CAPITOLUL 11. Separarea prin cromatografie de lichide (LC)

11.1. Istoric CAPITLUL 11 Separarea prin cromatografie de lichide (LC) Începutul cromatografiei de lichide este atribuit lui Ţwet (1903), care a reuşit pentru prima dată separarea unor compuşi naturali coloraţi pe o coloană umplută cu carbonat de calciu, utilizând o fază mobilă alcătuită din solvenţi organici. Dezvoltarea cromatografiei de lichide ca tehnică analitică are loc ceva mai târziu şi este legată de necesitatea crescândă de separare a compuşilor organici din matrici complexe. In iunie 1941, Societatea Britanică de Biochimie, îşi ţinea cea de-a 214-a şedinţă de comunicări, la Institutul Naţional de Cercetări Medicale. La această întâlnire Martin şi Synge, doi tineri chimişti (Martin avea 31 de ani; Synge 26), au prezentat o lucrare despre separarea şi determinarea amino-acizilor N-acilaţi din probe de lână, printr-o nouă metodă analitică. Aceştia au separat acetil-prolina de acetil-leucina, utilizând o coloană umplută cu silicagel impregnat cu apă (un material foarte polar) şi cloroform ca fază mobilă. Lua naştere astfel cromatografia de partiţie, recunoscută apoi ca separare prin cromatografie de lichide în fază normală. [106,107] Exact 10 ani mai târziu, Martin şi un alt tânăr cercetător (A.James 29 ani) trimiteau spre publicare o lucrare descriind un proces cromatografic în care faza mobilă este un gaz. [108,109] Se puneau bazele cromatografiei de partiţie gaz-lichid. In anul 1948 Martin şi grupul său de cercetare încep cercetări la Institutul Naţional din Londra cu privire la problema separării cromatografice a acizilor graşi, cu catenă hidrocarbonată mare. Aplicarea separării cromatografice în fază normală nu a dat rezultatele dorite, deoarece coeficienţii de partiţie ai acestor compuşi erau aproape total în favoarea fazei mobile. Deci retenţia şi astfel separarea lor pe o coloană polară nu avea loc. Ideea de a schimba rolurile celor două faze a venit imediat. Astfel au realizat prima fază staţionară nepolară prin tratarea kiselgurului cu ( ) 2 Cl 2, care devine total neaderent de către solvenţi polari şi hidrofili. In anul următor au realizat pentru prima dată separarea acidului lauric (C12) de acidul stearic (C18). Mai târziu, tehnica bazată pe acest principiu avea să fie cunoscută ca separare prin cromatografie de lichide în fază inversă, deşi până în 1970 chiar şi IUPAC considera această tehnică analitică doar de interes istoric. Prin realizarea fazelor staţionare chimic legate această tehnică ia o mare dezvoltare, în prezent fiind cea mai importantă tehnică analitică de separare. [110] Contribuţiile esenţiale ale lui Martin şi Synge la dezvoltarea cromatografiei au fost răsplătite în anul 1952 prin acordarea Premiului Nobel în Chimie. Prima fază staţionară sintetizată este atribuită autorilor Halasz şi Sebastian (1969), care au refluxat silicagelul cu 1-octanol, obţinând eterul având la bază o structură destul de instabilă în prezenţa apei, caraterizată de legăturile --C: H + H-(CH 2 ) 7 (CH 2 ) 7 + HH In 1970 Kirkland şi DeStefano au ataşat lanţuri hidrocarbonate la structura silicagelului prin utilizarea reactivilor de derivatizare de tip silanic, obţinând structuri mult mai stabile 179

