε λεμφοκυτταρικούς ιστούς και εκφράζεται σε νεοπλάσματα παχέος εντέρου όπου πιθανόν συμμετέχει στην ανοσιακή διαφυγή (immune evasion). Συνέκφραση του FasL, της πυρηνικής β-catenin και της μεταλλοπρωτεϊνάσης matrilysin της θεμέλιας ουσίας (matrix) είναι συχνή σε ΚΠΕ, σχετίζεται με μείωση των CD8-κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων που διηθούν τον όγκο (CD8-bearing tumor-infiltrating lymphocytes), αυξημένη αγγείωση του όγκου και δυσμενή πρόγνωση. (40) Πειραματικές μελέτες δείχνουν ότι επίπεδες δυσπλαστικές αλλοιώσεις του βλεννογόνου, σχετιζόμενες με ACF, αποτελούν προκαρκινικές αλλοιώσεις κατά τη διαδικασία της ογκογένεσης του παχέος εντέρου και η ανάπτυξη αδενωμάτων στα πειραματόζωα δείχνει συσχέτιση ιστολογικής παρουσίας δυσπλασίας και κυτταροπλασματικής υπερέκφρασης β-catenin. (41) Πρόσφατα δεδομένα υποδηλώνουν τον ρόλο των αρχέγονων κυττάρων στην ογκογένεση του παχέος εντέρου. Για τα αρχέγονα εντερικά κύτταρα, η Wnt οικογένεια των αυξητικών παραγόντων και η σχετιζόμενη ρύθμιση της ενδοπυρηνικής εντόπισης της β-catenin, φαίνεται να παίζουν κεντρικό ρόλο στη φυσιολογική τους ομοιόσταση, ενώ μεταλλάξεις των στοιχείων αυτών των οδών οδηγούν στην ανάπτυξη ΚΠΕ. Για παράδειγμα, παθολογική βιολογία του αρχέγονου κυττάρου παρατηρείται στην οικογενή πολυποδίαση. (42,43) p53: Η πυρηνική αυτή ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη εμπλέκεται στη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος, καθώς βλάβη του DNA οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του p53, το οποίο προκαλεί παύση του ενεργού κυτταρικού κύκλου στη φάση G1. Ακολούθως το p53 επάγει παράγοντες που επιτρέπουν την επισκευή του DNA, ενώ σε περίπτωση σοβαρής βλάβης του DNA επάγει παράγοντες που προκαλούν απόπτωση. Έλλειμμα αλληλομόρφου γονιδίου του χρωμοσώματος 17p, στην περιοχή όπου εδράζεται το γονίδιο αυτό, αποτελεί την πιο συχνή μορφή ελλείμματος αλληλομόρφου γονιδίου στον ΚΠΕ και απαντάται στο 60%-70% των περιπτώσεων. Επειδή τα αδενώματα σπάνια εκδηλώνουν έλλειμμα του χρωμοσώματος 17p, η p53 μετάλλαξη εμφανίζεται ως όψιμο συμβάν κατά την μετάπτωση του αδενώματος σε διηθητικό καρκίνωμα. (1,13) Από πρακτικής πλευράς, τα επίπεδα των p53 αντισωμάτων στον ορό ασθενών με ΚΠΕ μειώνονται μετά την εξαίρεση του όγκου και φαίνεται ότι αποτελούν χρήσιμο δείκτη για την παρακολούθηση των ασθενών. (44) Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η p53 παίζει κριτικό ρόλο στον έλεγχο της ανταπόκρισης του όγκου στη χημειοθεραπεία. (45) Άλλα ογκοκατασταλτικά γονίδια είναι: α) DCC (Deleted Colon Cancer) γονίδιο: εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 18q, η φυσιολογική του λειτουργία είναι η επαγωγή της διακυτταρικής προσκόλλησης, ελλείμματα ή μεταλλάξεις του απαντούν στο σποραδικό καρκίνο και φαίνεται ότι διευκολύ-

37 νουν τις μεταστάσεις. Η απώλεια του DCC στο στάδιο ΙΙ (Dukes B) της νόσου σχετίζεται με κακή πρόγνωση. (1,13) β) MCC (Mutated in Colon Cancer) γονίδιο σχετιζόμενο με τον ΚΠΕ. γ) DPC4 (Deleted in Pancreas Cancer) γονίδιο, το οποίο εντοπίζεται επίσης στο χρωμόσωμα 18q. Το γονίδιο αυτό ανήκει στην οικογένεια SMAD γονιδίων που εμπλέκονται σε οδούς μετάδοσης σημάτων ενεργοποιούμενων μέσω υποδοχέων του TGF-β (Transforming Growth Factor-β, μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας-β). Μεταλλάξεις του DPC4 έχουν παρατηρηθεί στον σποραδικό ΚΠΕ. Η απώλεια της ετεροζυγωτίας του σε ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα και νόσο Crohn πιθανόν να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου στους ασθενείς αυτούς. (1,13) 2.3. Γονίδια διόρθωσης λανθασμένων ζευγών βάσεων κατά το διπλασιασμό του DNA (DNA Mismatch Repair, MMR) Μια άλλη σημαντική μοριακή οδός καρκινογένεσης σχετίζεται με γονίδια (hmlh1, hmsh2, hmsh6, hpms1, hpms2) εμπλεκόμενα στους διορθωτικούς μηχανισμούς του DNA. Γενετική ή επιγενετική αδρανοποίηση των DNA MMR γονιδίων οδηγεί σε μεταλλάξεις καρκινικών γονιδίων και ανάπτυξη νεοπλασίας. (1,46) Οι μεταλλάξεις των γονιδίων αυτών προκαλούν χαρακτηριστικό φαινότυπο αποκαλούμενο μικροδορυφορική αστάθεια (Microsatellite Instabillity, MSI), η οποία παρατηρείται στους περισσότερους από το 90% των ασθενών με HNPCC και στο 10% των σποραδικών περιπτώσεων ΚΠΕ. (13,47) Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων (90%) οι μεταλλάξεις αφορούν τα γονίδια hmlh1 και hmsh2. Ειδικότερα, κάθε ένα από τα γονίδια αυτά κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που μετέχει στο σύστημα επιδιόρθωσης βλαβών του DNA κατά το διπλασιασμό του. Σε κύτταρα, στα οποία υπάρχει βλάβη στο σύστημα MMR, εμφανίζονται μεταλλάξεις σε γονίδια, λόγω μη διόρθωσης λανθασμένων ζευγών βάσεων κατά τη φάση διπλασιασμού του DNA και κυρίως στα γονίδια που παρουσιάζουν βραχείες, επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες βάσεων, καλούμενες μικροδορυφόροι. Συνέπεια των μεταλλάξεων των γονιδίων του συστήματος MMR, λόγω της μικροδορυφορικής αστάθειας, είναι η απενεργοποίηση γονιδίων, τα οποία μετέχουν σε λειτουργίες ρύθμισης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όπως ο τύπου ΙΙ υποδοχέας του μετατρεπτικού αυξητικού παράγοντα (Transforming Growth Factor-β RII, TGFβRII), ο τύπου ΙΙ υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα ομολόγου ινσουλίνης (Insulin-like Growth Factor II, IGFIIR) και του γονιδίου Bax που επάγει την απόπτωση. Η απενεργοποίηση των γονιδίων αυτών έχει ως αποτέλεσμα τη διαταραχή του μηχανισμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού και τη δημιουργία όγκων. (48) Επισημαίνεται ότι οι ΜΜR-σχετιζόμενοι ΚΠΕ έχουν καλύτερη πρόγνωση ακόμη και σε προχωρημένες περιπτώσεις σε σχέση με τους μη ΜΜR-σχετιζόμενους όγκους. (49,50,51) Η καλύτερη πρόγνωση αποδίδεται στο

38 ότι οι πρώτοι δυνατόν να είναι εντόνως ανοσογενείς, προκαλώντας ισχυρή ανοσιακή απάντηση που περιορίζει την πρόοδό τους. (46) H υπομεθυλίωση του DNA φαίνεται να παίζει ρόλο στην ογκογένεση. Επίσης, υπερμεθυλίωση στις CpG νησίδες αποτελεί σπουδαίο μηχανισμό ογκογένεσης των αδενωμάτων και ΚΠΕ. (13) 2.4. Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και διακυτταρικά μόρια προσκόλλησης (integrins, cadherins, selectins, proteoglycans) Μεταβολές αυτής της ουσίας και των διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων φαίνεται ότι παίζουν σπουδαίο ρόλο στις φαινοτυπικές μεταβολές των καρκινικών κυττάρων. (13) Ειδικότερα, η ενεργός μεταλλοπρωτεϊνάση-2 της θεμέλιας ουσίας (Matrix Metaloproteinase-2, ΜΜΡ-2) αυξάνει σημαντικά στον ΚΠΕ και εντοπίζεται σε εν τω βάθει περιοχές του όγκου (στο μυϊκό χιτώνα και όχι σε επιπολής καρκινικά κύτταρα), σχετιζόμενη με διηθητική ικανότητα και μεταστατική νόσο. Επιπλέον, τα επίπεδά της στο πλάσμα υποχωρούν μετά επιτυχή εκτομή του όγκου και μπορεί να χρησιμεύσει ως πιθανός μη επεμβατικός δείκτης παρουσίας ΚΠΕ με μεγάλη τάση διήθησης, γεγονός που θα απαιτεί την εφαρμογή συμπληρωματικής χημειοθεραπείας. (52) Αύξηση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 επίσης σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση του ΚΠΕ. (53,54) 2.5. Κυκλοοξυγενάση (COX) Η COX οξειδώνει το αραχιδονικό οξύ προς παραγωγή προσταγλανδίνης PG 2, ανάγει την PGG 2 σε PGH 2 (Prostaglandin Endoperoxide H 2, ενδοπεροξείδιο H 2 προσταγλανδίνης) και αποτελεί ένζυμο κλειδί για την παραγωγή προσταγλανδινών (PGs, Prostaglandins) και άλλων εικοσανοειδών. Υφίσταται κυρίως σε 2 μορφές, COX-1 και COX-2. Η COX-1 απαντάται στην πλειονότητα των ιστών και εμπλέκεται στη φυσιολογία παραγωγής των προσταγλανδινών που είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της φυσιολογικής ομοιόστασης. Η COX-2 επάγεται από κυτταροκίνες, μιτογόνα και αυξητικούς παράγοντες και τα επίπεδά της ανευρίσκονται αυξημένα σε ΚΠΕ πειραματοζώων και ανθρώπου. (1) 3. Μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος Με την επίδραση διαφόρων φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στους ιστούς, πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, όπως το αραχιδονικό, απελευθερώνονται από τα φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης με τη δράση της εκκριτικής ή της κυτταροπλασματικής φωσφολιπάσης Α 2 (secretory Phospholipase A 2, spla 2 και cytosolic Phospholipase A 2, cpla 2).

39 Το αραχιδονικό πολυακόρεστο λιπαρό οξύ απαρτίζεται από 20 μόρια άνθρακα και παράγεται είτε απευθείας από τις προσλαμβανόμενες τροφές, είτε από την τροποποίηση του λινολεϊκού οξέος. Μετά την εστεροποίησή του σε φωσφολιπίδιο, εστιάζεται στη μεμβράνη των κυττάρων. Αποτελεί την κυριότερη πρόδρομη μορφή των προστανοειδών, τα οποία αποτελούνται από 18, 20 ή 22 μόρια άνθρακα και ανήκουν στη μεγάλη ομάδα των εικοσανοειδών λιπαρών οξέων, τα οποία ασκούν ορμονική δράση. Τα εικοσανοειδή παράγονται από τα ω3 (n-3) και ω6 (n-6) πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και περιλαμβάνουν: (α) προστανοειδή, τα οποία σχηματίζονται μέσω της οδού της COX, (β) λευκοτριένες, λιποξίνες, εποξιλίνες και μονοϋδροξυ-λιπαρά οξέα που παράγονται δια της οδού της λιποξυγενάσης, (γ) εποξυ- και διυδροξυ-λιπαρά οξέα παραγόμενα μέσω του κυτοχρώματος Ρ450 και (δ) ισοπροστάνες, ισολευκοτριένες και άλλα υπεροξειδωμένα παράγωγα λιπαρών οξέων παραγόμενα χωρίς τη δράση ενζύμων. (55) Μετά την απελευθέρωσή του, το ελεύθερο αραχιδονικό οξύ εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στην πυρηνική μεμβράνη, όπου υφίσταται οξείδωση με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή προσταγλανδινών. Η αναφερθείσα COX ή συνθετάση του ενδοπεροξειδίου της PGH (Prostaglandin Endoperoxide H Synthase, PGHS), αποτελεί το ρυθμιστικό ένζυμο που καταλύει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος στο ενδοπεροξείδιο της PGH 2, μέσω διαδικασίας που εξελίσσεται σε δύο φάσεις. Κατά την πρώτη (αντίδραση COX), δύο μόρια οξυγόνου ενώνονται με το αραχιδονικό και σχηματίζουν την PGG 2 που αποτελεί ενδιάμεσο προϊόν. Κατά τη δεύτερη φάση (αντίδραση υπεροξειδάσης), με την αφαίρεση δύο ηλεκτρονίων από την PGG 2 προκύπτει το ασταθές ενδοπεροξείδιο PGH 2. Οι δύο αυτές φάσεις εκδηλώνονται σε διαφορετικές, αλλά δομικά και λειτουργικά συνδεόμενες περιοχές του ενζύμου. Ειδικότερα, η αντίδραση υπεροξειδάσης λαμβάνει χώρα σε μία ενεργό περιοχή περιέχουσα αίμη, πλησίον της επιφάνειας της πρωτεΐνης, ενώ η αντίδραση της κυκλοξυγενάσης σε ένα υδρόφοβο κανάλι στον πυρήνα του ενζύμου. Η αντίδραση υπεροξειδάσης δυνατόν να επιτελείται in vitro, ανεξάρτητα από την COX (σε περίπτωση αναστολής της από τη δράση ΜΣΑΦ) ή κατά τη διάρκεια της καταλυτικής δραστηριότητας της COX. Αντιθέτως, η αντίδραση COX εξαρτάται από το υπεροξείδιο και προϋποθέτει την οξείδωση της αίμης με δύο ηλεκτρόνια. Δεν είναι γνωστοί οι παράγοντες που σηματοδοτούν την έναρξη της οξείδωσης της αίμης in vivo. Όσον αφορά στην αντίδραση των δύο ισομορφών της COX, COX-1 (PGHS-1) και COX-2 (PGHS-2), βρέθηκε ότι για την COX-2 απαιτούνται 10 φορές χαμηλότερες συγκεντρώσεις υδροπεροξειδίου σε σύγκριση με την COX-1, γεγονός που επιτρέπει την ανεξάρτητη λειτουργία της πρώτης από τη δεύτερη στα κύτταρα, στα οποία εκφράζονται και οι δύο ισομορφές. (55) Στο ενδοπεροξείδιο PGH 2 δρουν άμεσα οι ειδικές για κάθε τύπο κυττάρου συνθετάσες προσταγλανδινών, προστακυκλίνης και θρομβοξά-

40 νης. Αποτέλεσμα της δράσης αυτής είναι η παραγωγή τουλάχιστον 5 βιοδραστικών μορίων λιπιδίων που περιλαμβάνουν τις προσταγλανδίνες PGΕ 2, PGD 2, PGF 2α, PGI 2 (προστακυκλίνη) και τη θρομβοξάνη Α 2 (ΤΧΑ 2). (Σχήμα 3, Σχήμα 4) ΜΣΑΦ COXIBs Αραχιδονικό οξύ COX-1 COX-2 PGH 2 PG, Tx συνθετάσες TxA 2 PGI 2 PGE 2 PGD 2 PGF 2α Θρομβωτική (1)Γαστροπροστασία (1)Φλεγμονή Αντιφλεγμονώδης Στειρότητα διάθεση (2) Αντιθρομβωτική (2)Ανάπτυξη δράση δράση όγκου Σχήμα 3. Σύνθεση προσταγλανδινών και κύριες λειτουργίες τους. COXIBs: εκλεκτικοί αναστολείς COX-2, PGH2: ενδοπεροξείδιο H2 προσταγλανδίνης. Αναλόγως προς τον τύπο του κυττάρου και τις συνθήκες που επικρατούν είναι διαφορετικός και ο μεταβολισμός του PGH2. Η συνθετάση της PGD ανευρίσκεται στα μαστοκύτταρα και στον εγκέφαλο, της PGF στη μήτρα, της PGI στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ η ισομεράση της PGΕ στην πλειονότητα των κυττάρων. Η συνθετάση της θρομβοξάνης ανευρίσκεται στα αιμοπετάλια και στα μακροφάγα. Εκτός αυτών, υπάρχουν και μη ενζυματικοί μηχανισμοί μετατροπής του PGH 2 σε προσταγλανδίνες. Τα προϊόντα αυτά μετά την έξοδο τους από το κύτταρο συνδέονται με αντίστοιχους υποδοχείς με αυτοκρινή ή παρακρινή τρόπο. Οι διαμεμβρανικοί κυτταρικοί υποδοχείς των προσταγλανδινών (7 transmembrane G-protein-coupled rhodopsin-type receptors, διαμεμβρανικοί υποδοχείς τύπου ροδοψίνης συνδεδεμένοι με πρωτεΐνη G) χαρακτηρίζονται αναλόγως με την PG, με την οποία συνδέονται, ως DP για την PGD 2, EP (EP1, EP2, EP3, EP4) για την PGΕ 2, FP για την PGF 2α, IP για την PGI 2 και TP για την θρομβοξάνη ΤΧΑ 2. Σε μερικές περιπτώσεις οι προσταγλανδί-

41 νες συνδέονται με πυρηνικούς υποδοχείς, όπως τους ενεργοποιημένους υποδοχείς PPAR. (56) Οι υποδοχείς ΕΡ έχουν εντοπισθεί στο γαστρεντερικό σωλήνα αρουραίων. Συγκεκριμένα αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊνικό οξύ (mrna) των ΕΡ1 και ΕΡ3 έχει βρεθεί στη μυϊκή στιβάδα του λεπτού και παχέος εντέρου τους, όπως επίσης θετική βρέθηκε και η έκφραση του γονιδίου του ΕΡ4. Στο στόμαχο, ΕΡ1mRNA βρέθηκε στο μυϊκό τοίχωμα και έκφραση των γονιδίων των υποδοχέων ΕΡ3 και ΕΡ4 στο επιθήλιο του γαστρικού βλεννογόνου. (57) Φωσφολιπάση Α 2 Φωσφολιπίδιο Κυκλοοξυγενάση Ο 2 Ο 2 Υπεροξειδάση Συνθετάσες Προσταγλανδίνες Προστακυκλίνη Θρομβοξάνη Α 2 Σχήμα 4. Οδός βιοσύνθεσης των προστανοειδών που παράγονται από το αραχιδονικό οξύ. 3.1. COX Στον ανθρώπινο οργανισμό υφίστανται κυρίως οι αναφερθείσες δύο ισομορφές της COX (COX-1 και COX-2). Πρόσφατα σε πειραματόζωα προσδιορίστηκε η COX-3, η οποία ανευρίσκεται κυρίως στον εγκεφαλικό φλοιό, παρουσιάζει μεγάλη ευαισθησία στην ακεταμινοφαίνη και η σημασία της στον ανθρώπινο οργανισμό δεν έχει διευκρινιστεί προς το παρόν. (58) Μεταξύ των δύο ισομορφών της COX υπάρχει κατά 60-65%

42 ομοιότητα στην αλληλουχία των αμινοξέων μεταξύ ομοίων ειδών. Στον άνθρωπο τα γονίδια των COX-1 και COX-2 εδράζονται στα χρωμοσώματα 9 και 1, αντιστοίχως. (59) Η COX-1 εκφράζεται σε πολλούς ιστούς και κύτταρα και τα επίπεδά της παραμένουν σταθερά, τόσο σε φυσιολογικές, όσο και σε παθολογικές συνθήκες. Η COX-1 εμπλέκεται στην αναφερθείσα παραγωγή των προσταγλανδινών που προστατεύουν το γαστρεντερικό βλεννογόνο από τη δράση διαφόρων βλαπτικών παραγόντων, διατηρώντας την ακεραιότητά του. Επίσης, μέσω της COX-1, η παραγωγή προσταγλανδινών στους νεφρούς διατηρεί την αιματική ροή και την σπειραματική διήθηση σε καταστάσεις που προκαλούν αγγειοσύσπαση. (60) Υπό φυσιολογικές συνθήκες η COX-2 δεν εκφράζεται ή εκφράζεται ελάχιστα στους περισσοτέρους ιστούς και κύτταρα. Γνωστές εξαιρέσεις αποτελούν οι σπερματοδόχοι κύστεις, επειδή η PGE2 και οι μεταβολίτες της αποτελούν τα κύρια συστατικά του σπέρματος. (61) Επίσης, η COX-2 εκφράζεται στα νεφρικά σπειράματα και στα μικρά αιμοφόρα αγγεία, συμβάλλοντας πιθανόν στη ρύθμιση του Na σε καταστάσεις στρες. (62) Επιπλέον, εκφράζεται στο κεντρικό νευρικό σύστημα και ειδικότερα σε νευρωνικά και μη νευρωνικά κύτταρα του ιππόκαμπου, υποθάλαμου, φλοιού και νωτιαίου μυελού, όπου συμμετέχει στην αίσθηση του άλγους και στη ρύθμιση της θερμοκρασίας. (63) Τέλος, εκφράζεται στα ωοθηλάκια, επιθηλιακά κύτταρα της μήτρας και στα περιβάλλοντα στρωματικά κύτταρα στο σημείο πρόσφυσης της βλαστοκύστης. (64) Η δράση διαφόρων φλεγμονωδών ερεθισμάτων έχει ως αποτέλεσμα την άμεση επαγωγή της COX-2, η οποία είναι παροδική και επανέρχεται στα αρχικά της επίπεδα σε διάστημα 24-48 ωρών. (65) Η COX-2 επάγεται από ορισμένες κυτταροκίνες, αυξητικούς και μιτογόνους παράγοντες, όπως η ιντερλευκίνη-1 (IL-1), ο παράγοντας νέκρωσης του όγκου (Tumor Necrosis Factor, TNFα), ο μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας (Transforming Growth Factor, TGF-β), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (Epidermal Growth Factor, EGF), ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας (Platelet-derived Growth Factor, PDGF) και ο ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας (Fibroblast Growth Factor, FGF). Αντιθέτως, μόρια με αντιφλεγμονώδη δράση, όπως κορτικοειδή και οι κυτταροκίνες IL-13, IL-10 και IL-4 καταστέλλουν την έκφραση της COX-2. (66) (Πίνακας 3)

43 Πίνακας 3. Επαγωγείς της έκφρασης της COX-2 στα επιθηλιακά κύτταρα Κυτταροκίνες Αυξητικοί παράγοντες Άλλοι παράγοντες IL-1α IL-1β IL-6 IL-8 IL-11 TNF-α IFN-γ PDGF VEGF EGF TGFβ IGF αfgf βfgf PGE2 NO Υποξία Μηχανικό στρες Οι διαφορετικές φαρμακολογικές και βιολογικές ιδιότητες που παρουσιάζουν οι δύο μορφές της COX οφείλονται σε μικρές διαφορές στη δομή τους. Το μέγεθος της ενεργού περιοχής της COX-1 είναι μικρότερο της αντίστοιχης περιοχής της COX-2 [ύπαρξη 17 και 35 αμινοξέων, αντικατάσταση της Ισολευκίνης (Ile) με Βαλλίνη (Val) στις θέσεις 434 και 523 στην COX-1 και COX-2, αντιστοίχως]. Η διαφορά αυτή του μεγέθους των ενεργών περιοχών οδήγησε στη δημιουργία των εκλεκτικών αναστολέων της CΟX-2. (67) Το διαφορετικό μέγεθος των ενεργών περιοχών εξηγεί και το διαφορετικό βαθμό αναστολής που προκαλεί η δράση της ασπιρίνης στα δύο ένζυμα. Η σερίνη 530 (Ser530) αποτελεί την περιοχή ακετυλίωσής τους από την ασπιρίνη. Στην περίπτωση της COX-1, η ασπιρίνη αναστέλλει πλήρως την ικανότητά της για οξείδωση του αραχιδονικού οξέος. Ο ίδιος μηχανισμός ακετυλίωσης στην COX-2 δεν εμποδίζει την οξείδωση του αραχιδονικού οξέος, το οποίο όμως στην προκείμενη περίπτωση δεν μετατρέπεται σε PGG 2, αλλά σε άλλο παράγωγο (15R-υδροξυεικοσατετραϊνοϊκό οξύ, 15R-hydroxyeicosatetraenoic acid, HETE). (68) Μια άλλη διαφορά που έχει παρατηρηθεί μεταξύ των δύο μορφών της COX αφορά στο σημείο δράσης τους. Με τεχνικές φθορισμού έχει βρεθεί ότι ενώ και η COX-1 και η COX-2 εντοπίζονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στην πυρηνική μεμβράνη, τα επίπεδα της δεύτερης είναι υψηλότερα στη μεμβράνη του πυρήνα. (69) 4. COX-2 και καρκινογένεση Έκφραση της COX-2 έχει βρεθεί σε πειραματικά πρότυπα φλεγμονής και στην φλεγμονώδη νόσο του εντέρου του ανθρώπου, καταστάσεις που σχετίζονται με την ογκογένεση της γαστρεντερικής οδού. Αυξημένη έκφραση της COX-2 έχει αναφερθεί σε αδενώματα και όγκους παχέος εντέ-

44 ρου, καρκίνο στομάχου, οισοφάγο Barrett και αδενοκαρκίνωμα οισοφάγου. (70,71) Ιn vitro μελέτες δείχνουν ότι η COX-2 ασκεί μιτογόνο και ογκογόνο δράση και η υπερέκφρασή της προκαλεί αναστολή της διεργασίας απόπτωσης και αύξηση της διεισδυτικότητας των νεοπλασματικών κυττάρων. (72) Επιπλέον, οι προσταγλανδίνες ως παράγωγα της COX-2, προάγουν την αγγειογένεση, αναστέλλουν την ανοσιακή επιτήρηση και αυξάνουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, συμβάλλοντας στην καρκινογένεση. (70,72) Ειδικότερα, κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων συνεχώς προκύπτουν ενδείξεις για το ρόλο της COX-2 στην ογκογένεση, ιδιαίτερα του παχέος εντέρου, τόσο από μελέτες σε πειραματόζωα και σε ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση, όσο και από επιδημιολογικές μελέτες. 4.1. Πειραματικές μελέτες Σε πειραματικό επίπεδο, η σχέση της COX-2 με την καρκινογένεση προκύπτει από μελέτες σε πρότυπα γενετικά τροποποιημένων πειραματόζωων με FAP, καθώς και σε πειραματόζωα, στα οποία προκλήθηκε καρκίνος με χορήγηση χημικών ουσιών. Υπερέκφραση της COX-2 βρέθηκε σε αδενώματα μυών APC Min, που εμφανίζουν πολλαπλές εντερικές νεοπλασίες (Multiple intestinal neoplasia, Min), ως αποτέλεσμα μετάλλαξης στο γονίδιο APC. (73) Αυξημένα επίπεδα COX-2 βρέθηκαν και σε πειραματόζωα με καρκίνο εντέρου μετά από χορήγηση αζοξυμεθανίου (Azoxymethane, AOM). (74) Από την άλλη πλευρά, εξάλειψη του γονιδίου COX-2 προκάλεσε μείωση σχηματισμού όγκων στο λεπτό και παχύ έντερο σε μύες APC Min και σε μύες APC Δ716, ένα άλλο πρότυπο με μετάλλαξη στο γονίδιο APC. (75,76) Στη συνάφεια αυτή, μελέτες σε διαφορετικά πειραματικά πρότυπα έδειξαν την προστατευτική δράση των ΜΣΑΦ έναντι των όγκων. Σε μύες Apc Min, η χορήγηση μη εκλεκτικών ΜΣΑΦ (Sulindac και Piroxicam) και εκλεκτικών αναστολέων COX-2 (Celecoxib και Rofecoxib), προκάλεσε μείωση των μικρών πολυπόδων στο έντερο. (77,78) Σε πειραματόζωα με καρκίνο εντέρου από ΑΟΜ, παρατηρήθηκε χημειοπροφυλακτική δράση των μη εκλεκτικών ΜΣΑΦ και των εκλεκτικών αναστολέων COX-2. (79,80) Η εκλεκτική αναστολή της COX-2 προκάλεσε σχεδόν πλήρη καταστολή του ΚΠΕ πειραματοζώων ή πολυπόδων μυών (APC knockout mouce). (13) Επίσης η χορήγηση ΜΣΑΦ ανέστειλε την ανάπτυξη κυττάρων ΚΠΕ σε κυτταρικές καλλιέργειες. (81) 4.2. Μελέτες σε ασθενείς με FAP Έχει αναγνωρισθεί η χημειοπροστατευτική επίπτωση των ΜΣΑΦ στον επιπολασμό και την πρόοδο του ΚΠΕ με κύρια οδό δράσης την αναστολή σύνθεσης προσταγλανδινών από την COX-2. (82,83) Η χορήγησή τους (κατεξοχήν Sulindac) οδήγησε σε ελάττωση του αριθμού και του μεγέθους των πολυπόδων του παχέος εντέρου. (84) Επιπλέον, η προκληθείσα

