Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΑΣΗ ΤΟΥ ΣΥΝΔΡΟΜΟΥ ΥΠΕΡΑΝΔΡΟΓΟΝΑΙΜΙΑΣ ΣΤΗ ΓΥΝΑΙΚΑ ΝΕΚΤΑΡΙΑ Β. ΞΗΤΑ ΙΑΤΡΟΣ

Μ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘ ΟΛΟΓΙΚΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Διευθυντής: Επαμεινώ νδας Τσιάνος, Καθηγητής Παθολογίας ΜΟΝΑΔΑ ΕΝΔΟΚΡΙΝΟΛΟΓΙΑΣ Υπεύθυνος: Αγαθοκλής Τσατσούλης, Κ αθηγητής Π αθολογίας/ενδοκρινολογίας Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΑΣΗ ΤΟΥ ΣΥΝΔΡΟΜΟΥ ΥΠΕΡΑΝΔΡΟΓΟΝΑΙΜΙΑΣ ΣΤΗ ΓΥΝΑΙΚΑ ΝΕΚΤΑΡΙΑ Β. ΞΗΤΑ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟ ΡΙΚΗ ΔΙΑ ΤΡΙΒΗ Ιω άννινα 2004

\ ΒΙβΛΙΟ Η<Η ΠΑΝεηΐίΤΗ ΊΙΟν ΙΟΑΝΝΙ^ΟΝ

«Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα». Ν. 5343/32, άρθρο 202, παράγραφος 2

Ημερομηνία αιτήσεως: 14-10-1997 Ημερομηνία ορισμού τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής:3389/16-12-97 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε π ιβλέπ ω ν καθηγητής Αγαθοκλής Τσατσούλης, Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας/Ενδοκρινολογίας Μ έλη Μωυσής Ελισάφ, Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας Ιωάννης Γεωργίου, Λέκτορας Μαιευτικής/Γυναικολογίας Ημερομηνία ορισμού του θέματος: 27-3-2000 Ημερομηνία κατάθεσης της διδακτορικής διατριβής: 22-12-2004 ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Επαμεινώνδας Τσιάνος, Καθηγητής Παθολογίας ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αλέξανδρος Δρόσος, Καθηγητής Παθολογίας/Ρευματολογίας, μέλος Μωυσής Ελισάφ, Καθηγητής Παθολογίας, μέλος Κωνσταντίνος Σιαμόπουλος, Καθηγητής Παθολογίας/Νεφρολογίας, μέλος Αγαθοκλής Τσατσούλης, Καθηγητής Παθολογίας/Ενδοκρινολογίας, επιβλέπων Ιωάννης Γεωργίου, Αναπληρωτής Καθηγητής Ιατρικής Γενετικής Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής της Μαιευτικής/Γυναικολογίας, μέλος Ιωάννης Γουδέβενος, Αναπληρωτής Καθηγητής Καρδιολογίας, μέλος Σοφία Καλανταρίδου, Επίκουρος Καθηγήτρια Μαιευτικής/Γυναικολογίας, μέλος και Η διδακτορική διατριβή έγινε αποδεκτή με βαθμό «ΑΡΙΣΤΑ» Η Γραμματέας της Ιατρικής Σχολής ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΤΣΑΓΓΑΛΑ

στους γονείς μου σ τον αδερφό μου Γ'άννη

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το σύνδρομο των ττολυκυστικών ωοθηκών αποτελεί τη συχνότερη ενδοκρινοπάθεια σε γυναίκες της αναπαραγωγικής ηλικίας. Είναι γνωστό ότι αποτελεί μια οικογενή διαταραχή, ωστόσο οι γενετικοί παράγοντες που συμβάλλουν στη παθογένεια του δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Πιστεύεται ότι περισσότερα από ένα γονίδια αλληλεπιδρώντας μεταξύ τους αλλά και με περιβαλλοντικούς παράγοντες, κυρίως διατροφικούς, παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη του συνδρόμου. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μια προσπάθεια διερεύνησης της γενετικής βάσης του συνδρόμου των πολυκυστικών ωοθηκών. Το πληθυσμό μελέτης αποτέλεσαν ασθενείς που προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία της Μονάδας Ενδοκρινολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων και η γενετική ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Γενετικής της Ανθρώπινης Αναπαραγωγής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον επιβλέποντα καθηγητή Αγαθοκλή Τσατσούλη και τον αναπληρωτή καθηγητή Ιατρικής Γενετικής Ιωάννη Γεωργίου, που μου έδωσαν την ευκαιρία να ασχοληθώ με το συγκεκριμένο αντικείμενο καθώς και για την πολύτιμη βοήθεια, τις ουσιαστικές υποδείξεις και καθοδήγησή τους. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συνεργάτες της Μονάδας Ενδοκρινολογίας, τις παρασκευάστριες του Εργαστηρίου Γενετικής, Αλεξάνδρα Μπέλλου και Χρυσάνθη Κώστα για την πολύτιμη βοήθειά τους στο χώρο του εργαστηρίου, την Ανθούλα Χατζηκυριακίδου, βιολόγο, για την πρόθυμη βοήθεια της στο εργαστηριακό τμήμα της μελέτης και την Αφροδίτη Κατσαράκη, υπεύθυνη της στατιστικής υπηρεσίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων που συνέβαλλε στη στατιστική ανάλυση των δεδομένων. Τέλος, ιδιαίτερα ευχαριστώ την οικογένειά μου, που πέρα από την οικονομική τους υποστήριξη, στάθηκαν δίπλα μου με πολλή υπομονή, μοιράστηκαν τις αγωνίες και τις αμφιβολίες μου και μου έδωσαν την ενθάρρυνση που χρειαζόμουν.

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σελ 1. Εισαγωγή 1.1 Η σημασία της γενετικής στην ενδοκρινολογία... 1 1.2 Η έννοια του γενετικού πολυμορφισμού... 3 1.3 Μέθοδοι γενετικής ανάλυσης πολυπαραγοντικών νοσημάτων... 5 1.3.1 Ανάλυση της γενετικής σύνδεσης (Linkage analysis)...5 1.3.2 Μελέτες συσχέτισης (Association studies)... 6 2. Σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (ΣΠΩ) 2.1 Ορισμός - επιδημιολογικά χαρακτηριστικά του ΣΠΩ... 9 2.2 Κλινικά χαρακτηριστικά του ΣΠΩ... 11 2.3 Εργαστηριακά ευρήματα του ΣΠΩ...12 2.3.1 Ορμονικές διαταραχές του Σ Π Ω... 12 2.3.2 Μεταβολικές διαταραχές του ΣΠΩ... 13 2.3.3 Υπερηχογραφική εικόνα ωοθηκών... 15 2.4 Παθοφυσιολογία του ΣΠΩ... 16 3. Γενετική βάση του ΣΠΩ... 23 3.1 Γονίδια που εμπλέκονται στην έκκριση και δράση των γοναδοτροπινών... 26 3.1.1 Το γονίδιο της β-υποομάδας της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH-β )... 26 3.2 Γονίδια που εμπλέκονται στην έκκριση και δράση των ανδρογύνων... 27 3.2.1 Το γονίδιο της 17α-υδροξυλάσης/17,20-λυάσης (CYP17)... 27 3.2.2 Το γονίδιο αποκοπής της πλάγιας αλύσου χοληστερόλης (CYP11a)..28 3.2.3.ΤΟ γονίδιο της αρωματάσης (CYP19)... 29 3.2.4 Το γονίδιο του υποδοχέα των ανδρογόνων (AR)...30 3.3 Γονίδια που εμπλέκονται στην έκκριση και δράση της ινσουλίνης...32 3.3.1 Το γονίδιο της ινσουλίνης... 32

3.3.2 Το γονίδιο του υποδοχέα της ινσουλίνης... 34 3.4 Γονίδια που εμπλέκονται στην ωοθυλακιογένεση... 36 3.4.1 Το γονίδιο της φολλιστατίνης...36 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ...39 2. ΥΛΙΚΟ ΜΕΛΕΤΗΣ... 42 3. ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ... 44 4. ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ... 45 4.1 Εξαγωγή DNA από περιφερικά λευκοκύπαρα... 46 4.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 47 4.3 Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες...50 4.4 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης... 51 4.5. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου... 51 4.6 Χρώση νιτρικού αργύρου... 53 5. ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ. 5.1 Καθορισμός γονότυπων του πολυμορφισμού -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης...54 5.2 Καθορισμός γονότυπων του πολυμορφισμού 45T/G του γονιδίου της αδιπονεκτίνης... 56 5.3. Καθορισμός γονότυπων του πολυμορφισμού 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης... 58 5.4 Καθορισμός γονότυπων του πολυμορφισμού (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG... 60 6. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ... 63 7. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 64 8. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...79 9. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 87

10.ΠΕΡΙΛΗΨΗ...... -. 89 11.SUM M A RY...... 93 12. Βιβλιογραφία...... 97

1 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΔΟΚΡΙΝΟΛΟΓΙΑ Τις προηγούμενες δεκαετίες, οι ορμονικές εξετάσεις αποτέλεσαν το κύριο διαγνωστικό εργαλείο, αλλά και τη βάση της κλινικής έρευνας, στον τομέα της ενδοκρινολογίας. Η σημαντική ανάπτυξη των τεχνολογιών της μοριακής και κυτταρικής βιολογίας που ακολούθησε, συνέβαλλε στην κατανόηση της ορμονικής σύνθεσης, έκκρισης, ρύθμισης και δράσης σε κυτταρικό επίπεδο. Όμως, η αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γενετικού υλικού πρόσθεσε μια νέα διάσταση, που επιτρέπει την ευρεία εφαρμογή της γενετικής στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών πολλών ενδοκρινικών διαταραχών και συμβάλλει στην ασφαλή διάγνωση αλλά και πρόληψή τους. Το ανθρώπινο γενετικό υλικό αποτελείται από περισσότερα από 3,5 δισεκατομμύρια νουκλεοτίδια, αλλά μόνο ένα μικρό ποσοστό (<2%) είναι υπεύθυνο για τη κωδικοποίηση πρωτεϊνών (1,2). Αν και, ακόμα και σήμερα, δεν γνωρίζουμε ακριβώς πόσα γονίδια περιέχει το ανθρώπινο DNA, εκτιμάται ότι περιλαμβάνει περίπου 30000-35000 γονίδια, αριθμός πολύ μικρότερος από ότι αρχικά είχε εκτιμηθεί (3). Από αυτά τα γονίδια, περισσότερο από το 50%, είναι θεωρητικές προβλέψεις βασιζόμενες σε ηλεκτρονική ανάλυση της αλληλουχίας του ανθρώπινου γενετικού υλικού και δεν έχουν διερευνηθεί πειραματικά (4). Ωστόσο, ένας σημαντικός αριθμός γονιδίων έχουν ταυτοποιηθεί ως υπεύθυνα για την πρόκληση νοσημάτων, μέσω της ύπαρξης μεταλλάξεων που διαταράσσουν την έκφραση ή τη λειτουργία του πρωτεϊνικού παραγώγου τους. Σχεδόν κάθε νόσημα οφείλεται στην συνδυασμένη δράση γονιδίων και περιβάλλοντος, αλλά ο ρόλος του γενετικού παράγοντα ποικίλλει. Μεταξύ των

2 διαταραχών ττου προκαλούνται εξ ολοκλήρου ή εν μέρει από γενετικούς παράγοντες αναγνωρίζονται 3 κύριοι τύποι (5): 1. χρωματοσωμικές διαταραχές 2. μονογονιδιακές διαταραχές 3. πολυγονιδιακές - πολυπαραγοντικές διαταραχές Στις χρωματοσωμικές ανωμαλίες, η διαταραχή οφείλεται σε περίσσεια ή έλλειψη γονιδίων που περιέχονται σε ολόκληρα χρωματοσώματα ή τμήματα χρωματοσωμάτων. Οι διαταραχές των χρωματοσωμάτων ήταν οι πρώτες που αναγνωρίστηκαν ως αιτίες ενδοκρινολογικών και αναπαραγωγικών νοσημάτων (για παράδειγμα τα σύνδρομα Kleinfelter και Turner). Συνολικά οι χρωματοσωμικές ανωμαλίες είναι περισσότερο συχνές από τις μονογονιδιακές διαταραχές και εκδηλώνονται σε 7 περίπου ανά 1000 γεννήσεις, ενώ είναι υπεύθυνες για περίπου τις μισές από τις αυτόματες αποβολές κατά το πρώτο τρίμηνο της ζωής του εμβρύου (5). Οι μονογονιδιακές διαταραχές προκαλούνται από μεταλλαγμένα γονίδια και κληρονομούνται με το απλό μενδελιανό τρόπο. Για περισσότερα από εκατό χρόνια, ο αυτοσωματικός και φυλοσύνδετος τύπος κληρονομικότητας χρησιμοποιήθηκαν για να εξηγήσουν πολλές τέτοιες διαταραχές (5). Τα τελευταία χρόνια, εκτός από διαταραχές του χρωματοσωμικού DNA, έχουν περιγράφει και άλλοι μηχανισμοί πρόκλησης μονογονιδιακών νοσημάτων, όπως οι γενετικές αλλαγές μιτοχονδριακών γονιδίων (6), οι διαταραχές της γονιδιακής αποτύπωσης, (imprinting, μηχανισμός με το οποίο η επίδραση ορισμένων γονιδίων εξαρτάται από το αν έχουν κληρονομηθεί από την μητέρα ή τον πατέρα) (7), η μονογονεϊκή δισωμία (uniparental disomy, μια σπάνια κατάσταση στην οποία και τα δύο χρωμοσώματα ενός από τα 23 ζεύγη προέρχεται από ένα γονιό) (8), και η επέκταση τρινουκλεοτιδικών επαναλήψεων (ένα φαινόμενο σύμφωνα με το οποίο μια αλληλουχία τριών βάσεων που φυσιολογικά επαναλαμβάνεται συγκεκριμένες φορές στο γονιδίωμα, επαναλαμβάνεται σε αυτές τις περιπτώσεις πάρα πολλές φορές και προκαλεί νόσο) (9).

3 Οι μονογονιδιακές διαταραχές παρουσιάζονται συνήθως με εμφανή και χαρακτηριστικό τρόπο στα γενεαλογικά δέντρα. Οι περισσότερες ανωμαλίες αυτού του είδους είναι σπάνιες, έχοντας συχνότητα που μπορεί να φθάσει το μέγιστο έως 1/500, αλλά συνήθως είναι πολύ μικρότερη (10). Ένας σημαντικός αριθμός ενδοκρινικών διαταραχών ανήκουν σε αυτή την κατηγορία (π.χ. συγγενή υπερπλασία των επινεφριδίων, MODY) και αποτελούν το απλούστερο και καλύτερα κατανοητό παράδειγμα συμβολής της γενετικής στην ενδοκρινολογία (11). Στα πολυγονιδιακά νοσήματα υπάρχει ένας συνδυασμός γενετικών σφαλμάτων, που συνολικά μπορεί να προκαλέσουν ή να προδιαθέσουν ένα άτομο να αναπτύξει μια νόσο. Πολύ συχνά είναι δυνατόν να εμπλέκονται και περιβαλλοντικοί παράγοντες (πολυπαραγοντικά νοσήματα). Πρακτικά οι δύο όροι, πολυγονιδιακά και πολυπαραγοντικά νοσήματα, χρησιμοποιούνται ως συνώνυμοι. Οι πολυπαραγοντικές διαταραχές τείνουν να επανεμφανίζονται σε οικογένειες, αλλά δεν παρουσιάζουν τα χαρακτηριστικά πρότυπα των μονογονιδιακών νοσημάτων. Αυτό δε σημαίνει ότι παραβλέπονται οι κανόνες της μενδελιανής κληρονομικότητας, αλλά ο τρόπος κληρονόμησης δεν είναι τόσο απλός (5). Στην κατηγορία των πολυπαραγοντικών διαταραχών ανήκει η παχυσαρκία, ο σακχαρώδης διαβήτης αλλά και το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών. 1.2 Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ Ένα χαρακτηριστικό του ανθρώπινου γονιδιώματος είναι ότι δύο μη συγγενικά άτομα έχουν κοινό το 99,9% της αλληλουχίας του DNA τους. Δεδομένου ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα αποτελείται από περισσότερα από 3 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων, αυτή η ομολογία σημαίνει ότι τα δύο αυτά άτομα διαφέρουν σε εκατομμύρια βάσεις. Από το 0,1% των αλληλουχιών που διαφέρουν, οι περισσότερες αλλαγές αφορούν συνήθεις πολυμορφισμούς (12). Ως γενετικός πολυμορφισμός ορίζεται η ύπαρξη πολλαπλών αλληλομόρφων σε ένα γενετικό τόπο, όπου τουλάχιστον δύο αλληλόμορφα εμφανίζονται με συχνότητα

4 μεγαλύτερη από 1%. Πρακτικά, πολυμορφικοί γενετικοί τόποι είναι εκείνοι για τους οποίους 2% των ατόμων του πληθυσμού είναι ετερόζυγα. Επίσης, κατά σύμβαση, αλληλόμορφα με συχνότητες μικρότερες του 1% καλούνται σπάνιες παραλλαγές και σε αυτή την κατηγορία ανήκουν οι μεταλλάξεις (5). Περισσότερο από το ένα τρίτο των γενεπκών τόπων του ανθρώπου, που έχουν μελετηθεί, έχει βρεθεί ότι είναι πολυμορφικοί. Μ πλειοψηφία των πολυμορφισμών του ανθρώπινου γονιδιώματος είναι σημειακοί πολυμορφισμοί (SNPs, single nucleotide polymorphisms) και απαντώνται σε συχνότητα περίπου ένας πολυμορφισμός κάθε 1000 ζεύγη βάσεων. Μια υποκατηγορία των SNPs είναι οι πολυμορφισμοί μεγέθους περιοριστικού τμήματος (RFLPs, restriction fragment length polymorphisms), που προκαλούνται από την αντικατάσταση μιας βάσης από άλλη και δημιουργούν θέσεις αναγνώρισης από περιοριστικά ένζυμα (13). Οι ποικίλου αριθμού διαδοχικών επαναλήψεων πολυμορφισμοί (VNTRs, variable number of tandem repeats) αποτελούνται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων και μπορεί να είναι μινιδορυφορικοί δείκτες (m inisatellites) όταν οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες είναι 10-60 ζεύγη βάσεων ή μικροδορυφορικοί δείκτες (m icrosatellites) που αποτελούνται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες δύο, τριών ή τεσσάρων νουκλεοτιδίων. Όταν ο αριθμός των επαναλήψεων των VNTR ποικίλλει στα διάφορα άτομα τότε ο γενετικός δείκτης θεωρείται πολυμορφικός (14). Σε αντίθεση με τις μεταλλάξεις, οι πολυμορφισμοί δεν συνδέονται άμεσα με μια συγκεκριμένη ασθένεια. Πολύ σπάνια ένας πολυμορφισμός επηρεάζει την έκφραση και σταθερότητα του γονιδίου του, ενώ η πλειοψηφία των πολυμορφισμών δεν έχει λειτουργική σημασία, αλλά δρουν συνεργικά με άλλους γενετικούς πολυμορφισμούς και συμβάλλουν έτσι στην ανάπτυξη πολυπαραγοντικών νοσημάτων.

5 1.3 ΜΕΘΟΔΟΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΟΛΥΠΑΡΑΓΟΝΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ. Η πολυπλοκότητα της μελέτης των πολυπαραγοντικών νοσημάτων οφείλεται στο ότι η απλή σχέση γονότυπου και φαινοτύπου δεν υφίσταται και έτσι ο ίδιος γονότυπος μπορεί να δώσει διαφορετικούς φαινοτύπους (λόγω περιβαλλοντικών επιδράσεων), αλλά και διαφορετικοί γονότυποι να δώσουν τον ίδιο φαινότυπο. Η ανακάλυψη των πολυμορφισμών που συμβάλλουν στην ανάπτυξη πολυπαραγοντικών νοσημάτων έχει μεγαλύτερη δυσκολία από την ανακάλυψη των μεταλλάξεων που προκαλούν μονογονιδιακές διαταραχές, αλλά έχει και μεγαλύτερο ενδιαφέρον, αν λάβει κανείς υπόψη την μεγάλη συχνότητα των πολυπαραγοντικών νοσημάτων. Δύο μέθοδοι έχουν περιγράφει για τη μεθοδική γενετική ανάλυση των πολυπαραγοντικών νοσημάτων: 1. η ανάλυση της γενετικής σύνδεσης (linkage analysis) και 2. οι μελέτες συσχέτισης (association studies) 1.3.1 Ανάλυση της γενετικής σύνδεσης (linkage analysis) Η ανάλυση της γενετικής σύνδεσης είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό της θέσης των υπεύθυνων γονιδίων σε μια ή περισσότερες οικογένειες που φέρουν ένα γενετικό νόσημα. Με αυτή τη μέθοδο γίνεται μελέτη της συν-κληρονόμησης ενός πολυμορφικού δείκτη και ενός γενετικού τόπου μιας ασθένειας. Βασίζεται στην αρχή ότι γενετικοί τόποι ή γονίδια που βρίσκονται πολύ κοντά, έχουν μικρή πιθανότητα να διαχωριστούν κατά τη διαδικασία της χιασματυπίας- ανασυνδυασμού. (συνδεδεμένοι γενετικοί τόποι ή συνδεδεμένα γονίδια) (15). Ο πολυμορφικός δείκτης μελετάται στα μέλη μιας οικογένειας και αντιπαρατίθεται στην παρουσία ή απουσία μιας συγκεκριμένης ασθένειας. Τα στοιχεία που προκύπτουν χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του LOD score. To LOD score είναι ο δεκαδικός λογάριθμος ενός κλάσματος, όπου αριθμητής είναι η πιθανότητα ο πολυμορφικός δείκτης και ο γενετικός τόπος της ασθένειας να είναι συνδεδεμένοι και παρονομαστής η πιθανότητα να μην είναι συνδεδεμένοι. Επειδή η ακριβής απόσταση

