ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2009 2010 Αριθμός 2746 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΚΑΙ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΜΕΝΙΑ ΑΠΟ ΣΤΕΛΕΧΗ CANDIDA

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΙΔΙΟΥ Γ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Ν. ΤΣΑΝΑΚΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2009 2010 Αριθμός 2746 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΚΑΙ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΜΕΝΙΑ ΑΠΟ ΣΤΕΛΕΧΗ CANDIDA ΑΣΠΑΣΙΑΣ ΚΑΤΡΑΓΚΟΥ ΠΑΙΔΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΡΟΗΛΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΪΔΩ ΤΣΑΝΤΑΛΗ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΡΟΗΛΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΪΔΩ ΤΣΑΝΤΑΛΗ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΦΑΝΗ ΑΘΑΝΑΣΙΑΔΟΥ-ΠΙΠΕΡΟΠΟΥΛΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΤΣΑΝΑΚΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΙΜΟΛΕΩΝ-ΑΧΙΛΛΕΑΣ ΒΥΖΑΝΤΙΑΔΗΣ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ ΑΝΤΑΧΟΠΟΥΛΟΣ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ «Ἡ ἔγκρισις τῆς Διδακτορικῆς Διατριβῆς ὑπὸ τῆς Ἰατρικῆς Σχολῆς τοῦ Ἀριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δὲν ὑποδηλοῖ ἀποδοχὴν τῶν γνωμῶν τοῦ συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, ἄρθρ. 202 2 και ν. 1268/82, ἄρθρ. 50 8)

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ

Στο δάσκαλό μου, Ε. Ροηλίδη με σεβασμό Στην οικογένειά μου με αγάπη

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ...- 3-2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ...- 5 - ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3 ΜΥΚΗΤΕΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA...- 13-3.1 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA - 13-3.2 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΤΟΙΧΩΜΑ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA... - 17-3.3 ΛΟΙΜΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA... - 19-4 ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΜΕΝΙΑ...- 21-4.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ... - 21-4.2 ΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΜΕΝΙΑ - ΓΕΝΙΚΑ... - 22-4.3 ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΥΜΕΝΙΩΝ ΣΤΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ... - 24-4.3.1 Λοιμώξεις ανώτερου αναπνευστικού: Ωτίτιδα-Παραρινοκολπίτιδα... - 28-4.3.2 Λοιμώξεις κατώτερου αναπνευστικού: κυστική ίνωση... - 30-4.3.3 Λοιμώξεις σχετιζόμενες με τη χρήση επεμβατικών ιατρικών εργαλείων.. - 32-4.3.4 Άλλες λοιμώξεις... - 37-4.4 ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΑΣΗ BΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΥΜΕΝΙΩΝ ΑΠΟ ΣΤΕΛΕΧΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA... - 37-4.5 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΟ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΥΜΕΝΙΩΝ - 40-4.6 ΈΚΦΡΑΣΗ ΕΙΔΙΚΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΤΑ BΙΟΛΟΓΙΚΑ YΜΕΝΙΑ ΑΠΟ ΣΤΕΛΕΧΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA... - 44-4.7 ΔΙΑΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΧΗΜΙΚΗ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑ (QUORUM SENSING) ΣΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΜΕΝΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA... - 46-4.8 ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΑ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ... - 49-5 Η ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA...- 53-5.1 Η ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑΚΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA... - 54-5.1.1 Η αναγνώριση των μυκήτων του γένους Candida... - 54-5.2 ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ... - 62-5.2.1 Φαγοκύτταρα... - 63-5.2.2 Δενδριτικά κύτταρα... - 66-5.2.3 Φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα... - 66-5.2.4 Διαλυτοί παράγοντες... - 67-5.2.5 Κυτταροκίνες... - 68-6 ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ...- 72-6.1 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ... - 74 - ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7 ΣΚΟΠΟΣ...- 81-8 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...- 82 - - 1 -

8.1 ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ... - 82-8.2 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ... - 83-8.2.1 Ανθρώπινα πολυμορφοπύρηνα (PMNs)... - 83-8.2.2 Ανθρώπινα μονοκύτταρα (MNCs)... - 84-8.3 ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΥΜΕΝΙΩΝ... - 86-8.4 ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ... - 88-8.5 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Η/ΚΑΙ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΕΝΑΝΤΙ CANDIDA SPP.... - 89-8.6 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΡΟ-ΕΠΩΑΣΜΕΝΩΝ ΜΕ IFN-Γ Η G-CSF ΕΝΑΝΤΙ C. ALBICANS... - 90-8.7 ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΧΤΤ... - 91-8.8 ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ PMNS... - 92-8.9 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΟΚΙΝΩΝ... - 93-8.10 ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΣΑΡΩΣΗΣ ΜΕ LASER (CONFOCAL LASER SCANNING MICROSCOPY, CLSM)... - 94-9 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ...- 97-10 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...- 99-10.1 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ (VRC, PSC, CAS, ANID) ΣΤΑ ΒΥ ΑΠΟ C. ALBICANS ΚΑΙ C. PARAPSILOSIS ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΤΙΣ ΠΛΑΝΚΤΟΝΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ.... - 99-10.2 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ «ΔΙΑΛΥΜΕΝΑ» ΒΥ Η ΠΛΑΝΚΤΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ C. ALBICANS... - 104-10.3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑ ΒΥ ΚΑΙ ΣΤΑ ΠΛΑΝΚΤΟΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟ C. ALBICANS.... - 105-10.4 ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ (PMNS Η MNCS) ΚΑΙ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ (VRC, PSC, CAS, ANID) ΣΤΑ ΒΥ ΑΠΟ C. ALBICANS ΚΑΙ C. PARAPSILOSIS ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΤΙΣ ΠΛΑΝΚΤΟΝΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ.... - 107-10.5 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ, ΒΥ ΚΑΙ ΠΛΑΝΚΤΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ C. ALBICANS ΣΤΗΝ ΕΚΛΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΟΚΙΝΩΝ ΑΠΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΑ... - 113-10.6 ΕΠΙΔΡΑΣΗ IFN-Γ ΚΑΙ G-CSF ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΒΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΛΑΝΚΤΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ C. ALBICANS... - 115-10.7 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Η/ΚΑΙ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΒΥ C. ALBICANS... - 119-11 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...- 125-12 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...- 135-13 ABSTRACT...- 137-14 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...- 139 - - 2 -

