ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΗΣ LISTERIA MONOCYTOGENES ΠΟΥ ΕΜΒΟΛΙΑΣΤΗΚΕ ΣΕ ΠΑΓΩΤΟ, ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΗ ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΧΑΜΗΛΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ (5 ο C) Εργαστήριο Χηµείας Τροφίµων, Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Αθηνών. Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, Σχολή Χηµικών Μηχανικών, ΕΜΠ. 1
ΠΑΘΟΓΟΝΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ LISTERIA MONOCYTOGENES (Lm) GRAM-θετικό βακτήριο Ανάπτυξη σε συνθήκες Θερµοκρασία 0,4 έως 50 ο C ph 4,1 9,6 Οσµωτική πίεση έως 10% NaCl 2
Εντονότατο ενδιαφέρον της επιστηµονικής έρευνας γύρω από την Lm: 2500 άνθρωποι αρρωσταίνουν σοβαρά από λιστερίωση και $2,3 εκατοµµύρια είναι το κόστος των αιφνίδιων τροφολοιµώξεων από Lm κάθε χρόνο στις ΗΠΑ Οι δηµοσιεύσεις που αφορούν στη Μικροβιολογία Τροφίµων έχουν κατά ποσοστό µεγαλύτερο του 20% ως αντικείµενο την Lm. 3
ΙΕΙΣ ΥΤΙΚΟΤΗΤΑ ΠΑΘΟΓΟΝΟΣ ΡΑΣΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΑ ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΞΕΝΙΣΤΗ ΙΑΤΡΟΦΗ ΜΕ ΤΟ ΠΛΟΥΣΙΟ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΕΣ ΥΛΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΠΛΑΣΜΑ ΜΕΤΑΒΑΣΗ ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΟ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΨΕΥ ΟΠΟ ΙΟΥ 4
ΠΑΡΑΚΑΜΨΗ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΞΕΝΙΣΤΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΝΕΥΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ Προκαλεί: Αποβολές εγκύων, µηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα, σηψαιµία. 5
Μόλυνση τροφίµων : Γαλακτοκοµικά, αλλαντικά, πουλερικά, αυγά, θαλασσινά, λαχανικά κ.α. Θνησιµότητα από τροφολοιµώξεις: >20% ΟΜΑ ΕΣ ΥΨΗΛΟΥ ΚΙΝ ΥΝΟΥ: Έγκυες, Υπερήλικες, Παιδιά, Άτοµα µε ανοσοκαταστολή, Άτοµα που έχουν σχέση µε την επεξεργασία των τροφίµων που προσβάλλει το βακτήριο. 6
Πιθανοί λόγοι για τις αυξηµένες περιπτώσεις λιστερίωσης τα τελευταία χρόνια: (α) οι επερχόµενες αλλαγές στις διατροφικές συνήθειες που περιλαµβάνουν αυξανόµενη κατανάλωση έτοιµων φαγητών ήπιας επεξεργασίας, µακράς ζωής στο ψυγείο που είναι δυνατόν να καταναλωθούν χωρίς θέρµανση. (β) η συνεχής αύξηση του ποσοστού του πληθυσµού που αντιπροσωπεύεται είτε από ηλικιωµένα, είτε από ανοσοκατεσταλµένα άτοµα. (γ) το γεγονός ότι έχουν βελτιωθεί οι τρόποι διάγνωσης αιτιών των διαφόρων λοιµώξεων. των 7
Ευαίσθητο στις βακτηριολυσίνες των άλλων µικροοργανισµών Προάγεται η ανάπτυξη σε συνθήκες συντήρησης τροφίµων (χαµηλή θερµοκρασία, υψηλή αλατότητα ) Συγκέντρωση ενδιαφέροντος στην απόκριση λιπιδίων της µεµβράνης σε χαµηλή θερµοκρασία (5 0 C) ως µηχανισµός προσαρµογής στην ψύξη, παρουσιάζοντας αλλαγές στη σύστασή τους 8
Από προηγούµενες έρευνες υπάρχουν αποτελέσµατα που παρουσιάζουν διαφορές στα λιποειδή της µεµβράνης του βακτηρίου όταν αναπτύσσεται στους 5 0 C. Annous et al, Applied Environmental Microbiology, 69, 3887-3894, 1997 Mastronicolis et al, Food Microbiology, 15, 299-306, 1998 9
