Λοιμώξεις Γαστρεντερικού Συστήματος Οξείες Γαστρεντερίτιδες

Λοιμώξεις Γαστρεντερικού Συστήματος Οξείες Γαστρεντερίτιδες Ελένη Μαλάμου-Λαδά ιευθύντρια Μικροβιολογικού τμήματος Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών«Γ. Γεννηματάς» Αμισθη επίκουρη Καθηγήτρια Πανεπιστημίου Αθηνών Μαθήματα ειδικευομένων στη Βιοπαθολογία 17-11 11-2010

Οξεία γαστρεντερίτις Λοίμωξη του γαστρεντερικού συστήματος βραχείας διαρκείας (< 7 ημερών) που εμφανίζεται με διάρροια, ναυτία, εμέτους και κοιλιακά άλγη ιάρροια Μεταβολή της σύστασης των κενώσεων (μαλακές ή υδαρείς κενώσεις) σε συνδυασμό με την αύξηση της συχνότητας των κενώσεων σε τρεις ή περισσότερες ημερησίως Λοιμώδης διάρροια Οφείλεται σε βακτήρια, ιούς, παράσιτα

Επιδημιολογία Η οξεία γαστρεντερίτις εξακολουθεί να αποτελεί σοβαρό πρόβλημα ημόσιας Υγείας για ολόκληρο τον πλανήτη με αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα κυρίως στις αναπτυσσόμενες χώρες Αποτελεί για τους ενήλικες τη δεύτερη αιτία θανάτου μετά τις καρδιαγγειακές παθήσεις και την πρώτη αιτία θανάτου στην παιδική ηλικία ΗΠΑ: 2-3 επεισόδια διάρροιας /παιδί/έτος Αναπτυσσόμενες χώρες: 6-12 12 επεισόδια διάρροιας/ παιδί/έτος (>9.000 θάνατοι /ημέρα σε παιδιά <5 ετών)

Αίτια οξείας γαστρεντερίτιδας Βακτήρια 40% Ιοί 11% Παράσιτα 1% Άλλα 2% Άγνωστα 46% CDC 1991-2000

Αίτια λοιμώδους διάρροιας Β α κ τ ή ρ ι α Salmonella sp. Shigella sp. Campylobacter sp. Yersinia enterocolitica Aeromonas hydrophila Plesiomonas shigelloides Staphylococcus aureus Bacillus cereus Vibrio sp. Clostridium difficile EPEC ETEC EHEC EIEC EAGGEC

Απομόνωση εντεροπαθογόνων βακτηρίων στον Ελληνικό χώρο Salmonella spp 35% C. jejuni 7% Shigella spp 4% Yersinia enterocolitica 2% Καλλιέργειες (-) 49% Mantzaris et al, Endoscopy 1995

Παθογένεση Η οξεία γαστρεντερίτις είναι το αποτέλεσμα αντιπαράθεσης και διαταραχής της ισορροπίας μεταξύ των αμυντικών μηχανισμών του μεγαλοοργανισμού και των λοιμογόνων παραγόντων του μικροοργανισμού

Παράγοντες μεγαλοοργανισμού Παράγοντες μικροοργανισμού Ηλικία Κοινωνικοοικονομικές συνθήκες Αριθμός μικροοργανισμών Λοιμογόνος δύναμη Προσωπική υγιεινή και καθαριότητα Ανοσολογική κατάσταση Φυσιολογική χλωρίδα

Κύριοι λοιμογόνοι παράγοντες 1. Προσκολλητίνες 2. Εντεροτοξίνες 3. Κυτταροτοξίνες 4. ιεισδυτικότητα 5. Άγνωστοι

Λοιμογόνοι παράγοντες μικροβίων 1. Προσκoλλητίνες Προσκόλληση: αναγκαία και απαραίτητη προϋπόθεση Επιφανειακές πρωτεΐνες που συνδέονται σταθερά με υποδοχείς (σάκχαρα) των κυττάρων Σύστημα Tir/intimin καταστροφή μικρολαχνών των εντεροκυττάρων διαταραχή του κυτταροσκελετού Πρότυπο: EPEC