1 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ANID Anidulafungin Ανιδουλαφουγκίνη BF-MIC BY Biofilm-Minimal Inhibitory Concentration Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του βιολογικού υμενίου Βιολογικό υμένιο CAS Caspofungin Κασποφουγκίνη CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute Ινστιτούτο κλινικών και εργαστηριακών προτύπων CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ DC Dendritic cells Δενδριτικά κύτταρα DHR-123 Dihydrorhodamine-1,2,3 Διϋδροροδαμίνη-1,2,3 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Ενζυμοσυνδετική ανοσομέθοδος FCM Fetal Calf Medium Θρεπτικό μέσο που περιέχει εμβρυϊκό ορό FCS Fetal Calf Serum Εμβρυϊκός ορός μόσχου G-CSF Granulocyte Colony Stimulating Factor Παράγοντας διέγερσης των αποικιών των κοκκιοκυττάρων GFP Green Fluorescent Protein Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη ΗBSS Hanks Buffered Salt Solution Hanks ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων IFN-γ Interferon-γ Ιντερφερόνη-γ IL Interleukin Ιντερλευκίνη LPS Lipopolysaccharides Λιποπολυσακχαρίτες MIC Minimal Inhibitory Concentration Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση MNC Monocytes Μονοκύτταρα - 3 -

MR Mannose Receptor Υποδοχέας της μαννόζης NF-κΒ Nuclear Factor κβ Πυρηνικός παράγοντας κβ ΝΚ Natural Killer cells Κύτταρα φυσικοί φονείς PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns Μοριακά πρότυπα των παθογόνων PG Prostaglandin Προσταγλανδίνη PL-MIC Planktonic-Minimal Inhibitory Concentration Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση των πλανκτονικών κυττάρων PMA Phorbol-12-myristate-13-acetate Εστέρας της φορμπόλης PMN Polymorphonuclear Πολυμορφοπύρηνα PRR Pattern Recognition Receptors Υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων PSC Posaconazole Ποσακοναζόλη R-123 Rhodamine-1,2,3 Ροδαμίνη-1,2,3 RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute-1640 Ειδικό καλλιεργητικό υλικό TGF-β Transforming Growth Factor Μετατρεπτικός παράγοντας αύξησης Th-1 Τ1-helper cells T1-βοηθητικό λεμφοκύτταρο Th-2 Τ2-helper cells T2-βοηθητικό λεμφοκύτταρο TLR Τoll-like receptors Υποδοχείς τύπου Τoll TNF-α Tumor Necrosis Factor-α Παράγοντας νέκρωσης των όγκων-α VRC Voriconazole Βορικοναζόλη XTT 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl]2h-tetrazolium-5- carboxanilide Τετραζολικό άλας (χρωματομετρική μέθοδος ανίχνευσης της καταστροφής των μυκήτων) YNB Yeast Nitrogen Base Αζωτούχος βάση ζύμης - 4 -

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τα βιολογικά υμένια ή βιοϋμένια ή βιομεμβράνες ή biofilms, όπως διαφορετικά ονομάζονται από διάφορους μελετητές, τα τελευταία 20 χρόνια, προσελκύουν ολοένα και περισσότερο το επιστημονικό ενδιαφέρον γεγονός που, εν μέρει, οφείλεται στην «πανταχού παρούσα» φύση τους. Τα βιολογικά υμένια αποτελούν μορφή διαβίωσης των μικροοργανισμών. Πρόκειται για αποικίες μικροοργανισμών, που είναι προσκολλημένες σε μια επιφάνεια και περιβάλλονται από εξωκυττάρια ουσία. Οι οργανισμοί στα βιολογικά υμένια διαφέρουν από τους αντίστοιχους πλανκτονικούς (ελεύθερους) τόσο φαινοτυπικά όσο και στο ρυθμό ανάπτυξής τους και στην έκφραση των γονιδίων τους. Έτσι, βιολογικά υμένια έχουν περιγραφεί σε φυσικά οικοσυστήματα, σε βιομηχανικά καθώς και σε νοσοκομειακά περιβάλλοντα. Ιδιαίτερα έντονο είναι το ενδιαφέρον στην κλινική έρευνα δεδομένου ότι το 65% όλων των λοιμώξεων, σύμφωνα με στοιχεία του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, φαίνεται να σχετίζεται με το σχηματισμό βιολογικών υμενίων. Τα βιολογικά υμένια αναδεικνύονται πλέον σε μείζον πρόβλημα στην ιατρική λόγω της εμπλοκής τους σε μια σειρά χρόνιων λοιμώξεων, σε λοιμώξεις που σχετίζονται με τη χρήση επεμβατικών ιατρικών εργαλείων (π.χ. καθετήρες, προθέσεις, βαλβίδες) καθώς και της αυξημένης αντοχής τους στους διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες και στην άμυνα του ξενιστή. Ανάλογα με τον τύπο του πειραματικού μοντέλου και το μελετούμενο μικροοργανισμό τα βιολογικά υμένια μπορεί να είναι εκατοντάδες ή και χιλιάδες φορές πιο ανθεκτικά στα αντιμικροβιακά σε σχέση με τις ελεύθερες (πλανκτονικές) μορφές του μικροοργανισμού. Μέχρι σήμερα έχει αναπτυχθεί μια ποικιλία in vitro μοντέλων προκειμένου να μελετηθούν τα βιολογικά υμένια. Η έρευνα πάνω στα μυκητιακά βιολογικά υμένια, σε αντίθεση με τα μικροβιακά, βρίσκεται ακόμα σε αρχικά στάδια. Ενώ είναι γνωστή η αντοχή των βιολογικών υμενίων από μύκητες του γένους Candida στα συμβατικά αντιμυκητιακά φάρμακα, η ευαισθησία τους στα νεότερα αντιμυκητιακά δεν έχει διερευνηθεί πλήρως. Άγνωστη παραμένει και η επίδραση των κυττάρων του συστήματος της φυσικής ανοσίας στα βιολογικά υμένια από μύκητες του γένους Candida. Τα κενά αυτά στη μελέτη των βιολογικών υμενίων έρχεται να καλύψει η παρούσα Διδακτορική Διατριβή. Με την παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η δράση νεότερων αντιμυκητιακών φαρμάκων όπως και των κυττάρων της φυσικής ανοσίας έναντι των βιολογικών - 5 -