6 του πολυμορφικού δείκτη και του γενετικού τόπου δεν είναι γνωστή, ο πιθανός ανασυνδυασμός τους μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αδρή μέτρηση της απόστασης τους. Έτσι, αν ο γενετικός τόπος μιας ασθένειας βρίσκεται κοντά σε ένα πολυμορφικό δείκτη του οποίου η κληρονόμηση μπορεί να μελετηθεί σε μία οικογένεια, είναι δυνατό να προβλέψει κανείς ποια μέλη της οικογένειας κινδυνεύουν να αναπτύξουν τη νόσο, ακολουθώντας απλά την κληρονόμηση του πολυμορφικού δείκτη. Η πιθανότητα λάθους είναι συνάρτηση της απόστασης του πολυμορφικού δείκτη και του γενετικού τόπου της ασθένειας. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η ικανότητα της εντόπισης ενός γενετικού τόπου υπεύθυνου για μία ασθένεια, χωρίς να είναι απαραίτητη η προηγούμενη γνώση ή υπόθεση για γονίδια που εμπλέκονται στην συγκεκριμένη ασθένεια. Μολονότι η ανάλυση της γενετικής σύνδεσης μπορεί να χαρτογραφήσει την περιοχή όπου βρίσκονται το υπεύθυνο γονίδιο για την πρόκληση μιας ασθένειας, δεν μπορεί να καθορίσει ποιο από όλα τα γονίδια αυτής της περιοχής είναι το υπεύθυνο. Επιπλέον, για να υπάρχουν ασφαλή συμπεράσματα με την εφαρμογή αυτής της μεθόδου, πρέπει ο αριθμός των μελών των υπό μελέτη οικογενειών να είναι ικανοποιητικός, ο φαινότυπος να είναι καθορισμένος με ακρίβεια και το μοντέλο κληρονόμησης να είναι γνωστό, αν και τελευταία έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι ανάλυσης γενετικής σύνδεσης όπου το μοντέλο κληρονόμησης δεν θεωρείται απαραίτητο να είναι γνωστό (μη παραμετρικές μέθοδοι, π.χ. η ανάλυση ζεύγους αδερφών (sib-pair analysis), 16). Η ανάλυση της γενετικής σύνδεσης είναι ιδιαίτερα σημαντική μέθοδος για τη μελέτη μονογονιδιακών νοσημάτων και λιγότερο σημαντική όσον αφορά τα πολυγονιδιακά νοσήματα όπου η συμμετοχή του κάθε γονιδίου είναι μέτρια. 1.3.2 Μ ελέτες συσχέτισης (association studies) Οι μελέτες συσχέτισης αποτελούν τη συχνότερη προσέγγιση για την ταυτοποίηση γενετικών επιδράσεων στα πολυπαραγοντικά νοσήματα. Με αυτή τη μέθοδο

7 συγκρίνονται οι συχνότητες των αλληλομόρφων ενός συγκεκριμένου πολυμορφισμού μεταξύ των πασχόντων και μη, ενός πληθυσμού (association or case-control studies), σε αντίθεση με την ανάλυση της γενετικής σύνδεσης η οποία μελετάει τα μέλη οικογενειών (17). Οι μελέτες συσχέτισης γίνονται για τη διερεύνηση γονιδίων που σύμφωνα με την παθοφυσιολογική βάση της υπό-μελέτη ασθένειας θεωρούνται ως υποψήφια και εξετάζουν αν κάποιο αλληλόμορφο έχει μεγαλύτερη συχνότητα σε πάσχοντα άτομα σε σχέση με μη πάσχοντα άτομα. Αυτές οι μελέτες έχουν πολύ καλή εφαρμογή στη διερεύνηση νοσημάτων των οποίων το μοντέλο κληρονόμησης δεν είναι γνωστό και έχουν ετερογενή φαινότυπο. Μια θετική συσχέτιση μπορεί να παρατηρηθεί για τρεις λόγους (18): 1. αν ένα αλληλόμορφο είναι πραγματικά ο παθογενετικός παράγοντας μιας νόσου και στην περίπτωση αυτή η θετική συσχέτιση θα πρέπει να επιβεβαιωθεί σε όλους τους πληθυσμούς. 2. αν ένα αλληλόμορφο δεν προκαλεί τη νόσο αλλά βρίσκεται σε ανισορροπία σύνδεσης με γενετικό τόπο που προκαλεί την ασθένεια. Λέγοντας ανισορροπία σύνδεσης (linkage disequilibrium) είναι η επιλεκτική σύνδεση ενός αλληλομόρφου με γειτονικό γενετικό τόπο σε συχνότητα μεγαλύτερη από ότι θα αναμένονταν με βάση τον παράγοντα τύχη. 3. Τέλος μπορεί μία συσχέτιση να είναι ψευδώς θετική αν ο πληθυσμός μελέτης είναι ετερογενής. Σε ένα μη ομοιογενή πληθυσμό κάθε χαρακτηριστικό που συναντάται συχνά σε μια ομάδα θα δείξει θετική συσχέτιση με οποιοδήποτε αλληλόμορφο τυχαίνει να απαντάται επίσης συχνά σε αυτήν την ομάδα. Ένας τρόπος να αποφευχθεί η ψευδώς θετική συσχέτιση, που οφείλεται στην ετερογένεια του πληθυσμού είναι να χρησιμοποιηθούν ως ομάδα ελέγχου τα μη πάσχοντα μέλη της οικογένειας του πάσχοντα (19). Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί μοντέλα που βασίζονται σε μελέτες οικογενειών (έλεγχος ανισορροπίας σύνδεσης σε οικογενειακού χαρακτήρα

8 μελέτες, Family-based linkage disequilibrium tests). Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι η ανάλυση ανισορροπίας μεταβίβασης αλληλομόρφων (Transmission Disequilibrium test, TDT), σύμφωνα με την οποία ελέγχεται αν οι ετερόζυγοι γονείς μεταφέρουν πιο συχνά το υπεύθυνο για τη νόσο αλληλόμορφο στα πάσχοντα παιδιά τους (20). Αρχικά αυτής της κατηγορίας οι μελέτες χρησιμοποιήθηκαν για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων των μελετών συσχέτισης, πλέον όμως θεωρούνται επαρκείς και ως αρχική μέθοδο μελέτης γενεπκών νοσημάτων (21).

9 2. ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΤΩΝ ΠΟΛΥΚΥΣΤΙΚΩΝ ΩΟΘΗΚΩΝ (ΣΠΩ ) 2.1 ΟΡΙΣΜΟΣ - ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟ Υ ΣΠΩ Το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών (ΣΠΩ) είναι η συχνότερη αιτία υπερανδρογοναιμίας και η πιο συχνή ενδοκρινοπάθεια σε γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας (22,23). Περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Stein και Leventhal το 1935, οι οποίοι παρατήρησαν την ύπαρξη πολυκυστικών ωοθηκών σε γυναίκες παχύσαρκες με αμηνόρροια και δασυτριχισμό (24). Το ΣΠΩ είναι σύνδρομο και όχι νόσος και αυτό αντανακλά την ετερογένεια της κλινικής εικόνας και την πιθανότητα ύπαρξης πολλών αιτιοπαθογενετικών μηχανισμών (25). Όσον αφορά τον ορισμό του συνδρόμου δεν υπάρχει ομοφωνία, δεδομένου ότι δεν υφίσταται κάποιος σταθερός κλινικός ή βιοχημικός δείκτης που να παρατηρείται μόνο σε αυτό το σύνδρομο και να το διακρίνει από άλλες μορφές υπερανδρογοναιμίας. Οι περισσότεροι χρησιμοποιούν τα κριτήρια που δόθηκαν στο συνέδριο του ΣΠΩ από το National Institutes of Health-National Institute of Child Health and Human Development (NIH-NICHD) to 1990 (26). Αυτά είναι: χρόνια ανωοθυλακιορρηξία, υπερανδρογοναιμία, κλινική (υπερτρίχωση, ακμή ή αλωπεκία ανδρογενετικού τύπου) ή/και βιοχημική (αυξημένα επίπεδα ανδρογόνων), αποκλεισμός άλλων νόσων που προκαλούν υπερανδρογοναιμία (μη κλασσική συγγενή υπερπλασία των επινεφριδίων, σύνδρομο Cushing, υπερπρολακτιναιμία, θυρεοειδική δυσλειτουργία και αρρενοποιητικοί όγκοι των ωοθηκών και των επινεφριδίων). Επομένως, φαίνεται ότι η διάγνωση του συνδρόμου είναι διάγνωση εξ αποκλεισμού. Επίσης, σε αυτά τα κριτήρια δεν συμπεριλαμβάνεται η υπερηχογραφική διάγνωση πολυκυστικών ωοθηκών, η οποία τότε θεωρήθηκε ανεπαρκής για να υποστηρίξει τη διάγνωση του συνδρόμου. Ωστόσο, σήμερα έχει γίνει σαφές ότι το ΣΠΩ περικλείει μεγαλύτερο εύρος φαινοτύπων. Πλέον υποστηρίζεται ότι γυναίκες με κανονικούς εμμηνορρυσιακούς

10 κύκλους και υπερανδρογοναιμία και/ή πολυκυστική μορφολογία ωοθηκών έχουν ΣΠΩ (27). Επίσης, υπάρχουν γυναίκες με ΣΠΩ με πολυκυστική μορφολογία ωοθηκών και ωοθηκική δυσλειτουργία, χωρίς να έχουν κλινικά σημεία υπερανδρογοναιμίας (28). Ως αποτέλεσμα το 2003, the Rotterdam ESHRE/ASRM- sponsored PCOS consensus workshop group αναθεώρησε τα κριτήρια και συμπεριέλαβε την πολυκυστική μορφολογία ωοθηκών (29). Σύμφωνα με αυτή την αναθεώρηση τα κριτήρια που προτείνονται για τη διάγνωση του ΣΠΩ είναι: Ολίγο- και/ή ανωοθυλακιορρηξία Κλινικά και/ή βιοχημικά ευρήματα υπερανδρογοναιμίας Πολυκυστική μορφολογία ωοθηκών Για τη διάγνωση του συνδρόμου απαιτείται να υπάρχουν τα δύο από τα τρία αυτά κριτήρια. Επίσης, σύμφωνα και με αυτή την αναθεώρηση, το σύνδρομο εξακολουθεί να είναι μια διάγνωση εξ αποκλεισμού, καθώς θα πρέπει να αποκλειστούν άλλες γνωστές καταστάσεις που προκαλούν φαινότυπο ΣΠΩ. Η συχνότητα του ΣΠΩ υπολογίζεται στο 4,6% και κυμαίνεται από 3,5-11,2% (23). Στις ΗΠΑ, η συχνότητα δεν διαφέρει ανάμεσα στις γυναίκες της καυκάσιας και μαύρης φυλής και υπολογίζεται στο 4%, ενώ στην Ελλάδα εκτιμάται στο 6,8% και παρόμοια είναι και η συχνότητα στην Ισπανία (22,23,30). Χαρακτηριστικό είναι ότι υπάρχουν σημαντικές εθνικές και φυλετικές διαφορές όσον αφορά τις κλινικές εκδηλώσεις του συνδρόμου. Έτσι, έχει βρεθεί ότι οι ιαπωνέζες με ΣΠΩ είναι λιγότερο παχύσαρκες και με μικρότερο βαθμό υπερτρίχωσης σε σχέση με ασθενείς από τις ΗΠΑ και την Ιταλία, αν και τα επίπεδα των ανδρογόνων και οι δείκτες αντίστασης στην ινσουλίνη δεν διαφέρουν σε αυτούς τους πληθυσμούς (31). Οι Dunaif et al (32) συνέκριναν ασθενείς καραϊβικής-ισπανικής καταγωγής με καυκάσιες-μη ισπανικής καταγωγής και διαπίστωσαν ότι η πρώτη ομάδα είχε μεγαλύτερου βαθμού αντίσταση στην ινσουλίνη. Επίσης, η επίδραση της εθνικότητας στην κλινική εκδήλωση του συνδρόμου φαίνεται και από τη σύγκριση ευρωπαίων γυναικών με γυναίκες από τα νησιά του Ειρηνικού Ωκεανού, όπου βρέθηκε ότι οι ευρωπαίες είναι λιγότερο

11 παχύσαρκες, με μικρότερη αντίσταση στην ινσουλίνη, με καλύτερο λιπιδαιμικό προφίλ και λιγότερο υπογόνιμες από τη δεύτερη ομάδα (33). 2.2 ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟ Υ ΣΠΩ Το κλινικό φάσμα του ΣΠΩ είναι ετερογενές. Τα 2/3 έχουν συμπτώματα ανωοθυλακιορρηξίας (που μπορεί να ποικίλλουν από ολιγο/αμηνόρροια έως δυσλειτουργικές αιμορραγίες και υπογονιμότητα), τα 2/3 των ασθενών εμφανίζουν κλινικά σημεία υπερανδρογοναιμίας (υπερτρίχωση, ακμή, λιπαρότητα του δέρματος αλωπεκία ανδρογενετικού τύπου), και το 1/2 είναι παχύσαρκες γυναίκες με ανδροειδή τύπο παχυσαρκίας. Συνεπώς, μόνο το 1/3 εμφανίζουν την κλασσική εικόνα του συνδρόμου (εικόνα 1) (34). Κλινικές εκδηλώσεις υπερανδρογοναιμίας Κλινικές εκδηλώσεις ανωοθυλακιορηξίας * Κλασσική εικόνα ΣΠΩ Παχυσαρκία Εικόνα 1. Κλινικό φάσμα του ΣΠΩ Επιπλέον στο 5-10% των φυσιολογικού σωματικού βάρους γυναικών με ΣΠΩ και στο 50% των παχύσαρκων γυναικών με ΣΠΩ παρατηρείται μελανίζουσα ακάνθωση (35). Η παρουσία μελανίζουσας ακάνθωσης σε γυναίκα με δασυτριχισμό αποτελεί χρήσιμο κλινικό δείκτη ενδεικτικό του ΣΠΩ, που το διαφοροδιαγνώσκει από ανδρογονοεκκρπικούς όγκους (εικόνα 2)(36).

12 Εικόνα 2. Ύπαρξη μελανίζουσας ακάνθωσης στον αυχένα (Α) και την μασχαλιαία χώρα (Β) σε γυναίκα με ΣΠΩ. Το ΣΠΩ συνήθως εμφανίζεται αττό την εμμηναρχή. Η πιο πρώιμη εκδήλωση του συνδρόμου είναι η πρώιμη αδρεναρχή. Ειδικά τα κορίτσια που εμφανίζουν πρώιμη αδρεναρχή και έχουν αυξημένα επίπεδα DHEAS και υπερινσουλιναιμία έχουν υψηλό κίνδυνο να αναπτύξουν φαινότυπο ΣΠΩ αργότερα (37). Έ χει παρατηρηθεί, όπ στην ηλικία των 40 υπάρχει ένα «παράθυρο», όπου βελτιώνεται τόσο η υπερανδρογοναμία όσο και η κανονικότητα των εμμηνορρυσιακών κύκλων (38,39). 2.3 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΕΥΡΗΜ ΑΤΑ ΤΟ Υ ΣΠΩ 2.3.1. Ο ρμονικές διαταραχές του ΣΠΩ Όπως συμβαίνει με την κλινική εικόνα έτσι και με τα εργαστηριακά ευρήματα το ΣΠΩ χαρακτηρίζεται από σημαντική ετερογένεια. Οι κύριες ορμονικές διαταραχές του συνδρόμου είναι η διαταραχή της έκκρισης των γοναδοτροπινών και φυσικά η υπερανδρογοναιμία. Πληθώρα παρατηρήσεων συνηγορούν στο ότι οι γυναίκες με ΣΠΩ παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) πλάσματος, σε ποσοστό που κυμαίνεται αττό 30-90%. Αυτό το μεγάλο εύρος της συχνότητας οφείλεται στις μεθόδους προσδιορισμού των γοναδοτροπινών, καθώς και στην ώρα της

13 δειγματοληψίας, μιας και η έκκριση των γοναδοτροτπνών είναι κατά ώσεις και μεμονωμένα δείγματα στο ναδίρ ή το ζενίθ μπορεί να δώσουν διαφορετικά αποτελέσματα (40). Εκτός όμως από τα αυξημένα επίπεδα, υπάρχει και διαταραχή του προτύπου έκκρισης της LH, μιας και στις ασθενείς με ΣΠΩ παρατηρούνται μεγαλύτερης συχνότητας ώσεις έκκρισης LH σε σχέση με τις υγιείς γυναίκες (41). Όσον αφορά τη θυλακιοτρόπο ορμόνη (FSH), οι γυναίκες με ΣΠΩ έχουν φυσιολογικά ή ελαφρώς ελαττωμένα επίπεδα σε σχέση με τις υγιείς γυναίκες. Ως αποτέλεσμα, ο λόγος LH/FSH μπορεί να είναι αυξημένος στο ΣΠΩ (περίπου 2,5:1) και παλιότερα είχε θεωρηθεί ως χαρακτηριστικό του συνδρόμου, αλλά πλέον έχει βρεθεί ότι παρατηρείται μόνο στο 30% των περιπτώσεων και ιδιαίτερα στις φυσιολογικού σωματικού βάρους (42). Η υπερανδρογοναιμία αποτελεί την πλέον συχνή διαταραχή του συνδρόμου, αν και τα επίπεδα των ανδρογόνων, όπως συμβαίνει και με την LH, μπορεί να είναι εντός των φυσιολογικών ορίων (43). Η βιοδιαθεσιμότητα και η κάθαρση της τεστοστερόνης επηρεάζεται από τη συγκέντρωση της φυλοδεσμευτικής σφαιρίνης (SHBG), στα επίπεδα της οποίας ρυθμιστικό ρόλο παίζουν κυρίως οι ορμόνες του φύλου και η ινσουλίνη (44). Στο ΣΠΩ, τα επίπεδα της SHBG είναι χαμηλά, με αποτέλεσμα το επίπεδο των βιολογικά δραστικών ανδρογόνων να είναι υψηλό, μολονότι μπορεί η ολική τεστοστερόνη να είναι φυσιολογική (45). Σημαντικό είναι ότι στο 25% των γυναικών με ΣΠΩ εκτός από τα ωοθηκικά είναι αυξημένα και τα επίπεδα των επινεφριδικών ανδρογόνων (46). 2.3.2 Μ εταβολικές διαταραχές του ΣΠΩ Αν και αρχικά το ΣΠΩ θεωρήθηκε ως η κλινική οντότητα συνύπαρξης ανωοθυλακιορρηξίας και υπερανδρογοναιμίας, σήμερα πιστεύεται ότι αποτελεί μέρος του μεταβολικού συνδρόμου (σύνδρομο XX) (47). Πιστεύεται ότι οι παχύσαρκες, αλλά και φυσιολογικού σωματικού βάρους γυναίκες με ΣΠΩ, παρουσιάζουν αυξημένη αντίσταση στην ινσουλίνη σε σύγκριση με φυσιολογικές γυναίκες αντίστοιχης ηλικίας

14 και σωματικού βάρους (48,49). Επομένως, υπάρχουν δύο παράμετροι που συμβάλλουν στην ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη στο ΣΠΩ, μία παράμετρος που είναι μοναδική για το σύνδρομο και μία παράμετρος που σχετίζεται με το σωματικό βάρος. Στο ΣΠΩ συνυπάρχει σε κάποιο ποσοστό και διαταραχή της λειτουργίας του β- κυττάρου. Πιο συγκεκριμένα, οι γυναίκες με ΣΠΩ εμφανίζουν αυξημένη έκκριση ινσουλίνης σε βασικές καταστάσεις και ελαττωμένη μεταγευματική έκκριση, αδυνατώντας έτσι να αντισταθμίσουν την αντίσταση στην ινσουλίνη (50). Το αποτέλεσμα είναι ότι το 20-40% των παχύσαρκων γυναικών με ΣΠΩ και το 12% των ασθενών με φυσιολογικό σωματικό βάρος εμφανίζουν διαταραχή ανοχής γλυκόζης ή σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 μέχρι το τέλος της 4πς δεκαετίας της ζωής τους σε σύγκριση με το 10% του γενικού πληθυσμού γυναικών αντίστοιχης ηλικίας (51,52). Στο ΣΠΩ παρατηρούνται επίσης διαταραχές των λιπιδίων. Συγκεκριμένα το λιπιδαιμικό προφίλ των γυναικών με ΣΠΩ χαρακτηρίζεται από μειωμένα επίπεδα HDL-χοληστερόλης και αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων (53). Αυτά τα ευρήματα ωστόσο ποικίλλουν και εξαρτώνται από την ύπαρξη παχυσαρκίας, τη διατροφή και την εθνικότητα του πληθυσμού μελέτης. Φαίνεται ότι μείζονες παράγοντες δυσλιπιδαιμίας σε αυτές τις γυναίκες είναι η υπερανδρογοναιμία και η αντίσταση στην ινσουλίνη (53). Αν στην αντίσταση στην ινσουλίνη και την δυσλιπιδαιμία προστεθεί η υπέρταση και η διαταραχή των ινωδολυτικών μηχανισμών που παρατηρείται στις γυναίκες με ΣΠΩ, δικαιολογείται η αυξημένη συχνότητα αθηροσκλήρωσης και ο αυξημένος κίνδυνος για καρδιαγγειακή νόσο σε αυτές τις γυναίκες (54, 55). Εκτιμάται ότι οι γυναίκες με ΣΠΩ έχουν επτά φορές μεγαλύτερο κίνδυνο εμφράγματος του μυοκαρδίου από το γενικό γυναικείο πληθυσμό και για αυτό είναι κυρίως υπεύθυνη η αντίσταση στην ινσουλίνη (56,57).