Από έρευνες της οµάδας µας προέκυψε ότι η προσαρµογή της σύστασης των λιπαρών οξέων της Listeria σε χαµηλές θερµοκρασίες ανάπτυξης επιτυγχάνεται κυρίως µε: Αύξηση των ουδέτερων λιποειδών. Mastronicolis et al, Food Microbiology, 23, 184-194, 2006. 10
και µε: Ελάττωση στο µήκος της αλυσίδας των διακλαδισµένων λιπαρών οξέων. Συγκεκριµένα αύξηση των διακλαδισµένων λιπαρών οξέων anteiso 15:0 και ελάττωση του anteiso- 17:0 στα ουδέτερα λιπαρά οξέα και στα φωσφολιποειδή. Mastronicolis et al, Applied and Environmental Microbiology, 2008 in press. Giotis et al, Applied and Environmental Microbiology, 73 (3) 997-1001 2007. 11
Αυτό µπορεί να ερµηνευθεί αφού το anteiso-15:0 είναι χαµηλότερου σηµείου τήξεως από το anteiso-17:0 και συνεπώςθαβοηθάστηνδιατήρησητης µεµβράνης σε υγροκρυσταλλική φάση στις χαµηλότερες θερµοκρασίες και έτσι η µεµβράνη του βακτηρίου διατηρεί τις κανονικές της λειτουργίες. 12
13
14
Με την ονοµασία παγωτά χαρακτηρίζεται µεγάλη ποικιλία προϊόντων που παρασκευάζονται µε τη χρησιµοποίηση του γάλακτος ή χυµού διαφόρων φρούτων και γλυκαντικών υλών, και καταναλώνονται σε καταψυγµένη κατάσταση. Τα πραγµατικά παγωτά παρασκευάζονται µε βάσητογάλα, γι αυτό θεωρούνται ως προϊόντα που προέρχονται από αυτό. 15
Πρώτες ύλες: Γάλα, ορισµένα προϊόντα του (κρεµά γάλακτος, βούτυρο, σκόνη γάλακτος) Γλυκαντικές ύλες Σταθεροποιητές Γαλακτωµατοποιητές 16
Παγωτό και Listeria Το παγωτό προτιµάται από όλες τις οµάδες καταναλωτών και ειδικά από τα παιδιά. ιάφορα πρωτότυπα παγωτά Η επιµόλυνση µετά το στάδιο της παστερίωσης του µίγµατος παγωτού Στο περιβάλλον παραγωγής παγωτού το βακτήριο αναπτύσσει ικανότητα προσαρµογής στις συνθήκες χαµηλής θερµοκρασίας. 17
Έχει την τάση να προσκολλάται σε αδρανείς επιφάνειες (τοίχοι, ιµάντες κ.λπ.). Έχει ενδιαφέρον να εξετασθεί ποια θα είναι η τύχη κρυοανθεκτικών κυττάρων Listeria, που θα επιµόλυναν ένα παγωτό σε αυτό το χώρο. 18
Σκοπός της εργασίας: Να διερευνηθεί η τύχη κρυοπροσαρµοσµένων σε 5 0 C κυττάρων Lm: σε παγωτό συνήθους σύστασης κατά την µακροχρόνια αποθήκευσή του και σε παγωτό µε µεταβολή της σύστασής του είτε στο είδος είτε στην αναλογία της πρώτης ύλης (είδος λίπους και γλυκαντικών). 19
Πίνακας της %σύστασης των δειγµάτων των παγωτών που χρησιµοποιήθηκαν. Στις παρακάτω τιµές πρέπει να προστεθούν και τα εξής: 0,2% σταθεροποιητής (κόµι ξανθάνης), 0,2% γαλακτωµατοποιητής (µονο-διγλυκερίδια λιπαρών οξέων) και 9,46% σκόνη γάλακτος: είγµα Σακχαρόζη Άλλη γλυκαντική ύλη Κρέµα γάλακτος Φοινικέλαιο Νερό Control 16-28,57-45,57 S1 (φοινικέλαιο 30%) S2 (φοινικέλαιο 50%) 16-20,00 3 51,14 16-14,29 5 54,85 S3 (φρουκτόζη) 13,6 3 (σιρόπι φρουκτόζης) 28,57-44,97 S4 (αµυλοσιρόπιο) 13,6 3 (αµυλοσιρόπιο) 28,57-44,97 S5 (µαλτιτόλη) 13,6 3 (σιρόπι µαλτιτόλης) 28,57-44,97 20
