ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ FLOW CYTOMETRY

Κυτταρομετρία Ροής Η Κυτταρομετρία Ροής είναι μια τεχνική που εκμεταλλεύεται την μέτρηση ορισμένων βιοχημικών και βιοφυσικών παραμέτρων των κυττάρων μεμονωμένα, όταν αυτά βρίσκονται σε εναιώρημα εντός υγρού που ρέει σε νηματοειδή ροή. Η ανάλυση αυτή μπορεί να αφορά το μέγεθος, τον όγκο, την κοκκίωση, καθώς και χημικές ιδιότητες όπως την περιεκτικότητα σε DNA και RNA, πρωτεΐνες και ένζυμα. Κυτταρικά επιφανειακά μόρια μπορούν ευκρινώς να ανιχνευθούν με ανοσοφθορισμό με την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων Προέκταση της τεχνολογίας αυτής αποτελεί ο κυτταροδιαχωρισμός ροής, κατά τον οποίο οποιοδήποτε μεμονωμένο κύτταρο, οργανίδιο κτλ., που προσδιορίζεται όπως παραπάνω, μπορεί επιλεκτικά να απομακρυνθεί από το εναιώρημα με βάση τις μετρήσεις αυτές

ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Γενικά χαρακτηριστικά Απεικόνιση των κυτταρικών πληθυσμών με βάση: το μέγεθος την κοκκίωση το φθορισμό

ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Υδροδυναμική ροή Πρόσθιος σκεδασμός Πλάγιος σκεδασμός Πρόσθιος σκεδασμός Πλάγιος σκεδασμός Φθορισμός http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4intro_flow/player.html

ΣΚΕΔΑΣΗ ΤΟΥ ΦΩΤΟΣ Πλάγιος σκεδασμός Πηγή (lαser) Πρόσθιος σκεδασμός Μέγεθος Μικρό Μεσαίο Μεγάλο

ΣΚΕΔΑΣΗ ΤΟΥ ΦΩΤΟΣ Πλάγιος σκεδασμός Πηγή (lαser) Πρόσθιος σκεδασμός Κοκκίωση

ΠΡΟΣΘΙΟΣ / ΠΛΑΓΙΟΣ ΣΚΕΔΑΣΜΟΣ

ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Αντίσωμα με φθοριόχρωμα κύτταρο

ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ

ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Εκτός από τη σκέδαση του φωτός στην κυτταρομετρία ροής μελετάται και αναλύεται ένα ακόμα φυσικό φαινόμενο που είναι ο φθορισμός. Φθορισμός είναι η ιδιότητα ορισμένων ουσιών να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος από αυτήν που δέχονται (διεγείρουσα ακτινοβολία). και η φυκοκυανίνη

ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Εφόσον τα εξεταζόμενα κύτταρα τα επεξεργαστούμε με ανιχνευτές που φθορίζουν - μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώματα, ενωμένα με φθορίζουσες χρωστικές που ανιχνεύουν χαρακτηριστικά αντιγόνα κυττάρων, καθώς και χημικές φθορίζουσες ουσίες που συνδέονται με το DNA και το RNA - εκτός από τη σκεδαζόμενη πρωτογενή ακτινοβολία, μπορεί να ανιχνευθεί και η δευτερογενής από τον φθορισμό ακτινοβολία (flurescence-1 FL-1 πράσινος φθορισμός, flurescence-2 FL-2 κόκκινος φθορισμός Η πλέον συνηθέστερη φθορίζουσα χρωστική ή φθοριόχρωμα είναι η φλουορεσκεΐνη στην ισοθειοκυανική της μορφή (FITC). Χρησιμοποιείται ευρέως γιατί η περιοχή διέγερσης της είναι στα 494nm και συμπίπτει με το μήκος κύματος απο το Laser Argon-ion (488 nm). Αλλά φθοριοχρώματα που χρησιμοποιούνται στην κυτταρομετρία ροής είναι η φυκοερυθρίνη