υμενίων από Candida spp. Επίσης για πρώτη φορά, σε παγκόσμιο επίπεδο, μελετήθηκαν οι ανοσοφαρμακολογικές επιδράσεις των νεότερων αντιμυκητιακών παραγόντων έναντι των βιολογικών υμενίων. Η μελέτη έγινε σε πειραματικό μοντέλο in vitro, που προσομοίαζε τις in vivo συνθήκες λοίμωξης σε καθετήρες. Διαπιστώθηκε η υπεροχή μιας συγκεκριμένης κλάσης αντιμυκητιακών φαρμάκων, των εχινοκανδινών και αντίστροφα η ελαττωμένη δραστικότητα των αζολών στην καταστροφή των βιολογικών υμενίων. Βρέθηκε ακόμα ότι τα βιολογικά υμένια είναι ανθεκτικά και στη δράση των ανθρώπινων φαγοκυττάρων, τα οποία αδυνατούν να φαγοκυτταρώσουν τα μυκητιακά στοιχεία του βιολογικού υμενίου. Διαπιστώθηκε επίσης, ότι από τους αντιμυκητιακούς παράγοντες που μελετήθηκαν, μόνο η ανιδουλαφουγκίνη είχε αθροιστική αλληλεπίδραση με τα φαγοκύτταρα έναντι των βιολογικών υμενίων επάγοντας συγχρόνως μια τύπου Th1 ανοσιακή απόκριση. Από τα πειράματα της μελέτης επίσης συνάγεται ότι η ίδια η δομή του βιολογικού υμενίου φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την αντοχή του στα αντιμυκητιακά φάρμακα και στα φαγοκύτταρα. Το κλινικό όφελος από τα ευρήματα της παρούσας μελέτης αναμένεται να είναι ιδιαίτερα σημαντικό, δεδομένης της ολοένα αυξανόμενης χρήσης καθετήρων και γενικότερα επεμβατικών ιατρικών εργαλείων, που αποτελούν πλέον αναπόσπαστο τμήμα της σύγχρονης ιατρικής. Συγκεκριμένα, αναδεικνύεται ο σημαντικός ρόλος των μυκητιακών βιολογικών υμενίων στην αντοχή και στη χρονιότητα των λοιμώξεων, που σχετίζονται με τη χρήση καθετήρων. Ικανοποιητική θεραπευτική εναλλακτική στις λοιμώξεις αυτές φαίνεται να αποτελούν οι εχινοκανδίνες και ιδιαίτερα η ανιδουλαφουγκίνη. Επίσης τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν μελλοντικές θεραπευτικές προοπτικές έναντι των βιολογικών υμενίων από Candida spp, που θα στοχεύουν στη διάσπαση της ακεραιότητας του βιολογικού υμενίου και στη χρήση μορίων που θα επάγουν την τύπου Th1 ανοσιακή απόκριση. Η δομή της παρούσας μελέτης περιλαμβάνει το Γενικό Μέρος, όπου περιγράφονται αρχικά η ταξινόμηση, η μορφολογία και η δομή των μυκήτων του γένους Candida. Επίσης στο Γενικό Μέρος ορίζεται και αναλύεται η έννοια του βιολογικού υμενίου γενικά και ειδικότερα των βιολογικών υμενίων των μυκήτων του γένους Candida καθώς και η σημασία και ο ρόλος τους στις λοιμώξεις. Ακολούθως παρέχονται σύγχρονες θεωρητικές γνώσεις πάνω στη φυσική ανοσιακή απόκριση έναντι των μυκήτων του γένους Candida και τέλος περιγράφονται τα αντιμυκητιακά φάρμακα και οι ανοσοφαρμακολογικές επιδράσεις τους. Στο Ειδικό Μέρος, παρουσιάζονται ο σκοπός της μελέτης, οι οργανισμοί και τα υλικά που - 6 -