ΙΑΓΡΑΜΜΑ ΡΟΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΙΚΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ ΠΑΓΩΤΟΥ ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ Γλυκαντικές ύλες Λιπαρές ύλες Σκόνη γάλακτος Σταθεροποιητής Γαλακτωµατοποιητής Ανάµιξη πρώτων υλών Νερό 50 C 1600rpm Παστερίωση µίγµατος 78 C 20min Οµογενοποίηση 2 σταδίων 200bar 20bar αντίστοιχα Ωρίµανση µίγµατος 4 C - 18h Εµβολιασµός προϊόντος Κατάψυξη µίγµατος 21
Κρυοανθεκτική Listeria monocytogenes (στάσιµη φάση, 8 µέρες, 5 ο C, pη 5,8) Μετά από δύο δεκαδικές αραιώσεις παρελήφθει1ml εµβόλιο για επιµόλυνση δειγµάτων 50g παγωτού Αποθήκευση-κατάψυξη στους -20 o C 1η Ανάκτηση 18 µέρες 4η Ανάκτηση 182 µέρες 2η Ανάκτηση 36 µέρες 3η Ανάκτηση 137 µέρες 22
Για την ταυτοποίηση - απαρίθµηση των κυττάρων L.monocytogenes χρησιµοποιήθηκαν εκλεκτικά τρυβλία OCLA (Oxoid Chromogenic Listeria Agar Plate) CODE: PO5165A. 23
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 24
είγµα Εµβολιασµός µε: cfu Lm/g παγωτού (log cfu/g παγωτού) 1 η Ανάκτηση (18ηµέρες) cfu/g δείγµατος (log cfu/g δείγµατος) 2 η Ανάκτηση (36ηµέρες) 3 η Ανάκτηση (137ηµέρες) 4 η Ανάκτηση (182 µέρες) Control 2,0 10 6 (6,30) 2,2 10 3 (3,34) 2,2 10 3 (3,34) 1,3 10 3 (3,11) 2,3 10 3 (3,36) S1 (φοινικέλαιο 30%) 2,0 10 6 (6,30) 1,4 10 3 (3,15) 9,6 10 3 (3,98) 6,0 10 3 (3,78) 2,7 10 4 (4,43) S2 (φοινικέλαιο 50%) 2,0 10 6 (6,30) 9,9 10 (2,00) 9,0 10 2 (2,95) 0 S3 (φρουκτόζη) 2,0 10 6 (6,30) 2,9 10 2 (2,46) 7,5 10 2 (2,88) 2,0 10 2 (2,30) 1,7 10 4 (4,23) S4 (αµυλοσιρόπιο) 2,0 10 6 (6,30) 1,0 10 2 (2,00) 6,0 10 2 (2,78) 4,3 10 3 (3,63) S5 (µαλτιτόλη) 2,0 10 6 (6,30) 2,9 10 2 (2,47) 5,4 10 3 (3,74) 7,0 10 2 (2,85) 6,2 10 3 (3,8) 25
είγµα Εµβολιασµός µε: cfu Lm/g παγωτού (log cfu/g παγωτού) 1 η Ανάκτηση (18ηµέρες) cfu Lm/g δείγµατος (log cfu/g δείγµατος) 2 η Ανάκτηση (36ηµέρες) 3 η Ανάκτηση (137ηµέρες) 4 η Ανάκτηση (182 µέρες) Control 2,0 10 6 (6,30) 2,2 10 3 (3,34) 2,2 10 3 (3,34) 1,3 10 3 (3,11) 2,3 10 3 (3,36) 26
log cfu/g 7 6 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 Χρόνος, ηµέρες Control Μεταβολή του πληθυσµού κρυοπροσαρµασµένου παθογόνου Lm που επιµόλυνε το δείγµα παγωτού συνήθους σύστασης (control). 27
7 log cfu/g 6 5 4 3 Control S1 S3 S5 S4 Control S1,φοιν.30% S2,φοιν.50% S3,φρουκτ. 2 S4,αµυλοσ. 1 0 0 50 100 150 200 Χρόνος, ηµέρες S2 S5,µαλτιτ. Μεταβολή του πληθυσµού του κρυοπροσαρµοσµένου παθογόνου Lm που επιµόλυνε δείγµατα παγωτού διαφορετικής σύστασης κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. 28
Συνοψίζοντας: Παρατεταµένη επιβίωση του κρυοπροσαρµοσµένου παθογόνου για 6 µήνες, αλλά σε χαµηλότερα επίπεδα από εκείνα του αρχικού πληθυσµού κατά 2-3 log. 29
Παρουσίαση της οµάδας που εργαστήκαµε σε αυτή την έρευνα: Ι. ιακογιάννης, µεταπτυχιακός φοιτητής, Εργαστήριο Χηµείας Τροφίµων, Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Αθηνών. Α.Μπερµπέρι, µεταπτυχιακή φοιτήτρια, >> >> Π.Μπισµπιρούλας, µεταπτυχιακός φοιτητής, >> >> Σ.Μαστρονικολή, Αναπλ. καθηγήτρια, >> >> Χ.Σούκουλης, µεταπτυχιακός φοιτητής ( ), Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, Σχολή χηµικών µηχανικών, ΕΜΠ. Κ.Τζιά, Καθηγήτρια, >> >> 30
31