15 2.3.3. Υ π ερηχογραφική εικόνα ω οθηκώ ν Σύμφωνα με την αναθεώρηση των κριτηρίων διάγνωσης του 2003 (29), στα κριτήρια συμπεριλήφθηκε και η πολυκυστική εμφάνιση των ωοθηκών κατά των υπερηχογραφικό έλεγχο. Για το χαρακτηρισμό της πολυκυστικής ωοθήκης απαραίτητη θεωρείται η παρουσία περισσοτέρων των 12 θυλακίων, διαμέτρου 2-9mm σε κάθε ωοθήκη, και/ή συνύπαρξη αυξημένου μεγέθους ωοθήκης (>10ml) (εικόνα 3) (58). Η διαπίστωση αυτής της μορφολογίας σε μία μόνο ωοθήκη αρκεί για να τεθεί η διάγνωση των πολυκυστικών ωοθηκών. Σύμφωνα με αυτό το χαρακτηρισμό, η κυκλική διάταξη των θυλακίων, που παλιότερα θεωρήθηκε απαραίτητη, δεν λαμβάνεται πλέον υπόψη. Μία γυναίκα που έχει εικόνα πολυκυστικών ωοθηκών κατά τον υπερηχογραφικό έλεγχο απουσία ωοθηκικής δυσλειτουργίας και υπερανδρογοναιμίας (ασυμπτωματικές πολυκυστικές ωοθήκες) δεν πρέπει να θεωρείται όπ έχει ΣΠΩ, μιας και αυτό το εύρημα παρατηρείται στο 20% των υγιών γυναικών (59). Ε ικόνα 3 Υπερηχογραφική και ιστολογική εικόνα πολυκυστικής ωοθήκης

16 2.4 ΠΑΘ ΟΦ ΥΣΙΟΛΟ ΓΙΑ ΤΟΥ ΣΠΩ Η τταθογένεια του συνδρόμου δεν έχει απόλυτα διευκρινιστεί. Έχουν προταθεί τρεις υποθέσεις για την ερμηνεία της παθοφυσιολογίας του συνδρόμου. Αυτές είναι: η κεντρική υπόθεση [υπόθεση της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH)], η περιφερική υπόθεση (ωοθηκική ή επινεφριδική) και η υπόθεση της ινσουλίνης (60). - Κεντρική υπόθεση ή υπόθεση της ωχρινοτρόπου ορμόνης (υπόθεση LH). Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, στις γυναίκες με ΣΠΩ υπάρχει μια πρωτοπαθής νευροενδοκρινική διαταραχή, που είναι υπεύθυνη για την αύξηση του ύψους και της συχνότητας των ώσεων έκκρισης της LH, με αποτέλεσμα την υπερδιέγερση παραγωγής ανδρογόνων από τα κύτταρα θήκης των ωοθηκών και την πρόκληση ανωοθυλακιορρηξίας (60). Είναι γνωστό ότι η συχνότητα και το ύψος των ώσεων της GnRH είναι αυτό που καθορίζει την έκκριση των γοναδοτροπινών. Βραχείας συχνότητας ώσεις GnRH ευνοούν την έκκριση της FSH, ενώ ταχείας συχνότητας ώσεις ευνοούν την έκκριση της LH. Επομένως διαταραχή του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης με αυξημένο ρυθμό έκκρισης της GnRH έχει ως αποτέλεσμα υπεροχή της έκκρισης της LH με σχετική ανεπάρκεια της FSH, όπως συμβαίνει στο ΣΠΩ (61). Δεν έχει καθοριστεί αν η υποθαλαμική διαταραχή που εκφράζεται με διαταραχή των ώσεων της GnRH είναι πρωτοπαθής υποθαλαμική βλάβη και το πιθανότερο είναι να είναι δευτεροπαθής άλλων ορμονικών και μεταβολικών διαταραχών, όπως της υπερινσουλιναμίας (62). Η υπόθεση αυτή δεν μπορεί να εξηγήσει όλη την παθογένεια του ΣΠΩ, ούτε την εμφάνιση του συνδρόμου σε ασθενείς με φυσιολογικά επίπεδα LH. Επιπλέον, παρόμοιες διαταραχές της έκκρισης των γοναδοτροπινών παρατηρούνται και σε άλλες υπερανδρογοναιμικές καταστάσεις, όπως για παράδειγμα στη συγγενή υπερπλασία των επινεφριδίων (63). Επομένως ανεξάρτητα της αιτίας, η υπερέκκριση

17 της LH συμβάλλει στη διέγερση των κυττάρων του στρώματος και της θήκης των ωοθηκών οδηγώντας σε αυξημένα επίπεδα ανδρογύνων - Περιφερική υπόθεση (ω οθηκική ή επ ινεφριδική υπ όθεση). Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση το αίτιο για την ανάπτυξη του ΣΠΩ είναι η πρωτοπαθής βλάβη της στεροειδογένεσης, που οδηγεί σε υπερβολική έκκριση ανδρογύνων και ανωοθυλακιορρηξία (60). Η ωοθήκη και τα επινεφρίδια έχουν κοινό το αρχικό τμήμα της οδού βιοσύνθεσης των στεροειδών (εικόνα 4). Το αρχικό βήμα αυτής της οδού είναι η μετατροπή της χοληστερόλης σε πρεγνενολόνη με τη βοήθεια του ενζύμου αποκοπής της πλάγιας αλύσου της χοληστερόλης (cholesterol side chain cleavage enzyme, P450scc). H ταχύτητα αυτής της διαδικασίας εξαρτάται από την μεταφορά της χοληστερόλης στην έσω μιτοχονδριακή μεμβράνη, αντίδραση που καταλύεται από την οξεία στερεοειδογενετική ρυθμιστική πρωτεΐνη (StAR). Στη συνέχεια η πρεγνενολόνη μέσω της οδού των Δ5-στεροειδών μετατρέπεται σε 17-κετοστεροειδική δεύδροεπιανδροστερόνη (DHEA). Σημαντικό ρόλο σε αυτό το βήμα παίζει το κυτόχρωμα P450C17, που έχει δράσεις 17α-υδροξυλάσης και 17,20-λυάσης. Παράλληλα η πρεγνενολόνη, μέσω της οδού των Δ4-στεροειδών, μετατρέπεται σε ανδροστενεδιόνη (64). Η ενδοωοθηκική συγκέντρωση των ανδρογόνων είναι σημαντική για τη λειτουργία της ωοθήκης. Από την μία, τα ανδρογόνα είναι απαραίτητα υποστρώματα για τη βιοσύνθεση των οιστρογόνων και την ανάπτυξη των μικρών θυλακίων, από την άλλη όμως, όταν η συγκέντρωσή τους είναι ιδιαίτερα αυξημένη εμποδίζεται η ωοθυλακική ωρίμανση που οδηγεί σε ανάδειξη κυρίαρχου ωοθυλακίου, ενώ ταυτόχρονα προκαλείται υπερπλασία του στρώματος της ωοθήκης (65). Φαίνεται έτσι ότι η ωοθηκική σύνθεση των ανδρογόνων πρέπει να διατηρείται στο ελάχιστο επίπεδο που απαιτείται για την ανάπτυξη των θυλακίων.

18 Χοληστερόλη ' 1 P450scc Πρεγνενολόνη 3p-HSD Προγεστερόνη ι r 17α-υδροξυλάση 17-ΟΗ ττρεγνενολόνη 3β-ΗβΩ ^ 17-ΟΗ προγεστερόνη 17α-υδροξυλάση 17,20-λυάση Δεϋδροεττιανδροστερόνη I17,20-λυάση 3p-HSD - Ανδροστενδιόνη I 17P-HSD Τεστοστερόνη Ε ικόνα 4. Οδός βιοσύνθεσης των ανδρογόνων (P450scc: ένζυμο αποκοπής της πλάγιας αλύσου της χοληστερόλης, 3p-HSD: 3β-υδροξυστεροειδική δεϋδρογενάση και Δδ-ισομεράση, 17p-HSD: 17β-υδροξυστεροειδική δεϋδρογενάση) Σύμφωνα με την περιφερική ωοθηκική υπόθεση, υπεύθυνη για τη παθογένεια του ΣΠΩ θα μπορούσε να είναι μια διαταραχή της λειτουργίας του κυτοχρώματος P450c17 (ρυθμιστικό στάδιο της βιοσύνθεσης των ανδρογύνων), που θα οδηγούσε σε αυξημένη σύνθεση ανδρογόνων (66). Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι σε περίπου το 80% των γυναικών με ΣΠΩ υπάρχει ωοθηκική υπερανδρογοναιμία, που συνίσταται σε γενικευμένη ωοθηκική υπεραπαντητικότητα στη δράση των γοναδοτροπινών. Ως αποτέλεσμα, οι γυναίκες με ΣΠΩ έχουν αυξημένη σύνθεση 17α-υδροξυπρογεστερόνης (17-ΟΗΡ) και ανδροστενεδιόνης ως απάντηση στην LH (67). Αυτή η παρατήρηση επιβεβαιώθηκε και σε in vitro πειράματα, σε καλλιέργειες

19 κυπάρων θήκης ωοθηκών από γυναίκες με ΣΠΩ, στις οποίες βρέθηκε αυξημένη παραγωγή ανδροστενεδιόνης και επιπλέον η προσθήκη LH σε αυτές τις κυτταροκαλλιέργειες δεν μετέβαλλε το κλάσμα ανδροστενεδιόνης/προγεστερόνης, αποδεικνύοντας έτσι, ότι αυτή η υπερπαραγωγή δεν οφείλεται στις αυξημένες συγκεντρώσεις LH που μπορεί να παρατηρηθούν στο ΣΠΩ in vivo (68). Το κυτόχρωμα P450c17 συμμετέχει στη βιοσύνθεση των ανδρογόνων, τόσο στις ωοθήκες όσο και στα επινεφρίδια. Επομένως διαταραχή της λειτουργίας του θα μπορούσε να προκαλέσει αύξηση της σύνθεσης των ανδρογόνων και από τα επινεφρίδια. Έχει βρεθεί ότι περίπου το 50% των ασθενών με ΣΠΩ παρουσιάζουν επίσης ένα χαρακτηριστικό πρότυπο επινεφριδικής δυσλειτουργίας που συνίσταται σε μέτρια υπεραπαντητικότητα των 17-κετοστεροειδών και ειδικότερα της δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEA) στην ACTH (69). Αν και η πιθανότερη εκδοχή για την πρόκληση της επινεφριδικής υπερανδρογοναιμίας είναι η ενζυματική διαταραχή της στεροειδογένεσης, τα τελευταία χρόνια έχει υποστηριχθεί και ο πιθανός ρόλος της διαταραχής του μεταβολισμού της κορτιζόλης στη παθογένεια του ΣΠΩ. Σύμφωνα με αυτή τη θεωρία ο αυξημένος περιφερικός μεταβολισμός της κορτιζόλης είτε λόγω αυξημένης αδρανοποίησής της (μέσω αυξημένης δραστηριότητας της 5α-αναγωγάσης), είτε λόγω μειωμένης μετατροπής της από κορτιζόνη (μέσω διαταραχής της 11pHSD), οδηγεί σε αντισταθμιστική αύξηση της έκκρισης της ACTH (μέσω ελάττωσης του αρνητικού feedback), προκειμένου να διατηρηθούν φυσιολογικά τα επίπεδα της κορτιζόλης εις βάρος των επινεφριδικών ανδρογόνων (70-72). Ωστόσο ο μηχανισμός της διαταραχής της λειτουργίας της 5α-αναγωγάσης και της ΙΙβ Η Έ Ω στο ΣΠΩ και η πιθανή συμμετοχή της παχυσαρκίας και της αντίστασης στην ινσουλίνη δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Αν και τα επινεφριδικής προέλευσης ανδρογόνα είναι αυξημένα στο 20% των γυναικών με ΣΠΩ (46), οι ωοθήκες αποτελούν τον κύριο παράγοντα που συμβάλλει στην υπερανδρογοναιμία του συνδρόμου.

20 -Υπόθεση της ινσ ο υ λίνη ς Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, βλάβη στη δράση κάι/ή έκκριση της ινσουλίνης προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη με σνπρροτπσπκή υπερινσουλιναιμία (60). Το γεγονός ότι, τόσο το μόριο της ινσουλίνης, όσο και ο υποδοχέας της, δεν εμφανίζουν δομικές ανωμαλίες στο ΣΠΩ, υποστηρίζουν την υπόθεση όπ η αντίσταση στη δράση της ινσουλίνης, οφείλεται σε βλάβη του μηχανισμού μετάδοσης του ινσουλινικού σήματος, μετά την σύνδεση της ινσουλίνης με τον υποδοχέα της (73,74). Αυτή η διαταραχή της αγωγής του σήματος της ινσουλίνης, αφορά μόνο σπς δράσεις της ινσουλίνης που σχεπ'ζονται με τον μεταβολισμό των υδατανθράκων και τίθεται επομένως ζήτημα εκλεκτικής αντίστασης στην ινσουλίνη (75). Έ νας πιθανός μηχανισμός εξήγησης της αντίστασης στην ινσουλίνη, τουλάχιστον στο 50% των γυναικών με ΣΠΩ, είναι η αυξημένη φωσφορυλίωση της σερίνης, αντί της τυροσίνης, του ινσουλινικού υποδοχέα. Κάποιος παράγοντας εξωγενής του ινσουλινικού υποδοχέα, πιθανότατα κάποια σερίνη/θρεονίνη κινάσηί είναι υπεύθυνη για αυτή την φωσφορυλίωση της σερίνης, που οδηγεί σε διακοπή της μεταβίβασης του σήματος της ινσουλίνης (εικόνα 5) (76). PC Ε ικόνα 5. Μηχανισμός αντίστασης στην ινσουλίνη στο' ΣΠΩ. Κάποιος εξωγενής παράγοντας είναι υπεύθυνος για τη φωσφορυλίωση τη< σερίνης του ινσουλινικού υποδοχέα που διαταράσσει την αγωγή του σήματος της ινσουλίνης. Κυτταροκίνες και ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA) ενεργοποιούν ενδοκυττάριες κινάσες σερίνης και ίσως εμπλέκονται στη παθογένεια του ΣΠΩ.

21 Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει η παρατήρηση ότι ο μηχανισμός της φωσφορυλίωσης της σερίνης εμπλέκεται και στη ρύθμιση της δραστηριότητας της 17,20-λυάσης επηρεάζοντας την έκκριση των ανδρογόνων (77). Αυτή η διαπίστωση οδήγησε στην υπόθεση ότι ίσως να υπάρχει κοινή αιτιολογία για την ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη και υπερανδρογοναμίας στο ΣΠΩ. Πλήθος συζητήσεων έχουν γίνει, όσον αφορά το δίλημμα, εάν η υπερανδρογοναιμία προκαλεί υπερινσουλιναιμία ή το αντίστροφο. Οι περισσότερες μελέτες υποστηρίζουν ότι η υπερινσουλιναιμία οδηγεί σε υπερανδρογοναιμία. Έτσι η θεραπεία με αντιανδρογόνα, ή με φάρμακα που καταστέλλουν την ωοθηκική στεροειδογένεση (GnRH αγωνιστές), ενώ μειώνει τα επίπεδα των ανδρογύνων, δεν βελτιώνει την υπερινσουλιναιμία (78-80). Επίσης, ελάττωση των επιπέδων της ινσουλίνης με φάρμακα που ευαισθητοποιούν τους περιφερικούς ιστούς στη δράση της ορμόνης ή αναστέλλουν την έκκρισή της, βελτιώνουν τα επίπεδα του ελεύθερου κλάσματος ανδρογόνων και την ωοθηκική λειτουργία (81,82). Μολονότι υπάρχουν κάποιες μελέτες όπου η αντίσταση στην ινσουλίνη βελτιώθηκε με τη χορήγηση αντιανδρογόνων, η υπερανδρογοναιμία δε φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της αντίστασης στην ινσουλίνη στο ΣΠΩ (83,84). Έχει βρεθεί, ότι τα υψηλά επίπεδα ινσουλίνης: - διεγείρουν άμεσα την έκκριση της LH και αυξάνουν την ευαισθησία των υποφυσιακών κυττάρων που εκκρίνουν LH στην GnRH (85,86). - διεγείρουν την παραγωγή ανδρογόνων από τα επινεφρίδια και τις ωοθήκες ασκώντας ευοδωτική επίδραση στο κυτόχρωμα P450c17 (87,88), - μειώνουν τα επίπεδα της SHBG με επακόλουθη αύξηση του ελεύθερου κλάσματος ανδρογόνων (89), - μειώνουν τα επίπεδα της IGFBP-1 στο ήπαρ και την ωοθήκη με αποτέλεσμα αύξηση των ελεύθερων IGFs στην κυκλοφορία και ενδοωοθηκικά (90). Επιπλέον τα υψηλά επίπεδα ινσουλίνης προκαλούν προς τα πάνω ρύθμιση (upregulation) του

22 υποδοχέα του IGF-1, με αποτέλεσμα να ενισχύεται η δράση των IGFs αλλά και της ινσουλίνης στην ωοθήκη (91) και, - δρουν συνεργικά με την LH στο επίπεδο της ωοθήκης συμβάλλοντας στην ανωοθυλακιορρηξία και το σχηματισμό κυστεων (92). Οι τρεις αυτές υποθέσεις, η κεντρική, η περιφερική (ωοθηκική και επινεφριδική) και της ινσουλίνης, είναι συνδεόμενες και όχι απαραίτητα αλληλοαναιρούμενες. Παραδοσιακά το ΣΠΩ θεωρείται το αποτέλεσμα ενός «φαύλου κύκλου» που συμμετέχουν όλοι οι προηγούμενοι μηχανισμοί και σαν τελικό αποτέλεσμα έχουν την χρόνια ανωοθυλακιορρηξία και την υπερανδρογοναιμία. Πρόσφατα διατυπώθηκε η θεωρία «των δύο χτυπημάτων» (two-hit hypothesis) σύμφωνα με την οποία χρειάζονται δύο ή περισσότερες διαταραχές για να εκδηλωθεί το σύνδρομο (34). Το πρώτο «χτύπημα» που προδιαθέτει στην εμφάνιση του ΣΠΩ είναι η διαταραχή των στεροειδικών ενζύμων που εμπλέκονται στην ωοθηκική και επινεφριδική παραγωγή ανδρογύνων και το δεύτερο «χτύπημα» αφορά διαταραχές που οδηγούν σε ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμίας που επιδεινώνουν την υπερανδρογοναιμία. Ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα είναι και η «εξελικτική θεωρία» (developmental origin hypothesis) σύμφωνα με την οποία ο φαινότυπος του ΣΠΩ είναι αποτέλεσμα γενετικά καθορισμένη έκθεσης σε αυξημένα ανδρογόνα κατά την ενδομήτρια ζωή. Αυτή η έκθεση στα ανδρογόνα, «προγραμματίζει» τον υποθαλαμικο-υποφυσιακό άξονα να αυξήσει την έκκριση της LH στην μετέπειτα ζωή και επίσης ευνοεί την ανάπτυξη κοιλιακής παχυσαρκίας προδιαθέτοντας στην εμφάνιση αντίστασης στην ινσουλίνη (93). Επομένως το ΣΠΩ μπορεί να αποδειχθεί σημαντικό μοντέλο μελέτης για την κατανόηση της αλληλεπίδρασης γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων που συνεργικά συμβάλλουν στις ενδοκρινικές και μεταβολικές διαταραχές που το χαρακτηρίζουν.

23 3. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΑΣΗ ΤΟΥ ΣΠΩ Μολονότι υπάρχουν διαταραχές της ωοθηκικής λειτουργίας που είναι γενετικά καθορισμένες, η συχνότητα αυτών των διαταραχών είναι σπάνια. Τέτοια παραδείγματα αποτελούν η πρόωρη ωοθηκική ανεπάρκεια και η υποθαλαμική ανεπάρκεια της εκλυτικής ορμόνης των γοναδοτροπινών (94,95). Κύριες γενετικές αιτίες, για την πλειοψηφία των περιπτώσεων ωοθηκικής ανεπάρκειας, είναι οι χρωματοσωμικές ανωμαλίες όπως συμβαίνει για παράδειγμα στο σύνδρομο Turner και στη ΧΟ γοναδική δυσγενεσία. Αλλά η συχνότητα αυτών των νοσημάτων είναι μικρότερη από 0,02% (95). Το ΣΠΩ, σε αντίθεση, αποτελεί μια γενετικώς καθορισμένη διαταραχή της ωοθηκικής λειτουργίας, που όμως είναι και αρκετά συχνή. Κλινικές μελέτες των τελευταίων είκοσι χρόνων έδειξαν ότι το ΣΠΩ είναι μια οικογενής διαταραχή και διάφορα χαρακτηριστικά του συνδρόμου πιθανότατα κληρονομούνται με διαφορετικό τρόπο (96). Έ χει βρεθεί ότι το 40% από τις αδερφές και το 20% από τις μητέρες γυναικών με ΣΠΩ, πληρούν τα κριτήρια του συνδρόμου και επιπλέον ποσοστό περίπου 10% από τις αδερφές και 13% από τις μητέρες έχουν είτε μόνο υπερτρίχωση είτε μόνο ολιγομηνόρροια (97). Επίσης, οι άντρες συγγενείς πρώτου βαθμού γυναικών με ΣΠΩ έχουν διαταραχή της έκκρισης των ανδρογύνων με αυξημένα επίπεδα DHEAS όπως συμβαίνει και στο 50% των γυναικών που έχουν συγγενείς πρώτου βαθμού ασθενείς με ΣΠΩ (98,99). Από όλα τα χαρακτηριστικά του συνδρόμου, η υπερανδρογοναιμία per se αποτελεί το ισχυρότερο γενετικά κληρονομούμενο χαρακτηριστικό στις οικογένειες με μέλη που έχουν ΣΠΩ (100). Ο καθορισμός του τύπου της κληρονομικότητας του συνδρόμου είναι δύσκολος, λόγω της ετερογένειας των κλινικών και βιοχημικών χαρακτηριστικών του ΣΠΩ και γιατί όλες οι μελέτες που έχουν γίνει δεν έχουν χρησιμοποιήσει τα ίδια κριτήρια καθορισμού του συνδρόμου. Επιπλέον δεν υπάρχει σαφώς καθορισμένος ανδρικός φαινότυπος και αυτή η διαταραχή εκφράζεται κλινικά μόνο σε γυναίκες της αναπαραγωγικής ηλικίας.

24 Θεωρώντας ως αντρικό φαινότυπο του συνδρόμου την πρώιμη αλωπεκία (εμφάνιση αλωπεκίας πριν την ηλικία των 30) προτάθηκε ο αυτοσωματικός κυρίαρχος τύπος κληρονομικότητας με τον οποίο συμφωνούν και οι περισσότερες μελέτες (101-103). Υπάρχουν όμως και μελέτες που υποστηρίζουν, ότι η συχνότητα του ΣΠΩ σε κάποιες οικογένειες είναι τόσο μεγάλη και οι εκδηλώσεις τόσο ετερογενείς, ώστε δε μπορεί ο τύπος κληρονομικότητας να εξηγηθεί απλώς με τον αυτοσωματικό κυρίαρχο τύπο κληρονομικότητας του Mendel (104). Σε αυτό το συμπέρασμα συγκλίνει και μελέτη μονοζυγωτικών και διζυγωτικών διδύμων κοριτσιών σύμφωνα με την οποία το ΣΠΩ δεν μπορεί να είναι αποτέλεσμα μιας μόνο αυτοσωματικής βλάβης και ίσως να είναι το αποτέλεσμα πολυγονιδιακής επίδρασης (105). Έτσι ο τύπος κληρονομικότητας παραμένει ασαφής, αν και γενικώς, θεωρείται ότι το ΣΠΩ αποτελεί επικρατούσα κληρονομική διαταραχή με υψηλό βαθμό εκφραστικότητας του φαινοτύπου και φαίνεται ότι περισσότερα από ένα γονίδια αλληλεπιδρώντας μεταξύ τους αλλά και με περιβαλλοντικούς παράγοντες, κυρίως διατροφικούς, παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη του συνδρόμου. Οι περισσότερες μελέτες, που προσπάθησαν να εξηγήσουν τη γενετική βάση του συνδρόμου, είναι μελέτες συσχέτισης και μη-παραμετρικές αναλύσεις της γενετικής σύνδεσης και έστιασαν στη διερεύνηση γονιδίων που σύμφωνα με την παθοφυσιολογια του ΣΠΩ θεωρήθηκαν υποψήφια. Ως αποτέλεσμα ένα πλήθος γονιδίων έχει μελετηθεί στη προσπάθεια να εξηγηθεί η γενετική βάση του ΣΠΩ, που όμως παραμένει άγνωστη. Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 1, τα γονίδια που μελετήθηκαν μπορούν να ομαδοποιηθούν σε πέντε κατηγορίες: -γονίδια που εμπλέκονται στην έκκριση και δράση των γοναδοτροπινών, -γονίδια που εμπλέκονται στην σύνθεση και δράση των ανδρογύνων, -γονίδια που εμπλέκονται στην έκκριση και δράση της ινσουλίνης -γονίδια που εμπλέκονται στην ωοθυλακιογένεση και, -γονίδια που σχετίζονται με την παχυσαρκία και την ενεργειακή ομοιόσταση. Τα σημαντικότερα από αυτά τα γονίδια αναφέρονται στη συνέχεια.

