Molecular Analysis of trnaglu, Trp, Ala, Asp Genes of mtdna in Patients with Long QT Syndrome Mehri Khatami 1, Monireh Eghbali Ebrahimabadi 2 1 Department of Biology, Faculty of Science, Yazd University, Yazd, Iran 2 MSc in Genetics, Department of Biology, Faculty of Science, Yazd University, Yazd, Iran (Received March 10, 2013 ; Accepted August 9, 2014) Abstract Background and purpose: Long QT syndrome is a heart arrhythmia identified by prolongation of the QT interval which is a cause of sudden cardiac death in young individuals. In most cases, abnormalities in heart repolarization are reasons of prolongation of action potential and arrhythmia. The activity of ion channels is sensitive to ATP level, therefore, mitochondrial disorders are considered to be very important. The purpose of this study was to investigate the areas of mtdna that are identified as hot spots in most cardiac diseases. Material and Methods: Total DNA was extracted from the peripheral blood of 30 patients with LQT syndrome and 35 normal persons. Mitochondrial trna Trp-Ala-Apn-Glu genes and cytochrome b gene were amplified by polymerase chain reaction (PCR). Then, PCR fragments were screened for singlestrand conformation polymorphism analysis (SSCP) and all positive samples were sequenced. Results: We observed a homoplasmic and conserved T14687C mutation in the mitochondrial trna glutamic acid gene in one patient with pervious syncope. We found a homoplasmic C14766T transition in five patients that changed threonine to isoleucine substitution at amino acid 7. Also, we found a heteroplasmy G14838A mutation in mitochondrial cytochrome b gene which is nonsense and changed tryptophan to a stop codon in position 31. Conclusion: Mitochondria ATP synthesis is important in heart, therefore, it is possible that mutations in mitochondrial genes could constitute a predisposing factor in combination with environmental factors and may also trigger the syncope in patients with L QT. Keywords: Long QT syndrome, mitochondrial trna, mutation, PCR-SSCP J Mazandaran Univ Med Sci 2014; 24(116): 141-148 (Persian). 141
پژوهشي مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران دوره بيست و چهارم شماره 116 شهريور سال (141-148) 1393 بررسي مولكولي trna هاي اسيد گلوتاميك تريپتوفان آلانين وآسپارژين درژنوم ميتوكندري بيماران مبتلا بهسندرم Long QT در مقايسه با گروه كنترل چكيده سابقه و هدف: 1 مهري خاتمي 2 منيره اقبالي ابراهيم آبادي سندرم( LQT ) Long QT نوعي آريتمي قلبي است كه با طويل شدن فاصله QT شناسايي ميشود و منجر به مرگهاي ناگهاني در افراد جوان ميگردد. در اغلب موارد اختلال در رپلاريزاسيون قلب منجر به طولاني شدن پتانسيل عمل و آريتمي ميشود. چون كانالهاي يوني قلب با مصرف انرژي كار ميكنند اختلالات ميتوكندري در آنها از اهميت خاصي برخوردار است. هدف اين مطالعه بررسي