pe bază de legături --, ca în exemplul următor: H + Cl (CH 2 ) 7 (CH 2 ) 7 + HCl Horvath, Knox, Soczewinski, Snyder, Scott, Kirkland, Guiochon sunt doar câteva nume mari de oameni de ştiinţă care au adus contribuţii fundamentale, teoretice sau experimentale, la dezvoltarea cromatografiei de lichide ca tehnică analitică de mare performanţă. 11.2. Clasificarea separărilor prin cromatografia de lichide Retenţia în cromatografia de lichide este un proces complex, care implică interacţii ale speciilor din proba injectată atât cu faza mobilă, cât şi cu faza staţionară. Cunoaşterea mecanismului după care se desfăşoară procesul de retenţie are ca prim avantaj pentru analist posibilitatea predicţiei acestuia şi mai ales alegerea acelor condiţii experimentale pentru atingerea unor selectivităţi maxime între analiţi. Cea mai importantă clasificare a separărilor LC este bazată pe mecanismul care stă la baza separării, care la rândul său depinde de natura celor faze (staţionară şi mobilă) participante în procesul de separare cromatografică. Cele mai importante clase de separări LC sunt următoarele: A) Cromatografia de lichide în fază normală (NP-LC normal-phase liquid chromatography ) în care faza staţionară este polară, iar faza mobilă este alcătuită dintrun solvent nepolar cu un conţinut mic de modificator polar. B) Cromatografia de lichide în fază inversă (RP-LC reversed-phase liquid chromatography ) în care faza staţionară este nepolară şi hidrofobă, iar faza mobilă este alcătuită dintr-un solvent polară. C) Cromatografia de lichide prin mecanism de schimb ionic (IC ion chromatography ), în care faza staţionară este un schimbător de ioni, iar faza mobilă este apoasă cu un ph controlat. D) Cromatografie de lichide prin mecanism de excludere (sau cromatografie pe gel), în care faza staţionară este un gel cu porozitate controlată, iar componenţii probei sunt separaţi în funcţie de forma şi dimensiunea moleculară. E) Cromatografie de lichide bazată pe interacţia diferită a compuşilor asimetrici cu anumite structuri din faza staţionară (numite selectori de chiralitate). Cele mai importante separări cromatografice se efectuează în prezent pe o coloană cromatografică, confecţionată dintr-un metal. In interiorul coloanei se găseşte faza staţionară, fixată la capete între două frite. Diametrul şi lungimea sunt parametri constructivi, funcţie de care coloanele se împart în mai multe clase, descrise în tabelul următor. Cromatografia de lichide planară este o tehnică cu aplicaţii din ce în ce mai puţin utilizate în practică analitică. Cromatografia pe hârtie sau cromatografia în strat subţire în diverse variante (ascendentă sau descendentă) pot decurge prin unul din mecanismele de mai sus, iar vizualizarea compuşilor separaţi sub forma de spoturi se poate face utilizând proprietatea de absorbţie sau de fluorescenţă a analiţilor separaţi, cu sau fără reactiv de derivatizare (aşa-numita developare). Există şi posibilitatea ca spoturile rezultate să fie izolate şi apoi printr-o procedură de extracţie cu un solvent adecvat, analitul conţinut să fie determinat printr-o tehnică spectrometrică. 180

Tabel 11.1. Clasificarea coloanelor în LC în funcţie de dimensiuni. [111] Descriere i.d. (mm) d.p. (μm) Debit optim fază mobilă Coloane deschise < 0,025 - < 25 nl/min Coloane nanobore 0,025 0,1-25-4000 nl/min Coloane capilare 0,1-1 - 0,4 200 μl/min Coloane microbore 1-2 3-5 0,05 1 ml/min Coloane narrow-bore 2-4 3-5 0,3 3 ml/min Coloane normal-bore 4-5 3-7 1 10 ml/min Coloane semi-preparative 5-10 5-12 5 40 ml/min Coloane preparative > 10 5-20 > 20 ml/min 11.3. Faze mobile în cromatografia de lichide Faza mobilă (nepolară) în cromatografia de lichide în fază normală (NP-LC) este alcătuită din două componente principale: a) solventul nepolar, care poate fi unul dintre solvenţii: pentan, hexan, ciclohexan; b) modificator polar (într-un procent foarte mic): tetrahidrofuran, 2-propanol, acetonitril, eteri, esteri, cloroform, etc. Aceştia pot fi clasificaţi în solvenţi slabi (cu putere elutropică mică) şi solvenţi tari (putere elutropică mare, după cum se poate observa din tabelul 11.2). Faza mobilă (polară) în RP-LC este în general alcătuită din două componente principale: componenta apoasă şi componenta