ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Κ. ΖΑΧΑΡΗ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Κ. ΖΑΧΑΡΗ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΥΤΟΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΤΗΝ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΤΗΣ ΙΑ ΟΧΙΚΗΣ ΕΓΧΥΣΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΣΕ ΣΥΝ ΥΑΣΜΟ ΜΕ ΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΦΑΣΗ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Κ. ΖΑΧΑΡΗ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΥΤΟΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΤΗΝ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΤΗΣ ΙΑ ΟΧΙΚΗΣ ΕΓΧΥΣΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΣΕ ΣΥΝ ΥΑΣΜΟ ΜΕ ΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΦΑΣΗ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας, του Τοµέα Φυσικής, Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χηµείας, του Τµήµατος Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Αναστάσιος Ν. Βουλγαρόπουλος Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Παναγιώτης Νικήτας (Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής) Επικ. Καθηγητής Γεώργιος Α. Θεοδωρίδης (Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής Μιχαήλ Κουππάρης (Καποδιστριακό Πανεπιστήµιο Αθηνών) Καθηγητής Νικόλαος Χανιωτάκης (Πανεπιστήµιο Κρήτης) Αναπλ. Καθηγητής ηµήτριος Γ. Θεµελής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης) Αναπλ. Καθηγήτρια Ελένη Τσούκαλη (Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης)

Η επταµελής εξεταστική επιτροπή που διορίστηκε για την κρίση της ιδακτορικής ιατριβής του κ. Ζαχαρή Κων/νου, Χηµικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης στις 31 Ιανουαρίου 2006 όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής µε τίτλο: «Αυτοµατισµός στην προκατεργασία και ανάλυση δειγµάτων µε χρήση της τεχνικής της διαδοχικής έγχυσης δείγµατος σε συνδυασµό µε διαχωριστικές τεχνικές στην υγρή φάση». Η επιτροπή έκρινε οµόφωνα ότι η ιατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συµβολή στην πρόοδο της Επιστήµης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Καθηγητής Αναστάσιος Βουλγαρόπουλος Καθηγητής Μιχαήλ Κουππάρης Καθηγητής Παναγιώτης Νικήτας Καθηγητής Νικόλαος Χανιωτάκης Αναπλ. Καθηγητής ηµήτριος Θεµελής Αναπλ. Καθηγήτρια Ελένη Τσούκαλη Επικ. Καθηγητής Γεώργιος Θεοδωρίδης

«Η έγκριση της ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα» (Νόµος 5343 / 1932, αρθρ. 202 παρ. 2)

Στους γονείς µου

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 1 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές τεχνικές 2 1.1. Εισαγωγή 2 1.2. Υγρή Χρωµατογραφία 2 1.2.1. Γενικά 2 1.2.2. ιαχωρισµός στην υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης (RPLC) και στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (ΙΕC) 4 1.2.2.1. ιαχωρισµός στην υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης 4 1.2.2.2. ιαχωρισµός στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής 5 1.2.3. Οργανολογία συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας 6 1.2.4. Μονολιθικές στήλες στην υγρή χρωµατογραφία 8 1.3. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση 10 1.3.1. Γενικά 10 1.3.2. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζωνών (CZE) 11 1.3.3. Τριχοειδής ηλεκτροκινητική χρωµατογραφία µικκυλίων (MEKC) 13 1.3.4. Οργανολογία συστήµατος τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης 15 1.4. Εφαρµογές της υγρής χρωµατογραφίας και της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης στη βιοανάλυση 17 1.5. Απόδοση συστήµατος διαχωρισµού 17 1.5.1. Απόδοση συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας 18 1.5.2. Απόδοση συστήµατος τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης 19 Βιβλιογραφία 21 Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία δείγµατος στη βιοανάλυση 23 2.1. Γενικά για την προκατεργασία δείγµατος 23 2.2. Τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος στη βιοανάλυση 25 2.2.1. ιήθηση 25 2.2.2. Καταβύθιση 26 2.2.3. Εκχύλιση 26 2.2.3.1. Εκχύλιση υγρού-υγρού 26 i

2.2.3.2. Εκχύλιση στερεάς φάσης 28 2.2.3.3. Εκχύλιση και τεχνολογίες µεµβράνης 31 2.2.4. Παραγωγοποίηση 32 2.2.4.1. Παραγωγοποίηση για αύξηση της πτητικότητας των ενώσεων 33 2.2.4.2. Παραγωγοποίηση για βελτίωση του διαχωρισµού 33 2.2.4.3. Παραγωγοποίηση για αύξηση της ευαισθησίας της µεθόδου 34 2.3. Αυτοµατισµός στις τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος 38 2.3.1. Αυτοµατισµός στις τεχνικές εκχύλισης 40 2.3.1.1. Αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση στερεάς φάσης 40 2.3.1.2. Αυτοµατοποιηµένη µικροεκχύλιση στερεάς φάσης 43 2.3.1.3. Αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση µεµβρανών 44 2.3.2. Αυτοµατισµός στην παραγωγοποίηση 46 2.3.3. Αυτοµατισµός στις συνδυασµένες τεχνικές 49 Βιβλιογραφία 53 Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 55 3.1. Γενικά για την τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 55 3.1.1. Οργανολογία ενός αναλυτή SIA 55 3.1.2. Αρχή λειτουργίας 57 3.1.3. Αναχαίτιση της ροής 60 3.1.4. Βελτιστοποίηση µιας µεθόδου SIA 61 3.1.5. Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα της τεχνικής SIA 62 3.1.6. Αναλυτής SIA µε έγχυση σφαιρικών σωµατιδίων 62 3.1.7. Εφαρµογές της SIA 63 3.2. Η τεχνική SIA στην αυτοµατοποιηµένη προκατεργασία και ανάλυση δείγµατος 64 3.2.1. Αραίωση του δείγµατος 64 3.2.2. ιάχυση αερίων και διαπίδυση 65 3.2.3. Εκχύλιση υγρού-υγρού, αέριου-υγρού και στερεάς φάσης 66 3.2.4. Ενζυµικές αντιδράσεις 70 3.2.5. Ανοσοχηµικές αντιδράσεις 71 3.2.6. Αντίδραση παραγωγοποίησης και εισαγωγή δείγµατος στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση 72 3.2.7. ιαχωρισµός µίγµατος ενώσεων 73 3.2.8. Προσυγκέντρωση σε ηλεκτρόδιο 74 3.2.9. Πέψη µε λυχνία UV ή µε µικροκύµατα 74 Βιβλιογραφία 76 ii

Κεφάλαιο 4 ο. Βιβλιογραφική επισκόπηση αναλυτικών µεθόδων 78 4.1. Βιβλιογραφική επισκόπηση της σύζευξης της τεχνικής SIA µε διαχωριστικές τεχνικές στην υγρή φάση 78 4.1.1. Σύζευξη της τεχνικής SIA µε υγρή χρωµατογραφία 78 4.1.2. Σύζευξη της τεχνικής SIA µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση 79 4.1.3. Σύζευξη της τεχνικής SIA µε µονολιθική στήλη 82 4.2. Βιβλιογραφική επισκόπηση των χηµικών συστηµάτων 82 4.2.1. Μέθοδοι προσδιορισµού του γ-αµινοβουτυρικού οξέος 83 4.2.2. Μέθοδοι προσδιορισµού αµινοξέων 83 4.2.3. Μέθοδοι προσδιορισµού πεπτιδίων και αµινοξέων 84 4.2.4. Μέθοδοι για τη µελέτη της αλληλεπίδρασης φαρµάκου-πρωτεΐνης 84 Βιβλιογραφία 86 Κεφάλαιο 5 ο. Σκοπός και στοιχεία πρωτοτυπία της διατριβής 90 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 6 ο. Οργανολογία και αντιδραστήρια 92 6.1. Οργανολογία και λογισµικά 92 6.2. Αντιδραστήρια και υλικά 93 Κεφάλαιο 7 ο. Σύζευξη της SIA µε την HPLC σε ροή. Eφαρµογή στην παραγωγοποίηση και προσδιορισµό του γ-αµινοβουτυρικού οξέος σε βιολογικά υγρά 95 7.1. Αρχή της µεθόδου 95 7.2. Αποτελέσµατα και συζήτηση 95 7.2.1. Προκαταρκτικά πειράµατα 96 7.2.2. Βελτιστοποίηση της παραγωγοποίησης σε ροή µε το σύστηµα SIA 97 7.2.2.1. Μελέτη χηµικών παραµέτρων 98 7.2.2.2. Μελέτη γεωµετρικών παραµέτρων 101 7.2.3. Βελτιστοποίηση των συνθηκών διαχωρισµού µε το σύστηµα της HPLC 106 iii

7.2.4. Βελτιστοποίηση των παραµέτρων της σύζευξης σε ροή των τεχνικών SIA και HPLC 108 7.3. Προσδιορισµός του γ-αµινοβουτυρικού οξέος σε υδατικά διαλύµατα µε τη συζευγµένη τεχνική SIA-HPLC 112 7.4. Αναλυτικά χαρακτηριστικά της µεθόδου 113 7.5. Ακρίβεια και επαναληψιµότητα της µεθόδου 115 7.6. Προσδιορισµός του γ-αµινοβουτυρικού οξέος σε δείγµατα ούρων µε τη συζευγµένη τεχνική SIA-HPLC 116 7.7. Προσδιορισµός του γ-αµινοβουτυρικού οξέος σε δείγµατα εγκεφαλονωτιαίου υγρού µε τη συζευγµένη τεχνική SIA-HPLC 120 Βιβλιογραφία 123 Κεφάλαιο 8 ο. Σύζευξη της SIA µε την HPLC σε ροή. Eφαρµογή στον προσδιορισµό αµινοξέων σε φαρµακευτικά δείγµατα µετά από παραγωγοποίηση 124 8.1. Αρχή της µεθόδου 124 8.2. Αποτελέσµατα και συζήτηση 124 8.2.1. Προκαταρκτικά πειράµατα 125 8.2.2. Βελτιστοποίηση των συνθηκών διαχωρισµού µε το σύστηµα της HPLC 126 8.2.3. Βελτιστοποίηση της παραγωγοποίησης σε ροή 128 8.2.3.1. Μελέτη χηµικών παραµέτρων 129 8.2.3.2. Μελέτη γεωµετρικών παραµέτρων 131 8.3. Προσδιορισµός αµινοξέων σε υδατικά διαλύµατα µε τη συζευγµένη τεχνική SIA-HPLC 136 8.4. Αναλυτικά χαρακτηριστικά της µεθόδου 139 8.5. Ακρίβεια και επαναληψιµότητα της µεθόδου 141 8.6. Προσδιορισµός αµινοξέων σε φαρµακευτικά δείγµατα µε τη συζευγµένη τεχνική SIA-HPLC 143 Βιβλιογραφία 147 Κεφάλαιο 9 ο. Σύζευξη σε ροή της SIA µε την CE µέσω µικροβαλβίδας. Eφαρµογή στην παραγωγοποίηση και στον προσδιορισµό πεπτιδίων και αµινοξέων 148 9.1. Αρχή της µεθόδου 148 9.2. Αποτελέσµατα και συζήτηση 148 9.2.1. Προκαταρκτικά πειράµατα 149 iv

9.2.2. Βελτιστοποίηση των συνθηκών διαχωρισµού και παραγωγοποίησης µε το σύστηµα CE 150 9.2.2.1. Βελτιστοποίηση των συνθηκών διαχωρισµού 151 9.2.2.2. Βελτιστοποίηση των συνθηκών της αντίδρασης παραγωγοποίησης 157 9.2.3. Εισαγωγή µικροβαλβίδας στο σύστηµα CE 161 9.2.4. Μετατροπή της συµβατικής σε παραγωγοποίηση σε ροή µε το σύστηµα SIA 165 9.2.5. Σύζευξη των συστηµάτων SIA και CE σε ροή 166 9.2.5.1. Μελέτη των παραµέτρων της σύζευξης των συστηµάτων SIA και CE 166 9.2.5.2. Παραγωγοποίηση σε ροή µε χρήση του συστήµατος SIA-CE 168 Βιβλιογραφία 174 Κεφάλαιο 10 ο. Σύζευξη της SIA σε ροή µε ανιονανταλλακτική µονολιθική στήλη. Eφαρµογή στην αλληλεπίδραση φαρµάκου-πρωτεΐνης 175 10.1. Αρχή της µεθόδου 175 10.2. Θεωρία 175 10.3. Αποτελέσµατα και συζήτηση 178 10.3.1. Προκαταρκτικά πειράµατα 179 10.3.2. Βελτιστοποίηση των συνθηκών δέσµευσης της πρωτεΐνης στη µονολιθική στήλη 179 10.3.2.1. Επιλογή κατάλληλου τύπου µονολιθικής στήλης 179 10.3.2.2. Βελτιστοποίηση του αναρροφώµενου όγκου BSA 181 10.3.3. Μελέτη της µη-δέσµευσης του φαρµάκου ciprofloxacin στην ανιονανταλλακτική µονολιθική στήλη 182 10.3.4. Μελέτη της αναρροφώµενου όγκου του ciprofloxacin 184 10.4. Συµβατική και σε ροή ανάµιξη ciprofloxacin µε BSA 186 10.4.1. Συµβατική ανάµιξη 186 10.4.2. Ανάµιξη σε ροή 188 10.5. Αναλυτικά χαρακτηριστικά της µεθόδου 189 10.6. Ακρίβεια και επαναληψιµότητα της µεθόδου 191 10.7. Υπολογισµός των παραµέτρων δέσµευσης του ciprofloxacin 192 10.7.1. Υπολογισµός παραµέτρων δέσµευσης µε συµβατική ανάµιξη αντιδραστηρίων 192 10.7.2. Υπολογισµός παραµέτρων δέσµευσης µε ανάµιξη αντιδραστηρίων σε ροή 198 v

10.8. Σύγκριση της προτεινόµενης µεθόδου µε την υπερδιήθηση 201 Βιβλιογραφία 203 Κεφάλαιο 11 ο. Ανακεφαλαίωση-Συµπεράσµατα 204 Κεφάλαιο 12 ο. EXTENDED SUMMARY 207 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ηµοσιεύσεις ιδακτορικής ιατριβής 210 Ανακοινώσεις θεµάτων της ιδακτορικής ιατριβής σε διεθνή συνέδρια 211 vi

1 Πρόλογος Στην παρούσα ιδακτορική ιατριβή αναπτύχθηκε µια νέα οργανολογική διάταξη για αυτοµατοποιηµένη προκατεργασία και ανάλυση δειγµάτων µε σύζευξη της τεχνικής της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή (Sequential Injection Analysis SIA), µε διαχωριστικές τεχνικές στην υγρή φάση (υγρή χρωµατογραφία, τριχοειδής ηλεκτροφόρηση). Ιδιαίτερη έµφαση δόθηκε στην παραγωγοποίηση του δείγµατος, ως τεχνική προκατεργασίας, αλλά και στη χρήση αναλυτή SIA για απευθείας διαχωρισµούς µιγµάτων µικρών µορίων και µεγαλοµορίων. Το περιεχόµενο της ιδακτορικής ιατριβής αποτελείται από δυο µέρη, το θεωρητικό και το πειραµατικό µέρος. Στο θεωρητικό µέρος της ιατριβής, αναπτύσσεται εν συντοµία το υπόβαθρο των αναλυτικών τεχνικών που χρησιµοποιήθηκαν και καταγράφονται οι σπουδαιότερες από τις τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος που χρησιµοποιούνται στη σύγχρονη χηµική ανάλυση-βιοανάλυση. Η βιβλιογραφική επισκόπηση του θέµατος χωρίζεται σε δυο µέρη. Το πρώτο µέρος αναφέρεται στην οργανολογική διάταξη της σύζευξης της τεχνικής SIA µε διαχωριστικές τεχνικές στην υγρή φάση. Στο δεύτερο µέρος, καταγράφονται οι µέθοδοι προσδιορισµού των ενώσεων εκείνων που µελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Στο πειραµατικό µέρος της ιατριβής, περιγράφονται τα πειραµατικά στάδια των αυτοµατοποιηµένων µεθόδων προκατεργασίας δείγµατος και ανάλυσης. Επίσης γίνεται µελέτη και µαθηµατική επεξεργασία των αποτελεσµάτων. Η διεξαγωγή του πειραµατικού µέρους της ιατριβής πραγµατοποιήθηκε κατά το µεγαλύτερο µέρος (κεφ. 7 ο, 8 ο και 10 ο ) στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας, της Σχολής Θετικών Επιστηµών, του Α.Π.Θ., ενώ ένα πειραµατικό κοµµάτι (κεφ. 9 ο ) στο Εργαστήριο Βιοϊατρικής Ανάλυσης του Πανεπιστηµίου της Ουτρέχτης στα πλαίσια του προγράµµατος κίνησης µεταπτυχιακών φοιτητών Socrates- Erasmus. Από τη θέση αυτή ευχαριστώ θερµά τον Καθηγητή κ. Αναστάσιο Ν. Βουλγαρόπουλο, ο οποίος είχε την επίβλεψη της ιδακτορικής ιατριβής, αλλά και για τη συνεχή επιστηµονική καθοδήγηση και το ενδιαφέρον του σε όλη τη διάρκεια της ιατριβής. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τον Καθηγητή κ. Παναγιώτη Νικήτα, µέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, για την ευγενική προσφορά του λογισµικού

Πρόλογος 2 καταγραφής των σηµάτων από ανιχνευτή, την βοήθειά του στις µαθηµατικές εξισώσεις στο κεφάλαιο 10, αλλά και για τις εύστοχες παρατηρήσεις και υποδείξεις του στο κείµενο της ιατριβής. Επίσης, αισθάνοµαι την ανάγκη να ευχαριστήσω θερµά τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Γεώργιο Θεοδωρίδη, µέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, για την άριστη συνεργασία που είχα µαζί του, την επιστηµονική του καθοδήγησή του, την στήριξή του σε όλη τη διάρκεια της ιατριβής και ιδιαίτερα κατά το διάστηµα της εργασίας µου στην Ουτρέχτη. Τέλος, για τις εύστοχες παρατηρήσεις και υποδείξεις του στο κείµενο της ιατριβής. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τον Καθηγητή κ. Gerhardus J. de Jong, τους Αναπληρωτές Καθηγητές κ. Willy J. M. Underberg και κ. Govert W. Somsen του Εργαστηρίου της Βιοϊατρικής Ανάλυσης του Πανεπιστηµίου της Ουτρέχτης, την επίβλεψή τους και για την άριστη συνεργασία τους κατά τη διάρκεια παραµονής µου εκεί. Τους Καθηγητές κκ. Μιχαήλ. Κουππάρη και Νικόλαο Χανιωτάκη και τους Αναπληρωτές Καθηγητές κκ. ηµήτριο Θεµελή και Ελένη Τσούκαλη ευχαριστώ θερµά, για τις καθοριστικές υποδείξεις τους που συντέλεσαν στη διαµόρφωση της τελικής µορφής της ιατριβής. Η εκπόνηση της παρούσας ιδακτορικής ιατριβής χρηµατοδοτήθηκε από το Υπουργείο Παιδείας στα πλαίσια των υποτροφιών βασικής έρευνας «Ηράκλειτος» µε επιστηµονικό υπεύθυνο τον Καθηγητή κ. Αναστάσιο Ν. Βουλγαρόπουλο. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω της κ. Ελένη Τσούκαλη (Εργαστήριο Τοξικολογίας Α.Π.Θ.) για το δανεισµό πειραµατικής διάταξης συστήµατος HPLC καθώς και τον κ. Θεµιστοκλή αµπάλη (Κτηνιατρικό Εργαστήριο Σερρών) για το δανεισµό φθορισµοµετρικού ανιχνευτή. Ευχαριστώ τους διδάκτορες Χηµείας, κ. Αναστάσιο Οικονόµου για τη βοήθειά του σε θέµατα οργανολογίας και τον κ. Παρασκευά Τζαναβάρα για τις εποικοδοµητικές συζητήσεις που είχα µαζί του. Κλείνοντας, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τους γονείς µου Κλέαρχο και Βασιλική Ζαχαρή αλλά και την αδερφή µου Βαΐα Ζαχαρή για την αµέριστη ηθική και υλική συµπαράστασή τους στην όλη µου προσπάθεια. Επίσης, ευχαριστώ βαθύτατα την υποψήφια ιδάκτορα κ. Φωτεινή Κίκα για την συµπαράστασή της σε όλη την πορεία της ιατριβής. Κωνσταντίνος Κ. Ζαχαρής Θεσσαλονίκη, Ιανουάριος 2006

Θεωρητικό µέρος

2 Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές τεχνικές 1.1. Εισαγωγή Οι διαχωριστικές τεχνικές συνιστούν από τα πιο σηµαντικά εργαλεία στη χηµική ανάλυση. Χρησιµοποιούνται σε ευρεία κλίµακα στον τοµέα της εφαρµοσµένης χηµείας, της βιοχηµείας, της αναλυτικής χηµείας, της βιοϊατρικής καθώς επίσης και της βιοτεχνολογίας. Επίσης, σηµαντική είναι η συνεισφορά τους και κεντρικός ο ρόλος τους στον τοµέα της βιοανάλυσης [1]. Ο όρος «βιοανάλυση» σχετίζεται µε την ανάλυση µιας ή και περισσοτέρων ενώσεων (βιοδείκτες, biomarkers) σε βιολογικά δείγµατα, για την πρόληψη ή καταπολέµηση διαφόρων ασθενειών. Ως προσδιοριζόµενες ενώσεις µπορεί να είναι ενδογενή (αµινοξέα, πεπτίδια, πρωτεΐνες) ή εξωγενή (φάρµακα) συστατικά του δείγµατος. Τα κυριότερα από τα βιολογικά δείγµατα που αναλύονται είναι το αίµα (πλάσµα ή ορός), τα ούρα, η σίελος, οι τρίχες, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ο ιδρώτας και διάφοροι ιστοί. Από τη φύση τους τα δείγµατα αυτά έχουν πολύπλοκο υπόστρωµα ακόµα και στην περίπτωση των ούρων ή του εγκεφαλονωτιαίου υγρού που θεωρούνται από τα λιγότερο περίπλοκα δείγµατα. Είναι εύκολο να αντιληφθεί κανείς ότι οι διαχωριστικές τεχνικές συµβάλλουν καθοριστικά στον προσδιορισµό των ενώσεων που ενδιαφέρουν [2]. Από το σύνολο των διαχωριστικών τεχνικών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη βιοανάλυση παρουσιάζει η χρήση των τεχνικών της υγρής χρωµατογραφίας και της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. 1.2. Υγρή χρωµατογραφία 1.2.1. Γενικά Από ιστορική άποψη, η χρωµατογραφία αποτελεί ίσως τη µοναδική αναλυτική τεχνική, η οποία αναπτύχθηκε στις αρχές του προηγούµενου αιώνα (από το Ρώσο βοτανολόγο Μ. Tswett το 1903) και η οποία χρησιµοποιείται έως και σήµερα σ ένα τόσο ευρύ πεδίο εφαρµογών. Βασίζεται στη διαδικασία διαχωρισµού που επιτυγχάνεται, λόγω της