45 από ινδομεθακίνη (Indomethacin) αναστολή ανάπτυξης νεοπλασματικών κυττάρων τύπου ΗΤ-29 (παραγομένων από ΚΠΕ ανθρώπου) συνοδευόταν από καταστολή έκφρασης του ογκογονιδίου c-myc στα αναφερόμενα κύτταρα. (85) (Πίνακας 4) Πίνακας 4: Μελέτες χορήγησης ΜΣΑΦ σε ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση (FAP) Ν ΜΣΑΦ Διάρκεια Αποτέλεσμα Συγγραφέας Τυχαιοποιημένες μελέτες 41 Sulindac 48 μήνες Καμία διαφορά Giardiello (86) 21 Sulindac 3 μήνες αριθμού Keller (87) 24 Sulindac 6 μήνες πολυπόδων ορθού Nugent (88) πολυπόδων 12λου 22 Sulindac 9 μήνες αριθμού & μεγέθους Giardiello (89) 10 Sulindac 4 μήνες αριθμού Labayle (90) Μη τυχαιοποιημένες μελέτες 4 Sulindac 12 μήνες πολυπόδων Waddell (84) 11 Sulindac 5 έτη πολυπόδων Waddell (91) 4 Sulindac 6 μήνες πολυπόδων Rigau (92) 13 Sulindac 6 μήνες Tonelli (93) 15 Sulindac 42 εβδομάδες πολυπόδων Winde (94) 8 Indomethacin 4-8 εβδομάδες πολυπόδων Hirota (95) 4.3. Επιδημιολογικές μελέτες Έχει δειχθεί αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας εμφάνισης KΠE και συστηματικής λήψης ασπιρίνης ή ΜΣΑΦ. Παρόμοιος προστατευτικός ρόλος προκύπτει από αναδρομικές και προοπτικές μελέτες. (96,97,98,99) Πρόσφατες εκτιμήσεις δείχνουν ότι η συστηματική χορήγηση ασπιρίνης μειώνει τον αριθμό των αδενωμάτων σε άτομα με ιστορικό ΚΠΕ ή αδενωμάτων. (100,101) Επίσης, η χορήγηση ΜΣΑΦ προκαλεί μείωση του αριθμού και του μεγέθους των αδενωμάτων του παχέος εντέρου στα μέσου κινδύνου άτομα. Παρόμοιο αποτέλεσμα των ΜΣΑΦ παρατηρείται στις αναφερθείσες ACF, που πιθανόν αποτελούν πρόδρομες βλάβες των αδενωμάτων και του ΚΠΕ. (102) Εντούτοις, δεν έχει βρεθεί η κατάλληλη δοσολογία των ΜΣΑΦ, ούτε και η διάρκεια χορήγησης που απαιτούνται για να επιτευχθεί το επιθυμητό αποτέλεσμα. Στην περίπτωση της ασπιρίνης φαίνεται ότι η κλιμακούμενη δόση παρουσιάζει καλύτερο αποτέλεσμα. (103) Επίσης, δεν

46 έχει αποδειχθεί η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια της μακροχρόνιας προληπτικής χορήγησης των ΜΣΑΦ. 5. COX-2 και καρκίνος πεπτικού Στην αναφερόμενη διεργασία ογκογένεσης σημαντικό ρόλο παίζουν τα σχετιζόμενα με φλεγμονή γονίδια και η αποπτωτική διεργασία στις προκαρκινικές και νεοπλασματικές καταστάσεις της γαστρεντερικής οδού. Πρόσφατα η σχετική ερευνητική προσπάθεια επικεντρώνεται στα γονίδια που σχετίζονται με τη φλεγμονή και απόπτωση σε σχέση με την αλληλουχία μετάπτωσης του φυσιολογικού επιθηλίου σε φλεγμονώδες επιθήλιο, μεταπλασία, δυσπλασία και καρκίνο της γαστρεντερικής οδού, με ιδιαίτερη επικέντρωση στον οισοφάγο (οισοφάγος Barrett), στόμαχο (γαστρίτιδα από Ελικοβατηρίδιο του πυλωρού) και παχύ έντερο (ιδιοπαθής φλεγμονώδης νόσος εντέρου). Οι φλεγμονώδεις αυτές παθολογικές καταστάσεις χαρακτηρίζονται από ενεργοποίηση του αντιαποπτωτικού παράγοντα μεταγραφής NF-κB, προκαλώντας έκφραση των NF-κB-ρυθμιζόμενων και σχετιζόμενων με φλεγμονή γονιδίων, όπως της επαγώγιμης μορφής συνθετάσης οξειδίου του αζώτου (inducible Nitric Oxide Synthase, inos) και της COX-2. Η έκφραση αυτών των γονιδίων συμβάλλει στην επιβίωση των κυττάρων. Πράγματι, επί απουσίας ενεργοποίησης του NF-κB, η έκθεση σε προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες προκαλεί απόπτωση, ενώ οι χρόνιες αυτές φλεγμονώδεις καταστάσεις συνοδεύονται από ενεργοποίηση του αντιαποπτωτικού NF-κB και συνεχή έκφραση των γονιδίων επιβίωσης (pro-survival genes). Παρόλο που η έκφραση αυτή εξασκεί ευεργετικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων κατά την διάρκεια έκθεσης τους στο φλεγμονώδες ερέθισμα, η συνεχής ενεργοποίηση του NF-κB ενέχει τον κίνδυνο, κύτταρα με φαινότυπο επιβίωσης (pro-survival phenotype) να μεταπέσουν σε συνεχώς πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα εκδηλώνοντας κακοήθη φαινότυπο. Για την πρόοδο αυτών των κυττάρων προς τον κακοήθη φαινότυπο εμπλέκονται επιπρόσθετες μεταβολές με έκφραση μη ρυθμιζόμενων από τον NF-κB γονιδίων που προκαλούν στροφή της ισορροπίας των προ- και αντι-αποπτωτικών γονιδίων προς την κατεύθυνση του αντι-αποπτωτικού φαινοτύπου, προάγοντας τελικά την ογκογένεση του οισοφάγου και της υπόλοιπης γαστρεντερικής οδού. (13,104) 5.1. Οισοφαγικός καρκίνος H COX-2 εκφράζεται εκλεκτικά στο επιθήλιο Barrett και η έκφρασή της διεγείρεται από αυξητικούς παράγοντες, κυτταροκίνες, εστέρες (phorbol esters) και από υπερέκφραση πρωτεϊνικής κινάσης C, παράγοντες

47 που εμπλέκονται στην παθογένεση του οισοφάγου Barrett, ο οποίος προδιαθέτει για ανάπτυξη οισοφαγικού αδενοκαρκινώματος. Επίσης, αυξημένα επίπεδα COX-2 παρατηρούνται σε αδενοκαρκίνωμα που αναπτύχθηκε σε έδαφος οισοφάγου Barrett. Επιπλέον, σε περιοχές με υψηλόβαθμη δυσπλασία και αδενοκαρκίνωμα, τα επίπεδα COX-2 είναι υψηλότερα σε σύγκριση με περιοχές με χαμηλόβαθμη ή χωρίς δυσπλασία. Συστατικά της χολής (χολικά άλατα) σε συνδυασμό με γαστρικό οξύ φαίνεται ότι επιδρούν στην COX-2-μεταγραφή και κατ επέκταση στην ανάπτυξη και πρόοδο της αλληλουχίας οισοφάγος Barrett-δυσπλασία-οισοφαγικό αδενοκαρκίνωμα. Έχει δειχθεί ότι το οξύ και τα χολικά άλατα αυξάνουν σημαντικά την έκφραση της COX-2 σε ιστό επιθηλίου Barrett και η δράση αυτή αναστέλλεται με χρήση εκλεκτικών αναστολέων COX-2. (70,105) Η προσθήκη εκλεκτικού αναστολέα COX-2 σε κύτταρα βιοψιών από οισοφάγο Barrett προκαλεί ελάττωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά 55% σε σύγκκριση με την ομάδα κυττάρων ελέγχου, ενώ η προσθήκη εξωγενούς προσταγλανδίνης PGE 2 αναστρέφει τη δράση του αναστολέα. (106) Η παρατηρούμενη αυξημένη έκφραση COX-2 στην αλληλουχία μεταπλασία-δυσπλασία-οισοφαγικό αδενοκαρκίνωμα σχετίζεται με λεμφαδενική προσβολή και υπερέκφραση του ογκογονιδίου Ki-67 (57,8%), ευρήματα που υποδηλώνουν ότι η επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης οδηγεί σε λεμφαδενική διασπορά και ελάττωση της επιβίωσης στις περιπτώσεις του σχετιζόμενου με οισοφάγο Barrett αδενοκαρκινώματος. (70,107,108) Ομοίως, η αυξημένη επαγωγή της COX-2 από τον αυξητικό παράγοντα TGF-β1 συμβάλλει στην αύξηση ογκογένεσης και διεισδυτικότητας κυττάρων που μεταμορφώθηκαν από το ογκογονίδιο Ras, υποδηλώνοντας τη σημασία της συσχέτισης έκφρασης COX-2 και αγγειογενετικών παραγόντων στον σχηματισμό νέων αγγείων και την επέκταση των όγκων. Στη νεοαγγείωση σημαντικό ρόλο παίζουν οι προσταγλανδίνες, συμβάλλοντας στην καρκινογένεση του οισοφάγου. (70) 5.2. Γαστρικός καρκίνος Υψηλά επίπεδα COX-2 ανευρίσκονται στις προκαρκινικές βλάβες του στομάχου και στο γαστρικό καρκίνο, ενώ στο φυσιολογικό βλεννογόνο του στομάχου εκφράζεται μόνο η COX-1. Έχει δειχθεί ότι η έντονη παρουσία του συνθετικού μηχανισμού (COX-1, COX-2) των προσταγλανδινών και υποδοχέων τους στα Τ λεμφοκύτταρα (ΤLs) του γαστρικού βλεννογόνου εγγύς του όγκου ή και στα καρκινικά γαστρικά κύτταρα, υποδηλώνουν έναν πιθανό κεντρικό ρόλο της καθοδηγούμενης από προστανοειδή ογκογένεσης. (109) Σε μοριακό επίπεδο, οι προσταγλανδίνες συνδέονται με τον πυρηνικό υποδοχέα PPARδ, εξασκώντας έτσι αντι-αποπτωτική δράση και προάγοντας την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, μέσω ενεργοποίησης αυτού του υποδοχέα που δυνατόν να οδηγεί στην κλωνική τους ανάπτυξη και την ογκογένεση. (110) Επιπλέον, υψηλή έκφραση της COX-2

48 παρατηρείται και σε προκαρκινικές και καρκινικές βλάβες που σχετίζονται με το Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού, μετά την εκρίζωση του οποίου παρατηρείται ελάττωση της έκφρασης της COX-2. (11,112) Η αναστολή της COX-2 προλαμβάνει την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων γαστρικού καρκίνου σε τρωκτικά. Η συστηματική χρήση ασπιρίνης και ΜΣΑΦ σχετίζεται με ελαττωμένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του στομάχου σε σύγκριση με τους μη χρήστες των παραπάνω φαρμάκων. (113) 6. COX-2 και ΚΠΕ Ο σχετιζόμενος με την COX μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος φαίνεται να συνδέεται με βλάβες στο DNA του κυττάρου, επειδή η εξαρτώμενη από υπεροξείδια οξείδωση έχει σχετισθεί με τη μεταβολική ενεργοποίηση καρκινογόνων. (114) Ανοσοϊστοχημική αυξημένη έκφραση της COX-2 από 2 έως 50 φορές, έχει παρατηρηθεί αρχικά (1994) στο 85-90% των ΚΠΕ. Επίσης, ανοσοϊστοχημική υπερέκφραση της πρωτεΐνης παρατηρήθηκε στο 40% των αδενωμάτων σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου. Τα επίπεδα του αγγελιοφόρου RNA (COX-2messenger RNA, COX-2mRNA) βρέθηκαν σε υψηλά επίπεδα, ενώ η έκφραση της COX-1 ήταν σταθερή στο φυσιολογικό βλεννογόνο και στο νεοπλασματικό ιστό. (115) Η αναλογία του COX-2mRNA ήταν υψηλότερη στον καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο, στην πλειοψηφία (46/50) των περιπτώσεων ΚΠΕ. (116) Η έκφραση των δύο ισομορφών COX ήταν διαφορετική. Συγκεκριμένα, η έκφραση της COX-1 ήταν παρόμοια στο σύνολο των καρκινικών ιστών και του φυσιολογικού βλεννογόνου, ενώ τα επίπεδα της COX-2 ήταν αυξημένα στο 76% των περιπτώσεων ΚΠΕ και μόνο στο 8% των φυσιολογικών βλεννογόνων. (117) Παρόμοιες εκτιμήσεις έδειξαν αυξημένη έκφραση της COX-2 στα καρκινικά και φλεγμονώδη κύτταρα, στο αγγειακό ενδοθήλιο και στους ινοβλάστες των παθολογικών ιστών σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο. Αντιθέτως, τα επίπεδα έκφρασης της COX-1 ήταν χαμηλά στο φυσιολογικό βλεννογόνο και καρκινικό ιστό. (118) Η COX-2 ανευρίσκεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα των νεοπλασματικών επιθηλιακών κυττάρων και σε μικρότερο βαθμό στα μακροφάγα, στους ινοβλάστες και στο ενδοθήλιο. Σε σχετικές ανοσοϊστοχημικές μελέτες που δείχνουν αυξημένη έκφραση της COX-2 σε αδενώματα παχέος εντέρου (77% των αδενωμάτων), η εντόπιση της εστιάζεται κυρίως στα διάμεσα επιφανειακά μακροφάγα (75%) και σε μικρότερη έκταση στα διάμεσα εν τω βάθει μακροφάγα (17%). Στα επιθηλιακά κύτταρα με δυσπλασία, η COX-2 ανιχνεύεται σε ποσοστό 29% αυτών. (119) Πιθανόν ο ρόλος της να είναι σημαντικός στην ανάπτυξη των αδενωμάτων του παχέος εντέρου,

49 επειδή η πρωτεΐνη COX-2mRNA ανιχνεύεται σε υψηλότερα επίπεδα σε όλα τα αδενώματα σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα και σχετίζεται με το μέγεθος των αδενωμάτων. Εντούτοις, στους υπερπλαστικούς πολύποδες τα επίπεδα COX-2mRNA δεν διαφέρουν σημαντικά από τα αντίστοιχα του φυσιολογικού βλεννογόνου. (117) Φαίνεται ότι η αυξημένη έκφραση της COX-2 αποτελεί πρώιμο γεγονός στη διαδικασία της καρκινογένεσης του ΚΠΕ. Στις αρχικές μελέτες η εκτίμηση της υπερέκφρασης της COX-2 στον ΚΠΕ αφορούσε το σύνολο του όγκου, χωρίς να καθορίζεται το είδος των κυττάρων, στα οποία τα επίπεδα του ενζύμου ήταν υψηλότερα. (115) Η γνώση της ακριβούς εντόπισης της COX-2 δυνατόν να συμβάλει στην κατανόηση της σχέσης της με τη διαδικασία της καρκινογένεσης. Εντούτοις, η σχετική έρευνα δείχνει συχνά αντιφατικά αποτελέσματα. Πράγματι, πειραματικές μελέτες δείχνουν ότι η COX-2 δυνατόν να εκφράζεται σε εστίες δυσπλασίας και νεοπλασίας του εντερικού βλεννογόνου, ενώ σε άλλες μελέτες φαίνεται ότι ο ρόλος της COX-2 περιορίζεται στα πρώιμα στάδια του σχηματισμού αδενωμάτων και ανευρίσκεται στα διάμεσα κύτταρα. (73) Σε μύες APC Min η COX-2 εκφράζεται κυρίως στα μακροφάγα των αδενωμάτων του λεπτού και παχέος εντέρου. (120) Σε αδενώματα λεπτού εντέρου μυών APC Min και σε ΚΠΕ μετά από χορήγηση ΑΟΜ σε αρουραίους, αυξημένη έκφραση COX-2 παρατηρείται κυρίως στο νεοπλασματικό επιθήλιο. Σε μικρότερο ποσοστό αυξημένα επίπεδα COX-2 ανευρίσκονται στα στρωματικά κύτταρα (μακροφάγα ή ινοβλάστες) στους πολύποδες των APC Min μυών. (121) Στους μύες APC D716, η COX-2 εντοπίζεται στα στρωματικά κύτταρα πολυπόδων λεπτού εντέρου και ειδικότερα στο ενδοθήλιο και στους ινοβλάστες. (122,123) Δεν υπάρχει σαφής εξήγηση για τα αντικρουόμενα αυτά αποτελέσματα. Πιθανολογείται ότι η μέσω COX-2 παραγωγή προσταγλανδινών προάγει την ανάπτυξη του όγκου, δρώντας στα νεοπλασματικά επιθηλιακά κύτταρα, στα στρωματικά κύτταρα ή και στα δύο. (121) Ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε ανθρώπους δείχνουν ότι η COX-2 υπερεκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα των αδενωμάτων και αδενοκαρκινωμάτων, ενώ άλλες δείχνουν ότι η COX-2 υπερεκφράζεται στα κύτταρα του στρώματος. (124,125) Η αυξημένη έκφραση COX-2 περιγράφεται σε κάθε είδος κυττάρου του στρώματος αδενοκαρκινωμάτων, όπως σε ινοβλάστες, μυοϊνοβλάστες, φλεγμονώδη μονοκύτταρα και σε επιθηλιακά κύτταρα. (117,126) Σε αδενώματα παχέος εντέρου ανθρώπων, η COX-2 εκφράζεται έντονα στα υποεπιθηλιακά διάμεσα κύτταρα. (127) Στο φυσιολογικό επιθήλιο δεν ανευρίσκεται η COX-2. Επίσης, τα επίπεδα COX-2 mrna είναι αυξημένα στον ΚΠΕ σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο, ενώ τα επίπεδα COX-1 είναι παρόμοια μεταξύ του όγκου και του φυσιολογικού βλεννογόνου. (121)

50 Επειδή υπερέκφραση COX-2 δεν διαπιστώνεται σε φυσιολογικό βλεννογόνο αλλά κατεξοχήν σε μυοϊνοβλάστες αδενωματώδους και νεοπλασματικού ιστού ασθενών με όγκους παχέος εντέρου, οι μυοϊνοβλάστες πιθανόν να αντιπροσωπεύουν μελλοντικά κύτταρα στόχους για τη μέσω ΜΣΑΦ χημειοπροστασία έναντι του ΚΠΕ. (82,128) 6.1. Σχέση της COX-2 με τα χαρακτηριστικά του όγκου Η έρευνα έχει εστιασθεί στην έκφραση της COX-2 σε σχέση με την εντόπιση του όγκου, το στάδιο κατά Dukes, την ύπαρξη μεταστάσεων και την επιβίωση. Εντούτοις, τα ευρήματα των σχετικών μελετών ήταν αντικρουόμενα. Ο Elder και συν. εξετάζοντας σε 76 ασθενείς με αδενωματώδεις πολύποδες, το μέγεθος των πολυπόδων και την έκφραση της COX-2 στα επιθηλιακά κύτταρα, βρήκαν ότι συγχρόνως με την αύξηση του μεγέθους των αδενωμάτων αυξανόταν ο αριθμός των κυττάρων, στα οποία παρατηρήθηκε έκφραση της COX-2 και η ένταση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης στα κύτταρα αυτά. (124) Σε άλλη μελέτη με 108 ασθενείς, βρέθηκε ότι η έκφραση COX-2 mrna σχετίζεται με το μέγεθος των αδενωμάτων, αλλά μόνο για τους πολύποδες του άπω τμήματος του παχέος εντέρου (σπληνική καμπή έως ορθό). (129) Στη μελέτη του Pisano και συν., η έκφραση της COX-2 βρέθηκε θετική σε 62 από τα 68 αδενώματα του παχέος εντέρου και ήταν εντονότερη στους μεγαλύτερου μεγέθους πολύποδες, ενώ δεν βρέθηκε συσχέτιση με την εντόπιση των πολυπόδων. (130) Ο Fujita και συν. βρήκαν σε πρωτοπαθείς ΚΠΕ, θετική συσχέτιση της έκφρασης της COX-2 με το μέγεθος του όγκου, καθώς και με το βάθος διήθησης. Δεν βρέθηκε συσχέτιση του mrnacox-2 με την εντόπιση των όγκων. (131) Τα αποτελέσματα ανάλογης μελέτης έδειξαν ότι η έκφραση της COX-2 ήταν εντονότερη στους πολύποδες με μεγαλύτερο μέγεθος, με περισσότερα θηλώδη στοιχεία και με μεγαλύτερο βαθμό δυσπλασίας. (132) Επιπλέον, η COX-2 έχει βρεθεί στο δίκτυο των νεόπλαστων αιμοφόρων αγγείων των ΚΠΕ και σε λεμφαδενικές ή ηπατικές μεταστάσεις. Στα αδενώματα με υψηλή έκφραση της COX-2 βρέθηκε μεγαλύτερη μικροαγγειακή πυκνότητα (Microvessel Density, MVD) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα χωρίς έκφραση της COX-2. Σε περιοχές με αυξημένα επίπεδα MVD παρατηρήθηκε συσσώρευση κυττάρων με έκφραση της COX-2, υποδηλώνοντας την πιθανή συσχέτιση έκφρασης της COX-2 και αγγειογένεσης. (133) Όσον αφορά στην επέκταση του όγκου, σε 128 περιπτώσεις ΚΠΕ βρέθηκε θετική συσχέτιση της COX-2 με το βάθος διείσδυσης του όγκου και την ύπαρξη μεταστάσεων στους λεμφαδένες και στο ήπαρ. Ειδικότερα, στις 45 περιπτώσεις με θετικούς λεμφαδένες παρατηρήθηκε έκφραση της COX-2 σε ποσοστό 86,7% στους πρωτοπαθείς όγκους και σε ποσοστό 100% στους διηθημένους λεμφαδένες. (134) Παρόμοιες μελέτες έδειξαν ποσοστά έκφρασης COX-2 στο φυσιολογικό βλεννογόνο, στον καρκινικό ιστό και στους διηθημένους λεμφαδένες 17%, 72% και 100%, αντιστοί-

51 χως. (135) Επίσης, βρέθηκε αυξημένη έκφραση της COX-2 στους πρωτοπαθείς και μεταστατικούς ΚΠΕ και υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στον καρκινικό ιστό των ηπατικών μεταστάσεων σε σύγκριση με τον ιστό από τους πρωτοπαθείς όγκους. (136) Η τάση ανάπτυξης νεοπλασμάτων παχέος εντέρου φαίνεται ότι διαφέρει ανάμεσα στο δεξιό και αριστερό τμήμα. (13) Ο Dimberg και συν. βρήκαν μεγαλύτερη έκφραση της COX-2 στον καρκίνο του ορθού, ενώ σε πιο πρόσφατη μελέτη αναφέρεται συχνότερη έκφραση στο υπόλοιπο τμήμα του παχέος εντέρου και στους διαφοροποιημένους όγκους. (137,138) Οι διαφορές αυτές στην έκφραση της COX-2, πιθανόν να είναι αποτέλεσμα διαφορετικών μηχανισμών που υπεισέρχονται στην ανάπτυξη των όγκων. Η σύγκριση διαφόρων γονιδίων που υπεισέρχονται στη διαδικασία της καρκινογένεσης, καθώς και η μελέτη της προγνωστικής τους αξίας σε 35 αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου και σε 42 του ορθού, έδειξε ότι η έκφραση του p53 ήταν σημαντικά αυξημένη στα καρκινώματα του ορθού και σχετιζόταν με χειρότερη πρόγνωση. Επίσης, βρέθηκε μεγαλύτερη έκφραση της πυρηνικής β-catenin στους καρκίνους του ορθού σε σχέση με τους καρκίνους του υπολοίπου τμήματος του παχέος εντέρου, χωρίς όμως να σχετίζεται με παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο APC. (139) Επιπλέον, πιθανόν να υφίσταται μηχανισμός που προάγει την ανάπτυξη διηθητικού καρκίνου από βλεννογονικές αλλοιώσεις στο αριστερό τμήμα του παχέος εντέρου και στο ορθό, ενώ υποστηρίζεται ότι σε μερικές περιπτώσεις καρκίνων του δεξιού τμήματος, αυτοί αναπτύσσονται de novo σε επίπεδες βλάβες. (140) Τέλος, ενώ ο ρυθμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όπως εκτιμάται με την έκφραση του ογκογονιδίου Κi-67, είναι σταθερός σε όλο το μήκος του παχέος έντερου, αντίθετα η αποπτωτική διεργασία, εκτιμώμενη με τη αποπτωτική πρωτεΐνη Βax, είναι περισσότερο αυξημένη στο αριστερό παρά στο δεξιό τμήμα. Το εύρημα αυτό σχετίζεται με τις διαφορές στην επιδημιολογική και γενετική συμπεριφορά των καρκίνων αυτών των περιοχών του παχέος εντέρου. (13) Συνοπτικά, τα ευρήματα αυτά, και λαμβάνοντας υπόψη ότι στην περίπτωση του συνδρόμου FAP οι όγκοι συνήθως αναπτύσσονται στο αριστερό τμήμα του παχέος εντέρου, ενώ στο σύνδρομο HNPCC στο δεξιό, οδηγούν στην υπόθεση της ύπαρξης δύο διαφορετικών μηχανισμών καρκινογένεσης για τους όγκους του παχέος εντέρου, ανάλογα με το σημείο ανάπτυξής τους. Οι διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ των εγγύς και των άπω όγκων του παχέος εντέρου, συνέπεια των οποίων είναι και η διαφορετική ευαισθησία τους στη θεραπεία με 5-FU, φαίνεται ότι είναι αποτέλεσμα των διαφορετικών μοριακών χαρακτηριστικών τους. Στη συνάφεια αυτή, η μικροδορυφορική αστάθεια φαίνεται να σχετίζεται με τους όγκους του δεξιού τμήματος του παχέος εντέρου, ενώ η χρωμοσωμιακή αστάθεια με τους όγκους του αριστερού τμήματος. (141) Σε μελέτη περιπτώσεων ΚΠΕ