organică. Parametrii fazei mobile care influenţează retenţia în RP-LC sunt următorii: Natura modificatorului organic (acetonitril, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, tetrahidrofuran, dioxan, etc); puterea elutropică a modificatorului organic este o măsură a capacităţii sale de a micşora factorul de capacitate (timpul de retenţie) al analiţilor: cu cât puterea elutropică este mai mare, cu atât timpul de retenţie va fi mai mic. Conţinutul modificatorului organic (% în volume): de regulă, cu cât concentraţia modificatorului organic este mai mare, cu atât timpul de retenţie al analiţilor este mai mic (prin creşterea solubilităţii analiţilor în faza mobilă); ph-ul şi componentei apoase din faza mobilă influenţează retenţia analiţilor cu proprietăţi acido-bazice; Natura acidului (acizi formic, acetic, trifluoracetic, tricloracetic) sau a tamponului utilizat în componenta apoasă (se pot utiliza soluţii tampon pe bază de fosfat, borat, acetat, etc, cu amoniac, trietilamina, dar cu ph-ul cuprins între 2 şi 8); Tăria ionică a componentei apoase (care depinde de concentraţia unor săruri adăugate, sau de concentraţia soluţiei tampon); Natura şi concentraţia agenţilor de formare de perechi ionice (R 4 N + ; R-S 3 - ; R--S 3 -, etc). Solvenţii folosiţi în LC trebuie să fie filtraţi (pentru a nu conţine particule în suspensie), degazaţi şi de puritate cromatografică. Folosirea unor solvenţi cu particule solide în suspensie conduce la colmatarea coloanei cromatografice şi a sistemului cromatografic. Prezenţa unor gaze (N 2 sau 2 ) dizolvate în faza mobilă poate influenţa 181

detecţia, deoarece după ieşirea din coloana cromatografică fluxul mobil are o presiune mai mică decât în coloană şi astfel se pot forma bule gazoase care pot perturba în procesul de detecţie. 11.4. Faze staţionare în cromatografia de lichide Fază normală Cea mai importantă fază staţionară în cromatografia de lichide în fază normală este silicagelul ( 2 ). Acesta este considerat un adsorbant foarte polar, datorită grupărilor silanol reziduale din matricea sa. De asemenea, Al 2 3, Zr 2, sau Ti 2 sunt menţionate des ca faze staţionare polare în NP-LC. Fazele staţionare polare legate sunt derivate din silicagel; acestea conţin grupări funcţionale polare X, precum hidroxil, nitro, cian, sau amino, legate printr-un lanţ hidrocarbonat scurt R: R X Dintre acestea, aminopropil-silicagelul sau dihidroxipropil-silicagelul sunt cele mai utilizate faze staţionare legate în separările LC prin acest mecanism. CH 2 CH 2 CH 2 Aminopropil-silicagel NH 2 CH 2 CH CH 2 H H Dihidroxipropil-silicagel Utilizând tehnica derivatizării amino-silicagelului cu acidul dodecamolibdofosforic s-au realizat noi faze staţionare polare, utilizate în separarea compuşilor aromatici. Retenţia puternică a compuşilor aromatici pe astfel de faze staţionare polare se explică prin interacţia puternică a orbitalilor π din nucleele aromatice cu orbitalii d ai Mo. [112] H + (CH 2 ) 3 -NH 3 + (CH 2 ) 3 -NH 3 3- PMo 12 40 + (CH 2 ) 3 -NH 3 Fază inversă In cromatografia de lichide în fază inversă (RP-LC) fazele staţionare sunt hidrofobe. Acestea se pot obţine prin modificarea chimică a silicagelului (sau chiar 182