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 3 διαφορετικής αλληλεπίδρασης των ενώσεων ενός µίγµατος, µε δυο µη αναµειγνυόµενες φάσεις (µια στατική και µια κινητή φάση). Στο σχήµα 1.1 εικονίζεται ο διαχωρισµός µίγµατος δυο ενώσεων Α και Β. Οι καµπύλες δηλώνουν την κατανοµή τύπου Gauss των µορίων της ένωσης Α και Β ανάµεσα στη στατική και στην κινητή φάση (θεωρία πλακών). Οι ελκτικές δυνάµεις αλληλεπίδρασης των µορίων της ένωσης Β και της στατικής φάσης είναι µεγαλύτερες από εκείνες της Β µε την κινητή φάση. Εποµένως, η ένωση Β συγκρατείται πιο ισχυρά στη στατική φάση και εκλούεται από τη στήλη σε µεγαλύτερο χρόνο. Το αντίθετο συµβαίνει µε τα µόρια της ένωσης Α τα οποία αλληλεπιδρούν ελκτικά σε µικρότερο βαθµό µε τη στατική φάση και εξέρχονται από τη χρωµατογραφική στήλη σε µικρότερο χρόνο. Σχήµα 1.1. ιαχωρισµός µίγµατος των ενώσεων Α και Β. Η τεχνική της χρωµατογραφίας ταξινοµείται στην αέρια, υγρή και χρωµατογραφία υπερκρίσιµων ρευστών, ανάλογα µε τη φυσική κατάσταση της κινητής φάσης (αέριο, υγρό ή υπερκρίσιµο ρευστό). Η πιο ευρέως διαδεδοµένη τεχνική είναι της υγρής χρωµατογραφίας (liquid chromatography, LC). Μια δεύτερη ταξινόµηση της υγρής χρωµατογραφίας γίνεται ανάλογα µε το µηχανισµό διαχωρισµού [1]. Έτσι ταξινοµείται στη: I. Χρωµατογραφία κατανοµής (partition chromatography) II. Χρωµατογραφία συγγένειας (affinity chromatography) III. Χρωµατογραφία αποκλεισµού µεγέθους (size exclusion chromatography, SEC) IV. Χρωµατογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography)

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 4 V. Χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (ion-exchange chromatography, IEC) VI. Χρωµατογραφία ζεύγους ιόντων (ion-pair chromatography) Στο πειραµατικό µέρος της παρούσας διατριβής έγινε χρήση της υγρής χρωµατογραφίας αντίστροφης φάσης (reversed phase liquid chromatography, RPLC), η οποία κατατάσσεται στη χρωµατογραφία κατανοµής και η χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής. Για τα δυο αυτά είδη χρωµατογραφίας θα δοθεί ιδιαίτερη έµφαση στην επόµενη ενότητα. 1.2.2. ιαχωρισµός στην υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης (RPLC) και στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (IEC) 1.2.2.1. ιαχωρισµός στην υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης Όπως προαναφέρθηκε, η υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης ανήκει στην κατηγορία της χρωµατογραφίας κατανοµής. Ο µηχανισµός διαχωρισµού βασίζεται σε µια σειρά συνεχόµενων σταδίων προσρόφησης-εκρόφησης των µορίων των ενώσεων του µίγµατος, σε ακινητοποιηµένες υδρόφοβες (µη πολικές) οµάδες της στατικής φάσης. Αν για παράδειγµα, οι έλξεις µεταξύ των µορίων της ένωσης και της κινητής φάσης είναι µεγαλύτερες από εκείνες µε τη στατική φάση, τότε τα µόρια της ένωσης κινούνται πιο γρήγορα και εκλούονται από τη στήλη σε µικρότερο χρόνο. Ο ρυθµός των σταδίων της αντιστρεπτής διαδικασίας προσρόφησης και εκρόφησης και συνεπώς η κατανοµή των µορίων ανάµεσα στις δυο φάσεις εξαρτάται από το βαθµό του υδρόφοβου χαρακτήρα της ένωσης και από τη σύσταση της κινητής φάσης [1]. Στη χρωµατογραφία RPLC οι στατικές φάσεις έχουν ως βάση τροποποιηµένο SiO 2 ή συµπολυµερή του στυρενίου-διβινυλοβελζολίου, ενώ οι ενεργές οµάδες µπορεί να είναι ανθρακικές αλυσίδες (C 2, C 4, C 8, C 18 ), φαινύλιο, νιτριλο-οµάδες, κ.ά. Οι κινητές φάσεις είναι συνήθως µίγµατα νερού ή υδατικών ρυθµιστικών διαλυµάτων µε οργανικούς διαλύτες, όπως µεθανόλη, ακετονιτρίλιο, ισοπροπανόλη, τετραϋδροφουράνιο, αιθανόλη, κ.ά. Η RPLC µπορεί να εφαρµοστεί για το διαχωρισµό και τον προσδιορισµό ενώσεων µε πολικό αλλά και µη πολικό χαρακτήρα. Λαµβάνοντας υπόψη, ότι η µεγάλη πλειονότητα των χηµικών ενώσεων που έχουν βιολογική δράση εµπίπτουν σ αυτή την ευρεία κατηγορία, γίνονται κατανοητοί οι λόγοι που έχουν οδηγήσει την RPLC στο κέντρο του

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 5 ενδιαφέροντος και την έχουν καταστήσει το κύριο αναλυτικό-διαχωριστικό εργαλείο στη σύγχρονη βιο-φαρµακευτική ανάλυση. 1.2.2.2. ιαχωρισµός στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής Ο διαχωρισµός στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής (IEC) στηρίζεται στην αλληλεπίδραση των ιονικών οµάδων των ενώσεων του µίγµατος µε τις δυο φάσεις (στατική και κινητή), µέσω δυνάµεων ηλεκτροστατικής φύσεως. Η στατική φάση αποτελείται από φορτισµένες οµάδες οι οποίες είναι δεσµευµένες µε οµοιοπολικούς δεσµούς πάνω σε κατάλληλο υπόστρωµα (υλικό βάσης, SiO 2, sapharose ή άλλο) [3]. Κύριος παράγοντας που επηρεάζει τον διαχωρισµό είναι η τιµή του ph της κινητής φάσης, διότι από την τιµή του εξαρτάται ο ιονισµός των οµάδων της ένωσης και το φορτίο των ενεργών οµάδων του υποστρώµατος. Επίσης, η ιονική ισχύς της κινητής φάσης επιδρά στο διαχωρισµό µε το φαινόµενο της ιοντοανταλλαγής, όπου ένα ιόν µε το ίδιο φορτίο µε την προσδιοριζόµενη ένωση ανταγωνίζεται στις θέσεις δέσµευσης στη στατική φάση [7]. Στη IEC οι στατικές φάσεις ανάλογα µε το είδος της ιοντοανταλλαγής που λαµβάνει χώρα κατά το διαχωρισµό, διακρίνονται σε κατιονανταλλακτικές και σε ανιονανταλλακτικές στατικές φάσεις. Tα υλικά πλήρωσης των στηλών αυτών έχουν ως βάση τo διοξείδιο του πυριτίου, τη δεξτράνη (dextran), σεφαρόζη (sapharoze) ή την κυτταρίνη (cellulose). Οι ενεργές οµάδες των κατιονανταλλακτικών στατικών φάσεων είναι συνήθως καρβοξυµεθυλόµαδες (-Ο-CH 2 -COO - ) ή σουλφονυλοµάδες (-SO - 3 ), ενώ των ανιονανταλλακτικών, διαιθυλαµινοαιθυλοµάδες (DEAE) (-Ο-CH 2 -CH 2 -N + H (CH 2 CH 3 ) 2 ), τεταρτοταγείς αµινοαιθυλοµάδες (QAE) ή τριµεθυλ-αµµώνιο (QA) (-Ν + (CH 3 ) 3 ). Οι κινητές φάσεις είναι κυρίως µίγµατα υδατικών ρυθµιστικών διαλυµάτων µε οργανικούς διαλύτες ή τασενεργές ουσίες (surfactants). Στους µηχανισµούς διαχωρισµού της χρωµατογραφίας αντίστροφης φάσης και της ιοντοανταλλαγής υπεισέρχονται διάφορα φαινόµενα και δράσεις. Αποτέλεσµα αυτού είναι ότι, για τη συστηµατική µελέτη και κατανόηση των µηχανισµών απαιτούνται πολυδύναµα και πολυπαραγοντικά συστήµατα και προφανώς εκτενέστερη περιγραφή από εκείνη που δίνεται παραπάνω. Στο σχήµα 1.2 εικονίζεται η αλληλεπίδραση µιας µη πολικής ένωσης µε ιονίζουσα οµάδα µε τη στατική φάση στη RPLC και IEC χρωµατογραφία. Σηµειώνεται ότι η κινητή φάση έχει διαφορετική σύσταση για τις δυο περιπτώσεις του σχήµατος.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 6 Σχήµα 1.2. Αλληλεπίδραση ιονίζουσας ένωσης µε τη στατική φάση (Α) στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης και (Β) στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής. 1.2.3. Οργανολογία συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας Η απλούστερη διάταξη ενός συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας εικονίζεται στο σχήµα 1.3. Η κινητή φάση προωθείται µε τη βοήθεια µιας αντλίας υψηλής πίεσης στη αναλυτική στήλη του χρωµατογραφικού συστήµατος µέσω της βαλβίδας εισαγωγής δείγµατος. Στη συνέχεια διέρχεται µέσα από την κυψελίδα του ανιχνευτή και καταλήγει στα απόβλητα. Το δείγµα εισάγεται αρχικά µε µια µικροσύριγγα ή µε αυτόµατο δειγµατολήπτη στο βρόχο της βαλβίδας εισαγωγής δείγµατος και στη συνέχεια στο ρεύµα της κινητής φάσης µε αλλαγή της θέσης της βαλβίδας. Η αντλία παρέχει συνεχή και επαναλήψιµη ροή της κινητής φάσης σε συνθήκες υψηλής πίεσης. Επίσης, έχει τη δυνατότητα να διατηρεί σταθερή τη σύσταση και την περιεκτικότητα των συστατικών της κινητής φάσης κατά τη διάρκεια ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού (ισοκρατική έκλουση) ή να µεταβάλλεται τόσο η σύσταση όσο και η περιεκτικότητα (βαθµιδωτή έκλουση). Τέλος, υπάρχει η δυνατότητα µεταβολής της ταχύτητας ροής όγκου κατά την διάρκεια ενός διαχωρισµού. Η βαλβίδα εισαγωγής δείγµατος είναι το τµήµα µέσω του οποίου εισάγεται το δείγµα στο χρωµατογραφικό σύστηµα. Ο όγκος του δείγµατος που εγχύεται στην αναλυτική στήλη εξαρτάται από τον όγκο του βρόχου ο οποίος είναι προσαρµοσµένος στη

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 7 βαλβίδα. Ο απλούστερος και πιο ευρέως διαδεδοµένος τύπος βαλβίδας είναι εκείνος των έξι εισόδων και δυο διαδροµών (σχήµα 1.3). Σχήµα 1.3. Σχηµατική διάταξη συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας. Η αναλυτική στήλη είναι το κυριότερο τµήµα ενός χρωµατογραφικού συστήµατος. Το 80 % περίπου των χρωµατογραφικών διαχωρισµών πραγµατοποιούνται σε στήλες αντίστροφης φάσης, 10% σε στήλες αποκλεισµού µοριακού µεγέθους, 8% σε ιοντοανταλλακτικές στήλες, ενώ µόλις 2% σε στήλες κανονικής φάσης (silica gel, αλουµίνα) [5]. Τα υλικά πλήρωσης των στηλών διακρίνονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα µε τη χηµική τους σύσταση και την πυκνότητα δέσµευσης. Χαρακτηρίζονται επίσης από φυσικά µεγέθη όπως, σχήµα, µέγεθος και διάµετρο σωµατιδίων [5]. Τα τελευταία χρόνια η χρήση των µονολιθικών στηλών διαχωρισµού γίνεται όλο και πιο έντονη. Για τα υλικά πλήρωσης, τα τεχνικά χαρακτηριστικά και τη χρησιµότητα των µονολιθικών στηλών θα γίνει λεπτοµερής αναφορά στην επόµενη ενότητα. Το σύστηµα ανίχνευσης διακρίνεται σε δυο κατηγορίες ανάλογα µε το αν η ανίχνευση γίνεται µε βάση µια φυσικοχηµική ιδιότητα των προσδιοριζόµενων ουσιών (solute-property detector) ή µε βάση τη φυσική ιδιότητα της κινητής φάσης (bulk-property detector). Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι κοινοί ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού (UV- Vis), φθορισµοµετρικοί και οι ηλεκτροχηµικοί ανιχνευτές, κ.ά., ενώ στη δεύτερη οι ανιχνευτές δείκτη διάθλασης και διηλεκτρικής σταθεράς.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 8 1.2.4. Μονολιθικές στήλες στην υγρή χρωµατογραφία Από τα πρώτα στάδια ανάπτυξης της υγρής χρωµατογραφίας, το υλικό πλήρωσης των στηλών διαχωρισµού αποτελούσαν κυρίως µεγάλα σωµατίδια ακανόνιστου σχήµατος. Τα συστήµατα αυτά χαρακτηρίζονταν από χαµηλή πίεση επαναφοράς (back pressure), ενώ κύριο µειονέκτηµά τους ήταν η αυξηµένη ακτινική διασπορά (axial dispersion) της ζώνης του δείγµατος, λόγω της ανοµοιογένειας της στήλης. Στις τελευταίες δεκαετίες, τα σωµατίδια ακανόνιστου σχήµατος αντικαταστάθηκαν από σφαιρικά σωµατίδια µικρότερου µεγέθους (πορώδη ή µη-πορώδη σωµατίδια), περιορίζοντας σε σηµαντικό βαθµό την ακτινική διασπορά, ενώ παράλληλα βελτιώθηκε o υδροδυναµικός χαρακτήρας του συστήµατος [11]. Τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί ένας νέος τύπος στατικής φάσης, τα µονολιθικά υλικά, τα οποία παρουσιάζουν ενδιαφέρον λόγω της εύκολης παρασκευής τους, των ιδιοτήτων τους και της απόδοσής τους συγκρινόµενα µε τις συµβατικές στήλες σφαιρικών σωµατιδίων [12]. Στο σχήµα 1.4 εικονίζεται το υλικό πλήρωσης των συµβατικών και των µονολιθικών στηλών. Η µονολιθική στατική φάση παρουσιάζει µια συνεχή πορώδη δοµή (σχήµα 1.4 και Ε), τύπου «σκελετού», η οποία συνήθως παρασκευάζεται µε in situ πολυµερισµό ή σταθεροποίηση µέσα στο σωλήνα της στήλης ή σε τριχοειδή σωλήνα, ενώ η επιφάνεια του υλικού µπορεί να τροποποιηθεί µε κατάλληλες ενεργές οµάδες. Οι µονολιθικές στήλες χαρακτηρίζονται κυρίως από πόρους µεγάλης διαµέτρου. Οι πόροι αυτοί συνδέονται µεταξύ τους δηµιουργώντας ένα «δίκτυο» από κανάλια, που κατανέµεται σε όλη τη µάζα του πολυµερούς υλικού [13]. Η διέλευση της κινητής φάσης γίνεται µε ιδιαίτερη ευκολία χωρίς την εµφάνιση υψηλών πιέσεων επαναφοράς. Έτσι κύριο χαρακτηριστικό των µονολιθικών στηλών είναι ότι υποστηρίζουν µεγάλες ταχύτητες ροής, χωρίς να ελαττώνεται η απόδοση του διαχωρισµού [14]. Κατά καιρούς έχουν κατασκευαστεί µονολιθικές στήλες διαφόρων διαστάσεων και γεωµετρικών µορφών όπως για παράδειγµα, η µορφή ράβδου, δισκίων ή κυλίνδρου [15, 16]. Το υλικό πλήρωσης είναι συνήθως πολυµερές SiO 2, συµπολυµερές στυρενίουδιβινυλοβενζολίου ή γλυκιδυλ-µεθακρυλικού οξέος-αιθυλενοδιµεθυλακρυλικού οξέος ή ακόµη και πολυµερές µοριακής αποτύπωσης (molecularly imprinted polymers, MIPs) [12], ενώ οι ενεργές οµάδες ποικίλουν ανάλογα µε το µηχανισµό διαχωρισµού (αντίστροφης φάσης, ιοντοανταλλαγής, κ.ά).

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 9 Σχήµα 1.4. Υλικό πλήρωσης των συµβατικών (Α, Β, Γ) και µονολιθικών στηλών (, Ε). [11] Οι µονολιθικές στήλες σε συνδυασµό µε την οργανολογία της υγρής χρωµατογραφίας (συµβατική, µικρο-lc ή νανο-lc) είναι οι πλέον κατάλληλες για τον διαχωρισµό µεγαλοµορίων. Μερικές από τις εφαρµογές των µονολιθικών στηλών αναφέρουν τη χρήση τους στο καθαρισµό και διαχωρισµό πεπτιδίων [17], πρωτεϊνών [18], ολιγο- και πολυ-νουκλεοτιδίων [19] κ.ά. Επίσης, χρησιµοποιούνται στη χρωµατογραφία συγγένειας για την ακινητοποίηση διαφόρων αντισωµάτων ή ενζύµων (τρυψίνη) για την πέψη (digestion) πρωτεϊνών. Τέλος, σηµαντική είναι η εφαρµογή των µονολιθικών στηλών στην τριχοειδή ηλεκτροχρωµατογραφία (capillary electrochromatography, CEC) όπου αυξάνει την εκλεκτικότητα του διαχωρισµού, ενώ ταυτόχρονα ξεπερνά τα προβλήµατα ακινητοποίησης και σταθεροποίησης που εµφανίζονται µε τη χρήση των σωµατιδιακών υλικών ως στατική φάση στη CEC.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 10 1.3. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση 1.3.1. Γενικά Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (capillary electrophoresis, CE) είναι σχετικά νέα τεχνική, η οποία επιτρέπει το γρήγορο και αποτελεσµατικό διαχωρισµό φορτισµένων ενώσεων µε εφαρµογή δυναµικού. Η πρώτη εµφάνιση της τεχνικής αυτής, µε τη διάταξη που είναι γνωστή ως σήµερα, έγινε το 1981 από τους ερευνητές Jorgenson και Lukacs [20]. Ωστόσο, ο όρος «ηλεκτροφόρηση» ήταν γνωστός από τον F. Kohlrausch το 1897. Η ηλεκτροφόρηση είναι ουσιαστικά η κίνηση των ηλεκτρικά φορτισµένων σωµατιδίων ή ενώσεων µέσα σε ένα ηλεκτρικά αγώγιµο µέσο, συνήθως υδατικό διάλυµα, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Σωµατίδια ή ενώσεις διαφορετικού µεγέθους ή φορτίου κινούνται µε διαφορετικές ταχύτητες (σχήµα 1.5). Το γεγονός αυτό αποτελεί και τη βάση των ηλεκτροφορητικών µεθόδων διαχωρισµού. Σχήµα 1.5. Σχηµατική απεικόνιση της ηλεκτροφόρησης.. Με το σύµβολο «-», «+» και «Ν» παριστάνονται τα αρνητικά, θετικά και τα ουδέτερα µόρια των ενώσεων. Η τεχνική της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης διακρίνεται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα µε το µηχανισµό ή το µέσο στο οποίο επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός [21]. Έτσι ταξινοµείται στην: I. Τριχοειδή ηλεκτροφόρηση ζωνών (capillary zone electrophoresis, CZE) II. Τριχοειδή ηλεκτροφόρηση πηκτής (capillary gel electrophoresis, CGE) III. Τριχοειδή ηλεκτροκινητική χρωµατογραφία µικυλλίων (micellar electrokinetic capillary chromatography, MEKC ή MECC) IV. Τριχοειδή ηλεκτροχρωµατογραφία (capillary electrochromatography, CEC) V. Τριχοειδή ισοηλεκτρική εστίαση (capillary isoelectric focusing, CIEF) VI. Τριχοειδή ισοταχοφόρηση (capillary isotachophoresis, CITP)