52 με υψηλή συχνότητα MSI ή με μετάλλαξη στο γονίδιο MMR, βρέθηκε χαμηλή έκφραση της COX-2. Η COX-2 εκφράζεται σε μικρότερο ποσοστό στους ΚΠΕ που αναπτύσσονται σε ασθενείς με HNPCC σε σύγκριση με τις σποραδικές περιπτώσεις. (126) 6.2. Η COX-2 ως προγνωστικός δείκτης ΚΠΕ Η έκφραση της COX-2 πιθανόν να σχετίζεται με το στάδιο του όγκου και την επιβίωση. Μελέτες σε 232 χειρουργικά παρασκευάσματα ΚΠΕ, έδειξαν την ύπαρξη συσχέτισης της έκφρασης της COX-2 με τον ιστολογικό τύπο του όγκου, το στάδιο και την ύπαρξη μετάχρονων ηπατικών μεταστάσεων. Η πρόγνωση στις περιπτώσεις των ασθενών με όγκους θετικούς στην COX-2 ήταν δυσμενέστερη από την αντίστοιχη των ασθενών με COX-2 αρνητικούς όγκους. (142) Ο Petersen και συν. ανέφεραν συσχέτιση της αυξημένης έκφρασης COX-2 σε αδενοκαρκινώματα του ορθού με αυξημένο κίνδυνο αιματογενών μεταστάσεων, αλλά χωρίς συσχέτιση με την πιθανότητα τοπικής υποτροπής, ούτε και με την επιβίωση. (143) Αντιθέτως, άλλες μελέτες σε ασθενείς με προχωρημένο ΚΠΕ, έδειξαν σημαντική συσχέτιση της υψηλής έκφρασης COX-2 με την υποτροπή του όγκου και ειδικότερα με τις αιματογενείς μεταστάσεις, χωρίς παρουσία συσχέτισης με το στάδιο του όγκου. (137,144) Σε σειρά 288 ασθενών με χειρουργηθέντα ΚΠΕ, βρέθηκε ότι η αυξημένη έκφραση COX-2 σχετιζόταν με μειωμένη επιβίωση και αναγνωρίστηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας. (145) Επίσης σε περιπτώσεις ασθενών με ΚΠΕ χωρίς διήθηση λεμφαδένων, η έκφραση της COX-2 σχετίστηκε με μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής ή θανάτου σε σύγκριση με τους COX-2 αρνητικούς όγκους. (146) Σε ενδιαφέρουσα μελέτη, στην οποία προσδιορίσθηκε το mrna της COX-2 και του καρκινοεμβρυϊκού αντιγόνου (Carcinoembryonic Antigen, CEA) στα κόπρανα ασθενών με ΚΠΕ και υγιών μαρτύρων, βρέθηκε ότι η ευαισθησία των δύο μεθόδων ήταν εξίσου υψηλή (90% έναντι 100%), ενώ η ειδικότητα του mrnacox-2 ήταν σημαντικά υψηλότερη (100% έναντι 5%). (147) Συνοπτικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η COX-2 επηρεάζοντας ποικιλοτρόπως την βιολογία του ΚΠΕ, πιθανόν να χρησιμεύει ως προγνωστικός δείκτης σε υποομάδες ασθενών με συνοδό υπερέκφραση. 7. COX-2 και άλλοι καρκίνοι Στον καρκίνο του μαστού, η υπερέκφραση της COX-2 αποτελεί πρώιμο γεγονός στη διαδικασία της καρκινογένεσης και έχει συσχετισθεί με ύπαρξη διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων, επιθετικούς ιστολογικούς χαρακτήρες του όγκου και μειωμένη επιβίωση ελεύθερη νόσου. Επίσης, έχει αναφερθεί αυξημένη συγκέντρωση προσταγλανδινών, ειδικότερα της

53 PGΕ 2 και TXA 2. Η μακροχρόνια χρήση ΜΣΑΦ έχει συσχετισθεί με μειωμένη εμφάνιση της νόσου. (148) Στον καρκίνο του προστάτη έχει βρεθεί αυξημένη έκφραση COX-2, με ασθενή ή απουσία έκφρασης στο φυσιολογικό προστατικό ιστό. Εντούτοις, υφίσταται ασυμφωνία όσον αφορά στην έκφραση της COX-2 στην ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, η οποία αποτελεί πρόδρομη βλάβη και στον εγκατεστημένο καρκίνο του προστάτη. (148) Υπερέκφραση της COX-2 έχει βρεθεί και σε άλλους τύπους διηθητικού καρκίνου, όπως δέρματος, πνευμόνων, ουροδόχου κύστης, τραχήλου μήτρας και ωοθηκών. (149) Επιπλέον, ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει αυξημένη έκφραση της COX-2 σε προκαρκινικές βλάβες, όπως λευκοπλακία, ακτινική κεράτωση, in situ καρκίνωμα μαστού και ουροδόχου κύστης. (149) (Πίνακας 5) Πίνακας 5. Έκφραση COX-2 σε προκαρκινικές και καρκινικές βλάβες Καρκίνος (Προκαρκινική βλάβη) Έκφραση COX-2 % Ορθοκολικός 80-90 Γαστρικός 80 Οισοφαγικός 70 Ηπατοκυτταρικός (Κίρρωση ήπατος) 54 (81) Παγκρεατικός 67 Κεφαλής-τραχήλου 80 Μη μικροκυτταρικός πνεύμονα 70 Μαστού (In situ πόρων) 40 (60) Προστάτη 83-93 Ουροδόχου κύστης 86 Τραχήλου 43 Ενδομητρίου 37 Βασικοκυτταρικός δέρματος 25 Ακανθοκυτταρικός δέρματος 80 8. COX-2 και μοριακοί μηχανισμοί καρκινογένεσης Έχουν προταθεί ποικίλοι μηχανισμοί που εμπλέκουν την COX-2 στην καρκινογένεση και περιλαμβάνουν αύξηση κυτταρικού πολλαπλασιασμού,

54 αναστολή απόπτωσης, επαγωγή αγγειογένεσης, αύξηση της διηθητικότητας των κυττάρων, αυξημένη διεισδυτικότητα, ανοσοτροποποίηση και επαγωγή μεταλλάξεων. (150) Σε αντιστοιχία με τα συνοπτικά αυτά δεδομένα, συστατικά του εντερικού αυλού, όπως τα χολικά άλατα, φαίνεται ότι επιδρούν στην μεταγραφή της COX-2 και κατ επέκταση στην ανάπτυξη ΚΠΕ. (70,72,128) Σε μοριακό επίπεδο, η phosphatidyloinositol (PI)-3 κινάση (παραγόμενη από παράγωγα λιπιδίων) αντιπροσωπεύει μια σπουδαία ομάδα δευτερογενών αγγελιοφόρων με ποικίλες δράσεις που περιλαμβάνουν κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διακίνηση επιφανειακών κυτταρικών υποδοχέων. (71) Η δραστηριότητα της ΡΙ-3 κινάσης αυξάνει σε ιστό ΚΠΕ συγκριτικά με παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο παχέος εντέρου και φαίνεται ότι παίζει ρυθμιστικό ρόλο για την προκαλούμενη από τον παράγοντα-α νέκρωσης όγκου (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α) έκφραση της COX-2 που ευθύνεται για την ογκογένεση. (71) Επιπλέον, αυξημένη επαγωγή της COX-2 από τον αυξητικό παράγοντα TGF-β1 συμβάλλει στην αύξηση ογκογένεσης και διεισδυτικότητας των κυττάρων που μεταμορφώθηκαν από το ογκογονίδιο Ras. (151) 8.1. COX-2, PGΕ2 και καρκινογένεση Όπως προκύπτει από μελέτες σε καλλιέργειες κυττάρων και σε πειραματόζωα, η μέσω COX-2 παραγόμενη PGE2 ενεργοποιώντας τους υποδοχείς ΕΡ, προάγει τη διαδικασία της καρκινογένεσης. Ενώ η PGΕ2 φυσιολογικά ευθύνεται για την προστασία των κυττάρων του γαστρικού βλεννογόνου και τη φυσιολογική αγγείωσή του, η μέσω COX-2 σχηματιζόμενη PGΕ2 φαίνεται να δρα ως προφλεγμονώδης παράγοντας, συμβάλλοντας στην πρόοδο φλεγμονωδών νόσων (αρθρίτιδες, ιδιοπαθή φλεγμονώδη νοσήματα του εντέρου) και του καρκίνου. (114) Η σταθερότητα των επιπέδων της PGΕ 2 στο κύτταρο εξαρτάται από τη σχέση της βιοσύνθεσής, μέσω της COX-2/PGE συνθετάσης και της αποδόμησής, μέσω της δεϋδρογενάσης της 15-υδροξυπροσταγλανδίνης (15- Hydroxyprostaglandin Dehydrogenase, 15-PGDH). Σε πειραματόζωα έχει βρεθεί ότι η απώλεια της έκφρασης του γονιδίου 15-PGDH έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της PGΕ 2 στους ιστούς. Η απώλεια της έκφρασης της 15-PGDH σχετίζεται με την εμφάνιση ΚΠΕ, καρκίνου πνεύμονα και καρκίνου της ουροδόχου κύστης από μεταβατικό επιθήλιο. Τα ΜΣΑΦ αυξάνουν την έκφραση της 15-PGDH στις περιπτώσεις ΚΠΕ. (114) Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η απώλεια της 15-PGDH δυνατόν να συμβάλλει στην πρόοδο του όγκου. Η συγκεκριμένη λειτουργία της 15- PGDH στη διαδικασία της ογκογένεσης αποτελεί αντικείμενο έρευνας. (152) Επισημαίνεται ότι η PGE 2 αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και τη διηθητικότητα νεοπλασματικών κυττάρων ΚΠΕ, μέσω ενεργοποίησης σημαντι-

55 κών ενδοκυτταρικών οδών μετατροπής σημάτων (major intracellular signal transduction pathways) όπως PI3K/Akt. (83) Πειραματικές μελέτες σε μύες APC Min έδειξαν ότι η χορήγηση εξωγενούς PGΕ 2 είχε ως αποτέλεσμα την προστασία των μικρών πολυπόδων του εντέρου από την υποστροφή που προκαλείται με τη χορήγηση ΜΣΑΦ. (153) Επίσης, η θεραπεία των APC Min μυών με PGΕ 2, ευνοεί την ανάπτυξη αδενωμάτων του εντέρου, υποδηλώνοντας τη συμβολή της στην ανάπτυξη του ΚΠΕ. (154) Η δράση της PGΕ 2, όσον αφορά στην ανάπτυξη των όγκων, επιτυγχάνεται μέσω των τεσσάρων υποτύπων υποδοχέων προσταγλανδίνης ΕΡ1 ΕΡ4, με τους οποίους συνδέεται. Από σχετικές μελέτες έχει φανεί ότι και οι τέσσερεις υπότυποι εμπλέκονται στη διαδικασία της καρκινογένεσης, έχοντας ο καθένας διαφορετική δράση ανάλογα με το είδος των κυττάρων ή των ιστών. Ο Sonoshita και συν. διασταυρώνοντας μύες APC Min ομοζυγώτες στη μετάλλαξη των υποδοχέων ΕΡ, έδειξαν ότι μετά τη διασταύρωση ΕΡ1 -/- ή ΕΡ3 -/- μυών δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στον αριθμό των πολυπόδων, ενώ αντιθέτως η διασταύρωση μυών ΕΡ2 -/- είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους και του αριθμού των πολυπόδων, ειδικότερα αυτών που είχαν μέγεθος > 2 mm, και ελάττωση της παραγωγής του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). (155) Η χορήγηση εκλεκτικού αναστολέα ΕΡ4 σε μύες APC Min, είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση κατά 67% των ACF, ενώ η χορήγηση AOM στους μύες ΕΡ4 -/- προκάλεσε κατά 56% μείωση στον αριθμό των εμφανιζομένων ACF. (156) Η χορήγηση εκλεκτικού αναστολέα ΕΡ1 στο ίδιο είδος πειραματόζωων έδειξε ελάττωση των πολυπόδων κατά 40%, ενώ μετά τη χορήγηση ΑΟΜ στους μύες ΕΡ1 -/- ο αριθμός των ACF που παρατηρήθηκαν ήταν μειωμένος κατά 60%. (157) Η ταυτοποίηση των υποδοχέων ΕΡ στους όγκους και η πιθανή ρύθμιση της έκφρασης των υποδοχέων της PGΕ 2 από τα ΜΣΑΦ, δυνατόν να οδηγήσουν στη δημιουργία και χρήση ανταγωνιστών των υποδοχέων ΕP, ως εναλλακτική λύση έναντι των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2. 8.2. Αύξηση αγγειογένεσης Ως αγγειογένεση ορίζεται η διαδικασία σχηματισμού νέων αγγείων από το ήδη υπάρχον αγγειακό δίκτυο. Στον ανθρώπινο οργανισμό αποτελεί φυσιολογική διαδικασία κατά την ανάπτυξη του εμβρύου, καθώς και στην ενήλικη ζωή κατά τη διάρκεια της έμμηνης ρύσης. Η νεοαγγειογένεση σχετίζεται και με παθολογικές καταστάσεις που περιλαμβάνουν καρκίνο, φλεγμονή, επούλωση ελκών και διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και είναι το αποτέλεσμα διαταραχής της ισορροπίας μεταξύ αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων.

56 Ειδικότερα σε ότι αφορά στους συμπαγείς όγκους, η δημιουργία νέων αγγείων είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του μεγέθους τους πέραν των 2-3 mm. (158) Καρκινικά κύτταρα, όπως επίσης και κύτταρα σε εστίες φλεγμονής, παράγουν αγγειογενετικούς παράγοντες, οι οποίοι οδηγούν στη συγκέντρωση και πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων για τη δημιουργία νέου αγγειακού δικτύου. Τα νεοσχηματιζόμενα αγγεία, σε αντίθεση με το φυσιολογικό αγγειακό δίκτυο, παρουσιάζουν παθολογική δομή, ελικοειδή πορεία και τυφλό άκρο, με αποτέλεσμα τη μη φυσιολογική ροή αίματος. Το τοίχωμα τους παρουσιάζει αυξημένη διαπερατότητα με συνέπεια τη διαφυγή υγρών και πρωτεϊνών του πλάσματος στους περιβάλλοντες ιστούς και αύξηση της πίεσης στο διάμεσο χώρο και εντός του όγκου. Η μειωμένη μεταφορά οξυγόνου λόγω της αυξημένης πίεσης και η παθολογική ροή αίματος δημιουργούν συνθήκες υποξίας, η οποία οδηγεί στην παραγωγή αγγειογενετικών παραγόντων και σχηματισμό νέων αγγείων. Γενετικές μελέτες σε πειραματόζωα COX-2 -/-, έχουν δείξει σημαντική μείωση της πυκνότητας των αγγείων και της ανάπτυξης των όγκων σε ΚΠΕ. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν το ρόλο της COX-2 στην αγγειογένεση που σχετίζεται με την ανάπτυξη του όγκου. (159) Η αυξημένη παραγωγή COX-2 σε κύτταρα καρκίνου ΚΠΕ διεγείρει την παραγωγή αγγειογενετικών παραγόντων, όπως τον VEGF και το βασικό αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών (Basic Fibroblast Growth Factor, BFGF). (160) Η παραγωγή των αγγειογενετικών παραγόντων αναστέλλεται από τα εκλεκτικά και μη εκλεκτικά ΜΣΑΦ, με αποτέλεσμα την αναστολή του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και του σχηματισμού σωληνίσκων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων. Οι σχετικές μελέτες δείχνουν ότι η COX-2 είναι δυνατόν να ρυθμίζει αυτές τις διαδικασίες μέσω της παραγωγής αγγειογενετικών παραγόντων. (161) Κατά συνέπεια, η αναστολή της COX-2 από τα ΜΣΑΦ ελαττώνει το σχηματισμό σωληνίσκων, ασκώντας άμεση και έμμεση δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα, μέσω οδού εξαρτώμενης από τη ΜΑΡ κινάση. (161) Η αυξημένη παραγωγή της αναφερθείσης PGE 2 ευθύνεται για το ρόλο της COX-2 στην αγγειογένεση. Από τα ευρήματα σχετικών μελετών προκύπτει ότι η αντιαγγειογενετική δράση των ΜΣΑΦ αναστέλλεται από την PGE 2. (162) Σε ΕΡ2 -/- μύες APC Δ716 παρατηρείται πλήρης κατάργηση της επαγωγής VEGF στους πολύποδες του εντέρου. (163) Η PGE 2 ευθύνεται για την επαγωγή των αγγειογενετικών παραγόντων, οι οποίοι είναι απαραίτητοι για την ανάπτυξη και επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη μετανάστευσή τους για τη δημιουργία τριχοειδών αγγείων. Πράγματι, η PGE 2 προκαλεί αύξηση του VEGF σε καλλιέργειες ανθρώπειων ινοβλαστών και αυξάνει την έκφραση των VEGF και BFGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα, μέσω ενεργοποίησης της οδού μετάδοσης σήματος ERK2/JNK1, αλλά και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. (164) Επιπλέον, οι παράγοντες

57 VEGF και BFGF καθαυτοί επάγουν την έκφραση της COX-2 και την συνακόλουθη παραγωγή προσταγλανδινών στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το αποτέλεσμα της PGE 2 στη ρύθμιση των παραγόντων VEGF και BFGF πιθανόν ενισχύεται μέσω ενός κύκλου θετικής ανάδρασης. (165) (Σχήμα 5) ΜΣΑΦ PGE 2 COX-2 AA Πολλαπλασιασμός PGE 2 αvβ3 ΕΡ1-4 ΕΡ1-4 Cdc42 Μετανάστευση Πυρήνας PGE 2 ERK2 JNKP Επιθηλιακό κύτταρο VEGF bfgf ΜΣΑΦ COX-2 CXCR4 Ενδοθηλιακό κύτταρο Σχηματισμός σωληνίσκων Σχήμα 5. Η μέσω COX-2 παραγόμενη PGE2 επάγει την παραγωγή VEGF και BFGF, οι οποίοι αυξάνουν την παραγωγή PGE2 μέσω επαγωγής της COX-2 (θετική ανάδραση). Τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν την παραγωγή αγγειογενετικών παραγόντων με συνέπεια την αναστολή του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων και της ικανότητας τους σχηματισμού μικροσωληνίσκων (Τροποποίηση από Wang D, Gastroenterology 2005). Επισημαίνεται ότι η επαγωγή της PGE 2 από τον VEGF δυνατόν να αποτελεί μιαν εξήγηση για τις ανεπιθύμητες ενέργειες από το καρδιαγγειακό σύστημα από τη χρήση των εκλεκτικών αναστολέων COX-2, επειδή ο VEGF υπεισέρχεται στην ομοιόσταση του συστήματος αυτού. 8.2.1.Αγγειακοί αυξητικοί παράγοντες Στους παράγοντες με αγγειογενετική δράση περιλαμβάνονται ο VEGF, ο BFGF, ο μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας-α (Transforming Growth Factor-α, TGF-α) και ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας των ενδοθηλιακών κυττάρων (Platelet-derived Endothelial Cell Growth Factor, PD-ECGF). (166) Ο VEGF ανήκει στην οικογένεια των μορίων VEGF που περιλαμβάνει τους αυξητικούς παράγοντες VEGF-Α, VEGF-Β, VEGF-C, VEGF-D και PlGF (Placenta Growth Factor, πλακουντιακός αυξητικός παράγοντας) και τους 3 υποδοχείς VEGF-R1, VEGF-R2 και VEGF-R3. Οι παράγοντες VEGF-Α και VEGF-Β αποτελούν τους συνδέτες του VEGF-R1, οι VEGF-Α και VEGF-C του VEGF-R2 και οι VEGF-C και VEGF-D του υποδοχέα VEGF-R3. Και οι 3

58 υποδοχείς αποτελούν διαμεμβρανικούς υποδοχείς τυροσινικής κινάσης. Οι VEGF-R1 και VEGF-R2 εκφράζονται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων αγγείων, ενώ ο VEGF-R3 κυρίως στο ενδοθήλιο των λεμφαγγείων. (166) (Σχήμα 6) PlGF VEGFB VEGFA VEGFC VEGFD Ενδοθηλιακό κύτταρο Κυτταροπλασματική μεμβράνη VEGF-R1 VEGFR-2 VEGFR-3 Αγγειογένεση Λεμφαγγειογένεση Σχήμα 6. Σχηματικό διάγραμμα των υποδοχέων VEGF-R με τους συνδέτες τους και τις βιολογικές λειτουργίες τους (Τροποποίηση από Ellis LM, Semin Oncol 2004). Ο πλέον μελετημένος αγγειογενετικός παράγοντας είναι ο VEGF-Α, ο οποίος αποτελεί ομοδιμερές αποτελούμενο από δύο υπομονάδες 23 kda και συντίθεται από 6 ισομορφές: VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 183, VEGF 189 και VEGF 206. Από τους συμπαγείς όγκους παράγονται κυρίως οι ισομορφές VEGF 121 και VEGF 165, ενώ οι υπόλοιπες παράγονται σε μικρότερη αναλογία. Ο VEGF προκαλεί χαρακτηριστική αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων, η οποία είναι κατά 50000 φορές μεγαλύτερη από αυτήν της ισταμίνης. Η αυξημένη διαπερατότητα επιτρέπει την εναπόθεση ινικής στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, η οποία λειτουργεί ως σκελετός για τα ενδοθηλιακά κύτταρα που μεταναστεύουν. Η αγγειογενετική του δράση επιτελείται κυρίως μέσω του υποδοχέα VEGF-R2, ο οποίος ευθύνεται για τις περισσότερες λειτουργίες του VEGF που περιλαμβάνουν τη διαπερατότητα του αγγειακού ενδοθηλίου, τον πολλαπλασιασμό, την ικανότητα μετανάστευσης και την επιβίωση. (167) Παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα και από τα κύτταρα που διηθούν τον καρκινικό ιστό (ινοβλάστες, μονοπύρηνα/μακροφάγα). Η δράση του κατευθύνεται περισσότερο στα κύτταρα του αγγειακού ενδοθηλίου. Ειδικότερα στα ενδοθηλιακά κύτταρα του όγκου, ο υποδοχέας VEGF-R2 εκφράζεται σε πολύ υψηλότερα επίπεδα σε

59 σύγκριση με κύτταρα του ενδοθηλίου των φυσιολογικών ιστών. Η έκφραση του VEGF ρυθμίζεται από παράγοντες που περιλαμβάνουν την αναφερθείσα υποξία των ιστών, κυτταροκίνες (IL-1, IL-6), ενεργοποίηση ογκογονιδίων, απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων και αυξητικούς παράγοντες (TGF-β, EGF). (167) Η ιστική υποξία σχετίζεται με την ανάπτυξη του όγκου, την εμφάνιση μεταστάσεων και την ανθεκτικότητα στην ακτινοθεραπεία. (168,169) Σε σχετικές μελέτες έχει βρεθεί ότι η ιστική υποξία εκτός από την αύξηση της μεταγραφικής δραστηριότητας του VEGF, έχει ως αποτέλεσμα και την αυξημένη σταθερότητα του mrna του. (170,171) Εκτός από τη μιτογόνο δραστηριότητα στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και την επαγωγή της αγγειογένεσης, άλλη δράση του VEGF αποτελεί η αναστολή της απόπτωσης. Σχετικές μελέτες δείχνουν υψηλά επίπεδα έκφρασης του VEGF και της αντιαποπτωτικής Bcl-2, καθώς και των mrna τους σε ανθρώπεια ενδοθηλιακά κύτταρα, στα οποία προστέθηκε VEGF. (172) Επισημαίνεται ότι η συσχέτιση αυξημένων επιπέδων VEGF αίματος και πτωχής πρόγνωσης του καρκίνου δεν εξαρτάται μόνον από την VEGF-επαγόμενη αγγειογένεση, αλλά και από την VEGF-σχετιζόμενη ανοσοκαταστολή, καθώς ο VEGF προκαλεί αναστολή της ωρίμανσης των δενδριτικών κυττάρων και μείωση της αντινεοπλασματικής IL-12. (172) Εκτιμώντας την προγνωστική αξία του VEGF σε σποραδικές περιπτώσεις ΚΠΕ, παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έντασης της χρώσης για VEGF και παρουσίας μεταστάσεων. (174) Επίσης, παρατηρήθηκε συσχέτιση έκφρασης του VEGF και διήθησης αιμοφόρων αγγείων, λεμφαγγείων και περινευρικού χώρου σε ασθενείς με ΚΠΕ και αρνητικούς λεμφαδένες. (175) Η αυξημένη έκφραση του VEGF έχει συσχετισθεί και με τη θνησιμότητα από ΚΠΕ. (176) Επιπλέον, ο VEGF-D που σχετίζεται με τη δημιουργία λεμφαγγείων, βρέθηκε να αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα σε ότι αφορά στο διάστημα ελεύθερο νόσου και τη συνολική επιβίωση. (177) Ομοίως, ο VEGF-C έχει σχέση με την ανάπτυξη του λεμφαγγειακού συστήματος και η έκφρασή του σε περιπτώσεις ΚΠΕ φαίνεται ότι σχετίζεται σημαντικά με τη διαφοροποίηση του όγκου, το βάθος διήθησης, τη διήθηση λεμφαγγείων, τις λεμφαδενικές μεταστάσεις, τη διήθηση φλεβικών αγγείων και το στάδιο κατά Dukes. (178) Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι ο VEGF-C και η COX-2 συνεκφράζονται στον ΚΠΕ και σχετίζονται σημαντικά με λεμφαδενικές μεταστάσεις και κακή πρόγνωση των ασθενών. (179) Ο προσδιορισμός του VEGF γίνεται σε ιστολογικά παρασκευάσματα με ανοσοϊστοχημική χρώση και με μέτρηση των επιπέδων του στον ορό ή στο πλάσμα. Τα επίπεδα του VEGF στον ορό σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά του ΚΠΕ περισσότερο από ότι οι μετρήσεις στο πλάσμα. (180) Υψηλά επίπεδα VEGF πιθανόν να σχετίζονται με προχωρημένη νόσο, όπως προκύπτει από το στάδιο κατά Dukes, το βάθος διήθησης, τη διήθηση αγγείων και την ύπαρξη μεταστάσεων σε λεμφαδένες ή στο ήπαρ. (181) Η έρευνα της αξίας των προεγχειρητικών επιπέδων του VEGF

60 στον ορό ως καρκινικού δείκτη και η σχέση τους με το στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση, έδειξε ότι η διαφορά σε σύγκριση με τους μάρτυρες, παρουσίαζε αύξηση ανάλογα με το στάδιο της νόσου (στατιστικά σημαντική διαφορά σε όγκους Τ3 και Τ4, με διήθηση λεμφαδένων και μεταστάσεις). Σε ότι αφορά στην προγνωστική αξία, η ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν 90,7% και 61,0%, αντιστοίχως. (182) Εντούτοις, άλλες μελέτες έδειξαν ότι η προγνωστική αξία του VEGF στο ορό προεγχειρητικά, ήταν χαμηλής ευαισθησίας (36%), όμως σε συνδυασμό με τα επίπεδα του CEA η ευαισθησία ήταν αυξημένη (62%). (183) Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, η έρευνα για την ανάπτυξη νέων ουσιών για τη θεραπεία του ΚΠΕ, στράφηκαν προς την προσπάθεια παρεμβολής στη διαδικασία της νεοαγγειογένεσης, με αποτέλεσμα την δημιουργία του αντιαγγειογενετικού παράγοντα Bevacizumab. Ο παράγοντας χρησιμοποιείται, προς το παρόν, στη μεταστατική νόσο του ήπατος με τους περιορισμούς των παρενεργειών (κυρίως υπέρταση και αρτηριακά θρομβοεμβολικά επεισόδια), ενώ δοκιμάζεται και στην συμπληρωματική θεραπεία του ΚΠΕ. (184) 8.3. Αναστολή της απόπτωσης Ο ρόλος της απόπτωσης είναι κρίσιμος σε πολλές φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές διεργασίες και η παθολογική ρύθμισή της ενέχεται στην παθογένεση ποικίλων νοσημάτων συμπεριλαμβανομένων και των κακοήθων. Αντίθετα προς τη νέκρωση του κυττάρου, η απόπτωση είναι μια ελεγχόμενη διαδικασία που λαμβάνει χώρα σε μεμονωμένα κύτταρα, χωρίς να επηρεάζει την ακεραιότητα τους και χωρίς την ύπαρξη φλεγμονής. Μορφολογικά η απόπτωση χαρακτηρίζεται από ρίκνωση του κυττάρου με διατήρηση της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης, πύκνωση της χρωματίνης του πυρήνα, εξοίδηση του ενδοπλασματικού δικτύου, κατάτμηση του πυρήνα και τελική κατάτμηση του κυττάρου με σχηματισμό σωματιδίων που περιβάλλονται από κυτταρική μεμβράνη, των αποπτωτικών σωματιδίων. Η απόπτωση είναι διεργασία που απαιτεί κατανάλωση ενέργειας, με τη διέγερση μεταβολικών οδών, μεταγραφή γονιδίων και σύνθεση πρωτεϊνών. Αντιθέτως, η νέκρωση χαρακτηρίζεται από εξοίδηση του κυττάρου και τυχαία κατάτμηση του DNA. Μεταξύ των άλλων, πρωτεύουσας σημασίας λειτουργία της απόπτωσης θεωρείται ο περιορισμός των κυττάρων που έχουν υποστεί γενετική βλάβη από έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες. Με την απόπτωση εμποδίζεται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η δημιουργία παθολογικών κλώνων. (185) Η διεργασία της απόπτωσης ή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου είναι απαραίτητη για δύο λόγους: α) Για την εύρυθμη ανάπτυξη του οργανισμού, άποψη που ενισχύεται από περιπτώσεις, όπως η θανάτωση του υπερβολικού αριθμού των αναπτυσσομένων κυττάρων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, o θάνατος των ορμονοεξαρτώμενων κυττάρων