aluminei) sau pot fi de natură polimerică. De aceea, aceste faze staţionare se mai numesc şi faze chimic legate ( bonded phases ). Principiul de sinteză a fazelor chimic legate se bazează pe reacţia grupărilor silanol reziduale din matricea silicagelului tratat termic cu un agent de silanizare. In figura următoare, prin reacţia de derivatizare, în una din cele două modalităţi menţionate, s-a introdus radicalul hidrocarbonat octadecil legat de matricea silicagelului. [113,114] In funcţie de natura radicalului R grefat prin intermediul reactivului de derivatizare de tip silanic se disting următoarele faze staţionare (redate în ordinea descrescătoare a hidrofobicităţii lor): -C 18 H 37 (octadecil-silicagel, sau C18); -C 8 H 17 (octil-, sau C8); C6, C4, C2 -C 6 H 5 (fenil-); -C 6 H 4 -N 2 (nitrofenil); -(CH 2 ) 3 -CN(cianopropil). H + X (CH 2 (CH 2 pk a = 5-7 (CH 2 H (CH 2 X H + X (CH 2 (CH 2 X H (CH 2 licagel Densitate: Densitate: 8 ± 1 μmol/m 2 4,5 μmol/m 2 Fig. 11.1. Modalităţi de obţinere a fazelor staţionare chimic modificate din silicagel, utilizând reactivi de derivatizare mono-funcţionali sau tri-funcţionali, şi unele caracteristici ale suprafeţei silicagelului înainte şi după derivatizare. Cu toate acestea, în materialul rezultat după reacţia de silanizare o parte însemnată a grupărilor silanol rămân intacte. Prezenţa acestora în compoziţia fazei staţionare poate influenţa mecanismul de separare, datorită interacţiunilor dipol-dipol sau 183

prin legături de hidrogen cu grupări similare din moleculele de analit. Derivatizarea completă a acestora conduce la faze staţionare complet inertizate (cunoscute în literatura de specialitate ca faze staţionare de tip end-capped ) şi se poate efectua prin utilizare unui reactiv de derivatizare trifuncţional, plus aplicarea în final a unei silanizări cu trimetilclorsilan, care datorită volumului său mai mic poate accesa restul de grupări silanol, ecranate steric de grupările chimic legate deja introduse anterior. Fazele staţionare chimic modificate de tip monolitic, conţinând radicali hidrocarbonaţi R, se obţin prin procese sol-gel. Aceste materiale au un aspect ceramic, caracterizate de o porozitate înaltă, iar radicalii R sunt orientaţi în afara matricei solide. Prepararea unor astfel de materiale de tip ceramic porneşte de la reactivul de bază tetrametoxisilan, care prin hidroliză acidă (în prezenţă de HCl) formează compuşi intermediari cu legături -H, datorată reacţiei: [115] () 4 + n HH () 4-n(H) n + n H In continuare au loc reacţii de condensare ce conduc la formarea de legături siloxanice, iar structura devine tridimensională: H + H + HH + H + H Dacă alături de tetrametoxisilan se adaugă într-un raport molar ales trimetoxialchilsilan; structura tridimensională rezultată va conţine radicali hidrocarbonaţi R legaţi de atomul de siliciu. Ecuaţia reacţiei poate fi scrisă în mod simplificat astfel: R R HH x + y ( ) ( ) x y + (4x + 3y) H La încălzire, molecule de apă şi metanol sunt eliminate din porii materialului format. Acesta poate lua forma unei bare care apoi se introduce în coloana cromatografică. Fazele staţionare modificate din silicagel au o mare aplicabilitate în cromatografia de lichide, dar prezintă şi unele inconveniente. Două dintre inconvenientele cele mai serioase ale acestor faze staţionare sunt: - domeniul de ph al componentei apoase utilizate este relativ restrâns (2-8); la ph-uri sub 2 are loc hidroliza grupărilor -( ) 2 -R, iar la ph-uri mai mari de 8 are loc dizolvarea silicagelului; - acestea nu pot fi utilizate în separări cromatografice pentru concentraţii ale componentei apoase în faza mobilă apropiate de 100%. In acest caz lanţurile hidrocarbonate legate de structura silicagelului colapsează, ele neputând a reveni la conformaţia iniţială după utilizarea de faze mobile total sau aproape total apoase (mai mari de 98%). Colapsarea lanţurilor hidrocarbonate este similară formării micelelor, lanţurile hidrocarbonate având tendinţa de a micşora suprafaţa de contact cu mediul apos. In Fig. 11.2 sunt redate tendinţele unei suprafeţe de silicagel chimic modificat cu lanţuri 184

