7 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Χειμερινό Ακαδημαϊκό Εξάμηνο 2016_17 Αμανατιάδου Π. Έλσα, PhD eamanat@pharm.auth.gr Κυτταροκαλλιέργειες: Σχεδιασμός πειραμάτων με τη χρήση κυτταροκαλλιεργειών - Παραδείγματα
ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ: Σαφής διατύπωση του ερευνητικού ερωτήματος (!) Επιλογή μοντέλου- συγκριτικών μοντέλων (κριτήρια) Ορισμός μεταβλητών παραμέτρων πειράματος (π.χ. χρονοεξαρτώμενη/ δοσοεξαρτώμενη επίδραση) Καλλιέργειες αναφοράς (ενσωμάτωση θετικών και αρνητικών προτύπων αναφοράς) Κυτταρική ανάλυση, Μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται σε σύζευξη με την καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων για την παρατήρηση του αποτελέσματος (όπως οπτική παρατήρησηφαινότυπος, μεταβολή της κυτταρικής ανάπτυξης-θανάτου, απομόνωση DNA/RNA/πρωτεϊνικών δειγμάτων και μοριακή ανάλυση κ.ά.) Επαναληψιμότητα πειραμάτων, Βιολογικές/τεχνικές επαναλήψεις, Στατιστική ανάλυση διαφορών 2/14
2 Βασικά κριτήρια επιλογής πειραματικού μοντέλου όπως: Είδος προέλευσης (π.χ. άνθρωπος, ποντίκι) Προσομοίωση του ιστού προέλευσης (π.χ. φαινοτυπικά χαρακτηριστικά κυττάρων, βαθμός διαφοροποίησης, προφίλ γονιδιακής έκφρασης) Διαθεσιμότητα μοντέλου Επαρκής χαρακτηρισμός Συνεχής ή μη κυτταρική σειρά Φυσιολογικά ή μεταμορφωμένα κύτταρα (φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα ή συνεχή κυτταρική σειρά μεταμορφωμένων κυττάρων) - Συγκριτικές μελέτες (π.χ. καρκινική σε σχέση με αντίστοιχη φυσιολογική κυτταρική σειρά) - Έκφραση φυσιολογικών ή μεταλλαγμένων μορφών των μακρομορίων ενδιαφέροντος-μελέτης, αντίστοιχα μονοπάτια ενδοκυττάριας σηματοδότησης Επιδεκτικότητα χειρισμών (π.χ. χαρακτηριστικά ανάπτυξης, ευκολία μετασχηματισμού) Η ίδια κυτταρική σειρά σε άλλο πείραμα μπορεί να εξυπηρετεί διαφορετικό ερευνητικό σκοπό 3/14
Cell growth (x 10⁴ cells/ml) Cell death (% trypan blue + cells) 6 Γραφήματα κυτταρικής ανάπτυξης- κυτταρικού θανάτου Παράδειγμα: Επίδραση φαρμάκου ετοποσίδη σε λευχαιμικά κύτταρα ΜΕL MEL MEL MEL + Drug MEL + Drug 24 48 72 96 24 48 72 96 Time (hrs) Time (hrs) 4/14
6 Ερμηνεία αποτελεσμάτων.. Επιδρά το φάρμακο στα κύτταρα στη συγκεκριμένη συγκέντρωση?? Είναι χρονοεξαρτώμενη η επίδρασή του?? Περιορίζει το φάρμακο τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό?? Έχει το φάρμακο κυτταροτοξική δράση?? Σε ποια φάση της καμπύλης ανάπτυξης είναι περισσότερο ορατή η επίδραση?? Πιθανός μηχανισμός δράσης..?? 5/14
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ: ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΛΕΥΧΑΙΜΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Κύτταρα Κ562 (ανθρώπινα, χρόνια μυελογενή λευχαιμία) http://www.addexbio.com/productdetail?pid=52 Φ1 Φ2 Φ3 καλλιέργεια αναφοράς (control) (10 ⁹-10 ³M) (10 ⁹-10 ³M) (10 ⁹-10 ³M) Μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης μετά από 48hrs Η επίδραση των διαφορετικών φαρμάκων στην κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε με αιμοκυτταρόμετρο: υπολογισμός % κυτταρικής ανάπτυξης και προσδιορισμός IC50 για κάθε Φ 6/14