61 της μήτρας λόγω κυκλικής μείωσης των ειδικών ορμονών και η εξάλειψη του πλεονάσματος των κυττάρων κατά τη διεργασία σχηματισμού συνάψεων μεταξύ των νευρώνων του εγκεφάλου. (186,187) β) Για την καταστροφή κυττάρων που απειλούν την ακεραιότητα του οργανισμού, όπως κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιούς και κύτταρα του ανοσιακού συστήματος. Στην πρώτη περίπτωση τα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα (Cytotoxic T Lymphocytes, CTLs) θανατώνουν τα μολυσμένα από ιούς κύτταρα επάγοντας την απόπτωσή τους. Στη δεύτερη περίπτωση, όταν μειώνεται η κυτταρική ανοσιακή απόκριση και απαιτείται εξάλειψη των ενεργών κυττάρων για να μην προσβάλλουν συστατικά του οργανισμού, τα CTLs επάγουν την απόπτωση το ένα εναντίον του άλλου ή εναντίον των ιδίων. Ανεπάρκεια της αποπτωτικής αυτής διεργασίας οδηγεί σε ανάπτυξη αυτοανόσων νοσημάτων, όπως του ερυθηματώδους λύκου, ρευματοειδούς αρθρίτιδας ή φλεγμονώδους νόσου εντέρου (ελκώδης κολίτιδα). Επιπλέον, η παρατεινόμενη ανοσιακή απόκριση των δραστικών κυττάρων που εκδηλώνουν μειονεκτική απόπτωση σχετίζεται με χρόνια επιθηλιακή φλεγμονή, η οποία προκαλεί καρκινογένεση σε πολλούς ιστούς. Στην γαστρεντερική οδό, η χρόνια φλεγμονή σχετίζεται με καρκίνους οισοφάγου (οισοφαγίτιδα και οισοφάγος Barrett), στομάχου, λεπτού και παχέος εντέρου (φλεγμονώδης νόσος εντέρου και αδενοκαρκίνωμα). (13,186) Η αποπτωτική διεργασία καθαυτή εμπλέκεται στην ογκογένεση. Ορισμένοι ογκογόνοι ιοί οδηγούν στην καρκινογένεση χρησιμοποιώντας τρόπους που παρεμποδίζουν την απόπτωση των κυττάρων που έχουν υποστεί εξαλλαγή. Για παράδειγμα, από τους δύο ιούς ανθρωπίνων θηλωμάτων HPVs (Human Papilloma Viruses) που εμπλέκονται στην ανάπτυξη τραχηλικού καρκινώματος, ο ένας παράγει πρωτεΐνη (E6), η οποία συνδέεται και αδρανοποιεί τον επαγωγέα της απόπτωσης p53. Εξάλλου, τα νεοπλασματικά κύτταρα ενεργοποιούν δικούς τους τρόπους αποφυγής της απόπτωσης χωρίς τη συμμετοχή των ιών. Για παράδειγμα, μερικοί τύποι καρκινωμάτων, κυρίως πνεύμονα και παχέος εντέρου, εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες ενός διαλυτού μορίου, το οποίο δίκην δολώματος συνδέεται με τον Fas συνδέτη (Fas Ligand, FasL) του CTL, παρεμποδίζοντας τη σύνδεσή του με τον Fas υποδοχέα του νεοπλασματικού κυττάρου, με αποτέλεσμα τη μη πυροδότηση της αποπτωτικής διαδικασίας και την αδυναμία του CTL να θανατώσει το καρκινικό κύτταρο. Άλλα νεοπλασματικά κύτταρα εκφράζουν υψηλές στάθμες FasL που μπορούν να συνδεθούν με τους Fas υποδοχείς, οι οποίοι επίσης εκφράζονται στα CTLs, προκαλώντας θάνατο των CTLs στην προσπάθειά τους να θανατώσουν τα καρκινικά κύτταρα. (186,187) Η CTL-μεσολαβούσα απόπτωση των κυττάρων στόχων εξελίσσεται σε 5 στάδια. Κατά το πρώτο στάδιο αναγνωρίζεται το αντιγόνο του κυττάρου στόχου από το CTL, το οποίο και συνδέεται με αυτό χρησιμοποιώντας τον ειδικό αντιγονικό υποδοχέα του (Τ Cell receptor, TCR) και άλλα επικου-

62 ρικά μόρια, όπως CD8, CD2 και το σχετιζόμενο με τη λεμφοκυτταρική λειτουργία αντιγόνο-1 (Lymphocyte Function Associated-Antigen-1, LFA-1). Στην αναγνώριση του κυττάρου στόχου εμπλέκονται το τάξης Ι μόριο του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (Major Histocompatibitility Complex, MHC) (συνδέτης για CD8) συνδυαζόμενo σε ειδικό πεπτίδιο για ξένα αντιγόνα (το σύμπλεγμα εξυπηρετεί ως συνδέτης για τον TCR), LFA-3 (συνδέτης για CD2) και μόρια προσκόλλησης ICAM-1 ή ΙCAM-2 (Intracellular Adhesion Molecule, ενδοκυττάριο μόριο προσκόλλησης) (συνδέτες για LFA-1). Επισημαίνεται ότι CTL και κύτταρο στόχος συνδέονται παροδικά μέσω CD2- και LFA-1- μεσολαβουσών προσκολλήσεων χωρίς να προηγηθεί αναγνώριση του ειδικού αντιγόνου. (186,187) Στη συνέχεια ενεργοποιείται το CTL (δεύτερο στάδιο) και επέρχεται το θανατηφόρο χτύπημα (lethal hit) μέσω περφορίνης και γρανένζυμου Β (granzyme B) ή μέσω FasL-Fas συμπλέγματος (τρίτο στάδιο). Για τον σκοπό αυτό τα CTLs αναπτύσσουν δεσμευμένα σε μεμβράνες, ειδικά κυτταροπλασματικά κοκκία, τα οποία περιέχουν μακρομόρια, όπως την περφορίνη ή κυτταρολυσίνη (perforin ή cytolysin), πρωτεΐνη σχηματίζουσα πόρους-μεμβράνης, τα γρανένζυμα, τα οποία περιέχουν αντιδραστικές σερίνες (serines) στην ενεργό θέση τους και τις πρωτεογλυκάνες. Επιπλέον, τα CTLs μαζί με άλλα ενεργοποιημένα T-λεμφοκύτταρα εκδηλώνουν επιφανειακή έκφραση FasL ο οποίος ενεργοποιεί τη απόπτωση σε κύτταρα στόχους που εκφράζουν FasR (υποδοχέα για τον FasL). Επίσης, τα CTLs μαζί με άλλα εκτελεστικά T-λεμφοκύτταρα μεταγράφουν και εκκρίνουν κυτταροκίνες και άλλες πρωτεΐνες, κυρίως IFN-γ, TNF και σε μικρότερο βαθμό IL-2. (186,187) Κατά συνέπεια, το θανατηφόρο χτύπημα των ενεργοποιημένων TCLs επιτυγχάνεται μέσω 2 οδών: της εξαρτώμενης από εξωκυττάρωση κοκκίων (μέσω perforin/granzyme) και της μη εξαρτώμενης από εξωκυττάρωση των κοκκίων (μέσω FasL) θανατηφόρας οδού. Η επίτευξη του θανατηφόρου χτυπήματος περιλαμβάνει εξωκυττάρωση του περιεχομένου των κοκκίων προς στη μεμβράνη του κυττάρου-στόχου και πολυμερισμό της περφορίνης, η οποία ανευρισκόμενη ως μονομερές στα κοκκία, επί παρουσίας εξωκυτταρικών επιπέδων του ασβεστίου (τυπικά 1-2mM) σχηματίζει μεγάλο κανάλι (πλήρες ύδατος) κατά προτίμηση στην λιποειδική διπλοστιβάδα της πλασματοκυτταρικής μεμβράνης του κυττάρου-στόχου. Σε περίπτωση που σχηματισθεί επαρκής αριθμός καναλιών πολυμερισμένης περφορίνης, το κύτταρο στόχος αδυνατεί να εξάγει ιόντα και ύδωρ, με τελικό αποτέλεσμα την οσμωτική διόγκωση και λύση του. (186,187) Μια δεύτερη εξίσου σημαντική λειτουργία των καναλιών περφορίνης είναι η είσοδος των γρανενζύμων εντός του κυττάρου στόχου. Στο κύτταρο στόχο, το γρανένζυμο B αποδομεί κατά προτίμηση υποστρώματα πρωτεϊνών που έχουν υπόλοιπο ασπαρτικού οξέος, όπως το μετατρεπτικό ένζυμο της IL-1 (IL-1 Converting Enzyme, ICE) και τις σχετικές πρωτεάσες κυ-

63 στεΐνης (ΙCΕ-like proteases) που ενεργοποιούνται καταλυτικά. Έτσι το γρανένζυμο προκαλεί έναρξη ενός ΙCE καταρράκτη πρωτεασών, παρόμοιο με τον καταρράκτη που επάγεται μέσω σύνδεσης του FasL με τον επιφανειακό Fas υποδοχέα του κυττάρου στόχου. Απώτερος στόχος του περφορίνης/γρανένζυμου B και FasL-Fas-επαγόμενου καταρράκτη αποτελεί η ενεργοποίηση των κασπασών που οδηγεί σε αποπτωτικό θάνατο του κυττάρου-στόχου. (186,187) Η αποσύνδεση του CTL και η θανάτωση του κυττάρου-στόχος με απόπτωση ή οσμωτική λύση αποτελούν το τέταρτο και πέμπτο στάδιο, αντιστοίχως. (186,187) Ο εστιασμός της αποπτωτικής διεργασίας στα λεμφοκύτταρα (Ls) του ξενιστή δείχνει ότι κατά τα στάδια της λεμφοκυτταρικής ωρίμανσης και ενεργοποίησης, ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος ελέγχει το μέγεθος της δεξαμενής των λεμφοκυτάρων. Διακυμάνσεις στην έκφραση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL σχετίζονται αντιστρόφως ανάλογα με την ευαισθησία των λεμφοκυττάρων σε απόπτωση. Υπερέκφραση της Bcl-2 ή της Bcl-xL παρατείνει την επιβίωση των ανώριμων λεμφοκυττάρων και την αντιγονική απόκριση, ενώ το αντίθετο συμβαίνει στις περιπτώσεις μη έκφρασής τους. Υποστηρίζεται ότι ο μεγάλος χρόνος ζωής των μνημονικών λεμφοκυττάρων δυνατόν να οφείλεται σε ιδιοσυστατική έκφραση της Bcl-2 ή/και της Bcl-xL. (186,187) Σε τοπικό επίπεδο πεπτικής οδού, η ρύθμιση της απόπτωσης των T- λεμφοκυττάρων του χορίου του βλεννογόνου γίνεται μέσω ενεργών και παθητικών μηχανισμών. Οι ανοσοαποκρίσεις στον βλεννογόνο συχνά χαρακτηρίζονται από μεγάλη ανάπτυξη των ειδικών T-λεμφοκυττάρων, τα οποία έχουν δραστική εκτελεστική λειτουργία. Ενώ αυτό έχει μεγάλη σημασία για την άμυνα του ξενιστή, εντούτοις δυνατόν να οδηγεί και σε ανάπτυξη εκτελεστικών κυτταρικών πληθυσμών με σημαντική αυτοδραστικότητα και ικανότητα να προκαλούν βλεννογονική βλάβη, η οποία έχει απώτερη καρκινογόνο επίπτωση. Με βάση την τελευταία πιθανότητα, το ανοσιακό σύστημα του βλεννογόνου ρυθμίζει την απόπτωση: α) μέσω του ενεργώς επαγομένου κυτταρικού θανάτου (Activation-Induced Cell Death, AICD), σε αντίθεση με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (programmed cell death), σχετιζόμενου με διέγερση του TCR. Ο AICD επάγεται και ρυθμίζεται από μηχανισμούς ξεχωριστούς από τους αντίστοιχους που ελέγχουν τον Bcl-2-ρυθμιζόμενο προγραμματισμένο θάνατο και διαδραματίζει σπουδαίο ρόλο τόσο για τον θάνατο των λεμφοκυττάρων που αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνα όσο και για την επαγωγή ανοχής σε μερικά ξένα αντιγόνα. (186,187) β) μέσω παθητικού μηχανισμού συνδεόμενου με αποστέρηση λεμφοτοξινών (για παράδειγμα, με απόσυρση της IL-2). Ο ενεργός μηχανισμός εμπλέκει υποδοχείς θανάτου όπως Fas-υποδοχέα, TNF-υποδοχέα ή και τους συνδέτες τους, οι οποίοι δεν εμπλέκονται στους παθητικούς μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. (186,187)

64 Σε μοριακό επίπεδο, η διαταραχή της λειτουργίας αυτών των μορφών απόπτωσης στο βλεννογονικό ανοσιακό σύστημα προκαλεί φλεγμονή του βλεννογόνου με απώτερη καρκινογόνο επίπτωση. Κατά την διάρκεια της αποπτωτικής διεργασίας η τελική φάση (φάση θανάτωσης του κυττάρου) μπορεί να διακριθεί από την εναρκτήρια φάση. Στην τελική φάση, οι κασπάσες, μια οικογένεια πρωτεασών, αποσυνθέτουν το κύτταρο μέσω συνεχούς ενεργοποίησης και κατάτμησης (cleavage) των πρωτεϊνών-κλειδιά. Στην πλειονότητα των κυττάρων οι κασπάσες ανευρίσκονται στο κυτταρόπλασμα ως ανενεργά προένζυμα (ζυμογόνα), τα οποία μετά την ενεργοποίησή τους ασκούν πρωτεολυτική δράση, διακόπτοντας την πολυπεπτιδική αλυσίδα στην καρβοξυλική θέση μορίων ασπαρτικού οξέος (aspartate moieties). Επειδή οι κασπάσες καθαυτές ενεργοποιούνται με διάσπαση κλασμάτων ασπαρτικών μορίων (aspartate residues), είναι γενικώς αποδεκτό ότι ενεργοποιούνται από άλλες κασπάσες. Αυτή η ενεργοποίηση οδηγεί σε ένα καταρράκτη ανάλογο με τον καταρράκτη της πήξης του αίματος. (186,187) Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 14 κασπάσες θηλαστικών, οι οποίες εμπλέκονται στον κυτταρικό θάνατο, παρόλο που η λειτουργία τους παραμένει κατά το μεγαλύτερο μέρος άγνωστη. Οι κασπάσες -1, -4 και -5 συμμετέχουν στη διαδικασία ενεργοποιώντας κυτταροκίνες. Οι κασπάσες -2, -8 και -9 σηματοδοτούν την έναρξη του καταρράκτη της απόπτωσης και ονομάζονται εκκινητήριες (initiator), ενώ οι -3, -6 και -7 ασκώντας πρωτεολυτική δράση και ενεργοποιώντας τις απαραίτητες πρωτεΐνες για την ολοκλήρωση της αποπτωτικής διαδικασίας, ονομάζονται εκτελεστικές (effector). (188) Έχουν αναγνωρισθεί δύο κύριες οδοί ενεργοποίησης των εκτελεστικών αυτών κασπασών. Στην πρώτη εμπλέκονται οι παράγοντες και υποδοχείς θανάτου (εξωγενής, οδός υποδοχέων θανάτου) και στη δεύτερη συμμετέχουν τα μιτοχόνδρια, από τα οποία απελευθερώνονται πρωτεΐνες που ενεργοποιούν τις κασπάσες (ενδογενής, οδός μιτοχονδρίων). (13,186,187) Η κασπάση -8 αποτελεί την κορυφαία κασπάση της πρώτης οδού, ενώ η -9 λειτουργεί ως κορυφαία κασπάση στη δεύτερη οδό. Μια πρόσθετη οδό αποτελεί η αναφερθείσα μέσω CTLs, εξαρτώμενη από περφορίνη/γρανένζυμο καταστροφή του κυττάρου. 8.3.1. Εξωγενής οδός απόπτωσης Οι υποδοχείς θανάτου της πρώτης οδού ενεργοποίησης των κασπασών, αποτελούν μέλη της ΤNF-σχετιζόμενης οικογένειας. Έχουν περιγραφεί οκτώ υποδοχείς θανάτου, κοινό χαρακτηριστικό των οποίων είναι η ύπαρξη κυτταροπλασματικής περιοχής 80 αμινοξέων αποκαλούμενη περιοχή επαγωγής κυτταρικού θανάτου (Death Domain, DD). Ο ρόλος της περιοχής αυτής είναι σημαντικός στη μεταφορά του σήματος από την κυτ-

65 ταρική επιφάνεια στις ενδοκυττάριες οδούς μετάδοσης σήματος. Στους υποδοχείς θανάτου και στους αντίστοιχους συνδέτες που έχουν μελετηθεί περιλαμβάνονται οι FasL/FasR, TNF-L/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 και Apo2/DR5. Η αλληλουχία των γεγονότων που χαρακτηρίζει την εξωγενή οδό της απόπτωσης έχει περιγραφεί λεπτομερώς με βάση το μοντέλο FasL/FasR και TNF/TNFR-1. Η σύνδεση των συνδετών με τους αντίστοιχους υποδοχείς, προσελκύει πρωτεΐνες-προσαρμοστικά μόρια που συνδέονται με τους υποδοχείς. Με τη σύνδεση FasL/FasR και TNF/TNFR-1, τα προσαρμοστικά μόρια FADD (Fas-Associated Death Domain, Fas σχετιζόμενη περιοχή κυτταρικού θανάτου) και TRADD (TNFR-associated death domain, TNFR σχετιζόμενη περιοχή κυτταρικού θανάτου) συνδέονται αντιστοίχως, στη θέση των ενεργοποιημένων FasR και TNFR-1. Η σύνδεση TRADD με τον TNFR-1 προσελκύει και το προσαρμοστικό μόριο FADD. Η πρωτεΐνη FADD συνδεόμενη με την προκασπάση-8 σχηματίζει το σύμπλεγμα DISC (Death Induced Signaling Complex, σύμπλεγμα σηματοδότησης επαγωγής κυτταρικού θανάτου) με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της προκασπάσης-8. Η χαμηλού βαθμού ενδογενής δραστηριότητα πρωτεάσης που διατηρούν τα κοκκία της προκασπάσης, επιτρέπει υπό αυτές τις συνθήκες, την αμοιβαία ενεργοποίηση των μορίων του προενζύμου (αυτοπρωτεολυτική δράση) που στη συνέχεια οδηγεί στην ενεργοποίηση της κασπάσης-8 (FLICE), η οποία ακολούθως ενεργοποιεί την κασπάση-3 και το καθοδικό ρεύμα των εκτελεστικών κασπασών (downstream effector caspases). Η μέσω υποδοχέα θανάτου επαγόμενη απόπτωση δυνατόν να ανασταλεί με τη σύνδεση της πρωτεΐνης c-flip με το μόριο FADD ή με την προκασπάση-8. (186,187) Υπογραμμίζεται ότι το Ced-3 γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη σχετιζόμενη με το μετατρεπτικό ένζυμο της IL-1β (ICE, caspase-1) που ασκεί πρωτεολυτική δραστηριότητα στον ακολουθούντα καταρράκτη των κασπασών και αποτελεί το επίκεντρο της διαδικασίας της απόπτωσης. (186,187) (Σχήμα 7) 8.3.2. Ενδογενής οδός απόπτωσης Στην ενδογενή οδό απόπτωσης, η ενδογενής πρωτεολυτική δραστηριότητα της κορυφαίας κασπάσης-9 συμβάλλει ελάχιστα στην ενεργοποίησή της. Το κυτταρικό ερέθισμα πυροδοτεί την απελευθέρωση κυτοχρώματος c (Cyt c) από τα μιτοχόνδρια. Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος προκαλείται από μεταβολή της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και απώλεια του υφιστάμενου διαμεμβρανικού δυναμικού. Στη συνέχεια, το κυτόχρωμα c μαζί με τον παράγοντα ενεργοποίησης της απόπτωσης (Apoptosis-activating factor-1, Apaf-1) και την προκασπάση-9 δημιουργούν ένα σύμπλεγμα, το αποπτωσώμιο (apoptosome), το οποίο ενεργοποιεί την κασπάση-9. Η παρουσία datp προκαλεί προσαρμοστική μεταβολή της κασπάσης-9 καθιστώντας την ενεργή.

66 Από το σημείο αυτό οι οδοί συγκλίνουν, επειδή η κασπάση-9 ενεργοποιεί το αναφερόμενο καθοδικό ρεύμα των εκτελεστικών κασπασών. Επιπλέον δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι οδοί των υποδοχέων θανάτου και μιτοχονδρίων συνδέονται με την πρωτεΐνη Bid, η οποία διασπάται και ενεργοποιείται από την κασπάση-8 και οδηγεί σε απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια. Συγκεκριμένα από τη διάσπαση της Bid προκύπτει το ενεργό θραύσμα Bid (truncated Bid, tbid), το οποίο συνδέεται και αναστέλλει τη δράση της Bcl-2 στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, προκαλώντας έναρξη της μιτοχονδριακής θανατικής ακολουθίας. (186,187,189) (Σχήμα 7) Η διαπερατότητα της μεμβράνης των μιτοχονδρίων που επιτρέπει τη διέλευση του κυτοχρώματος c, εξαρτάται από το λόγο των αποπτωτικών προς τους αντιαποπτωτικούς μεσολαβητές. Τα αποπτωτικά μόρια Bax και ανταγωνιστής/φονέας Bcl-2 (Bcl-2 Αntagonist/Κiller, BAK) επιτρέπουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, είτε αυξάνοντας τη διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης, είτε συνδεόμενα με μόρια που έχουν αντιαποπτωτική δράση (Bcl-2, Bcl-xL, mcl-1), με συνέπεια την εξουδετέρωσή τους, είτε με συνδυασμό και των δύο μηχανισμών. (190) Σε φυσιολογικές συνθήκες, οι Bcl-2 και η Bcl-x L παρεμβάλλονται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και συμβάλλουν στην μιτοχονδριακή ακεραιότητα επιτρέποντας την έξοδο ιόντων Η + από το εσωτερικό των μιτοχονδρίων, πιθανόν μέσω της ικανότητάς τους να σχηματίζουν κανάλι ιόντων. Αντιθέτως, άλλες πρωτεΐνες αυτής της οικογένειας (Bid, Bad, Bak, Bax, Bim και Nοxa) συνδέονται με τις Bcl-2 και Bcl-x L και αναστέλλουν τη δράση τους. (186,187) Η διάσπαση της μεμβράνης των μιτοχονδρίων επιτρέπει την διαφυγή εκτός από το κυτόχρωμα c και του δεύτερου μιτοχονδριακού ενεργοποιητή κασπασών Smac (Second mitochondrial activator of caspases) ή DIABLO, ο οποίος αδρανοποιεί τον αναστολέα των πρωτεϊνών της απόπτωσης ΙΑΡ (Inhibitor of Apoptosis Proteins) και επιπλέον ενεργοποιεί το καθοδικό ρεύμα (downstream) των κασπασών. Η σύνθεση και η ενεργοποίηση των αναστολέων της απόπτωσης, ρυθμίζεται από τον πυρηνικό μεταγραφικό παράγοντα NFκΒ. Η έναρξη της απόπτωσης οδηγεί στην απελευθέρωση του NFκΒ, ο οποίος στον πυρήνα σηματοδοτεί την έναρξη της μεταγραφής των αναστολέων της απόπτωσης. (191)

67 Οδός υποδοχέων θανάτου (Ενδογενής) Οδός μιτοχονδρίων (Εξωγενής) TNF-L FAS-L Βλάβη DNA TNF-R1 FAS-R Bax cflip SMAC/D Bcl-2 TRADD FADD Κασπάση-8 Bid Κυτόχρωμα c ΑΤΡ DISC Κασπάση-9 Apaf-1 IAP Αποπτόσωμα Κασπάση -3, -6, -7 ΝFκΒ ΑΠΟΠΤΩΣΗ Κατακερματισμός Πρωτεόλυση Αποδόμηση λαμινίνης DNA κυτταροσκελετικών Ρίκνωση κυττάρου πρωτεϊνών Σχήμα 7. Μηχανισμοί απόπτωσης. Επαγωγή της εξωγενούς οδού (αριστερά) μέσω υποδοχέων της οικογένειας TNF έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία συμπλέγματος θανάτου και την ενεργοποίηση της κασπάσης-8, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί τον καθοδικό καταρράκτη κασπασών (-3, -6-7). Η ενδογενής οδός (δεξιά) επάγεται με την απελευθέρωση Cyt c από τα μιταχόνδρια. Αποπτωτικές πρωτεΐνες (Βax) επάγουν την απελευθέρωση Cyt c και αντιαποπτωτικές (Bcl-2) την αναστέλλουν. Το Cyt c συνδέεται και ενεργοποιεί τον παράγοντα Apaf-1, με επακόλουθο την ενεργοποίηση της κασπάσης-9, η οποία επίσης οδηγεί στον καταρράκτη των κασπασών. Συνεχής γραμμή: Επαγωγική δράση, Διακεκομμένη γραμμή: Ανασταλτική δράση (Τροποποίηση από Huerta S, Am J Surg 2006). Η ενεργός κασπάση-8, ανάλογα με τα επίπεδά της, δύναται να πυροδοτεί δύο οδούς μετάδοσης σήματος. Η πρώτη οδός της Fas-μεσολαβούσης απόπτωσης ενεργοποιείται από μικρά ποσά κασπάσης 8 και εμπλέκει την κατάτμηση (cleavage) του προαποπτωτικού Bid μορίου, ακολουθούμενου από απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια εντός του κυτταροπλάσματος και τελικά τον κυτταρικό θάνατο. Η δεύτερη οδός εμπλέκει μεγάλα ποσά κασπάσης-8, τα οποία παρακάμπτουν τα μιτοχόνδρια και ενεργοποιούν άλλες κασπάσες, όπως την κασπάση-3. Επισημαίνεται ότι η ενεργός κασπάση-8 προάγει την ενεργοποίηση των -3, -6 και -7 κασπασών (downstream caspases) και αυτές οι μικρότερες εκτελεστικές κασπάσες προκαλούν βλάβη των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού (fordin, gelsolin), κυτταρικών συστατικών (πυρηνικές λαμίνες) και καταβολισμό του αναστολέα της δεοξυριβονουκλεάσης ICAD (Ιnhibitor of Caspase-Activated DNAse), οδηγώντας τελικά στην έκλυση DNAse ενεργοποιούμενης από κασπάση (Caspase-Activated DNAse,