hidrocarbonate, în prezenţa unei faze mobile conţinând un procent semnificativ de modificator organic, comparativ cu o fază mobilă cu un conţinut apropiat de 100% apă. Mediu polar (solvent organic / apă) Mediu foarte polar (100% apă) Lanţuri hidrocarbonate de tip C 18 Fig. 11.2. Conformaţii ale lanţurilor C18 în prezenţa unui mediu apă + modificator (solvent) organic (partea stângă) şi în prezenţa unui mediu total apos (partea dreaptă). Acest ultim inconvenient s-a putut rezolva prin realizarea de faze staţionare chimic modificate, conţinând grupări polare intercalate între lanţul hidrocarbonat şi atomul de siliciu. astfel de structură este mai flexibilă la faze mobile total sau aproape total apoase. nteza lor presupune două etape, una de introducere a grupării polare, urmată de introducerea radicalului hidrofob R. Două dintre posibilităţile aplicate în obţinerea fazelor staţionare chimic legate cu grupări polare intercalate sunt prezentate în continuare. Calea de sinteză a fazelor staţionare legate, cu grupare polară intercalată de tip amidică este următoarea: [116] H NH2 H H + CH 2 NH2 H NH2 H H (silicagel) Grupa amidica H NH C R NH C R + R C Cl H Fig. 11.3. Procedeu de derivatizare a silicagelului pentru obţinerea fazelor staţionare chimic legate cu grupare polară amidică intercalată. 185

Calea de sinteză a fazelor staţionare legate, cu grupare polară intercalată de tip carbamic, este redată mai jos: [116] H R N H H CH 3 + R H Cl N H H - HCl Grupare H carbamica H N H R Fig. 11.4. Procedeu de derivatizare a silicagelului pentru obţinerea fazelor staţionare chimic legate cu grupare polară carbamică intercalată. Introducerea grupării polare influenţează procesul de retenţie cromatografică. Gruparea polară poate interacţiona cu grupări polare din moleculele de analit. In cazul grupărilor polare intercalate de tip amidic sau carbamic, pot interveni interacţii π-π între analit şi gruparea polară din faza staţionară. Astfel, în exemplul redat în Fig. 11.5, ordinea de eluţie se poate modifica în cazul perechii de analiţi trans-stilben şi dibenzil la eluţia printr-o coloană umplută cu fază staţionară C18 cu grupare polară intercalată, comparativ cu una C18 clasică. Spre deosebire de dibenzil, molecula de trans-stilben posedă în plus o dublă legătură carbon-carbon, care determină o interacţie mai puternică cu legăturile π din grupările polare ale fazei staţionare. In schimb, în cazul separării pe o coloană clasică C18, ordinea de eluţie este dată de ordinea hidrofobicităţii; trans-stilbenul este mai puţin hidrofob decât dibenzilul, datorită dublei legături (vezi Tabelul 2.4), astfel că va elua primul din coloana cromatografică. Răspuns detector Răspuns detector min Fig. 11.5. Compararea separării unui amestec de trans-stilben şi dibenzil, pe o coloană cu fază staţionară C18 (sus) şi fază staţionară C18 cu grupare polară intercalată (jos). Condiţiile de separare identice pentru cele două coloane: faza mobilă compusă din 70% H şi 30% H 2; debit 1 ml/min; 40 C; detecţie UV 254 nm. [117] min 186

11.5. Mecanismul de separare LC în fază normală Cromatografia de lichide în fază normală se aplică de obicei la separarea compuşilor organici foarte polari, cum sunt aminoacizii. Cromatografia lichid-solid (LSC) este de obicei denumită ca o tehnică de separare în fază normală, caracterizată de utilizarea unui adsorbant anorganic sau a unei faze staţionare chimic legate cu grupări funcţionale polare, iar ca fază mobilă neapoasă unul sau mai mulţi solvenţi organici apolari (în special hexanul) în amestec cu un solvent polar, până la realizarea unei valori optime a tăriei solventului din punct de vedere al polarităţii. In cadrul acestei separări, pe suprafaţa fazei staţionare se formează un strat de molecule adsorbite ale fazei mobile, cu o compoziţie ce depinde de alegerea fazei mobile, care de multe ori nu reflectă compoziţia acesteia sau modificarea