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Κύτταρα Κ562 (1ml καλλιέργειας, Cαρχ = 10⁵κύτταρα/ml) επωάστηκαν σε 24well plate για 48ώρες με τα φάρμακα Ετοποσίδη, Μεθοτρεξάτη, Κυταραβίνη (Ara-C). Καλλιέργειες που δεν προστέθηκε φάρμακο αποτελούν τις καλλιέργειες αναφοράς Χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένες συγκεντρώσεις των φαρμάκων σε κλίμακα 10 ⁹ - 10 ³ M Στο χρονικό σημείο 48 ωρών μετράται ο αριθμός των κυττάρων κάθε καλλιέργειας με τη βοήθεια αιμοκυτταρόμετρου Γίνονται γραφικές παραστάσεις της % κυτταρικής ανάπτυξης για κάθε καλλιέργεια σε σχέση με τις διαφορετικές συγκεντρώσεις των Φ που χρησιμοποιήθηκαν Υπολογισμός της IC₅₀ για κάθε φάρμακο (IC: Inhibitory Concentration, συγκέντρωση Φ που προκαλεί αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης κατά 50%) 7/14
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Φ1 Φ1 Φ1 10 9M Φ1 Φ1 Φ1 10 8M Φ1 Φ1 Φ1 10 7M 10 9M 10 7M 10 9M 10 8M 10 8M 10 7M Φ1 Φ1 Φ1 10 6M 10 6M 10 6M Φ1 Φ1 Φ1 10 5M Φ1 Φ1 Φ1 10 4M Φ1 Φ1 Φ1 10 3M 10 5M 10 4M 10 3M 10 5M 10 4M 10 3M cntr cntr cntr Πειραματικός σχεδιασμός: 24 well plate (1ml καλλιέργειας, Cαρχ=10⁵ κυτ/ml) από την stock καλλιέργεια με εφαρμογή του τύπου C1xV1 = C2xV2 Εύρος συγκεντρώσεων Φαρμάκου: 10 ³ - 10 ⁹Μ & καλλιέργειες αναφοράς! Χρόνος επώασης με το φάρμακο: 48 ώρες Τριπλή επανάληψη Ομοίως για τα άλλα δύο Φ.. Πιθανά λάθη στην προετοιμασία?? 8/14
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Χρονικό σημείο 48 ωρών Φ1 Φ2 Φ3 Μικροσκοπική παρατήρηση!!! Πολύ καλή ομογενοποίηση κάθε δείγματος καλλιέργειας φόρτωση πλάκας Neubauer http://www.microbehunter.com/thehemocytometer-counting-chamber/ Προσδιορισμός κυτταρικής ανάπτυξης και % κυτταρικής ανάπτυξης σε κάθε δείγμα 9/14
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μεθοτρεξάτη (ΜΤΧ) 1 η μέτρηση 2 η μέτρηση Κυταραβίνη (Αra-C) 1 η μέτρηση 2 η μέτρηση control Α: 41 B: 42 C: 31 D: 38 1 x 10-9 M Α: 39 B: 28 C: 34 D: 47 1 x 10-8 M Α: 36 B: 23 C: 23 D: 21 1 x 10-7 M Α: 6 B: 12 C: 12 D: 11 1 x 10-6 M Α: 5 B: 4 C: 3 D: 11 1 x 10-5 M A: 10 B: 7 C: 6 D: 11 1 x 10-4 M A: 2 B: 3 C: 6 D: 3 1 x 10-3 M A: 1 B: 0 C: 1 D: 0 A: 35 B: 26 C: 43 D: 41 A: 40 B: 34 C: 29 D: 43 Α: 23 B: 26 C: 19 D: 11 A: 10 B: 4 C: 8 D: 12 A: 10 B: 7 C: 9 D: 4 A: 8 B: 12 C: 8 D: 13 A: 4 B: 2 C: 5 D: 5 A: 2 B: 0 C: 1 D: 2 Α: 12 B: 39 C: 25 D: 37 Α: 30 B: 17 C: 27 D: 27 Α: 27 B: 18 C: 23 D: 36 Α: 9 B: 8 C: 15 D: 13 Α: 8 B: 6 C: 11 D: 8 A: 10 B: 8 C: 7 D: 6 A: 4 B: 6 C: 3 D: 8 A: 2 B: 0 C: 3 D: 2 A: 31 B: 27 C: 25 D: 35 A: 32 B: 34 C: 44 D: 30 A: 21 B: 23 C: 26 D: 17 A: 8 B: 19 C: 11 D: 15 A: 5 B: 6 C: 8 D: 10 A: 8 B: 5 C: 3 D: 3 A: 2 B: 3 C: 1 D: 2 A: 2 B: 3 C: 1 D: 0 control Α: 74 B: 96 C: 77 D: 82 1 x 10-9 M Α: 67 B: 62 C: 72 D: 71 1 x 10-8 M Α: 50 B: 39 C: 31 D: 45 1 x 10-7 M Α: 18 B: 11 C: 12 D: 16 1 x 10-6 M Α: 10 B: 9 C: 10 