68 CAD) που καταβολίζει το DNA προκαλώντας θάνατο και φαγοκυττάρωση του κυττάρου. (186,187) 8.3.3. Οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών Η Bcl-2 οικογένεια αριθμεί 3 ομάδες. Η πρώτη περιλαμβάνει αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες, όπως Bcl-2 και Bcl-x L, οι οποίες χαρακτηρίζονται από 4 μικρές περιοχές ΒΗ (homology domains) και μια ΤΜ (carboxy-terminal hydrophobic transmembrane) τελική περιοχή, η οποία τοποθετεί τις πρωτεΐνες στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Η δεύτερη ομάδα περιλαμβάνει Bax και Bak πρωτεΐνες, οι οποίες ομοιάζουν με αυτές της πρώτης ομάδας εκτός από την απουσία της τελικής ΤΜ (ΒΗ4 domain). Η τρίτη ομάδα περιέχει ένα μεγάλο σύμπλεγμα προαποπτωτικών μορίων (Bid και Bik), τα οποία ομοιάζουν πολύ λίγο με τις δύο άλλες ομάδες και περιέχουν μόνο BH3 θέση (BH3 domain). Επειδή οι πρωτεΐνες Bcl-2 και η Bcl-xL αναστέλλουν μόνο τις αποπτωτικές δραστηριότητες των μιτοχονδρίων, μόνο η πρώτη (ενεργοποιoύμενη με μικρά ποσά κασπάσης-8) και όχι η δεύτερη (ενεργοποιούμενη με μεγάλα ποσά κασπάσης-8) οδός της ενεργού απόπτωσης αναστέλλεται από τις αντιαποπτωτικές αυτές πρωτεΐνες. (186,187) Επίσης, παθητικές μορφές απόπτωσης εμπλέκουν ενεργοποίηση των BID πρωτεϊνών, οι οποίες δρουν αποκλειστικά μέσω μιτοχονδριακών μηχανισμών. Κατά συνέπεια, η προκαλούμενη από απόσυρση λεμφοκίνης (lymphokine withdrawal) παθητική απόπτωση αναστέλλεται δραστικά από τις Bcl-2 και Bcl-xL. (186,187,189) Η ανάπτυξη των όγκων εξαρτάται από τη διαταραχή της φυσιολογικής ισορροπίας που υπάρχει μεταξύ του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης. Η παράταση της επιβίωσης των κυττάρων, ως αποτέλεσμα της αναστολής της απόπτωσης, επιτρέπει την αθροιστική δράση μεταλλαξιογόνων παραγόντων που διευκολύνουν την ανάπτυξη και πρόοδο του όγκου. Στο νεοπλασματικό ιστό σποραδικών περιπτώσεων αδενωμάτων και ΚΠΕ και στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου ασθενών με FAP, το ποσοστό των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση είναι ελαττωμένο. Η απόπτωση ελαττώνεται κατά τη σειρά αναφοράς, σε ιστοτεμάχια βλεννογόνου φυσιολογικού παχέος εντέρου, βλεννογόνου παχέος εντέρου ασθενών με FAP, με αδενώματα παχέος εντέρου ή με ΚΠΕ. Η ελάττωση αυτή είναι αντιστρόφως ανάλογη με την αύξηση της Bcl-2 στο πρώιμο καρκίνωμα σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο. (192) Η διαταραχή της διαδικασίας της απόπτωσης στον ΚΠΕ είναι εμφανής ακόμα και στο φυσιολογικό βλεννογόνο ασθενών με ιστορικό αδενωμάτων παχέος εντέρου. Πράγματι, σε ιστοτεμάχια βλεννογόνου παχέος εντέρου που ελήφθησαν κατά τον ενδοσκοπικό επανέλεγχο σε ασθενείς με ιστορικό αδενωμάτων, η απόπτωση ήταν ελαττωμένη σε σύγκριση με το βλεννογόνο ασθενών χωρίς ιστορικό αδενωμάτων παχέος εντέρου. (193) Σύμφωνα με τις υπάρχου-

69 σες ενδείξεις η απόπτωση ελαττώνεται καθώς τα φυσιολογικά κύτταρα μετατρέπονται σε καρκίνωμα. Η υπερέκφραση της COX-2 στο εντερικό επιθήλιο αρουραίων σχετίζεται με αυξημένη αντίσταση στην απόπτωση και με αυξημένη έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2. (194) Μελέτη σε καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων έδειξε ότι η PGE 2 αναστέλλει την απόπτωση, την οποία επάγουν τα ΜΣΑΦ και ο εκλεκτικός αναστολέας της COX-2, SC58125. Τα ευρήματα αυτά ενισχύουν την άποψη ότι η μέσω COX-2 παραγόμενη PGE2 μπορεί να ευθύνεται για την αντίσταση στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Οι μηχανισμοί, μέσω των οποίων η PGE2 ασκεί τη ρυθμιστική δράση της δεν είναι επακριβώς γνωστοί. Πιθανόν να παρεμβαίνει στη ρύθμιση της απόπτωσης προκαλώντας αύξηση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως της Bcl-2 ή των άλλων μελών της οικογένειας Bcl-2. (195) Άλλον πιθανό μηχανισμό αποτελεί η αύξηση του αντιαποπτωτικού παράγοντα NFκΒ. (196) Σε μελέτη του Li και συν. βρέθηκε ότι ο εκλεκτικός αναστολέας της COX-2 NS-398, επάγει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα ΚΠΕ, μέσω της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια και της αύξησης των επιπέδων της κασπάσης -9 και -3. (197) Ο Sun και συν. σε μελέτη με καρκινικά κύτταρα ΚΠΕ (HCT-15) βρήκαν ότι η υπερέκφραση της COX-2 σχετίζεται με την αναστολή της μιτοχονδριακής οδού της απόπτωσης, με συνοδό ελαττωμένη απελευθέρωση κυτοχρώματος c, ασθενή ενεργοποίηση της κασπάσης -9 και -3 και αυξημένα επίπεδα της Bcl-2. (198) Η υπερέκφραση της COX-2 σε καρκινικά κύτταρα HCT-15 καταστέλλει τη μέσω του συνδέτη του υποδοχέα θανάτου TRAIL, επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, η υπερέκφραση της COX-2 επηρεάζει αρνητικά την εξωγενή οδό της απόπτωσης και σχετίζεται με ασθενή ενεργοποίηση της κασπάσης -8, -3 και -9, καθώς και με αύξηση της Bcl-2. Αντιθέτως, η αναστολή της COX-2 με την προσθήκη ΜΣΑΦ (Sulindac Sulfide) αποκαθιστά την μέσω TRAIL απόπτωση. (199) Η πρωτεΐνη Βcl-2 αποτελεί το πρότυπο της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης. Έχει μελετηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του ΚΠΕ. Ανήκει στην αναφερθείσα οικογένεια Bcl-2, η οποία αριθμεί περισσότερα από 20 μέλη που ανάλογα με τη δράση τους κατατάσσονται σε αποπτωτικές και αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες. (200,201) (Πίνακας 6)

70 Πίνακας 6: Διαίρεση της οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών ανάλογα με τη αποπτωτική ή αντιαποπτωτική λειτουργία τους Αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες Υποκατηγορία Bcl-2 Bcl-2 Bcl-x L Α1 Bcl-w Mcl-1 NR-13 CED-9 Αποπτωτικές πρωτεΐνες Υποκατηγορία Bax Υποκατηγορία ΒΗ3 Bax Bid Bak Bim Bok Bad Noxa Puma Bik EGL-1 Η Bcl-2 φυσιολογικά εκφράζεται στο κάτω ήμισυ των εντερικών κρυπτών, όπου ανευρίσκονται τα αρχέγονα κύτταρα, τα οποία και προστατεύει από την απόπτωση. Η έκφραση αυτή προοδευτικά ελαττώνεται, καθώς τα κύτταρα διαφοροποιούνται και ανέρχονται στο άνω άκρο της κρύπτης, όπου ο μηχανισμός της απόπτωσης προκαλεί την προγραμματισμένη απόρριψή τους. Στην πλειοψηφία των αδενωμάτων του παχέος εντέρου ανευρίσκονται υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Βcl-2. Επειδή, στους μη νεοπλασματικούς πολύποδες η έκφρασή της είναι φυσιολογική, θεωρείται ότι η υπερέκφραση της Bcl-2 σχετίζεται με τη μετατροπή του υπερπλαστικού επιθηλίου σε αδενωματώδες. Στον ΚΠΕ παρατηρούνται υψηλότερα επίπεδα Bcl-2 σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο, αλλά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα αδενώματα. (188) Επίσης, παρατηρείται αντίστροφη σχέση μεταξύ της έκφρασης Bcl-2 και του δείκτη απόπτωσης στο νεοπλασματικό ιστό του παχέος εντέρου. (150,151) Η συχνότητα της απόπτωσης αυξάνεται ανάλογα με το στάδιο του ΚΠΕ κατά Dukes (Α<Β<C<D), ενώ η έκφραση της Bcl-2 ελαττώνεται. (202,203) Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκφραση της Bcl-2 αυξάνει στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του ΚΠΕ και ελαττώνεται ή εξαφανίζεται με την πρόοδο της εξεργασίας μετατροπής του αδενώματος σε καρκίνωμα. Εντούτοις, παρά την ελάττωση ή απουσία της Bcl-2, η απόπτωση εξακολουθεί να ελαττώνεται στα προχωρημένα στάδια του καρκίνου, ως συνέπεια των μεταλλάξεων στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53. Φαίνεται ότι κατά τα πρώιμα στάδια της καρκινογένεσης η απόπτωση ελαττώνεται λόγω αυξημένης έκφρασης Bcl-2, ενώ στα προχωρημένα στάδια ως αποτέλεσμα των μεταλλάξεων του p53. (190) Η υψηλή συχνότητα μεταλλάξεων σε προχωρημένα στάδια δυνατόν να αναστέλλει και την οδό απόπτωσης μέσω Fas. (204) (Σχήμα 8)

71 Απόπτωση Φυσιολογικός Υπερπλαστικό Αδένωμα Καρκίνωμα βλεννογόνος επιθήλιο Μετάλλαξη Υπερέκφραση Μετάλλαξη Μετάλλαξη APC COX-2 Kras p53 Bcl-2 Σχήμα 8. Ελάττωση της απόπτωσης κατά την πρόοδο της διεργασίας καρκινογένεσης. Καθώς αυξάνει η συγκέντρωση των μεταλλάξεων στα γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του p53, η έκφραση της Bcl-2 ελαττώνεται. Συνοπτικά, κατά τη διεργασία της ογκογένεσης, η παθολογική έκφραση της Βcl-2 εμφανίζεται νωρίτερα από την αντίστοιχη του p53. Στη συνέχεια, κατά την εξέλιξη του αδενώματος σε καρκίνο, η Bcl-2 εξαφανίζεται ενώ αυξάνει η έκφραση του p53. Εξάλλου, η Bcl-2 σχηματίζει συμπλέγματα με τη αποπτωτική πρωτεΐνη Bax και η επιβίωση του κυττάρου εξαρτάται από το λόγο Bcl-2/Bax. Μερικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι κυρίως οι μεταλλάξεις της Βax πρωτεΐνης συμβάλλουν στην πρόοδο του αδενώματος σε καρκίνο (σύνδρομο HNPCC) παρά οι μεταλλάξεις του p53. (13) Eνδιαφέρον παρουσιάζει και το εύρημα ότι οι ακρομεγαλικοί ασθενείς παρουσιάζουν συχνά νεοπλάσματα παχέος εντέρου ιδίως στο δεξιό τμήμα με συνοδό αυξημένη έκφραση της Βcl-2 και μειωμένη έκφραση της Bax στα αδενώματα και καρκίνους, γεγονότα που αντανακλούν πιθανή ογκογενή απώλεια του αποπτωτικού ελέγχου. (13) Όσον αφορά στην εκτίμηση της Bcl-2 ως προγνωστικού δείκτη του ΚΠΕ, τα ευρήματα σχετικών ερευνών είναι αντικρουόμενα. Υψηλά επίπεδα έκφρασης Bcl-2 έχουν σχετισθεί με καλύτερη πρόγνωση. (205,206,207,208) Αντιθέτως, άλλοι ερευνητές δεν βρήκαν καμία συσχέτιση. (209,210) Η έκφραση της πρωτεΐνης σχετίσθηκε και με πτωχή πρόγνωση. (211) Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν ότι, η έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-2 σε διαγνωστική βιοψία έχει προγνωστική αξία στα αδενοκαρκινώματα του άπω τμήματος του παχέος εντέρου και προτείνεται ως προγνωστικός δείκτης σε ασθενείς με ΚΠΕ σταδίου ΙΙ, για την επιλογή εκείνων που θα ωφεληθούν από τη συμπληρωματική θεραπεία. (212,213) Όσον αφορά στην υποτροπή του όγκου μετά από χειρουργική θεραπεία, σε συνάρτηση με τη διαφοροποίησή του, βρέθηκε θετική συσχέτιση της Bcl-2 έκφρασης και του ελεύθερου νόσου διαστήματος σε όγκους μέτριας διαφοροποίησης. (214) Ο Bhatavdecar και συν. βρήκαν χαμηλή έκ-

72 φραση Bcl-2 σε χαμηλής διαφοροποίησης όγκους. Φαίνεται ότι υφίσταται απώλεια της έκφρασης Bcl-2 στους χαμηλής διαφοροποίησης όγκους. (211) Η αντιαποπτωτική δράση της πρωτεΐνης Bcl-2 έρχεται σε αντίθεση με τα ευρήματα των μελετών που συσχετίζουν την έκφρασή της με ευνοϊκότερη πρόγνωση. Πιθανολογείται ότι εκτός από την αναστολή της απόπτωσης, η πρωτεΐνη Bcl-2 προκαλεί επιπλέον, επιβράδυνση της ανάπτυξης, επειδή έχει βρεθεί στο μόριό της περιοχή με αντιπολλαπλασιαστική λειτουργία. (215) Εξάλλου είναι γνωστό ότι η λειτουργία της απόπτωσης είναι αποτέλεσμα της αναφερθείσας σχέσης της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2 και της αποπτωτικής Bax. Ίσως η υψηλή έκφραση Bcl-2 να συνδυάζεται με αντίστοιχη έκφραση Bax. (216) Τέλος, η εκτίμηση των επιπέδων της Bcl-2 στον ορό ασθενών με ΚΠΕ, έδειξε ότι είναι αυτά είναι ανάλογα με το βαθμό έκφρασης της πρωτεΐνης στον ιστό και δυνατόν να χρησιμοποιηθούν ως προγνωστικός δείκτης. (217) 8.4. Αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Η υπερέκφραση της COX-2 και η συνακόλουθη παραγωγή της PGE 2 διεγείρουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η προσθήκη της PGE 2 σε καλλιέργεια κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και της κινητικότητας τους. (218) Φαίνεται ότι η COX-2 επηρεάζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό είτε άμεσα, είτε μέσω αυξητικών παραγόντων. Η έκφραση της COX-2 σε κύτταρα ΚΠΕ διεγείρει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της επαγωγής του υποδοχέα EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα), ενώ η PGE 2 βρέθηκε ότι διεγείρει τον πολλαπλασιασμό ηπατοκυττάρων μυών και κυττάρων κερατίνης ανθρώπου. (219,220,221) Επιπλέον, ο πυρηνικός παράγοντας NF-κΒ προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω αύξησης της έκφρασης COX-2, ασκώντας σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του ΚΠΕ. (222) Από την άλλη πλευρά, ο συνδυασμός μη εκλεκτικού ΜΣΑΦ και αναστολέα της τυροσινικής κινάσης EGFR είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση σχηματισμού πολυπόδων σε μύες APC Min. (223) Παρόμοιος συνδυασμός είχε ως αποτέλεσμα σημαντική ελάττωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης σε κύτταρα ΚΠΕ και καρκίνου μαστού ανθρώπου. (224) Σε αδενώματα μυών με ανεπάρκεια APC βρέθηκε αυξημένη δραστηριότητα EGFR στα κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου. (225) Τέλος, σε κύτταρα χολαγγειοκαρκινώματος η προσθήκη COX-2 ή PGE 2 ή ενός ανταγωνιστή του υποδοχέα Ε1 είχε επαγωγική δράση στη φωσφορυλίωση EGFR, με αποτέλεσμα την αύξηση του πολλαπλασιασμού και της διηθητικότητας των κυττάρων. (226)

73 8.5. Αύξηση της διηθητικότητας των κυττάρων Η υπερέκφραση της COX-2 σχετίζεται με αύξηση της διηθητικότητας των καρκινικών κυττάρων. Σε καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων με υπερέκφραση COX-2 μετά από γενετική τροποποίηση τους, παρατηρείται αυξημένη διηθητικότητα, η οποία ήταν αναστρέψιμη μετά θεραπεία με Sulindac. Η βιοχημική αλλαγή που σχετίζεται με τη φαινοτυπική αλλαγή, περιλαμβάνει ενεργοποίηση της αναφερθείσας μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 θεμέλιας ουσίας (ΜΜΡ-2) και αυξημένα επίπεδα RNA μεταλλοπρωτεϊνάσης μεμβρανικού τύπου. (227) Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες θεμέλιας ουσίας τονίστηκε ότι ευθύνονται για την ικανότητα διήθησης των κακοήθων όγκων, μέσω της αποδόμησης της βασικής μεμβράνης των κυττάρων και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, διευκολύνοντας τη μετακίνηση των καρκινικών κυττάρων. (229) Καθώς η μετανάστευση των κυττάρων αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την διηθητική ικανότητα και την εμφάνιση μεταστάσεων, η έρευνα έχει στραφεί προς την μελέτη της ρύθμισης της κινητικότητας των κυττάρων δια της μέσω COX-2 παραγόμενης PGE 2. Έτσι, σε καλλιέργεια κυττάρων ΚΠΕ έχει βρεθεί ότι η PGE2 προκαλεί επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης ενεργοποιώντας την οδό μετάδοσης του σήματος μέσω του παράγοντα EGFR. (229) Η χορήγηση Rofecoxib, εκλεκτικού αναστολέα της COX-2, προκαλεί αναστολή ανάπτυξης και ικανότητας διήθησης-μετάστασης του ΚΠΕ. (230) 8.6. Ρύθμιση της ανοσοκαταστολής Η καταστολή του ανοσιακού συστήματος παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση. Η καταστολή αυτή λαμβάνει χώρα σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο, με αποτέλεσμα την ανοσοαντοχή αρχικά στην περιοχή του όγκου και στη συνέχεια στο σύνολο του οργανισμού. (231) Συνοπτικά, η ανοσιακή απάντηση διακρίνεται σε δύο κατηγορίες, την κυτταρική και την χυμική. Η πρώτη σχετίζεται με την Th1 (Τ helper 1-cell, T-βοηθητικό κύτταρο) κυτταρική ανοσιακή απάντηση, η οποία επιτελείται μέσω των παραγομένων από τα CD4 + T-λεμφοκύτταρα κυτταροκινών που περιλαμβάνουν κυρίως IL-2, ιντερφερόνη (IFN)-γ και TNF-α. Αντιθέτως, η χυμική ανοσία συνδέεται με την Th2 (Τ helper 2-cell) κυτταρική ανοσιακή απάντηση, η οποία επιτελείται μέσω των παραγομένων από τα CD4 + T λεμφοκύτταρα κυτταροκινών που περιλαμβάνουν IL-4, IL-6 και IL-10. Στην περίπτωση ανάπτυξης καρκίνου, η επικράτηση της Th1 κυτταρικής ανοσιακής απάντησης δυνατόν να προκαλέσει καταστροφή των καρκινικών κυττάρων, μέσω της ενεργοποίησης των κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων, των κυττάρων φυσικών φονέων (Natural Killer cells, NKCs), μακροφάγων και μονοκυττάρων. Η επικράτηση της Th2 απάντησης επιφέρει το αντίθετο αποτέλεσμα. Στην περίπτωση του ΚΠΕ και στις περισσότερες περιπτώσεις

74 καρκίνων, παρατηρείται καταστολή της κυτταρικής ανοσιακής απάντησης εκφραζόμενης με ελάττωση του αριθμού των CD4 + και των Th1 κυτταροκινών, ενώ οι κυτταροκίνες οι επαγόμενες από τα Th2 T-λεμφοκύτταρα παραμένουν σε φυσιολογικά επίπεδα ή αυξάνουν. Η επικράτηση της Th2 σε βάρος της Th1 ανοσιακής απάντησης γίνεται εντονότερη στα πιο προχωρημένα στάδια του καρκίνου. (232) Το φλεγμονώδες υπόστρωμα, το οποίο αποτελεί συνήθως τη βάση ανάπτυξης του ΚΠΕ, πιθανόν να ευθύνεται για την παρατηρούμενη διαταραχή στην ανοσιακή απάντηση. Σε περιβάλλον χρόνιας φλεγμονής παρατηρείται ανοσιακή απάντηση σχετιζόμενη με την επούλωση τραύματος, η οποία όπως και στην περίπτωση της κακοήθειας, χαρακτηρίζεται από καταστολή της κυτταρικής ανοσιακής απάντησης με σύγχρονη επικράτηση της χυμικής ανοσιακής απάντησης και την παραγωγή αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων. (233) Εντούτοις, ο ακριβής μηχανισμός, με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα διαφεύγουν από την ανοσοεπιτήρηση δεν είναι επακριβώς γνωστός. Η μέσω COX-2 παραγόμενη PGE2 προκαλεί αναστολή της διαφοροποίησης και της λειτουργικότητας των αντιγονοπαρουσιαστικών δενδριτικών κυττάρων, τα οποία είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση της ανοσιακής απάντησης έναντι του καρκίνου. (234) Άλλες μελέτες δείχνουν παρουσία αυξημένων επιπέδων IL-1 και TNF-α σε κύτταρα ΚΠΕ συγκριτικά με τον παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο, εύρημα ενδεικτικό ενεργοποίησης της μη ειδικής ανοσιακής απάντησης. Επιπλέον εύρημα αποτελεί η σημαντική ελάττωση των επιπέδων IL-2mRNA. (235). Επισημαίνεται ότι η IL-2 ελέγχει την αύξηση και ενεργοποίηση των T-λεμφοκυττάρων έναντι του καρκίνου. Εξάλλου, η μέσω COX-2 επαγόμενη PGE 2 φαίνεται ότι καταστέλλει τη δράση των ΝΚCs και των μακροφάγων που στρέφονται κατά του καρκίνου. Τονίζεται, επίσης, ότι η PGE 2, καταστέλλει την παραγωγή κυτταροκινών από τα Th1 λεμφοκύτταρα, όπως IL-2, IFN-γ, επηρεάζοντας δυσμενώς τους μηχανισμούς ειδικής ανοσιακής απάντησης. (236) Σε καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων με αυξημένα επίπεδα COX-2mRNA και αναμενόμενη αυξημένη παραγωγή PGE 2, παρατηρείται καταστολή του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων ως απάντηση στην επίδραση μιτογόνου παράγοντα, η οποία μετά την προσθήκη εκλεκτικού αναστολέα της COX-2 αναστρέφεται. (237) Εξάλλου η PGE 2 συμβάλλει στην αύξηση της παραγωγής των Th2 κυτταροκινών, όπως IL-4, IL-6, καθώς και IL-10, με συνοδό ανοσοκατασταλτική δράση. (238) Τέλος, πρόσφατα βρέθηκε ότι η PGE 2 ασκεί επαγωγική δράση σε μια πρωτεΐνη ρυθμιστική του συμπληρώματος, ένδειξη της συμμετοχής των προσταγλανδινών στη ρύθμιση στοιχείων της αντίδρασης συμπληρώματος. (239) (Σχήμα 9) Συνοπτικά, η επικράτηση της Th2 ανοσιακής απάντησης σε βάρος της Th1 στον καρκινικό ιστό, έχει ως συνέπεια την αναστολή της κυτταρικής ανοσιακής απάντησης και πρόοδο του καρκίνου. H αρνητική επί-

75 δραση της PGE 2 στην ανοσιακή επιτήρηση έχει ως αποτέλεσμα την πιθανή διαφυγή των καρκινικών κυττάρων από τη δράση του ανοσιακού συστήματος. ΜΣΑΦ PGE 2 COX-2 Πυρήνας AA PGE 2 ΕΡ1-4 T- κύτταρα Επιθηλιακό κύτταρο Τh1 κυτταροκίνες (TNF-α, IFN-γ,IL12) Τh2 κυτταροκίνες (Il-4, IL-6, I:-10) Καταστολή DC, NK Ανοσοκαταστολή Σχήμα 9. Η μέσω της COX-2 επαγόμενη PGE2 προκαλεί καταστολή της κυτταρικής ανοσιακής απάντησης. Η δραστηριότητα των δενδριτικών κυττάρων και των κυττάρων φυσικών φονέων είναι ελαττωμένη με αποτέλεσμα την επικράτηση της Th2 ανοσιακής απάντησης. DC: Δενδριτικά κύτταρα, ΝΚ: κύτταρα φυσικοί φονείς (Τροποποίηση από Wang D, Gastroenterology 2005). 8.7. Παράγοντας νέκρωσης του όγκου TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) Ο αναφερθείς TNF-α συμμετέχει σε διάφορες λειτουργίες, όπως της απόπτωσης, της φλεγμονής και της ανοσιακής απάντησης. Η δράση του ασκείται μέσω των δύο υποδοχέων TNFR-1 και TNFR-2. Παράγεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα, T-λεμφοκύτταρα, NKCs και σε μικρότερο βαθμό από ινοβλάστες, κύτταρα λείων μυϊκών ινών και καρκινικά κύτταρα. Ενώ ο TNF-α παρουσιάζει μεγαλύτερη εκλεκτικότητα προς τον TNFR-2, οι περισσότερες λειτουργίες του καθορίζονται από τη σύνδεσή του με τον TNFR-1, ο οποίος βρίσκεται στα περισσότερα κύτταρα, ενώ ο TNFR-2 εντοπίζεται κυρίως στα κύτταρα του ανοσιακού συστήματος. (240) Τονίζεται ότι στον TNFR-1 βρίσκεται η περιοχή επαγωγής κυτταρικού θανάτου DD, μέσω της οποίας καθίσταται δυνατή η επαγωγή της απόπτωσης δια του TNF-α. (241) Εκτός από την επαγωγή της απόπτωσης, ο TNFR-1 μετέχει και στη μεταφορά στον πυρήνα σήματος που ρυθμίζει την επιβίωση του κυττάρου, αναστέλλοντας την απόπτωση, μέσω ενεργοποίησης του αντιαποπτωτικού παράγοντα NF-κB. (242) Μέσω αυτής της ενεργοποίησης, ο TNF-α δρα επαγωγικά στην έκφραση διαφόρων γονιδίων, όπως της COX-2 και του VEGF που συμβάλλουν στη διήθηση και μεταστατική ικανότητα του όγκου.

76 Σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα ορθού βρέθηκαν αυξημένα επίπεδα των προφλεγμονωδών κυτταροκινών TNF-α και IL-8 στον ορό, σε σχέση με τους μάρτυρες και αυξημένη έκφραση της COX-2 και του NF-κB στο νεοπλασματικό ιστό σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο. (243) Η προσθήκη εκλεκτικού αναστολέα της COX-2 (Celecoxib) προκάλεσε σημαντική ελάττωση των επιπέδων των κυτταροκινών στον ορό και την ενεργοποίηση του NF-κB στον καρκινικό ιστό. Σε μύες που ανέπτυξαν ΚΠΕ μετά από χορήγηση ΑΟΜ, βρέθηκαν χαμηλά επίπεδα του cpla 2mRNA και ελάττωση της δραστηριότητας αυτής της φωσφολιπάσης, παρά την αυξημένη έκφραση της COX-2 και της PGE2. Όμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν και σε προνεοπλασματικές βλάβες ACF και σε ΚΠΕ ανθρώπου. Σημαντική αύξηση του TNF-α βρέθηκε στους καρκίνους μετά χορήγηση ΑΟΜ. Αντιθέτως, η χορήγηση ειδικού αναστολέα της cpla 2 είχε ως αποτέλεσμα την προστασία των κυττάρων του παχέος εντέρου από την απόπτωση, παρέχοντας ενδείξεις ότι η καταστολή της cpla2 δυνατόν να ελαττώνει τη μέσω TNF-α προκαλούμενη απόπτωση κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, συμβάλλοντας στην πρόοδο του όγκου. (244) 8.8. Η οδός EGFR Ο αυξητικός επιδερμικός παράγοντας (Epidermal Growth Factor, EGF) αποτελεί το πρότυπο της ακόλουθης οικογένειας πολυπεπτιδίων, τα οποία παρουσιάζουν παρόμοια αλληλουχία, εκλεκτικότητα προς τον ίδιο υποδοχέα και παρόμοιο εύρος βιολογικής δραστηριότητας: μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας-α (TGF-α), αμφιρεγκουλίνη (amphiregulin, AR), αυξητικός παράγοντας ομόλογος επιδερμικού αυξητικού παράγοντα συνδέοντος την ηπαρίνη (Heparin Binding Epidermal Growth Factor-like Growth Factor, HB-EGF), βητασελουλίνη (Betacellulin, BTC) και επιρεγκουλίνη (Epiregulin). Για τη δράση των αυξητικών παραγόντων στις λειτουργίες του κυττάρου είναι απαραίτητη η ένωση του συνδέτη με τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα, ακολουθούμενη από τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη και τέλος η έναρξη της ενδοκυττάριας μετάδοσης σήματος που ενεργοποιεί πρωτεΐνες ρυθμίζουσες λειτουργίες, όπως κινητικότητα και ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων, αλλά και λειτουργίες που συμμετέχουν στην καρκινογένεση ή επιδρούν σε γονίδια στόχους εντός του πυρήνα. (245) Στον άνθρωπο, η ομάδα των υποδοχέων EGFR, απαρτίζεται από τέσσερις διαφορετικές πρωτεΐνες που αποτελούν μεμβρανικούς υποδοχείς τυροσινικής κινάσης με ένα εξωκυττάριο τμήμα σύνδεσης, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και ένα εσωτερικό τμήμα στο κυτταρόπλασμα. Τα τέσσερα μέλη της ομάδας, τα οποία κωδικοποιούνται από το προογκογονίδιο c-erb-b, είναι ο EGFR (HER1), o HER2/neu (c-rbb-2), ο HER3 (c-rbb-3) και ο HER4 (c-rbb-2).