بخشهايي از mtdna است كه در اكثر بيماريهاي قلبي به عنوان نقاط داغ معرفي شدهاند. مواد و روش ها: DNA ژنومي از نمونههاي خون محيطي 30 بيمار LQT و 35 فرد سالم استخراج گرديد. قطعات ژني trna Trp-Ala-Asn-Glu و سيتوكروم b با Reaction(PCR) Polymerase Chain استفاده از SSCP انجام شد و نمونههايي كه داراي الگوي باندي متفاوت بودند تعيين توالي شدند. تكثير شد. سپس غربالگري جهشها با يافته ها: در اين مطالعه جهش هموپلاسمي و حفاظت شده T14687C در trna گلوتاميك اسيد در يك بيمار با سابقه سنكوب ديده شد. جهش هموپلاسمي ديگري در C14766T در 5 بيمار پيدا شدكه اين جهش اسيدآمينه تري ونين را با ايزولوسين در هفتمين اسيد آمينه جايگزين ميكرد. همچنين جهش بيمعني و هتروپلاسمي G14838A در ژن سيتوكروم b پيدا شد كه باعث تغيير اسيدآمينه تريپتوفان در موقعيت 31 به كدون انتهايي ختم ميشود. استنتاج: به دليل اهميت توليد ATP در قلب جهش در ژنهاي ميتوكندريايي ممكن است همراه با عوامل محيطي در افزايش وخامت سندرم LQT نقش داشته باشند. واژه هاي كليدي: سندرم trna Long QT ميتوكندريايي جهش PCR-SSCP مقدمه سندرم QT(LQT) Long يك اختلال آريتموژنيك نادر است كه با طويل شدن فاصله QT در الكتروكارديوگرام (ECG) قابل تشخيص است. بيماران بهطور جدي در معرض مرگ ناگهاني قلبي حتي در صورت داشتن قلب سالم مي باشند( 1 2). تظاهرات اين سندرم شامل حمله قلبي طپش قلب و سنكوپ است و LQTs مستعد Torsade de Pointes بطني هستند و معمولا زماني اتفاق ميافتد كه فرد در شرايط استرسهاي E-mail: m.khatami@yazd.ac.ir تاريخ تصويب : 1393/5/18 مولف مسي ول: مهري خاتمي- يزد- گروه زيست شناسي دانشكده علوم پايه دانشگاه يزد 1. استاديار گروه زيست شناسي دانشكده علوم پايه دانشگاه يزد 2. كارشناس ارشد ژنتيك گروه زيست شناسي دانشكده علوم پايه دانشگاه يزد تاريخ دريافت : 1392/12/19 تاريخ ارجاع جهت اصلاحات : 1393/3/19 142 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران
پژوهشي مهري خاتمي و همكار روحي يا جسمي باشد. اين در حالي است كه فرد جوان بوده و سلامت عمومي بالايي داشته باشد. مرگ و مير بالا و نشانههاي اندك اين سندرم پزشكان را در تشخيص و دنبال كردن علايم براي غربالگري بيماران دچار مشكل كرده است( 3 4). فاصله QT در الكتروكارديوگرام نمايانگر زمان رپلاريزه شدن بطنها است.طول اين فاصله در افراد به عوامل متعددي مانند سن جنسيت بيماريهاي قلبي مصرف داروهاي مختلف و عملكرد عمومي قلب بستگي دارد ولي بهطور متوسط بايد كمتر از 480 ميليثانيه باشد. درحاليكه در افراد مبتلا به اين سندرم در شرايط استرسهاي محيطي به حدود 550 تا 600 ميليثانيه مي رسد و بعد از رهايي از اين شرايط استرسزا به مقدار طبيعي خودش بازميگردد( 5 ). مطالعات مولكولي ثابت كرده است كانالهاي يوني كه فعاليت الكتريكي قلب را كنترل ميكنند در بروز LQTs نقش دارند و در اين ارتباط جهشهايي در ژنهاي كد كننده كانالهاي سديم و پتاسيم قلب شناسايي شده است( 6 7). با اين وجود براي تقريبا 30 تا 40 درصد موارد بيماري نميتوان جهشهاي كانالهاي يوني را مسي ول دانست و احتمال دارد علاوه بر ژنوم هستهاي mtdna نيز در وخامت بيماري سهم داشته باشد( 4 8). چون كانالهاي يوني قلب به انرژي اكسيداتيو توليد شده در ميتوكندريها بسيار وابستهاند هرگونه نقص در كمپلكسهاي زنجيره تنفسي مستقيما باعث اختلال در عملكرد قلب ميشود( 9 10 ).