2. Εντεροτοξίνες Μικροβιακές πρωτεΐνες που δρουν στο επιθήλιο του βλεννογόνου του εντέρου και προκαλούν υδαρή διάρροια χωρίς βλάβη του εντερικού βλεννογόνου Υπάρχουν 2 είδη : Θερμοευαίσθητη (heat labile, LT) Παράγεται από τα Vibrio cholerae αλλά και τα ETEC Θερμοανθεκτική (heat stable, ST) Παράγεται από τα ETEC

Τρόπος δράσης θερμοευαίσθητης εντεροτοξίνης Πρότυπο η χολερική τοξίνη Συνδέεται με ειδικούς υποδοχείς και αυξάνει τα κυκλικά νουκλεοτίδια των εντεροκυττάρων ιεγείρει την αδενυλική κυκλάση και μετατρέπει την διφωσφορική αδενοσίνη σε κυκλική μονοφωσφωρική αδενοσίνη LT ADP αδενυλική κυκλάση camp αναστολή απορρόφησης H2Ο & NaCl Αύξηση έκκρισης υγρού

Τρόπος δράσης θερμοανθεκτικής εντεροτοξίνης (ST) ιεγείρει την γουανυλική κυκλάση και μετατρέπει την διφωσφορική γουανοσίνη σε κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη διάρροια ST GPD γουανυλική κυκλάση cgmp διάρροια

3. Κυτταροτοξίνες Αναστολή πρωτεϊνοσύνθεσης καταστροφή του κυττάρου απορρόφησης μείωση Πρότυπο: Shiga toxin της Shigella dysenteriae serotype 1 Shiga like toxins - Verocytotoxins του EHEC

4. ιεισδυτικότητα ιείσδυση στα κύτταρα δυσεντεροειδές σύνδρομο αιμορραγική διάρροια, βλέννη και λευκοκύτταρα Πρότυπο: Shigella spp από πλασμίδιο ελέγχεται

Παθογενετικoί μηχανισμοί 1. Προσκολλητίνες Οξεία γαστρεντερίτις Θέση δράσης/κλινική εκδήλωση Λεπτό έντερο /εκκριτική διάρροια EPEC Βακτήρια 2. Εντεροτοξίνες 2. (cholera, cholera like) LT ST 3. Κυτταροτοξίνες 3. (Shiga, Shiga like) 4. ιεισδυτικότητα Λεπτό έντερο/υδαρής διάρροια Παχύ έντερο/ φλεγμονώδης κολίτιδα, υσεντερία Παχύ έντερο/ υσεντερικό σύνδρομο Λεπτό έντερο Vibrio cholerae,, ETEC Salmonella spp Campylobacter spp C. difficile toxin A C. perfringens type A Shigella spp Salmonella spp C. difficile toxin B Campylobacter spp Shigella, EIEC Campylobacter Salmonella Yersinia

Πηγή Γαστρεντερικός σωλήνας ανθρώπου/ ζώου όχημα Μολυσμένη τροφή (τροφιμογενής) Μολυσμένο νερό (Υδατογενής) Μολυσμένα χέρια (άτομο σε άτομο) Ξενιστής (Ασθενής)

ιάγνωση οξείας βακτηριακής γαστρεντερίτιδας 1) Κλινική εικόνα: ιάρροια, ναυτία, έμετοι, πυρετός 2) Ιστορικό- Επιδημιολογικά στοιχεία Χρόνος έναρξης Κοιλιακά άλγη τεινεσμός Αιμορραγικές κενώσεις Απώλεια βάρους Κατανάλωση θαλασσινών Ανοσοκαταστολή Πρόσφατο ταξίδι Υποψία επιδημίας 3) Μικροβιολογική διερεύνηση Μακροσκοπική εξέταση κοπράνων Μικροσκοπική εξέταση κοπράνων ή και δοκιμασία λακτοφερρίνης Καλλιέργεια κοπράνων