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 11 Η τεχνική της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης ζωνών και της τριχοειδούς ηλεκτροκινητικής χρωµατογραφίας µικυλλίων θα εξεταστούν λεπτοµερώς στην επόµενη ενότητα, διότι αποτέλεσαν αντικείµενο µελέτης της παρούσας διατριβής. 1.3.2. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζωνών (CZE) Η ταχύτητα µετακίνησης v i ενός φορτισµένου σωµατιδίου i µέσα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο έντασης Ε, δίνεται από την σχέση (1.1) [22]. v i = µ E (1.1) µ, eff, i eff i qi = (1.2) 6 π η r i όπου µ eff,i, q i, r i είναι αντίστοιχα η αποτελεσµατική ιονική ευκινησία (ionic mobility), το φορτίο και η ακτίνα του σωµατιδίου i, ενώ η είναι το ιξώδες του ηλεκτροφορητικού διαλύµατος. Έτσι, σε συγκεκριµένες πειραµατικές συνθήκες (Ε, η = σταθερά), ο διαχωρισµός των φορτισµένων ενώσεων εξαρτάται από το λόγο του φορτίου προς την ακτίνα του µορίου τους (εξίσωση 1.2). Όταν εφαρµόζεται διαφορά δυναµικού στα άκρα τριχοειδούς σωλήνα διοξειδίου του πυριτίου, ο οποίος έχει πληρωθεί µε ηλεκτροφορητικό διάλυµα, ο σωλήνας φορτίζεται αρνητικά και δηµιουργείται µια κίνηση (ροή) των ιόντων του ηλεκτρολύτη, από την άνοδο προς την κάθοδο (ηλεκτροόσµωση). Η κίνηση αυτή ονοµάζεται ηλεκτροσµωτική ροή, v eof (electroosmotic flow, EOF) και παίζει ουσιαστικό ρόλο στο διαχωρισµό. Σηµειώνεται ότι, η v eof δίνεται από τη µαθηµατική εξίσωση (1.3) και είναι σταθερή για συγκεκριµένες συνθήκες πειράµατος [22]. v eof ε ζ E = = µ eof E 4 π η (1.3) όπου ε αντιστοιχεί στην διηλεκτρική σταθερά του διαλύµατος ηλεκτρολύτη και ζ είναι το δυναµικό της διεπιφάνειας του τριχοειδούς σωλήνα και του διαλύµατος [22]. Με βάση τα παραπάνω, η φαινόµενη ευκινησία (apparent mobility, µ app ) ενός ιόντος, είναι το άθροισµα της αποτελεσµατικής ευκινησίας του και της ηλεκτροσµωτικής ευκινησίας, µ eof, του διαλύµατος του ηλεκτρολύτη. Εποµένως, η ταχύτητα µετακίνησης v i ενός θετικά ή αρνητικά φορτισµένου σωµατιδίου καθώς επίσης και ενός ουδέτερου µορίου δίνεται αντίστοιχα από τις εξισώσεις (1.4), (1.5) και (1.6), αντίστοιχα.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 12 vi = ( µ eof + µ eff, i) E (1.4) vi = ( µ eof µ eff, i) E (1.5) vi = µ eof E (1.6) Γενικά, η µ eof είναι πολύ µεγαλύτερη από τις αντίστοιχες ευκινησίες των ιόντων, µε αποτέλεσµα όλα τα ιόντα (θετικά και αρνητικά) και τα ουδέτερα µόρια να κινούνται προς την κάθοδο. Ο χρόνος που απαιτείται, για τη µετακίνηση ενός ιόντος i στο τριχοειδή σωλήνα, από το σηµείο εισαγωγής του µέχρι το σηµείο ανίχνευσης, ονοµάζεται χρόνος µετακίνησης, t m (migration time) και δίνεται από τη σχέση (1.7) [22]. t mi, L = µ 2 app, i V (1.7) όπου L είναι το αποτελεσµατικό µήκος του τριχοειδούς (effective length) που αντιστοιχεί στο µήκος από το σηµείο εισόδου του δείγµατος µέχρι το σηµείο ανίχνευσης, µ app,i είναι η πραγµατική ευκινησία του ιόντος i και V η διαφορά δυναµικού ανάµεσα στα δυο άκρα του τριχοειδούς σωλήνα. Στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση ζωνών ο διαχωρισµός των ιονικών ενώσεων γίνεται κατά ζώνες ανάλογα µε την ηλεκτροφορητική ευκινησία των ενώσεων (σχήµα 1.6). Σχήµα 1.6. Σχηµατική απεικόνιση διαχωρισµού στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση ζωνών. Τα γράµµατα Α, Β και Γ αντιπροσωπεύουν ζώνες διαφορετικού λόγου φορτίου προς µέγεθος µορίου. Αρχικά ανιχνεύονται τα πολλαπλώς φορτισµένα κατιόντα µικρού µεγέθους, διότι έχουν τη µεγαλύτερη ταχύτητα µετακίνησης. Στη συνέχεια ακολουθούν τα κατιόντα µεγαλύτερου µεγέθους ή µικρότερου φορτίου, ακολουθούν τα ουδέτερα µόρια τα οποία κινούνται µε την ίδια ταχύτητα µε την EOF και τέλος τα ανιόντα µεγάλης µάζας και τελευταία τα πολλαπλώς φορτισµένα ανιόντα µικρού µεγέθους. Οι παράµετροι που

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 13 επηρεάζουν την EOF και κατά συνέπεια το διαχωρισµό, είναι το εφαρµοζόµενο δυναµικό, η ιονική ισχύς, η τιµή ph και η παρουσία οργανικού διαλύτη στο ηλεκτροφορητικό διάλυµα, η θερµοκρασία και η χηµική τροποποίηση του τριχοειδούς σωλήνα µε άλλες ενεργές οµάδες. Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζωνών είναι η ηλεκτροφορητική τεχνική που χρησιµοποιείται περισσότερο στην ανάλυση. Παρέχει τη δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισµού ανιονικών και κατιονικών ενώσεων, όχι όµως και ουδετέρων µορίων. 1.3.3. Τριχοειδής ηλεκτροκινητική χρωµατογραφία µικυλλίων (MEKC) Όπως προαναφέρθηκε, το βασικό µειονέκτηµα της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης ζωνών είναι ότι δεν µπορεί να διαχωρίσει ουδέτερα µόρια. Το κενό αυτό έρχεται να καλύψει η τριχοειδής ηλεκτροκινητική χρωµατογραφία µικυλλίων. Η MEKC εισήχθηκε για πρώτη φορά από την ερευνητική οµάδα του Terabe [23] και όπως προκύπτει από την ονοµασία της, είναι συνδυασµός της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης µε τη χρωµατογραφία. Ο µηχανισµός διαχωρισµού βασίζεται στη διαφορετική κατανοµή των ιονικών ενώσεων ανάµεσα στα µικύλλια µιας τασενεργού ένωσης και στο ηλεκτροφορητικό διάλυµα. Οι τασενεργές ουσίες (surfactants) είναι ενώσεις οι οποίες έχουν υδρόφοβο και υδρόφιλο χαρακτήρα. Αποτελούνται συνήθως από µια υδρόφοβη οµάδα και από µια ή περισσότερες υδρόφιλες οµάδες δυνάµενες να ιονισθούν. Ανάλογα µε το φορτίο της οµάδας χαρακτηρίζονται ως κατιονικές, ανιονικές, επαµφοτερίζουσες και µη-ιονικές τασενεργές ενώσεις. Παράδειγµα κατιονικών τασενεργών ενώσεων είναι το χλωριούχο δωδεκυλο-τριµεθυλο-αµµώνιο, βρωµιούχο εξαδεκυλο-τριµεθυλο-αµµώνιο, ενώ ανιονικές τασενεργές ενώσεις είναι το δωδεκυλο-σουλφονικό νάτριο (SDS), το χολικό νάτριο, κ.ά. Στις επαµφοτερίζοντες τασενεργές ενώσεις ανήκει το 3-[(3-χολαµιδοπροπυλο)- διµεθυλαµµωνιο]-1-προπανοσουλφονικό νάτριο κ.ά. και στα µη-ιονικά το Triton X-100, Brij-35 κ.ά. Όταν η συγκέντρωση µιας τασενεργού ένωσης σε ένα διάλυµα είναι µεγαλύτερη από την κρίσιµη συγκέντρωση µικυλλίων (critical micelle concentration, CMC), τότε τα µόρια της τασενεργού ένωσης (µονοµερή) συσσωµατώνονται και σχηµατίζουν το µικύλλιο (σχήµα 1.7) λόγω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Ο αριθµός των µονοµερών που απαιτούνται για να σχηµατίσουν ένα µικύλλιο ονοµάζεται αριθµός συσσωµάτωσης (aggregation number). Τα µικύλλια έχουν συνήθως σφαιρικό σχήµα, ενώ το µέγεθός τους καθορίζεται από τον αριθµό συσσωµάτωσης και τον τύπο των µονοµερών.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 14 Σχήµα 1.7. Σχηµατισµός µικυλλίου από τα µονοµερή του ανιονικού τασενεργού δωδεκυλο-σουλφονικού νατρίου (SDS). Για λόγους απλότητας σχεδιάστηκαν µόνο έξι µονοµερή. Όπως στη χρωµατογραφία έτσι και στη MECK σχηµατίζονται δυο φάσεις: η φάση του υδατικού διαλύµατος ηλεκτρολύτη («κινητή» φάση) και η φάση του µικυλλίου («ψευδο-στατική» φάση). Στην περίπτωση της τασενεργού ένωσης SDS, η ταχύτητα µετακίνησης των µικυλλίων προς την κάθοδο, είναι πολύ µικρή, λόγω της ισχυρής έλξης των αρνητικών φορτίων του µικυλλίου από το ηλεκτρόδιο της ανόδου. Οι υδρόφοβες ενώσεις αλληλεπιδρούν ισχυρά µε τα µικύλλια, µε αποτέλεσµα να κινούνται πιο αργά από τις υδρόφιλες ενώσεις (σχήµα 1.8). Σχήµα 1.8. ιαχωρισµός στη MEKC. Τα γράµµατα Α, Β και Γ αντιπροσωπεύουν τρεις ενώσεις διαφορετικού υδρόφοβου χαρακτήρα. Οι δείκτες «m» και «aq» υποδηλώνουν τη φάση του µικυλλίου και του υδατικού διαλύµατος, αντίστοιχα. Στο σχήµα 1.8 η ένωση Α είναι λιγότερη υδρόφιλη από τη Β, ενώ η ένωση Γ είναι περισσότερο υδρόφιλη. Έτσι πρώτη ανιχνεύεται η ένωση Γ η οποία κατανέµεται στον

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 15 ηλεκτρολύτη, έπειτα η Β και τέλος η ένωση Α η οποία κατανέµεται σε µεγάλο ποσοστό στα µικύλλια. Ο παράγοντας χωρητικότητας k' (capacity factor) στη MEKC ορίζεται ως ο λόγος των moles της ένωσης που κατανέµεται στο µικύλλιο, n m, προς τον αριθµό moles της ένωσης στην υδατική φάση, n aq (εξίσωση (1.8)). Επίσης, ο παράγοντας k' σχετίζεται µε τις ηλεκτροφορητικές ευκινησίες σύµφωνα µε τη σχέση (1.9) [22]. k n n m = (1.8) aq µ eof 1 µ eff, i k = µ m 1 µ eff, i (1.9) όπου µ eof, µ eff,i, µ m, είναι η ηλεκτροσµωτική ευκινησία, η αποτελεσµατική ευκινησία της ένωση i και η ευκινησία των µικυλλίων, αντίστοιχα. Οι παράγοντες που επηρεάζουν το διαχωρισµό στη MEKC είναι οι ίδιοι µε αυτούς που αναφέρθηκαν στην προηγούµενη ενότητα και επιπλέον το είδος και η συγκέντρωση των τασενεργών ενώσεων. Αξίζει να σηµειωθεί ότι, η προσθήκη διαφόρων υδατοδιαλυτών ολιγοσακχαριτών (κυκλοδεξτρίνες) δίνουν µια επιπλέον εκλεκτικότητα στο διαχωρισµό των ουδετέρων µορίων. 1.3.4. Οργανολογία συστήµατος τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης Ένα απλό σύστηµα της τεχνικής της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης περιλαµβάνει ένα τριχοειδή σωλήνα, το σύστηµα εισαγωγής του δείγµατος, τροφοδοτικό υψηλής τάσης, δυο ηλεκτρόδια, φιαλίδια και ανιχνευτή (σχήµα 1.9). Ο τριχοειδής σωλήνας αποτελεί το κύριο µέρος ενός συστήµατος τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης και είναι πληρωµένος µε διάλυµα ηλεκτρολύτη. Το υλικό του σωλήνα είναι συνήθως τηγµένο SiO 2, αλλά και Teflon ή Pyrex. Σε πολλές περιπτώσεις, το εσωτερικό των σωλήνων έχει τροποποιηθεί κατάλληλα µε διάφορες ενεργές οµάδες (coating) προσφέροντας επιπλέον εκλεκτικότητα στο διαχωρισµό. Το σύστηµα εισαγωγής του δείγµατος περιλαµβάνει ένα αυτόµατο δειγµατολήπτη ο οποίος εισάγει το δείγµα στον τριχοειδή σωλήνα µε υδροδυναµικό (εφαρµογή πίεσης ή σιφωνισµό) ή ηλεκτροκινητικό τρόπο (εφαρµογή διαφοράς δυναµικού).

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 16 Τα φιαλίδια εισόδου (inlet vial) και εξόδου (outlet vial), είναι δοχεία τα οποία περιέχουν το ηλεκτροφορητικό διάλυµα. Η στάθµη του υγρού στα δυο φιαλίδια είναι η ίδια για να αποφεύγονται φαινόµενα σιφωνισµού. Σχήµα 1.9. Σχηµατική διάταξη ενός συστήµατος τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. Τα ηλεκτρόδια είναι δυο σύρµατα λευκόχρυσου τα οποία είναι βυθισµένα στο διάλυµα του ηλεκτρολύτη. Χρησιµοποιούνται για την εφαρµογή της διαφοράς δυναµικού στα φιαλίδια εισόδου και εξόδου. Το τροφοδοτικό είναι ένα πολύπλοκο κύκλωµα το οποίο παρέχει υψηλή τάση της τάξης των kv. Η ανίχνευση γίνεται στο εσωτερικό του τριχοειδούς σωλήνα (on-capillary) µε τη βοήθεια οπτικών ινών, χωρίς να διαταράσσεται η κίνηση του υγρού µέσα στο σωλήνα. Το «παράθυρο» ανίχνευσης (detection window) δηµιουργείται µε αφαίρεση ενός µικρού τµήµατος του εξωτερικού καλύµµατος (πολυαµίδιο) του τριχοειδούς σωλήνα. Ως τύπος ανίχνευσης µπορεί να είναι φασµατοφωτοµετρική ανίχνευση παράταξης φωτοδιόδων (Photo Diode Array, PDA), φθορισµοµετρική ανίχνευση µε LASER ως ακτινοβολία διέγερσης (Laser Induced Fluorescence, LIF), ηλεκτροχηµική ανίχνευση, ανίχνευση χηµειοφωταύγειας, φασµατογράφος µάζας (mass spectrometry, MS), ή τέλος ανίχνευση δείκτη διάθλασης (refractive index).

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 17 1.4. Εφαρµογές της υγρής χρωµατογραφίας και της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης στη βιοανάλυση Η τεχνική της υγρής χρωµατογραφίας και της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης βρίσκει µεγάλη εφαρµογή στο πεδίο της βιοανάλυσης. Η µεγάλη ποικιλία των υλικών διαχωρισµού σε συνδυασµό µε τους διάφορους εµπορικούς ανιχνευτές καθιστούν τις τεχνικές αυτές ιδιαίτερα ελκυστικές. Μεγάλο και σηµαντικό πλεονέκτηµα των τεχνικών αυτών είναι ακριβώς η φύση τους ως διαχωριστικές τεχνικές και η µεγάλη ικανότητα διαχωρισµού που παρέχουν. Η αµεσότητα στο διαχωρισµό πολικών µορίων (τα οποία αποτελούν τα σπουδαιότερα µόρια στις επιστήµες της ζωής) χωρίς περιορισµούς ως προς το µέγεθός τους, είναι ένα επιπλέον χαρακτηριστικό που επιτρέπει την ανάλυση τόσο µικρών µορίων όσο και µεγαλοµορίων σε διάφορα βιολογικά δείγµατα. Σηµαντική είναι η συµβολή τους στη φαρµακευτική επιστήµη, ειδικότερα στον κλάδο ανάπτυξης και στον έλεγχο ποιότητας νέων φαρµάκων. Η ανάπτυξη ενός νέου φαρµάκου, συνοδεύεται από εντατικές µελέτες για την εύρεση της βιοσυµβατότητάς του, των επιπέδων συγκέντρωσης της τοξικολογικής και θεραπευτικής δράσης του στον οργανισµό, καθώς και για τη µελέτη της φαρµακοδυναµικής και της φαρµακοκινητικής του. Στις µελέτες αυτές η ανάλυση και ο προσδιορισµός του φαρµάκου στα βιολογικά δείγµατα γίνεται κυρίως µε την υγρή χρωµατογραφία. Στον έλεγχο ποιότητας των φαρµακευτικών σκευασµάτων, η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο, αφού η αξιοπιστία, η ακρίβεια και η ταχύτητα στην ανάλυση των δειγµάτων είναι τα κύρια χαρακτηριστικά της. 1.5. Απόδοση συστήµατος διαχωρισµού Κατά την ανάπτυξη µιας µεθόδου µε την τεχνική της υγρής χρωµατογραφίας ή της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης οι παράµετροι διαχωρισµού βελτιστοποιούνται µε στόχο την καλύτερη απόδοση του συστήµατος.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 18 1.5.1. Απόδοση συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας Κύρια παράµετρος που αντιπροσωπεύει την απόδοση ενός χρωµατογραφικού συστήµατος είναι η διακριτική ικανότητα, R S, (resolution). Η διακριτική ικανότητα διαχωρισµού δυο ενώσεων Α και Β ορίζεται ως η απόσταση µεταξύ των µεγίστων των κορυφών των ενώσεων συγκρινόµενη µε το µέσο όρο του εύρους κάθε κορυφής (εξίσωση (1.10)) [6]. R S t = W 2 B A A t + W B (1.10) όπου t A και t Β είναι οι χρόνοι συγκράτησης ή µετακίνησης και W A και W B είναι το εύρος των κορυφών των ενώσεων Α και Β (σχήµα 1.10). Επίσης, η διακριτική ικανότητα διαχωρισµού δυο ενώσεων συνδέεται και µε τους παράγοντες εκλεκτικότητας, αποτελεσµατικότητας και συγκράτησης του συστήµατος σύµφωνα µε τη σχέση (1.11) [6]. R s 1 a 1 k = ( )( N)( ) 4 a 1+ k (1.11) όπου α είναι ο παράγοντας διαχωρισµού (γνωστός παλαιότερα ως εκλεκτικότητα), k ο µέσος όρος των παραγόντων συγκράτησης των ενώσεων Α και Β και Ν είναι ο αριθµός των θεωρητικών πλακών της στήλης για κάθε ένωση. Για τιµές R S µεγαλύτερες του 1,5, θεωρείται ότι επιτυγχάνεται πλήρης διαχωρισµός των ενώσεων. Σχήµα 1.10. ιαχωρισµός δυο ενώσεων Α και Β στην υγρή χρωµατογραφία ή στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 19 O παράγοντας χωρητικότητας ή συγκράτησης, k', (retention factor) αντιπροσωπεύει τη συγκράτηση του συστατικού στη αναλυτική στήλη και ορίζεται από τη σχέση (1.12). k t t t R o = (1.12) o όπου t o είναι ο «νεκρός» όγκος (βλέπε σχήµα 1.10) και t R είναι ο χρόνος συγκράτησης (retention time) της ένωσης. Ο παράγοντας συγκράτησης µιας ένωσης εξαρτάται κυρίως από τη σύσταση της κινητής φάσης και στην περίπτωση ενός ικανοποιητικού διαχωρισµού κυµαίνεται από 1 έως 20. O παράγοντας διαχωρισµού ή εκλεκτικότητα (selectivity) α, του διαχωρισµού δυο ενώσεων Α και Β, ορίζεται ως το πηλίκο των παραγόντων χωρητικότητας των ενώσεων. Με άλλα λόγια η εκλεκτικότητα αντιπροσωπεύει την ικανότητα του συστήµατος να διαχωρίσει δύο ενώσεις Α και Β [6]. a k k B = (1.13) A Η αποτελεσµατικότητα (efficiency) της στήλης εκφράζεται µε τον αριθµό των θεωρητικών πλακών, Ν, ο οποίος µε τη σειρά του δίνεται από τον τύπο της εξίσωσης (1.14) (µέθοδος 4σ) [6]. R N 16 t = W 2 (1.14) όπου W είναι το εύρος της κορυφής σε µονάδες χρόνου. 1.5.2. Απόδοση συστήµατος τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης Οι παράµετροι διαχωρισµού στην τεχνική της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης είναι παραπλήσιοι µε εκείνους της υγρής χρωµατογραφίας. Η διακριτική ικανότητα R S στη CZE δίνεται από τη µαθηµατική σχέση (1.10) της υγρής χρωµατογραφίας. Με αντικατάσταση των µεγεθών του χρόνου και του εύρους κορυφής µε ηλεκτροφορητικά µεγέθη προκύπτει [21]:

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 20 R 1 V s = ( µ app, A µ app, B ) 4 2 D( µ app + µ eof ) (1.15) όπου µ app,a και µ app,b είναι η πραγµατική ευκινησία της ένωσης Α, Β, µ eof είναι η ηλεκτροσµωτική ευκινησία, µ app είναι ο µέσος όρος των µ app,a και µ app,b, V είναι η διαφορά δυναµικού στα άκρα του τριχοειδούς σωλήνα και D είναι ο µέσος όρος των συντελεστών διάχυσης των ενώσεων Α και Β. H εκλεκτικότητα και η αποτελεσµατικότητα του τριχοειδούς σωλήνα δίνεται από τις σχέσεις (1.16) και (1.17), αντίστοιχα [21]. t a = t B A t t o o (1.16) ( µ app + µ eof ) V N = (1.17) 2D όπου t A, t B είναι οι χρόνοι µετακίνησης των ενώσεων Α και Β, t o είναι ο χρόνος µετακίνησης ενός ουδετέρου µορίου δείκτη (EOF marker). Η διακριτική ικανότητα στη τεχνική της MEKC δίνεται από τη σχέση (1.18) και είναι παρόµοια µε τη σχέση (1.10) της υγρής χρωµατογραφίας [21]. R s to 1 1 a 1 k ( ) B t m = N 4 a k t 1+ B o 1 k + A t m (1.18) όπου k' Α και k' B είναι ο παράγοντας χωρητικότητας της ένωσης Α και Β (βλέπε εξίσωση (1.9)) και t m είναι ο χρόνος µετακίνησης των µικυλλίων.

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 21 Βιβλιογραφία [1] Raymond P. W. Scott, Techniques and Practice of Chromatography, Marcel Dekker Inc. New York, 1995. [2] Richard F. Venn, Principles and Practice of Bioanalysis, Taylor & Francis, London, 2000. [3] Pharmacia Biotech, Ion exchange chromatography Principles and Methods, Vastra Aros tryckeri, Sweden. [4] C. Schoneich, S. K. Kwok, G. S. Wilson, S. R. Rabel, J. F. Stobaugh, T. D. Williams, D. G. Vander Velde, Anal. Chem., 65 (1993) 67R. [5] M. C. McMaster, HPLC A practical user s guide, VCH Publishers Inc. USA, 1994 [6] Pharmacia Biotech, Reversed phase chromatography Principles and Methods, Vastra Aros tryckeri, Sweden. [7] Karen M. Gooding, Ion Exchange: mechanism and factors affecting separation, Encyclopedia of Chromatography, Marcel Dekker Inc., New York, 2005 [8] K. Stulik, V. Pacakava, J. Suchankova, H. A. Claessens, Anal. Chim. Acta, (1997) 352 [9] N. Lundell, LC-GC, 8 (1995) 638 [10] D. L. Crimmins, Anal. Chim. Acta, 352 (1997) 21 [11] F. C. Leinweber, U. Tallarek, J. Chromatogr. A, 1006 (2003) 207 [12] H. Zou, X. Huang, M. Ye, Q. Luo, J. Chromatogr. A, 954 (2002) 5 [13] R. Hahn, A. Podgornik, M. Merhar, E. Schallaun, A. Jungbauer, Anal. Chem., 73 (2001) 5126 [14] A. Podgornik, M. Barut, A. Strancar, Monolithic Disk supports for HPLC, Encyclopedia of Chromatography, Marcel Dekker Inc., New York, 2005 [15] Ιστοσελίδα της εταιρίας BIA separations, http://www.biaseparations.com [16] Ιστοσελίδα της εταιρίας Merck, http://www.merck.com [17] S. F. Xie, R. W. Allington, F. Svec, J. M. J. Frechet, J. Chromatogr. A, 865 (1999) 169 [18] C. Viklund, F. Svec, J. M. J. Frechet, Biotech. Prog. 13 (1997) 597 [19] D. Sykora, F. Svec, J. M. J Frechet, J. Chromatogr. A, 852 (1999) 297 [20] J. W. Jorgenson, K. D. Lukacs, Anal. Chem., 53 (1981) 1298

Κεφάλαιο 1 ο. ιαχωριστικές Τεχνικές 22 [21] S. F. Y. Li, Capillary Electrophoresis, Journal of Chromatography Library vol. 52, Elsevier, Amsterdam, 1993 [22] D. R. Baker, Capillary Electrophoresis, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995 [23] S. Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando, Anal. Chem., 56 (1984) 111

23 Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία δείγµατος στη βιοανάλυση 2.1. Γενικά για την προκατεργασία δείγµατος Τα δείγµατα που αναλύονται, σε ένα σύγχρονο αναλυτικό εργαστήριο, ποικίλουν ανάλογα µε τη φυσική τους κατάσταση (στερεά, υγρά ή αέρια) ή την πολυπλοκότητά τους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα δείγµατα που πρόκειται να αναλυθούν, είτε είναι αρκετά πολύπλοκα λόγω της παρουσίας σύνθετου υποστρώµατος είτε δεν βρίσκονται στην απαιτούµενη, για την ανάλυση, φυσική κατάσταση. Έτσι, το στάδιο της προκατεργασίας του δείγµατος κρίνεται απαραίτητο πριν την ανάλυση του δείγµατος [1]. Στο σχήµα 2.1 αναφέρονται µερικές τεχνικές προκατεργασίας ανάλογα µε τη φυσική κατάσταση του δείγµατος. Σχήµα 2.1. Κυριότερες τεχνικές προκατεργασίας για αέρια, υγρά και στερεά δείγµατα [2].