ei în timpul unui proces de separare în gradient de solvent. Retenţia unui solut este determinată de balanţa interacţiunilor moleculei de solut cu moleculele fazei mobile şi a moleculelor adsorbite pe suprafaţa fazei staţionare. Pentru acest proces s-au propus până în prezent două modele de retenţie: [30] a) modelul competiţional dezvoltat de Snyder şi Soczewinski; b) modelul interacţiilor de solvent, propus de Scott şi Kucera. In forma cea mai simplificată, modelul competiţional presupune că suprafaţa întreagă a adsorbantului este acoperită de un monostrat de molecule ale fazei mobile. Retenţia are loc prin dislocuirea unui număr de molecule de fază mobilă, adsorbite la nivelul centrilor activi ai fazei staţionare, echivalente ca volum cu molecula de solut. In următoarea etapă are loc dislocuirea moleculei de solut adsorbită de către molecule ale fazei mobile. reprezentare schematică a acestui model simplu de explicare a retenţiei în NP-LC este redată în figura următoare. Analit Modificator polar Fig. 11.6. Reprezentarea schematică a modelului competiţional de retenţie în cromatografia de lichide în fază normală. Conform modelului competiţional dat în Fig. 11.6, retenţia se bazează pe următoarele două procese fizice care au loc la suprafaţa fazei staţionare: -H + ns -H (S) n -H (S) n + A -H (S) n-x A + xs, în care -H reprezintă centrul de adsorbţie de pe suprafaţa adsorbantului (considerat ca fiind gruparea silanol reziduală din structura silicagelului), la care se adsorb n molecule de solvent polar S din faza mobilă, iar molecula de analit A va dislocui x dintre moleculele de solvent adsorbite. 187

Pentru ca analitul să elueze din coloana cromatografică este necesar ca acest proces să fie reversibil. De aceea tăria interacţiei sale cu centrul activ nu trebuie să fie foarte puternică. După cum se poate observa, modelul competiţional neglijează orice interacţie între molecula de analit şi moleculele fazei mobile. Predicţia retenţiei este redată de relaţia simplificată: k log 1 = α(ε1 ε2) (11.1) k2 ε reprezintă parametrul de tărie al fazei mobile (putere elutropică), care semnifică energia liberă de adsorbţie a moleculelor de solut per unitate de suprafaţă de fază staţionară, iar parametrul α este specific moleculei de solut (în dependenţă de volumul molar). In tabelul de mai jos sunt redate valorile parametrului ε pentru cei mai importanţi solvenţi utilizaţi în mecanismul de fază inversă în HPLC. Tabel 11.2. Valorile parametrului ε pentru solvenţi utilizaţi în NP-LC. [118] Solvent ε pentru licagel Alumina n-hexan 0,01 0,01 1-clorbutan 0,20 0,26 cloroform 0,26 0,40 izopropileter 0,34 0,28 acetat de etil 0,38 0,58 tetrahidrofuran 0,44 0,57 acetonitril 0,50 0,65 Modelul bazat pe interacţia moleculelor de solut, respectiv a modificatorului polar din faza mobilă, presupune formarea a două straturi adsorbite, ca urmare a interacţiilor dipol-dipol. Atunci când concentraţia modificatorului polar este mică, formarea celui de-al doilea strat de molecule de modificator polar adsorbite, în interacţie cu primul strat şi cu centrul activ, nu are loc, iar interacţia moleculei de solut cu centrul activ devine mai puternică, conducând la timpi de retenţie mari. Dimpotrivă, atunci când concentraţia modificatorului polar creşte, are loc formarea celui de-al doilea strat de molecule adsorbite, iar molecula de solut va interacţiona mult mai slab cu centrul activ, datorită ecranării celor două straturi adsorbite. Ca urmare, timpul de retenţie al solutului va fi de data aceasta mai scurt, fiind dat de relaţia simplificată: 1 = α + β Cmodificator polar (11.2) tr Această relaţie este însă valabilă pentru un domeniu relativ îngust al concentraţiei modificatorului polar din faza mobilă. 188