Αντιγόνα επιφανείας Τα Λεμφοκύτταρα εμφανίζουν στην επιφάνεια τους ένα μεγάλο αριθμό διαφορετικών πρωτεϊνικών μορίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διακριτοί δείκτες μεταξύ των κυτταρικών πληθυσμών Αυτοί οι ειδικοί δείκτες καλούνται αντιγόνα επιφανείας γιατί ανιχνεύονται με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων Ο επιφανειακός δείκτης που χαρακτηρίζει επακριβώς μια κυτταρική σειρά ή ένα στάδιο διαφοροποίησης, έχει καθοριστική δομή και αναγνωρίζεται από μια ομάδα -cluster- μονοκλωνικών αντισωμάτων, ονομάζεται μέλος ομάδας διαφοροποίησης, Cluster of Differentiation Τα χαρακτηριστικά αυτά αντιγόνα ονομάζονται δείκτες επιφανείας ή αντιγόνα διαφοροποίησης και αναφέρονται με τον όρο CD και ένα αριθμητικό προσδιορισμό όπως CD1, CD2 κλπ.

Τ λεμφοκύτταρα-1 Αποτελούν το 80-85% των περιφερικών λεμφοκυττάρων Δεν εμφανίζουν στην επιφάνεια τους ανοσοσφαιρίνες Σχηματίζουν αυτόματα ροζέτες με τα ερυθροκύτταρα προβάτου (ύπαρξη του CD2 επιφανειακού αντιγόνου) Μαζί με τα μακροφάγα συμμετέχουν στην ανοσιακή απάντηση Τα TCR-2+ κύτταρα υποδιαιρούνται σε δυο υποπληθυσμούς

Τ λεμφοκύτταρα-2 Σε αυτά που φέρουν τον CD4 δείκτη και βοηθούν ή προτρέπουν τη ανοσολογική απάντηση (βοηθητικά Τ Η ) Και σε αυτά που φέρουν τον CD8 δείκτη και έχουν κυτταροτοξική-κατασταλτική δράση (κυτταροτοξικά T c ) Τα CD4+ κύτταρα αναγνωρίζουν αντιγόνα σε συνδυασμό με τα μόρια της τάξης ΙΙ του MHC ενώ τα CD8+ σε συνδυασμό με τα μόρια της τάξης Ι του MHC Το CD3 επιφανειακό αντιγόνο είναι ο χαρακτηριστικός δείκτης όλων των Τ κυττάρων

Τ λεμφοκύτταρα CD4 TCR CD3 CD2 CD3/CD4 CD8 TCR CD3 CD2 CD3/CD8 TH TC Β λεμφοκύτταρα BCR CD19 CD20 CD20 CD19 ΝΚ /T κύτταρα CD3 CD56 CD57 CD3 CD16/56

Ανοσοφαινότυπος υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση ή ανοσοφαινότυπος (Immunophenotyping) με κυτταρομετρία ροής βασίζεται στην ταυτοποίηση ενός ή πολλών μεμβρανικών ή ενδοκυττάριων ή πυρηνικών αντιγόνων των κυττάρων σε εναιώρημα, ταυτόχρονα με τον σκεδασμό που δίνουν τα κύτταρα στο προσπίπτον σ αυτά φως.

Κλινικές εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής Φαινοτυπική ανάλυση λεμφοκυττάρων Διάγνωση ανοσοκατασταλτικών νοσημάτων Πρόγνωση των HIV θετικών ασθενών Έλεγχος της ανοσοθεραπείας ή της χημειοθεραπείας σε ανοσοκατασταλτικά νοσήματα Διάγνωση ανοσοανεπάρκειας Φαινοτυπική ανάλυση κακοήθων κυττάρων Διάγνωση και τυποποίηση λευχαιμιών και λεμφωμάτων Διαφοροποίηση των αιμοποιητικών από μη αιμοποιητικά κακοήθη κύτταρα Πρόγνωση των κακοηθειών DNA ανάλυση Μελέτη της φάσης του κύκλου των κυττάρων Κυτταρογενετική