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 24 Βασικός στόχος της προκατεργασίας του δείγµατος είναι η µετατροπή του δείγµατος σε µια µορφή, η οποία είναι κατάλληλη ή «συµβατή» µε τις περισσότερες διαχωριστικές τεχνικές. Έτσι, η προκατεργασία του δείγµατος σκοπεύει: στην αποµάκρυνση των ενώσεων που παρεµποδίζουν είτε στο διαχωρισµό, είτε στην ανίχνευση των ενώσεων που ενδιαφέρουν. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται βελτίωση της εκλεκτικότητας της µεθόδου. στην αύξηση της συγκέντρωσης των προσδιοριζόµενων ενώσεων, µε αποτέλεσµα την αύξηση της ευαισθησίας της µεθόδου. στη µετατροπή των ενώσεων σε κατάλληλη µορφή για ανίχνευση ή διαχωρισµό. στην ανάπτυξη µιας επαναλήψιµης και εύρωστης µεθόδου, ανεξάρτητης από το υπόστρωµα του δείγµατος. Το στάδιο προκατεργασίας του δείγµατος µπορεί να θεωρηθεί ως το πρώτο στάδιο διαχωρισµού πριν τον κυρίως διαχωρισµό. Έρευνα έχει δείξει ότι, το 92% των ερωτηθέντων έκριναν ότι είναι απαραίτητη η προκατεργασία δείγµατος, ενώ το 60% του χρόνου που απαιτείται για την αναλυτική διαδικασία αφιερώνεται στο στάδιο της προκατεργασία του δείγµατος [3]. Στις αρχές του 1960 η προκατεργασία των δειγµάτων, κυρίως ανόργανης φύσης, γίνονταν µε τη χρήση ιοντοανταλλακτικών στηλών, ενώ χρησιµοποιούνταν ευρέως η χρωµατογραφία επί χάρτου. Στα µέσα της δεκαετίας του 80 αναπτύχθηκαν διάφορες τεχνικές προκατεργασίας δειγµάτων, οι οποίες αφορούσαν κυρίως την παραγωγοποίηση ενώσεων πριν την ανάλυσή τους µε αέρια χρωµατογραφία [4]. Στη δεκαετία του 1990 χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά η αυτοµατοποιηµένη διαπίδυση σε ροή (on-line dialysis), σε συνδυασµό µε την υγρή χρωµατογραφία παρέκκλισης της στήλης (column switching), για τον προσδιορισµό ενώσεων σε βιολογικά δείγµατα [5]. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί νέες τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος, οι οποίες προσφέρουν µεγαλύτερη εκλεκτικότητα, αξιοπιστία και απαιτούν λιγότερο χρόνο. Από το σύνολο των τεχνικών προκατεργασίας δείγµατος, ιδιαίτερη έµφαση θα δοθεί στις τεχνικές που χρησιµοποιούνται στη βιοανάλυση.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 25 2.2. Τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος στη βιοανάλυση Η τεχνική της προκατεργασίας του δείγµατος ποικίλει ανάλογα µε τη µέθοδο διαχωρισµού. Τα κριτήρια επιλογής µιας τεχνικής προκατεργασίας αφορούν κυρίως τη φυσική κατάσταση του δείγµατος (στερεή, υγρή ή αέρια), το βαθµό εκλεκτικότητας, απόδοσης και χρόνου του σταδίου προκατεργασίας και τέλος τη διαχωριστική τεχνική που πρόκειται να χρησιµοποιηθεί. Παρακάτω θα γίνει αναφορά εκείνων των τεχνικών προκατεργασίας που χρησιµοποιούνται κυρίως στις αναλυτικές διαχωριστικές τεχνικές. 2.2.1. ιήθηση Η διήθηση αποτελεί σηµαντικό µέρος της προκατεργασίας ενός δείγµατος και στόχος της είναι η αποµάκρυνση των σχετικά µεγάλων σωµατιδίων, µε απώτερο σκοπό την προστασία των αναλυτικών οργάνων. Η εκλεκτικότητα της διήθησης σχετίζεται µε το πορώδες του φίλτρου που χρησιµοποιείται. Υπάρχουν διαφόρων τύπων φίλτρα (χαρτί, ίνες γυαλιού, φίλτρα µεµβράνης, κ.ά.) τα οποία επιλέγονται ανάλογα µε τον τύπο του δείγµατος και το µέγεθος των σωµατιδίων που πρόκειται να κατακρατηθούν. Για παράδειγµα το δείγµα διηθείται πριν την ανάλυσή του µε υγρή χρωµατογραφία. Στην περίπτωση αυτή το δείγµα θα πρέπει να είναι απαλλαγµένο από αδιάλυτες ενώσεις οι οποίες φράσουν τις φρίτες της αναλυτικής στήλης. Ένας τύπος διήθησης που παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, ειδικά στην προκατεργασία βιολογικών δειγµάτων, είναι η υπερδιήθηση (ultrafiltration). Η υπερδιήθηση χρησιµοποιείται για τον καθαρισµό/διαχωρισµό µορίων µε σχετικά µικρές µοριακές µάζες από µεγαλοµόρια. Η λειτουργία της βασίζεται στη χρήση ενός φίλτρου/µεµβράνης συγκεκριµένου πορώδους, στο οποίο εφαρµόζεται θετική εξωτερική πίεση, είτε µε µηχανικό τρόπο, είτε µε τη βοήθεια της υπερφυγοκέντρου. Τα µόρια µικρού µεγέθους διαπερνούν τη µεµβράνη, ενώ τα µεγαλύτερα συγκρατούνται απ αυτή. Σηµειώνεται ότι υπάρχει αντιστοιχία µεταξύ του πορώδους της µεµβράνης και της τιµής της σχετικής µοριακής µάζας των µεγαλοµορίων που συγκρατούνται στο φίλτρο.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 26 2.2.2. Καταβύθιση Η µεγάλη περιεκτικότητα των βιολογικών δειγµάτων (πλάσµα αίµατος) σε πρωτεΐνες (π.χ. αλβουµίνες), αποτελεί ένα σηµαντικό πρόβληµα στην ανάλυση των δειγµάτων αυτών µε τις συµβατικές διαχωριστικές τεχνικές. Στις περιπτώσεις αυτές η καταβύθιση (precipitation) των πρωτεϊνών αποτελεί κύριο στάδιο προκατεργασίας του δείγµατος πριν την ανάλυσή του. Αυτή επιτυγχάνεται µε την προσθήκη ενός οργανικού διαλύτη (µεθανόλη, ακετονιτρίλιο, ακετόνη, αιθανόλη κ.ά) ο οποίος αναµιγνύεται µε το νερό ή µε την προσθήκη ισχυρού οξέος (π.χ. υπερχλωρικό ή τριχλωροξικό οξύ). Σε χαµηλές τιµές ph οι πρωτεΐνες βρίσκονται µε την κατιονική τους µορφή και σχηµατίζουν αδιάλυτα άλατα µε τα ισχυρά οξέα. Γενικά, η προσθήκη ισχυρών οξέων πλεονεκτεί έναντι του οργανικού διαλύτη, διότι επιτυγχάνεται µεγαλύτερη απόδοση καταβύθισης των πρωτεϊνών [6]. 2.2.3. Εκχύλιση Μια από τις πιο βασικές τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος είναι η εκχύλιση (extraction). Στην τεχνική αυτή η ένωση που ενδιαφέρει αποµονώνεται από το υπόστρωµα του δείγµατος µε τη βοήθεια ενός διαλύτη. Ανάλογα µε την φυσική κατάσταση του υποστρώµατος (υγρό ή στερεό), διακρίνεται σε εκχύλιση υγρού-υγρού και σε εκχύλιση στερεάς φάσης (solid phase extraction, SPE), ενώ ο διαλύτης εκχύλισης µπορεί να είναι ένας οργανικός διαλύτης, υπερκρίσιµο ρευστό (supercritical fluid) ή υπέρθερµο υγρό (superheated liquid). 2.2.3.1. Εκχύλιση υγρού-υγρού Η εκχύλιση υγρού-υγρού (liquid-liquid extraction, LLE) αποτελεί µια από τις πρώτες τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος. Ο διαλύτης εκχύλισης αλλά και το δείγµα βρίσκονται στην υγρή φάση. Η εκχύλιση υγρού-υγρού βασίζεται στη διαφορετική σχετική διαλυτότητα της προσδιοριζόµενης ένωσης ανάµεσα σε δυο µη αναµειγνυόµενες φάσεις/διαλύτες. Στη σύγχρονη βιοανάλυση, υπάρχει η γενική τάση αντικατάστασης της κλασσικής εκχύλισης υγρού-υγρού, διότι η τεχνική παρουσιάζει σηµαντικά µειονεκτήµατα, όπως: δεν προσφέρεται για όλες τις οµάδες ενώσεων οι διαλύτες εκχύλισης που χρησιµοποιούνται έχουν µικρή εκλεκτικότητα

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 27 µικρή απόδοση της εκχύλισης πιθανός σχηµατισµός γαλακτωµάτων απαιτεί µεγάλους όγκους δείγµατος και διαλύτη εκχύλισης (γεγονός που ανεβάζει το οικονοµικό και περιβαλλοντικό κόστος της µεθόδου είναι αρκετά χρονοβόρα και δεν µπορεί να αυτοµατοποιηθεί Τελευταία έχει αναπτυχθεί µια νέα «µικρο»-τεχνική προκατεργασίας, η µικροεκχύλιση υγρής φάσης (liquid phase microextraction, LPME) η οποία βασίζεται στην ίδια αρχή µε την εκχύλιση υγρού-υγρού [7] και χρησιµοποιεί µικρότερο όγκο δείγµατος. Επιτυγχάνεται µε τη χρήση µιας πορώδους κοίλης ίνας (hollow fiber) από πολυπροπυλένιο, στην οποία έχει ακινητοποιηθεί ένα λεπτό στρώµα µη πτητικού οργανικού διαλύτη, ο οποίος δεν αναµιγνύεται µε το νερό. Όπως φαίνεται από το σχήµα 2.2 το υδατικό διάλυµα του δείγµατος τοποθετείται στο φιαλίδιο, όπου βρίσκεται εµβαπτισµένη η πορώδης ίνα. Οι ενώσεις του δείγµατος κατανέµονται στην υδατική και στην οργανική φάση λόγω διάχυσης και στη συνέχεια στη φάση του δέκτη. Ορισµένος όγκος του δέκτη αφαιρείται από το υπόλοιπο σύστηµα και αναλύεται. Όταν ο δέκτης είναι ο ίδιος οργανικός διαλύτης που χρησιµοποιείται στην ίνα, τότε το σύστηµα χαρακτηρίζεται ως διφασικό. Αυτός ο τύπος εκχύλισης βρίσκει εφαρµογή σε ενώσεις, οι οποίες έχουν µεγάλη διαλυτότητα σε µη-πολικούς οργανικούς διαλύτες. Στην περίπτωση που ο δέκτης είναι διαφορετικός του διαλύτη της ίνας, τότε το σύστηµα ονοµάζεται τριφασικό. Η εκλεκτικότητα, η απόδοση και η ταχύτητα της εκχύλισης εξαρτώνται κυρίως από τη φύση του οργανικού διαλύτη, την τιµή ph του δείγµατος αλλά και του δέκτη, τη θερµοκρασία και την ανάδευση του δείγµατος. Μερικά από τα πλεονεκτήµατα της τεχνικής αυτής είναι: η υψηλή απόδοση µικρός όγκος δείγµατος (~100 µl) ελάχιστη κατανάλωση οργανικών διαλυτών δυνατότητα προσυγκέντρωσης χαµηλό κόστος και ευκολία στην κατασκευή του συστήµατος Σηµαντικό µειονέκτηµα της µικροεκχύλισης υγρού-υγρού είναι το µεγάλο χρονικό διάστηµα που απαιτείται για την εκχύλιση (~ 45 λεπτά), µε αποτέλεσµα να µειώνεται κατά πολύ ο αριθµός των αναλύσεων ανά ώρα. Βέβαια το µειονέκτηµα αυτό µπορεί να εξαλειφθεί κάνοντας χρήση παράλληλων συστηµάτων εκχύλισης. Τέλος, η τεχνική αυτή

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 28 µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την αποµόνωση ενώσεων σε δείγµατα ολικού αίµατος, πλάσµατος, ούρων κ.ά. Α Β Σχήµα 2.2. Αρχή λειτουργίας της Α) µικροεκχύλισης υγρής φάσης [7], Β) µικροεκχύλισης σταγόνας [9]. Παρόµοια τεχνική µε τη µικροεκχύλισης υγρής φάσης είναι η µικροεκχύλιση µε σταγόνας (single drop microextraction, SDME). Η αρχή λειτουργίας της, είναι η ίδια µε αυτή περιγράφτηκε παραπάνω, µε τη διαφορά ότι αντί της πορώδους ίνας χρησιµοποιείται στιβάδα οργανικού διαλύτη και ως φάση του δέκτη, σταγόνα [8] (σχήµα 2.2 B). 2.2.3.2. Εκχύλιση στερεάς φάσης Η εκχύλιση στερεάς φάσης (solid-phase extraction, SPE) χρησιµοποιείται ευρέως στη βιοανάλυση τόσο σε αναλύσεις ρουτίνας, όσο και στην έρευνα. Βασίζεται στην προσρόφηση των προσδιοριζόµενων ενώσεων του δείγµατος, σε ένα στερεό

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 29 υπόστρωµα/προσροφητικό (sorbent). Στο σχήµα 2.3 εικονίζονται τα πιο βασικά στάδια της τεχνικής, τα οποία είναι: Ενεργοποίηση του προσροφητικού µε τη βοήθεια ενός διαλύτη (CH 3 OH, CH 3 CN, H 2 O, κ.ά.) (στάδιο Α) Εισαγωγή του δείγµατος (στάδιο Β) Πλύση του προσροφητικού υλικού µε µια σειρά διαφορετικών διαλυτών για την αποµάκρυνση των ενώσεων που παρεµποδίζουν (στάδιο Γ) Παραλαβή των ενώσεων που ενδιαφέρουν µε κατάλληλο διαλύτη έκλουσης (στάδιο ) Σχήµα 2.3. Αρχή λειτουργίας της εκχύλισης στερεάς φάσης µε µικροστήλες. Ο µηχανισµός συγκράτησης των ενώσεων στο προσροφητικό υλικό, είναι ο ίδιος µε εκείνο της υγρής χρωµατογραφίας. Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ ενώσεων, στατικής φάσης και διαλυτών βασίζονται σε δυνάµεις van der Waals (διπόλου-διπόλου, δεσµών υδρογόνου), ηλεκτροστατικής φύσεως αλλά και συνδυασµών µεταξύ τους [10]. Τα προσροφητικά υλικά αποτελούνται κυρίως από σφαιρικά σωµατίδια SiO 2, Al 2 O 3 ή συµπολυµερή στυρενίου-διβινυλοβενζολίου και έχουν µέγεθος από 30 έως 100 µm. Η επιφάνεια των σωµατιδίων αυτών έχει τροποποιηθεί κατάλληλα µε διάφορες οµάδες πολικού (νιτριλο-οµάδα, διόλη, κ.ά.), µη-πολικού (C 8, C 18, φαινυλο-οµάδα, κ.ά.) ή ηλεκτροστατικού χαρακτήρα (τεταρτοταγής αµίνη, σουλφονυλο-οµάδα, κ.ά.). Τα τελευταία χρόνια, έχουν αναπτυχθεί νέα υλικά πλήρωσης των µικροστηλών SPE, τα οποία επιτρέπουν την απευθείας εισαγωγή βιολογικού δείγµατος. Αυτά ονοµάζονται υλικά περιορισµένης πρόσβασης (restricted access material, RAM) και συγκρατούν τα υδρόφοβα και σχετικά µικρού µεγέθους µόρια [11]. Μεγαλύτερη ακόµη

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 30 εκλεκτικότητα παρουσιάζουν τα πολυµερή µοριακής αποτύπωσης (molecular imprinted polymers, MIPs) τα οποία «µιµούνται» τη δοµή της προσδιοριζόµενης ένωσης και συγκρατούν εκλεκτικά µόνον αυτή [12]. Τέλος, η δέσµευση διαφόρων αντισωµάτων στο προσροφητικό υλικό των µικροστηλών SPE παρέχει στο σύστηµα µια ιδιαίτερη εκλεκτικότητα λόγω αλληλεπιδράσεων αντιγόνου-αντισώµατος [13]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η µικροεκχύλιση στερεάς φάσης (solid phase microextraction, SPME). Η τεχνική αυτή βασίζεται σε διαδικασία δυο σταδίων: α) οι προσδιοριζόµενες ενώσεις προσροφώνται σε µια λεπτή ίνα από τηγµένο SiO 2 η οποία είναι εµβαπτισµένη στο διάλυµα του δείγµατος (σχήµα 2.4) και β) οι ενώσεις εκροφώνται είτε µε την τοποθέτηση της ίνας σε οργανικό διαλύτη, είτε µε θέρµανση [14, 15]. Επίσης, η προσρόφηση µπορεί να γίνει και από τον αέριο υπερκείµενο χώρο (headspace) όταν πρόκειται για πτητικές ή αέριες ενώσεις. Η απλότητα, η ευκολία, η µικρή κατανάλωση οργανικών διαλυτών, ο µικρός όγκος δείγµατος και το χαµηλό κόστος είναι τα κύρια χαρακτηριστικά της τεχνικής αυτής. Ως υλικά επικάλυψης της ίνας χρησιµοποιούνται κυρίως µη-πολικά πολυµερή (πολυ-διµεθυλοσιλοξάνιο, PDMS), ηµι-πολικό συµπολυµερές (πολυ-διµεθυλοσιλοξάνιο-διβινυλοβενζόλιο, PDMS-DVB) ή πολικό πολυµερές (πολυακρυλαµίδιο, PA). Σχήµα 2.4. Αρχή λειτουργίας της µικροεκχύλισης εκχύλισης στερεάς φάσης. ειγµατοληψία από Α) υγρή φάση και Β) αέριο υπερκείµενο χώρο [16].