χρησιμοποιήθηκαν, οι εργαστηριακές μέθοδοι που εφαρμόστηκαν και η μεθοδολογία της στατιστικής ανάλυσης των δεδομένων. Ακολουθεί η αναλυτική παρουσίαση των αποτελεσμάτων. Αρχικά παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της επίδρασης των αντιμυκητιακών φαρμάκων στα βιολογικά υμένια, ακολουθούν τα αποτελέσματα από την επίδραση των ανθρώπινων φαγοκυττάρων και στη συνέχεια τα αποτελέσματα της συνδυασμένης επίδρασης αντιμυκητιακών και φαγοκυττάρων. Τέλος, παρουσιάζονται φωτογραφίες από το συνεστικακό μικροσκόπιο όπου απεικονίζονται οι αλληλεπιδράσεις βιολογικών υμενίων με φάρμακα ή/και με φαγοκύτταρα. Ακολουθεί η κριτική ανάλυση και συζήτηση των αποτελεσμάτων σε σχέση με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα. Η πλειονότητα των πειράματων της μελέτης αυτής διενεργήθηκαν στο Εργαστήριο Λοιμώξεων της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ. Τα πειράματα με το συνεστιακό μικροσκόπιο διενεργήθηκαν στο National Cancer Institute (NCI) των Νational Institutes of Health (NIH) στη Βethesda του Maryland των Ηνωμένων Πολιτειών. Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή χρηματοδοτήθηκε από την European Society of Pediatric Infectious Diseases (ESPID), το National Cancer Institute (NCI) και τη φαρμακευτική εταιρεία Pfizer. Στο σημείο αυτό νιώθω τη βαθιά ανάγκη να ευχαριστήσω όλους εκείνους που συνέβαλαν στην πραγματοποίηση αυτής της μελέτης. Πρωτίστως, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στο Δάσκαλό μου και επιβλέποντα της Διατριβής Καθηγητή κ. Εμμανουήλ Ροηλίδη. Είναι ο άνθρωπος που με εισήγαγε στην ιατρική επιστήμη και έρευνα και μου ενέπνευσε, και συνεχίζει να μου εμπνέει, τη χαρά της δημιουργίας και τις διαχρονικές αξίες του ήθους και της αξιοκρατίας. Τον ευχαριστώ για την ανάθεση του θέματος, την αδιάκοπη βοήθειά του, τις υποδείξεις του και την επίβλεψή του κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Χωρίς την επιμονή του, την εργατικότητά του και το ακούραστο ενδιαφέρον του η διατριβή αυτή δε θα μπορούσε να ολοκληρωθεί. Θα αποτελεί για μένα για πάντα πρότυπο δασκάλου, επιστήμονα, εργατικότητας, συνέπειας και ανθρώπου. Βαθιά ευγνωμοσύνη θα ήθελα να εκφράσω και προς τον Καθηγητή κ. Τhomas Walsh, Διευθυντή του Immunocompromised Host Section, Pediatric Oncology Branch στο National Cancer Institute στην Bethesda των Ηνωμένων Πολιτειών, που πίστεψε - 7 -

στην ερευνητική μας προσπάθεια, την αγάπησε και την προώθησε εμπράκτως. Ευχαριστώ επίσης θερμά το Διδάκτορα Βιολόγο κ. Michael Kruhlak από το Experimental Immunology Branch στο National Cancer Institute στην Bethesda των Ηνωμένων Πολιτειών για το χρόνο που διέθεσε, την υπομονή του και την πολύτιμη βοήθειά του στα πειράματα με το συνεστιακό μικροσκόπιο. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω και όλους του φίλους και συνεργάτες από το παραπάνω Ίδρυμα, που με βοήθησαν σημαντικά καθόλο το χρονικό διάστημα που βρισκόμουν στο NIH εκτελώντας τα πειράματα με το συνεστιακό μικροσκόπιο. Ευχαριστώ επίσης θερμά την Ομότιμη Καθηγήτρια κ. Χάιδω Τσάνταλη, μέλος της τριμελούς επιτροπής, για το ενδιαφέρον και την εμπιστοσύνη που έδειξε σε όλα τα στάδια της μελέτης. Θερμές ευχαριστίες και στην Καθηγήτρια κ. Ευδοξία Δίζα- Ματαυτσή, μέλος επίσης της τριμελούς επιτροπής, για το ενδιαφέρον και τις εποικοδομητικές υποδείξεις της κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Πολλές ευχαριστίες οφείλω επίσης στον Ομότιμο Καθηγητή κ. Ιωάννη Τσιούρη, στην Ομότιμη Καθηγήτρια κ. Θεοδούλη Παπασταύρου-Μαυρουδή, πρώην Διευθυντές της Γ Παιδιατρική Κλινικής, και στον Καθηγητή κ. Ιωάννη Τσανάκα, νυν Διευθυντή της Γ Παιδιατρικής Κλινικής, για την ευκαιρία που μου έδωσαν, μαζί με τον πρώτο επιβλέποντα, να εκπονήσω τη διδακτορική μου διατριβή στη Γ Παιδιατρική Κλινική του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω το Λέκτορα κ. Χαράλαμπο Ανταχόπουλο για τα πολύτιμα εφόδια ερευνητικής μεθοδολογίας που μου μετέδωσε κατά τη διάρκεια της διπλωματικής μου εργασίας, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού μου στην Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία, που αποτέλεσαν τις βάσεις για τη μετέπειτα ερευνητική μου πορεία. Εκ βαθέων επίσης ευχαριστίες στο προσωπικό του ερευνητικού εργαστηρίου Λοιμώξεων της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ και ιδιαίτερα στη Διδάκτορα Βιολόγο κ. Μαρία Σιμιτσοπούλου για την άριστη καθοδήγηση, το συνεχές ενδιαφέρον της και την αμέριστη συμπαράσταση που μου πρόσφερε στο χρονικό διάστημα διεξαγωγής των πειραμάτων της διατριβής. Επίσης στον Υποψήφιο Διδάκτορα Βιολόγο κ. Αθανάσιο Χατζημόσχου για την άριστη συνεργασία του στην ολοκλήρωση των πειραμάτων της διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τη Βιολόγο κ. Μαρία Δαλακιουρίδου και τις τεχνολόγους κ. Ελπινίκη Γεωργιάδου και κ. Θωμαή Κωνσταντίνου για την τεχνική υποστήριξη και συνεργασία τους στην ολοκλήρωση των πειραμάτων της διατριβής. - 8 -