25 Α. Γονίδια που εμπλέκονται στην έκκριση και δράση των γοναδοτροπινών 1. Γονίδιο του υποδοχέα της GnRH 2. Γονίδιο της β-υποομάδας της LH (LH-β). 3. Γονίδιο του υποδοχέα της LH 4. Γονίδιο της β-υποομάδας της FSH (FSH-β) 5. Γονίδιο του υποδοχέα της FSH. 6. Γονίδια των D2 και D3 ντοπαμινινεργικών υποδοχέων Β. Γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση και δράση των ανδρογύνων 1. Γονίδιο της οξείας στεροειδογενετικής ρυθμιστικής πρωτεΐνης (StAR) 2. Γονίδιο CYP17 3. Γονίδιο CYP11a 4. Γονίδιο CYP19 5. Γονίδιο CYP21 6. Γονίδιο της 3β-Η 8ϋ I, II 7. Γονίδιο της Ι ΐβ -H SD I, II, III 8. Γονίδιο του υποδοχέα των ανδρογύνων Γ. Γονίδια που εμπλέκονται στην έκκριση και δράση της ινσουλίνης 1. Γονίδιο της ινσουλίνης 2. Γονίδιο του υποδοχέα της ινσουλίνης '3. Γονίδια των υποστρωμάτων του ινσουλινικού υποδοχέα -1 και -2 4. Γονίδιο της PC-1 5. Γονίδιο της πρωτεϊνικής τυροσινικής φωσφατάσης 1Β (ΡΤΡ1 Β) 6. Γονίδιο του IGF-1,IGF-2 και των υποδοχέων τους 7. Γονίδιο της IGFBP1+3 8. Γονίδιο του PPARy 9. Γονίδιο της καλπαϊνηςί 0 10. Γονίδιο της παραοξονάσης Δ. Γονίδια που εμπλέκονται στην ωοθυλακιογένεση 1. Γονίδιο της φολλιστατίνης 2. Γονίδιο του υποδοχέα της ακτιβίνης 1 και 2Α και 2Β. Ε. Γονίδια που εμπλέκονται στην παχυσαρκία / ενεργειακή ομοιάσταση 1. Γονίδιο της λεπτίνης και του υποδοχέα της λεπτίνης 2. Γονίδιο του γλυκοκορτικοειδικού υποδοχέα Π ίνακας 1. Γονίδια που έχουν μελετηθεί για τη πιθανή συσχέτισή τους με το ΣΠΩ (130,190-192)

26 3.1 ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΜ ΠΛΕΚΟ ΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΚΚΡΙΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ Γ ΟΝ ΑΔΟΤΡΟΠΙΝΩ Ν 3.1.1. Γονίδιο τη ς β-υττοομάδας της ωχρινοτρόττου ορμόνης (LH-β). Βασιζόμενοι στην παρατήρηση ότι στο ΣΠΩ υπάρχει υπερέκκριση της LH, το γονίδιο της β-υποομάδας της LH (LH-β) θεωρήθηκε ένα από τα υποψήφια γονίδια. Έχουν ταυτοποιηθεί δύο γενετικές παραλλαγές της LH. Η πρώτη γενετική παραλλαγή (vlh), φέρει δύο σημειακές μεταλλάξεις στο εξόνιο 2, και συγκεκριμένα φέρει αλλαγή της Trp (TGG) σε Arg (CGG) στη θέση 8 και της lie (ATC) σε Thr (ACC) στη θέση 15, οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα δομικές αλλαγές του μορίου της LH (106). Αυτή η γενετική παραλλαγή αποτελεί έναν παγκοσμίως κοινό πολυμορφισμό με μέση συχνότητα εμφάνισης που φθάνει στο 18,5% του πληθυσμού. Παρατηρείται σε μεγαλύτερη συχνότητα σε πληθυσμούς της βόρειας Ευρώπης (41.9% στους Λάπωνες της βόρειας Φινλανδίας) και η συχνότητα μειώνεται καθώς αυξάνει η γεωγραφική απόσταση, έχοντας τη μικρότερη συχνότητα εμφάνισης σε πληθυσμούς της Ασίας (12% στην Ιαπωνία, 7.1% στους ιθαγενείς Μεξικανούς που είναι ασιατικής προέλευσης) (107). Όσον αφορά τη λειτουργική σημασία αυτής της παραλλαγής, έχει βρεθεί ότι ενώ σε in vitro πειράματα είναι πιο βιολογικά δραστική από τον άγριο τύπο LH, ο χρόνος ημιζωής της vlh στην κυκλοφορία είναι μικρότερος και έτσι το συνολικό αποτέλεσμα, όσον αφορά την in vivo δράση της, παραμένει ασαφές (108). Από τη στιγμή που περί γράφηκε η vlh, αυξημένο ενδιαφέρον δόθηκε στη πιθανή συσχέτιση με καταστάσεις ωοθηκικής δυσλειτουργίας και οι πρώτες μελέτες έδειξαν να συσχετίζεται με υπογονιμότητα (106,109). Οι Tapanainen et al (110) διαπίστωσαν ότι αυτή η γενετική παραλλαγή παρατηρείται σε μικρότερη συχνότητα σε παχύσαρκες ασθενείς με ΣΠΩ και έτσι φαίνεται ότι ίσως η vlh κατά κάποιο τρόπο προστατεύει τις παχύσαρκες γυναίκες από το να αναπτύξουν ΣΠΩ και πιθανότατα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση παχύσαρκων γυναικών που κινδυνεύουν να αναπτύξουν ΣΠΩ. Ωστόσο δεν παρατήρησαν διαφορές ανάμεσα στις γυναίκες με

27 ΣΠΩ όταν τις συνέκριναν συνολικά με υγιείς γυναίκες, συμττεραίνοντας ότι ο πολυμορφισμός αυτός δεν σχετίζεται με την ανάπτυξη του συνδρόμου, κάτι που επιβεβαιώθηκε και σε άλλες μελέτες (107, 111-113). Επιπλέον, το γεγονός ότι η vlh παρατηρείται σε μεγάλη συχνότητα, τόσο σε υγιείς γυναίκες όσο και σε γυναίκες με ΣΠΩ, δείχνει ότι η vlh είναι συμβατή με τη γονιμότητα. Η δεύτερη γενετική παραλλαγή της LH, αφορά σε μια σημειακή αλλαγή στο εξόνιο 3 του LH-β γονιδίου, που οδηγεί σε αντικατάσταση της γλυκίνης από σερίνη στη θέση 102 (114). Οι αρχικές μελέτες συσχέτισαν αυτή την παραλλαγή με την ανάπτυξη υπογονιμότητας στις γυναίκες (112,115). Η λειτουργική σημασία της όμως δεν έχει καθοριστεί και υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα σχετικά με το αν αυτός ο πολυμορφισμός επηρεάζει τη βιοδραστικότητα της LH (116,117) και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να καθοριστεί η φυσιολογική σημασία αυτής τπζ παραλλαγής καθώς και ο πιθανός ρόλος στην παθογένεια του ΣΠΩ. 3.2. ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΜ ΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΔΡΟΓΟΝΩΝ 3.2.1 Το γονίδιο της 17α-υδροξυλάσης / 17,20-λυάσης (C YP 17) Οι γυναίκες με ΣΠΩ εμφανίζουν διαταραχή της λειτουργίας του κυτοχρώματος P450c17a (εικόνα 4) και πιο συγκεκριμένα έχουν αυξημένη δραστηριότητα της 17αυδροξυλάσης και σε μικρότερο βαθμό της 17,20-λυάσης (118). Η σχετική αναλογία της δραστηριότητας της 17-υδροξυλάσης προς την 17,20-λυάση αποτελεί το κλειδί ελέγχου για τη βιοσύνθεση των ανδρογόνων και επομένως διαταραχή αυτού του λόγου θα μπορούσε να οδηγήσει σε διαταραχή της έκκρισης των ανδρογόνων από τις ωοθήκες και τα επινεφρίδια. Αποτέλεσμα αυτών των παρατηρήσεων ήταν να μελετηθεί ο πιθανός ρόλος του CYP17, που είναι το γονίδιο που κωδικοποιεί το κυτόχρωμα P450c17a και βρίσκεται στο χρωματόσωμα 10q24.3 (119). Έχει βρεθεί ότι το γονίδιο αυτό υπερεκφράζεται στα κύτταρα θήκης των πολυκυστικών ωοθηκών (120). Στη ρυθμιστική περιοχή του

28 CYP17 γονιδίου, έχει περιγράφει μια σημειακή αλλαγή βάσης (θυμίνη σε κυτοσίνη), 34 ζεύγη βάσεων πριν το σημείο έναρξης της μετάφρασης, στην περιοχή του υποκινητή (promoter). Λόγω της θέσης αυτού του πολυμορφισμού πιθανολογήθηκε ότι θα μπορούσε να ευθύνεται για την υπερέκφραση του γονιδίου CYP17 οδηγώντας σε αυξημένη σύνθεση ανδρογόνων. Οι αρχικές μελέτες υποστήριξαν ότι υπάρχει συσχέτιση αυτού του πολυμορφισμού και συγκεκριμένα του σπάνιου αλληλόμορφου με το ΣΠΩ, αλλά αφορούσαν μικρό πληθυσμό ατόμων (121,122). Μετέπειτα πολυπληθέστερες μελέτες έδειξαν ότι η συχνότητα του δεν διέφερε στις γυναίκες με ΣΠΩ σε σύγκριση με υγιείς γυναίκες και δεν βρέθηκε συσχετισμός του με τα επίπεδα τεστοστερόνης (123-125). Επιπλέον, βρέθηκε ότι αυτός ο πολυμορφισμός δεν έχει λειτουργική σημασία για την έκφραση του CYP17 (126). Φαίνεται επομένως ότι αυτή η αλλαγή βάσης στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου CYP17 αποτελεί συνήθη πολυμορφισμό και πιθανότατα άλλοι μηχανισμοί να ευθύνονται για την υπερέκφραση του γονιδίου CYP17 στο ΣΠΩ (127). 3.2.2. Το γονίδιο απ οκοπής π λάγιας αλύσου χοληστερόλης (CYP11a). Εκτός από το γονίδιο CYP17 και το γονίδιο CYP11a, που κωδικοποιεί το ένζυμο αποκοπής της πλάγιας αλύσου χοληστερόλης (P450scc, Ρ450 side chain cleavage enzyme) έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται στα κύτταρα θήκης και κοκκιώδη κύτταρα της ωοθήκης στο ΣΠΩ (120). Έτσι το γονίδιο CYP11a μελετήθηκε για πιθανούς πολυμορφισμούς που θα μπορούσαν να συσχετιστούν με το ΣΠΩ. Το γονίδιο CYP11a βρίσκεται στο μακρό βραχίονα του χρωματοσώματος 15, στη θέση 15q24 (119). Στην περιοχή του υποκινητή, ταυτοποιήθηκε μια πολυμορφική περιοχή και πιο συγκεκριμένα μια πεντανουκλεοτιδική επανάληψη (III ΙΑ), -528bps από το ATG σημείο έναρξης της μετάφρασης. Στον φυσιολογικό πληθυσμό βρέθηκαν αλληλόμορφα με τέσσερις, έξι, οκτώ και εννέα επαναλήψεις, με πιο συχνό το αλληλόμορφο με τις τέσσερις επαναλήψεις. Το ΣΠΩ συσχετίστηκε με την απουσία του αλληλόμορφου με τις τέσσερις επαναλήψεις και η συσχέτιση αυτή ήταν πιο

29 σημαντική ιδιαίτερα σε ασθενείς με κλινικά σημεία υπερανδρογοναιμίας (128). Στην ίδια μελέτη ο πολυμορφισμός συσχετίστηκε και με τα επίπεδα τεστοστερόνης ορού (128). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν στη συνέχεια και σε ελληνικό πληθυσμό γυναικών με ΣΠΩ (129). Αν και αρχικά, το γονίδιο CYP11a θεωρήθηκε ως κύριος γενετικός τόπος (locus) για την εμφάνιση του ΣΠΩ, υπήρξαν μελέτες που δεν επιβεβαίωσαν τη συσχέτιση του (tttta)n πολυμορφισμού με την ανάπτυξη του συνδρόμου και τα διαφορετικά αποτελέσματα αποδόθηκαν σε φυλετικές ή εθνικές διαφορές των πληθυσμών μελέτης (130-132). Επιπλέον βρέθηκε ότι ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός δεν επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου CYP11a και επομένως δεν μπορεί να εξηγήσει την υπερέκφραση του γονιδίου στο ΣΠΩ (126). Έ τσ ι φαίνεται ότι η συμβολή του στη παθογένεια του συνδρόμου είναι μικρή, ενώ δεν είναι απίθανο άλλοι πολυμορφισμοί του CYP11a να εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ΣΠΩ. 3.2.3. Το γονίδιο της αρω ματάσης (C YP19) Ένα άλλο ένζυμο κλειδί για τη στεροειδογένεση είναι η αρωματάση (P450arom), που καταλύει την μετατροπή των C19 στεροειδών (ανδρογόνα) σε C18 (οιστρογόνα) (133). Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί περιπτώσεις ασθενών με υπερανδρογοναιμία που οφειλόταν σε έλλειψη αρωματάσης (134,135). Επιπλέον, σε ανοσοϊστοχημικές μελέτες πολυκυστικών ωοθηκών, δεν μπόρεσε να ανιχνευθεί επαρκή ποσότητα αρωματάσης, σε θυλάκια διαφόρων μεγεθών (136). Ως αποτέλεσμα αυτών των παρατηρήσεων, εξετάστηκε ο πιθανός ρόλος του γονιδίου της αρωματάσης (CYP19) στο ΣΠΩ, αλλά ως τώρα μελέτες του γονιδίου δεν το συσχετίζουν με το σύνδρομο (128,130,137). Επιπρόσθετα σε in vitro μελέτες κοκκιωδών κυττάρων πολυκυστικών ωοθηκών παρατηρήθηκε αυξημένη παραγωγή οιστραδιόλης μετά από διέγερση με FSH, σε σύγκριση με κύτταρα φυσιολογικών ωοθηκών και αυτό σημαίνει ότι δεν υπάρχουν στοιχεία για πραγματική έλλειψη αρωματάσης στις πολυκυστικές ωοθήκες (138). Επομένως δεν υπάρχουν στοιχεία

30 ττου να τεκμηριώνουν της αρχική υπόθεση για τον πιθανό ρόλο της αρωματάσης στο ΣΠΩ. 3.2.4. Το γονίδιο του υποδοχέα τω ν ανδρογύνω ν (A R) Όλα τα ανδρογόνα δρουν μέσω του υποδοχέα των ανδρογύνων, ο οποίος ανήκει στην οικογένεια των πυρηνικών μεταγραφικών παραγόντων και κωδικοποιείται από το γονίδιο AR, που έχει χαρτογραφηθεί στη θέση Xq11-12 (139,140). Το γονίδιο AR περιέχει μια πολυμορφική περιοχή στο εξόνιο 1, η οποία αποτελείται από επαναλαμβανόμενα CAG τρινουκλεοτίδια που κωδικοποιεί μια πολυγλουταμινική αλυσίδα στην αμινοτελική λειτουργική περιοχή του υποδοχέα (141). Σε υγιή άτομα, ο αριθμός των επαναλήψεων CAG ποικίλλει από 11 έως 31, με πιο συχνό αλληλόμορφο, το αλληλόμορφο με τις 20 επαναλήψεις (142). Το μήκος αυτής της πολυμορφικής περιοχής συσχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα με την μεταφραστική δραστηριότητα του γονιδίου AR. Πιο συγκεκριμένα, όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των επαναλήψεων, τόσο μικρότερη είναι η μεταφραστική δραστηριότητα του γονιδίου (143). Είναι γνωστό ότι αλληλουχίες επαναλαμβανόμενων τρινουκλεοτιδίων αποτελούν θέσεις γενετικής αστάθειας και μπορεί να είναι υπεύθυνες για πρόκληση γενετικών νοσημάτων, όπως είναι το σύνδρομο του εύθραυστου X και η μυοτονική δυστροφία (144). Στην περίπτωση του γονιδίου AR, έχει βρεθεί ότι παθολογικά μεγάλος αριθμός CAG επαναλήψεων (>40), προκαλεί το σύνδρομο Kennedy, ένα φυλοσύνδετο σύνδρομο, το οποίο χαρακτηρίζεται από προοδευτική νωτιαία μυϊκή ατροφία και ποικίλου βαθμού αντίσταση στα ανδρογόνα (145). Ενώ, σχετικά μικρός αριθμός CAG επαναλήψεων (<22) σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του προστάτη και μικρότερο κίνδυνο υπογονιμότητας στους άντρες (146,147). Όσον αφορά το ΣΠΩ, οι Legro et al (148), μολονότι δεν βρήκαν διαφορά στον αριθμό των CAG επαναλήψεων συγκρίνοντας γυναίκες με φυσιολογικά επίπεδα ανδρογόνων και υπερανδρογοναιμικές γυναίκες, παρατήρησαν μια αντιστρόφως

31 ανάλογη σχέση του αριθμού των επαναλήψεων με το βαθμό υπερτρίχωσης σε γυναίκες με ιδιοπαθή υπερτρίχωση. Κατέληξαν, έτσι, στη διαπίστωση ότι οι υποδοχείς ανδρογόνων με βραχέα CAG αλληλόμορφα είχαν αυξημένη ευαισθησία στα ανδρογόνα. Άλλη κλινική παρατήρηση που υποστηρίζει αυτή τη διαπίστωση, δόθηκε με τη συσχέτιση αυτού του πολυμορφισμού με ανδρογενετικές δερματικές εκδηλώσεις, τόσο σε γυναίκες όσο και σε άντρες (149). Επίσης, οι Mifsud et al (150) παρατήρησαν αυξημένη συχνότητα βραχέων CAG αλληλομόρφων στην υποομάδα γυναικών με ΣΠΩ που είχαν χαμηλά επίπεδα ανδρογόνων, αποδίδοντας τον φαινότυπο ΣΠΩ αυτής της υποομάδας, σε αυξημένη ενδογενή δραστηριότητα του υποδοχέα των ανδρογόνων, λόγω των βραχέων CAG αλληλομόρφων. Οι Vottero et al (151) δεν παρατήρησαν διαφορά στη συχνότητα αυτού του πολυμορφισμού σε γυναίκες με υπερανδρογοναιμία και σε υγιείς γυναίκες και υποστήριξαν τη θεωρία της παράκαμψης της τυχαίας απενεργοποίησης του X χρωματοσώματος. Σύμφωνα με αυτή τη θεωρία, σε αντίθεση με την υπόθεση του Lyon που υποστηρίζει τη τυχαία μεθυλίωση του ενός από τα X χρωματοσώματα, στις γυναίκες με υπερτρίχωση μεθυλιώνεται κατά προτίμηση το μεγαλύτερο σε μήκος αλληλόμορφο του γονιδίου AR. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, το μεθυλιωμένο αλληλόμορφο να μη μπορεί να εκφραστεί και να επιτρέπει στο βραχύτερο αλληλόμορφο να είναι λειτουργικό και υπεύθυνο για την περιφερική υπερευαισθησία στη δράση των ανδρογόνων. Σε αντίθεση, οι Hickey et al (152) επιβεβαίωσαν ότι το μεγαλύτερο σε μήκος CAG αλληλόμορφο είναι αυτό που μεθυλιώνεται, χωρίς όμως αυτό να αποτελεί χαρακτηριστικό των γυναικών με ΣΠΩ και επίσης παρατήρησαν ότι στο ΣΠΩ παρατηρούνται σε μεγαλύτερη συχνότητα μακρά CAG αλληλόμορφα (>22 επαναλήψεις) που συσχετίζονται και με υψηλότερα επίπεδα ανδρογόνων. Ενώ τέλος οι Calvo et al (153), διαπίστωσαν ότι ούτε ο αριθμός των CAG επαναλήψεων, ούτε το φαινόμενο της παράκαμψης της τυχαίας απενεργοποίησης του X χρωματοσώματος σχετίζονται με την ύπαρξη υπερανδρογοναιμίας στις γυναίκες. Από όλα αυτά,

32 φαίνεται ότι χρειάζονται περισσότερες μελέτες για να διερευνηθεί ο ρόλος αυτού του πολυμορφισμού στην ανάπτυξη του ΙΠ Ω. 3.3. ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΕΚΚΡΙΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗΣ. 3.3.1. Το γονίδιο της ινσουλίνης Η αντίσταση στην ινσουλίνη είναι κατά μεγάλο βαθμό αναστρέψιμη με την ελάττωση του σωματικού βάρους σε παχύσαρκες ασθενείς με ΣΠΩ, ωστόσο εξακολουθεί να υπάρχει διαταραχή της πρώτης φάσης της έκκρισης της ινσουλίνης από τα β-κύτταρα του παγκρέατος (154). Αυτή η παρατήρηση οδήγησε στη διερεύνηση του ρόλου του γονιδίου της ινσουλίνης στην παθογένεια του ΣΠΩ. Το γονίδιο της ινσουλίνης βρίσκεται ανάμεσα από το γονίδιο της υδροξυλάσης της τυροσίνης και το γονίδιο του παρόμοιου με την ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα-2 (IGF-2), στο χρωμόσωμα 11ρ15.5 (155). Σε αυτό το γονίδιο, στο 5 άκρο, μελετήθηκε μια μικροδορυφορική περιοχή, αποτελούμενη από ποικίλο αριθμό επαναλήψεων, το INS-VNTR (Insulin Gene Variable Number Tandem Repeats). Αυτή η περιοχή φαίνεται να εμπλέκεται άμεσα στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της ινσουλίνης. Πρόκειται για μια πολυμορφική περιοχή, η οποία αποτελείται από αλληλουχίες 14-15 ζευγών βάσεων που επαναλαμβάνονται. Η πιο συχνή επαναλαμβανόμενη αλληλουχία είναι η ACAGGGGTGTGGGG. Ο πολυμορφισμός INS-VNTR βρίσκεται 596 ζεύγη βάσεων πριν το κωδικόνιο έναρξης (ATG) της μετάφρασης του γονιδίου της ινσουλίνης, στην περιοχή του υποκινητή. Ο αριθμός των επαναλήψεων στην μικροδορυφορική αυτή περιοχή του γονιδίου ποικίλλει από 26 έως και πάνω από 200. Τα αλληλόμορφα του INS-VNTR διακρίνονται σε τρεις τύπους ανάλογα με το μέγεθος: - τα τύπου I αλληλόμορφα (class I) είναι τα βραχύτερα και αποτελούνται από 26-63 επαναλήψεις (κατά μέσο όρο 40 επαναλήψεις),