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 31 Μια παραλλαγή της SPME µε τη χρήση ίνας, αποτελεί η µικροεκχύλιση µε µαγνητικό αναδευτήρα (stir-bar sorptive extraction, SBSE). Η αρχή λειτουργίας της είναι παρόµοια µε αυτή που περιγράφτηκε παραπάνω ενώ χρησιµοποιείται µαγνητικός αναδευτήρας αντί της ίνας [17]. 2.2.3.3. Εκχύλιση και τεχνολογίες µεµβράνης Στη τεχνική της εκχύλισης µεµβράνης (membrane extraction), η µεµβράνη δρα ως φίλτρο στο οποίο δεσµεύονται εκλεκτικά τα µόρια της ένωσης ή γίνεται µεταφορά της ένωσης από το δείγµα (δότης) σε ένα διάλυµα (δέκτης) λόγω του φαινοµένου της διάχυσης [18]. Μερικά παραδείγµατα κατασκευών που χρησιµοποιούνται στην εκχύλιση µεµβράνης φαίνονται στο σχήµα 2.5. Σχήµα 2.5. Αρχή λειτουργίας της εκχύλισης µεµβράνης [1]. Α) επίπεδη διάταξη µε σπειροειδή κανάλια, Β) επίπεδη επιφάνεια µε ευθύγραµµο κανάλι όγκου 10 µl, Γ) ιάταξη µε κοίλη ίνα όγκου 1,3 µl. Η εκχύλιση µεµβράνης µπορεί να χρησιµοποιηθεί και για την προκατεργασία δειγµάτων για ανάλυση πτητικών ενώσεων (π.χ. αιθανόλη). Στην περίπτωση αυτή, το δείγµα ακινητοποιείται µε τη βοήθεια µιας αντλίας στην περιοχή της µεµβράνης, όπου στη συνέχεια τα πτητικά συστατικά τη διαπερνούν και εισέρχονται στο διάλυµα του δέκτη. Στο πεδίο της βιοανάλυσης χρησιµοποιείται κυρίως η µικροδιαπίδυση (microdialysis). Στην περίπτωση αυτή, ο διαχωρισµός της ένωσης από το υπόστρωµα του δείγµατος γίνεται µε βάση το µέγεθος των µορίων. Τα µικρού µεγέθους µόρια διαπερνούν την ηµιπερατή µεµβράνη και εισέρχονται στο διάλυµα του δέκτη, ενώ τα µεγαλύτερα παραµένουν στο δείγµα. Η τεχνική της µικροδιαπίδυσης βρίσκει µεγάλη εφαρµογή σε in

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 32 vivo αναλύσεις, όπου η προσδιοριζόµενη ένωση µετράται µε συνεχή ρυθµό στον οργανισµό [19]. Επίσης, χρησιµοποιείται για την αποµόνωση φαρµάκων από υπόστρωµα µεγαλοµορίων και στην αποµάκρυνση DNA, ολιγονουκλεοτιδίων και πρωτεϊνών από βιοπολυµερή. Ένα άλλο είδος τεχνικής προκατεργασίας δείγµατος είναι η ηλεκτροδιαπίδυση (electrodialysis). Η αρχή λειτουργίας της είναι η ίδια µε εκείνη της εκχύλισης µεµβράνης, µε τη διαφορά ότι εφαρµόζεται διαφορά δυναµικού στο ρεύµα του δέκτη. Έτσι, οι φορτισµένες ενώσεις διαπερνούν τη µεµβράνη και οδεύουν προς το αντίθετα φορτισµένο ηλεκτρόδιο. Βασικό πλεονέκτηµα αυτής της τεχνικής είναι ότι, περιορίζει στο ελάχιστο τη διαδικασία επαναδιάχυσης της ένωσης προς το δείγµα. Τέλος, βρίσκει ευρεία εφαρµογή στην αποµόνωση βιοµορίων από αγαρόζη ή πηκτή πολυακριλαµιδίου [20]. 2.2.4. Παραγωγοποίηση Οι παραπάνω τεχνικές προκατεργασίας στοχεύουν στη «µετατροπή» του δείγµατος σε µια µορφή, όπου επιτρέπεται η απευθείας ανάλυσή του. Παρόλα αυτά, υπάρχουν περιπτώσεις όπου η προσδιοριζόµενη ένωση δεν είναι «συµβατή» µε τη µέθοδο διαχωρισµού, είτε από πλευράς ανίχνευσης είτε από πλευράς διαχωρισµού. Στις περιπτώσεις αυτές εισάγεται ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας πριν την ανάλυση του δείγµατος, η παραγωγοποίηση (derivatization), που σκοπό έχει τη µετατροπή της ένωσης σε µια άλλη µορφή µε καλύτερες ιδιότητες ανίχνευσης ή διαχωρισµού. Η παραγωγοποίηση βασίζεται στη χηµική αντίδραση µιας ή περισσοτέρων οµάδων της προσδιοριζόµενης ένωσης µε ένα αντιδραστήριο σε κατάλληλες συνθήκες [1]. Γενικά δίνεται από την απλή εξίσωση του τύπου: Α (ένωση) + R (αντιδραστήριο) D (παράγωγο) Στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί µεγάλος αριθµός ερευνητικών εργασιών που κάνουν χρήση παραγωγοποίησης πριν από την ανάλυση µε διαχωριστικές τεχνικές. Στις περισσότερες εργασίες χρησιµοποιούνται αντιδραστήρια παραγωγοποίησης που υπάρχουν στο εµπόριο, ενώ λίγες είναι εκείνες που κάνουν χρήση αντιδραστηρίων µετά από οργανική σύνθεσή τους. Η αντίδραση παραγωγοποίησης µπορεί να επιτευχθεί πριν ή µετά το διαχωρισµό ανάλογα µε σκοπό της µεθόδου. Οι αντιδράσεις που λαµβάνουν χώρα πριν τη στήλη (pre-

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 33 column) βελτιώνουν συνήθως το διαχωρισµό, τις φυσικοχηµικές ιδιότητες των ενώσεων αλλά και τις ιδιότητες ανίχνευσής τους. Οι αντιδράσεις µετά τη στήλη (post-column), στοχεύουν στη βελτίωση των ιδιοτήτων ανίχνευσης. Η παραγωγοποίηση έχει χαρακτηριστεί από πολλούς ερευνητές ως αναγκαίο κακό [21]. Και αυτό γιατί στόχος µιας µεθόδου είναι να ληφθεί το επιθυµητό αποτέλεσµα µε όσο το δυνατό λιγότερα στάδια προκατεργασίας του δείγµατος. Είναι φανερό ότι η εισαγωγή ενός επιπλέον σταδίου αυξάνει την αβεβαιότητα, αφού η παραγωγοποίηση απαιτεί αρκετούς χειρισµούς διαλυµάτων. Επίσης, κάθε αντίδραση παραγωγοποίησης συνοδεύεται από ένα στάδιο µέτρησης του λευκού προσδιορισµού (blank), πράγµα που αυξάνει το χρόνο της όλης διαδικασίας. Όπως προαναφέρθηκε, η παραγωγοποίηση βελτιώνει το διαχωρισµό των ενώσεων µε παρόµοια δοµή, καθώς επίσης αυξάνει την ευαισθησία και την εκλεκτικότητα της µεθόδου. 2.2.4.1. Παραγωγοποίηση για αύξηση της πτητικότητας των ενώσεων Η αντίδραση παραγωγοποίησης αυτού του είδους εφαρµόζεται σε αναλύσεις µε την τεχνική της αέριας χρωµατογραφίας. Κύριος στόχος είναι η αύξηση της πτητικότητας των ενώσεων που προσδιορίζονται και κατά συνέπεια βελτίωση του διαχωρισµού των ενώσεων του δείγµατος. Η παραγωγοποίηση πριν την ανάλυση µε αέρια χρωµατογραφία, περιλαµβάνει συνήθως αντιδράσεις ακυλίωσης, αλκυλίωσης, συλιλίωσης ή εστεροποίησης [22]. 2.2.4.2. Παραγωγοποίηση για βελτίωση του διαχωρισµού Η παραγωγοποίηση αποτελεί σηµαντικό στάδιο προκατεργασίας, σε περιπτώσεις όπου απαιτείται ο διαχωρισµός των εναντιοµερών µορφών της ένωσης. Η αντίδραση της ένωσης µε κατάλληλα αντιδραστήρια έχει ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία διαστερεοµερών παραγώγων τα οποία έχουν διαφορετική αλληλεπίδραση µε τη στατική φάση. Τα τελευταία χρόνια η παραγωγοποίηση αυτού του είδους τείνει να εγκαταλειφθεί, διότι έχουν αναπτυχθεί ειδικές χρωµατογραφικές στήλες µε ενεργές οµάδες, κυκλοδεξτρίνες, πρωτεΐνες, αιθέρες στέµµατα κ.ά., οι οποίες αλληλεπιδρούν µε ένα από τα εναντιοµερή της ένωσης. Στον ίδιο µηχανισµό βασίζονται και οι διαχωρισµοί µε την

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 34 τριχοειδή ηλεκτροφόρηση, όπου οι κυκλοδεξτρίνες αποτελούν συστατικό του ηλεκτροφορητικού διαλύµατος. 2.2.4.3. Παραγωγοποίηση για αύξηση της ευαισθησίας της µεθόδου Η αύξηση της ευαισθησίας της µεθόδου είναι ο κυριότερος λόγος για τον οποίο χρησιµοποιείται η παραγωγοποίηση. Εφαρµόζεται σε περιπτώσεις όπου η προσδιοριζόµενη ένωση δεν έχει την «κατάλληλη» προς ανίχνευση οµάδα (π.χ. έλλειψη χρωµοφόρας οµάδας των αµινοξέων) και συνεπώς είναι δύσκολο να µετρηθεί σε χαµηλές συγκεντρώσεις. Χρησιµοποιείται κατά κόρον στην ιχνο-ανάλυση (trace-analysis) µε τη µικρο- ή νανο-hplc καθώς και µε την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση, όπου το µήκος της οπτικής διαδροµής του ανιχνευτή είναι πολύ µικρό σε σχέση µε τους συµβατικούς ανιχνευτές. Η παραγωγοποίηση (πριν ή µετά το διαχωρισµό), όπως και όλες οι τεχνικές προκατεργασίας, έχει πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα. Μερικά από αυτά παραθέτονται στον πίνακα 2.1. Επισηµαίνεται ότι η διαδικασία που χρησιµοποιείται περισσότερο είναι η αντίδραση πριν το διαχωρισµό.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 35 Πίνακας 2.1. Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα της παραγωγοποίησης πριν και µετά το διαχωρισµό πριν το διαχωρισµό Παραγωγοποίηση µετά το διαχωρισµό Πλεονεκτήµατα δυνατότητα βελτιστοποίησης του χρόνου αντίδρασης ελεύθερη επιλογή διαλύτη αντίδρασης δεν υπάρχει χρονικός περιορισµός δυνατότητα βελτιστοποίησης των παραµέτρων απόδοσης του συστήµατος (διακριτική ικανότητα, κ.τ.λ.) δυνατότητα καθαρισµού των παραγώγων των ενώσεων, από τα παραπροϊόντα της αντίδρασης δυνατότητα αυτοµατοποίησης δυνατότητα ανίχνευσης των µη παραγωγοποιηµένων ενώσεων λιγότερα στάδια προκατεργασίας δυνατότητα δύο ή και περισσοτέρων ειδών ανίχνευσης επιτρέπει τη χρήση γρήγορων αντιδράσεων των οποίων τα προϊόντα είναι ευαίσθητα ή διασπώνται γρήγορα Μειονεκτήµατα είναι αρκετά επίπονη και χρονοβόρα απαιτείται η χρήση εσωτερικού προτύπου περιορισµός στην επιλογή των συνθηκών αντίδρασης παρατηρείται απώλεια της απόδοσης διαχωρισµού λόγω διεύρυνσης των κορυφών πιθανή παρεµπόδιση στη µέτρηση της ένωσης λόγω της περίσσειας του αντιδραστηρίου απαιτείται επιπλέον οργανολογία (post-column reactor) Κατά την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση µιας αντίδρασης παραγωγοποίησης, οι παράµετροι που µελετώνται συνήθως είναι η θερµοκρασία, ο χρόνος και ο διαλύτης αντίδρασης, η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης και η επίδραση του ενεργοποιητή (activator) ή του καταλύτη (catalyst). Στο τελικό στάδιο, επιλέγονται εκείνες οι τιµές των παραµέτρων µε τις οποίες προκύπτει η µεγαλύτερη απόδοση της αντίδρασης [21].

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 36 Η επιλογή µιας αντίδρασης παραγωγοποίησης εξαρτάται κυρίως από: την ελεύθερη οµάδα της ένωσης την τεχνική που χρησιµοποιείται και το είδος των δειγµάτων που πρόκειται να αναλυθούν Ενώσεις που περιέχουν ελεύθερες αµινο-οµάδες (πρωτοταγείς, δευτεροταγείς), ιµινο-οµάδες καρβοξυλο-οµάδες, σουλφυδρυλο-οµάδες, υδροξυλο-οµάδες, κ.ά. µπορούν σχετικά εύκολα να παραγωγοποιηθούν. Τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιούνται ποικίλουν ανάλογα µε το είδος της οµάδας ή της ανίχνευσης. Στον πίνακα 2.2. αναφέρονται µερικά παραδείγµατα αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης καθώς και ο τύπος ανίχνευσης. Η παραγωγοποίηση χρησιµοποιείται τόσο στην υγρή και αέρια χρωµατογραφία όσο και στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση µε κατάλληλο σύστηµα ανίχνευσης. Βέβαια, η επιλογή γίνεται ανάλογα µε το είδος των προσδιοριζόµενων ενώσεων (φορτισµένες ή ουδέτερες ενώσεις) και τη διαθέσιµη οργανολογική διάταξη. Τέλος, το είδος των δειγµάτων παίζει ουσιαστικό ρόλο στην επιλογή αλλά και στην ανάπτυξη µιας αντίδρασης παραγωγοποίησης. Στη βιοανάλυση, λόγω της φύσης των δειγµάτων, επιλέγονται αντιδράσεις οι οποίες πραγµατοποιούνται σε πολικούς πρωτικούς διαλύτες (π.χ. H 2 O). Ωστόσο, υπάρχουν αντιδράσεις (π.χ. αντίδραση καρβοξυλικών ενώσεων) οι οποίες γίνονται σε µη-πρωτικούς διαλύτες. Στις περιπτώσεις αυτές είναι απαραίτητη η µεταφορά της ένωσης από τη φάση του δείγµατος στη φάση του διαλύτη αντίδρασης µε εκχύλιση ή µε τη βοήθεια τασενεργών ουσιών (phase-transfer catalysis) [23].

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 37 Πίνακας 2.2. Αντιδραστήρια παραγωγοποίησης για κάθε οµάδα και τύπο ανίχνευσης Οµάδα Αντιδραστήριο παραγωγοποίησης Είδος ανίχνευσης αµινοµάδα 4-χλωρο-7-νιτροβενζο-2-οξα-1,3-διαζόλη (NBD-Cl) 9-φλουορενυλο-µεθυλο-χλωροφορµικό άλας (FMOC) ο-φθαλαδιαλδεΰδη (OPA) ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) 5-διµεθυλο-αµινο-ναφθαλενιο-1-σουλφονυλοχλωρίδιο (Dns-Cl) 4-φαινυλο-σπιρο[φουρανο-2(3Η)-1 -φθαλα]-3 -διονη (φλουορεσκαµίνη) 1-φθορο-2,4-δινιτροβελζόλιο N-(4-αµινο-βουτυλο)-Ν-αιθυλο-ισολουµινόλη (ABEI) UV α, FL β UV, FL γ UV, FL, ED ox UV, FL UV, FL UV, FL ED red δ CD ε υδροξύλιο Βενζυλοχλωρίδιο 4-διµεθυλαµινο-1-ναφθοϋλονιτρίλιο πυρενιο-1-καρβονυλονιτρίλιο UV UV, FL UV σουλφυδρυλοµάδα 4-χλωρο-7-νιτροβενζο-2-οξα-1,3-διαζόλη Ν-χλωροντανσυλαµίδιο 1-πυρενυλο-µαλεϊµίδιο UV, FL UV, FL UV, FL Καρβοξύλιο 4-βρωµοµεθυλο-7-µεθοξυκουµαρίνη (Br-Mmc) 9-αµινοφαινανθρένιο 9-χλωροµεθυλο-ανθρακένιο π-νιτροφαινυλυδραζίνη UV, FL UV, FL UV, FL ED red α φασµατοφωτοµετρική ανίχνευση β φθορισµοµετρική ανίχνευση γ ηλεκτροχηµική ανίχνευση (οξείδωση) δ ηλεκτροχηµική ανίχνευση (αναγωγή) ε ανίχνευση χηµειοφωταύγειας

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 38 2.3. Αυτοµατισµός στις τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος Οι τεχνικές προκατεργασίας, παρά την ανάπτυξη και βελτίωσή τους, υστερούν στο γεγονός ότι είναι σχετικά χρονοβόρες και επίπονες διαδικασίες, και επιπλέον ότι ο ανθρώπινος παράγοντας αποτελεί πηγή σφαλµάτων. Λύση στο πρόβληµα έρχεται να δώσει η χρήση αυτοµατοποιηµένων συστηµάτων. Την τελευταία δεκαετία πολλές ερευνητικές οµάδες έχουν στραφεί στην ανάπτυξη αυτοµατοποιηµένων τεχνικών προκατεργασίας, τόσο σε συµβατική κλίµακα όσο και σε µικρο-κλίµακα (miniaturization), µε σκοπό την εφαρµογή τους σε αναλύσεις ρουτίνας. Οι αυτοµατοποιηµένες τεχνικές προκατεργασίας πλεονεκτούν έναντι των συµβατικών διότι: απαιτείται πολύ µικρότερος χρόνος προκατεργασίας επιτυγχάνεται µεγαλύτερος αριθµός αναλύσεων την ώρα, κάνοντας χρήση παράλληλων διαδικασιών προκατεργασίας παρουσιάζουν καλύτερη ακρίβεια και επαναληψιµότητα είναι ασφαλείς για το προσωπικό, αφού µειώνουν την έκθεση σε επικίνδυνους και τοξικούς διαλύτες είναι λιγότερο επίπονες Τα συστήµατα αυτοµατισµού, παρά την ευκολία που προσφέρουν στη χρήση, υστερούν στο γεγονός ότι: έχουν περιορισµένη απόδοση λόγω των φαινοµένων «µνήµης» (carry-over effects) η ύπαρξη συστηµατικών σφαλµάτων έχει άµεσο αντίκτυπο στην ακρίβεια της µεθόδου η φυσική και χηµική σταθερότητα των δειγµάτων αποτελεί πρόβληµα, ειδικά όταν χρησιµοποιούνται παράλληλες διαδικασίες προκατεργασίας έχουν υψηλό κόστος αγοράς και συντήρησης δεν είναι ευέλικτα όσον αφορά την οργανολογία Παρόλα αυτά, τα αυτοµατοποιηµένα συστήµατα προκατεργασίας και ανάλυσης χρησιµοποιούνται εκτεταµένα στη βιοµηχανία, διότι απαιτείται αξιοπιστία και ταχύτητα στην ανάλυση δειγµάτων. Η σύνδεση των τεχνικών προκατεργασίας του δείγµατος µε την τεχνική διαχωρισµού µπορεί να γίνει µε τρεις διαφορετικούς τρόπους (σχήµα 2.6):

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 39 µε τη χρήση ροµποτικού συστήµατος (at-line). Στην περίπτωση αυτή η διαδικασία της προκατεργασίας γίνεται µε τη βοήθεια ενός ροµποτικού συστήµατος (π.χ. βραχίονας). Στη συνέχεια, η εισαγωγή του δείγµατος γίνεται µε ένα δεύτερο αυτοµατοποιηµένο σύστηµα (αυτόµατος δειγµατολήπτης, autosampler). Παράδειγµα αυτού αποτελεί το σύστηµα 96-well plate για εκχύλιση στερεάς φάσης [27]. σε σειρά (on-line). Εδώ υπάρχει απευθείας σύνδεση του συστήµατος προκατεργασίας µε το δειγµατολήπτη. Το δείγµα µετά την προκατεργασία εισάγεται κατευθείαν στο σύστηµα διαχωρισµού. Η ανάλυση των δειγµάτων µπορεί να γίνει σε σειρά (το ένα πίσω από το άλλο) ή παράλληλα (ανάλυση του ενός µε ταυτόχρονη προκατεργασία του επόµενου δείγµατος). µε την ενσωµάτωση της τεχνικής προκατεργασίας στο σύστηµα διαχωρισµού (inline). Το είδος αυτό της συνδεσµολογίας επιτρέπει την απευθείας εισαγωγή του δείγµατος στο αναλυτικό σύστηµα. Παραδείγµατα τέτοιων συστηµάτων είναι η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση, όπου σ ένα τµήµα του τριχοειδούς σωλήνα έχει ακινητοποιηθεί υλικό για εκχύλιση στερεάς φάσης [25]. Επίσης, η ίδια τεχνική έχει χρησιµοποιηθεί για την παραγωγοποίηση ενώσεων στο στάδιο του διαχωρισµού [26]. Σχήµα 2.6. Σχηµατική παράσταση σύνδεσης της τεχνικής προκατεργασίας δείγµατος µε την τεχνική διαχωρισµού [24].

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 40 Στις επόµενες ενότητες θα δοθεί έµφαση στις αυτοµατοποιηµένες τεχνικές προκατεργασίας οι οποίες συνδέονται σε σειρά (on-line) µε τη τεχνική διαχωρισµού. 2.3.1. Αυτοµατισµός στις τεχνικές εκχύλισης 2.3.1.1. Αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση στερεάς φάσης Η αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση στερεάς φάσης (automated SPE) σε συνδυασµό µε την υγρή χρωµατογραφία αποτελεί την πιο ευρέως διαδεδοµένη αυτοµατοποιηµένη τεχνική εκχύλισης. Βασικό πλεονέκτηµά της είναι η βελτίωση της αξιοπιστίας της µεθόδου και η αύξηση του αριθµού αναλύσεων ανά ώρα. Ως τώρα έχουν αναπτυχθεί δυο τύποι αυτοµατοποιηµένης εκχύλισης στερεάς φάσης. O πρώτος τύπος εκχύλισης βασίζεται στη χρήση, ενός ροµποτικού συστήµατος/βραχίονα (at-line) µε συµβατικές µικροστήλες SPE ή πλάκες εκχύλισης (96- well plates). Παραδείγµατα τέτοιων συστηµάτων είναι το Microlab SPE της εταιρίας Hamilton, το Prospekt 2 της εταιρίας Spark Holland και το ASPEC XL της Gilson [27]. Ο δεύτερος τύπος εκχύλισης βασίζεται στη χρήση µικροστηλών οι οποίες βρίσκονται σε διαφορετική «διάσταση» από την κυρίως αναλυτική στήλη διαχωρισµού (multidimensional chromatography). Η απλούστερη µορφή της προσέγγισης αυτής απαιτεί ένα σύστηµα HPLC, µια επιπλέον αντλία για προώθηση διαλυτών και µια ή περισσότερες βαλβίδες (σχήµα 2.7). Αρχικά, το δείγµα δεσµεύεται στη µικροστήλη SPE, η οποία βρίσκεται στη θέση του βρόχου της βαλβίδας. Στη συνέχεια µε µια σειρά διαλυτών, αποµακρύνονται οι ενώσεις που παρεµποδίζουν. Με αλλαγή της θέσης της βαλβίδας το δείγµα εκλούεται και οδηγείται στην κυρίως στήλη για περαιτέρω διαχωρισµό. Η αντλία, που προωθεί το δείγµα στη µικροστήλη, µπορεί να είναι υψηλής ή χαµηλής πίεσης ανάλογα µε την πίεση επαναφοράς. Η πίεση αυτή, καθορίζεται κυρίως από τις διαστάσεις και το µέγεθος των σωµατιδίων του υλικού πλήρωσης της µικροστήλης. Σηµαντικό πλεονέκτηµα της αυτοµατοποιηµένης SPE σε ροή έναντι της συµβατικής και της SPE µε τη βοήθεια ροµπότ είναι ότι επιτυγχάνεται µεγαλύτερη ευαισθησία, αφού στο τελικό στάδιο έκλουσης παραλαµβάνεται όλη η ποσότητα του δείγµατος. Από την άλλη µεριά, υστερεί στο γεγονός ότι µετά από ένα συγκεκριµένο αριθµό εγχύσεων η µικροστήλη χάνει την απόδοσή της και αντικαθίσταται. Λύση στο πρόβληµα αυτό έχουν δώσει η χρήση των υλικών περιορισµένης πρόσβασης (RAM) και

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 41 τα πολυµερή µοριακής αποτύπωσης (MIPs) (βλέπε ενότητα 2.2.3.2.), τα οποία αυξάνουν κατά πολύ το χρόνο ζωής της στήλης. Σχήµα 2.7. Τυπική διάταξη αυτοµατοποιηµένης εκχύλισης στερεάς φάσης συνδυασµένη µε τη διάταξη της υγρής χρωµατογραφίας. Επίσης το σύστηµα της αυτοµατοποιηµένης SPE, µπορεί να συνδεθεί και µε την αέρια χρωµατογραφία. Τα συστήµατα αυτά είναι πιο πολύπλοκα, όσον αφορά την οργανολογία, και δεν είναι εµπορικά διαθέσιµα. Στο σχήµα 2.8 φαίνεται η διάταξη σύνδεσης αυτοµατοποιηµένης SPE µε σύστηµα αέριας χρωµατογραφίας. Όπως φαίνεται από το σχήµα 2.8, η διάταξη περιλαµβάνει τρεις βαλβίδες υψηλής πίεσης, δυο αντλίες προώθησης διαλυτών και µια ολοκληρωµένη διάταξη αέριας χρωµατογραφίας µε φασµατογράφο µάζας. Η λειτουργία του βασίζεται στην ίδια αρχή µε την υγρή χρωµατογραφία, µε τη διαφορά ότι χρησιµοποιείται αέριο άζωτο για την αποµάκρυνση του νερού από τη µικροστήλη SPE. Επίσης, στο στάδιο έκλουσης και παραλαβής του δείγµατος, χρησιµοποιείται πολύ µικρός όγκος διαλύτη, συµβατού µε την αέρια χρωµατογραφία. Τέλος, τα υλικά πλήρωσης της µικροστήλης SPE είναι όµοια µε εκείνα που χρησιµοποιούνται στην υγρή χρωµατογραφία.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 42 Σχήµα 2.8. ιάταξη αυτοµατοποιηµένης SPE συζευγµένη µε αέρια χρωµατογραφία σε ροή [28]. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η σύνδεση της SPE µε σύστηµα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης σε ροή. Στο σχήµα 2.9 φαίνεται η διάταξη ενός τέτοιου συστήµατος, όπου χρησιµοποιούνται δυο συµβατικές βαλβίδες και µια µικροβαλβίδα υψηλής πίεσης. Η διάταξη που χρησιµοποιείται είναι αρκετά πολύπλοκη, δεν είναι πλήρως αυτοµατοποιηµένη και βρίσκεται σε στάδιο ανάπτυξης. Σχήµα 2.9. ιάταξη σύζευξης µικροστήλης SPE µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε ροή [29].

