ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΠΡΟΦΙΛ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΩΡΟΝΩΝ O. Σερίφη, Α. Ο. Χατζηβασιλείου, Μ. Όξενκιουν-Πετροπούλου, Α. Δέτση Σχολή Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ, Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 15780 Αθήνα Π. Κεφάλας Τμήμα Ποιότητας Τροφίμων και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Μεσογειακό Αγρονομικό Ινστιτούτο Χανίων, 73100 Χανιά, Κρήτη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία παρασκευάστηκαν ωρόνες οι οποίες περιέχουν ομάδες υδροξυλίου ως υποκαταστάτες στους δύο αρωματικούς δακτυλίους, μέσω αντίδρασης οξειδωτικής κυκλοποίησης των αντίστοιχων χαλκονών. Μελετήθηκε η ηλεκτροχημική συμπεριφορά των ωρονών σε υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα διαφορετικών ph χρησιμοποιώντας κυκλική βολταμμετρία (CV) σε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα. Ως συνέχεια των πειραμάτων αυτών έγινε προσπάθεια συσχέτισης των ηλεκτροχημικών παραμέτρων με την αντιοξειδωτική δράση των παραγώγων. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι ωρόνες [(Ζ)-2-βενζυλιδενοβενζοφουραν-3-(2Η)-όνες] είναι φυσικά προϊόντα που ανήκουν στην οικογένεια των φλαβονοειδών και απαντούν σπάνια στη φύση. Έχουν αναφερθεί περίπου 100 είδη ωρονών σε περίπου 21 οικογένειες ανθοφόρων φυτών, καθώς και σε μερικές φτέρες, βρύα και θαλάσσιες καφέ άλγες [1,2]. Βιοσυντίθενται από τις χαλκόνες μέσω του ενζύμου συνθάση της ωρεοσιδίνης και προσδίδουν το φωτεινό κίτρινο χρώμα σε ορισμένα άνθη (Antirrhinum majus, Scrophulariaceae, Coreopsis sp., Comos sp., Dahlia sp.). Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα ωρονών που απομονώνονται από φυσικές πηγές είναι η ωρεοσιδίνη, η σουλφουρετίνη και η μαριτιμετίνη (Σχήμα 1), που περιέχουν ομάδες υδροξυλίου σε διαφορετικές θέσεις του βενζοφουρανικού συστήματος. Σχήμα 1: Παραδείγματα πολυ-υδροξυλιωμένων ωρονών που απομονώνονται από φυσικές πηγές. Οι φυσικές και συνθετικές ωρόνες διαθέτουν αντιπαρασιτική, αντιοξειδωτική, αντικαρκινική, αντιπαρασιτική και αντιβακτηριακή δράση, παρουσιάζουν επομένως μεγάλο ενδιαφέρον στην ανάπτυξη έρευνας για την παραγωγή νέων βιοδραστικών ενώσεων [3,4]. Οι φυτικοί και ζωικοί οργανισμοί έχουν στην κατοχή τους ένα ευρύ φάσμα μηχανισμών για την αντιμετώπιση αυτών των ελεύθερων ριζών. Στα φυτά και τα ζώα αυτές οι ελεύθερες ρίζες απενεργοποιούνται από τα αντιοξειδωτικά, τα οποία δρουν ως αναστολείς της διαδικασίας οξείδωσης, ακόμη και σε σχετικά μικρή συγκέντρωση, και ως εκ τούτου έχουν ποικίλο φυσιολογικό ρόλο στο σώμα. Τα αντιοξειδωτικά ενεργούν ως αποικοδομητές, μετατρέποντας τις ελεύθερες ρίζες σε λιγότερο δραστικές ενώσεις. Τα αντιοξειδωτικά που χρησιμοποιούνται παραδοσιακά για να αναστείλουν την οξείδωση στα τρόφιμα, καθώς και για να αδρανοποιήσουν τις επικίνδυνες ελεύθερες ρίζες και να αποτρέψουν τις αλυσιδωτές