Επίσης το Διδάκτορα Παιδίατρο κ. Ιωάννη Ντότη για τις χρήσιμες υποδείξεις του στα πειράματα της κυτταρομετρίας ροής. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην πολύτιμη συνεργάτιδα Διδάκτορα Βιολόγο κ. Άννα Ταπάρκου για το χρόνο της και την αναντικατάστατη συνεισφορά της στα πειράματα κυτταρομετρίας ροής. Θα ήθελα ακόμα να εκφράσω τις βαθιές μου ευχαριστίες προς την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Πανεπιστημίου της Πάτρας κ. Φωτεινή Παληογιάννη, για τις χρήσιμες υποδείξεις της κατά τη συγγραφή των δημοσιεύσεων της μελέτης και για τη γενναιόδωρη προσφορά των μονοκυττάρων της κυτταρικής σειράς. Επίσης ευχαριστώ την Καθηγήτρια κ. Χαρίκλεια Χατζησεβαστού-Λουκίδου για την ευγενή παραχώρηση χώρου του εργαστηρίου της για την καλλιέργεια των μονοκυττάρων της κυτταρικής σειράς. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Καθηγητές κ. Μahmoud Ghannoum από το University Hospital του Cleveland of Οhio των Ηνωμένων Πολιτειών, την Καθηγήτρια κ. Joulia Douglas από το University of Glasgow του Ηνωμένου Βασιλείου και τον Καθηγητή κ. Alistair Brown από το University of Aberdeen του Ηνωμένου Βασιλείου για τη γενναιόδωρη προσφορά των στελεχών Candida, που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Κλείνοντας θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συγγενείς και φίλους, που με βοήθησαν ηθικά και με ενθάρρυναν να συνεχίσω στις δύσκολες στιγμές. Τέλος, δε θα ήθελα να παραλείψω να ευχαριστήσω από καρδιάς τους ειδικευόμενους ιατρούς της Γ Παιδιατρικής Κλινικής όπως και τους φοιτητές της Ιατρικής του ΑΠΘ, που αποτέλεσαν τους κύριους εθελοντές αιμοδότες της μελέτης. Ασπασία Κατράγκου Θεσσαλονίκη, 12 Φεβρουαρίου 2010. - 9 -

- 10 -

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 11 -

- 12 -

3 ΜΥΚΗΤΕΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA Στη φύση έχουν περιγραφεί πάνω από 200.000 είδη μυκήτων, από τους οποίους οι περισσότεροι είναι ωφέλιμοι για τον άνθρωπο. Λίγες εκατοντάδες ειδών μυκήτων προκαλούν νόσο στον άνθρωπο και το 90% των λοιμώξεων αυτών προκαλούνται από λίγες δεκάδες μυκήτων. Όλoι oι μύκητες είναι ετερότροφοι ευκαρυωτικoί oργανισμoί, τα κύτταρα των oπoίων έχoυν τoυλάχιστoν έναν πυρήνα, πυρηνική μεμβράνη, ενδoπλασματικό δίκτυo, μιτoχόνδρια και εκκριτική συσκευή. Περιβάλλoνται, επίσης, από κυτταρικό τoίχωμα τo oπoίo καθορίζει τo σχήμα τoυς και απoτελείται από πoλυσακχαρίτες, γλυκoπρωτεΐνες και λιπίδια. Oι περισσότερoι μύκητες είναι υπoχρεωτικά ή πρoαιρετικά αερόβιoι oργανισμoί και παράγoυν ένζυμα πoυ απoικoδoμoύν μια μεγάλη πoικιλία oργανικών oυσιών. Το γένος Candida περιλαμβάνει περίπου 200 είδη, από τα οποία το 65% δεν είναι παθογόνα για τον άνθρωπο. Οι μύκητες του γένους Candida αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του σώματος και μπορούν να προκαλέσουν ευρύ φάσμα λοιμώξεων από τις οποίες οι σοβαρότερες αφορούν ειδικές κατηγορίες ασθενών, όπως οι ανοσοκατεσταλμένοι. Τα τελευταία χρόνια οι λοιμώξεις από στελέχη του γένους Candida παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω αύξησης της συχνότητάς τους αλλά και της αλλαγής στην επιδημιολογία τους (1). 3.1 Ταξινόμηση και μορφολογία των μυκήτων του γένους Candida Το σύστημα ταξινόμησης της ονοματολογίας των μυκήτων είναι περίπλοκο, πολυπαραγοντικό και υπό διαρκή αναθεώρηση. Η σύγχρονη θεώρηση της ταξινόμησης των ανάμορφων, των τελειόμορφων στελεχών Candida καθώς και του στενού «συγγενή» της Candida, Saccharomyces, παρουσιάζεται στον πίνακα 1 (2). Μια πραγματικά σημαντική εξέλιξη, στον τομέα της ταξινόμησης των μυκήτων, αποτελεί η εφαρμογή της μοριακής φυλογενετικής. Γενετικές αναλύσεις αρκετών κλινικά σημαντικών μυκήτων, που ταξινομούνται στο γένος Candida, όπως C. krusei, C. guilliermondii, C. lusitaniae και C. kefyr, έδειξαν ότι στην πραγματικότητα οι οργανισμοί αυτοί είναι ασεξουαλικές (ανάμορφες) μορφές των σεξουαλικών (τελειόμορφων) μυκήτων (πίνακας 2). Επιπλέον μοριακές και φυλογενετικές - 13 -