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 43 2.3.1.2. Αυτοµατοποιηµένη µικροεκχύλιση στερεάς φάσης Μια διαφορετική προσέγγιση της εκχύλισης σε ροή είναι η αυτοµατοποιηµένη µικροεκχύλιση στερεάς φάσης (automated SPME). Το σύστηµα αυτό χρησιµοποιείται κυρίως ως στάδιο προκατεργασίας πριν το διαχωρισµό, µε τεχνικές που απαιτούν µικρό όγκο δείγµατος (µικρο-hplc, τριχοειδής ηλεκτροφόρηση, αέρια χρωµατογραφία). Έχουν αναπτυχθεί δυο τύποι σύνδεσης σε ροή. Ο πρώτος τύπος βασίζεται στην τοποθέτηση της ίνας σε τροποποιηµένο σύνδεσµο τύπου «Τ» (tee connector). Με τη βοήθεια µιας µικροαντλίας το δείγµα προωθείται και οι ενώσεις του δεσµεύονται στην ίνα. Στη συνέχεια µε κατάλληλο διαλύτη έκλουσης, οι ενώσεις εκροφώνται και οδεύουν προς το σύστηµα της HPLC ή της αέριας χρωµατογραφίας για περαιτέρω διαχωρισµό [30]. Ο δεύτερος τρόπος στηρίζεται στην τοποθέτηση του υλικού εκχύλισης στον εσωτερικό σωλήνα µικρής διαµέτρου µέσα από τον οποίο διέρχεται το δείγµα (in-tube SPME). Στο σχήµα 2.10 εικονίζεται η διάταξη της SPME συνδεδεµένη σε σειρά µε σύστηµα µικρο-hplc. Το δείγµα προσροφάται στην επιφάνεια της ίνας µε τη βοήθεια µιας αντλίας τύπου σύριγγας. Στη συνέχεια, µε προώθηση του διαλύτη εκρόφησης, το δείγµα εκλούεται και «ακινητοποιείται» στο βρόχο του συστήµατος HPLC. Σχήµα 2.10. ιάταξη σύζευξης SPME σε σωλήνα µε µικρο-hplc σε ροή [31]. Η ερευνητική οµάδα του Saito [31] αντικατέστησε την ίνα µε µια σειρά ινών µικρότερης διαµέτρου. Αυτό οδήγησε σε αύξηση της απόδοσης της εκχύλισης SPME αφού η ενεργός επιφάνεια των ινών είναι πολύ µεγαλύτερη από εκείνη της µιας ίνας. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η σύνδεση της εκχύλισης SPME µε την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Στην περίπτωση αυτή, η ίνα τοποθετείται στη µια είσοδο ενός συνδέσµου

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 44 σχήµατος σταυρού (cross connector) και στις άλλες δυο άκρες του συνδέσµου προσαρµόζεται ο τριχοειδής σωλήνας διαχωρισµού (σχήµα 2.11). Με τον ίδιο τρόπο το δείγµα προωθείται και δεσµεύεται στη ίνα, ενώ δεν έχει εφαρµοστεί ακόµη διαφορά δυναµικού στα άκρα του τριχοειδούς σωλήνα. Σχήµα 2.11. ιάταξη σύζευξης SPME µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε ροή [32]. Στην συνέχεια µε προώθηση κατάλληλου διαλύτη εκρόφησης, µέρος του δείγµατος εισέρχεται στο σωλήνα διαχωρισµού λόγω τριχοειδών φαινοµένων. Με εφαρµογή δυναµικού στα άκρα του τριχοειδούς επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός του δείγµατος. 2.3.1.3. Αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση µεµβρανών Η τεχνική της εκχύλισης µε µεµβράνη (µικροδιαπίδυση, microdialysis) µπορεί να αποτελέσει στάδιο προκατεργασίας πριν το διαχωρισµό µε HPLC, GC και CE. Αυτοµατοποιείται σχετικά εύκολα χωρίς να απαιτείται εξειδικευµένη οργανολογία. Όπως φαίνεται από το σχήµα 2.12 η µεµβράνη βρίσκεται µεταξύ δυο καναλιών του δότη και δέκτη. Το δείγµα µε τη βοήθεια του ρεύµατος του δότη µεταφέρεται και ακινητοποιείται στο σηµείο της µεµβράνης. Τα µόρια των ενώσεων του δείγµατος τα οποία έχουν κατάλληλο µέγεθος, διαπερνούν τη µεµβράνη και εισέρχονται στο ρεύµα του δέκτη. Στη συνέχεια, το δείγµα προωθείται στο βρόχο της υγρή χρωµατογραφίας και εισάγεται στην αναλυτική στήλη. Η αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση µεµβρανών βρίσκει ευρεία εφαρµογή στην ανάλυση ενώσεων τόσο σε περιβαλλοντικά όσο και σε βιολογικά δείγµατα καθώς στη µελέτη δέσµευσης φαρµάκων σε πρωτεΐνες.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 45 Σχήµα 2.12. ιάταξη σύζευξης του συστήµατος εκχύλισης µεµβράνης µε υγρή χρωµατογραφία σε ροή [33]. Το σύστηµα της µικροδιαπίδυσης µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την προκατεργασία δείγµατος πριν την ανάλυση µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Έχουν αναπτυχθεί δυο διαφορετικοί τύποι σύνδεσης των τεχνικών µεταξύ τους. Ο ένας βασίζεται στη χρήση µεµβράνης µε τη µορφή κοίλης ίνας η οποία παρεµβάλλεται στον τριχοειδή σωλήνα. Το δείγµα εισάγεται σε ένα χώρο που περιβάλλει τη µεµβράνη. Οι ενώσεις κατάλληλου µεγέθους διαπερνούν τη µεµβράνη και εισέρχονται στο εσωτερικό του τριχοειδούς σωλήνα. Στη συνέχεια µε εφαρµογή δυναµικού επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός [34]. Ο δεύτερος τύπος βασίζεται στη χρήση µεµβράνης η οποία παρεµβάλλεται µεταξύ δυο καναλιών (παρόµοια µε το σχήµα 2.12), ενώ η σύνδεση µεταξύ των δυο τεχνικών γίνεται µε ένα ειδικά κατασκευασµένο σύνδεσµο (interface) [35]. Όµοια µε παραπάνω, το δείγµα µετά την εκχύλισή του µέσω µεµβράνης εισέρχεται στο ρεύµα του ηλεκτρολύτη και στη συνέχεια ακινητοποιείται στο σύνδεσµο. Η εισαγωγή του δείγµατος στον τριχοειδή σωλήνα διαχωρισµού γίνεται µε ηλεκτροκινητικό τρόπο. Η όλη συνδεσµολογία απαιτεί µια περισταλτική αντλία, ένα σύνδεσµο και µια ολοκληρωµένη διάταξη τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 46 Σχήµα 2.13. ιάταξη σύνδεσης του συστήµατος εκχύλισης µεµβράνης µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε ροή [35]. 2.3.2. Αυτοµατισµός στην παραγωγοποίηση Η αντίδραση παραγωγοποίησης είναι συνήθως µια σχετικά επίπονη διαδικασία, διότι αποτελείται από αρκετά στάδια (ανάµιξη, θέρµανση, ανάδευση). Είναι φανερό, ότι η αυτοµατοποίησή της συµβάλλει καθοριστικά στην όλη διαδικασία. Οι περισσότερες αυτοµατοποιηµένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης, πριν την υγρή χρωµατογραφία, γίνονται µε τη βοήθεια ενός ροµποτικού βραχίονα (robotic arm) ή ενός αυτόµατου δειγµατολήπτη (autosampler). Η αντίδραση πραγµατοποιείται µε την ανάµιξη του δείγµατος και του αντιδραστηρίου σε ένα τρίτο φιαλίδιο. Μετά από συγκεκριµένο χρόνο ο αυτόµατος δειγµατολήπτης αναρροφά ορισµένο όγκο από το φιαλίδιο του δείγµατος και το εισάγει στην αναλυτική στήλη. Παρόλο που η σύνδεση του αυτόµατου δειγµατολήπτη και της υγρής χρωµατογραφίας είναι «εν-ροή» (on-line), εντούτοις ο τρόπος της παραγωγοποίησης θα µπορούσε να χαρακτηριστεί ως «at-line» διαδικασία. Η διάταξη ενός τέτοιου συστήµατος φαίνεται στο σχήµα 2.14. Η δειγµατοληψία γίνεται in vivo µε συσκευή µικροδιαπίδυσης. Το δείγµα µε τη βοήθεια της αντλίας 1, ενώνεται µε το ρεύµα του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (αντλία 2) σε ένα σύνδεσµο σχήµατος «Τ». Η ανάµιξη των ζωνών επιτυγχάνεται στο σπείραµα αντίδρασης και στη συνέχεια το

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 47 παραγωγοποιηµένο δείγµα εισάγεται στην αναλυτική στήλη µέσω αυτόµατου δειγµατολήπτη. Σχήµα 2.14. ιάταξη παραγωγοποίησης σε ροή πριν την υγρή χρωµατογραφία [36]. Ως αυτοµατοποιηµένη αντίδραση παραγωγοποίησης µπορεί να χαρακτηριστεί και εκείνη η οποία λαµβάνει χώρα µετά το διαχωρισµό (post-column derivatization). Οι αντιδράσεις αυτές συνήθως, δεν απαιτούν ειδική οργανολογία παρά µόνο µια αντλία συνεχούς ροής (π.χ. περισταλτική) η οποία προωθεί το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης. Η αυτοµατοποιηµένη αντίδραση παραγωγοποίησης πριν το διαχωρισµό µε αέρια χρωµατογραφία επιτυγχάνεται µε συστήµατα, παρόµοια µε αυτά που χρησιµοποιούνται πριν την υγρή χρωµατογραφία. Τα συστήµατα περιλαµβάνουν ροµποτικούς µηχανισµούς ή αυτόµατους δειγµατολήπτες οι οποίοι «διαχειρίζονται» το δείγµα και το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η αυτοµατοποιηµένη παραγωγοποίηση σε ροή πριν το διαχωρισµό µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Τα συστήµατα αυτά περιλαµβάνουν τη σύνδεση σε ροή της τεχνικής έγχυσης του δείγµατος σε συνεχή ροή (flow injection analysis, FIA) µε την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (σχήµα 2.15).

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 48 Σχήµα 2.15. ιάταξη παραγωγοποίησης σε ροή πριν την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση [37]. Στην περίπτωση αυτή το δείγµα εισέρχεται στο ρεύµα του µεταφορέα και ενώνεται µε το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης. Στη συνέχεια, µέρος του προϊόντος αντίδρασης εισάγεται µε κατάλληλη βαλβίδα στο ρεύµα του ηλεκτρολύτη και προωθείται στον τριχοειδή σωλήνα διαχωρισµού. Το δείγµα εισάγεται στο σωλήνα είτε ηλεκτροκινητικά ή λόγω τριχοειδών φαινοµένων. Σηµαντικό πλεονέκτηµα της διάταξης αυτής είναι ο µεγάλος αριθµός αναλύσεων την ώρα. Η αντίδραση παραγωγοποίησης µπορεί επίσης να επιτευχθεί µετά το διαχωρισµό µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (post-column derivatization). Η σύνδεση του ενός άκρου του τριχοειδούς σωλήνα και του ρεύµατος του αντιδραστηρίου γίνεται µε τη βοήθεια ενός συνδέσµου σχήµατος «Τ». Η προώθηση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης γίνεται µε αντλία τύπου σύριγγας. Στο σχήµα 2.16 εικονίζεται ένα παράδειγµα διάταξης αυτοµατοποιηµένης αντίδρασης µετά το διαχωρισµό.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 49 Σχήµα 2.16. ιάταξη παραγωγοποίησης σε ροή µετά το διαχωρισµό µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση [38]. Μια διαφορετική προσέγγιση αυτοµατοποιηµένης παραγωγοποίησης αποτελεί η αντίδραση στον τριχοειδή σωλήνα κατά τη διάρκεια του διαχωρισµού. Βασίζεται στη διαδοχική έγχυση του δείγµατος και του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης. Σε συγκεκριµένες πειραµατικές συνθήκες, η ηλεκτροφορητική ευκινησία του αντιδραστηρίου είναι µεγαλύτερη από εκείνη του δείγµατος µε αποτέλεσµα, η αντίδραση να πραγµατοποιείται κατά την αλληλοεπικάλυψη των δυο ζωνών [39]. Η διαδικασία αυτή δεν απαιτεί επιπλέον οργανολογία, αφού το στάδιο της παραγωγοποίησης είναι «ενσωµατωµένο» στο σύστηµα διαχωρισµού (in-line). Κύριο πρόβληµα αυτού του τύπου παραγωγοποίησης είναι η περίσσεια του αντιδραστηρίου, η οποία τις περισσότερες φορές δηµιουργεί πρόβληµα στην ανίχνευση των άλλων ουσιών. 2.3.3. Αυτοµατισµός στις συνδυασµένες τεχνικές προκατεργασίας Τα αυτοµατοποιηµένα συστήµατα που έχουν περιγραφεί στην προηγούµενη ενότητα, µπορούν να χρησιµοποιηθούν και ως συνδυασµένες τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος, βελτιώνοντας την αξιοπιστία της µεθόδου και παράλληλα µειώνοντας σηµαντικά το χρόνο προκατεργασίας. Ανάλογα µε την περίπτωση, η οργανολογία µπορεί να είναι η ίδια µε τα συστήµατα προκατεργασίας που αναφέρθηκαν παραπάνω ή πιο πολύπλοκη. Η σειρά µε

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 50 την οποία επιτυγχάνεται κάθε στάδιο προκατεργασίας, καθορίζεται από τον τύπο του δείγµατος, από τη µέθοδο και από τη διαχωριστική τεχνική που χρησιµοποιείται. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί η αυτοµατοποιηµένη SPE σε συνδυασµό µε την παραγωγοποίηση του δείγµατος. Η οργανολογική διάταξη που χρησιµοποιείται είναι παρόµοια µ εκείνη του σχήµατος 2.7. Στο συγκεκριµένο παράδειγµα έχουν αναπτυχθεί δυο διαφορετικές µεθοδολογίες. Σύµφωνα µε την πρώτη, αρχικά αποµακρύνονται οι ενώσεις που παρεµποδίζουν, µε χρήση µικροστήλης SPE, και στη συνέχεια οι ενώσεις που ενδιαφέρουν παραγωγοποιούνται πριν το διαχωρισµό τους. Η παραγωγοποίηση επιτυγχάνεται µε τη χρήση ενός συνδέσµου σχήµατος «Τ», µετά τη µικροστήλη SPE, όπου το αντιδραστήριο προωθείται µε µια αντλία. Στη δεύτερη µεθοδολογία, η εκχύλιση στερεάς φάσης και η παραγωγοποίηση πραγµατοποιούνται ταυτόχρονα (solid-phase derivatization) (σχήµα 2.17). Στην περίπτωση αυτή χρησιµοποιούνται µικροστήλες SPE, οι οποίες έχουν ως ενεργές οµάδες το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης. Όταν το δείγµα εισέρχεται στη µικροστήλη, οι ενώσεις που αντιδρούν µε το υλικό της στήλης δεσµεύονται από αυτή, ενώ οι υπόλοιπες αποµακρύνονται. Με κατάλληλο διαλύτη, εκλούεται το προϊόν της αντίδρασης από τη µικροστήλη και ακινητοποιείται στο χρωµατογραφικό βρόχο, όπου και εισάγεται, στη συνέχεια, στη στήλη διαχωρισµού. Τα υλικά πλήρωσης των µικροστηλών είναι όµοια µε εκείνα της συµβατικής SPE, όπως πηκτή SiO 2, αλουµίνα, συµπολυµερή στυρενίου-διβινυλοβενζολίου κ.ά. Επίσης, µεγαλύτερη εκλεκτικότητα προσφέρουν τα υλικά περιορισµένης πρόσβασης που έχουν τροποποιηθεί κατάλληλα µε αντιδραστήριο παραγωγοποίησης [40]. Σχήµα 2.17. ιάταξη εκχύλισης και παραγωγοποίησης σε ροή πριν την υγρή χρωµατογραφία [40].

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 51 Άλλο παράδειγµα συνδυασµένης τεχνικής προκατεργασίας είναι η εκχύλιση στερεάς φάσης µε υλικό περιορισµένης πρόσβασης (RAM) και πολυµερές µοριακής αποτύπωσης (MIP). Η οργανολογική διάταξη (σχήµα 2.18) είναι αρκετά πολύπλοκη αφού περιλαµβάνει δυο βαλβίδες, τρεις στήλες και τρεις αντλίες υψηλής πίεσης. Το δείγµα εγχύεται στο σύστηµα, µέσω αυτόµατου δειγµατολήπτη και εισέρχεται αρχικά στη µικροστήλη RAM. Οι ενώσεις µικρού σχετικά µοριακού µεγέθους δεσµεύονται από αυτή, ενώ οι µεγαλοµοριακές ενώσεις (π.χ. πρωτεΐνες, νουκλεοτίδια) αποµακρύνονται. Στη συνέχεια µε οργανικό διαλύτη (ακετονιτρίλιο, µεθανόλη), το δείγµα εκλούεται και µεταφέρεται στη µικροστήλη MIP. Το πολυµερές µοριακής αποτύπωσης δεσµεύει εκλεκτικά την ένωση που ενδιαφέρει, ενώ οι υπόλοιπες ενώσεις εξέρχονται από τη στήλη. Τέλος, µε έκλουση της ένωσης από τη µικροστήλη MIP η ένωση εισέρχεται στην κυρίως αναλυτική στήλη για περαιτέρω διαχωρισµό. Παρά την πολυπλοκότητά της, η διάταξη που περιγράφτηκε επιτρέπει τη ανάλυση ενώσεων µε απευθείας έγχυση βιολογικού δείγµατος [41]. Σχήµα 2.18. ιάταξη εκχύλισης σε ροή µε υλικό περιορισµένης πρόσβασης (RAM) και πολυµερές µοριακής αποτύπωσης (MIP) πριν την υγρή χρωµατογραφία [41].Τα P1, P2 και P3 αντιστοιχούν σε αντλίες υψηλής πίεσης, V1 και V2 σε βαλβίδες,as σε αυτόµατο δειγµατολήπτη, AC σε αναλυτική στήλη, D σε ανιχνευτή και W σε απόβλητα.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 52 Τελευταία έχουν αναπτυχθεί ολοκληρωµένα συστήµατα προκατεργασίας πριν την ανάλυση µε υγρή χρωµατογραφία, τα οποία επιτρέπουν τη αραίωση, την ανάµιξη, την προσθήκη εσωτερικού προτύπου και την εκχύλιση του δείγµατος. Τα συστήµατα αυτά δεν επιδέχονται τροποποιήσεις και συνήθως χρησιµοποιούνται στη βιοµηχανία για αναλύσεις ρουτίνας.