جهشهاي مختلفي در گروههاي ژنتيكي و قوميتي متفاوت وجود دارند كه اين موضوع از نظر شخصيسازي درمان و تشخيصهاي مولكولي اهميت زيادي دارد( 11 ). جهش در ژنهاي trna معمولا باعث نقص در عملكرد كمپلكسهاي I وIII و همين طور كمپلكس سيتوكرومc اكسيداز (IV) ميشود و روي سنتز ATP مو ثر است. اما روي كمپلكس II به دليل اينكه تمام زير واحدهايش توسط ژنهاي هستهاي كد ميشود تا ثيري ندارد( 12 13). هدف از اين تحقيق مطالعه بخشي از ژنوم ميتوكندري حاوي ژنهاي مربوط به trna هاي تريپتوفان آلانين آسپارژين و گلوتاميك اسيد و بخشي از سيتوكروم b با استفاده از روش PCR-SSCP است. دليل انتخاب اين نواحي از ژنوم ميتوكندري اين است كه اين ژنها غالبا در بيماريهاي قلبي مانند كارديوميوپاتي به عنوان نقاط داغ معرفي ميشوند. مواد و روش ها اين مطالعه از نوع مورد- شاهدي بوده كه با نمونههاي در دسترس انجام گرفته است. در اين تحقيق 30 بيمار مبتلا به LQTsو 35 فرد سالم كه هيچ سابقه خانوادگي از بيماريهاي قلبي- عروقي نداشتند مورد مطالعه قرار گرفتند. مبناي تشخيص باليني اين سندرم بر اساس مشاهدات الكتروكاريوگرام و سابقه خانوادگي از سكته قلبي بود. طيف سني بيماران مورد مطالعه 9 تا 54 سال بود كه 11 نفر از بيماران مرد و بقيه زن بودند. 5 نفر از اين بيماران سابقه سنكوب داشتندكه منجر به مرگ نشده بود (جدول شماره 1). جدول شماره 1 : مشخصات بيماران مبتلا به سندرم LQT و افراد كنترل تعداد سن* جنسيت (مذكر)** مشخصهي اصلي سن بروز سنكوپ معيار بيماران 30 افراد كنترل 35 25±5/8 15 24±5/6 11 5 مرد داراي سابقه نكوپ بدون سابقه يماري هاي قلبي و ميتوكندريايي - * P value = 0.545 **P value = 0.799 9-43 اين بيماران از بين افراد مراجعه كننده به كلينيك آريتمي تهران انتخاب شدند. افراد كنترل از نظر سني و قوميت با نمونههاي بيماران مطابقت داشتند. اين افراد كساني بودند كه هيچگونه علامتي از بيماريهاي قلبي و حتي بيماريهاي ميتوكندريايي نداشتند. همين طور نمونهگيري خون و انجام طرح از كميته اخلاق در پژوهش زيست شناسي- دانشگاه يزد مجوز لازم كسب كرده بود و تمام افراد مورد مطالعه رضايتنامه تدوين شده را آگاهانه امضا كردند. مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران 143
بررسي مولكولي trna هاي اسيد گلوتاميك استخراج DNA و واكنش زنجيره اي پليمراز استخراج DNA از نمونه خون افراد بيمار و شاهد با روش استاندارد رسوب نمكي انجام گرفت( 14 ). براي تكثير دو قطعه ژن كه اولي شامل ژنهاي Asn و دومي شامل ژنهاي trna Trp-Ala- trna Glu و سيتوكروم b بود دو جفت پرايمر طراحي شد (جدول شماره 2). هر واكنش (PCR)Polymerase Chain Reaction با حجم نهايي 25 µl حاوي مواد زير با غلظت نهايي بافر PCR به ميزان 1x پرايمر Mgcl2 0/4 µm با غلظت dntps 1/5 mm با غلظت 0/2 mm آنزيم Taq DNA Polymerase با غلظت نهايي 0/05 U/µl و DNA حدود 100ng انجام شد. تمامي تركيبات (به جز پرايمرها كه از شركت تكاپوزيست ايران تهيه گرديد) از شركت سيناكلون تهيه شد. برنامه تنظيمي واكنشهاي PCR براي به دست آوردن ميزان اپتيمم DNA به شرح زير است: مرحله اول شامل: دناتوراسيون اوليه