33 - τα τύπου II (class II) αλληλόμορφα είναι σπάνια στην Καυκάσια φυλή, έχουν μέτριο μέγεθος, αποτελούμενα από περίπου 80 επαναλήψεις, και - τα τύπου III (class III) αλληλόμορφα, που έχουν το μεγαλύτερο μέγεθος, έχοντας 141-209 επαναλήψεις (κατά μέσο όρο 157 επαναλήψεις) (156). Ο πολυμορφισμός INS-VNTR έχει λειτουργική σημασία, ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου της ινσουλίνης και πιθανότατα και του γονιδίου του IGF-2 (157). Δεν κωδικοποιεί καμία γνωστή πρωτεΐνη και έχει βρεθεί ότι το γονίδιο της ινσουλίνης, που περιέχει το τύπου III INS-VNTR αλληλόμορφο, έχει μεγαλύτερη μεταγραφική δραστηριότητα από το τύπου IINS-VNTR αλληλόμορφο (158). Ο λειτουργικός ρόλος του πολυμορφισμού πιθανότατα επιτυγχάνεται μέσω σύνδεσης με μεταγραφικούς παράγοντες, όπως φάνηκε σε in vitro πειράματα. Πιο συγκεκριμένα, ο πολυμορφισμός INS-VNTR περιέχει θέσεις υψηλής συγγένειας σύνδεσης με τον μεταγραφικό παράγοντα Pur-1, που έχει την ικανότητα να επάγει την έκφραση του γονιδίου της ινσουλίνης, ακόμα και σε κύπαρα που υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν εκφράζουν το γονίδιο της ινσουλίνης (158). Το τύπου III αλληλόμορφο του INS-VNTR, και ειδικότερα ο γονότυπος ΙΙΙ/ΙΙΙ, έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη και τον σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (159-161). Επίσης, αυτός ο γονότυπος έχει συσχετιστεί με την κεντρική παχυσαρκία (159) και με μεγαλύτερο βάρος γέννησης (161). Επιπλέον το επίτοπο (locus) IDDM2 του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 έχει χαρτογραφηθεί στο INS-VNTR και το τύπου III αλληλόμορφο έχουν συσχετιστεί με μικρότερο κίνδυνο εμφάνισης σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 (162). Οι Waterworth et al (163) παρατήρησαν ότι τα τύπου III αλληλόμορφα και ιδιαίτερα ο γονότυπος ΙΙΙ/ΙΙΙ, σχετίζονται και με την ανάπτυξη του ΣΠΩ, ειδικότερα σε γυναίκες με ανωοθυλακιορρηκτικούς κύκλους. Επίσης παρατήρησαν ότι γυναίκες ομοζυγώτες ή ετεροζυγώτες για το τύπου III αλληλόμορφο είχαν υψηλότερα επίπεδα ινσουλίνης νηστείας και μεγαλύτερο δείκτη μάζας σώματος, συγκρινόμενες με ομοζυγώτες γυναίκες για το τύπου I αλληλόμορφο. Αυτό το συμπέρασμα επιβεβαιώνεται και από

34 την παρατήρηση ότι οι γυναίκες με πολυκυστικές ωοθήκες και χρόνια ανωοθυλακιορρηξία έχουν σημαντικότερου βαθμού υπερινσουλιναιμία από υπερανδρογοναιμικές ασθενείς με φυσιολογικό εμμηνορρυσιακό κύκλο (164). Επίσης στην ίδια μελέτη παρατηρήθηκε ότι ο ομόζυγος γονότυπος ΙΙΙ/ΙΙΙ είναι συχνότερος σε γυναίκες με ΣΠΩ παρά σε γυναίκες που έχουν μόνο πολυκυστική εμφάνιση ωοθηκών και είναι ασυμτττωματικές (163). Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση, ότι το τύπου III αλληλόμορφο μεταβιβάζεται συχνότερα από το τύπου I αλληλόμορφο από Ι/ΙΙΙ ετερόζυγους γονείς σε κορίτσια με ανωορρηκτικό ΣΠΩ και η μεταβίβαση αυτή είναι συχνότερη από τον πατέρα (165,166). Η συσχέτιση του ΣΠΩ με τον πολυμορφισμό INS-VNTR επιβεβαιώθηκε και από τους Michelmore et al (167). Ωστόσο υπήρξαν και μελέτες που υποστήριξαν την έλλειψη συσχέτισης αυτού του πολυμορφισμού με το ΣΠΩ (130,168,169). Αυτές οι διαφορές πιθανότατα οφείλονται στα διαφορετικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των υπό μελέτη πληθυσμών αλλά και στις διαφορετικές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του πολυμορφισμού, μιας και υπήρξαν μελέτες με άμεση ταυτοποίηση του μήκους του INS-VNTR και άλλες όπου η ταυτοποίηση του πολυμορφισμού έγινε έμμεσα με τη χρήση σημειακού πολυμορφισμού που βρίσκεται σε σύνδεση με τον INS-VNTR. Φαίνεται ότι ο πολυμορφισμός INS-VNTR είναι κύριος γενετικός τόπος για το ΣΠΩ. Αν λάβουμε υπόψη ότι τα τύπου III INS-VNTR αλληλόμορφο έχουν επίσης συσχετιστεί και με τον σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι αυτός ο γονότυπος μπορεί να προδιαθέσει, όχι μόνο στην εμφάνιση του ΣΠΩ, αλλά και να καθορίσει ποιες από αυτές τις γυναίκες αντιμετωπίζουν κίνδυνο εμφάνισης σακχαρώδη διαβήτη στο μέλλον. 3.3.2 Το γονίδιο του υποδοχέα της ινσουλίνης Ο υποδοχέας της ινσουλίνης είναι μια ετεροτετραμερής γλυκοπρωτεΐνη αποτελούμενη από δύο α- και δύο β- υποομάδες. Το γονίδιο, που κωδικοποιεί τον

35 υποδοχέα της ινσουλίνης αποτελείται από 22 εξόνια και βρίσκεται στο χρωματόσωμα 19 (170). Η αρχική υπόθεση ήταν, ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη, που χαρακτηρίζει το ΣΠΩ, θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα ανωμαλίας του υποδοχέα της ινσουλίνης. Εξάλλου μεταλλάξεις αυτού του γονιδίου έχουν ταυτοποιηθεί σε διάφορα σπάνια σύνδρομα τα οποία, όπως και το ΣΠΩ, χαρακτηρίζονται από υπερανδρογοναιμία και αντίσταση στην ινσουλίνη (λεπρεχωνισμός, σύνδρομο Rabson-Mendenhall, Τύπου A αντίσταση) (171). Μοριακές μελέτες του γονιδίου του υποδοχέα της ινσουλίνης σε γυναίκες με ΣΠΩ έδειξαν μεγάλο αριθμό «σιωπηλών» πολυμορφισμών, κυρίως στις αλληλουχίες των ιντρονίων (στο 5'ιντρόνιο του εξονίου 3, στα 3Ίντρόνια των εξονίων 6,7 και 15 και στα ιντρόνια του εξονίου 22). Αν και οι πολυμορφισμοί των ιντρονίων είναι μικρής λειτουργικής σημασίας, είναι πιθανό να μεταβάλλουν το συναρμογή (splicing) των εξονίων. Όμως, αυτοί οι πολυμορφισμοί ανιχνεύτηκαν και σε φυσιολογικά άτομα, αποτελούν συνήθεις μεταλλάξεις και δε μπορούν να οδηγήσουν σε αξιοσημείωτη διαταραχή της λειτουργίας του υποδοχέα (73,74,172). Έτσι καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η λειτουργία του υποδοχέα της ινσουλίνης πιθανότατα είναι φυσιολογική σε γυναίκες με ΣΠΩ. Δεν έχει καθοριστεί ακόμη, αν υπάρχει γενετική βάση για την αυξημένη φωσφορυλίωση της σερίνης αντί της τυροσίνης στην β- υποομάδα του υποδοχέα της ινσουλίνης, που αναστέλλει την αγωγή του σήματος της ινσουλίνης μετά τη σύνδεση με τον υποδοχέα της (76). Πρόσφατες μελέτες, έδειξαν συσχέτιση του ΣΠΩ με ένα γενετικό τόπο (locus), το D19S884, που βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 19 (19ρ13.3), κοντά, αλλά όχι σε ανισορροπία σύνδεσης (linkage disequilibrium), με το γονίδιο του υποδοχέα της ινσουλίνης (137,173). Επομένως, είναι απίθανο η συσχέτιση αυτού του γενετικού τόπου με το ΣΠΩ, να οφείλεται σε σύνδεση του με κάποιο πολυμορφισμό του γονιδίου του υποδοχέα της ινσουλίνης και κάποιο άγνωστο γειτονικό γονίδιο φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο. Ωστόσο χρειάζονται περισσότερες και

36 πολυπληθέστερες μελέτες να επιβεβαιώσουν αν αυτός ο γενετικός τόπος έχει λειτουργική σημασία και επηρεάζει τη δράση της ινσουλίνης. Το ίδιο χρειάζεται να συμβεί και για πρόσφατες μελέτες που συσχετίζουν πολυμορφισμούς των γονιδίων που κωδικοποιούν τα υποστρώματα-1 και -2 του υποδοχέα της ινσουλίνης (IRS-1, IRS-2) με μεταβολικές παραμέτρους του ΣΠΩ (174,175). Τα υποστρώματα IRS-1 και IRS-2 είναι βασικής σημασίας για την αγωγή του σήματος της ινσουλίνης στους ιστούς-στόχους και έχει βρεθεί ότι δύο πολυμορφισμοί των γονιδίων τους (ο Gly972Arg στο IRS-1 και ο Gly1057Asp στο IRS-2) συσχετίζονται με το σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (176). Ο πολυμορφισμός Gly972Arg έχει επίσης βρεθεί ότι επηρεάζει την έκκριση της ινσουλίνης από τα β- παγκρεατικά κύτταρα και την μεταφορά γλυκόζης στα σκελετικά μυϊκά κύτταρα (177,178). Αυτοί οι πολυμορφισμοί μελετήθηκαν και στο ΣΠΩ και βρέθηκε να συσχετίζονται με την αντίσταση στην ινσουλίνη αλλά όχι με το ΣΠΩ per se (174,175). 3.4 ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΩΟΘΥΛΑΚΙΟΓΕΝΕΣΗ 3.4.1 Το γονίδιο της φολλιστατίνης. Μια πρόσφατη μελέτη (130) 37 υποψήφιων γονιδίων που εμπλέκονται στην αναπαραγωγή, στην έκκριση και δράση της ινσουλίνης και τον ενεργειακό μεταβολισμό, υπέδειξε πιθανή συσχέτιση του ΣΠΩ με το γονίδιο της φολλιστατίνης. Η φολλιστατίνη είναι πρωτεΐνη σύνδεσης της ακτιβίνης και έχει βρεθεί σε in vitro και in vivo μελέτες ότι δρα εξουδετερώνοντας τη βιολογική δράση της ακτιβίνης (179). Τόσο η φολλιστατίνη όσο και η ακτιβίνη, εκφράζονται σε ποικίλους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου των ωοθηκών, της υπόφυσης, του φλοιού των επινεφριδίων και του παγκρέατος (180). Η ακτιβίνη προάγει την ανάπτυξη των ωοθυλακίων, αναστέλλει την παραγωγή ανδρογύνων από τα κύτταρα της θήκης των ωοθηκών, αυξάνει την έκκριση της FSH από την υπόφυση καθώς και την έκκριση της ινσουλίνης από τα β-παγκρεατικά κύτταρα (180,181). Τα αποτελέσματα της δράσης της φολλιστατίνης, όπως είναι

37 αναμενόμενο, είναι αντίθετα αττό τη δράση της ακτιβίνης, και αυτό επιβεβαιώθηκε σε πειραματόζωα με αυξημένα επίπεδα φολλιστατίνης και τα οποία τελικά ανέπτυξαν χαρακτηριστικά ίδια με τα χαρακτηριστικά του ΣΠΩ (182). Ωστόσο η μελέτη της αλληλουχίας του γονιδίου της φολλιστατίνης έδειξε ότι δεν υπάρχουν πολυμορφισμοί που συσχετίζονται με το ΣΠΩ. Πιο συγκεκριμένα οι Urbanek et al (183) ταυτοποίησαν 17 γενετικές παραλλαγές του γονιδίου από τις οποίες οι 16 είναι πολύ σπάνιες και η μόνη συνήθης γενετική παραλλαγή είναι μια σημειακή αντικατάσταση βάσης σε περιοχή που όμως δε μεταφράζεται (3 άκρο του γονιδίου). Άλλες δύο μελέτες δεν κατάφεραν να ταυτοποιήσουν πολυμορφισμούς που να συσχετίζονται με το ΣΠΩ καταλήγοντας στο ίδιο συμπέρασμα (184,185). Η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου της φολλιστατίνης στις γυναίκες με ΣΠΩ κατέληξε σε αντικρουόμενα αποτελέσματα. Οι Fujiwara et al (186) δεν διαπίστωσαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της φολλιστατίνης στα κοκκιώδη κύτταρα της ωοθήκης, συγκρίνοντας γυναίκες με ΣΠΩ και υγιείς γυναίκες και ομοίως οι Erickson et al (187) δεν βρήκαν διαφορά στα επίπεδα της φολλιστατίνης στο θυλακικό υγρό συγκρίνοντας πολυκυστικές και φυσιολογικές ωοθήκες. Σε αντίθεση όμως, υπήρξαν μελέτες που παρατήρησαν ότι τα επίπεδα της φολλιστατίνης στο αίμα είναι υψηλότερα σε γυναίκες με ΣΠΩ (188,189). Από όλα αυτά φαίνεται ότι η συμβολή του γονιδίου της φολλιστατίνης στο ΣΠΩ, αν υπάρχει, είναι πολύ μικρή.

39 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Σκοπός αυτής της μελέτης είναι η συμβολή στην κατανόηση της γενετικής βάσης του ΣΠΩ, διερευνώντας τη πιθανή συσχέτιση πολυμορφισμών υποψηφίων γονιδίων με την ανάπτυξη του συνδρόμου και με μεταβολικές παραμέτρους που το χαρακτηρίζουν. Πρόκειται για μια μελέτη συσχέτισης, όπου έγινε σύγκριση γυναικών με ΣΠΩ με υγιείς γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας. Ως υποψήφια γονίδια, μελετήθηκαν το γονίδιο της ρεζιστίνης της αδιπονεκτίνης και της φυλοδεσμευτικής σφαιρίνης (SHBG). Όπως έχει ήδη αναφερθεί η αντίσταση στην ινσουλίνη αποτελεί ένα από τα χαρακτηριστικά του ΣΠΩ παίζοντας σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του. Πολλές μελέτες προσπάθησαν να εξηγήσουν τους πιθανούς κυτταρικούς μηχανισμούς, που συμμετέχουν στην ανάπτυξη της αντίστασης στην ινσουλίνη, εστιάζοντας την προσοχή στο ρόλο του λιποκυττάρου. Ο λιπώδης ιστός απέκτησε ιδιαίτερο ενδιαφέρον μετά την ανακάλυψη της λεπτίνης το 1994, που άλλαξε τη θεώρηση του από ένα απλό ιστό αποθήκευσης ενέργειας σε ενδοκρινικό εκκριτικό όργανο (193). Πιστεύεται ότι εκκρίνει ποικίλα πρωτεϊνικά μόρια (λιποκυτταροκίνες) με ενδοκρινικές λειτουργίες που επιτρέπουν στο λιποκύτταρο να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ενεργειακής ομοιόστασης και πιθανότατα συμβάλλουν στην ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη (194). Η ρεζιστίνη και η αδιπονεκτίνη αποτελούν δύο παραδείγματα τέτοιων ουσιών και θεωρήθηκαν ότι αποτελούν το συνδετικό κρίκο ανάμεσα στην παχυσαρκία και στην αντίσταση στην ινσουλίνη. Η ρεζιστίνη ταυτοποιήθηκε κατά τον έλεγχο για πιθανά γονίδια που επάγονται κατά την διαφοροποίηση των λιποκυττάρων και θεωρήθηκε ότι επηρεάζει τον μεταβολισμό της γλυκόζης τροποποιώντας τη δράση της ινσουλίνης (195).

40 Η αδιπονεκτίνη, οστό την άλλη πλευρά, έχει την ιδιαιτερότητα, σε αντίθεση με τις άλλες λιττοκυτταροκίνες, να έχει μειωμένα επίπεδα σε παχύσαρκα άτομα και σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (196,197). Έχει βρεθεί ότι χορήγηση αδιπονεκτίνης σε ζώα-πειραματικά μοντέλα παχυσαρκίας βελτιώνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη (198). Επίσης τα επίπεδα αδιπονεκτίνης αυξάνουν με τη χορήγηση PPAR-γ αγωνιστών (199). Πρόσφατες μελέτες σε knockout ποντίκια επιβεβαίωσαν τη σημασία της αδιπονεκτίνης στην ευαισθησία στη δράση της ινσουλίνης καθώς και τις αντιαθηρογόνες ιδιότητές της (200,201). Εκτός από τη λειτουργική σημασία αυτών των πρωτεϊνών, τόσο το γονίδιο της ρεζιστίνης όσο και της αδιπονεκτίνης, έχουν χαρτογραφηθεί κοντά σε γονιδιακές θέσεις που έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη του ΣΠΩ και του μεταβολικού συνδρόμου αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, το γονίδιο της ρεζιστίνης βρίσκεται περίπου 420 Kbp από τη γονιδιακή θέση D19S884 του γονιδίου του υποδοχέα της ινσουλίνης, με την οποία έχει βρεθεί ότι υπάρχει ισχυρή ανισορροπία σύνδεσης και συσχέτιση με το ΣΠΩ (195,137). Ενώ, το γονίδιο της αδιπονεκτίνης βρίσκεται στη θέση 3q27, με την οποία θέση έχει βρεθεί συσχέτιση με το σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και το μεταβολικό σύνδρομο (202). Αυτές οι διαπιστώσεις καθιστούν τα δύο αυτά γονίδια υποψήφια για την παθογένεια της αντίστασης στην ινσουλίνη αλλά και του ΣΠΩ. Έχουν μελετηθεί πολλοί πολυμορφισμοί, τόσο του γονιδίου της ρεζιστίνης όσο και της αδιπονεκτίνης, για πιθανή συσχέτισή τους με δείκτες αντίστασης στην ινσουλίνη και την ανάπτυξη σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2. Στη συγκεκριμένη μελέτη διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση του πολυμορφισμού -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης και των πολυμορφισμών 45T/G και 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης. Η επιλογή των συγκεκριμένων πολυμορφισμών έγινε για δύο λόγους: πρώτον, ο πολυμορφισμός -179C/G που βρίσκεται στον υποκινητή του γονιδίου της ρεζιστίνης είναι λειτουργικός πολυμορφισμός και επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου και δεύτερον, οι πολυμορφισμοί 45T/G και 276G/T του γονιδίου της

41 αδιττονεκτίνης έχουν συσχετιστεί στο παρελθόν με την παχυσαρκία και με την αντίσταση στην ινσουλίνη σε μελέτες άλλων πληθυσμών (203-207). Όσον αφορά την SHBG, ο ρόλος της είναι καθοριστικός, μιας και συνδέει τα ανδρογόνα και τα οιστρογόνα και ρυθμίζει τη βιοδιαθέσιμότητα τους στους ιστούςστόχους (208). Τα επίπεδα της SHBG είναι χαμηλά σε ασθενείς με υπερανδρογοναιμία όπως είναι το ΣΠΩ και σε άτομα που κινδυνεύουν να εμφανίσουν σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και καρδιαγγειακή νόσο (209-211). Στο ΣΠΩ, σημαντικές αιτίες για τα χαμηλά επίπεδα της SHBG είναι η υπερανδρογοναιμία και της υπερινσουλιναιμία που χαρακτηρίζουν το σύνδρομο, αλλά και γενετικοί παράγοντες πιθανότατα παίζουν ρόλο. Το γονίδιο της SHBG αποτελείται από 8 εξόνια και βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωματοσώματος 17 (212). Πρόσφατα περιγράφηκε ένας πολυμορφισμός που αποτελείται από επαναλαμβανόμενα πεντανουκλεοτίδια (ΤΑΑΑΑ)η και βρίσκεται στο 5 άκρο του υποκινητή του γονιδίου της SHBG (213). Πρόκειται για ένα λειτουργικό πολυμορφισμό που επηρεάζει τη μεταγραφική ικανότητα του γονιδίου in vitro (213) και επομένως θα μπορούσε να συμβάλλει στις διαφορετικά επίπεδα της SHBG που παρατηρούνται στα διάφορα άτομα επηρεάζοντας με αυτό το τρόπο τη μεταφορά των ορμονών του φύλου στους ιστούς στόχους. Ο πολυμορφισμός (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG είναι ο τρίτος πολυμορφισμός που διερευνήθηκε στη συγκεκριμένη μελέτη για πιθανή συσχέτιση με το ΣΠΩ.

42 2. ΥΛΙΚΟ ΜΕΛΕΤΗΣ Το υλικό της μελέτης αττοτέλεσαν 180 γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας με ΣΠΩ που προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία της Ενδοκρινολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν 140 γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας, υγιείς χωρίς ιστορικό χρόνιων νοσημάτων, με φυσιολογικό καταμήνιο κύκλο (28-30 ημέρες) και χωρίς κλινικά σημεία υπερανδρογοναιμίας. Και οι ασθενείς και η ομάδα ελέγχου είχαν καταγωγή από την ευρύτερη περιοχή της Ηπείρου. Η διάγνωση του συνδρόμου έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια που προτάθηκαν το 1990 από το συμπόσιο για το ΣΠΩ που διοργάνωσε τα Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας του Παιδιού και Ανθρώπινης Ανάπτυξης (National Institutes of Health-National Institute of Child Health and Human Development (NIH-NNICHD) (26). Ως υπερανδρογοναιμία ορίστηκε η κλινική διαπίστωση υπερτρίχωσης (Feniman-Gallwey score>8, εικόνα 6), ακμής ή αλωπεκίας και/η διαπίστωση υπερανδρογοναιμίας. Ε ικόνα 6. Feniman-Gallwey score. Μια μέθοδος εκτίμησης της τρίχωσης του σώματος σύμφωνα με την οποία ελέγχεται η ύπαρξη και η πυκνότητα της τρίχωσης σε 9 θέσεις του σώματος με κλίμακα από το μηδέν έως το τέσσερα. Ο βαθμός μηδέν υποδηλώνει την πλήρη απουσία τρίχωσης. Άθροισμα μεγαλύτερο από οκτώ βαθμούς υποδηλώνει υπερτρίχωση.