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 53 Βιβλιογραφία [1] R. M. Smith, J. Chromatogr. A, 1000 (2003) 3 [2] H. Kataoka, Trends Anal. Chem., 22(4) (2003) 232 [3] R. E. Majors, LC-GC Int., 4 (1991) 10 [4] S. C. Churms, J. Chromatogr., 500 (1990) 555 [5] Μ. Μ. L. Aerts, W. M. J. Beek, U. A. Th Brinkman, J. Chromatogr., 500 (1990) 453 [6] G. Evans, A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism, CRC Press Inc., London, 2004 [7] Y. He, H. K. Lee, Anal. Chem., 69 (1997) 4634 [8] S. Pedersen-Bjergaard, K. E. Rasmussen, J. Chromatogr. B, 817 (2005) 3 [9] L. Ramos, J. J. Ramos, U. A. Th. Brinkman, Anal. Bioanal. Chem., 381 (2005) 119 [10] Richard F. Venn, Principles and Practice of Bioanalysis, Taylor & Francis, London, 2000. [11] K. S. Boos, A. Rudolphi, LC-GC Int., 15 (1997) 602 [12] G. Theodoridis, A. Kantifes, P. Manesiotis, N. Raikos, H. Tsoukali-Papadopoulou, J. Chromatogr. A, 987 (2003) 103. [13] G. Theodoridis, W. Haasnoot, G. Gazemier, R. Schilt, M. Jaziri, B. Diallo, I. N. Papadoyannis, G. J. de Jong, J. Chromatogr. A, 948 (2002) 177. [14] J. Pawilszyn, Solid Phase Microextraction Theory and practice, Wiley & Sons, New York, 1997 [15] G. Theodoridis, E. H. M. Koster, G. J. de Jong, J. Chromatogr. B, 745 (2000) 49 [16] Y. Saito, K. Jinno, J. Chromatogr. A, 1000 (2003) 53 [17] E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers, J. Microcolumn Sep., 11 (1999) 737 [18] J. A. Jonsson, L. Mathiasson, J. Sep. Sci., 24 (2001) 495 [19] T. Niwa, W. Maruyama, D. Nakahara, N. Takeda, H. Yoshizumi, A. Tatematsu, A. Takahashi, P. Dostert, M. Naoi, T. Nagatsu, J. Chromatogr. A, 578 (1992) 109 [20] N. C. van de Merbel, J. Chromatogr. A, 856 (1999) 55 [21] H. Lingeman. W. J. M. Underberg, Detection-Oriented Derivatization Techniques in Liquid Chromatography, Marcel Dekker Inc., New York, 1990 [22] Igor G. Zenkevich, Derivatization of amines, amino acids, amides and imides for GC analysis, Encyclopedia of Chromatography, Marcel Dekker Inc., New York, 2005

Κεφάλαιο 2 ο. Προκατεργασία είγµατος στη Βιοανάλυση 54 [23] Y. C. Fiamegos, C. D. Stalikas, Anal. Chim. Acta, 550 (2005) 1 [24] K. S. Boos, C. T. Fleischer, Fresenius J. Anal. Chem., 371 (2001) 16 [25] J. R. Veraart, H. Lingeman, U. A. Th. Brinkman, J. Chromatogr. A, 856 (1999) 483 [26] M. Molina, M. Silva, Electrophoresis, 23 (2002) 2333 [27] M. Gilar, E. S. P. Bouvier, B. J. Compton, J. Chromatogr. A, 909 (2001) 111 [28] A. J. H. Louter, C. A. van Beekvelt, P. Montanes, J. Slobodnik, J. J. Vreuls, U. A. Th. Brinkman, J. Chromatogr. A, 725 (1996) 67 [29] F. W. A. Tempels, W. J. M. Underberg, G. W. Somsen, G. J. de Jong, Anal. Chem., 76 (2004) 4432 [30] K. Jinno, T. Muramatsu, Y. Saito, Y. Kiso, S. Magdic, J. Pawliszyn, J. Chromatogr. A, 754 (1996) 137 [31] Y. Saito, Y. Nakao, M. Imaizumi, T. Takeichi, Y. Kiso, K. Jinno, Fresenius J. Anal. Chem., 368 (2000) 641 [32] K. Jinno, M. Kawazoe, Y. Saito, T. Takeichi, M. Hayashida, Electrophoresis, 22 (2001) 3785 [33] N. C. van de Merbel, U. A. Th Brinkman, Trends Anal. Chem., 12 (1993) 249 [34] L. Bao, P. Dasgupta, Anal. Chem., 64 (1992) 991 [35] P. Kuban, B. Karlberg, Anal. Chem., 69 (1997) 1169 [36] C. S. Yang, P. J. Tsai, W. Y. Chen, J. S. Kuo, J. Chromatogr. B, 752 (2001) 33 [37] Y. Cheng, L. Fan, H. Chen, X. Chen, Z. Hu, J. Chromatogr. A, 1072 (2005) 259 [38] M. Ye, S. Hu, W. W. C. Quigley, N. J. Dovichi, J. Chromatogr. A, 1022 (2004) 201 [39] A. Tivesten, E. Ornskov, S. Folestad, J. High Resolut. Chromatogr., 19 (1996) 229 [40] I. S. Krull, M. E. Szulc, A. J. Bourque, F. X. Zhou, J. Y. R. Strong, J. Chromatogr. B, 659 (1994) 19 [41] K. S. Boos, C. T. Fleischer, Fresenius J. Anal. Chem., 371 (2001) 16

55 Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 3.1. Γενικά για την τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή Όπως αναφέρθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο, οι διαρκώς αυξανόµενες απαιτήσεις στο πεδίο της χηµικής ανάλυσης, οδήγησαν στην ανάπτυξη αυτοµατοποιηµένων συστηµάτων, τα οποία χρησιµοποιούνται τόσο στην έρευνα όσο και σε αναλύσεις ρουτίνας. Μια από τις πλήρως αυτοµατοποιηµένες τεχνικές είναι εκείνη της έγχυσης του δείγµατος σε συνεχή ροή (flow injection analysis, FIA). Η FIA είναι µια µη-διαχωριστική τεχνική και βασίζεται, στην έγχυση γνωστού όγκου δείγµατος σ ένα ρεύµα µεταφορέα, το οποίο στη συνέχεια ενώνεται µε ρεύµατα άλλων αντιδραστηρίων. Μετά από χηµική αντίδραση του δείγµατος µε τα αντιδραστήρια, το σχηµατιζόµενο προϊόν οδεύει προς τον ανιχνευτή όπου και ανιχνεύεται [1]. Παρόλη την αυτοµατοποίηση και την ταχύτητα στην ανάλυση που προσφέρει αυτή η τεχνική, υστερεί στο ότι, υπάρχει σηµαντική κατανάλωση αντιδραστηρίων και σε ορισµένες περιπτώσεις απαιτούνται πολύπλοκα τµήµατα ανάµειξης και αντίδρασης. Τα µειονεκτήµατα αυτά έρχεται να αντιµετωπίσει η τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος (sequential injection analysis, SIA). Η τεχνική SIA αναπτύχθηκε από τους J. Ruzicka και G. Marshall το 1990 και αποτελεί τη δεύτερη γενιά των αυτοµατοποιηµένων τεχνικών [2]. Χρησιµοποιείται ως αυτόνοµη τεχνική στον τοµέα της φαρµακευτικής, κλινικής, περιβαλλοντικής και βιοµηχανικής ανάλυσης, καθώς επίσης και στον τοµέα των τροφίµων και ποτών. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η χρήση της ως αυτοµατοποιηµένη τεχνική προκατεργασίας δείγµατος, πριν από την ανάλυση µε διαχωριστικές τεχνικές. 3.1.1. Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Η απλούστερη διάταξη ενός αναλυτή SIA εικονίζεται στο σχήµα 3.1. Η βαλβίδα έγχυσης του δείγµατος, είναι πολλαπλής επιλογής θέσης και βρίσκεται σε συγχρονισµό µε µονοκαναλική αντλία, ενώ το δείγµα και τα αντιδραστήρια βρίσκονται σε διαφορετικές θέσεις στη βαλβίδα εισαγωγής [3, 4]. Αρχικά, µε τη βοήθεια της αντλίας και µε εναλλαγή των θέσεων της αντλίας, αναρροφώνται διαδοχικά δύο ζώνες, του δείγµατος και του

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 56 αντιδραστηρίου, οι οποίες οδηγούνται στο σπείραµα παραµονής. Στη συνέχεια µε αλλαγή της ροής της αντλίας, οι ζώνες προωθούνται στον ανιχνευτή µέσω του σπειράµατος αντίδρασης. Σχήµα 3.1. Τυπική οργανολογική διάταξη ενός αναλυτή SIA. Η αντλία αποτελεί ένα από τα κύρια τµήµατα της οργανολογίας SIA. Χαρακτηριστικό της είναι ότι, παρέχει συνεχή και επαναλήψιµη ροή του µεταφορέα και για τις δυο κατευθύνσεις (bi-directional pump) και έχει δυνατότητα να διαχειρίζεται πολύ µικρούς όγκους. Αρχικά είχε χρησιµοποιηθεί αντλία ηµιτονοειδούς ροής [5], ενώ στη συνέχεια αντικαταστάθηκε µε περισταλτική αντλία ή αντλία τύπου σύριγγας. Η επιλογή του σπειράµατος παραµονής (holding coil) γίνεται έτσι ώστε, ο συνολικός αναρροφώµενος όγκος να µην υπερβαίνει το 1/4 του όγκου του σπειράµατος. Το όριο αυτό έχει τεθεί, για λόγους ασφαλείας, έτσι ώστε να µην επιτραπεί η είσοδος των ζωνών των αντιδραστηρίων, στη φιάλη του διαλύµατος του µεταφορέα ή στη σύριγγα. Η βαλβίδα πολλαπλής επιλογής θέσης είναι το κυριότερο τµήµα ενός αναλυτή SIA. Οι βαλβίδες που υπάρχουν στο εµπόριο έχουν 4, 6, 8, 10 ή και 12 θέσεις. Σηµαντική παράµετρος που καθορίζει την ποιότητα µιας βαλβίδας είναι ο «νεκρός» όγκος (dead volume). Ο όγκος αυτός επιδιώκεται να είναι ο µικρότερος δυνατός, διότι επηρεάζει τόσο την ακρίβεια των αναρροφώµενων όγκων των αντιδραστηρίων όσο και τη µη-ελεγχόµενη διασπορά των ζωνών τους. Από την άλλη µεριά όµως, ο µικρός «νεκρός» όγκος, δηµιουργεί πίεση στο σύστηµα και ενδεχοµένως συνεισφέρει στην ανάπτυξη φυσαλίδων.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 57 Για το λόγο αυτό, τα λογισµικά που συνοδεύουν τη λειτουργία τέτοιων συστηµάτων, είναι κατάλληλα προγραµµατισµένα, ώστε να αφήνουν χρονική περίοδο παύσης ενός δευτερολέπτου µεταξύ των λειτουργιών. Ως σύστηµα ανίχνευσης µπορεί να χρησιµοποιηθεί φασµατοφωτοµετρικός (UV- Vis), φθορισµοµετρικός ή ηλεκτροχηµικός ανιχνευτής αλλά και ανιχνευτής εγγύς υπερύθρου (near-infrared), χηµειοφωταύγειας και φασµατογράφος µάζας. Οι ανιχνευτές αυτοί, εκτός του φασµατογράφου µάζας, θα πρέπει να έχουν κυψελίδα συνεχούς ροής τέτοιων διαστάσεων, ώστε να µη δηµιουργούνται φυσαλίδες κατά την προώθηση των αντιδραστηρίων. 3.1.2. Αρχή λειτουργίας Η αρχή λειτουργίας του συστήµατος SIA είναι παρόµοια µε εκείνη της FIA. Βασίζεται στη διασπορά και στην αλληλεπικάλυψη των ζωνών του δείγµατος και του αντιδραστηρίου, µέσα σε ένα υγρό µεταφορέα. Το αντιδραστήριο επιλέγεται έτσι ώστε να αντιδρά εκλεκτικά µε την προσδιοριζόµενη ένωση του δείγµατος. Ακολουθώντας τα στάδια ενός κύκλου ανάλυσης µε αναλυτή SIA, αρχικά αναρροφούνται µε ακρίβεια συγκεκριµένοι όγκοι του δείγµατος και των αντιδραστηρίων και οδηγούνται στο σπείραµα παραµονής ως στοιβαγµένες ζώνες (σχήµα 3.2 Α). Σχήµα 3.2. Προφίλ ροής των ζωνών των αντιδραστηρίων [1]. Α) αναρρόφηση των ζωνών στο σπείραµα παραµονής, Β) αντιστροφή της ροής της αντλίας, Γ) αλληλεπικάλυψη των ζωνών κατά τη διέλευση µέσα από σπείραµα αντίδρασης.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 58 Με αντιστροφή της ροής της αντλίας, οι ζώνες του δείγµατος και του αντιδραστηρίου διεισδύουν η µια µέσα στην άλλη και αρχίζει να σχηµατίζεται η ζώνη του προϊόντος της αντίδρασης (σχήµα 3.2 Β). Κατά το στάδιο της προώθησης των διαλυµάτων προς τον ανιχνευτή, οι ζώνες του δείγµατος και των αντιδραστηρίων διασπείρονται λόγω ακτινικής και αξονικής διασποράς και εισχωρούν η µια µέσα στην άλλη, σχηµατίζοντας µια περιοχή αλληλεπικάλυψης. Στη περιοχή αυτή η προσδιοριζόµενη ένωση µετατρέπεται σε ανιχνεύσιµο προϊόν, το οποίο στη συνέχεια ανιχνεύεται διερχόµενο από τον ανιχνευτή (σχήµα 3.2 Γ). Η σειρά αναρρόφησης του δείγµατος και των αντιδραστηρίων καθώς και η διασπορά των ζωνών τους, αποτελούν κύριες παραµέτρους ενός αναλυτή SIA. Οι παράµετροι αυτές θα πρέπει να ελέγχονται µε τέτοιο τρόπο, ώστε να επιτυγχάνεται η µέγιστη διείσδυση των ζωνών µεταξύ τους, πράγµα που συνεπάγεται µεγαλύτερη ευαισθησία της µεθόδου. Όπως στη τεχνική FIA έτσι και στη SIA, η έκταση της διασποράς (dispersion) των ζωνών προσδιορίζει την ευαισθησία της µεθόδου. Ο συντελεστής διασποράς D ορίζεται όπως την εξίσωση [6]: o C D = (3.1) C όπου C o και C είναι η συγκέντρωση του δείγµατος κατά την στιγµή της έγχυσης και στον ανιχνευτή, αντίστοιχα. Ο συντελεστής διασποράς της ζώνης ενός δείγµατος εξαρτάται από τον αναρροφώµενο όγκο, το µήκος, την εσωτερική διάµετρο και την µορφολογία του σπειράµατος αντίδρασης καθώς και από την ταχύτητα ροής όγκου. Η τιµή του συντελεστή διασποράς ρυθµίζεται ανάλογα µε τη µέθοδο προσδιορισµού. Για παράδειγµα, επιτυγχάνεται οριακός συντελεστής διασποράς του δείγµατος (D ~ 1) σε µεθόδους µέτρησης ph ή αγωγιµότητας και µέσες τιµές (D = 2 10), σε µεθόδους φασµατοφωτοµετρίας φθορισµοµετρίας, χηµειοφωταύγειας, κ.ά. Βέβαια, υπάρχουν περιπτώσεις που απαιτείται εκτεταµένη αραίωση του δείγµατος, στις οποίες ο συντελεστής διασποράς είναι µεγαλύτερος του 10. Ο βαθµός διείσδυσης των ζωνών, P, (zone penetration) αποτελεί σηµαντικό µέγεθος που εκφράζει ποσοτικά το βαθµό αλληλεπικάλυψης των ζωνών. Στην περίπτωση ενός συστήµατος δυο ζωνών, ο ορισµός του βαθµού P γίνεται µε διάφορους τρόπους. Μπορεί να εκφραστεί ως ο λόγος του εύρους της ζώνης της επικάλυψης, W o, προς εκείνο

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 59 του δείγµατος, W S (εξίσωση (3.2)). Επίσης, µπορεί να εκφραστεί ανάλογα µε τη διακριτική ικανότητα (resolution) στη χρωµατογραφία (εξίσωση (3.3)) [6]: P W W o = (3.2) S 2 Wo P = W + W S R (3.3) όπου W o, Ws και W R είναι τα πλάτη των ζωνών της επικάλυψης, του δείγµατος και του αντιδραστηρίου αντίστοιχα (σχήµα 3.3). Όσον αφορά την εξίσωση (3.3), για τιµή βαθµού διείσδυσης P = 1, παρατηρείται πλήρης αλληλεπικάλυψη των ζωνών, ενώ για P = 0, οι ζώνες δεν επικαλύπτονται. Για ενδιάµεση τιµή, 0 < P < 1, υπάρχει µερική επικάλυψη. Τέλος, ο βαθµός διείσδυσης µπορεί να εκφραστεί και µε βάση το εµβαδό των κορυφών που επικαλύπτονται, αντί του εύρους κορυφής. Σχήµα 3.3. Αλληλεπικάλυψη των ζωνών δείγµατος αντιδραστηρίου [6]. Όπου W o, W s και W R είναι τα πλάτη των ζωνών της επικάλυψης, του δείγµατος και του αντιδραστηρίου, αντίστοιχα και Ι D είναι το σηµείο ισοδιασποράς. Σε περιπτώσεις µερικής επικάλυψης, όπως εκείνη του σχήµατος 3.3, το µέγιστο της κορυφής της ζώνης που αλληλεπικαλύπτεται ονοµάζεται σηµείο ισοδιασποράς I D (isodispersion point). Στο σηµείο αυτό οι επιµέρους τιµές διασποράς του δείγµατος και του αντιδραστηρίου είναι ίσες:

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 60 D = C = C (3.4) o R R S DR o CS CS Όταν οι συγκεντρώσεις του δείγµατος και του αντιδραστηρίου είναι ίσες, τότε το σηµείο I D αντιστοιχεί στη µέγιστη συγκέντρωση του προϊόντος της αντίδρασης και συνεπώς στο µέγιστο της λαµβανόµενης κορυφής. Στην πράξη όµως, η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου είναι πολύ µεγαλύτερη από εκείνη της ένωσης του δείγµατος, µε αποτέλεσµα η θέση του µεγίστου της κορυφής να µετατοπίζεται προς το κέντρο της ζώνης του δείγµατος. 3.1.3. Αναχαίτιση της ροής Η αναχαίτιση της ροής (stop-flow) είναι µια από τις σηµαντικότερες λειτουργίες ενός συστήµατος SIA. Σκοπός της είναι να δοθεί χρόνος στην αντίδραση να εξελιχθεί. Συνέπεια αυτού είναι ο σχηµατισµός µεγαλύτερης ποσότητας προϊόντος της αντίδρασης και συνεπώς αύξηση της ευαισθησίας της µεθόδου. Η αναχαίτιση της ροής µπορεί να γίνει πριν ή µέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή [4]. Όταν πραγµατοποιείται πριν τον ανιχνευτή, αυξάνεται ο χρόνος της αντίδρασης, ενώ παράλληλα αποφεύγονται οι φωτοχηµικές επιδράσεις της ακτινοβολίας του ανιχνευτή στο χηµικό σύστηµα. Από την άλλη µεριά, η αναχαίτιση της ροής στον ανιχνευτή χρησιµοποιείται κυρίως όταν έχουµε αργές αντιδράσεις. Αυτή πραγµατοποιείται µε την παγίδευση της αλληλεπικαλυπτόµενης ζώνης µέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή. Έτσι, είναι δυνατή η παρακολούθηση της ταχύτητας της αντίδρασης κατά το στάδιο αναχαίτισης της ροής, όπου η µεταβολή του σήµατος ως προς το χρόνο καθορίζεται από την ταχύτητα της χηµικής αντίδρασης. Η αναχαίτιση της ροής στην κυψελίδα του ανιχνευτή θα πρέπει να γίνεται σε καθορισµένο και αυστηρώς επαναλήψιµο τρόπο, ώστε να παγιδεύεται κάθε φορά το ίδιο τµήµα της ζώνης. Στο σχήµα 3.4 εικονίζονται τρεις καµπύλες απόκρισης του ανιχνευτή µε την έγχυση διαφορετικών όγκων δείγµατος. Τελευταία έχουν αναπτυχθεί ειδικά λογισµικά, που συνοδεύουν τη λειτουργία των συστηµάτων SIA, στα οποία η αναχαίτιση της ροής επιτυγχάνεται µε την εισαγωγή ενός επιπλέον σταδίου στο πρόγραµµα ροής ενός κύκλου ανάλυσης.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 61 Σχήµα 3.4. Καµπύλες απόκρισης του ανιχνευτή µε έγχυση τριών διαφορετικών όγκων δείγµατος [7]. 3.1.4. Βελτιστοποίηση µιας µεθόδου SIA Κατά την ανάπτυξη µιας άµεσης µεθόδου προσδιορισµού µε αναλυτή SIA, οι κύριες παράµετροι, οι οποίες µελετώνται διακρίνονται σε δυο κατηγορίες: Α) Χηµικές παράµετροι. Στην κατηγορία αυτή περιλαµβάνονται όλες οι παράµετροι που επηρεάζουν τη χηµική διεργασία, όπως η συγκέντρωση του κάθε αντιδραστηρίου, η ιονική ισχύς και η τιµή ph των διαλυµάτων, ο χρόνος που απαιτείται για την χηµική διεργασία σε ροή (αναχαίτιση της ροής), η θερµοκρασία, κ.ά. Β) Γεωµετρικές παράµετροι. Σ αυτή την οµάδα παραµέτρων περιλαµβάνονται οι αναρροφώµενοι όγκοι των αντιδραστηρίων, η ταχύτητα ροής όγκου αναρρόφησης και προώθησης προς τον ανιχνευτή, το µήκος και η διάµετρος του σπειράµατος αντίδρασης.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 62 3.1.5. Πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα της τεχνικής SIA Η τεχνική SIA, όπως και κάθε αυτοµατοποιηµένη τεχνική, πλεονεκτεί έναντι των συµβατικών µεθόδων σε ότι αφορά τον αυτοµατισµό, την ταχύτητα ανάλυσης και τα σφάλµατα που υπεισέρχονται λόγω του ανθρώπινου παράγοντα. Εκτός από αυτά, η τεχνική SIA πλεονεκτεί έναντι της FIA στα παρακάτω: δεν απαιτεί πολύπλοκα συστήµατα µίξης των αντιδραστηρίων. Η ανάµιξη τους γίνεται σε ένα κανάλι ροής µε τη βοήθεια της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής θέσης η ίδια ακριβώς διάταξη µπορεί να χρησιµοποιηθεί για ένα µεγάλο αριθµό διαφορετικών αναλύσεων, µεταβάλλοντας απλά το πρόγραµµα ροής ενός κύκλου ανάλυσης δεν απαιτείται αλλαγή της διάταξης κατά το στάδιο βελτιστοποίησης της µεθόδου η κατανάλωση των αντιδραστηρίων είναι πολύ µικρότερη από εκείνη της FIA έχει τη δυνατότητα να πραγµατοποιεί ταυτόχρονα διαφορετικούς αναλυτικούς προσδιορισµούς, αφού διάφορα αντιδραστήρια, µηχανικά τµήµατα και ανιχνευτές µπορούν να συνδεθούν σε κάθε θέση της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής Εκτός από τα πλεονεκτήµατά της, η τεχνική SIA υστερεί στο ότι: έχει µικρότερη συχνότητα δειγµατοληψίας από τη FIA προϋποθέτει έλεγχο από ηλεκτρονικό υπολογιστή για τη σωστή λειτουργίας της 3.1.6. Αναλυτής SIA µε έγχυση σφαιρικών σωµατιδίων Ο τύπος αυτός SIA αποτελεί µια πιο εξελιγµένη µορφή και αποτελεί την τρίτη γενιά των αυτοµατοποιηµένων τεχνικών µε έγχυση του δείγµατος σε ροή. Ονοµάζεται ανάλυση µε έγχυση σφαιρικών σωµατιδίων (bead injection analysis, BIA) και βασική διαφορά µε την κλασσική SIA είναι, ότι το αντιδραστήριο βρίσκεται δεσµευµένο στη επιφάνεια σφαιρικών σωµατιδίων [4, 7, 8]. Πρώτα εγχύεται στο ρεύµα του µεταφορέα συγκεκριµένος όγκος από µικροσφαίρες, στην επιφάνεια των οποίων βρίσκεται ακινητοποιηµένο το αντιδραστήριο. Τα σωµατίδια αυτά δεσµεύονται σε µια ειδική κυψελίδα συγκράτησης µέσα στον ανιχνευτή, ενώ στη συνέχεια ακολουθεί η έγχυση του δείγµατος, το οποίο διέρχεται µε τη σειρά του µέσα από την κυψελίδα του ανιχνευτή (σχήµα 3.5). Η προσδιοριζόµενη ουσία

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 63 αντιδρά µε το αντιδραστήριο που βρίσκεται ακινητοποιηµένο στην επιφάνεια των µικροσφαιρών και το προϊόν της αντίδρασης ανιχνεύεται µε κατάλληλο ανιχνευτή. Μετά το τέλος της µέτρησης οι µικροσφαίρες απορρίπτονται. Σχήµα 3.5. Τυπική οργανολογική διάταξη ενός αναλυτή ΒIA. 3.1.7. Εφαρµογές της SIA Η τεχνική της SIA βρίσκει εφαρµογή τόσο στην έρευνα όσο και σε αναλύσεις ρουτίνας. Οι σηµαντικότερες εφαρµογές της αφορούν τους τοµείς [9]: τροφίµων και ποτών ελέγχου διαφόρων βιο-διαδικασιών (bioprocess monitoring) της βιοανάλυσης και ανοσοανάλυσης της φαρµακευτικής ανάλυσης της περιβαλλοντολογικής ανάλυσης της χηµειοµετρίας

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 64 3.2. Η τεχνική SIA στην αυτοµατοποιηµένη προκατεργασία και ανάλυση δείγµατος Σηµαντικό πλεονέκτηµα ενός αναλυτή SIA είναι ότι έχει τη δυνατότητα προσαρµογής διαφόρων διατάξεων (ανιχνευτές, αντλίες, ειδικές κυψέλες, στήλες, κ.ά.) σε κάθε θέση της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής συνδυάζοντας µε αυτό τον τρόπο µια ευρεία γκάµα από διαδικασίες σε ροή. Έτσι µπορεί να αποτελέσει άριστο «εργαλείο» για το χειρισµό και την αυτοµατοποιηµένη προκατεργασία δειγµάτων πριν το στάδιο του διαχωρισµού [10]. Εκτός από τους άµεσους προσδιορισµούς, µερικές από τις τεχνικές που µπορούν να εφαρµοστούν σ έναν αναλυτή SIA αναφέρονται µε λεπτοµέρεια στις παρακάτω ενότητες. 3.2.1. Αραίωση του δείγµατος Η αραίωση του δείγµατος σε ροή (on-line dilution) αποτελεί ίσως την πιο απλή διαδικασία που µπορεί να επιτευχθεί µε το σύστηµα SIA. Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στη χρήση ενός επιπλέον τµήµατος (σπείραµα αραίωσης) το οποίο έχει συνδεθεί σε µια από τις θέσεις της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής. Η αραίωση του δείγµατος σε ροή µπορεί να επιτευχθεί µε διάφορους τρόπους. Ο πιο απλός τρόπος κάνει χρήση ενός σπειράµατος αραίωσης (dilution coil) συνδεδεµένο µε τη βαλβίδα πολλαπλής επιλογής θέσης. Το αναρροφώµενο δείγµα οδηγείται αρχικά στο σπείραµα παραµονής και στη συνέχεια προωθείται στο σπείραµα αραίωσης και τέλος αναρροφάται ξανά στο σπείραµα παραµονής (σχήµα 3.6). Η διαδικασία αυτή προκαλεί αύξηση του συντελεστή διασποράς του δείγµατος, ο οποίος εξαρτάται από το µήκος και τη διάµετρο του σπειράµατος αραίωσης [11]. Άλλος τρόπος αραίωσης είναι µε τη χρήση θαλάµου µίξης (mixing chamber). Στην περίπτωση αυτή, ο θάλαµος µίξης έχει πληρωθεί µε νερό και είναι συνδεδεµένος µε τη βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Το δείγµα κατά τη διέλευση µέσα από το θάλαµο αραιώνεται στον επιθυµητό βαθµό. Ο όγκος του θαλάµου µίξης καθορίζει και τη διασπορά και συνεπώς την αραίωση του δείγµατος [12].