Μακροσκοπική εξέταση κοπράνων Σύσταση κένωσης (υδαρής, σχηματισμένη, ημισχηματισμένη) Παρουσία βλέννης, αίματος, παρασίτων

Μικροσκοπική εξέταση κοπράνων Μόνιμο παρασκεύασμα (Gram): πυοσφαίρια, χλωρίδα, Campylobacters & Staphylococcus Νωπό παρασκεύασμα (κυανούνκυανούν του μεθυλενίου): πυοσφαίρια, ερυθρά, βλέννη

Λοιμώδης διάρροια Φλεγμονώδης Μη φλεγμονώδης Πυοσφαίρια (+) Πυοσφαίρια (-)

Λοιμώδης διάρροια Μικροσκοπική εξέταση κοπράνων Πυοσφαίρια (+) Πυοσφαίρια (-) Shigella sp. Salmonella sp. Campylobacter sp. EIEC Yersinia enterocolitica C. difficile E. histolytica EPEC ETEC EHEC Vibrio sp. Giardia lamblia Cryptosporidium Rotavirus Adenovirus Norovirus

Μικροβιολογική διερεύνηση λοιμώδους διάρροιας Κατάλληλο δείγμα κοπράνων ύο δείγματα /ασθενή ιαφορετικές ημέρες o Πρόσφατη κένωση (~1gr gr,, 5-10ml) 5 o Ορθικό επίχρισμα σε ρυθμιστικό διάλυμα γλυκερόλης (Ρ Γ) Συνοδό παραπεμπτικό με κλινικές πληροφορίες (όχι περιτύλιγμα) Σωστή μεταφορά και συντήρηση δειγμάτων στο Εργαστήριο 30 min ~2h χωρίς υλικό μεταφοράς Ρ Γ* > 2h2 υλικό μεταφοράς (4-6 ο C) Cary Blair (Phenol red) (1gr 10ml) * Ρ Γ: Βuffer φωσφορικών 0.03Μ Glycerol 1:1, ph:7.0

Θρεπτικά υλικά για την απομόνωση εντεροπαθογόνων βακτηρίων (Salmonella Shigella) Μικρής εκλεκτικότητας Mac Conkey 3 agar (MAC) Eosin methylene blue agar (EMB) Μέσης εκλεκτικότητας Hektoen enteric agar (HEK) Xylose lysine desoxycholate agar (XLD) Desoxycholate citrate agar (DCA) Salmonella Shigella agar (SS)

Θρεπτικά υλικά για την απομόνωση εντεροπαθογόνων βακτηρίων Υψηλής εκλεκτικότητας Bismuth sulfite Brilliant green agar Εμπλουτισμένοι ζωμοί Selenite F broth Gram negative broth (GN)

Μικροβιολογικό Τμήμα ΓΝ Αθηνών «Γ. Γεννηματάς» Καλλιέργεια κοπράνων για κοινά παθογόνα* Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacters Αιματούχο άγαρ Ο 2 35 ο C 24h Mac Conkey agar (No3) Ο 2 35 ο C 24h SS agar Ο 2 35 ο C 24h XLD agar Ο 2 35 ο C 24h CIN** **(Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin) Ο 2 25 ο C 48h Skirrow agar ή CCDA agar 5-10% Ο 2 5-10% CO 2 Selenite broth Ο 2 35 ο C * ιάρροια εντός των 3 πρώτων ημερών νοσηλείας ** Προαιρετικά 42 ο C 48h-72h 18-24h (MAC XLD)

ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΚΟΠΡΑΝΩΝ ΓΙΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΟΙΝΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ (Salmonella, Shigella, Yersinia) ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ 24h Χ Ρ Ο Ν Ο Σ 48h 72h Mac Conkey Νο 3 SS Agar XLD Agar Urea Λακτόζη (-) Άχροες ΚIΑ (Kligler) MC 2 Λακτόζη (-)) (άχροες( άχροες) Urea H 2 S(+) KIA MC N 2 Κόκκινες Κόκκινες με μαύρο κέντρο (-) H 2 S Λακτόζη(-) κεκλιμένη κόκκινη Γλυκόζη (+) βάση κίτρινη ορολ. Salmo,, Shiga(+) Προκαταρκτική ταυτοποίηση Τελική ταυτοποίηση ΑΡΙΑΡΙ Αντιβιόγραμμα (όπως MC 3 ) Urea KIA (ως( MC 3 ) N 2 Selenite broth MC 3 XLD Urea KIA N 2