43 Ως διαταραχή της εμμήνου ρύσεως ορίστηκε η παρουσία ολιγομηνόρροιας ή αμηνόρροιας. Οι γυναίκες δεν ελάμβαναν θεραπεία για τουλάχιστον 6 μήνες πριν τη συμμετοχή τους στη μελέτη με εξαίρεση δύο ασθενείς που βρίσκονταν σε αντισυλληπτική αγωγή και τα επίπεδα της SHBG και της αδιπονεκτίνης δεν ελήφθησαν υπόψη στην στατιστική ανάλυση.. Όλες οι ασθενείς μελετήθηκαν κατά την πρώιμη θυλακική φάση (3-5Π ημέρα του καταμήνιου κύκλου) μετά από ολονύκτια νηστεία. Ό λες οι εξεταζόμενες υποβλήθηκαν σε λεπτομερή λήψη ιατρικού ιστορικού και φυσική εξέταση προς αποκλεισμό άλλων κλινικών καταστάσεων. Έγινε καταγραφή των σωματομετρικών στοιχείων (ύψος και βάρος σώματος) και υπολογίστηκε ο δείκτης μάζας σώματος (ΒΜΙ, Body Mass Index) από τον τύπο: ΒΜΙ=ύψος(Κ9)/ βάρος σώματος2 (m) Έγινε μέτρηση γλυκόζης και ινσουλίνης νηστείας, λιπιδαιμικού προφίλ, γοναδοτροπινών, οιστραδιόλης, ολικής τεστοστερόνης, DHEAS, SHBG, 17- υδρόξυπρογεστερόνης, TSH, ft4, Τ3 και προλακτίνης. Υπολογίστηκε το Ελεύθερο Κλάσμα Ανδρογύνων (FAI, Free Androgen Index) ως: FAI= [ολικής τεστοτερόνης(ηγηοι/ι) / SHBG(nmol/l)] χ100. Ό σον αφορά τους δείκτες αντίστασης στην ινσουλίνη υπολογίστηκε ο λόγος γλυκόζης/ινσουλίνης νηστείας και ο δείκτης ΗΟΜΑ (homeostasis model assessm ent index): HOMA= [γλυκόζη νηστείας (mmol/l) x ινσουλίνη νηστείας (μ ΙΙ/m l)) / 22,5 Επιπλέον σε 100 ασθενείς (33 φυσιολογικού σωματικού βάρους και 67 υπέρβαρες- παχύσαρκες ασθενείς) έγινε δοκιμασία ανοχής γλυκόζης με 75γρ γλυκόζης από το

44 στόμα (OGTT). Τα επίπεδα γλυκόζης και ινσουλίνης νηστείας μετρήθηκαν πριν τη λήψη της γλυκόζης, 30,60, 90,120 min μετά τη λήψη της γλυκόζης. Υπολογίστηκε η επιφάνεια κάτω από την καμπύλη (Area Under the Curve, AUC) για τη γλυκόζη και την ινσουλίνη (ΑυΟινσουλίνης και ΑϋΟγλυκόζης) σύμφωνα με τη μέθοδο του Tai: AUC=,/a [3 0 ( χ ο + Χ 3ο ) + ( Χ 3ο + Χ 6ο ) + ( Χ 6ο + Χ 9ο ) + ( Χ 9ο+ Χ ι 2ο ) ] ό π ο υ : Χο, Χ3ο, Χβο. Χθο. Χΐ2ο είναι οι τιμές γλυκόζης ή ινσουλίνης 0, 30,60, 9 0,120min κατά το OGTT Υπολογίστηκαν επίσης τα επίπεδα της LDL-χοληστερόλης (LDL-C) σύμφωνα με την εξίσωση του Friedewald: LDL-C (mg/dl) = ολική χολησ τερόληίητρ/όιί-η Ο ί-^αιρ/όι)- τριγλυκερίδια(ητΐ9/άι)/5 Σε 78 ασθενείς έγινε μέτρηση αδιπονεκτίνης σε ορούς που στάλθηκαν στο τμήμα της Κλινικής Βιοχημείας στο Νοσοκομείο Παίδων «Αγία Σοφία» στην Αθήνα. Και από τις δύο ομάδες μελέτης έγινε λήψη δείγματος αίματος που αποθηκεύτηκε στους -20 C και χρησιμοποιήθηκε για τη γενετική μελέτη. 3. ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Το σάκχαρο ορού μετρήθηκε με τη μέθοδο της εξωκινάσης (Olympus 600, Clinical Chemistry Analyser, Olympus Diagnostica GmbH, Ireland) με (CV) <3%. Η μέτρηση της ινσουλίνης έγινε με τη μέθοδο Microparticle Enzyme Immunoassay με AXSYM Immunoanalyser (Abbott Laboratory, Abbott Park. IL. USA) έχοντας CV=5%. Η ολική τεστοστερόνη και οι γοναδοτροπίνες (LH, FSH) η προλακτίνη η TSH, ft4 και Τ3 μετρήθηκαν με Chemiluminescent Microparticle Immunoassay σε Abbott- ARCHITECT Immunoanalyser (Abbott Laboratory, Abbott Park. IL. USA). The CVs

45 ήταν 4% για την ολική τεστοστερόνη, 3,5% για την LH, και 4% για την FSH, 4,5% για την ττρολακτίνη, 3,5% για την TSH, 6% για την ft4 και 4,5% για την Τ3. Η DHEA-S και η SHBG μετρήθηκαν με Chemiluminescent Immunometric method (IMMULITE 2000 Immunoanalyser, DPC, CA, USA) και η συγκέντρωση της 17αυδροξυπρογεστερόνη μετρήθηκε με ELISA (IBL). Τα CVs για την DHEAS ήταν 9% για τις υψηλές τιμές και 13% για τις χαμηλές τιμές ενώ για την SHBG και την 17αυδροξυπρογεστερόνη ήταν 5,5% και 10% αντίστοιχα. Η ολική χοληστερόλη, η HDL-χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια μετρήθηκαν με ενζυματικές φωτομετρικές μεθόδους (Olympus 600, Clinical Chemistry Analyser, Olympus Diagnostica GmbH, Ireland) με CV<3%. Τέλος η μέτρηση της αδιττονεκτίνης έγινε με ανοσοενζυμική μέθοδο (R&D Systems Inc, Minneapolis, USA) έχοντας CV=2.5-4.7%. 4. ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Οι πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν είναι οι εξής: - ο πολυμορφισμός -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης - οι πολυμορφισμοί 45T/G και 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης - ο πολυμορφισμός (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG Πρόκειται για σημειακούς πολυμορφισμούς πολυμορφισμοί (SNPs) με εξαίρεση τον πολυμορφισμό του γονιδίου της SHBG είναι ανήκει στην κατηγορία των VNTR. Η γενετική ανάλυση των πολυμορφισμών περιλαμβάνει: -Εξαγωγή DNA από λευκά αιμοσφαίρια περιφερικού αίματος -Εκλεκτική ενίσχυση του γενωμικού DNA που περιέχουν τους αντίστοιχους πολυμορφισμούς με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). -Πέψη των προϊόντων της αντίδρασης PCR με κατάλληλες περιοριστικές ενδονουκλεάσες και προσδιορισμός των μοριακών παραλλαγών των πολυμορφισμών μετά από ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης σε πηκτή

46 αγαρόζης. Εξαίρεση αποτέλεσε ο πολυμορφισμός (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG, για την ταυτοποίηση του οποίου, δεν χρειάστηκε να γίνει πέψη και έγινε με ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης PCR σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% και στη συνέχεια χρώση με νιτρικό άργυρο. 4.1 Εξαγω γή DNA από π εριφερικά λευκοκύτταρα Το προς μελέτη γενετικό υλικό λαμβάνεται από περιφερικό αίμα (2,5ml αίμα σε αντιπηκτικό EDTA) προκειμένου να γίνει η απομόνωση του DNA από τα περιφερικά λευκοκύτταρα. Από κάθε δείγμα λαμβάνονται 750μΙ αίματος και προστίθονται 750μΙ ΤΚΜ και 25μΙ IGEPAL για την λύση και απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Μετά από ανάδευση το μείγμα φυγοκεντρείται για 1 λεπτό στις 10.000 στροφές/sec. Το υπερκείμενο απομακρύνεται, το ίζημα πλένεται με 500μΙ ΤΚΜ και μετά από καλή ανάδευση ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 sec στις 10.000 στροφές/sec. Αυτή η διαδικασία του «πλυσίματος των λευκών αιμοσφαιρίων» επαναλαμβάνεται για 3-4 φορές μέχρι να εξαλειφθεί πλήρως το σκούρο χρώμα των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Στο καθαρό ίζημα των λευκών αιμοσφαιρίων προστίθεται 200μΙ ΤΚΜ και 15μΙ SDS 10% και μετά από καλή ανάδευση τοποθετείται για τουλάχιστον 5 λεπτά σε υδατόλουτρο στους 55 C προκειμένου να γίνει λύση των λευκών αιμοσφαιρίων. Στη συνέχεια προστίθονται 80μΙ διαλύματος χλωριούχου νατρίου 6Μ για την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών. Ακολουθεί και πάλι καλή ανάδευση και φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στις 12.000 στροφές/sec. Μετά τη φυγοκέντρηση μεταφέρεται προσεκτικά το υπερκείμενο, το οποίο περιέχει διαλυμένο το DNA, και προστίθονται 750μΙ απόλυτης αιθυλικής αλκοόλης θερμοκρασίας -20 C. Μετά από προσεκτική ελαφρά ανάδευση η αιθανόλη απομακρύνει τα μόρια νερού από το διαλυμένο DNA το οποίο αποκτά μορφή επιπλέοντος βλεννώδους υλικού και απομονώνεται με τη βοήθεια του ρύγχους μιας

47 ττιττέτας και διαλύεται σε 50 μι ΤΕ. Με αυτή τη μορφή φυλάσσεται για όσο διάστημα χρειαστεί στους 4 C. Η σύσταση των διαφόρων διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή του DNA είναι η εξής: ΤΚΜ: IGEPAL SDS: TE: 10mM Tris-HCI (ρη=7,6), 10mM KCI, 2mM EDTA, 4mM MgCI2 (Sigma) Sodium dodecyl sulphate 10% (Sigma) 10mM Tris-HCI (ph=7,8), 1 mm EDTA (ph=8) 4.2 Α λυσ ιδω τή αντίδραση π ολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια απλή μέθοδος πολλαπλασιασμού του DNA που προσφέρει μεγάλη ευαισθησία και ταχύτητα. Αναλυτικότερα η PCR χωρίζεται σε τρία στάδια (Εικόνα 7): 1. Στάδιο αποδιάταξης του DNA (denaturation) Η αντίδραση θερμαίνεται στους 92-96 C για 30-60sec. Με αυτό τον τρόπο σπάνε οι δεσμοί υδρογόνου που συγκρατούν της δύο αλυσίδες της διπλής έλικας του DNA και το DNA αποδιατάσσεται σε μονόκλωνο. 2. Στάδιο υβριδισμού του γενωμικού DNA με τους εκκινητές (annealing) Σε αυτό το στάδιο με μείωση της θερμοκρασίας της αντίδρασης (50 C-65 C) επιτυγχάνεται ο υβριδισμός των εκκινητών (primers) στα αντίστοιχα σημεία των ανοικτών αλυσίδων του DNA. Οι εκκινητές είναι συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μεγέθους 15-25 βάσεων τα οποία αφορίζουν την αλληλουχία του DNA που πρόκειται να πολλαπλασιάσουμε. Αποτελούνται από διαφορετικές μη συμπληρωματικές αλληλουχίες, με αποτέλεσμα να μην υβριδίζονται μεταξύ τους, αλλά με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA. Η θερμοκρασία αυτού του σταδίου είναι καθοριστική και υπολογίζεται σύμφωνα με τη θερμοκρασία τήξης των εκκινητών. 3. Στάδιο επιμήκυνσης-σύνθεσης νέου DNA (extension)

48 Στο τρίτο και τελευταίο στάδιο πραγματοποιείται η σύνθεση των συμπληρωματικών κλώνων του DNA με επέκταση του 3 άκρου των εκκινητών σε θερμοκρασία 72 C. Αυτό το βήμα επιτυγχάνεται με τη χρήση του ένζυμου DNA πολυμεράσης (Taq DNA polymerase). Πρόκειται για ένα θερμοανθεκτικό ένζυμο και μιμείται τον τρόπο με τον οποίο τα ένζυμα του κυτταρικού πυρήνα διπλασιάζουν το DNA προκειμένου το κύτταρο να προχωρήσει σε μίτωση και μπορεί να συνθέσει περίπου 2000 νουκλεοτίδια ανά λεπτό. Σε μια τυπική ανάλυση PCR ο κύκλος αποδιάταξης, υβριδισμού και σύνθεσης νέου DNA μπορεί να επαναληφθεί συνήθως 30-40 φορές. Η διαδικασία είναι εκθετική αφού τα πολλαπλασιασμένα προϊόντα από τον προηγούμενο κύκλο χρησιμοποιούνται ως νέα καλούπια για τον επόμενο κύκλο πολλαπλασιασμού καταλήγοντας έτσι στο σχηματισμό περισσότερων από 230 ή 1 δισεκατομμυρίου ακριβών αντιγράφων του αρχικού τμήματος του DNA. Για τη διεξαγωγή της αντίδρασης γίνεται ένα διάλυμα που αποτελείται από: το προς ανάλυση γενομικό DNA, κατάλληλο ζεύγος εκκινητών, ιόντα μαγνησίου, ισομοριακό μείγμα των τεσσάρων δεοξυριβονουκλεοτιδίων [dntps: datp, dctp, dgtp, dttp (Promega), Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, Life Technologies, USA) και ρυθμιστικό διάλυμα που συνοδεύει την πολυμεράση. Όλη η διαδικασία προετοιμασίας του διαλύματος της αντίδρασης γίνεται με γάντια, μέσα σε ειδικές θήκες με πάγο και τα υλικά που χρησιμοποιούνται είναι αποστειρωμένα. Στο διάλυμα προστίθεται παραφινέλαιο σαν επικάλυψη για προστασία από την εξάτμιση καθώς στη συνέχεια θα εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες. Το μηχάνημα που χρησιμοποιήθηκε για τις αντιδράσεις PCR ήταν αυτόματος θερμικός κυκλοποιητής: PTC-100 (Peltier-Effect Cycling, MJ Research, Inc, USA). Η αξιολόγηση του προϊόντος PCR γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης εμπλουτισμένη με βρωμιούχο αιθίδιο. Τα προϊόντα PCR διατηρούνται σε θερμοκρασία -20 C.

49 p r o p o ly m e ra s e C h a in R e ^ t io n ^ 30-40 cycles of 3 steps : ιιιλιϋ ri w r ^ i ΐΓίττπΐίτπΐίίπτπ^^ Step 1 : denat 5' ΙΤΠΠΤΙ^ΠΜΙΓΤΠ^ y Step 2 : an 'ϊ. " ί«ί -V 5 forward and reverse primers!!! -<'ΓΓΠ ΤΠ Π«^ 3' step 3 : extension - V, ~ Ϊ" iliujijjmu 5 F - ^ ' ~ i \ I i " / 7 i - I x ', I i. 1_ s only dntp's y? i Mnly Vitf'rsrr^ete Ε ικόνα 7. Διαγραμματική οπτεικόνιση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης

50 4.3 Πέψη με π εριοριστικές ενδονουκλεάσες. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα που αναγνωρίζουν ειδικές δίκλωνες αλληλουχίες του DNA και κόβουν το μόριο μέσα ή κοντά στην αλληλουχία αναγνώρισης. Οι αλληλουχίες αναγνώρισης έχουν μήκος συνήθως 4-8 νουκλεοπδια και συχνά είναι παλίνδρομές, δηλαδή διαβάζονται το ίδιο και από τις δύο κατευθύνσεις του DNA (5 -+3 και 3»5 ) (Εικόνα 8). Ένας πολυμορφισμός μπορεί να εξαλείψει ή να δημιουργήσει μια θέση αναγνώρισης από περιοριστική ενδονουκλεάση. Εάν επωάσουμε το προϊόν PCR με τη κατάλληλη περιοριστική ενδονουκλεάση σε κατάλληλες συνθήκες και συνέχεια ηλεκτροφορήσουμε το προϊόν της πέψης θα δούμε τμήματα διαφορετικού μεγέθους και έτσι θα ταυτοποιηθεί ο πολυμορφισμός. Ε ικόνα 8. Σχηματική αναπαράσταση της δράσης των περιοριστικών ενδονουκλεασών. Στο συγκεκριμένο παράδειγμα η περιοριστική ενδονουκλεάση αναγνωρίζει την αλληλουχία CTTAA

51 4.4 Η λεκτροφόρηση σ ε ττηκτή αγαρόζης. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει το διαχωρισμό των τμημάτων DNA σύμφωνα με το μέγεθος τους. Η πηκτή αγαρόζης είναι εμπλουτισμένή με 0,5mg/ml βρωμιούχου αιθιδίου. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε διάλυμα ΤΒΕ (89mM Tris-HCI, 89πιΜ Boric acid, 2.5πιΜ EDTA ρη=8.0) Η ταχύτητα κίνησης και επομένως η απόσταση που διανύουν μέσα στη πηκτή αγαρόζης εξαρτάται από: - το μοριακό βάρος του DNA (αντιστρόφως ανάλογη) -τη συγκέντρωση της αγαρόζης (μικρή συγκέντρωση αγαρόζης χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μεγάλων τμημάτων DNA ενώ μεγαλύτερη συγκέντρωση χρησιμοποιείται για τα μικρά τμήματα. - τη διαμόρφωση του DNA (κυκλικό, γραμμικό) - τη διαφορά τάσης του ηλεκτροφορητικού πεδίου. Σε χαμηλή τάση ρεύματος (Volt) η κινητικότητα του γραμμικού DNA είναι ανάλογη της τάσης και η δυνατότητα διαχωρισμού ελαπώνεται όταν αυξάνεται η τάση του ρεύματος. Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκε πηκτή αγαρόζης 2% και 3%. Η συσκευή ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιήθηκε ήταν η HORIZON 11-14 (GIBRO BRL, USA) Μετά την ηλεκτροφόρηση ακολουθεί ανάγνωση και φωτογράφηση των ηλεκτροφορητικών ζωνών σε υπεριώδες φως. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι αυτό που δίνει έντονο πορτοκαλί χρώμα φθορισμού όταν είναι δεσμευμένο σε DNA. 4.5. Ηλεκτροφόρηση σε π ηκτή π ολυακρυλαμιδίου. Η ταυτοποίηση του (ΤΑΑΑΑ)η πολυμορφισμού της SHBG έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%. Για τη κατασκευή της πηκτής πολυακρυλαμιδίου ακολουθείται η εξής διαδικασία: 1. Αρχικά γίνεται καθαρισμός των τζαμιών που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή του πηκτώματος σχολαστικά με σφουγγάρι και απορρυπαντικό. Ξεπλένονται με απεσταγμένο νερό και στεγνώνονται με απορροφητικό χαρτί. Στη συνέχεια βρέχονται με αιθανόλη και αφήνονται να στεγνώσουν. Η πολύ καλή και σχολαστική καθαριότητα

52 των τζαμιών είναι απαραίτητη καθώς αποτρέπει τη δημιουργία φυσαλίδων κατά την έγχυση του διαλύματος πολυακρυλαμιδίου. 2. Ανάμεσα στα καθαρά τζάμια τοποθετούνται οι δύο ταινίες πλάτους 2cm και πάχους 1mm (spacers) που αφήνουν τον απαραίτητο χώρο μεταξύ των τζαμιών για τον πολυμερισμό του πηκτώματος. Τοποθετείται επίσης η ειδική ταινία στεγανοποίησης προκειμένου να μη γίνει διαφυγή του διαλύματος ακρυλαμιδίου πριν αυτό πολυμεριστεί. Τα τζάμια συγκροτούνται με ειδικούς σφιγκτήρες γίνεται η έγχυση του διαλύματος ακρυλαμιδίου προσεκτικά ώστε να μη δημιουργηθούν φυσαλίδες και τοποθετείται το κατάλληλο χτένι για τη δημιουργία θέσεων (πηγαδάκια) όπου θα τοποθετηθούν τα προς ηλεκτροφόρηση δείγματα. 3. Αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου και η ολοκλήρωση του πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου ολοκληρώνεται σε 1-2 ώρες. Όταν ο πολυμερισμός ολοκληρωθεί απομακρύνεται το χτένι και η ειδική ταινία στεγανοποίησης. Τα τζάμια με το πήκτωμα στερεώνονται στην ειδική βάση και βυθίζονται στο διάλυμα ΤΒΕ της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Για την ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκε η συσκευή V20-CDC (UK). 4. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση για περίπου 20 ώρες σε τάση 55-60 Volt. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης απομακρύνονται τα τζάμια και με προσοχή αφαιρείται η πηκτή πολυακρυλαμιδίου προκειμένου να ακολουθήσει η χρώση με νιτρικό άργυρο. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται για την δημιουργία της πηκτής πολυακρυλαμιδίου είναι τα εξής: Acrylamide και N N -methylene-bis-acrylamide σε αναλογία 29:1 ΤΒΕ: 89mM Tris-HCI, 89mM Boric acid, 2,5mM EDTA ph=8,0 APS: ammonium persulfate 20%. TEMED: Ν,Ν,Ν,Ν,-Tetramethylethylenediamine 2% Προετοιμάζονται 50ml πηκτής πολυακρυλαμιδίου 12% ως εξής: - 15ml διαλύματος acrylamide/bis-acrylamide

53-35ml TBE 1X -286μΙ APS - 57μΙ TEMED Τα APS και TEMED είναι απαραίτητα για τον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου. 4.6 Χρώση νιτρικού αργύρου Για τη χρώση νιτρικού αργύρου χρειάζονται τα εξής διαλύματα: Διάλυυα σταθεροποίησή - 40ml αιθανόλη extra pure (99.7-100%) - 2ml οξεικό οξύ - Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 400ml. Διάλυυα νιτρικού αργύρου 1%ο. Διάλυυα ευφ άνισικ - 800μΙ φορμαλδεϋδη 37% - 3gr NAOH (extra pure) - 0,02gr Sodium Borohydride (NaBH*) - Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 200ml. Ακολουθούνται τα παρακάτω βήματα: Αρχικά η πηκτή πολυακρυλαμιδίου βυθίζεται σε 200ml από το διάλυμα σταθεροποίησης και αφήνεται για 3min. Απομακρύνεται το διάλυμα και προστίθεται το υπόλοιπο διάλυμα σταθεροποίησης (200ml) για άλλα 3min. Αφαιρούμε το προηγούμενο διάλυμα και προσθέτουμε 200ml διαλύματος νιτρικού αργύρου για 10min υπό συνεχή ανάδευση. Αφαιρούμε το διάλυμα νιτρικού αργύρου και ξεπλένουμε με δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό. Προσθέτουμε το τελευταίο διάλυμα, το διάλυμα εμφάνισης, το οποίο προηγουμένως έχουμε αναδεύσει και θερμάνει στους 100 C και το αφήνουμε μέχρι την εμφάνιση των ηλεκτροφορητικών ζωνών.

