ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 3
ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Ονομάζουμε την ένωση ενός σωματιδιακού αντιγόνου με το ομόλογο αντίσωμα και τον σχηματισμό κροκίδων. Η συγκόλληση αυτή είναι ορατή με γυμνό μάτι ή με μικροσκόπιο. Διακρίνεται σε άμεση συγκόλληση το αντιγόνο βρίσκεται στην επιφάνεια των κυττάρων όπως τα αντιγόνα των ομάδων αίματος, και οι δοκιμασίες Widal και Wright για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι μικροβίων. Στην έμμεση ή παθητική συγκόλληση, όταν το αντιγόνο έχει προσροφηθεί πάνω στην επιφάνεια κατόπιν ειδικής επεξεργασίας.
ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Η συγκολλητινοαντίδραση γίνεται σε δύο φάσεις στην πρώτη φάση που γίνεται η αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα και ενώνεται με τις καθοριστικές αντιγονικές ομάδες (επιτόπους). Στη δεύτερη φάση τα κύτταρα που έχουν ενωθεί με τα αντισώματα πλησιάζουν και συγκολλιόνται μεταξύ τους και σχηματίζουν κροκίδες ορατές, οι οποίες σχηματίζουν δικτυωτό πλέγμα μεταξύ των αντισωμάτων και των κυττάρων.
Σωματιδιακό αντιγόνο + ομόλογο αντίσωμα 2 Φάσεις: 1 η φάση (Ευαισθητοποίηση) Αναγνώριση και πρόσδεση του αντισώματος με το αντιγόνο ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Agglutination 2 η φάση (Σχηματισμός πλέγματος) Το αντίσωμα αξιοποιεί το ελεύθερο Fab κλάσμα για να «γεφυρώσει» την απόσταση μεταξύ των σωματοδιακών αντιγόνων => σχηματισμός κροκίδων
Παράγοντες που επηρεάζουν την συγκόλληση ph T Ηλεκτρολύτες (ιονική ισχύς του διαλύματος) Συγγένεια/συνάφεια* Αριθμός και θέση των επιτόπων Σχετική συγκέντρωση αντιγόνου αντισώματος Απωθητικές δυνάμεις μεταξύ των σωματιδίων
ΑΤΕΛΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ Τα αντισώματα που δεν έχουν την ικανότητα να προκαλέσουν την πλήρη συγκόλληση συνηθίζεται να ονομάζονται ατελή. Η αποτυχία της συγκόλλησης δεν οφείλεται σε ειδικές μορφές αντισωμάτων, αλλά εξηγείται από τις ιδιότητες του αντιγόνου αντισώματος και από τις συνθήκες που εμποδίζουν την συγκόλληση που αναφέρθηκαν παραπάνω.
Το «διδακτικό» παράδειγμα των ερυθρών Η επιφάνεια των ερυθρών είναι φορτισμένη αρνητικά Σε φυσιολογικές συνθήκες ph (~7) και ηλεκτρολυτών (ισοτονικό διάλυμα) οι μεμβρανικές επιφάνειες δυο ερυθρών μπορούν να συμπλησιάσουν σε μια απόσταση το πολύ 18 nm Πως η τάξη της ανοσοφαιρίνης και η θέση των αντιγονικών επιτόπων μπορεί να επηρεάζει τον σχηματισμό κροκίδων;
IgM vs IgG
ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Απλότητα, ευκολία, ταχύτητα, η μη χρήση ακριβών μηχανημάτων, μεγάλη ευαισθησία, μεγάλη ποικιλία ανίχνευσης αντισωμάτων. ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Είναι οι μη ειδικές συγκολλήσεις, οι δυσκολίες στην ανεύρεση και συντήρηση ερυθρών, και το φαινόμενο της προζώνης.
ΤΙΤΛΟΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ Τίτλος αντισωμάτων είναι η μεγαλύτερη αραίωση του υπό εξέταση ορού στην οποία εμφανίζεται συγκόλληση. Χρήση συγκολλητινοαντιδράσεων. - προσδιορισμός ομάδων υποομάδων αίματος Rhesus - τυποποίηση μικροοργανισμών όπως σαλμονέλλα, E.coli - ανίχνευση ρευματοειδούς παράγοντα (RF) - C αντιδρώσας πρωτείνης (CRP) - ανίχνευση για την λοιμώδη μονοπυρήνωση (mono test) - σύφιλης (VDRL) - Widal, Wright.
Τίτλος αντισωμάτων Η μεγαλύτερη αραίωση του ορού στην οποία παρατηρείται συγκόλληση
Φαινόμενο προζώνης μικρές αραιώσεις του ορού αναστολή της συγκόλλησης από περίσσεια αντισωμάτων
Ατελή αντισώματα μπορούν να ενωθούν με τους επιτοπους πάνω στην επιφάνεια του σωματιδιακού αντιγόνου ΑΛΛΑ δεν μπορούν να προκαλέσουν συγκόλληση* *σε συνθήκες φυσιολογικού ορού Τι μπορεί να γίνει; Διάλυμα χαμηλής ιονικής ισχύος( Low ionic strength saline) Λευκωματίνη (albumin) Αντι-IgG αντισώματα**
COOMBS Το 1945 ο COOMBS παρασκεύασε τον αντισφαιρινικό ορό. Αυτός ο ορός αποτελείται από αντισώματα που δρούν έναντι ανοσοσφαιρινών ή συστατικών του συμπληρώματος. Η αρχή είναι απλή ενίονται στα κουνέλια ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες και παράγεται ανοσολογική απάντηση (αντί- ανθρώπινα αντισώματα) που λαμβάνονται από τον ορό του κουνελιού.
ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ COOMBS Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των IgG αντισωμάτων που συνδέονται με τις αντιγονικές ομάδες των ερυθρών αιμοσφαιρίων και προσκολλούνται χωρίς να δείχνουν κροκίδωση. Η εξέταση με την οποία ανιχνεύουμε την ύπαρξη των αντισωμάτων που είναι κολλημένα πάνω στα ερυθρά ονομάζεται άμεση coombs. Η εξέταση με την οποία ανιχνεύουμε την ύπαρξη των αντισωμάτων στον ορό του αίματος ονομάζεται έμμεση coombs.
ΑΜΕΣΟΣ COOMBS Χρησιμοποιούμε ολικό αίμα με αντιπηκτικό Το φυγοκεντρούμε στις 1000 στροφές για 10 και πετάμε το υπερκείμενο. Πλένουμε 3 φορές μς φυσιολογικό ορό (NaCL 0,9%) Σε σωληνάρια αιμόλυσης κάνουμε αραίωση των πλυμένων ερυθρών με φυσιολογικό ορό 1/10. Δηλαδή 45 σταγόνες φυσιολογικό ορό και 5 πλυμένα ερυθρά. Σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα βάζουμε μια σταγόνα από την αραίωση των ερυθρών και μια σταγόνα αντισφαιρινικού ορού και μικροσκοπούμε. Η θετικότητα της αντίδρασης διαβαθμίζεται από 1+ έως 4+.