Πίνακας 1. Ταξινόμηση των ανάμορφων, των τελειόμορφων στελεχών της Candida και του Saccharomyces Βασίλειο : Μύκητες Φύλο : Ascomycota Κλάση : Hemiascomycetes Τάξη : Saccharomycetales Οικογένεια : Metschnikowiaceae Γένος : Clavispora Οικογένεια : Saccharomycetaceae Γένος : * Debaryomyces * Issatchenkia * Pichia Kluyveromyces Saccharomyces Οικογένεια : Candidaceae (Ανάμορφοι) Γένος : Candida * ταξινόμηση που δεν είναι ακόμα σίγουρη μελέτες ανάδειξαν νέα είδη Candida όπως η C. dubliniensis, που προηγουμένως, λανθασμένα, χαρακτηριζόνταν ως C. albicans. Εξαιτίας των διάφορων προβλημάτων των παραδοσιακών συστημάτων ταξινόμησης, αρκετοί ερευνητές εφαρμόζουν μοριακές τεχνικές ταξινόμησης. Η τεχνική που αποδείχθηκε πιο χρήσιμη στον επακριβή καθορισμό των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των διαφόρων ειδών Candida, είναι αυτή που αφορά τη σύγκριση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών που κωδικοποιούν rrna γονίδια (3). Τέτοιες μελέτες, έδειξαν ότι η C. albicans, C. dubliniensis και C. tropicalis, είναι φυλογενετικά πολύ κοντά (Σχήμα 1). Σχήμα 1. Φυλογενετικό δέντρο της C. albicans, διάφορων μη-c. albicans ειδών και του S. cerevisiae. Η κλίμακα αναπαριστά 1% διαφορά στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων. Τα νούμερα παριστούν το ποσοστό εμφάνισης της συγκεκριμένης αλληλουχίας ειδών μετά τη δημιουργία 1000 επιλεγμένων δέντρων (3). Οι μύκητες του γένους Candida αποτελούν μια ιδιαίτερα ετερογενή ομάδα οργανισμών που εμφανίζονται με διάφορες μορφές. Η συχνότερη μορφή, στην οποία απαντάται είτε σε καλλιέργεια είτε στον ξενιστή, κατά την άμεση μικροσκόπηση κλινικού υλικού, είναι ως μονοκύτταρα βλαστοκύτταρα (yeasts) (εικόνα 1Α, Δ και εικόνα 2). Υπό κατάλληλες συνθήκες, όπως στη θερμοκρασία των 37 C του - 14 -

Πίνακας 2. Οι κυριότεροι παθογόνοι μύκητες του γένους Candida Καταγράφηκαν εως το 1988 Σημερινή λίστα Εγγενείς (σεξουαλικές) μορφές C. albicans C. albicans Δεν περιγράφηκε C. tropicalis C. tropicalis Δεν περιγράφηκε C. glabrata C. glabrata Δεν περιγράφηκε C. parapsilosis C. parapsilosis Δεν περιγράφηκε C. krusei C. krusei Issatchenkia orientalis C. guilliermondii C. guilliermondii Pichia guilliermondii C. kefyr α C. kefyr Kluyveromyces marxianus C. viswanathii C. viswanathii Δεν περιγράφηκε C. lusitaniae Clavisopora lusitaniae C. dubliniensis Δεν περιγράφηκε C. famata β Debaryomyces hansenii C. inconspicua Δεν περιγράφηκε C. utilis Pichia jadinii α προηγούμενα γνωστή ως C. pseudotropicalis β προηγούμενα γνωστή ως T. candida ανθρώπινου σώματος, απαντάται και ως πολυκύτταρος οργανισμός εκβάλλοντας από τα βλαστοκύτταρα επιμήκεις εκβλαστήσεις που σχηματίζουν ψευδοϋφές (εικόνα 1Γ). Όταν οι συνθήκες του περιβάλλοντος όπου αναπτύσσονται είναι δυσμενείς επί των ψευδοϋφών παράγονται και ανθεκτικά σπόρια, που ονομάζονται χλαμυδοσπόρια (εικόνα 1Ζ). Η Candida albicans και η Candida dubliniensis σχηματίζουν επιπλέον και πραγματικές υφές (hyphae) (εικόνα 1Β και Ε). Επομένως, τα δύο αυτά είδη θεωρούνται πολυμορφικά (4). Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, που ευνοούν τη δημιουργία εκβλαστήσεων, είναι θερμοκρασία >35 C και ph 6,5 με 7 ή ελαφρώς αλκαλικό. Χαμηλότερες θερμοκρασίες και όξινο ph ευνοούν το σχηματισμό βλαστοκυττάρων. Στην πραγματικότητα, η θερμοκρασία και το ph είναι μόνο κάποιοι από τους παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη της C. albicans. Συγκερκριμένα, από διάφορες ερευνητικές ομάδες, έχει διαπιστωθεί ότι πτωχά σε θρεπτικά υλικά καλλιεργητικά μέσα, μέγεθος ενοφθαλμίσματος <10 6 /ml, συνθήκες μερικής έλλειψης οξυγόνου ευνοούν το σχηματισμό υφών, ενώ η παροχή γλυκόζης (ως μοναδική πηγή άνθρακα), ph<6.5 εως 7, θερμοκρασία <35 C και μεγαλύτερο μέγεθος ενοφθαλμίσματος ευνοούν την ανάπτυξη βλαστοκυττάρων. Στα μυκητολογικά διαγνωστικά εργαστήρια, χρησιμοποιούνται διάφορες παράμετροι, που συνοψίζονται στον πίνακα 3, προκειμένου να διαπιστωθεί το είδος της Candida. Πολλές φορές, συμπληρωματικά, για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται και το βιοχημικό προφίλ των διαφόρων ειδών της Candida (5). - 15 -