54 5. ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜ ΟΙ. 5.1 ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΩΝ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΡΕ2ΙΣΤΙΝΗΣ Συνθήκεε αντίδοασης PCR -179C/G ΤΟΥ Σ υγκεντρώ σ εις αντιδρασ τηρίω ν τη ς αντίδρασ ης : Η αντίδραση PCR έγινε σε συνολικό όγκο 25μΙ που περιείχε: DNA (300-500ng) Ρυθμιστικό διάλυμα (500mM KCI, 200mM Tris-HCI, ρη=8,4) dntps (ισομοριακό μείγμα datp, dctp, dgtp, dttp) 2mM Ιόντα μαγνησίου (MgCfc) 1,5mM Εκκινητής 1 (2pmol/μl) Εκκινητής 2 (2ρΓηοΙ/μΙ) Taq DNA πολυμεράση (1 U/μΙ) Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 25 μι 1μΙ 2,5 μι 2,5 μι 0,5 μι 0,39μΙ 0,98 μι 0,25 μι 16,88 μι Α λληλουχία εκκινη τώ ν Εκκινητής 1: Εκκινητής 2: 5 -TGT CAT TCT CAC CCA GAG ACA-3 5 -TGG GCT CAG CTA ACC AAA TC-3 Πρόγραμμα κυκλο π ο ίησ ης Αρχική αποδιάταξη στους 94 C για 5 λεπτά Ακολουθεί: Αποδιάταξη (denaturing): 94 C για 30 δευτερόλεπτα Υβριδισμός (annealing): Σύνθεση (extension): 57 C για 30 δευτερόλεπτα 72 C για 90 δευτερόλεπτα Η αποδιάταξη, ο υβριδισμός και η σύνθεση του DNA επαναλαμβάνονται για 30 κύκλους και η διαδικασία ολοκληρώνεται με το τελικό στάδιο της επέκτασης στους 72 C για 10 λεπτά. Το προϊόν PCR που προκύπτει έχει μέγεθος 533 ζεύγη βάσεων.

55 Ακολουθεί ολονυκτια επώαση των προϊόντων PCR με την περιοριστική ενδονουκλεάση Earl (BioLabs Inc, New England) στους 37 C. Οι συνθήκες πέψ ης είναι οι ακόλουθες: Προϊόν PCR Ρυθμιστικό διάλυμα (lommbistris Propane-HCI, 10 mm MgCb, 1mM 4 μι 1 μι DTT) ph=7,0 Earl (10υ/μΙ) Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 10 μι 0,1 μι 4,9 μι Α λληλουχία αναγνώ ρισ ης της π ερ ιο ρ ισ τική ς ενδονουκλεάσ ης Earl To ένζυμο Earl αναγνωρίζει την αλληλουχία CTCTTC και κατατέμνει την αλυσίδα DNA που περιέχει τη συγκεκριμένη αλληλουχία 1 θέση πιο κάτω και τη συμπληρωματική της 4 θέσεις πιο κάτω Σημείο κοπής της κάθε μιας από πς συμπληρωμαπκές έλικες του DNA από το Earl: 5 -C Τ C Τ Τ C Ν-l -3' 3'-G A G A A G Ν Ν Ν N t -5 Από την πέψη προκύπτουν δύο τμήματα μεγέθους 207ζεύγη βάσεων και 326 ζεύγη βάσεων. Η παρουσία του σημείου περιορισμού Earl χαρακτηρίζει το G αλληλόμορφο ενώ η απουσία το C αλληλόμορφο. Συνεπώς προκύπτουν 3 γονότυποι CC, CG, GG, ο καθορισμός των οποίων γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2%. Το πρότυπο της ηλεκτροφόρησης είναι το ακόλουθο:

56 5.2 ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΩΝ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ 45T/G ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΑΔΙΠΟΝΕΚΤΙΝΗΣ Συνθήκες αντίδρ ασ ης PCR Συγκεντρώσ εις αντιδρ ασ τηρίω ν της αντίδρασης : Η αντίδραση PCR έγινε σε συνολικό όγκο 25μΙ που περιείχε: DNA (300-500ng) Ρυθμιστικό διάλυμα (500mM KCI, 200mM Tris-HCI, ρη=8,4) dntps (ισομοριακό μείγμα datp, dctp, dgtp, dttp) 2mM Ιόντα μαγνησίου (MgCfe) 1,5mM Εκκινητής 1 (2ρπποΙ/μΙ) Εκκινητής 2 (2ριποΙ/μΙ) Taq DNA πολυμεράση (1 U/μΙ) Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 25 μι 1 μι 2,5 μι 2,5 μι 0,5 μι 0,98μΙ 0,84 μι 0,5 μι 16,18 μι Α λληλουχία εκκινητώ ν Εκκινητής 1: 5 - GAA GTA GAC TCT GCT GAG ATG G -3 Εκκινητής 2: 5 - TAT CAG TGT AGG AGG TCT GTG ATG -3 Π ρόγραμμα κυκλοπ οίησ ης Αρχική αποδιάταξη στους 94 C για 5 λεπτά Ακολουθεί: Αποδιάταξη (denaturing): 94 C για 30 δευτερόλεπτα Υβριδισμός (annealing): Σύνθεση (extension): 60 C για 30 δευτερόλεπτα 72 C για 90 δευτερόλεπτα Η αποδιάταξη, ο υβριδισμός και η σύνθεση του DNA επαναλαμβάνονται για 30 κύκλους και η διαδικασία ολοκληρώνεται με το τελικό στάδιο της επέκτασης στους 72 C για 10 λεπτά. Το προϊόν PCR που προκύπτει έχει μέγεθος 372 ζεύγη βάσεων.

57 Ακολουθεί ολονύκτια επώαση των προϊόντων PCR με την περιοριστική ενδονουκλεάση Smal ( BioLabs Inc, New England) στους 25 C. Οι σ υ ν θ ή κ εζ T itu in c είναι οι ακόλουθε*:: Προϊόν PCR Ρυθμιστικό διάλυμά (50mM potassium acetate, 20mM Tris-acetate, 10 5 μι 1 μι mm magnesium acetate, 1mM DTT), ph=7,9 Smal (201Ι/μΙ) Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 10 μι 0,25 μι 3,75 μι Α λληλουχία αναγνώ ρισ ης της π ερ ιο ρ ισ τική ς ενδονουκλεάσ ης Sm al Το ένζυμο Smal αναγνωρίζει την αλληλουχία CCCGGG Σημείο κοπής της κάθε μιας από τις συμπληρωματικές έλικες του DNA από το Smal: 3'- G G G t C C C -5' Από την πέψη προκύπτουν δύο τμήματα μεγέθους 216 ζεύγη βάσεων και 156 ζεύγη βάσεων. Η παρουσία του σημείου περιορισμού Smal χαρακτηρίζει το G αλληλόμορφο ενώ η απουσία το Τ αλληλόμορφο. Συνεπώς προκύπτουν 3 γονότυποι ΤΤ, TG, GG, ο καθορισμός των οποίων γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 3%. Το πρότυπο της ηλεκτροφόρησης είναι το ακόλουθο:

58 5.3. ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΟΝ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΑΔΙΠΟΝΕΚΤΙΝΗΣ 276G/T ΤΟΥ Σ υνθ ή κε( α ντίδοασ ηςρορ Σ υγκεντρώ σ εις αντιδρ ασ τηρίω ν τη ς αντίδρασ ης : Η αντίδραση PCR έγινε σε συνολικό όγκο 25μ! που περιείχε: DNA (300-500ng) Ρυθμιστικό διάλυμα (500mM KCI, 200mM Tris-HCI, ρη=8,4) dntps (ισομοριακό μείγμα datp, dctp, dgtp, dttp) 2mM Ιόντα μαγνησίου (MgCI2) 1,5mM Εκκινητής 1 (2ρπηοΙ/μ!) Εκκινητής 2 (2ρπιοΙ/μΙ) Taq DNA πολυμεράση (IU /μι) Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 25 μι 1μΙ 2,5μΙ 2,5μΙ 0,6μΙ 1.42μΙ 1,44μΙ 0,3μΙ 15,24μΙ Α λληλουχία εκκινη τώ ν Εκκινητής 1: 5 - GGC CTC ΤΤΤ CAT CAC AGA CC -3 Εκκινητής 2: 5 - AGA TGC AGC AAA GCC AAA GT -3' Πρόγραμμα κυκλοπ οίησ ης Αρχική αποδιάταξη στους 94 C για 5 λεπτά Ακολουθεί: Αποδιάταξη (denaturing): 95 C για 30 δευτερόλεπτα Υβριδισμός (annealing): Σύνθεση (extension): 55 C για 30 δευτερόλεπτα 72 C για 90 δευτερόλεπτα Η αποδιάταξη, ο υβριδισμός και η σύνθεση του DNA επαναλαμβάνονται για 30 κύκλους και η διαδικασία ολοκληρώνεται με το τελικό στάδιο της επέκτασης στους 72 C για 10 λεπτά. Το προϊόν PCR που προκύπτει έχει μέγεθος 196 ζεύγη βάσεων.

59 Ακολουθεί ολονυκτια επώαση των προϊόντων PCR με την περιοριστική ενδονουκλεάση Bsml ( BioLabs Inc, New England) στους 65 C. Οι συνθήκε T T t u i n c είναι οι ακόλουθες: Προϊόν PCR Ρυθμισπκό διάλυμά (50Mm NaCI, 10mM Tris-HCI, 10mM MgCI2, 1mM 5μΙ 1 μι dithiothreitol), ph=7,9 Bsml (1011/μΙ) Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 10 μι Ο,δμΙ 3,5μΙ Αλληλουχία αναγνώ ρισης της π εριορισ τικής ενδονουκλεάσης Bsml Το ένζυμο Bsml αναγνωρίζει την αλληλουχία GAATGC. Σημείο κοπής της κάθε μιας από τις συμπληρωματικές έλικες του DNA από το Bsml: 5 -G A A Τ G C N i-3* 3 -C T T A C tg N -5; Από την πέψη προκύπτουν δύο τμήματα μεγέθους 148 ζεύγη βάσεων και 48 ζεύγη βάσεων. Η παρουσία του σημείου περιορισμού Bsml χαρακτηρίζει το G αλληλόμορφο ενώ η απουσία το Τ αλληλόμορφο. Συνεπώς προκύπτουν 3 γονότυποι GG GT ΤΤ, ο καθορισμός των οποίων γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 3%. Το πρότυπο της ηλεκτροφόρησης είναι το ακόλουθο:

60 5.4 ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΎΠΟΝ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ (ΤΑΑΑΑ)η ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟ Υ ΤΗΣ SHBG Σ υ ν θ ή κ η αντίδρασης PCR Σ υγκεντρώ σ εις αντιδρ ασ τηρίω ν τη ς αντίδρασ ης : Η αντίδραση PCR έγινε σε συνολικό όγκο 25μΙ που περιείχε: DNA (300-500ng) Ρυθμιστικό διάλυμα (500mM KCI, 200mM Tris-HCI, ρη=8,4) dntps (ισομοριακό μείγμα datp, dctp, dgtp, dttp) 2mM Ιόντα μαγνησίου (MgCI2) 1,5mM Εκκινητής 1 (2ριτιοΙ/μΙ) Εκκινητής 2 (2ρπιοΙ/μΙ) Taq DNA πολυμεράση (1 U/μΙ) Δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 25 μι 1μΙ 2,5 μι 2,5 μι 0,5 μι 1,1 μι 0,61 μι 0,25 μι 16,54 μι Α λληλουχία εκκινη τώ ν Εκκινητής 1: Εκκινητής 2: 5 - GCT TGA ACT CGA GAG GCA G-3 5 - CAG GGC CTA AAC AGT CTA GCA GT-3 Π ρόγραμμα κυκλοπ οίησ ης Αρχική αποδιάταξη στους 94 C για 5 λεπτά Ακολουθεί: Αποδιάταξη (denaturing): 94 C για 30 δευτερόλεπτα Υβριδισμός (annealing): 59 C για 30 δευτερόλεπτα Σύνθεση (extension): 72 C για 90 δευτερόλεπτα Η αποδιάταξη, ο υβριδισμός και η σύνθεση του DNA επαναλαμβάνονται για 30 κύκλους και η διαδικασία ολοκληρώνεται με το τελικό στάδιο της επέκτασης στους 72 C για 10 λεπτά. Το προϊόν PCR που προκύπτει έχει μέγεθος 169 ζεύγη βάσεων (το αλληλόμορφο με τις 8 ΤΑΑΑΑ επαναλήψεις).

61 Ο ηλεκτροφορηπκός διαχωρισμός έγινε σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% και ακολούθησε χρώση με νιτρικό άργυρο. Ο αριθμός των (ΤΑΑΑΑ)η επαναλήψεων γίνεται με σύγκριση με γνωστού μεγέθους προϊόντα PCR που ο αριθμός των επαναλήψεων τους ταυτοποιήθηκε με ανάλυση της αλληλουχίας (sequencing): Αλληλόμορφο με 6(ΤΑΑΑΑ) Η Λ SO ' 30 ac CAT AC.Μ Α Α Α Α Α Τ AO C A AO Τ C Τ C Τ 3 Τ Λ Τ Α A Α Α Τ Α Α Τ Α Α Α Α Τ Α Α Τ 4 Α Α A T C r - s r, c c o r, τ α Αλληλόμορφο με 7(ΤΑΑΑΑ) ίϊϊβ ρ τ ίρ ι η τι. ΤΑ C CA G TCGC TO C C Λ Τ Τ Τ Τ ΤΤΤΤΑΤΤΤΤΑΤΤΤΤΑΤΓΤΤΑΤΑΤΤΑΤ W Μ AT T A C G T 0 1 Τ OOC CT AT C Αλληλόμορφο με 8(ΤΑΑΑΑ) * ^ ή,...λτ β X, TCT ΑΑ,ΑΑΤ Α Α Λ Α ΤΑ Α Λ Α ΤΑ Α ΛΑ ΤΑ Α Λ Α Τ Α ΑΑ AT A A A A T AAA A T W O T «O C Αλληλόμορφο με 9(TAAAA)

Το π ρόιυπο της Ολεκτροφόρησης πολυμορφισμού (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου ιη ς SHBG είναι το ακόλουθο: I I 9/10 επαναλήψεις 8/9 επαναλήψεις 6/7 επαναλήψεις

63 6. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Αρχικά εξετάστηκε αν ο πληθυσμός μελέτης μας ήταν σε ισορροπία Hardy-Weinberg για κάθε πολυμορφισμό που μελετήσαμε, συγκρίνοντας τις συχνότητες των γονοτύπων που παρατηρήσαμε με τις συχνότητες των γονοτύπων που θα αναμέναμε σε τυχαίο δείγμα πληθυσμού (χ2 τεστ). Η απόκλιση ενός πληθυσμού από την ισορροπία Hardy-Weinberg σημαίνει ότι η επιλογή του δεν έγινε τυχαία και αμερόληπτα και επομένως τα αποτελέσματα που θα εξάγονταν θα ήταν λανθασμένα. Η στατιστική ανάλυση των γονοτυπικών διαφορών καθώς και των διαφορών στη συχνότητα των αλληλομόρφων έγινε με χ2 τεστ. Για τους γονότυπους που βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα τους ανάμεσα στις γυναίκες με ΣΠΩ και την ομάδα ελέγχου υπολογίστηκαν τα odds ratios. Η κανονική κατανομή των συνεχών μεταβλητών εκτιμήθηκε με το Kolmogorov- Smimov τεστ. Στις τιμές της ινσουλίνης, του ΗΟΜΑ, των τριγλυκεριδίων και της αδιπονεκτίνης έγινε λογαριθμική μετατροπή προκειμένου η κατανομή τους να γίνει κανονική, στους πίνακες που ακολουθούν οι τιμές αυτών των μεταβλητών παρουσιάζονται χωρίς τη λογαριθμική μετατροπή. Η ανάλυση των διαφορών των συνεχών μεταβλητών μεταξύ των γονοτύπων έγινε με t-test για ανεξάρτητες μεταβλητές (για δύο ομάδες) και με one-way ANOVA (για τρεις ομάδες). Η χρήση μη παραμετρικών μεθόδων (Mann W hitney U-test και Kruskal W allis analysis of variance) έδωσε παρόμοια αποτελέσματα. Προκειμένου να εξεταστεί το ενδεχόμενο της ανεξάρτητης επίδρασης των μελετηθέντων γονοτύπων έγινε πολυπαραγοντική ανάλυση (MANOVA). Όλα τα αποτελέσματα των συνεχών μεταβλητών καταγράφονται ως μέση τιμή ± SD. Ως στατιστικά σημαντική διαφορά θεωρήθηκε η τιμή του ρ<0,05. Ό λες οι αναλύσεις έγιναν με το στατιστικό πακέτο Statistica Software Package (version 5.1, StatSoft Inc, USA).

64 7. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜ ΑΤΑ Τα κλινικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των γυναικών με ΣΠΩ φαίνονται στον Πίνακα 2. Η ομάδα ελέγχου ήταν γυναίκες αντίστοιχης ηλικίας με φυσιολογικό σωματικό βάρος, χωρίς κλινική υττερανδρογοναιμία και με φυσιολογικούς καταμήνιους κύκλους. Π ίνακας 2. Κλινικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των γυναικών με ΣΠΩ Ηλικία (έτη) 22,8±5,9 ΒΜΙ (Kg/m2) 28,0±7,5 LH/FSH 1,4±1,1 SHBG (nmol/l) 37,5±26,1 Ολική τεστοστερόνη (nmol/l) 3,4±1,5 FAI 13,5±11,8 Γλυκόζη/ινσουλίνη νηστείας 9,6±7,5 ΗΟΜΑ 3,8±4,8 ΑϋΟγλυκόζης 14791±3120 ΑυΟ νσουλίνης 11303±9785 Ολική χοληστερόλη (mg/dl) 180,3±33,3 Τριγλυκερίδια (mg/dl) 85,7±53,2 HDL-χοληστερόλη (mg/dl) 47,2±13,9 LDL-χοληστερόλη (mg/dl) 163,2±30,0

65 Π ολυμορφισμός -179C/G του γο νιδ ίο υ της ρ εζισ τίνη ς Ο πολυμορφισμός -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης βρίσκονται σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg (ρ>0,05) και άρα δεν υπάρχει επιλεκτική πίεση στην ομάδα μελέτης. Η κατανομή των γονότυπων και των αλληλομόρφων φαίνεται στον Πίνακα 3. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα αυτού του πολυμορφισμού ανάμεσα σε ασθενείς και υγιείς γυναίκες. Έ γινε σύγκριση ασθενών που είχαν γονότυπο CC με ασθενείς με γονότυπους CG και GG και βρέθηκε ότι οι ασθενείς με ΣΠΩ είχαν αυξημένο ΒΜΙ σε σχέση με τη δεύτερη υποομάδα. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές όσον αφορά τους δείκτες αντίστασης στην ινσουλίνη και τα λιπίδια μεταξύ των γονοτύπων αυτού του πολυμορφισμού (Πίνακας 4) Πίνακας 3. Η κατανομή των συχνοτήτων των γονότυπων και των αλληλόμορφων του πολυμορφισμού -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης στις γυναίκες με ΣΠΩ και τις υγιείς γυναίκες. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά συγκρίνοντας τις δύο ομάδες. ΣΠΩ Ομάδα ελέγχου Αριθμός ατόμων 180 140-179C/G του γονιδ ίου της ρεζισ τίνης Γ ονότυπ οι Π(%) Α λληλόμορφ α π(%) CC 93 (51,7%) 73 (52,1%) CG 78 (43,3%) 56 (40%) GG 9 (5%) 11 (7,9%) C 264 (73,3%) 202 (72,1%) G 96 (26,7%) 78 (27,9%)

66 Π ίνακας 4. Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των γονοτύπων του πολυμορφισμού -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης σε γυναίκες με ΣΠΩ. (η$=μη σημαντική διαφορά) γονότυπος CC γονότυποι CG+GG Ρ Αριθμός ατόμων 93 87 Ηλικία (έτη) 22,3±5,4 23,416,4 ns BMKKg/m2) 29,0±7,8 26,716,8 0,045 LH/FSH 1,3±0,9 1,511,3 ns SHBG (nmol/l) 34,8±20,1 35,1119,3 ns Ολική τεστοστερόνη (nmol/l) 3,3±1,4 3,611,6 ns FAI 12,3±9,7 14,6113,6 ns Γλυκόζη/ινσουλίνη νηστείας 8,7±6,5 10,518,3 ns ΗΟΜΑ 3,6±2,8 3,413,2 ns ΑΙΙΟγλυκόζης (αριθμός ασθενών) 14949±3216 (53) 1461313030 (47) ns ΑΙΙΟινσουλίνης (αριθμός ασθενών) 12534111862(53) 978116174 (47) ns Ολική χοληστερόλη (mg/dl) 179,0132,8 181,9134,0 ns Τριγλυκερίδια (mg/dl) 79,4135,4 93,1168 ns HDL-χοληστερόλη (mg/dl) 46,3115,3 48,3112,0 ns LDL-χοληστερόλη (mg/dl) 163,1131,9 163,3127,9 ns

67 Π ολυμορφισμοί 45T/G και 276G/T του γο νιδ ίο υ της α δ ιπ ο νεκτίνη ς Στον Πίνακα 5 φαίνονται οι συχνότητες των αλληλομόρφων και των γονοτύπων των πολυμορφισμών 45T/G και 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης στις γυναίκες με ΣΠΩ και τις υγιείς γυναίκες. Και οι δύο πολυμορφισμοί βρίσκονται σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg (ρ>0,05) και στους δύο πληθυσμούς. Επίσης οι δύο πολυμορφισμοί είναι σε ανισορροπία σύνδεσης (χ2, ρ<0,001). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην κατανομή των γονότυπων και των αλληλόμορφων ανάμεσα στις γυναίκες με ΣΠΩ και τις υγιείς γυναίκες. Π ίνακας 5. Η κατανομή των συχνοτήτων των γονότυπων και των αλληλόμορφων των πολυμορφισμών του γονιδίου της αδιπονεκτίνης στις γυναίκες με ΣΠΩ και τις υγιείς γυναίκες. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά συγκρίνοντας τις δύο,ομάδες. ΣΠΩ Ο μάδα ελέγχου Αριθμός ατόμων 180 140 45T/G του γονιδ ίου της α δ ιπ ο νεκτίνης Γονότυπ οι η(%) Α λληλόμορφ α η(% ) ΤΤ 132 (73,3%) 106 (75,7%) TG 45 (25,0%) 30 (21,4%) GG 3 (1,7%) 4 (2,9%) Τ 309 (85,8%) 242 (86,4%) G 51 (14,2%) 38 (13,6%) 276G/T του γο νιδ ίο υ της α δ ιπ ο νεκτίνης Γ ονότυποι η(% ) Α λληλόμορφ α η(% ) GG 76 (42,2%) 52 (37,2%) GT 83 (46,1%) 73 (52,1%) ΤΤ 21 (11,7%) 15 (10,7%) G 235 (65,3%) 177 (63,2%) Τ 125 (34,7%) 103 (36,8%)