οξειδώσεις in vivo, θεωρούνται από πολλούς ως η φυσική λύση για το περιβαλλοντικό και φυσιολογικό στρες, τη γήρανση, την αρτηριοσκλήρυνση και τον καρκίνο. Ο ρόλος που καλούνται να διαδραματίσουν τα φυσικά αντιοξειδωτικά είναι διττός και έγκειται τόσο στη συντήρηση των τροφίμων όσο και στη μεγιστοποίηση των ωφέλιμων επιδράσεων στην υγεία. Για το λόγο αυτό, η αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των καθαρών μεμονωμένων ενώσεων και των ανάμικτων εκχυλισμάτων, καθώς και η βελτιστοποίηση των εφαρμογών τους, αποτελεί σημαντική πρόκληση τα τελευταία χρόνια. Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες συνδέονται με τα οξειδοαναγωγικά χαρακτηριστικά, επομένως η γνώση της οξειδοαναγωγικής συμπεριφοράς των μορίων είναι πολύ σημαντική για τον προσδιορισμό του μηχανισμού της ηλεκτροχημικής οξείδωσης των μορίων αλλά και τη συσχέτιση αντιοξειδωτικής δράσης-ηλεκτροχημικού προφίλ [5]. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η ηλεκτροχημική μελέτη των ωρονών πραγματοποιήθηκε με το πολαγραφικό σύστημα 797 VA Computrace (Metrohm). Στα πλαίσια αυτής της μελέτης ως ηλεκτρόδιο εργασίας χρησιμοποιήθηκε το ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα (GC), το σύστημα ηλεκτροδίων του πολαρογράφου συμπληρώνουν ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl, πληρωμένο με υδατικό διάλυμα 3M KCl ( 99.5%p.a.,Merck) σε δις απιονισμένο νερό από τη συσκευή EASYpure II (Model D 7381, Barnsted International), και ένα βοηθητικό ηλεκτρόδιο Pt. To ηλεκτρόδιο εργασίας γυαλίζεται κάθε φορά πριν την μέτρηση με σκόνη αλούμινας (0.3μm) για 3min χρησιμοποιώντας πανί γυαλίσματος και ξεπλένεται με απιονισμένο νερό και αιθανόλη. Επιπλέον στο τέλος κάθε πειραματικής μέρας το ηλεκτρόδιο τοποθετείται σε λουτρό υπερήχων για 5 min, πρώτα σε απιονισμένο νερό και μετά σε ακετόνη. Η κατάσταση του ηλεκτροδίου ελέγχεται με διάλυμα σιδηροκυανιούχου καλίου. Ειπλέον για τις μετρήσεις της κυκλικής βολταμμετρίας χρησιμοποιήθηκαν υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα τριών διαφορετικών ph: ph 7.4 για την προσομοίωση φυσιολογικών συνθηκών, ph 4.0 και ph 11.0. H ηλεκτροχημική μελέτη των ενώσεων έγινε σε θερμοκρασία δωματίου (22±1 ο C) και οι τελικές συγκεντρώσεις των ωρωνών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 1.0mM, σε κυψελίδα Metrohm των 10mL. Η περιοχή σάρωσης των κυκλικών βολταγραμμογραφημάτων ήταν -500 εώς 1100mV ενώ ο ρυθμός σάρωσης 20mVs -1. Όλες οι μετρήσεις διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν και ελήφθη η μέση τιμή. Οι ωρόνες 2a-2c που μελετήθηκαν παρασκευάστηκαν σε δύο στάδια: αρχικά, μέσω αντίδρασης οξειδωτικής κυκλοποίησης των αντίστοιχων χαλκονών, χρησιμοποιώντας ως καταλύτη οξικό υδράργυρο σε διαλύτη πυριδίνη, σε θερμοκρασία 110 o C παρασκευάστηκαν οι ωρόνες 1a-1c (Σχήμα 2). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε απομάκρυνση της μεθυλοομάδας από τους μεθοξυ-υποκαταστάτες των ωρονών 1a-1c. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα υπό την επίδραση τριβρωμιούχου βορίου σε διαλύτη διχλωρομεθάνιο, και παρέχει τα τελικά προίόντα 2a-2c σε καθαρή μορφή, μετά από κατάλληλη επεξεργασία. Σχήμα 2: Σύνθεση των ωρονών 2a-2c.