در دماي 94 درجه سانتيگراد به مدت 5 دقيقه دناتوراسيون ثانويه در دماي 94 درجه سانتيگراد به مدت 30 ثانيه. مرحله اتصال در دماي 57/5 درجه سانتيگراد به مدت 30 ثانيه. مرحله گسترش در دماي 72 درجه سانتيگراد به مدت 30 ثانيه و گسترش نهايي در دماي 72 درجه سانتيگراد به مدت 5 دقيقه. واكنش هايPCR در 30 سيكل انجام شد. آناليز مولكولي و PCR-SSCP براي تشخيص جهشهاي نقطهاي هتروپلاسمي و هموپلاسمي در ژنوم ميتوكندري از روش PCR-SSCP استفاده شد. حساسيت روش SSCP آنقدر بالا است كه قادر است جهشهاي هتروپلاسميك با فراواني بسيار كم را نيز شناسايي كند( 15 ). در اين مطالعه دو قطعه هر دو با اندازه 279bp جهت بررسي انتخاب و با PCR تكثير شدند. سپس محصولات (5 PCR ميكروليتر) به طور جداگانه با بافر دناتوره كننده SSCP ( 95 درصد فرماميد 10 ميلي مولNaOH 0/25 درصدبرموفنل بلو و 0/25 درصد زايلن سيانول) (5 ميكروليتر) مخلوط شده و به مدت 5 دقيقه در درجه حرارت 95 درجه قرار داده شدو سپس به سرعت در يخ قرار داده شد. مقدار 5 ميكروليتر از محلول حاصل در ژل اكريل آميد ( 8 درصد) به مدت 20 ساعت الكتروفورز شد. قطعات DNA افراد بيمار و كنترل به صورت كنار هم آناليز شدند و هر تفاوتي در الگوي باندينگ بين بيماران و افراد كنترل كه نشان دهنده جهشهاي هموپلاسمي يا هتروپلاسمي است( 16 ) جهت تعيين تغيير نوكلي وتيدي براي تعيين توالي ارسال شد. آناليز آماري تست آماري فيشر( exact (Fisher's براي تعيين ارتباط بين دو گروه شاهد و بيمار مورد استفاده قرار گرفت P كمتر از 0/05 نيز به عنوان سطح معنيداري در نظر گرفته شد. محاسبات با استفاده از نرم افزار GraphPad انجام گرفت. يافته ها 30 بيمار (19 زن و 11 مرد) مبتلا به سندرم LQT مورد مطالعه قرار گرفتند. با استفاده از روش SSCP و تعيين توالي بخشي از mtdna بيماران موفق به يافتن 3 جهش جدول شماره 2: توالي و موقعيت پرايمرها طول قطعه تكثير شده( bp ) توالي پرايمر موقعيت نوكلي وتيدي ناحيه ژني نام پرايمر ONP86 ONP89 trna Ala,Trp,Asn 5461-5480 5740-5721 5'- CCCTTACCACGCTACTCCTA- 3' 5'- GGCGGGAGAAGTAGATTGAA- 3' 279 ONP96 ONP97 b و بخشي از سيتوكروم trna Glu 14561-14580 14840-14821 5'-ACCACACCGCTAACAATCAA- 3' 5'- CAACATCTCCGCATGATGAA- 3' 279 144 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران
پژوهشي مهري خاتمي و همكار نقطهاي گشتيم كه عبارتند از: جهش هموپلاسمي C14766T كه در 5 بيمار ديده شد كه قبلا دچار سنكوپ نشده بودند. اين جهش باعث تغيير اسيد آمينه تري ونين به ايزولوسين در موقعيت 7 ميشود (تصوير شماره 1). تصوير شماره 1: شناسايي جهش C14766T با آناليز SSCP و تعيين توالي. لاين 1: كنترل لاين 7 5 4 3 2 و 8: بيماران بدون جهش و لاين 6: بيمار با جهش هموپلاسمي جهش هموپلاسمي A14687G در ژن trna اسيد گلوتاميك كه در لوپ TψC قرار دارد (تصوير شماره 2). جهش هتروپلاسمي G14838A در ژن سيتوكروم b كه در يك بيمار 9 ساله مشخص شد. اين فرد قبلا دچار سنكوپ شده بود. اين جهش از نوع بيمعني است و در موقعيت 31 پروتي ين اسيد آمينه ترپتوفان به كدون ختم تبديل ميشود (تصوير شماره 3). شكلگيري و عملكرد trna روي سنتز پروتي ينهاي ميتوكندريايي مو ثر است و در نتيجه باعث اختلال در كمپلكسهاي چند آنزيمي فسفريلاسيون اكسيداتيو مي شوند( 17 ).