68 Όσον αφορά τον πολυμορφισμό 45T/G του γονιδίου της αδιπονεκτίνης οι βιοχημικές διαφορές των γονοτύπων φαίνονται στον πίνακα 6. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ως προς το ΒΜΙ, ορμονικές παραμέτρους και λιπιδαιμικό προφίλ. Ωστόσο, στους ασθενείς που έγινε καμπύλη ανοχής γλυκόζης, οι ΤΤ ομοζυγώτες ασθενείς σε σύγκριση με ασθενείς με γονότυπο TG και GG είχαν χαμηλότερα επίπεδα ινσουλίνης 90 λεπτά (86,8±81,7pU/ml Vs 145,0±128,7pU/ml, ρ=0,0025) και 120 minutes μετά τη λήψη της γλυκόζης (66,3±51,0μυ/πιΙ Vs 93,9±73,5μυ/ιηΙ, ρ=0,03), ενώ δεν διέφεραν τα βασικά επίπεδα ινσουλίνης και τα επίπεδα της ΑΙΙΟγλυκόζης Ως αποτέλεσμα οι ΤΤ ομοζυγώτες ασθενείς είχαν χαμηλότερα επίπεδα ΑΙΙΟινσουλίνης (Σχήμα 1), ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές σε άλλους δείκτες αντίστασης στην ινσουλίνη (λόγο γλυκόζη/ινσουλίνη νηστείας και δείκτη ΗΟΜΑ). Η συσχέτιση του γονότυπου ΤΤ με μειωμένα επίπεδα υπερινσουλι ναι μίας και επομένως με αυξημένη ευαισθησία στην ινσουλίνη παρέμεινε σημαντική και μετά από προσαρμογή ως προς την ηλικία, το ΒΜΙ και τα επίπεδα της ΑΙΙΟγλυκόζης (ρ=0.003 για τις διαφορές των επιπέδων ινσουλίνης στα 90 λεπτά, ρ<0.05 για τις διαφορές των επιπέδων ινσουλίνης στα 120 λεπτά και ρ=0.05 για τα επίπεδα της ΑΙΙΟινσουλίνης). Συνολικά στα επίπεδα αδιπονεκτίνης στον όρο των ασθενών παρατηρήθηκε τάση προς χαμηλότερα επίπεδα στις ασθενείς με γονότυπους TG και GG, οι γονότυποι με τη μεγαλύτερη αντίσταση στην ινσουλίνη, αλλά αυτή η συσχέτιση δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Πίνακας 6). Τα χαρακτηριστικά των γονοτύπων του πολυμορφισμού 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης φαίνονται στον πίνακα 7. Οι ομοζυγώτες και ετεροζυγώτες ασθενείς για το G αλληλόμορφο (GG και GT) είχαν αυξημένο ΒΜΙ (ρ=0.01), αυξημένα επίπεδα ΑΙΙΟγλυκόζης (ρ=0.005) και ΑΙΙΟινσουλίνης (ρ=0.01) σε σύγκριση με τις γυναίκες με ΣΠΩ που είχαν γονότυπο ΤΤ. Επιπρόσθετα η πρώτη υποομάδα έτεινε προς χαμηλότερα επίπεδα SHBG (ρ=0,06) και μεγαλύτερο βαθμό υπερανδρογοναιμίας (FAI, ρ=0,09). Όσον αφορά το λιπιδαιμικό προφίλ, οι ομοζυγώτες και ετεροζυγώτες

69 ασθενείς για το G αλληλόμορφο είχαν υψηλότερα επίπεδα τριγλυκεριδίων (ρ=0.015) και χαμηλότερα επίπεδα HDL-χοληστερόλης (ρ=0.04) σε σύγκριση με τις γυναίκες με ΣΠΩ που είχαν γονότυπο ΤΤ. Τα επίπεδα αδιπονεκτίνης του ορού ήταν σημαντικά χαμηλότερα στις ασθενείς με γονότυπο GG ή GT σε σχέση με τις ΤΤ ομοζυγώτες ασθενείς και αυτή η συσχέτιση παρέμεινε σημαντική και μετά από προσαρμογή ως προς την ηλικία, τα επίπεδα ΒΜΙ και ινσουλίνης (ρ=0,03, σχήμα 2). Π ίνακας 6 Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των γονοτύπων του πολυμορφισμού 45T/G του γονιδίου της αδιπονεκτίνης (ηε=μη σημαντική διαφορά) Γ ονότυπ ος ΤΤ Γονότυπ οι TG+GG Ρ Αριθμός ατόμων 132 48 Ηλικία (έτη) 22,6±5,9 23,3±5,8 ns ΒΜ! (Kg/m2) 28,0±7,7 28,0±6,8 ns LH/FSH 1,4±1,0 1,3±1,3 ns SHBG (nmol/l) 37,8±27,8 35,6±19,4 ns Ολική τεστοστερόνη (nmol/l) 3,5±1,6 3,3±1,2 ns FAI 13,7±12,5 12,8±9,8 ns Γλυκόζη/ινσουλίνη νηστείας 10,1 ±8,7 8,2±7,0 ns ΗΟΜΑ 3,9±5,6 3,3±2,1 ns ΑΙΙΟγλυκόζης (αριθμός ατόμων) 14563+3108(77) 15588±3193 (23) ns ΑΙΙΟινσουλίνης (αριθμός ατόμων) 10095±7478(77) 15098114439 (23) 0,045 Ολική χοληστερόλη (mg/dl) 179,5±33,3 182,9±33,5 ns Τριγλυκερίδια (mg/dl) 85,7±57,9 85,5±35,7 ns HDL-χοληστερόλη (mg/dl) 46,4±11,2 49,9±19,8~~ ns LDL-χοληστερόλη (mg/dl) 162,3±28,9 165,8±33,5 ns Αδιπονεκτίνη (mg/l) (αριθμός ατόμων) 11,5±5,5 (65) 10,8±3,6 (13) ns

70 Πίνακας 7. Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των γονότυπων του πολυμορφισμού 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης (ηβ=μη σημαντική διαφορά) Γ ονότυποι GG+GT Γονότυπος ΤΤ Ρ Αριθμός ατόμων 159 21 Ηλικία (έτη) 22,9±6,0 22,1 ±4,8 ns BMI(Kg/m2) 28,5±7,6 24,0±5,0 0,01 LH/FSH 1,4±1,1 1,3±0,8 ns SHBG (nmol/l) 36,8±26,6 43,2±22,2 0,06 Ολική τεστοστερόνη (nmol/l) 3,5±1,6 2,9±1,4 ns FAI 14,0±12,2 9,7±8,2 0,09 Γλυκόζη/ινσουλίνη νηστείας 9,5±7,6 9,9±6,2 ns ΗΟΜΑ 3,6±3,2 2.4±1,1 ns ΑΙΙΟγλυκόζης (αριθμός ατόμων) 15105±3075 (88) 1249212492 (12) 0,005 ΑΙΙΟινσουλίνης (αριθμός ατόμων) 11924±10134 (88) 584612950 (12) 0,01 Ολική χοληστερόλη (mg/dl) 180,4±33,9 179,8±27,9 ns Τριγλυκερίδια (mg/dl) 88,7±55,0 59,5±19,0 0,015 HDL-χοληστερόλη (mg/dl) 46,5±13,7 53,7±13,9 0,04 LDL χοληστερόλη (mg/dl) 162,6±30,5 167,9±25,4 ns Αδιπονεκτίνη (mg/l) (αριθμός ατόμων) 10,9±5,2 (66) 13,614,9 (12) 0,03

71 Σχήμα 1. Σχηματική παράσταση των διαφορών της απάντησης της γλυκόζης και της ινσουλίνης κατά την καμπύλη ανοχής γλυκόζης στους διάφορους γονότυπους των πολυμορφισμών 45T/G και 276G/T των γονιδίων της αδιπονειαΐνης Πολυμορφισμός 45T/G Πολυμορφισμός 276G /T - - γονότυποι β β +GT γονότυπος ΤΤ (mg/dl) 3β Μ *β 120 Λεπτά (min) Λεπτά (min) Σχήμα 2. Σχέση των επιπέδων αδιπονεκτίνης και των πολυμορφισμών 45T/G και 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης στις γυναίκες με ΣΠΩ Επίπεδα αδιπονεκπνης Πολυμορφισμός 45T/G Π ολυμορφισμός 276G /T Γονόππτος ΤΤ Γονότυττοι TG+GG γονότυττοι GG+GT γονόππτος ΤΤ * Η διαφορά των επιπέδων αδιπονεκτίνης μεταξύ των γονοτύπων του πολυμορφισμού 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης παρέμεινε στατιστικά σημαντική και μετά από προσαρμογή των τιμών ως προς την ηλικία το ΒΜΙ και τα επίπεδα ινσουλίνης

72 Πολυμορφισμός (ΤΑΑΑΑ)π του γονιδίου της SHBG. Ταυτοττοιήθηκαν 6 αλληλόμορφα του γονιδίου της SHBG με 6-11 ΤΑΑΑΑ επαναλήψεις αντίστοιχα. Η κατανομή των αλληλόμορφων διέφερε στις γυναίκες με ΣΠΩ και τις υγιείς γυναίκες. Πιο συγκεκριμένα, το 37,7% των γυναικών με ΣΠΩ είχε αλληλόμορφα με περισσότερες από 8 επαναλήψεις σε σχέση με το 30% των υγιών γυναικών που είχε αλληλόμορφα με τον ίδιο αριθμό επαναλήψεων [ρ=0.03, OR= 1,44(95%CI=1,03-2,01)]. To 30,3% είχε αλληλόμορφα με μικρό αριθμό επαναλήψεων σε σχέση με το 38,2% των υγιών γυναικών [ρ=0,035, OR=0,7(95%CI=0,5-0,97)], ενώ δεν διέφερε η συχνότητα του αλληλομόρφου με τις 8 επαναλήψεις στις δύο ομάδες μελέτης. Επομένως οι γυναίκες με ΣΠΩ έχουν πιο συχνά ΤΑΑΑΑ αλληλόμορφα του γονιδίου της SHBG με μεγάλο αριθμό επαναλήψεων σε αντίθεση με τις υγιείς γυναίκες που έχουν πιο συχνά ΤΑΑΑΑ αλληλόμορφα με μικρό αριθμό επαναλήψεων (Σχήμα 3). Σχήμα 3. Διαφορές στην κατανομή των (ΤΑΑΑΑ)η αλληλομόρφων του γονιδίου της SHBG ανάμεσα στις γυναίκες με ΣΠΩ και τις υγιείς γυναίκες. D Ο 03 D 0 035 γυναίκες με ΣΠΩ υγιείς γυναίκες <8 επαναλήψεις 8 επαναλήψεις >8 επαναλήψεις

73 Εκτός οπτό την κατανομή των αλληλόμορφων και η κατανομή των γονότυττων του πολυμορφισμού (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG είχε την ίδια χαρακτηριστική εικόνα. Παρατηρήθηκε μεγαλύτερη συχνότητα γονότυπων με μεγάλο αριθμό επαναλήψεων στις γυναίκες με ΣΠΩ σε σχέση με τις υγιείς γυναίκες (Σχήμα 4). Ως γονότυποι με μικρό αριθμό επαναλήψεων ορίστηκαν οι γονότυποι με 6/6, 6/7, 6/8, 7/7, 7/8 επαναλήψεις και ως γονότυποι με μεγάλο αριθμό επαναλήψεων ορίστηκαν οι γονότυποι με 8/8, 8/9, 8/10, 8/11, 9/9, 9/10, 9/11,10/10 επαναλήψεις. Μελετήθηκε επίσης η συσχέτιση του πολυμορφισμού (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG με τα επίπεδα της SHBG στον ορό των γυναικών με ΣΠΩ. Βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα της SHBG μεταξύ των γυναικών με ΣΠΩ που είχαν αλληλόμορφα με 8 ή περισσότερες επαναλήψεις (30,7±18,0nmol/L) και στις ασθενείς με αλληλόμορφα με λιγότερες από 8 επαναλήψεις (38,8±19,3nmol/L, ρ=0,005]. Επίσης παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα FAI ανάμεσα σε αυτές τις δύο υποομάδες με την ομάδα των ασθενών που είχε το μεγαλύτερο αριθμό επαναλήψεων να έχει και τα υψηλότερα επίπεδα FAI (ρ=0,005). Δεν υπήρχαν διαφορές όσον αφορά την ηλικία το ΒΜΙ, το επίπεδο των ανδρογόνων το λόγο LH/FSH τους δείκτες αντίστασης και τη συγκέντρωση των λιπιδίων συγκρίνοντας τις ασθενείς με μικρό και μεγάλο αριθμό ΤΑΑΑΑ επαναλήψεων (Πίνακας 8). Η συσχέτιση του αριθμού των επαναλήψεων του πολυμορφισμού (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG και των επιπέδων SHBG στον ορό δεν επιβεβαιώθηκε στις υγιείς γυναίκες (Σχήμα 4)

74 Πίνακας 8. Α νθρω π ομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των γυναικώ ν με ΣΠΩ ανάλογα με τον α ριθμό τω ν ΤΑΑΑΑ επαναλήψ εω ν. Ο μάδα Α: ασθενείς με Υονότυπους με μικρό α ριθμό ΤΑΑΑΑ επαναλήψ εω ν, ομάδα Β: ασ θενείς με Υονότυπους μ ε μεγάλο α ρ ιθμ ό ΤΑΑΑΑ επ αναλήψ εω ν (ns: μη σημαντική διαφορά) Ομάδα A Ομάδα Β Ρ Αριθμός ατόμων 50 87 Ηλικία (έτη) 23,0±6,2 22,115,6 ns BMI(Kg/mz) 27,3±7,8 28,217,0 ns LH/FSH 1,3±0,8 1,411.2 ns SHBG (nmol/l) 38,8±19,3 30,7118 0,005 Ολική τεστοστερόνη (nmol/l) 3,2±1,4 3,511,5 ns FAI 10,5±7,8 16,3113,8 0,005 Γλυκόζη/ινσουλίνη νηστείας 9,8±6,9 9,718,6 ns ΗΟΜΑ 3,2±2,1 4,113,1 ns ΑΙΙΟγλυκόζης (αριθμός ατόμων) 1364512936 (20) 1493113161(45) ns ΑυΟινσουλίνης (αριθμός ατόμων) 902417842 (20) 11666110823 (45) ns Ολική χοληστερόλη (mg/dl) 178132,7 175129,6 ns Τριγλυκερίδια (mg/dl) 79,5147,3 79,3134,6 ns HDL-χοληστερόλη (mg/dl) 49,0111,5 46,7116,3 ns LDL χοληστερόλη (mg/dl) 162,2128,2 159,1128,5 ns

75 Σχήμα 4. Πάνω διάγραμμα: Σύγκριση της κατανομής των γονοτύττων του πολυμορφισμού του γονιδίου της SHBG, ομαδοποιημένων σε γονότυπους με μικρό και μεγάλο αριθμό ΤΑΑΑΑ επαναλήψεων, σπς γυναίκες με ΣΠΩ και τις υγιείς γυναίκες (ρ=0,009). Κάτω διάγραμμα: συσχέτιση των γονοτύπων του πολυμορφισμού του γονιδίου της SHBG με τα επίπεδα της SHBG στον ορό. Οι ασθενείς με γονότυπους με μικρό αριθμό επαναλήψεων είχαν υψηλότερα επίπεδα SHBG σε σχέση με ασθενείς με γονότυπους με μεγάλο αριθμό επαναλήψεων (ρ=0,005). γυναίκες με ΣΠΩ υγιείς γυναίκες Επίπεδα SHBG (nmol/l) V Α: γυναίκες με γονότυπους με μικρό αριθμό ΤΑΑΑΑ επαναλήψεων Β: γυναίκες με γονότυπους με μεγάλο αριθμό ΤΑΑΑΑ επαναλήψεων

76 Διαφορές ανάμεσα σε υπέρβαρες-παχύσαρκες γυναίκες με ΣΠΩ και φυσιολογικού σω ματικού βάρους ασθενείς. Διακρίναμε τις γυναίκες με ΣΠΩ σε δύο ομάδες ανάλογα με το σωματικό βάρος. Ομάδα 1: οι φυσιολογικού σωματικού βάρους γυναίκες με ΣΠΩ (BMI<25Kg/m2, η -77 ασθενείς) και ομάδα 2 οι υπέρβαρες-παχύσαρκες γυναίκες με ΣΠΩ (BMte25Kg/m2, η=103 ασθενείς). Στον Πίνακα 9 φαίνονται οι κλινικές και βιοχημικές διαφορές αυτών των δύο ομάδων. Όττως είναι αναμενόμενο οι υπέρβαρες-παχύσαρκες ασθενείς έχουν υψηλότερους δείκτες αντίστασης στην ινσουλίνη, χαμηλότερα επίπεδα SHBG και μεγαλύτερου βαθμού υπερανδρσγοναιμία όπως αυτή εκφράζεται με τα υψηλότερα επίπεδα FAI σε σύγκριση με τις φυσιολογικού σωματικού βάρους γυναίκες με ΣΠΩ. Όσον αφορά το λιπιδαιμικό προφίλ οι παχύσαρκες-υπέρβαρες γυναίκες έχουν υψηλότερα επίπεδα τριγλυκεριδίων και χαμηλότερα επίπεδα HDLχοληστερόλης ενώ τα επίπεδα της ολικής και LDL-χοληστερόλης δεν διαφέρουν στις δύο υποομάδες. Τέλος οι υπέρβαρες-παχύσαρκες ασθενείς είχαν μειωμένα επίπεδα αδιπονεκτίνης σε σύγκριση με τις φυσιολογικού σωματικού βάρους ασθενείς Συγκρίνοντας αυτές τις δύο υποομάδες η κατανομή των γονοτύπων των πολυμορφισμών -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης και του 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης διέφεραν σημαντικά (ρ=0.02 και ρ=0.01 αντίστοιχα). Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά το γονίδιο της ρεζιστίνης ο γονότυπος CC και το αλληλόμορφο C βρέθηκαν συχνότερα στις υπέρβαρες-παχύσαρκες γυναίκες με ΣΠΩ (ρ=0,01, OR=0,44 95%CI=0,24-0,81 και ρ=0,01, OR=0,53 95%CI=0,33-0,85 αντίστοιχα) (Σχήμα 5). Ό σον αφορά τους πολυμορφισμούς του γονιδίου της αδιπονεκτίνης δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη κατανομή των συχνοτήτων των γονότυπων και των αλληλόμορφων του πολυμορφισμού 45T/G ανάμεσα στις φυσιολογικού σωματικού βάρους και υπέρβαρες-παχύσαρκες γυναίκες με ΣΠΩ. Ωστόσο, στη θέση 276G/T του γονιδίου της αδιπονεκτίνης, ο γονότυπος ΤΤ ήταν λιγότερο συχνός στις υπέρβαρες- ν

77 παχύσαρκες γυναίκες με ΣΠΩ (ρ=0,03, OR=3,05 95%CI=1,17-7,97), και ο γονότυπος TG ήταν ο πιο συχνός σε αυτή την υποομάδα (ρ=0,01, OR=0,45 95%CI=0,25-0,83). (Σχήμα 5). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην κατανομή των αλληλομόρφων και των γονότυπων του πολυμορφισμού (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG στις φυσιολογικού σωματικού βάρους και τις υπέρβαρες-παχύσαρκες ασθενείς (Σχήμα 5) Πίνακας 9 Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των φυσιολογικού σωματικού βάρους και των υπέρβαρων-παχύσαρκων γυναικών με ΣΠΩ. Ομάδα 1: οι φυσιολογικού σωματικού βάρους γυναίκες με ΣΠΩ (BMI<25Kg/m2), Ομάδα 2: οι υπέρβαρες-παχύσαρκες γυναίκες με ΣΠΩ (ΒΜΙ 25Kg/m2). (ηε=μη σημαντική διαφορά) Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ρ Αριθμός ατόμων 77 103 Ηλικία (έτη) 21,1 ±4,3 24,1+6,6 <0,001 BMl(Kg/m2) 21,5±1,9 32,7+6,3 <0,001 LH/FSH 1,5±1,1 1,4±1,1 ns SHBG (nmol/l) 43,9±26,6 32,1 ±24,1 0,003 Ολική τεστοστερόνη (nmol/l) 3,2±1,5 3,6±1,6 0,04 FAI 10,1 ±8,6 16,1±13,3 <0,001 Γλυκόζη/ινσουλίνη νηστείας 13,4±8,5 6,9±5,3 <0,001 ΗΟΜΑ 2,6±6,1 4,6±3,5 <0,001 ΑυΟγλυκόζης (αριθμός ασθενών) 13320±2326 15556±3248 <0,001 ΑΙΙΟινσουλίνης (αριθμός ασθενών) 7267±3809 (33) 13384±11234 <0,001 Ολική χοληστερόλη (mg/dl) 175,3+29,3 183,5±35,3 ns Τριγλυκερίδια (mg/dl) 61,5±19,4 101,1+61,7 <0,001 HDL-χοληστερόλη (mg/dl) 52,2±10,2 44,0±15,0 0,001 LDL-χοληοτερόλη (mg/dl) 163,0+28,3 163,3±31,2 ns Αδιπονεκτίνη (mg/l) (αριθμός ασθενών) 12,7±4,7 (33) 10,2+5,5 (45) 0,004

78 Σχήμα 5. Κατανομή των γονότυττων και των αλληλόμόρφων των πολυμορφισμών: - 179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης, 45T/G και 276G/T του γονιδίου της αδατονεκτίνης και (ΤΑΑΑΑ)π του γονιδίου της SHBG στις φυσιολογικού σωματικού βάρους (Ομάδα 1) και τις υπέρβαρες-παχύσαρκες (Ομάδα 2) γυναίκες με ΙΠ Ω. ΟΜΑΔΑ 1 ΟΜΑΔΑ 2 0 0 40 20 0 ρ=*0.01 Ρ "0.04 pans ΓΤ1 ρ=0.01 llbd f =P-a- γσνότιπτος CC γσνότιπτος CG γονόηπτος GG αλληλόμορφο C αλληλόμορφο G Πολυμορφισμός -179C/G του γονιδίου της ρεζιστίνης γονότιπτος GG γονότυττος 7G γονόηπτος ΤΤ αλληλόμορφο G αλληλόμορφο Τ Πολυμορφισμός 276G/T του γονιδίου της αδιττονεκτίνης p=ns <8 επαναλήψεις 8 επαναλήψεις >8 επαναλήψεις Πολυμορφισμός (ΤΑΑΑΑ)η του γονιδίου της SHBG