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 65 Σχήµα 3.6. ιάταξη ενός αναλυτή SIA για αραίωση του δείγµατος σε ροή [11]. Η αραίωση του δείγµατος σε ροή χρησιµοποιείται σε περιπτώσεις, όπου η συγκέντρωση της προσδιοριζόµενης ένωσης στο δείγµα, βρίσκεται εκτός της καµπύλης αναφοράς. Επίσης, έχει χρησιµοποιηθεί για τη χάραξη καµπύλης αναφοράς µε τη χρήση ενός προτύπου διαλύµατος. 3.2.2. ιάχυση αερίων και διαπίδυση Όπως αναφέρθηκε σε προηγούµενο κεφάλαιο, η διάχυση αερίων (gas diffusion) και η διαπίδυση (dialysis) χρησιµοποιούνται τόσο για το διαχωρισµό ενώσεων από πολύπλοκα υποστρώµατα όσο και για την αραίωση του δείγµατος. Το σύστηµα της διάχυσης αερίων αποτελείται από µια µεµβράνη η οποία προσαρµόζεται ανάµεσα στο κανάλι του δότη και του δέκτη. Ανάλογα µε τον τύπο της, η µεµβράνη επιτρέπει την διέλευση αερίων και σχετικά µικρού µεγέθους µορίων. Η σύνδεση ενός συστήµατος διάχυσης αερίων µε τη διάταξη SIA γίνεται µε απλό τρόπο. Έτσι, σε δυο διαφορετικές θέσεις της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής προσαρµόζονται τα επιµέρους τµήµατα του συστήµατος της διάχυσης αερίων και επιπλέον το κανάλι του δέκτη συνδέεται µε τον ανιχνευτή (σχήµα 3.7).

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 66 Σχήµα 3.7. ιάταξη ενός αναλυτή SIA συζευγµένου µε σύστηµα διάχυσης αερίων σε ροή [13]. Το δείγµα αναρροφάται στο σπείραµα παραµονής, προωθείται στο ρεύµα του δότη και ακινητοποιείται στην περιοχή της µεµβράνης για ορισµένο χρονικό διάστηµα. Οι πτητικές και οι µικρού µεγέθους ενώσεις διαπερνούν τη µεµβράνη και εισέρχονται στο ρεύµα του δέκτη. Στην συνέχεια ανιχνεύεται η προσδιοριζόµενη ένωση µε προώθηση του δέκτη προς τον ανιχνευτή. Η τεχνική της διαπίδυσης βασίζεται στην ίδια περίπου λειτουργία µε τη διάχυση αερίων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ο συνδυασµός δύο τεχνικών προκατεργασίας, όπως για παράδειγµα της αραίωσης του δείγµατος και της διαπίδυσης. Στη περίπτωση αυτή απαιτούνται δυο αναλυτές SIA εκ των οποίων ο ένας «χειρίζεται» το κανάλι του δότη και ο δεύτερος το κανάλι του δέκτη [14]. Η εισαγωγή επιπλέον διατάξεων και συστηµάτων έχει ως αποτέλεσµα τη βελτίωση της ευελιξίας της µεθόδου, ενώ παράλληλα η όλη διάταξη καθίσταται περισσότερο πολύπλοκη. 3.2.3. Εκχύλιση υγρού-υγρού, αέριου-υγρού και στερεάς φάσης Κατά καιρούς έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες για αυτοµατοποίηση της εκχύλισης υγρούυγρού χρησιµοποιώντας την τεχνική FIA. Οι µέθοδοι αυτές βασίζονται στη συγχώνευση δυο µη-αναµειγνυόµενων υγρών, εκ των οποίων το ένα περιλαµβάνει το δείγµα και το άλλο είναι ο διαλύτης εκχύλισης. Το µίγµα των δυο υγρών εισέρχεται σε σύστηµα µε µεµβράνη, όπου διαχωρίζονται οι δυο φάσεις και στη συνέχεια το εκχυλιζόµενο συστατικό

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 67 προωθείται στον ανιχνευτή. Σηµαντικά µειονεκτήµατα της τεχνικής εκχύλισης µε σύστηµα FIA είναι η δυσκολία του διαχωρισµού των µη-αναµειγνυόµενων υγρών και η µικρή ανάκτηση της διαδικασίας εκχύλισης [15, 16]. Η εκχύλιση υγρού-υγρού µε αναλυτή SIA, είναι πιο απλή διαδικασία και βασίζεται σε µια λεπτή, ψευδοστατική, οργανική επιφάνεια, η οποία σχηµατίζεται στα τοιχώµατα των σωλήνων Teflon λόγω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Ο οργανικός διαλύτης και το υδατικό διάλυµα του δείγµατος, αναρροφώνται διαδοχικά στο σπείραµα εκχύλισης (extraction coil) ενώ ανάµεσα στις δυο ζώνες παρεµβάλλεται ένα τµήµα αέρα (σχήµα 3.8). Σχήµα 3.8. Εκχύλιση υγρού-υγρού µε τη βοήθεια αναλυτή SIA [16]. Η προσδιοριζόµενη ένωση µεταφέρεται από την υδατική στην οργανική φάση, λόγω διαφορετικής ταχύτητας ροής όγκου των δύο φάσεων και της ιδιότητας των οργανικών διαλυτών να σχηµατίζουν λεπτές και σταθερές επιφάνειες στα τοιχώµατα των σωλήνων Teflon. Στη συνέχεια µε αντιστροφή της ροής η εκχυλιζόµενη ένωση προωθείται στον ανιχνευτή. Μερικά από τα πλεονεκτήµατα της εκχύλισης υγρού-υγρού µε αναλυτή SIA, είναι η σχετικά µεγάλη απόδοση, η ελάχιστη κατανάλωση οργανικών διαλυτών και η δυνατότητα αυτοµατοποίησης. Ο αναλυτής SIA µπορεί να χρησιµοποιηθεί για αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση αέριου-υγρού πριν από την ανάλυση µε φασµατοµετρία ατοµικής απορρόφησης µε γεννήτρια υδριδίων. Όπως φαίνεται και από το σχήµα 3.9, η εκχύλιση επιτυγχάνεται µέσα

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 68 σε µια ειδικά κατασκευασµένη κυψέλη (σχήµα 3.9 Α). Μετά τη διαδικασία εκχύλισης, το εκχύλισµα που προκύπτει οδηγείται στον ανιχνευτή µε τη βοήθεια ρεύµατος αδρανούς αερίου. Σχήµα 3.9. Εκχύλιση αέριου-υγρού µε αναλυτή SIA πριν από ανάλυση µε φασµατοµετρία ατοµικής απορρόφησης [17]. Μια από τις πιο ευρέως διαδεδοµένες αυτοµατοποιηµένες τεχνικές προκατεργασίας του δείγµατος αποτελεί η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE). Όπως προαναφέρθηκε, στόχος της εκχύλισης SPE, είναι αφενός µεν ο «καθαρισµός» του δείγµατος από ενώσεις που παρεµποδίζουν και αφετέρου η προσυγκέντρωση του προσδιοριζόµενου συστατικού. Έχουν αναπτυχθεί δυο µεθοδολογίες εκχύλισης SPE µε αναλυτή SIA. Η πρώτη έχει περιγραφεί λεπτοµερώς στην ενότητα 3.1.5 και περιλαµβάνει την έγχυση ορισµένης ποσότητας µικροσφαιρών στο σύστηµα ροής. Στην επιφάνεια των µικροσφαιρών αυτών επιτυγχάνεται η εκχύλιση του δείγµατος. Η δεύτερη µεθοδολογία στηρίζεται στη χρήση µικροστήλης SPE η οποία είναι συνδεδεµένη µε µια από τις θέσεις της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής. Το δείγµα αναρροφάται αρχικά στο σπείραµα παραµονής και στην συνέχεια προωθείται στη µικροστήλη όπου δεσµεύεται από αυτή. Με πλύση της µικροστήλης µε µια σειρά διαλυτών, αποµακρύνονται οι ενώσεις που παρεµποδίζουν. Τέλος, µε κατάλληλο διαλύτη, η προσδιοριζόµενη ένωση εκλούεται και στην συνέχεια ανιχνεύεται ή οδηγείται για περαιτέρω επεξεργασία ή ανάλυση µε άλλη τεχνική.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 69 Η εκχύλιση SPE µε αναλυτή SIA µπορεί να λειτουργήσει ως αυτόνοµη τεχνική για την προσυγκέντρωση και τον προσδιορισµό διαφόρων ενώσεων τόσο σε απλά, όσο και σε πολύπλοκα δείγµατα [19-21]. Στο σχήµα 3.10 εικονίζεται η αυτοµατοποιηµένη εκχύλιση και ανάλυση µιας ένωσης µε αναλυτή SIA. Σχήµα 3.10. Εκχύλιση SPE και ανάλυση µε την τεχνική SIA [21]. Επίσης µπορεί να αποτελέσει στάδιο προκατεργασίας δείγµατος πριν την ανάλυση µε άλλες τεχνικές, π.χ. υγρή χρωµατογραφία, επαγωγικά συζευγµένο πλάσµα (ICP), φασµατοφωτοµετρία ατοµικής απορρόφησης µε φούρνο θερµαινόµενου γραφίτη (ETAAS), κ.ά. Στο σχήµα 3.11 εικονίζεται η αυτοµατοποιηµένη SPE µε αναλυτή SIA πριν το διαχωρισµό µε υγρή χρωµατογραφία [18].

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 70 Σχήµα 3.11. Εκχύλιση SPE µε αναλυτή SIA πριν από το διαχωρισµό µε υγρή χρωµατογραφία [18]. Σηµαντικό πλεονέκτηµα της αυτοµατοποιηµένης SPE, µε αναλυτή SIA, είναι ότι η διαδικασία της εκχύλισης γίνεται σε χαµηλή πίεση. Για το λόγο αυτό, το υλικό πλήρωσης της µικροστήλης αποτελείται είτε από µονολιθικό υλικό είτε από σωµατίδια µεγαλύτερου µεγέθους από εκείνα της στήλης HPLC. Το είδος του υλικού πλήρωσης ποικίλει, ανάλογα µε τη φύση της ένωσης και για παράδειγµα µπορεί να είναι τροποποιηµένο C 18, ενεργοποιηµένη αλουµίνα (Al 2 O 3 ), υλικά περιορισµένης πρόσβασης, πολυµερή µοριακής αποτύπωσης, κ.ά. 3.2.4. Ενζυµικές αντιδράσεις Οι ενζυµικές αντιδράσεις σε ροή πραγµατοποιούνται συνήθως µε τη χρήση αναλυτή SIA. Η λειτουργία τους βασίζεται στη χρήση ενός κατάλληλου στερεού υλικού, στην επιφάνεια του οποίου έχει ακινητοποιηθεί το ένζυµο (ενζυµικός αντιδραστήρας). Ο αντιδραστήρας αυτός µπορεί να συνδεθεί σε µια από τις θέσεις της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής, είτε στο σπείραµα παραµονής. Έτσι στην πρώτη περίπτωση το αναρροφώµενο δείγµα οδηγείται αρχικά στο σπείραµα αντίδρασης και στη συνέχεια προωθείται στο σπείραµα,

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 71 όπου λαµβάνει χώρα η ενζυµική αντίδραση. Στη δεύτερη περίπτωση, η ενζυµική αντίδραση πραγµατοποιείται µε την αναρρόφηση του δείγµατος στο σπείραµα παραµονής. Οι ενζυµικοί αντιδραστήρες είναι κατάλληλοι για την απευθείας µέτρηση οργανικών ενώσεων οι οποίες δρουν ως υπόστρωµα στις ενζυµικές αντιδράσεις. 3.2.5. Ανοσοχηµικές αντιδράσεις Η τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος χρησιµοποιείται ευρέως στις αυτοµατοποιηµένες ανοσοχηµικές αντιδράσεις. Ωστόσο, η πλέον κατάλληλη τεχνική, γι αυτού του είδους αντιδράσεων, είναι η τεχνική της έγχυσης σφαιρικών σωµατιδίων (BIA) (βλέπε ενότητα 3.1.5), διότι επιτρέπει την παρακολούθηση της αντίδρασης. Η αρχή λειτουργίας της βασίζεται στην αλληλεπίδραση της προσδιοριζόµενης ένωσης µε τα χηµικώς τροποποιηµένα σφαιρικά σωµατίδια. Στην επιφάνεια των σωµατιδίων έχει ακινητοποιηθεί ένα βιοειδικό µόριο (π.χ. αντίσωµα) το οποίο αλληλεπιδρά εκλεκτικά µ ένα από τα συστατικά του δείγµατος. Αρχικά, στο σύστηµα εγχύεται µια ορισµένη ποσότητα σωµατιδίων, τα οποία οδηγούνται σε µια ειδική κυψελίδα συνεχούς ροής στον ανιχνευτή και συγκρατούνται εκεί µε φυσικό τρόπο. Στη συνέχεια, εγχύεται το δείγµα το οποίο περιέχει την προσδιοριζόµενη ένωση και µια ένωση-ανταγωνιστή, η οποία φέρει την ίδια οµάδα «αναγνώρισης» µε το προσδιοριζόµενο συστατικό. Με τη διέλευση του δείγµατος µέσα από την κυψελίδα, η ένωση-ανταγωνιστής και η προσδιοριζόµενη ουσία ανταγωνίζονται τις θέσεις δέσµευσης στην επιφάνεια των σωµατιδίων. Σχήµα 3.12. Ανοσοχηµικός προσδιορισµός µε αναλυτή SIA µε έγχυση σφαιρικών σωµατιδίων [22].

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 72 Τέλος, µε κατάλληλο σύστηµα ανίχνευσης, µετράται η ποσότητα της αδέσµευτης ή της δεσµευµένης ένωσης-ανταγωνιστή και µε βάση αυτήν υπολογίζεται η συγκέντρωση του συστατικού στο δείγµα. Μια διαφορετική προσέγγιση ανοσοποίησης µε την τεχνική SIA είναι η χρήση µαγνητικών σωµατιδίων (magnetic beads) στην επιφάνεια των οποίων βρίσκεται ακινητοποιηµένο το αντίσωµα. Η αρχή λειτουργίας είναι παρόµοια µε αυτή που περιγράφθηκε παραπάνω, µε τη διαφορά, ότι τα µαγνητικά σφαιρίδια συγκρατούνται µε την επίδραση εξωτερικού ηλεκτροµαγνητικού πεδίου στο σπείραµα αντίδρασης. Το δείγµα µε τη διέλευσή του µέσα από το σπείραµα αλληλεπιδρά µε το αντίσωµα, ενώ µετά το τέλος της ανάλυσης τα σωµατίδια απορρίπτονται µε διακοπή του ηλεκτροµαγνητικού πεδίου [23]. 3.2.6. Αντίδραση παραγωγοποίησης και εισαγωγή δείγµατος στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση Η τεχνική SIA µπορεί να χρησιµοποιηθεί για αυτοµατοποιηµένη παραγωγοποίηση του δείγµατος σε ροή και απευθείας εισαγωγή του προϊόντος αντίδρασης, στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Κύριο τµήµα της σύνδεσης των δυο τεχνικών, αποτελεί η διάταξη του συνδέσµου (interface) µεταξύ τους. Στη αρχή αναρροφώνται διαδοχικά το δείγµα και το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης και οδηγούνται στο σπείραµα παραµονής. Κατά την προώθηση του µίγµατος προς τη διάταξη του συνδέσµου, οι δυο ζώνες των αντιδραστηρίων αλληλεπικαλύπτονται και το προϊόν της αντίδρασης εισάγεται στο σύστηµα της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης για περαιτέρω διαχωρισµό. Στο σχήµα 3.13 εικονίζεται η διάταξη σύνδεση της τεχνικής SIA µε την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Περισσότερες λεπτοµέρειες της συνδεσµολογίας αναφέρονται στην ενότητα 5.1.2.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 73 Σχήµα 3.13. Παραγωγοποίηση σε ροή µε τη βοήθεια αναλυτή SIA συζευγµένου µε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση [24]. 3.2.7. ιαχωρισµός µίγµατος ενώσεων Η τεχνική SIA είναι µια µη-διαχωριστική τεχνική, µε αποτέλεσµα να χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό µιας ένωσης ή µίγµατος δυο ενώσεων. Ένα βασικό ερώτηµα που προκύπτει είναι, αν ένας αναλυτής SIA µπορεί να πραγµατοποιήσει διαχωρισµούς. Απάντηση στο ερώτηµα αυτό έδωσε η ερευνητική οµάδα του D. Satinsky [25] µε τη σύνδεση της διάταξης SIA µε µονολιθική στήλη διαχωρισµού. Η οργανολογική διάταξη που χρησιµοποιήθηκε είναι όµοια µ εκείνη του σχήµατος 3.10. µε τη διαφορά ότι αντί της µικροστήλης SPE υπήρχε µονολιθική στήλη. Το δείγµα αναρροφάται στο σπείραµα παραµονής και στη συνέχεια προωθείται στη µονολιθική στήλη, όπου επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός των ενώσεων. Το διάλυµα του µεταφορέα αποτελεί την κινητή φάση. Σηµειώνεται, ότι η συγκεκριµένη διάταξη µπορεί να επιτύχει διαχωρισµό µόνο µε ισοκρατική έκλουση και αυτός είναι ένας πολύ σηµαντικός περιορισµός της παρούσας σχεδίασης. Βαθµιδωτή έκλουση µπορεί να επιτευχθεί µε τη χρήση δύο ανεξάρτητων αντλιών, η ταχύτητα των οποίων καθορίζει το πρόγραµµα της έκλουσης. Η βαθµιδωτή έκλουση µε αναλυτή SIA δεν έχει επιτευχθεί ακόµα και ίσως αποτελέσει µελλοντικό θέµα µελέτης.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 74 3.2.8. Προσυγκέντρωση σε ηλεκτρόδιο Μια ξεχωριστή εφαρµογή της τεχνικής της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος είναι η σύζευξή της µε ηλεκτροχηµικές τεχνικές. Στην περίπτωση αυτή, η προσδιοριζόµενη ένωση προσυγκεντρώνεται πάνω σε κατάλληλο ηλεκτρόδιο και µετράται ταυτόχρονα µε βολταµµετρικό ανιχνευτή. Στο σχήµα 3.14 εικονίζεται η σύνδεση ενός αναλυτή SIA µε βολταµµετρικό ανιχνευτή. Σχήµα 3.14. Προσυγκέντρωση µε αναλυτή SIA συζευγµένου µε βολταµµετρικό ανιχνευτή [26]. 3.2.9. Πέψη µε λυχνία UV ή µε µικροκύµατα Ο αναλυτής SIA µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την πέψη του δείγµατος σε ροή (on-line digestion) µε ακτινοβολία ή µε µικροκύµατα. Στην περίπτωση αυτή χρησιµοποιείται ένα σπείραµα αντίδρασης, το οποίο έχει περιτυλιχθεί σε κατάλληλο σωλήνα και βρίσκεται µέσα σε διάταξη µε λυχνία UV ή µε µικροκύµατα. Στο σχήµα 3.15 φαίνεται η διάταξη πέψης µε λυχνία UV σε ροή.

Κεφάλαιο 3 ο. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή 75 Σχήµα 3.15. Σύζευξη συστήµατος πέψης σε ροή µε αναλυτή SIA [27]. Η φωτο-οξείδωση της προσδιοριζόµενης ένωσης λαµβάνει χώρα µε την προώθηση του δείγµατος προς τον ανιχνευτή.