77 Ενώ για τους υποδοχείς HER1, HER3 και HER4 έχουν προσδιορισθεί διάφοροι συνδέτες, για τον HER2 δεν έχει ταυτοποιηθεί συνδέτης. Παρά το γεγονός αυτό, ο HER2 σχηματίζει συμπλέγματα με τους άλλους τρεις υποδοχείς και τους συνδέτες τους, με αποτέλεσμα τη μεταφορά σημάτων από τον εξωκυττάριο χώρο προς τον πυρήνα του κυττάρου, συμμετέχοντας στον έλεγχο της ανάπτυξης και της διαίρεσης του κυττάρου. Στην περίπτωση του ΚΠΕ παρατηρείται διαταραχή στη λειτουργία διαφόρων οδών μετάδοσης σήματος μέσω EGFR, όπως της σχετιζόμενης με την προσκόλληση των κυττάρων και της ενεργοποίησης του συμπλέγματος β-catenin/t-cell factor 4 (TCF4), το οποίο ενεργοποιεί μια σειρά γονιδίων στον πυρήνα του κυττάρου επηρεάζοντας την πρόοδο του όγκου. Επίσης, οι μέσω EGFR οδοί μετάδοσης σχετίζονται με μόρια που είναι απαραίτητα στην αγγειογένεση, όπως ο VEGF και ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντας-1α (Ηypoxia Ιnducible Factor-1α, HIF-1α). Η ενεργοποίηση του EGFR σχετίζεται με τη μεταγραφική δραστηριότητα της COX-2. (246) Η COX-2 και ο υποδοχέας EGFR ενεργοποιούνται στον ΚΠΕ, όπως και στους περισσότερους καρκίνους. Η υπερέκφραση της COX-2 στα κύτταρα ΚΠΕ διεγείρει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μέσω της επαγωγής του EGFR, υποδηλώνοντας την πιθανή παρεμβολή των δύο αυτών οδών. Υψηλή έκφραση του EGFR έχει βρεθεί στον προχωρημένο ΚΠΕ. (247) Επίσης, σε καλλιέργειες κυττάρων ΚΠΕ, η προσθήκη PGE 2 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα του παράγοντα ανάπτυξης ηπατοκυττάρων (c-met-r) που σχετίζεται με τη διηθητική ικανότητα του όγκου. Η απενεργοποίηση του EGFR με προσθήκη ειδικού αναστολέα, είχε ως αποτέλεσμα την σχεδόν πλήρη αναστολή της φωσφορυλίωσης του c-met-r, υποδηλώνοντας την πιθανή λειτουργική σχέση μεταξύ της COX-2 και του EGFR. (248) Τέλος, ο συνδυασμός ΜΣΑΦ με αναστολέα της τυροσινικής κινάσης ErbB σε μύες APC Min/+, έδειξε συνεργική δράση των δύο ουσιών, με αποτέλεσμα την πλήρη προφύλαξη των πειραματόζωων από την εμφάνιση νέων πολυπόδων σε ποσοστό 50%. (249) Σε καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων η συνδυασμένη θεραπεία με αναστολείς COX-2 και HER-2/neu είχε επίσης, ως αποτέλεσμα την αποτελεσματικότερη ελάττωση της ανάπτυξης του καρκίνου σε σύγκριση με τη χορήγηση των δύο παραγόντων μεμονωμένα. (250) 8.9. Μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας TGF-β (Transforming Growth Factor-β) Ανήκει σε οικογένεια πολυπεπτιδίων που αποτελούν αυξητικούς παράγοντες, οι οποίοι ρυθμίζουν μια σύνθετη σειρά λειτουργιών του κυττά-

78 ρου που περιλαμβάνει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την κινητικότητα, την ικανότητα προσκόλλησης και τον κυτταρικό θάνατο. Ο ρόλος του TGF-β στο φυσιολογικό επιθήλιο έγκειται κυρίως στην αναστολή της ανάπτυξης και η δράση του είναι ογκοκατασταλτική. Εντούτοις, κατά τη διαδικασία της μετατροπής του φυσιολογικού επιθηλίου σε νεοπλασματικό, παρατηρείται απώλεια της απόκρισης των κυττάρων στη φυσιολογική αυτή ανασταλτική δράση του TGF-β, ο οποίος και δρα πλέον ως ογκογονίδιο. Σε επιθηλιακούς όγκους έχει βρεθεί αυξημένη έκφραση του TGF-β, ο οποίος παρουσιάζει αυτοκρινή δράση στα νεοπλασματικά κύτταρα και ετεροκρινή στα κύτταρα της θεμέλιας ουσίας. Με την ενεργοποίηση μεσεγχυματικών κυττάρων, ο TGF-β διεγείρει τη διηθητικότητα των κυττάρων και την εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. (251) Η απώλεια αυτή της απόκρισης των κυττάρων στην ανασταλτική δράση του TGF-β έχει αναφερθεί σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, όπως του παχέος εντέρου, του παγκρέατος και του μαστού. (252) Τρεις υπότυποι του παράγοντα TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3) αποτελούν μέλη μιας ευρύτερης οικογένειας συνδετών που σηματοδοτούν την έναρξη μετάδοσης του σήματος, ενεργοποιώντας ετερομερή συμπλέγματα διαμεμβρανικών υποδοχέων με ενδογενή κυτταροπλασματική περιοχή κινάσης σερίνης-θρεονίνης. Οι συνδέτες TGF-β αρχικά συνδέονται με υποδοχέα τύπου ΙΙ (TβRII) και στη συνέχεια, με τη φωσφορυλίωση των τμημάτων σερίνης και θρεονίνης, ενεργοποιείται ο υποδοχέας τύπου Ι (TβRI/ALK5), ο οποίος προωθεί το σήμα σε ενδοκυττάριους μεσολαβητές. (253) Οι μεσολαβητές, μέσω των οποίων μεταφέρεται το σήμα, ανήκουν στην οικογένεια των πρωτεϊνών Smad και διακρίνονται σε τρεις υποκατηγορίες: τις μέσω υποδοχέα ενεργοποιούμενες R-Smad (Receptoractivated Smad) Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 και Smad8, τον κοινό μεσολαβητή Co-Smad (Common mediator Smad) Smad4 και τις ανασταλτικές I-Smad (Inhibitory Smad) Smad6 και Smad7. (254) Μέσω του TGF-β ενεργοποιούνται οι πρωτεΐνες Smad2 και Smad3, οι οποίες μετά τη φωσφορυλίωσή τους από τον υποδοχέα TβRI, συνδέονται με ετερομερές σύμπλεγμα με τον κοινό μεσολαβητή Smad4 και μεταφέρονται στον πυρήνα, όπου ενεργοποιούν τη μεταγραφή ειδικών γονιδίων στόχων. Η μεταφορά του συμπλέγματος στον πυρήνα επάγει τη δράση των αναστολέων των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor, CDKI), όπως των p15 και p21, με αποτέλεσμα την διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1. Οι ανασταλτικές πρωτεΐνες Smad6 και Smad7 ανταγωνίζονται την πρόσβαση των R-Smad στον αντίστοιχο υποδοχέα και τη φωσφορυλίωσή τους. (254) Παρά το σημαντικό ρόλο της οικογένειας Smad στη μέσω TGF-β οδό μετάδοσης του σήματος, υπάρχουν ενδείξεις παρουσίας και άλλης

79 οδού ανεξάρτητης από τον κοινό μεσολαβητή Smad4. Υπάρχουν αναφορές, με βάση τις οποίες ο TGF-β ενεργοποιεί πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιούμενες μέσω μιτογόνου (Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK) και τις c-jun αμινοτελικές κινάσες (c-jun N-terminal kinases, JNK) με αποτέλεσμα τη φωσφορυλίωση των Smad3 και την μέσω αυτών μετάδοση του σήματος. Η οδός αυτή φαίνεται να ευθύνεται για την επαγόμενη από τον TGF-β μετατροπή του επιθηλιακού φαινότυπου των κυττάρων σε μεσεγχυματικό. (255) Η φωσφορυλίωση της Smad3 στο καρβοξυ-τελικό άκρο της (psmad3c) έχει ως αποτέλεσμα, την μέσω της TβRI οδού μετάδοσης σήματος, αναστολή της ανάπτυξης των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων. Η φωσφορυλίωση της Smad στο συνδεδεμένο (linker) άκρο της (psmad3l) ενεργοποιεί την οδό JNK/pSmad3L με αποτέλεσμα τη επαγωγή της διηθητικότητας των ενεργοποιημένων μεσεγχυματικών κυττάρων. Η ύπαρξη της psmad3c στον πυρήνα του φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου ενισχύει την άποψη ότι η οδός TβRI/pSmad3C δρά ανασταλτικά στην ανάπτυξη. Αντιθέτως, η psmad3l δεν ανιχνεύεται στα διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα. Στα νεοπλασματικά κύτταρα του διηθητικού αδενοκαρκινώματος η φωσφορυλίωση του καρβοξυλικού άκρου της Smad3 λαμβάνει χώρα σε ελάχιστο βαθμό, με αποτέλεσμα την εξασθένηση της οδού TβRI/pSmad3C, ενώ η psmad3l ανιχνεύεται σε υψηλά επίπεδα στους σχηματιζόμενους παθολογικούς αδένες του όγκου. Κατά την εξέλιξη της διαδικασίας της καρκινογένεσης η επικράτηση της οδού JNK/pSmad3L σε βάρος της TβRI/pSmad3C αποτελεί σημαντικό μηχανισμό διαφυγής των κυττάρων από την ογκοκατασταλτική δράση του TGF-β και της επαγωγής της διηθητικής ικανότητάς τους. (256) Ο TGF-β που παράγεται από τα νεοπλασματικά κύτταρα θεωρείται υπεύθυνος για την προαγωγή της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετατροπής, δηλ. της μετάβασης των κυττάρων από τον επιθηλιακό φαινότυπο στο μεσεγχυματικό (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT), φαινόμενο το οποίο απαντάται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και επιτρέπει στα κύτταρα να διαφεύγουν από την αυστηρή δομή του ιστού, από τον οποίο προέρχονται και να αποκτούν ένα φαινότυπο που διευκολύνει την μετανάστευση και την κινητικότητά τους. Κατά τη διαδικασία αυτή, τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν την ικανότητα προσκόλλησης μεταξύ τους και την πολικότητά, αποκτώντας συγχρόνως φαινότυπο μεσεγχυματικού κυττάρου. Το φαινόμενο αυτό, κατά τη διαδικασία της καρκινογένεσης, ευθύνεται για την ανάπτυξη του όγκου και ειδικότερα για τη διηθητική ικανότητα του και την εμφάνιση μεταστάσεων, επιτρέποντας στα νεοπλασματικά κύτταρα να επάγουν έναν περισσότερο επιθετικό φαινότυπο. (257) Τα ευρήματα αυτά προκύπτουν από τη μελέτη κυτταρικών προτύπων in vivo, επειδή είναι αδύνατο να παρατηρηθούν στις συνήθεις παθολογοανατομικές εξετάσεις, πιθανόν εξαι-

80 τίας της παροδικότητας της διαδικασίας αυτής και της εντοπισμένης εμφάνισής της. Η απενεργοποίηση της αναφερθείσας επιθηλιακής καντερίνης (Epithelial-cadherin, E-cadherin) αποτελεί πρώιμο γεγονός στη διαδικασία της EMT. Για την επέκταση της ΕΜΤ απαιτούνται αλλαγές και σε άλλα μόρια προσκόλλησης. Η αυξημένη έκφραση της ιντεγκρίνης αvβ6 (integrin αvβ6) σχετίζεται με τη λειτουργία των μεσεγχυματικών κυττάρων και τη διαδικασία ΕΜΤ. Σε μελέτες in vivo βρέθηκε ότι η αvβ6 ενεργοποιεί τον παράγοντα TGF-β, ο οποίος επάγει τη διαδικασία ΕΜΤ. (257) Ένας από τους μηχανισμούς, μέσω των οποίων τα καρκινικά κύτταρα καθίστανται ανθεκτικά στην ογκοκατασταλτική δράση του TGF-β, είναι η μετάλλαξη του υποδοχέα τύπου ΙΙ (TβRII). Η ελαττωμένη έκφραση ή η απενεργοποίησή του TβRIΙ λόγω μεταλλάξεων, αποτελεί το εναρκτήριο βήμα στη διαδικασία μετατροπής του φυσιολογικού επιθηλίου σε νεοπλασματικό ιστό. (252) Μεταλλάξεις που οδηγούν στην απενεργοποίηση της πρωτεΐνης Smad4 ανευρίσκονται στο 16-25% των περιπτώσεων ΚΠΕ, ενώ αλλαγές στη Smad2 απαντούν στο 6%. (258,259) Μεταλλάξεις του TβRII έχουν βρεθεί σε ποσοστό περίπου 90% των ΚΠΕ που παρουσιάζουν μικροδορυφορική αστάθεια και στο 30% του συνόλου των ΚΠΕ. (260) Από πρόσφατες πειραματικές μελέτες συμπεραίνεται ότι η απενεργοποίηση του TβRII δυνατόν να συμβάλλει στη δημιουργία ΚΠΕ στον άνθρωπο και η συμμετοχή αυτή αφορά στη διαδικασία μετατροπής του εντερικού νεοπλάσματος σε διηθητικό αδενοκαρκίνωμα. (261) Σε καλλιέργειες κυττάρων μυός βρέθηκε αυξημένη έκφραση COX-2 και TGF-β1, και μειωμένα επίπεδα TβRII. (262) Ο TGF-β αυξάνει συνεργικά την COX-2, μέσω σημαντικής αύξησης της σταθερότητας του COX-2mRNA. (263) Επισημαίνεται ότι η υψηλή έκφραση TGF-β στον ΚΠΕ σχετίζεται με προχωρημένο στάδιο του όγκου και αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα υποτροπής και μικρότερης επιβίωσης. (264) Σε καρκινικό ιστό ασθενών με ΚΠΕ έχει βρεθεί υψηλότερη έκφραση της πρωτεΐνης TGF-β σε όγκους Τ3-Τ4 με σύγχρονη ύπαρξη μεταστάσεων, ενώ η έκφραση TβRII ήταν χαμηλότερη. (265) Πρόσφατα, παρατηρήθηκε και συσχέτιση της έκφρασης του TGF-β με την επιθετικότητα όγκων σταδίου Τ1. (266) Όσον αφορά στα επίπεδα του TGF-β στον ορό ή στο πλάσμα, η συγκέντρωση του παράγοντα TGF-β1 στο πλάσμα ασθενών με ΚΠΕ ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες, η αύξηση των επιπέδων ήταν ανάλογη του σταδίου της νόσου και παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των προεγχειρητικών και των μετεγχειρητικών επιπέδων. (267) Επίσης o TGF-β1 έχει σχετιστεί με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης μεταστάσεων. (268) Τέλος, τα επίπεδα του TGF-β1 στον ορό ασθενών με ΚΠΕ σχετίζο-

81 νται με την πρόοδο της νόσου, υποδηλώνοντας την πιθανότητα χρησιμοποίησής του ως προγνωστικού δείκτη. (269) 8.10. Η οδός των πυρηνικών υποδοχέων PPARδ (Peroxisom Proliferator- Activated Receptor δ) Οι υποδοχείς PPARδ (Peroxisom Proliferator-Activated Receptor δ, ενεργοποιημένος υποδοχέας δ του πολλαπλασιαστή του υπεροξειδιοσωματίου) αποτελούν μεταγραφικό παράγοντα του πυρήνα, ο οποίος ενεργοποιείται μέσω συνδέτη. Ο παράγοντας αυτός συμβάλλει στη ρύθμιση του μεταβολισμού του λίπους και εμποδίζει την εμφάνιση της παχυσαρκίας που οφείλεται είτε σε γενετική προδιάθεση, είτε σε δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λίπος. Επιπλέον έχει βρεθεί ότι λειτουργεί ως μεταγραφικός στόχος συμμετέχοντας στην αναφερθείσα οδό APC/β-catenin/Tcf. Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν την ενεργοποίηση του PPARδ μέσω της PGΕ2, με συνέπεια την προαγωγή της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων. Στους μύες APC Min η PGΕ 2 προάγει την επιβίωση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων και την ανάπτυξη των αδενωμάτων του παχέος εντέρου. Αντίθετα είναι τα ευρήματα στους μύες PPARδ -/- / APC Min, γεγονός που δείχνει το ρόλο του παράγοντα PPARδ στη μέσω της PGΕ2 ανάπτυξη του όγκου. (152) 9. Σταδιοποίηση του ΚΠΕ Το πρώτο σύστημα σταδιοποίησης του ΚΠΕ κατά Dukes και οι τροποποιήσεις του, αντικαταστάθηκαν τα τελευταία έτη από την σταδιοποίηση που στηρίζεται στην κατάταξη ΤΝΜ και καθορίζεται με βάση το βάθος διήθησης του πρωτοπαθούς όγκου (Τ:Tumor), τον αριθμό των διηθημένων περιοχικών λεμφαδένων (Ν:Node) και την ύπαρξη ή μη απομακρυσμένων μεταστάσεων (Μ:Metastasis). (270) (Πίνακας 7) Το στάδιο του καρκίνου του παχέος εντέρου σχετίζεται με τη φυσική εξέλιξη της νόσου. Το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για τους ασθενείς με όγκο σταδίου Ι ανέρχεται σε 90%, για το στάδιο ΙΙ είναι περίπου 70%, ενώ σε ασθενείς με όγκο σταδίου ΙΙΙ φθάνει έως 50% ανάλογα με τον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων. (271) Η σταδιοποίηση είναι αναγκαία για την επιλογή και πρόγνωση των ασθενών, στους οποίους οι μικρομεταστάσεις στην περιοχή του εξαιρεθέντος όγκου θα οδηγήσουν σε υποτροπή της νόσου. Με αυτόν τον τρόπο, αφενός επιλέγονται οι ασθενείς που θα ωφεληθούν περισσότερο από τη συμπληρωματική θεραπεία και αφετέρου περιορίζεται ο αριθμός των ασθενών που θα υποστούν άσκοπα τις τοξικές συνέπειες της χημειοθεραπείας.

82 Πίνακας 7. Ταξινόμηση σταδιοποίησης ΚΠΕ κατά ΤΝΜ Στάδιο 0: Στάδιο I (Dukes A ή Modified Astler-Coller A και B1): Στάδιο II (Dukes B ή Modified Astler-Coller B2 και B3): Στάδιο III (Dukes C ή Modified Astler-Coller C1-C3): Στάδιο IV (Dukes D): Tis, N0, M0 T1, N0, M0 T2, N0, M0 T3, N0, M0 T4, N0, M0 T1-4, N1, M0 T1-4, N2, M0 T1-4, N1-2, M1 Τis: καρκίνωμα in situ ή ενδοβλεννογόνιο, Τ1: διήθηση υποβλεννογόνου, Τ2: διήθηση μυϊκής στιβάδας, Τ3: διήθηση ορογόνου ή περικολικού/περιορθικού λίπους, Τ4: διήθηση παρακείμενων οργάνων και/ή διάτρηση σπλαγχνικού περιτοναίου. Ν0: μη ύπαρξη διηθημένων λεμφαδένων, Ν1: διήθηση 1-3 λεμφαδένων, Ν2: διήθηση >3 λεμφαδένων. Μ0: μη ύπαρξη απομακρυσμένων μεταστάσεων, Μ1: ύπαρξη απομακρυσμένων μεταστάσεων. 10. Το Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) ως προγνωστικός δείκτης στον ΚΠΕ Το CEA περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1965. Σε φυσιολογικές συνθήκες στην ενήλικη ζωή ανιχνεύεται σε χαμηλή συγκέντρωση, ενώ μικρή αύξηση των επιπέδων του παρατηρείται σε καλοήθεις καταστάσεις που περιλαμβάνουν το κάπνισμα, τη νόσο του πεπτικού έλκους, παγκρεατίτιδα και προστατίτιδα. Σε καρκίνους, όπως του παχέος εντέρου, του μαστού, του παγκρέατος και του ήπατος παρατηρείται αύξηση των επιπέδων. Λόγω της χαμηλής ειδικότητας, το CEA δεν χρησιμοποιείται ως διαγνωστική δοκιμασία στα υγιή άτομα. (272) Η εύρεση υψηλών επιπέδων του CEA προεγχειρητικά σε ασθενείς με ΚΠΕ δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης και κατά τη μετεγχειρητική παρακολούθηση ως κριτήριο εμφάνισης υποτροπής ή μετάστασης του όγκου. Η χρήση του ως κριτήριο επιλογής των ασθενών, στους οποίους θα εφαρμοσθεί συμπληρωματική θεραπεία δεν μπορεί να υποστηριχθεί με βάση τα ήδη υπάρχοντα στοιχεία. Η μέτρησή του στις περιπτώσεις χειρουργικής αντιμετώπισης της μεταστατικής νόσου του ήπατος ή των πνευμόνων, παρέχει πληροφορίες σε σχέση με την πρόγνωση.

83 Ο έλεγχος του CEA κατά τη μετεγχειρητική παρακολούθηση των ασθενών με όγκους σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ ενδείκνυται ανά τρίμηνο κατά τα πρώτα 3 έτη, εφόσον η κατάσταση του ασθενή επιτρέπει την εφαρμογή σε χημειοθεραπείας ή χειρουργικής επέμβασης. Η αύξηση των επιπέδων του CEA αποτελεί ένδειξη για τη διενέργεια περαιτέρω εργαστηριακών εξετάσεων με σκοπό τη διερεύνηση για υποτροπή του όγκου ή μεταστατική νόσο, αλλά δεν στοιχειοθετεί από μόνο της ένδειξη για την έναρξη συστηματικής χημειοθεραπείας. Στις περιπτώσεις μεταστατικής νόσου αποτελεί δείκτη παρακολούθησης της πορείας της νόσου και της ανταπόκρισης στη συστηματική χημειοθεραπεία, με μετρήσεις που γίνονται πριν την έναρξη της θεραπείας και ανά τρίμηνο κατά τη διάρκειά της. Η αύξηση των επιπέδων θεωρείται σημείο προόδου της νόσου, ακόμα και αν δεν επιβεβαιώνεται από τον απεικονιστικό έλεγχο. (273) Συνοπτικά, παρά την συχνή χρήση του ως δείκτη επιτήρησης του ΚΠΕ, η ευαισθησία του CEA για διάγνωση υποτροπής του όγκου δεν είναι βέλτιστη αλλά υπολείπεται. (274) 11. Θεραπεία ΚΠΕ Η χειρουργική επέμβαση αποτελεί τη θεραπεία εκλογής για την πλειονότητα των περιπτώσεων ΚΠΕ. Συνιστάται προεγχειρητική κολοσκόπηση για τον αποκλεισμό συγχρόνων εστιών και μέτρηση του CEA για μετεγχειρητική παρακολούθηση. Επίσης συνιστάται προεγχειρητικός έλεγχος με αξονική τομογραφία για την εκτίμηση ύπαρξης μεταστατικής νόσου για τον σχεδιασμό της θεραπευτικής προσέγγισης (χειρουργική αφαίρεση μεταστατικών εστιών). Η αξονική τομογραφία είναι επίσης, χρήσιμη για μετεγχειρητική διάγνωση πυελικής υποτροπής σε ασθενείς με όγκους του ορθοσιγμοειδούς. Επιπλέον, διορθικός υπερηχογραφικός έλεγχος συνιστάται για την εκτίμηση ασθενών με καρκίνο ορθού. (1) Η σταδιοποίηση της νόσου καθορίζεται με βάση το προαναφερθέν σύστημα ΤΝΜ. Επειδή με τον υφιστάμενο διαγνωστικό έλεγχο δεν είναι δυνατόν να ανιχνευθούν καρκινικά κύτταρα που παραμένουν μετά τη χειρουργική προσέγγιση, ούτε τυχόν μικρομεταστάσεις, η σταδιοποίηση αυτή δεν καθορίζει επακριβώς την πρόγνωση της νόσου. Γίνεται σχετική προσπάθεια καθορισμού μοριακών προγνωστικών δεικτών με βάση τα μοριακά χαρακτηριστικά του όγκου, οι οποίοι όμως δεν εφαρμόζονται στην καθημερινή πράξη. Οι μοριακοί αυτοί δείκτες περιλαμβάνουν ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια (Κ-ras, c-myc, p53, DCC, Smad, nm23), γονίδια σχετιζόμενα με την απόπτωση (Bcl-2, Βax), τον πολλαπλασιασμό του DNA (thymidilate synthase, thimidine phosphatase), την αγγειογένεση (VEGF), γονίδια μορίων προσκόλλησης (cd44, ICAM-1, E-cadherin) και αυξητικούς παράγοντες (TGFα, TGFβ, EGFR). (48)

84 Η μετεγχειρητική χημειοθεραπεία αποτελεί απαραίτητη συμπληρωματική θεραπεία στον ΚΠΕ μη αρχικού σταδίου και η ακτινοθεραπεία (προεγχειρητική ή μετεγχειρητική) στον καρκίνο του ορθού. Η έρευνα σε μοριακό επίπεδο των μηχανισμών της καρκινογένεσης, επεκτείνεται και σε θεραπευτικό επίπεδο. Φαρμακευτικές ουσίες που έχουν ως στόχο αυξητικούς παράγοντες ή τους υποδοχείς τους και ενδοκυττάριους μηχανισμούς μετάδοσης σήματος, βρίσκονται σε στάδιο κλινικών δοκιμών. Αντισώματα έναντι του αγγειακού ενδοθηλιακού παράγοντα (VEGF, Bevacuzimab) και των υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR, Cetuximab) χρησιμοποιούνται ήδη στο μεταστατικό ΚΠΕ, ενώ δοκιμάζονται και στη συμπληρωματική θεραπεία. Στο μέλλον αναμένεται να γίνει εφικτή η εξατομίκευση της θεραπείας, με βάση τους μοριακούς χαρακτήρες του όγκου. (275) 12. Η COX-2 ως στόχος για τη θεραπεία και πρόληψη του ΚΠΕ Η πρώτη κλινική παρατήρηση που αφορούσε την ελάττωση του κινδύνου ανάπτυξης ΚΠΕ με τη χρήση ΜΣΑΦ, έγινε από τους Waddell και Loughry, οι οποίοι παρατήρησαν ότι η χορήγηση ΜΣΑΦ είχε ως αποτέλεσμα την υποστροφή των πολυπόδων σε ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση. (84) Επίσης, η λήψη μικρών δόσεων ΜΣΑΦ (κυρίως ασπιρίνης) ελάττωσε τον κίνδυνο θανάτου από ΚΠΕ. (99) Επειδή η κύρια δράση των ΜΣΑΦ οφείλεται στην αναστολή της COX, θεωρήθηκε ότι το ευεργετικό τους αποτέλεσμα είναι αποτέλεσμα αναστολής της COX-2 στα κύτταρα του όγκου ή στο μικροπεριβάλλον της νεοπλασματικής βλάβης. Κατά τη δεκαετία του 1990 παρατηρήθηκε σχέση μεταξύ της τακτικής λήψης ΜΣΑΦ και ειδικότερα ασπιρίνης, με την ελάττωση της συχνότητας του ΚΠΕ. (275) Μελέτες που προηγήθηκαν έδειξαν ότι η χορήγηση Sulindac σε ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση του αριθμού και του μεγέθους των πολυπόδων. Στην προσπάθεια να αποδειχθεί η αντινεοπλασματική δράση των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2, χορηγήθηκε Celecoxib σε ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση και παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του αριθμού (28%) και του μεγέθους (30,7%) των πολυπόδων στην ομάδα που ελάμβανε δόσεις Celecoxib υψηλότερες (400 mg x 2, ημερησίως) από τις χορηγούμενες σε ασθενείς με αρθρίτιδα (100 200 mg x 2, ημερησίως). (276) Με βάση τα ανωτέρω ευρήματα εγκρίθηκε από το FDA η χρήση του Celecoxib στις περιπτώσεις οικογενούς πολυποδίασης, ως θεραπεία συμπληρωματική, της ενδοσκοπικής και χειρουργικής. Το γεγονός ότι απαιτήθηκαν υψηλές δόσεις Celecoxib για τα αποτελέσματα που σημειώθηκαν, αν δεν είναι συνέπεια της χαμηλής βιοδιαθεσιμότητας του φαρμάκου, θέτει την υπόνοια δράσης της φαρμακευτικής ουσίας ανεξάρτητα από τη δραστηριότητα COX-2. Η