Ταυτοποίηση Salmonella Salmonella spp, Shigella spp, Yersinia enterocolitica Βιοχημικές ιδιότητες (API, Crystal, κλπ) Ορολογικές ιδιότητες( Αντιοροί)

Ορολογική τυποποίηση Salmonella spp στο Μικροβιολογικό Νοσοκομειακό Εργαστήριο * Ορότυποι O Αντιγόνα phase 2 * * H-phase 1 H-phase 2 Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi A Salmonella Paratyphi B (D) 9, 12 (Vi) d - (A) 1,, 2, 12 a [1, 5] 5 (B) 1,, 4, (5), 12 b [1, 2] 2 Salmonella Typhimurium (B) 1,, 4, (5), 12 i 1, 2 Salmonella Enteritidis D 1,, 9, 12 g, m - *ΕπίΕπί αμφιβολιών, αρνητικού αποτελέσματος και για επιβεβαίωση Αναφοράς Σαλμονελλών-Σιγκελλών Σιγκελλών * * H-phase 2 Κέντρο Αναφοράς αποστολή στο Κέντρο

Ορολογική τυποποίηση Shigella spp * 1. S. dysenteriae (group Α ): 10 ορότυποι* 2. S. flexneri (group Β): 6 ορότυποι 3. S. boydii (group C): C 15 ορότυποι 4. S. sonnei (group D): D 1 ορότυπος * Επί αμφιβολιών, αρνητικού αποτελέσματος και για επιβεβαίωση, αποστολή στο Κέντρο Αναφοράς Σαλμονελλών, Σιγκελλών * Η Shigella dysenteriae serotype 1 προκαλεί τη βαρύτερη μορφή δυσεντερίας

Ταυτοποίηση Yersinia enterocolitica Βιοχημικές αντιδράσεις Kligler ( ΚΙΑ ) Προκαταρκτικές Λακτόζη (-) Alk (κόκκινο) Γλυκόζη (+) Acid (κίτρινο) Τελική (API 20 E) Urea ± Κινητικότητα 22 0 C (κινητό) 35 0 C (ακίνητο) Ορολογικές αντιδράσεις Ο: : 3 Ο: : 9

Αναζήτηση Campylobacters στα κόπρανα Μικροσκοπική εξέταση κοπράνων Καλλιέργεια κοπράνων Skirrow agar (Vanco+Trimetho+Polymyxine( B) CCDA (charcoal + cefoperazone + desoxycholate agar) Επώαση 42 ο C x 48h σε ειδικές μικροαερόφιλες συνθήκες (5-10% 10%Ο 2, 5-10% 5 CO 2 )

Ταυτοποίηση Campylobacters Μορφολογία αποικιών Μορφολογία σε Gram χρώση Βιοχημικές ιδιότητες Καταλάση (+) Οξειδάση (+) Υδρόλυση ιππουρικού Νa a (±)( Αντοχή σε Cephalothin Ευαισθησία σε Nalidixic acid

Ταυτοποίηση Campylobacters jejuni coli Καταλάση + + + Οξειδάση + + + Ανάπτυξη 42 ο C + + + Ανάπτυξη 25 ο C - - - Αντίδραση indoxylacetate lari + + - Ανάπτυξη σε Nacl 1,5% - - + Υδρόλυση ιππουρικού Na + - - Nalidixic acid Ε; Ε Α Cephalothin Α Α Α H2S (TSI agar) - - + Urea (ουρεάση( ουρεάση) - - ±

Αναζήτηση Vibrio στα κόπρανα Θρεπτικά υλικά Αλκαλικό πεπτονούχο H 2 O 1gr κόπρανα 10 ml υλικού 24h TCBS TCBS (Thiosulfate( Citrate Bile Sucrose agar) Vibrio cholerae κίτρινες αποικίες Vibrio parahemolyticus μπλέ ή πράσινες αποικίες