جهش A14687G در trna گلوتاميك اسيد در لوپ TΨC قرار گرفته است بررسي اين نوكلي وتيد در بين پستانداران نشان دهنده حفاظت شدگي آن طي تكامل است (تصوير شماره 4 ). اين جهش در لوپ T قرار دارد كه در ميانكنشهايي كه براي شكلگيري ساختار سوم لازم است تا ثير گذاشته و ميتواند به شكلگيري ساختار نادرست و كارايي پايين اين trna منجر شود. اين امر باعث ميشود trna نتواند عملكرد صحيح خود را داشته باشد و در نهايت منجر به كاهش سنتز پروتي ينهاي سازنده كمپلكس تنفسي و كاهش توليد ATP شود. اين جهش در يك بيمار مرد 17 ساله ديده شد كه سابقه سنكوب داشته است و پيش از اين نيز در يك مرد 16 ساله مبتلا به ميوپاتي ميتوكندريايي و نارسايي تنفسي به عنوان يك جهش بيماريزا گزارش شده است( 18 ). تصوير شماره 2 : آناليزSSCPبراي يافتن جهش ها. A )جهش A14687G (لاين 2 : بيمار داراي جهش هموپلاسمي لاين هاي 3 5 بيماراني و 4 كه اين جهش را ندارند و لاين 1: فرد كنترل). B ) جهش G14838A (لاين 1: بيمار داراي جهش هتروپلاسمي لاينهاي 5-2: بيماراني كه اين جهش را ندارند و لاين 6: فرد كنترل) بحث جهشدر ژنهاي trna ميتوكندريايي در بيماريهاي عصبي قلبي و ماهيچهاي رايج است زيرا تصوير شماره 4: الف) همرديفي تواليهاي trna گلوتاميك اسيد ميتوكندري در پستانداران. ب) موقعيت جهش A14687G در trna گلوتاميك اسيد. ژن سيتوكروم b در جايگاه 14747 تا 15887 قرار دارد كه كد كننده يك پروتي ين 380 اسيدآمينهاي است. مطالعات بيشتر در مورد سيتوكروم b ثابت كرده است كه جهش در ژن سيتوكروم b علاوه بر اينكه سيستم اكسيداتيو فسفريلاسيون را تخريب ميكند و توليد ATP را كاهش ميدهد در شكلگيري ساختاري مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران 145
بررسي مولكولي trna هاي اسيد گلوتاميك كمپلكسهاي I و III نيز اختلال ايجاد كرده و حتي در پايداري و فعاليت كمپلكس I نيز تاثير دارد( 19 ). جهش C14766T در اين ژن باعث تغيير اسيد آمينه تري ونين به ايزولوسين ميشود. اسيدآمينه تري ونين در موقعيت هفتم در انتهاي N پروتي ين سيتوكروم b قرار دارد. اسيدآمينه تري ونين در اين موقعيت در بين پستانداران به طور متوسط حفاظت شده است اين اسيدآمينه در ساختارهاي هليكسي شركت ندارد و داخل ماتريكس ميتوكندري جاي گرفته است. اين جابهجايي قبلا در بيماريهاي LHON MELAS ديستروفي ميوتونيك مادرزادي ديابت نوع دو به ارث رسيده از مادر و سندرم مرگ ناگهاني نوزادان مشاهده شده است( 20 ). اين جهش در اسيدآمينه عملكردي پروتي ين قرار ندارد و در ميزان فعاليت پروتي ين تا ثيري ندارد ولي از آنجايي كه مشخصات هيدروپاتي پروتي ين را در يك ناحيه آبدوست تغيير ميدهد ممكن است در پايداري پروتي ين و در نتيجه پايداري كمپلكس III اثر داشته باشد و افراد داراي اين جهش در معرض بيشتر ابتلا به بيماريهاي ميتوكندريايي باشند. جهش G14838A در ژن سيتوكروم b جهشي هتروپلاسمي و بيمعني است كه باعث از دست رفتن بيش از 91 درصد پروتي ين ميشود. اين تغيير قبلا به عنوان يك جهش بيماريزا در كارديوميوپاتي گزارش شده است( 21 22) و باعث از دست 350 اسيد آمينه پروتي ين ميشود. به احتمال زياد اين حذف باعث كاهش پروتي ينهاي هسته و پروتي ين آهن- سولفات ميشود. در نتيجه واكنش فسفوريلاسيون