Επίσης, μελετήθηκε η φυσική ωρόνη ωρεοσιδίνη (2d, Σχήμα 1), της οποίας η σύνθεση πραγματοποιήθηκε με βάση τη μέθοδο που έχει αναπτυχθεί στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, ΕΜΠ[3]. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η ηλεκτροχημική συμπεριφορά των εξεταζόμενων μορίων μελετήθηκε σε υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα διαφορετικών ph (ph 7.4, 4.0, 11.0) χρησιμοποιώντας κυκλική βολταμμετρία (CV) σε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα, το οποίο έχει επιλεγεί ως ηλεκτρόδιο εργασίας και σε ανάλογες μελέτες [5,6,7]. Η συγκέντρωση των βιοδραστικών μορίων ήταν 0.01Μ σε διαλύτη αιθανόλη. Στις βολταµµετρικές τεχνικές, παράµετρος ελέγχου είναι το δυναµικό το οποίο εφαρµοζόµενο εξωτερικά στην ηλεκτροχηµική κυψέλη προκαλεί τη διέλευση ρεύµατος όταν διεξάγεται µια ηλεκτροχηµική αντίδραση. Έτσι καταγράφεται το δυναμικό ανόδου (anodic peak potential, Ε pa ) και το δυναμικό καθόδου (cathodic peak potential, Ε pc ). Όσο μικρότερη είναι η τιμή του δυναμικού ανόδου της εξεταζόμενης ένωσης τόσο λιγότερη ενέργεια χρειάζεται για να οξειδωθεί, οπότε παρουσιάζει και καλή αντιοξειδωτική δράση. Πίνακας 1. Ανοδικά (Ε pa ) και καθοδικά (E pc ) δυναμικά των ωρονών. ph 4.0 ph 7.4 ph 11.0 E p (mv) Ένωση E p1a E p2a E p1c E p2c E p1a E p2a E p1c E p2c E p1a E p2a E p1c E p2c 386,77 703,42 349,57 _ 183,31 403,04 171,66 _ 352,88 572,05 405,93 _ 332,94 _ 215,08 _ 125,84 _ 77,96 _ -17,89 _ 140,16 367,47 302,65 106,72-28,01 203,91 102,28-132,25 34,62 _ -63,46 _ 403,22 _ 258,65 _ 190,21 _ 69,14 _ -46,3 _ -96,26 _
Από την ομάδα ωρονών που μελετήθηκαν, όλες οι ενώσεις παρουσίασαν αντιστρεπτή οξειδοαναγωγική δράση. Για τις ενώσεις που περιέχουν κατεχολικό σύστημα στις θέσεις 3 και 4 του δακτυλίου Β (ωρόνες 2b και 2d) παρατηρείται ότι με την αύξηση του ph (Πίνακας 1, Εικόνα 1) το δυναμικό οξείδωσης μετατοπίζεται προς χαμηλότερες τιμές (κατά 328mV και 449mV, αντίστοιχα). Οι ενώσεις 2b και 2d παρουσιάζουν καλύτερη αντιοξειδωτική δράση σε βασικό ph, με την ωρεοσιδίνη 2d να εμφανίζει ιδιαίτερα χαμηλή τιμή δυναμικού οξείδωσης σε αυτό το ph (-46.3mV). Το γεγονός αυτό εξηγείται από την παρουσία τεσσάρων ιονιζόμενων ομάδων υδροξυλίου σε αυτή την ένωση. Οι ωρόνες 2c, η οποία περιέχει τις δύο ομάδες υδροξυλίου στις θέσεις 2 και 3 του δακτυλίου Β, και 2a που έχει μόνο ένα φαινολικό υδροξύλιο εμφανίζουν τη βέλτιστη αντιοξειδωτική δράση τους στο φυσιολογικό ph 7,4, με την ωρόνη 2c να έχει την καλύτερη δράση από όλες τις ωρόνες που εξετάστηκαν σε αυτό το ph. Εικόνα 1: Κυκλικά βολταμμογραφήματα του μορίου 2d σε ρυθμιστικά διαλύματα ph 7.4, 4 και 11 αντίστοιχα. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η αντιοξειδωτική δράση των φαινολικών ενώσεων παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της εξάρτησης της από το ph και το δυναμικό οξειδοαναγωγής. Η κυκλική βολταμμετρία είναι μια τεχνική εύκολη και χρήσιμη στην αξιολόγηση της οξειδοαναγωγικής συμπεριφοράς των διαφόρων αντιοξειδωτικών μορίων και των παραγόντων που συμβάλλουν σε αυτές τις ηλεκτροχημικές αντιδράσεις. Περαιτέρω πειράματα για τη διευκρίνιση του μηχανισμού της ηλεκτροχημικής οξειδοαναγωγής των ωρονών που εξετάστηκαν είναι υπό εξέλιξη. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Markham K.R., Geiger H., J.B. (Ed.), The Flavonoids Advances in Research since 1986. Chapman and Hall, London, (1994), p 441. [2] Ur-Rahman A., Choudhary M.I., Hayat S., Khan A.M., Ahmed A., Chem. Pharm. Bull. 49:105 (2001). [3] Detsi Α., Majdalani M., Kontogiorgis C.A., Hadjipavlou-Litina D., Kefalas P., Bioorg.
Med. Chem. 17:8073 (2009). [4] Roussaki Μ., Costa Lima S., Kypreou A.-M., Kefalas P., Cordeiro da Silva A., Detsi A., Int. J. Med. Chem, Article ID 196921, doi:10.1155/2012/196921 (2012). [5] Serifi O., Tsopelas F., Kypreou A.-M., Ochsenkühn-Petropoulou M., Kefalas P., Detsi A., J. Phys. Org. Chem. 26:226 (2013). [6] Santos M.M.C., Garcia M. B. Q., Silva A.M.S., Santus R., Moliére P., Fernades E., Tetrahedron letters 54:85 (2013). [7] S. Mannino, O. Brenna, S. Buratti, M. S. Cosio, Electroanalysis, 10:908 (1998).