E.coli 1. Εντεροπαθογόνα (EPEC) 2. Εντεροτοξινογόνα (EΤEC) EC) ιαρροιογόνα E. coli Νόσος ιάρροια βρεφών σε αναπτυσσσόμενες χώρες ιάρροια ταξιδιωτών Μικροβιολογικός έλεγχος Ορότυποι Ειδικοί ανιχνευτές γόνων/ πλασμιδίων Κέντρα Αναφοράς Οροτυπία Ανίχνευση εντεροτοξινών (LT, ST) Ειδικοί ανιχνευτές Κέντρα Αναφοράς 3. Εντεροδιεισδυτικά (EΙEC) EC) 4. Εντεροπροσκολλητικά (EAggEC) 5.Εντεροαιμορραγικά (EHEC) Αιμορραγική διάρροια Χρόνια διάρροια/ παιδιά σε αναπτυσσσόμενες χώρες Νόσος hamburger/barbeque Αιμολυτιικό ουραιμικό σύνδρομο Οροτυπία (Ο 28 : NΜ) Aνιχνευτές για πλασμίδια διεισδυτικότητας Κέντρα Αναφοράς Κέντρα Αναφοράς Ανίχνευση τοξινών EIA Καλλιέργεια κοπράνων

ιάρροια από Εντεροαιμορραγικά E.coli (EHEC) Νόσος hamburger ή barbeque 1982 ύο επιδημίες ΗΠΑ Κλινική εικόνα: έντονα κοιλιακά άλγη χωρίς πυρετό, αρχικά υδαρής διάρροια που εξελίσσεται σε αιμορραγική ( αιμορραγία κατώτερου πεπτικού) Αίτιο: E. coli που παράγουν Verocytotoxins (Shiga like) ορότυπος O157: Η7 Πηγή: έντερο βοειδών Ριβόσωμα Αναστολή πρωτεϊνοσύνθεσης Επιπλοκές: Αιμολυτικό ουραιμικό σύνδρομο το συχνότερο αίτιο νεφρικής ανεπάρκειας στα παιδιά των χωρών της ύσης

Μικροβιολογική προσέγγιση διάρροιας από EHEC 1. Άμεση αναζήτηση των Verocytotoxins (VT 1, VT 2 ) στα κόπρανα ή μετά εμπλουτισμό σε ζωμό 2. Καλλιέργεια κοπράνων σε ειδικό εκλεκτικό υλικό (SorbitolSorbitol Mac Conkey agar- SMAC)

Αναζήτηση ΕΗΕC στα κόπρανα Sorbitol Mac Conkey agar (SMAC) άχροες αποικίες Αιματούχο α) οξειδάση (-), ινδόλη (+), MUG(-) β) latex O 157 (+) γ) ΑΡΙ (E. coli) δ) Έλεγχος τοξινών (ΕΙΑ)

Αναφορά αποτελέσματος καλλιεργείας κοπράνων Αρνητική για Salmonella Shigella Yersinia enterocolitica Campylobacter sp. Απομονώθηκε π.χ. Salmonella typhi ή Campylobacter jejuni Mεγάλη ή αποκλειστική ανάπτυξη S. aureus, P. aeruginosa, Candida, Klebsiella Καμμία ανάπτυξη Συνιστάται επανάληψη Πτωχή φυσιολογική χλωρίδα (απουσία Gram- αερόβιων, βακτηριδίων) Συνιστάται επανάληψη (Αναγράφεται επί πλέον η μικροσκοπική εξέταση: πυοσφαίρια, ερυθρά) Ημερομηνία αποτελέσματος Υπογραφή ιατρού