اكسيداتيو دچار اختلال شده و ATP توليد شده توسط ميتوكندري كاهش مييابد. مخصوصا اين كه جهش در بيماري با سن پايين (9 ساله) ديده شده است كه قبلا سابقه سنكوب داشته است و اين نشاندهنده اين موضوع است كه اين جهش به دليل اينكه منجر به سنتز پروتي ين ناكامل سيتوكروم b ميشود يك كمبود اساسي را در زنجيره انتقال الكترون ايجاد كرده كه با وجود هتروپلاسمي بودن سلولها قادر به جبران ميزان ATP توليدي كاسته شده در اثر اين جهش نبودهاند. همچنين نتايج ما نشان داد كه هيچ كدام از جهشهاي گزارش شده در اين مطالعه در افراد كنترل ديده نشد. نكته مهم آن است كه ميزان زياد جهشهاي mtdna در بيماران سبب ناپايداري ژنوم ميتوكندري اين بيماران در مقايسه با افراد سالم ميشود. جهشهاي ژنوم ميتوكندري ممكن است متابوليسم اكسيداتيو انرژي را تحت تاثير قرار دهد و بنابراين كمبود ATP را القاء كند. از طرفي ژنوم ميتوكندري نسبت به آسيبهاي DNA به علت توليد انواع اكسيژنهاي راديواكتيو حساس است چون پروتي ينهاي هيستون محافظي براي mtdna وجود ندارد و همچنين اين ژنوم قابليت ترميم محدودي دارد. بنابراين جهشهاي mtdna ممكن است در سندروم LQT درگير باشند و تجمعشان و ناپايداري mtdna ميتواند فاكتورهاي خطري براي اين سندرم باشد. سپاسگزاري اين مطالعه با حمايت مالي دانشگاه يزد انجام گرفته است و مراتب امتنان خود را از معاونت پژوهشي دانشگاه اعلام ميداريم. از آقاي دكتر محمود افتخار زاده فوق تخصص آريتمي قلبي از مركز آريتمي تهران كه بيماران را جهت اين مطالعه ارجاع دادهاند تشكر و قدرداني ميشود. از تمام بيماران رضايتنامه جهت اين مطالعه دريافت شده است و از آنها به علت همكاريشان قدرداني ميشود. References 1. Beckmann BM, Pfeufer A, Kaab S. Inherited cardiac arrhythmias: diagnosis, treatment, and prevention. Dtsch Arztebl Int. 2011 Sep; 108(37): 623-633; quiz 634. 146 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران
پژوهشي مهري خاتمي و همكار 2. Priori SG. Inherited arrhythmogenic diseases: the complexity beyond monogenic disorders. Circ Res. 2004 Feb 6; 94(2): 140-145. 3. Chiang CE. Congenital and acquired long QT syndrome. Current concepts and management. Cardiol Rev. 2004 Jul- Aug; 12(4): 222-234. 4. Crotti L, Celano G, Dagradi F, Schwartz PJ. Congenital long QT syndrome. Orphanet J Rare Dis. 2008; 3:18. 5. Grant AO, Carboni MP, Neplioueva V, Starmer CF, Memmi M, Napolitano C, et al. Long QT syndrome, Brugada syndrome, and conduction system disease are linked to a singlesodium channel mutation. J Clin Invest. 2002 Oct; 110(8): 1201-1209. 6. Naik A. Long QT syndrome revisited. J Assoc Physicians India. 2007 Apr;55 Suppl:58-61. 7. Moss AJ, Kass RS. Long QT syndrome: from channels to cardiac arrhythmias. J Clin Invest. 2005 Aug;115(8): 2018-2024. 8. Towbin JA, Vatta M. Molecular biology and the prolonged QT syndromes. Am J Med. 2001 Apr 1;110(5): 385-398. 9. Casademont J, Miro O. Electron transport chain defects in heart failure. Heart Fail Rev. 2002 Apr; 7(2): 131-139. 