A B Γ Δ Ε Ζ Εικόνα 1. Μορφές ανάπτυξης των μυκήτων του γένους Candida. Όλα τα είδη αναπτύσσονται με τη μορφή των βλαστοκυττάρων (Α και Δ) και τα περισσότερα παράγουν κάποια μορφή ψευδοϋφής (Γ). Οι C. albicans και C. dubliniensis παράγουν και πραγματικές υφές (Β και Ε). Οι εκβλαστήσεις εμφανίζονται σε διάφορα σημεία της επιφάνειας του κυττάρου. Σε περιβάλλον με μειωμένη επιφανειακή τάση και όξινο ph σχηματίζονται ανθεκτικά χλαμυδοσπόρια επί των ψευδοϋφών (βέλη, Ζ) (http://panacea.med.uoa.gr) Πίνακας 3. Μορφολογικά χαρακτηριστικά παθογόνων στελεχών του γένους Candida Είδος XΣ ΒΣ Ψευδοϋφή Μέγεθος (μm) CHROM-άγαρ C. albicans + + + 4-6 Χ 6-10 Μπλε-πράσινο C. tropicalis ± - + 4-8 Χ 5-11 Σκούρο μπλε-μπλε-γκρι C. glabrata - - - 1-4 Λευκό, ροζ-μοβ C. parapsilosis - - + 2,5-4 Χ 2,5Χ9 Λευκό, ανοικτό ροζ C. krusei - - +/- 3-5 Χ 6-20 Ανοικτό ροζ, μοβ C. dubliniensis + + + 3-7 Χ 3-14 Σκούρο πράσινο C. guilliermondii - - Απλή 2-5 Χ 3-7 Ανοικτό ροζ, μοβ C. lusitaniae - - Ποικίλλη 2-6 Χ 3-10 Ροζ, γκρίζο-μοβ C. kefyr - - + 2,5-5 Χ 5-10 Ροζ, μοβ C. inconspicua - - Απλή 1,5-3 Χ 3-5 Λευκό, ροζ C. famata - - Απλή 3,7-5 Χ 2,7-4,7 Λευκό, ανοικτό ροζ, μοβ ΧΣ: Χλαμυδοσπόριο, ΒΣ: Βλαστικός σωλήνας, Μέγεθος: μέγεθος βλαστοκυττάρου σε μm, CHROM-άγαρ: αντίδραση στο CHROM-άγαρ - 16 -

Α Β Εικόνα 2. Μακροσκοπική μορφολογία Candida spp. A, Καλλιέργεια κλινικού δείγματος, διακρίνονται οι λείες αποικίες σε συνήθη καλλιεργητικά υλικά. Β, Αποικίες από 4 διαφορετικά είδη Candida σε CHROMagar (εκλεκτικό και διαφορικό υλικό για την απομόνωση των μυκήτων). Τα 4 είδη Candida διακρίνονται από τη μορφολογία των αποικιών τους. Οι 2 ροζ αποικίες αντιστοιχούν στην C. glabrata, οι 2 μπλε-μοβ αποικίες στην C. tropicalis, οι 4 πράσινες στην C. albicans και οι 2 μεγάλες, ανοικτό ροζ στην C. krusei (μεγένθυση Χ 5,5) (6). 3.2 Κυτταρικό τοίχωμα των μυκήτων του γένους Candida Το κυτταρικό τοίχωμα των μυκήτων είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της σταθερότητας και της ζωτικότητάς τους. Το κυτταρικό τοίχωμα της C. albicans αποτελείται από 4 βασικά συστατικά: (i) μαννοπρωτεΐνες, που αποτελούν το 40% της βιομάζας του κυτταρικού τοιχώματος (ii) β-1,3-γλυκάνη, βασικό πολυσακχαρίτη, που σχηματίζοντας ένα τρισδιάστατο δίκτυο παράλληλα με την επιφάνεια του κυτταρικού τοιχώματος, ενισχύει τη σταθερότητά του (iii) β-1,6-γλυκάνη, υδατοδιαλυτό συστατικό που συνδέει τις μαννοπρωτεΐνες με τη β-1,3-γλυκάνη και τη χιτίνη και (iv) μικρό ποσό χιτίνης. Η αρχιτεκτονική του κυτταρικού τοιχώματος των βλαστοκυττάρων και των υφών της C. albicans είναι παρόμοια. Ωστόσο, η σύσταση του κυτταρικού τοιχώματος και ιδιαίτερα η πρωτεϊνική σύσταση ποικίλλει και εξαρτάται ισχυρά από περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ενώ οι αρχικές μελέτες έγιναν στην C. albicans, όλα τα μέχρι σήμερα δεδομένα δείχνουν ότι η δομή του κυτταρικού τοιχώματος των Candida spp. παρουσιάζει σημαντικές ομοιότητες (7, 8). Το κυτταρικό τοίχωμα της C. albicans αποτελείται από μια εσωτερική στιβάδα που περιβάλλεται εξωτερικά από μια ινιδώδους υφής πρωτεϊνική στιβάδα (εικόνα 3). Aυτή η αρχιτεκτονική του κυτταρικού τοιχώματος αποτρέπει την αναγνώριση της β- 1,3-γλυκάνης από τον υποδοχέα της δεκτίνης-1 του συστήματος της φυσικής ανοσίας. Στα βλαστοκύτταρα, στο σημείο που σχηματίζονται εκβλαστήσεις, μετά την αποχώρηση της εκβλάστησης από το μητρικό κύτταρο, δημιουργείται μια «ουλή». - 17 -