D: 12 1 x 10-5 M A: 8 B: 3 C: 7 D: 7 1 x 10-4 M A: 7 B: 9 C: 4 D: 5 1 x 10-3 M A: 2 B: 2 C: 5 D: 8 A: 58 B: 54 C: 71 D: 82 A: 80 B: 66 C: 65 D: 70 Α: 39 B: 39 C: 32 D: 28 A: 12 B: 15 C: 12 D: 13 A: 17 B: 12 C: 15 D: 8 A: 5 B: 5 C: 8 D: 7 A: 7 B: 6 C: 4 D: 5 A: 1 B: 3 C: 0 D: 2 Α: 81 B: 74 C: 75 D: 62 Α: 72 B: 66 C: 76 D: 73 Α: 45 B: 42 C: 48 D: 42 Α: 9 B: 11 C: 18 D: 13 Α: 19 B: 23 C: 17 D: 15 A: 10 B: 7 C: 8 D: 9 A: 5 B: 9 C: 10 D: 8 A: 2 B: 2 C: 1 D: 1 A: 70 B: 76 C: 89 D: 65 A: 71 B: 68 C: 72 D: 72 A: 32 B: 37 C: 43 D: 40 A: 10 B: 14 C: 11 D: 13 A: 10 B: 7 C: 9 D: 6 A: 8 B: 5 C: 8 D: 8 A: 5 B: 4 C: 2 D: 3 A: 3 B: 1 C: 0 D: 1 10/14
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ετοποποσίδης (Etoposide) 1 η μέτρηση 2 η μέτρηση control Α: 95 B: 100 C: 85 D: 99 A: 98 B: 101 C: 79 D: 88 Α: 88 B: 95 C: 110 D: 98 A: 92 B: 109 C: 97 D: 80 Υπολογισμός % Κυτταρικής ανάπτυξης: 1 x 10-9 M Α: 84 B: 88 C: 92 D: 83 1 x 10-8 M Α: 58 B: 60 C: 70 D: 62 1 x 10-7 M Α: 46 B: 59 C: 49 D: 49 1 x 10-6 M Α: 16 B: 10 C: 16 D: 11 1 x 10-5 M A: 13 B: 11 C: 10 D: 16 A: 91 B: 80 C: 94 D: 85 Α: 66 B: 82 C: 66 D: 58 A: 47 B: 52 C: 55 D: 52 A: 12 B: 12 C: 8 D: 10 A: 11 B: 10 C: 16 D: 10 Α: 99 B: 93 C: 87 D: 73 Α: 50 B: 61 C: 55 D: 59 Α: 60 B: 51 C: 59 D: 48 Α: 11 B: 17 C: 9 D: 17 A: 15 B: 11 C: 8 D: 12 A: 87 B: 84 C: 100 D: 70 A: 58 B: 65 C: 68 D: 68 A: 51 B: 49 C: 47 D: 60 A: 13 B: 12 C: 15 D: 15 A: 17 B: 15 C: 9 D: 11 % Κυτταρική Ανάπτυξη Κυτταρική Ανάπτυξη στο δείγμα με Φ Μ.Ο. = x Μ.Ο. Κυτταρική Ανάπτυξη της καλλιέργειας αναφοράς 100% 1 x 10-4 M A: 16 B: 11 C: 14 D: 14 A: 12 B: 12 C: 12 D: 12 A: 19 B: 11 C: 6 D: 14 A: 15 B: 7 C: 13 D: 13 1 x 10-3 M A: 8 B: 4 C: 11 D: 7 A: 9 B: 7 C: 10 D: 6 A: 5 B: 4 C: 3 D: 9 A: 6 B: 7 C: 5 D: 8 11/14
IC50 Φ1 IC50 Φ2 IC50 Φ3 % Cell growth ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας αποτελεσμάτων: 12/14 Drug conc (M) % Cell growth Φ1 Φ2 Φ3 control 100 100 100 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 86 92 95 55 74 79 27 50 56 10 20 45 8 10 25 5 5 10 2 2 4 100 75 50 25 Φ1 Φ2 Φ3 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 Drug concentration (M) Log scale!
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ - ΕΡΜΗΝΕΙΑ Επιδρούν τα τρία κυτταροτοξικά φάρμακα στο συγκεκριμένο τύπο καρκινικών κυττάρων (Κ562)?? Σε ποιο εύρος συγκεντρώσεων συμβαίνει αυτό? Συνοδεύεται από φαινοτυπικές αλλαγές των κυττάρων? Παρατηρήσατε διαφορές στη δραστικότητα των τριών διαφορετικών φαρμάκων? Πώς το αποδείξατε?? Ποιο από τα τρία φάρμακα θα επιλέγατε για χρήση σε ασθενείς με το συγκεκριμένο τύπο καρκίνου??? (ΠΡΟΣΟΧΗ: υπεραπλούστευση ) 13/14
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Η ΔΙΕΞΑΓΩΓΗ ΟΡΘΩΝ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΩΝ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΚΡΙΣΙΜΑ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟ (Διαφάνειες 2, 4-5, 11-12!!!) Επόμενη διάλεξη: Κυτταρικός κύκλος- Κυτταρικός θάνατος