10. Opdal SH, Vege A, Egeland T, Musse MA, Rognum TO. Possible role of mtdna mutations in sudden infant death. Pediatr Neurol. 2002 Jul; 27(1):23-29. 11. Kass RS, Moss AJ. Long QT syndrome: novel insights into the mechanisms of cardiac arrhythmias. J Clin Invest. 2003 Sep; 112(6): 810-815. 12. Mayr JA, Moslemi AR, Forster H, Kamper A, Idriceanu C, Muss W, et al. A novel sporadic mutation G14739A of the mitochondrial trna (Glu) in a girl with exercise intolerance. Neuromuscul Disord. 2006 Dec; 16(12): 874-877 13. Acin-Perez R, Bayona- Bafaluy MP, Fernandez-Silva P, Moreno-Loshuertos R, Perez-Martos A, Bruno C, et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Mol Cell. 2004 Mar 26; 13(6): 805-815. 14. Eridani S1, Sgaramella V, Cova L.Stem cells: From embryology to cellular therapy? An appraisal of the present state of art. Cytotechnology. 2004 Mar;44(3): 125-41. 15. Wong LJ, Liang MH, Kwon H, Park J, Bai RK, Tan DJ. Comprehensive scanning of the entire mitochondrial genome for mutations. Clin Chem. 2002 Nov; 48(11): 1901-1912. 16. Jaksch M, Gerbitz KD, Kilger C. Screening for mitochondrial DNA (mtdna) point mutations using nonradioactive single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Clin Biochem. 1995 Oct; 28(5): 503-509. 17. Florentz C, Sissler M. Disease-related versus polymorphic mutations in human mitochondrial trnas. Where is the difference? EMBO Rep. 2001 Jun; 2(6): 481-486. 18. Bruno C, Sacco O, Santorelli FM, Assereto S, Tonoli E, Bado M, et al. Mitochondrial myopathy and respiratory failure associated with a new mutation in the mitochondrial transfer ribonucleic acid glutamic acid gene. J Child Neurol. 2003 Apr; 18(4): 300-303. 19. Sierotzki H, Frey R, Wullschleger J, Palermo S, Karlin S, Godwin J, et al. Cytochrome b gene sequence and structure of Pyrenophora teres and P. tritici-repentis andimplications for QoI resistance. Pest Manag Sci. 2007 Mar; 63(3): 225-233. 147 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران
بررسي مولكولي trna هاي اسيد گلوتاميك 20. Lamminen T, Majander A, Juvonen V, Wikstrom M, Aula P, Nikoskelainen E, et al. A mitochondrial mutation at nt 9101 in the ATP synthase 6 gene associated with deficient oxidative phosphorylation in a family with Leber hereditary optic neuroretinopathy. Am J Hum Genet. 1995 May; 56(5): 1238-1240. 21. Andreu AL, Bruno C, Shanske S, Shtilbans A, Hirano M, Krishna S, et al. Missense mutation in the mtdna cytochrome b gene in a patient with myopathy. Neurology. 1998 Nov; 51(5): 1444-1447. 22. Blakely EL, Mitchell AL, Fisher N, Meunier B, Nijtmans LG, Schaefer AM, et al. A mitochondrial cytochrome b mutation causing severe respiratory chain enzyme deficiency inhumans and yeast. FEBS J. 2005 Jul; 272(14): 3583-3592. 148 مجله دانشگاه علوم پزشكي مازندران