85 χορήγηση του εκλεκτικού αναστολέα της COX-2 Rofecoxib (25 mg, ημερησίως) προκάλεσε επίσης, σημαντική ελάττωση του αριθμού και του μεγέθους των πολυπόδων στο ορθό ασθενών με οικογενή πολυποδίαση. (277) Σε ότι αφορά στην υποτροπή των πολυπόδων σε ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση, η χορήγηση Rofecoxib (25 mg, ημερησίως) είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση κατά 60% του ποσοστού ετήσιας υποτροπής κατά τη διάρκεια της θεραπείας. (278) Στοιχεία επιδημιολογικών μελετών δείχνουν την αποτελεσματικότητα των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2 σε ότι αφορά στη χημειοπροφύλαξη, αν και απαιτείται να ληφθεί υπόψη το μικρό χρονικό διάστημα χρήσης των φαρμακευτικών αυτών ουσιών. Στοιχεία από βάση ασφαλιστικών οργανισμών έδειξαν ελάττωση του κινδύνου ανάπτυξης νεοπλασίας (αδένωμα και καρκίνο) παχέος εντέρου με τη λήψη Celecoxib και Rofecoxib, σε ποσοστό παρόμοιο με αυτό των μη εκλεκτικών ΜΣΑΦ. (279) Με βάση τα δεδομένα υποστροφής των πολυπόδων στους ασθενείς με οικογενή πολυποδίαση, σχεδιάστηκαν νέες τυχαιοποιημένες μελέτες για να εξετασθεί η αποτελεσματικότητα των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2 στην εμφάνιση νέων πολυπόδων σε ασθενείς με ιστορικό σποραδικών περιπτώσεων αδενωμάτων παχέος εντέρου, μετά από πολυπεκτομή. Στη μελέτη πρόληψης αδενωμάτων με Celecoxib, APC (Adenoma Prevention with Celecoxib), τυχαιοποιήθηκαν 2035 άτομα με ιστορικό αφαίρεσης αδενωμάτων παχέος εντέρου, σε τρεις ομάδες, εκ των οποίων η πρώτη (679 ασθενείς) ελάμβανε εικονικό φάρμακο, η δεύτερη (685 ασθενείς) ελάμβανε Celecoxib 200 mg δύο φορές την ημέρα και η τρίτη (671 ασθενείς) Celecoxib 400 mg δύο φορές την ημέρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική, δοσοεξαρτώμενη ελάττωση της συχνότητας εμφάνισης νέων πολυπόδων κατά τη διάρκεια τριετούς παρακολούθησης (60,7%, 43,2% και 37,5% για τις τρεις ομάδες αντιστοίχως). (280) Επίσης, σημειώθηκε ελάττωση της συχνότητας εμφάνισης προχωρημένης νεοπλασίας (αδενώματα > 1 cm, με θηλοσωληνώδη ή θηλώδη στοιχεία, με υψηλόβαθμη δυσπλασία ή στοιχεία εξαλλαγής) στις ομάδες που ελάμβαναν Celecoxib (17,2%, 7,8% και 6,3% αντιστοίχως). Στη μελέτη πρόληψης σποραδικών αδενωματωδών πολυπόδων PreSAP (Prevention of Sporadic Adenomatous Polyps), 1561 ασθενείς μετά από τυχαιοποίηση έλαβαν 400 mg Celecoxib ημερησίως (933 ασθενείς) ή εικονικό φάρμακο (628 ασθενείς). Μετά τριετή παρακολούθηση, στην πρώτη ομάδα παρατηρήθηκε ελάττωση της συχνότητας εμφάνισης νέων αδενωμάτων κατά 33,6% και προχωρημένων αδενωμάτων κατά 5,3% έναντι 49,3% και 10,4%, αντιστοίχως στη δεύτερη ομάδα. (281) Τέλος στη μελέτη πρόληψης αδενωματωδών πολυπόδων με Vioxx APPROVe (Adenomatous Polyp Prevention on Vioxx), στην οποία, σε 2587 ασθενείς με ιστορικό αδενωμάτων παχέος εντέρου, χορηγήθηκε Rofecoxib 25 mg ή εικονικό φάρμακο, βρέθηκε σημαντική ελάττωση στην εμφάνιση νέων αδενωμάτων στην πρώτη ομάδα (41% έναντι 55%) και κατά 30% ελάττωση του κινδύνου εμφάνισης προχωρημένων αδενωμάτων. (282)

86 Σε πρόσφατη αναδρομική μελέτη ο Chan και συν. διερεύνησαν την πιθανή σχέση της ασπιρίνης με την έκφραση της COX-2 στον ΚΠΕ. Πράγματι, βρέθηκε ότι η τακτική χρήση ασπιρίνης είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική ελάττωση του κινδύνου εμφάνισης ΚΠΕ μόνο στις περιπτώσεις θετικής έκφρασης COX-2. (283) Εντούτοις, κατά τη διάρκεια των μελετών με τους αναστολείς της COX-2 ετέθη το σοβαρό ερώτημα κατά πόσο η μέσω της COX-2 αναστολή της σύνθεσης της προστακυκλίνης (PGI2) έχει ως συνέπεια την αύξηση του κινδύνου εμφάνισης καρδιοαγγειακών επιπλοκών, επειδή η μακροχρόνια καταστολή της σύνθεσής της έχει επίπτωση στη θρομβωτική διάθεση και την υπέρταση, ευνοώντας την αθηρογένεση. Τα αποτελέσματα των παρατηρήσεων ήταν αντικρουόμενα, επειδή δεν ήταν σαφές αν οι παρατηρήσεις αφορούσαν ειδικούς παράγοντες ή συνολικά την κατηγορία των συγκεκριμένων φαρμακευτικών ουσιών. Στη μελέτη APPROVe η χρήση Rofecoxib συσχετίσθηκε με αύξηση του κινδύνου θρομβωτικών επεισοδίων (σχετικός κίνδυνος 1,92) σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο, γεγονός που οδήγησε στην απόσυρση του φαρμάκου από την αγορά. Παρομοίως η μελέτη APC έδειξε αύξηση του σχετικού κινδύνου καρδιοαγγειακών επεισοδίων κατά 2,3 και 3,4 αναλόγως με τη δόση Celecoxib (200 mg x 2 και 400 mg x 2, αντιστοίχως). Στη μελέτη PreSAP η χορήγηση Celecoxib σε ημερήσια δόση 400 mg σχετίσθηκε με μικρότερη αύξηση του αντίστοιχου κινδύνου (1,3). (284) Υπάρχουν αναπάντητα ερωτήματα σχετικά με τους μηχανισμούς πρόκλησης και το μέγεθος του προβλήματος των ανεπιθύμητων ενεργειών από το καρδιοαγγειακό σύστημα με τη χρήση των αναστολέων της COX-2, επειδή ο σκοπός των σχετικών μελετών δεν ήταν η διερεύνηση των καρδιοαγγειακών επιπλοκών. Η εξαγωγή συμπερασμάτων από μελέτες που περιλαμβάνουν γεγονότα μικρής πιθανότητας κινδύνου και ποικίλης σοβαρότητας αποτελεί αντικείμενο έντονης αντιπαράθεσης απόψεων. Οι μετα-αναλύσεις έχουν δείξει ότι ο κίνδυνος οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου αυξάνει με τη χρήση Rofecoxib σε χαμηλές και υψηλές δόσεις από την αρχή ακόμα της θεραπείας. Όσον αφορά στη χρήση Celecoxib, ο κίνδυνος είναι αυξημένος σε δόσεις > 200 mg/ημέρα, ενώ σε χαμηλότερες δόσεις ο πιθανός κίνδυνος δεν είναι σαφής. Επίσης ένας άλλος κίνδυνος από τη χρήση των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2 αφορά στις ανεπιθύμητες εκδηλώσεις από τους νεφρούς (περιφερικό οίδημα, υπέρταση, νεφρική δυσλειτουργία). (285) Οι ανεπιθύμητες ενέργειες από το καρδιαγγειακό σύστημα που σημειώθηκαν, οδήγησαν στην απόσυρση της Rofecoxib και περιόρισαν τη χρήση των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2 στη χημειοπροφύλαξη του ΚΠΕ με αναμενόμενο περιορισμό της σχετικής έρευνας. Έτσι, η τρέχουσα έρευνα κατευθύνεται προς την πιθανότητα εκλεκτικής αναστολής της PGE2 (αναστολή των υποδοχέων ή της συνθετάσης PGE2), της σπουδαιότερης

87 προσταγλανδίνης που προάγει την καρκινογένεση, στην προσπάθεια χημειοπροφύλαξης με σύγχρονο περιορισμό των ανεπιθύμητων ενεργειών που συνεπάγεται η χρήση αναστολέων της COX-2. (286) Επιπλέον, επειδή η COX-2 έκφραση δεν διαπιστώνεται σε φυσιολογικό βλεννογόνο αλλά κατεξοχήν σε μυοϊνοβλάστες αδενωματώδους και νεοπλασματικού ιστού ασθενών με όγκους παχέος εντέρου, οι μυοϊνοβλάστες πιθανόν να αντιπροσωπεύουν μελλοντικά κύτταρα στόχους για τη ΜΣΑΦ-μεσολαβούσα χημειοπροστασία έναντι του ΚΠΕ. (72,82) Τέλος, ο ρόλος των εκλεκτικών αναστολέων της COX-2 στη συστηματική χημειοθεραπεία του προχωρημένου ΚΠΕ δεν έχει προσδιοριστεί επακριβώς. Σε μελέτη φάσης ΙΙ χορηγήθηκε Rofecoxib με 5-Φθοριοουρακίλη/Λευκοβορίνη (5-Fluorouracil/Leucovorin, 5-FU/LV) σε ασθενείς με μεταστατικό ΚΠΕ και αυξημένη έκφραση COX-2. Η εμφάνιση σοβαρού βαθμού τοξικότητας, χωρίς να σημειωθεί καμία ανταπόκριση του όγκου, είχε ως αποτέλεσμα την πρόωρη διακοπή της μελέτης. (287) Αντιθέτως, σε πιο πρόσφατη μελέτη φάσης Ι παρατηρήθηκε ότι η χορήγηση Celecoxib σε συνήθεις δόσεις (100-200 mg), συγχρόνως με 5-FU/LV, δεν παρουσίασε αύξηση της τοξικότητας από τη χημειοθεραπεία, ενώ τα χημειοφάρμακα δεν επηρέασαν την αναστολή της COX-2. (288) Ο συνδυασμός Celecoxib με κλασσικό σχήμα χημειοθεραπείας (CPT-11, 5-FU/LV) σε μεταστατικό ΚΠΕ, είχε καλύτερα αποτελέσματα σε σχέση με το θεραπευτικό σχήμα χωρίς τον αναστολέα COX-2, με τάση μείωσης του ποσοστού σοβαρού βαθμού εμπύρετης ουδετεροπενίας. (289) Πρόδρομα αποτελέσματα και άλλων μελετών, στις οποίες χορηγήθηκε Celecoxib σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία, έδειξαν καλύτερα αποτελέσματα σε ότι αφορά στην ανταπόκριση στη θεραπεία και το ποσοστό των ανεπιθύμητων ενεργειών στην ομάδα των ασθενών που ελάμβανε το συνδυασμό των φαρμάκων. Ανάλογες μελέτες φάσης ΙΙΙ βρίσκονται σε εξέλιξη, έχοντας ως στόχο την ανταπόκριση, το διάστημα ελεύθερο νόσου και την τοξικότητα. (290) Εντούτοις, στις μελέτες αυτές εκ νέου εγείρεται το αναφερθέν κρίσιμο πρόβλημα του κινδύνου σοβαρών καρδιοαγγειακών επιπλοκών (έμφραγμα μυοκαρδίου, εγκεφαλικά επεισόδια). (291)

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 89

91 1. ΣΚΟΠΟΙ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Οι σκοποί της παρούσας μελέτης ήταν: 1. Η εκτίμηση της έκφρασης της COX-2 σε χειρουργικά παρασκευάσματα παχέος εντέρου από ασθενείς με ΚΠΕ. 2. Η συσχέτιση της έκφρασης της COX-2 με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των όγκων που περιλάμβαναν την εντόπιση, το στάδιο κατά ΤΝΜ και τη διαφοροποίηση. 3. Η εκτίμηση της προγνωστικής αξίας της COX-2 σε σχέση με την πιθανότητα υποτροπής ή μετάστασης του όγκου και την επιβίωση. 4. Ο προσδιορισμός των πιθανών μηχανισμών ανάπτυξης του όγκου, στους οποίους υπεισέρχεται η COX-2 που περιλάμβαναν την απόπτωση, αγγειογένεση, σχέση της COX-2 με τους παράγοντες TGF-β, VEGF, TNF-α και την αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2. 5. Η εκτίμηση της προγνωστικής αξίας των παραγόντων Bcl-2, VEGF, TNF-α και TGF-β στον ορό ασθενών με ΚΠΕ και η σχέση με το CEA.

93 2. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Ασθενείς Μελετήθηκαν προοπτικά 53 διαδοχικοί ασθενείς (34 άρρενες, 19 θήλεις, μέσης ηλικίας 59,9±10,6 έτη, εύρος: 34-76 έτη) με ΚΠΕ, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε διαγνωστικό ενδοσκοπικό έλεγχο κατωτέρου πεπτικού στο Ενδοσκοπικό Εργαστήριο της Γαστρεντερολογικής Κλινικής του Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο» κατά το χρονικό διάστημα από 1/1/2002 έως και 31/3/2003. (Πίνακας 8) Πίνακας 8. Δημογραφικά δεδομένα ασθενών με ΚΠΕ Α/α Ασθενής Φύλο Ηλικία 1 ΜΣ Α 76 2 ΖΑ Α 62 3 ΠΑ Α 72 4 ΑΣ Γ 74 5 ΜΓ Α 72 6 ΒΣ Γ 53 7 ΠΣ Α 55 8 ΝΧ Α 64 9 ΛΚ Γ 44 10 ΜΑ Γ 73 11 ΖΕ Γ 68 12 ΣΟ Γ 40 13 ΛΜ Γ 68 14 ΘΜ Γ 69 15 ΤΔ Α 56 16 ΤΧ Α 48 17 ΤΑ Α 40 18 ΝΜ Γ 56 19 ΛΑ Α 63 20 ΟΛ Α 58 21 ΜΑ Α 34 22 ΠΚ Γ 56

94 Α/α Ασθενής Φύλο Ηλικία 23 ΚΔ Α 73 24 ΜΔ Α 68 25 ΤΓ Α 69 26 ΦΛ Α 53 27 ΚΓ Α 58 28 ΤΓ Α 67 29 ΚΚ Α 62 30 ΣΑ Γ 67 31 ΖΕ Α 68 32 ΜΜ Α 71 33 ΠΣ Γ 70 34 ΚΜ Α 58 35 ΤΚ Α 72 36 ΚΛ Α 63 37 ΓΚ Γ 47 38 ΙΕ Α 49 39 ΚΠ Γ 73 40 ΑΑ Α 59 41 ΣΚ Α 52 42 ΤΕ Γ 50 43 ΠΑ Γ 46 44 ΣΚ Α 64 45 ΠΣ Α 49 46 ΜΑΦ Γ 57 47 ΠΣ Α 65 48 ΚΘ Α 42 49 ΘΔ Γ 57 50 ΧΔ Α 63 51 ΝΔ Α 69 52 ΚΑ Γ 45 53 ΤΧ Α 72

95 Η προεγχειρητική διάγνωση βασίστηκε στην ιστολογική εξέταση βιοψιών από τον όγκο κατά τη διάρκεια του ενδοσκοπικού ελέγχου του παχέος εντέρου. Η προεγχειρητική αξιολόγηση περιλάμβανε αιματολογικό και βιοχημικό έλεγχο, προσδιορισμό του καρκινοεμβρυϊκού αντιγόνου, αξονική τομογραφία κοιλίας και θώρακος. Η χειρουργική αφαίρεση των όγκων έγινε στην Α Χειρουργική Κλινική του Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο». Κριτήρια εισόδου αποτέλεσαν: 1. Ηλικία μεγαλύτερη των 20 ετών. 2. Εξαιρέσιμος ΚΠΕ με ή χωρίς μεταστατική νόσο. 3. Φυσική κατάσταση 0, 1, 2 (Performance Status, PS: 0, 1, 2), η οποία χαρακτηρίστηκε με βάση τα ακόλουθα κριτήρια ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group, Ανατολική ομάδα συνεργασίας ογκολόγων). (292) 0: Ικανότητα διεκπεραίωσης όλων των συνήθων δραστηριοτήτων χωρίς περιορισμό. 1: Αδυναμία εκτέλεσης κοπιαστικής εργασίας, περιπατητικός ασθενής. 2: Αδυναμία εκτέλεσης οποιασδήποτε σωματικής εργασίας, ικανότητα αυτοεξυπηρέτησης, εκτός κλίνης για διάστημα < 50% του χρόνου που είναι ξυπνητός. 3: Ικανότητα μερικής αυτοεξυπηρέτησης, κλινήρης για διάστημα > 50% του χρόνου που είναι ξυπνητός. 4: Πλήρης αδυναμία αυτοεξυπηρέτησης. Κριτήρια αποκλεισμού αποτέλεσαν: 1. Λήψη φαρμακευτικών ουσιών που παρεμβάλλονται στη σύνθεση των προσταγλανδινών, περιλαμβανομένων των κορτικοειδών, της ασπιρίνης, των ΜΣΑΦ και των σκευασμάτων 5-ASA, κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ημερών πριν από τη χειρουργική επέμβαση. 2. Οικογενειακό ιστορικό συνδρόμου κληρονομούμενου καρκίνου παχέος εντέρου. 3. Ατομικό ιστορικό άλλου καρκίνου. 4. Προεγχειρητική ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία. Όλοι οι συμμετέχοντες ασθενείς αφού ενημερώθηκαν για την προβλεπόμενη διαδικασία του ερευνητικού πρωτοκόλλου, κατέθεσαν γραπτή συγκατάθεση σύμφωνα με τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι (1964), η οποία ενεκρίθη από την Επιτροπή Ιατρικής Ηθικής του Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο». (293)

96 2.2. Μέθοδοι Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε ενδοσκοπικό έλεγχο του κατώτερου πεπτικού. Για το σκοπό αυτό προσέρχονταν κατά τις πρωινές ώρες (περίπου 9 πμ) μετά από 12ώρη περίοδο νηστείας και κατάλληλη προετοιμασία παχέος εντέρου που περιλάμβανε τη λήψη υπεροσμωτικού υπακτικού διαλύματος (Klean-Prep sachets, KITE ΕΠΕ Ελλάς) την προηγούμενη ημέρα της εξέτασης. Μετά από καταστολή του ασθενή με ενδοφλέβια χορήγηση Midazolam 2-5mg (Dormicum 15mg/3ml, Roche) διενεργούνταν ενδελεχής ενδοσκοπικός έλεγχος παχέος εντέρου από τον ίδιο γαστρεντερολόγο (ΔΤ). Χρησιμοποιήθηκαν τα ενδοσκόπια Olympus CF-Q160L (OlympusMedical Systems Corp, Tokyo, Japan) ή Fujinon-200LR (Fujinon Toshiba ES Systems Co, Ltd Tokyo, Japan), γινόταν λήψη πολλαπλών βιοψιών με ειδική λαβίδα από την περιοχή του όγκου (6-8 δείγματα). Μετά από την ολοκλήρωση της ενδοσκόπησης, τα ενδοσκόπια απολυμαίνονταν με την καθιερωμένη τεχνική σε αυτοματοποιημένο ειδικό πλυντήριο (OLYMPUS EDT2+). Κατά τη διάρκεια της εξέτασης πραγματοποιούνταν παρακολούθηση των ζωτικών σημείων του ασθενή και συνεχής καταγραφή των σφύξεων και του κορεσμού οξυγόνου, με ειδικό αυτόματο καταγραφέα (Helicor N550). Για το ενδεχόμενο σοβαρών ανεπιθύμητων παρενεργειών, ο σχεδιασμός της μελέτης προέβλεπε την δυνητική εισαγωγή των ασθενών στο Νοσοκομείο για 24ωρη παρακολούθηση. Οι ασθενείς, μετά το πέρας της εξέτασης και εφόσον τα ζωτικά τους σημεία και ο κορεσμός οξυγόνου βρίσκονταν εντός των φυσιολογικών ορίων, μεταφέρονταν σε ειδική αίθουσα ανάνηψης, όπου παρέμεναν για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 2 ωρών, ελεγχόμενοι από τον ενδοσκόπο και την νοσηλεύτρια που ήταν υπεύθυνοι για την καταστολή. Η ανάνηψη ορίζονταν ως κορεσμός οξυγόνου >94%, αρτηριακή πίεση >100mmHg σε καθιστική θέση, αποκατάσταση του επιπέδου συνείδησης και απουσία αισθήματος ζάλης ή αστάθειας. Ως κριτήρια λήξης της παρακολούθησης των εξεταζόμενων ασθενών ορίζονταν η πλήρης αποκατάσταση του επιπέδου συνείδησης και της επαφής με το περιβάλλον, με σταθερά ζωτικά σημεία, δυνατότητα μετακίνησης χωρίς απαιτούμενη υποστήριξη ή άλλη βοήθεια και η απουσία κάθε είδους ανεπιθύμητης ενέργειας ή επιπλοκής. Ακολουθούσε τηλεφωνική επικοινωνία την επόμενη μέρα με ιδιαίτερο εστιασμό στην πλήρη επαναφορά του επιπέδου συνείδησης, την αποκατάσταση των δραστηριοτήτων και την απουσία κάθε είδους ανεπιθύμητης ενέργειας ή επιπλοκής. Επίσης οι ασθενείς ερωτούνταν σχετικά με την αποδοχή επιτέλεσης της ιδίας διαδικασίας μελλοντικά.

97 Πριν και μετά τη χειρουργική επέμβαση, λαμβάνονταν 20ml φλεβικού περιφερικού αίματος για τον προσδιορισμό των παραγόντων Bcl-2, TNF-α, VEGF, TGF-β1. Προεγχειρητικά, η λήψη του αίματος γινόταν 1-5 ώρες πριν τη χειρουργική επέμβαση (χρονική στιγμή 0), ενώ μετεγχειρητικά 4-6 εβδομάδες (χρονική στιγμή 1) και 12-14 μήνες (χρονική στιγμή 12) μετά την επέμβαση κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης των ασθενών στο Εξωτερικό Ιατρείο. Μετά από φυγοκέντρηση του αίματος, ακολουθούσε απομόνωση του ορού και διατήρησή του σε θερμοκρασία -70 0 C. Η μέτρηση των διαφόρων παραμέτρων στον ορό γινόταν μετά την απόψυξη των δειγμάτων στους 37 0 C. 2.3. Ιστολογική εξέταση Η εκτίμηση σε όλες τις τομές από τα χειρουργικά παρασκευάσματα, στα οποία πραγματοποιήθηκε έλεγχος συμβατικός (χρώση αιματοξυλίνηςηωσίνης, Η&Ε) και ανοσοϊστοχημικός (έκφραση COX-2, Bcl-2), γινόταν από έναν εξειδικευμένο παθολογοανατόμο (ΦΠ) που δεν είχε γνώση του ιστορικού και της κλινικής εικόνας των ασθενών, των ενδοσκοπικών ευρημάτων και των αποτελεσμάτων της χειρουργικής επέμβασης. Οι ιστοί αφού είχαν μονιμοποιηθεί σε διάλυμα φορμόλης 10% και εγκλωβισθεί σε παραφίνη, στη συνέχεια τέμνονταν σε τομές πάχους 3-4 μ. Ο συμβατικός έλεγχος αφορούσε τον ιστολογικό τύπο του καρκινώματος, τη διαφοροποίηση, την ύπαρξη λεμφαδενικής διήθησης και διήθησης λεμφαγγείων, αιμοφόρων αγγείων ή περινευρικών χώρων. Τα ιστοπαθολογικά ευρήματα ορίστηκαν σύμφωνα με το σύστημα ΤΝΜ κατάταξης των κακοήθων όγκων και περιελάμβαναν διήθηση του τοιχώματος, εξωτοιχωματική επέκταση, διήθηση λεμφαδένων (θέση και αριθμό). 2.4. Ανοσοϊστοχημικός έλεγχος Ο ανοσοϊστοχημικός έλεγχος στον καρκινικό ιστό και στον παρακείμενο φυσιολογικό πραγματοποιούνταν ως εξής: Οι ιστολογικές τομές από κύβους παραφίνης, πάχους 4 μm σε θετικά φορτισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες, τοποθετούνταν σε κλίβανο, σε θερμοκρασία 58 ο - 60 ο C για 2 ώρες τουλάχιστον ή για όλη τη νύχτα. Μετά την αποπαραφίνωση των τομών με ξυλόλη και την ενυδάτωση με αιθανόλη, ακολουθούσε η έκπλυσή τους με απεσταγμένο νερό και η προετοιμασία σε φούρνο μικροκυμάτων σε 350 Watt για 30. Ακολουθούσε η έκπλυση με απεσταγμένο νερό και η τοποθέτηση τους σε συσκευή αυτόματου συστήματος ανοσοϊστοχημείας (Benchmark 1CH/ISH Staining Module), στην οποία για την εξουδετέρωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης, χρησιμοποιούνταν διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου για 8. Στη συνέχεια η διαδικασία περιλάμβανε έκπλυση με ειδικό διάλυμα (Phosphate-Buff-