Θεραπευτική αντιμετώπιση οξείας βακτηριακής γαστρεντερίτιδας Αίτιο Πρώτη επιλογή εύτερη επιλογή Παρατηρήσεις Salmonella εν απαιτείται Κινολόνες per os επί 3-5 d Θεραπεία βακτηριαιμία Shigella Κινολόνες per os επί 5 d TMP-SMX ή Ampicillin Αντοχή Azithromycin για 5 d Campylobacter Κινολόνες per os επί 5 d Μακρολίδες ή οξυκυκλίνη Θεραπεία σε σοβαρές περιπτώσεις Αντοχή σε κινολόνες EHEC εν απαιτείται ETEC Κινολόνες per os επί 1-3 d TMP-SMX ή οξυκυκλίνη EIEC Κινολόνες per os επί 1-3 d TMP-SMX ή οξυκυκλίνη Yersinia Κινολόνες per os επί 7-10 d TMP-SMX ή οξυκυκλίνη

Νόσος εντέρου από Clostridium difficile 1935: Bacillus difficilis 1977-78: 78: Clostridium difficile ~ ιάρροια/κολίτιδα από αντιβιοτικά ~ Νόσος εντέρου από C. difficile 2005: Υπερλοιμογόνο C. difficile Επιδημίες σε Β. Αμερική & Ευρώπη

Μορφές της νόσου από C. difficile Απλή διάρροια Μη ειδική κολίτιδα Ψευδομεμβρανώδης κολίτιδα Τοξικό μεγάκολο ιάτρηση εντέρου Περιτονίτιδα Σήψη Θάνατος

Παθογένεση της νόσου του εντέρου από C. difficile 1. Προδιαθεσικοί παράγοντες ιαταραχή των τοπικών αμυντικών μηχανισμών της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου (colonization resistance) ιαταραχή της γενικής άμυνας του μεγαλοοργανισμού Αντιβιοτικά Κυτταροστατικά φάρμακα Χειρουργικές επεμβάσεις στο έντερο Υποκλυσμοί Παραμονή επί μακρόν ρινογαστρικών καθετήρων Αναστολείς των Η 2 ισταμινικών υποδοχέων Μεγάλη ηλικία Σοβαρή υποκείμενη νόσος 2. Αποικισμός του εντέρου από C. difficle Ενδογενείς Eξωγενείς πηγές (νοσοκομειακό περιβάλλον) 3. Λοιμογόνοι παράγοντες του μικροβίου Τοξίνες

Clostridium difficile Παθογόνος δράση Τοξίνες υαδική? Τοξίνη Α (εντεροτοξίνη) Τοξίνη Β (κυτταροτοξίνη)

Επιδημιολογία της νόσου από C. difficile Σποραδικά κρούσματα Νοσοκομειακές επιδημίες ιάρροια κοινότητας

Ταυτοποίηση C. difficile Προκαταρκτική ταυτοποίηση Μορφολογία (365 nm) αποικιών φθορισμός UV Μορφολογία (Gram χρώση) Οσμή κρεσόλης μικροβιακών κυττάρων

Τελική ταυτοποίηση C. difficile Έλεγχος βιοχημικών ιδιοτήτων Λιπάση, λεκιθινάση (-) Γλυκόζη, φρουκτόζη (+) Ζελατίνη, Εσκουλίνη (+) API 20A, API 32 ID, Crystal anaerobe, RapIDANA

Αναζήτηση τοξινών Α & Β στα κόπρανα και στα απομονωθέντα στελέχη Τοξίνη Α Τοξίνες Α+Β Τοξίνη Β - Ανοσοχρωματογραφία - ELISA -Ανοσοχρωματογραφία - Κυτταροκ/α (Μέθοδος αναφοράς) -Ανοσοχρωματογραφία Α+Β θετικές Α αρνητική τότε Β θετική Έμμεσα Γόνοι τοξινών (tcda & tcdb) Real time PCR

Θεραπεία διάρροιας και κολίτιδας Ήπιες μορφές από C. difficile ιακοπή του υπεύθυνου αντιβιοτικού (εάν χορηγείται) Metronidazole 250mg/6h X 10 ημέρες PO (εκλογής) Vancomycin 125mg/6h X 10 ημέρες PO (εναλλακτικά) ΨΜΚ Vancomycin 125-250mg/6h 250mg/6h X 10 ημέρες PO