98 ered saline, PBS), επώαση των τομών με 100 μl ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος για την ανθρώπειο COX-2 (Novocastra), σε αραίωση 1:40, επί 32 σε θερμοκρασία 37 ο C, ή με 100 μl ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος για την ανθρώπειο Bcl-2 πρωτεΐνη (BioGenex) σε αραίωση 1:100, επί 30 στους 37 ο C. Ακολουθούσε έκπλυση και επώαση με ενισχυτικό διάλυμα (Avidin+Biotinylated horseradish peroxidase complex) επί 8 για ενίσχυση της έντασης της χρώσης. Ακολουθούσε επώαση με διάλυμα γλουταραλδεΰδης, έκπλυση και επώαση με δευτερογενές αντίσωμα (37 ο C επί 8 ). Η δέσμευση του αντιγόνου γίνονταν ορατή με επώαση με σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης SA/HRP σε θερμοκρασία 37 ο C επί 8, ακολουθούμενη, μετά από έκπλυση, από επώαση με χρωμογόνο 3,3 διαμινοβενζιδίνη (Diaminobenzidine, DAB), έκπλυση και χρώση με αιματοξυλίνη, έκπλυση και διαφοροποίηση με αντιδραστήριο, έκπλυση με νερό βρύσης, αφυδάτωση και κάλυψη των τομών. 2.5. Εκτίμηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης COX-2 Η πρωτεΐνη της COX-2 προσδιορίσθηκε στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων, με διάχυτη, κυρίως κυτταροπλασματική χρώση, στα φλεγμονώδη μονοκύτταρα, στο αγγειακό ενδοθήλιο και στους ινοβλάστες. Οι αντιδράσεις στο φυσιολογικό επιθήλιο και στα μονοκύτταρα του βλεννογόνου του παχέος εντέρου μακράν του καρκινικού ιστού χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Όλες οι τομές εξετάσθηκαν και βαθμολογήθηκαν σε κοινό μικροσκόπιο. Η εκτίμηση της χρώσης έγινε με το ακόλουθο σύστημα βαθμολόγησης. Η ένταση της χρώσης με κλίμακα 0 (αρνητική), 1 (ήπια), 2 (μέτρια) και 3 (έντονη). Η έκταση της χρώσης, ανάλογα με το ποσοστό των κυττάρων με θετική χρώση στο κυτταρόπλασμα σε σχέση με τη συνολική έκταση του καρκινικού ιστού ή την τομή του φυσιολογικού ιστού, βαθμολογήθηκε με 0 (0%), 1 (1 25%), 2 (26 50%), 3 (51 75%) και 4 (76 100%). Το άθροισμα των βαθμολογιών της έντασης και της έκτασης της χρώσης χρησιμοποιήθηκε ως τελικός βαθμός (κλίμακα 0 7) για την COX-2. Η σχετικά απλή και αναπαραγώγιμη αυτή μέθοδος που επιτρέπει βέλτιστη συμφωνία μεταξύ ανεξάρτητων εκτιμητών, έχει χρησιμοποιηθεί και σε άλλες μελέτες. (294,143) Για την στατιστική ανάλυση, οι όγκοι με τελικό βαθμό χρώσης 3 θεωρήθηκαν θετικοί. 2.6. Εκτίμηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης Bcl-2 Η χρώση χαρακτηρίστηκε ως θετική ή αρνητική με βάση την ένταση της ανοσοαντίδρασης (κλίμακα 0-3 με 0 = αρνητική, 1 = ασθενής, 2 = μέτρια, 3 = έντονη χρώση) και το ποσοστό των χρωματισθέντων κυττάρων του όγκου. Ως Bcl-2 θετικοί χαρακτηρίστηκαν οι όγκοι που πληρούσαν τα ακόλουθα κριτήρια: κλίμακα έντασης χρώσης > 1 και ποσοστό χρωματι-

99 σθέντων κυττάρων > 30%. Η ανοσοχρώση των λεμφοκυτττάρων του βλεννογόνου του παχέος εντέρου χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. (162) 2.7. Μέτρηση παραγόντων στον ορό Για τον προσδιορισμό των επιπέδων Bcl-2, TNF-α, VEGF, TGF-β χρησιμοποιήθηκε η ανοσοπροσροφητική ανάλυση στερεάς φάσης με σύνδεση ενζύμου (Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA). Η μέθοδος στηρίζεται στην παθητική απορρόφηση ουσιών, όπως τα αντιγόνα και τα αντισώματα, στις στερεές επιφάνειες (πλαστικές), λόγω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Οι πλάκες των 96 φρεατίων που χρησιμοποιούνται στη μέθοδο διευκολύνουν την απορρόφηση. Με απλές πλύσεις είναι δυνατός ο διαχωρισμός και ο καθαρισμός του αντιδραστηρίου που βρίσκεται σε στερεή φάση από άλλα αντιδραστήρια. Το αποτέλεσμα είναι ένα έγχρωμο προϊόν που παρατηρείται με άμεση όραση γρήγορα και εύκολα και μετράται με φωτόμετρο. Ειδικότερα, η χρησιμοποιηθείσα sandwich ELISA για την εκτίμηση των αναφερθέντων παραγόντων, περιλάμβανε τα ακόλουθα στάδια: Παθητική απορρόφηση του αντισώματος Πλύσιμο Προσθήκη του αντιγόνου Πλύσιμο Προσθήκη του ενζύμου έναντι του αντιγόνου Πλύσιμο Προσθήκη και επώαση του χρωμογόνου Ανάγνωση απορρόφησης Bcl-2: Η μέτρηση της πρωτεΐνης Bcl-2 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος μυός, ειδικού για την ανθρώπειο Bcl-2 πρωτεΐνη. Χρησιμοποιήθηκε τυποποιημένη συσκευασία (kit) της Oncogene Research Products με ευαισθησία 1 u/ml (lower limit of detection, κατώτερο όριο προσδιορισμού). TNF-α: Για τη μέτρηση του TNF-α στον ορό χρησιμοποιήθηκε ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα μυός σε τυποποιημένη συσκευασία (kit) της εταιρείας R&D Systems (Quantikine HS) με ευαισθησία 0,12 pg/ml (Minimum Detectable Dose, MDD, ελάχιστη ανιχνεύσιμη δόση).

100 VEGF: O VEGF μετρήθηκε στον ορό με ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα μυός σε τυποποιημένη συσκευασία (kit) της ams Biotechology με ευαισθησία 18,6 pg/ml (MDD). TGF-β1: Ο TGF-β1 μετρήθηκε στον ορό με ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα σε τυποποιημένη συσκευασία (kit) της εταιρείας R&D Systems (Quantikine) με ευαισθησία 4,61 pg/ml (MDD). CEA: Η μέτρηση του CEA έγινε με ραδιοανοσολογική μέθοδο (sandwich principle). Χρησιμοποιήθηκαν δύο μονοκλωνικά αντισώματα σε τυποποιημένη συσκευασία (kit), IRMA-coat CEA της εταιρείας Byk-Sangtec Diagnostica με ευαισθησία 0,6 ng/ml (MDD). 2.8. Μετεγχειρητική παρακολούθηση Η σταδιοποίηση των όγκων, η οποία καθορίζεται από το βάθος διείσδυσης του όγκου στο εντερικό τοίχωμα, την επέκτασή του, τη διήθηση λεμφαδένων ή την ύπαρξη μεταστάσεων, έγινε με βάση το αναφερθέν σύστημα ΤΝΜ. (15) Οι ασθενείς με καρκίνο παχέος εντέρου σταδίου ΙΙΙ, σταδίου ΙΙ που παρουσίαζαν υψηλό κίνδυνο υποτροπής (διάτρηση εντέρου, ανεπαρκής αριθμός εξαιρεθέντων λεμφαδένων, όγκοι Τ4, χαμηλή διαφοροποίηση), υποβλήθηκαν σε συμπληρωματική χημειοθεραπεία ή συνδυασμό ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας στις περιπτώσεις καρκίνου του ορθού. Οι ασθενείς με καρκίνο σταδίου IV υποβλήθηκαν σε συστηματική χημειοθεραπεία. Όλοι οι ασθενείς μετά το τέλος της χημειοθεραπείας, όπως και αυτοί που δεν υποβλήθηκαν σε χημειοθεραπεία μετεγχειρητικά, ήταν σε τακτική παρακολούθηση στο Εξωτερικό Ιατρείο της Γαστρεντερολογικής Κλινικής, με κλινική εξέταση, αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις και προσδιορισμό των καρκινικών δεικτών CEA, CA 19-9, TAG 72 ανά 3 μήνες κατά τη διάρκεια των πρώτων 2 ετών και ανά 6 μήνες κατά τα επόμενα 3 έτη. Επίσης οι ασθενείς υποβάλλονταν σε ακτινογραφία θώρακα και αξονική τομογραφία κοιλίας ανά έτος κατά τη διάρκεια της πενταετούς παρακολούθησης και σε κολοσκόπηση κατά τη διάρκεια του πρώτου έτους μετά τη χειρουργική επέμβαση και στη συνέχεια ανά 3 5 έτη, εφόσον προεγχειρητικά είχε ελεγχθεί ενδοσκοπικά το παχύ έντερο στο σύνολό του. Στις περιπτώσεις αποφρακτικών όγκων η κολοσκόπηση γίνονταν 3-6 μήνες μετά τη χειρουργική επέμβαση. Στις περιπτώσεις καρκίνου του ορθού η αξονική τομογραφία κοιλίας και ο ενδοσκοπικός έλεγχος γίνονταν ανά 6 μήνες κατά τη διάρκεια των 2 πρώτων ετών παρακολούθησης, σύμφωνα με τις οδηγίες που ισχύουν. (234)

101 2.9. Στατιστική ανάλυση Χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία χ 2 για τη σχέση της έκφρασης της COX-2 με τα διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των όγκων. Για την ανάλυση της επιβίωσης χρησιμοποιήθηκαν η δοκιμασία χ 2 (στάδιο, εντόπιση) και Mann-Whitney (επίπεδα CEA). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε με το πρότυπο παλινδρόμησης Cox (Cox regression). Η καμπύλη Kaplan Meier χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της πιθανότητας εμφάνισης υποτροπής ή μετάστασης και της θνητότητας και η σύγκριση έγινε με τη δοκιμασία Log rank. Η σύγκριση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης Bcl-2 και COX-2 έγινε με τη δοκιμασία χ 2 και ακριβή έλεγχο Fisher (Fisher s exact test), της έκφρασης Bcl-2 στον ιστό, ως ποιοτικής μεταβλητής και της μέτρησης στον ορό, ως ποσοτικής μεταβλητής, με το κριτήριο Mann-Whitney και της μέτρησης στον ορό ως ποιοτικής διχοτομούμενης μεταβλητής με τη δοκιμασία χ 2. Η σύγκριση των τιμών των προσδιορισθέντων παραγόντων στον ορό έγινε με τον έλεγχο Wilcoxon (μη-παραμετρική μέθοδος για τιμές ανά ζεύγη) και η συσχέτιση με το βαθμό της κλίμακας έκφρασης της COX-2 ως ποιοτικής μεταβλητής, έγινε με το συντελεστή συσχέτισης Spearman. Οι συγκρίσεις των παραγόντων στη χρονική στιγμή 0 έγιναν με το κριτήριο Mann-Whitney για τις μεταβλητές στάδιο, διαφοροποίηση και υποτροπή, το κριτήριο Kruskal-Wallis για την εντόπιση και το συντελεστή συσχέτισης Spearman για την ποσοτική μεταβλητή του CEΑ. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα SPSS 12,0. Ως στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε η τιμή p < 0,05.

103 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα επιδημιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με ΚΠΕ παρατίθενται στον Πίνακα 9. Υποτροπή ή μετάσταση παρουσίασαν 8 ασθενείς κατά τη μετεγχειρητική διάρκεια παρακολούθησης. Σε χημειοθεραπεία, συμπληρωματική ή θεραπευτική, υποβλήθηκαν 36 ασθενείς (67,9%). Απεβίωσαν 13 ασθενείς (24,5%) κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης (μέσος χρόνος παρακολούθησης: 51,4±4,4 μήνες, εύρος: 44-58 μήνες), ενώ η μέση επιβίωση ανήλθε σε 42,8±16,3 μήνες (εύρος: 2-58 μήνες). Πίνακας 9. Επιδημιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά ασθενών με ΚΠΕ Ασθενείς Ν:53 Άρρενες (%) Θήλεις (%) Ηλικία (έτη) Μέση 34 (64,2%) 19 (35,8) 59,9±10,6 Εύρος 34-76 Υποτροπή όγκου (%) 8 (15,1%) Χημειοθεραπεία (%) 36 (67,9%) Θάνατοι (%) 13 (24,5%) Μέση επιβίωση (μήνες) 42,8±16,3 Εύρος: 2-58 Σε 26 ασθενείς ο όγκος εντοπιζόταν στο ορθό και σε 27 στο υπόλοιπο παχύ έντερο. Ο ενδοσκοπικός έλεγχος του παχέος εντέρου δεν ολοκληρώθηκε σε 5 από τους 26 ασθενείς με όγκο που εντοπιζόταν στο ορθό και σε 6 από τους 27 ασθενείς με όγκο των υπολοίπων τμημάτων του παχέος εντέρου (2 στο ανιόν, 1 στο εγκάρσιο και 3 στο σιγμοειδές). Η αδυναμία ολοκλήρωσης της εξέτασης οφειλόταν σε στένωση του αυλού του εντέρου από τον όγκο, που δεν επέτρεπε την προώθηση του ενδοσκοπίου. Σε έναν ασθενή με όγκο σιγμοειδούς βρέθηκε σύγχρονη βλάβη στο ίδιο τμήμα του παχέος εντέρου. Σε δύο ασθενείς με όγκο σιγμοειδούς βρέθηκαν συγχρόνως πολύποδες (2 στο κατιόν και 1 στο ορθό, αντιστοίχως), οι οποίοι αφαιρέθηκαν κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης. Ως προς το μέγεθος των όγκων, η μέση διάμετρος, όπως εκτιμήθηκε κατά τη μακροσκοπική εξέταση των χειρουργικών παρασκευασμάτων στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο, ανερχόταν σε 4,5 cm (εύρος: 3,6-5,0 cm). Χαμηλής διαφοροποίησης ήταν 6 όγκοι, μέτριας 41 και υψηλής 6. Ο όγκος διηθούσε όλο το τοίχωμα του εντέρου και το περικολικό λίπος (στάδιο Τ3) σε 45 περιπτώσεις. Σε 30 ασθενείς η εξέταση των εξαιρεθέντων λεμφαδένων για διήθηση από καρκινικά κύτταρα απέβη αρνητική (Ν0). Διή-

104 θηση λεμφαδένων βρέθηκε σε 23 ασθενείς και ειδικότερα σε 7 από αυτούς καρκινικά κύτταρα βρέθηκαν σε 3 λεμφαδένες (Ν1) και σε 16 περιπτώσεις ο αριθμός των διηθημένων λεμφαδένων ήταν > 3 (Ν2). Μεταστατική νόσος διαπιστώθηκε σε 12 ασθενείς (Μ1). Όσον αφορά στη σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ, 7 περιπτώσεις χαρακτηρίστηκαν σταδίου Ι, 21 περιπτώσεις σταδίου ΙΙ, 13 περιπτώσεις σταδίου ΙΙΙ και 12 περιπτώσεις σταδίου IV. Στην Εικόνα 1 φαίνονται ιστολογικές τομές αδενοκαρκινώματος παχέος εντέρου. Α. Β. Γ. Δ. Εικόνα 1. Α. Αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου μέτριας διαφοροποίησης (παχύ βέλος) και φυσιολογικός βλεννογόνος (λεπτό βέλος) (Η&Ε, x 20). Β. Αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου μέτριας διαφοροποίησης (Η&Ε, x 200). Γ. Αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου μέτριας διαφοροποίησης με ηθμοειδές πρότυπο ανάπτυξης (παχύ βέλος) και φυσιολογικός βλεννογόνος (λεπτό βέλος) (Η&Ε, x 200). Δ. Αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου μέτριας-χαμηλής διαφοροποίησης (παχύ βέλος) με διήθηση του μυϊκού τοιχώματος (λεπτό βέλος) (Η&Ε, x 100). Τα χαρακτηριστικά στοιχεία των όγκων καταγράφονται στον Πίνακα 10.

105 Πίνακας 10. Χαρακτηριστικά στοιχεία των όγκων Χαρακτηριστικά όγκου Ν (%) Εντόπιση Ορθό Κόλον Σιγμοειδές-Κατιόν Εγκάρσιο-Ανιόν-Τυφλό Εμφάνιση Πολυποειδής Ελκωτική ή/και Βλεννώδης Μέγεθος Μήκος / εύρος (cm) Όγκοι > 4,5 cm Διαφοροποίηση Χαμηλή Μέτρια Υψηλή Διήθηση αγγείων, λεμφαγγείων ή περινευρικού χώρου Διήθηση (T) pt1 pt2 pt3 Διήθηση λεμφαδένων (Ν) Ν0 Ν1 Ν2 Μεταστάσεις (Μ) Μ0 Μ1 Στάδιο ΤΝΜ 26 (49,1%) 27 (50,9%) 21 (39,6%) 6 (11,4%) 16 (30,2%) 37 (69,8%) 4,5 / 3,6-5,0 27 (52,9%) 6 (11,3%) 41 (77,4%) 6 (11,3%) 27 (50,9%) 2 (3,8%) 6 (11,3%) 45 (84,9%) 30 (56,6%) 7 (13,2%) 16 (30,2%) 41 (77,4%) 12 (22,6%) Ι 7 (13,2%) ΙΙ 21 (39,6%) ΙΙΙ 13 (24,5%) ΙV 12 (22,6%)

106 3.1. Ανοσοϊστοχημική έκφραση COX-2 Σε 44 περιπτώσεις (83%) η έκταση της χρώσης στους όγκους αφορούσε ποσοστό κυττάρων > 50%. Η ένταση της χρώσης χαρακτηρίστηκε μέτρια σε 18 όγκους (34%) και έντονη σε 20 (37,7%). Η έκφραση της COX-2 ήταν θετική (βαθμός κλίμακας 3 7) σε 48 περιπτώσεις (90,6%). Η μέση τιμή του βαθμού της κλίμακας της υπερέκφρασης COX-2 ήταν 5,23+1,83. Στον παρακείμενο του όγκου φυσιολογικό βλεννογόνο υπήρχε απουσία ή ασθενής (12 και 41 ασθενείς, αντιστοίχως) έκφραση της COX-2. Στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε από τη σύγκριση της έκφρασης της COX-2 μεταξύ του καρκινικού ιστού και του παρακείμενου φυσιολογικού βλεννογόνου (p<0,001). (Εικόνα 2,3,4,5 και 6) Α. Β. Εικόνα 2. Ήπια κυτταροπλασματική χρώση COX-2 στα νεοπλασματικά κύτταρα (βέλη). Α. x 200, B. x 400. Α. Β. Εικόνα 3. Μέτρια κυτταροπλασματική χρώση COX-2 στα νεοπλασματικά κύτταρα (βέλη). Α. x 200, B. x 400.

107 Α. Β. Εικόνα 4. Έντονη κυτταροπλασματική χρώση COX-2 στα νεοπλασματικά κύτταρα (βέλη). Α. x 200, B. x 400. Α. Β. Εικόνα 5. Α. Έντονη κυτταροπλασματική χρώση COX-2 στα νεοπλασματικά κύτταρα (βέλη) (x 200). B. Ετερογένεια κυτταροπλασματικής χρώσης COX-2 στα νεοπλασματικά κύτταρα (λεπτό βέλος: ήπια χρώση, παχύ βέλος: έντονη χρώση) (x 400). Α. Β. Εικόνα 6. Α. Αρνητική ανοσοχρώση COX-2 στα νεοπλασματικά κύτταρα του καρκινικού ιστού (x 100). Β. Θετική ανοσοχρώση COX-2 στα φλεγμονώδη κύτταρα (μάρτυρας) (x 400).

108 Στον Πίνακα 11 φαίνονται τα χαρακτηριστικά της χρώσης COX-2 ως προς την έκταση και έντασή της. Πίνακας 11. Έκταση και ένταση της χρώσης COX-2 στους όγκους Έκταση COX-2 0 1 2 3 4 4 (7,5%) 1 (1,9%) 4 (7,5%) 16 (30,2%) 28 (52,8%) Ένταση COX-2 0 1 2 3 4 (7,5%) 11 (20,8%) 18 (34,0%) 20 (37,7%) Βαθμός κλίμακας έκφρασης COX-2 Μέση τιμή Τιμή 3 (%) 5,23+1,83 48 (90,6%) Στον Πίνακα 12 φαίνεται η κατάταξη των όγκων ανάλογα με την ένταση και έκταση της ανοσοαντίδρασης της COX-2.

109 Πίνακας 12. Κατάταξη των όγκων ανάλογα με την έκφραση της COX-2 Ένταση Αρνητική 0 Ήπια 1 Μέτρια 2 Έντονη 3 0% 0 Ποσοστό κυττάρων (έκταση) 1-25% 1 26-50% 2 51-75% 3 76-100% 4 Σύνολο 4* 4 1* 5 5 11 2 5 11 18 2 6 12 20 Σύνολο 4 1 4 16 28 53 *: COX-2 αρνητικοί όγκοι Στο σχήμα 10 παρουσιάζεται σε ιστόγραμμα η κατανομή των περιπτώσεων ανάλογα με το βαθμό της κλίμακας έκφρασης της COX-2. Ιστόγραμμα έκφρασης COX-2 20 18 16 14 Ασθενείς 12 10 8 17 6 12 12 4 2 0 4 1 0 1 2 3 4 5 6 7 Κλίμακα COX-2 7 Σχήμα 10. Ιστόγραμμα έκφρασης COX-2. Αριθμός περιπτώσεων ανά βαθμό της κλίμακας έκφρασης COX-2. Στον Πίνακα 13 καταγράφεται η συσχέτιση έκφρασης της COX-2 με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων.

110 Πίνακας 13. Συσχέτιση παραμέτρων των όγκων με την έκφραση COX-2 Παράμετρος Αριθμός περιπτώσεων Έκφραση COX-2 Αρνητική Θετική Σύνολο (%) 53 5 (9,4) 48 (90,6) Άρρενες (%) Θήλεις (%) 34 (64,2) 19 (35,8) 5 (100) 0 (0) 29 (60,4) 19 (39,6) 0,147 Ηλικία 59,9 (34-76) 62 (48,0-69,5) 61 (52,2-69,0) 1,00 Μέγεθος όγκου (εύρος) > 4 cm (%) 4,5 cm (3,6-5,0) 27 (52,9) 3,7 cm (2,1-6,0) 2 (40) 4,5 cm (3,6-5,0) 25 (54,3) 0,534 0,656 Εντόπιση (%) Ορθό Κόλον 26 (49,1) 27 (51,9) 2 3 24 24 1,00 Εμφάνιση (%) Πολυποειδής Ελκωτική/Βλεννώδης 16 (30,2) 37 (69,8) 1 (20) 4 (80) 15 (31,3) 33 (68,8) 1,00 Διαφοροποίηση (%) Υψηλή /μέτρια Χαμηλή 42 (79,2) 11 (20,8) 3 (60) 2 (40) 39 (81,2) 9 (18,8) 0,275 Διήθηση (%) PΤ1-2 PΤ3 8 (15,1) 45 (84,9) 0 (0) 5 (100) 8 (16,7) 40 (83,3) 1,00 Διήθηση λεμφαδένων (%) Ναι Όχι 23 (43,4) 30 (56,6) 5 (100) 0 (0) 18 (37,5) 30 (62,5) 0,01 Διήθηση αγγείων, λεμφαγγείων (%) Ναι Όχι 26 (49,1) 27 (50,9) 4 (80) 1 (20) 23 (47,9) 25 (52,1) 0,351 Μεταστάσεις (%) Ναι 12 (22,6) 3 (60) 9 (18,8) Όχι 41 (77,4) 2 (40) 39 (81,3) 0,07 Στάδιο ΤΝΜ (%) I-II 28 (52,8) 0 (0) 28 (58,3) III-IV 25 (47,2) 5 (100) 20 (41,7) 0,02 Υποτροπή/μετάσταση (%) 8 (15,1) 1 (12,5) 7 (87,5) 0,574 Θάνατοι (%) 13 (24,5) 2 (23,1) 11 (76,9) 0,325 p

111 Όσον αφορά στο φύλο και στην ηλικία των ασθενών δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των ομάδων με θετική και αρνητική έκφραση της COX-2. Η έκφραση της COX-2 δεν βρέθηκε να σχετίζεται με την εντόπιση του όγκου. Σε 24 από τους 26 ασθενείς με εντόπιση του όγκου στο ορθό και σε 24 από τους 27 όγκους που εντοπίζονταν στο υπόλοιπο παχύ έντερο, βρέθηκε θετική έκφραση της COX-2. Η εμφάνιση του όγκου (πολυποειδής ή ελκωτική/βλεννώδης) δεν σχετιζόταν με την έκφραση της COX-2. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων με θετική ή αρνητική έκφραση της COX-2 και της διαφοροποίησης των όγκων. Από τους 42 όγκους υψηλής-μέτριας διαφοροποίησης, στους 39 βρέθηκε θετική έκφραση της COX-2. Από τους 11 όγκους χαμηλής διαφοροποίησης οι 9 βρέθηκαν θετικοί στην έκφραση της COX-2. (Πίνακας 13) Οι 8 όγκοι που διηθούσαν το τοίχωμα του εντέρου μέχρι τη μυϊκή στιβάδα ανήκαν στην ομάδα των θετικών στην έκφραση της COX-2. Από τους 45 όγκους που διηθούσαν όλο το τοίχωμα του παχέος εντέρου ή το περικολικό λίπος, οι 40 είχαν θετική έκφραση της COX-2. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των COX-2 θετικών όγκων σταδίου Τ1-2 και Τ3. (Πίνακας 13) Στις 18 από τις 23 (37,5%) περιπτώσεις των όγκων με θετικούς λεμφαδένες (Ν1-2) βρέθηκε θετική έκφραση της COX-2 κατά την ιστολογική εξέταση των χειρουργικών παρασκευασμάτων των όγκων, ενώ στις 30 (62,5%) περιπτώσεις με αρνητικούς λεμφαδένες (Ν0) σημειώθηκε θετική έκφραση της COX-2. Η έκφραση της COX-2 σχετίζεται σημαντικά με την παρουσία διηθημένων λεμφαδένων. (p=0,01). (Πίνακας 13) Το 81,3% των περιπτώσεων (39 ασθενείς) χωρίς μεταστατική νόσο (Μ0) ανήκαν στους COX-2 θετικούς όγκους, ενώ από τους ασθενείς με μεταστατική νόσο (Μ1) στο 18,8% (9 περιπτώσεις) βρέθηκε υπερέκφραση της COX-2. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση της έκφρασης της COX-2 και της ύπαρξης μεταστατικής νόσου. (Πίνακας 13) Οι 28 (58,3%) ασθενείς σταδίου Ι-ΙΙ ανήκαν στην κατηγορία των όγκων με θετική έκφραση της COX-2, ενώ από τους 25 ασθενείς σταδίου ΙΙΙ-IV με υπερέκφραση COX-2 βρέθηκαν οι 20 (41,7%) όγκοι. Η διαφορά μεταξύ των όγκων σταδίου Ι-ΙΙ και ΙΙ-IV ήταν σημαντική (p=0,02). (Πίνακας 13) Τοπική υποτροπή ή απομακρυσμένες μεταστάσεις παρατηρήθηκαν σε 8 (15,1%) ασθενείς κατά τη διάρκεια της μετεγχειρητικής παρακολούθησης. Από αυτούς οι 7 (87,5%) ανήκαν στην κατηγορία των όγκων με αυξημένη έκφραση COX-2. Από τη στατιστική ανάλυση των δύο ομάδων με θετική και αρνητική έκφραση COX-2 δεν προέκυψε σημαντική διαφορά. (Πίνακας 13)

112 Από τους 53 ασθενείς της μελέτης απεβίωσαν 13 (24,5%) από την κύρια νόσο (ένας ασθενής από την ομάδα των COX-2 θετικών όγκων απεβίωσε από αιτία διαφορετική από την κύρια νόσο). Από αυτούς οι 11 ανήκαν στην ομάδα με υψηλή έκφραση COX-2 και οι 2 στην ομάδα με αρνητική έκφραση. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των δύο αυτών ομάδων. (Πίνακας 13) 3.2. Ανοσοϊστοχημική έκφραση Bcl-2 Από τους 53 όγκους, ανοσοϊστοχημική έκφραση της Bcl-2 βρέθηκε σε 20 (37,7%) και σε 33 (62,3%) όγκους η έκφραση ήταν αρνητική. Στο σύνολό τους οι 20 Bcl-2 (+) όγκοι ήταν υψηλής/μέτριας διαφοροποίησης (3/17), ενώ κανένας δεν ήταν χαμηλής διαφοροποίησης. Από τους 33 όγκους με αρνητική έκφραση Bcl-2, οι 21 παρουσίαζαν υψηλή/μέτρια διαφοροποίηση (3/18) και οι 12 χαμηλή. Σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ των όγκων μέτριας/υψηλής και χαμηλής διαφοροποίησης σε σχέση με την έκφραση της Bcl-2 (p=0,002). Αρνητική ήταν η έκφραση της Bcl-2 στον παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο σε όλες τις περιπτώσεις. (Εικόνα 7) A. Β. Εικόνα 7. Α. Θετική ανοσοχρώση Bcl-2 στα λεμφοκύτταρα (βέλη) του παρακείμενου του όγκου, φυσιολογικού βλεννογόνου (μάρτυρας) (x100). Β. Θετική κυτταροπλασματική χρώση Bcl-2 στα νεοπλασματικά κύτταρα ΚΠΕ (βέλη) (x100). Στον πίνακα 14 φαίνεται η σχέση της έκφρασης Bcl-2 και της διαφοροποίησης των όγκων.