Γ Εικόνα 3. Το κυτταρικό τοίχωμα της Candida albicans. Α, Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο βλαστοκονιδίων και υφών C. albicans. Χαρακτηριστική η ινιδώδης υφή της εξωτερικής πρωτεϊνικής στιβάδας (9). B, Σχηματικό διάγραμμα του κυτταρικού τοιχώματος της C. albicans. Διακρίνεται ένας εσωτερικός σκελετός που αποτελείται από τον πολυσακχαρίτη β- 1,3-γλυκάνη και χιτίνη (μαύρες γραμμές), που βρίσκονται παράλληλα με την κυτταρική επιφάνεια. Η συγκρότηση της εσωτερικής στιβάδας διατηρείται από ισχυρούς δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των αλυσίδων της β-1,3-γλυκάνης και από την πρωτεΐνη Pir1 (X) που συνδέει τα μόρια της β-1,3-γλυκάνης. Αυτό το τρισδιάστατο δίκτυο λειτουργεί σαν «υποστήλωμα» για την εξωτερική γλυκοπρωτεϊνική στιβάδα (γκρι γραμμές) που έρχεται σε επαφή με το περιβάλλον, και μέσω του C-τελικού της άκρου με μόρια β-1,6-γλυκάνης (γκρι οβάλ) που, με τη σειρά τους, συνδέονται με τα μόρια της β-1,3-γλυκάνης (10). Γ, Σχηματική παράσταση των κυριότερων συστατικών και της κατανομής τους στο κυτταρικό τοίχωμα (βλ. κείμενο) (8). Στο σημείο αυτό συστατικά της εσωτερικής στιβάδας του κυτταρικού τοιχώματος, όπως χιτίνη και β-1,3-γλυκάνη εκτείθενται στην επιφάνεια (11). Ο σκελετός της εσωτερικής στιβάδας του τοιχώματος της C. albicans αποτελείται από μόρια β-1,3- γλυκάνης συνδεδεμένα ισχυρά με μόρια β-1,6-γλυκάνης και χιτίνης (που είναι πολυσακχαρίτης από β-1,4 συνδεδεμένα πολυμερή Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, GlcNAc) (εικόνα 3Γ). Μεταξύ αυτών των πολυμερών σχηματίζονται δεσμοί υδρογόνου και σχηματίζεται έτσι ένα σταθερό τρισδιάστατο δίκτυο μικροϊνιδίων. Στις περισσότερες μελέτες του κυτταρικού τοιχώματος της C. albicans διαπιστώθηκε ότι τα παραπάνω συστατικά βρίσκονται στην εσωτερική στιβάδα του κυτταρικού τοιχώματος, παρόλο που χιτίνη και γλυκάνη μπορεί να βρεθεί σε όλο το μήκος του τοιχώματος. Εξωτερικά διακρίνεται μια στιβάδα που αποτελείται κυρίως από γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες. Στην C. albicans το μεγαλύτερο μέρος των πρωτεϊνών του κυτταρικού τοιχώματος (Cell Wall Proteins, CWP) είναι γλυκοζυλφωσφατιδυλινοσιτόλη (GPI, glycosylphosphatidylinositol) -εξαρτώμενες πρωτεΐνες (GPI-CWP), που συνδέονται μέσω ενός GPI υπολείμματος με β-1,3-γλυκάνη ή με χιτίνη μέσω συνδετικών μορίων - 18 -

β-1,6-γλυκάνης (εικόνα 3Γ). Οι CWP φυσιολογικά είναι γλυκοζυλιωμένες με πολυσακχαρίτες που περιέχουν μαννόζη (μερικές φορές ονομάζονται μαννάνες) και το 90% του μοριακού τους βάρους οφείλεται στους υδρογονάνθρακες. Οι μαννάνες καθορίζουν πολλούς από τους ορότυπους των Candida spp. (8). 3.3 Λοιμογόνοι παράγοντες των μυκήτων του γένους Candida Οι κυριότεροι λοιμογόνοι παράγοντες που σχετίζονται με την παθογονικότητα των μυκήτων του γένους Candida περιγράφονται παρακάτω: Προσκολλητικότητα. Στην προσκόλληση των μυκήτων του γένους Candida στις επιφάνειες σημαντικό ρόλο παίζουν τα δομικά συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, όπως γλυκάνες, μαννοπρωτεΐνες, πρωτεΐνες, λιπίδια και χιτίνη. Οι μαννοπρωτεΐνες λειτουργούν ως σημεία πρόσδεσης με διάφορα μόρια της επιφάνειας των επιθηλιακών κυττάρων του ξενιστή, όπως ινωδογόνο, ινονεκτίνη του συνδετικού ιστού, λαμινίνη της βασικής μεμβράνης των επιθηλίων, προάγοντας την προσκόλληση και τη διείσδυση στους ιστούς. Στα είδη C. albicans και C. glabrata, τα οποία εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ικανότητα προσκόλλησης συγκριτικά με άλλα είδη Candida, οι προσκολλητικές μαννοπρωτεΐνες κωδικοποιούνται από τα γονίδια ALS και ΕΡΑ, αντίστοιχα (12). Δομές όπως τα ινίδια, που παρατηρούνται σε συγκεκριμένο φαινότυπο του είδους C. albicans, επηρεάζουν την προσκόλληση, την αποφυγή φαγοκυττάρωσης και συνεπώς τη λοιμογόνο δράση αυτού του είδους. Μετά την είσοδο των μυκήτων του γένους Candida στην κυκλοφορία του αίματος, η προσκόλλησή τους στο τοίχωμα των αγγείων διευκολύνεται από τη δυνατότητά τους να προσελκύουν τα αιμοπετάλια, ενώ η προσκόλληση σε εν τω βάθει όργανα του ξενιστή επιτυγχάνεται μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (13). Σχηματισμός βιολογικών υμενίων. Η σημασία τους για την παθογονικότητα των μυκήτων του γένους Candida αναλύεται στο παρακάτω κεφάλαιο. Διμορφισμός μυκήτων και δυνατότητα σχηματισμού αληθών υφών ή ψευδοϋφών. Την ικανότητα σχηματισμού ψευδοϋφών διαθέτουν όλα τα είδη Candida, εκτός από το είδος C. glabrata, που απαντάται μόνο με τη μορφή βλαστοκυττάρων σε όλες τις συνθήκες ανάπτυξης. Αληθείς υφές παράγουν τα είδη C. albicans και C. dubliniensis (14). Ο σχηματισμός των ψευδοϋφών/υφών, που κωδικοποιείται από το γονίδιο camp- Efg, ρυθμίζεται από ποικίλους παράγοντες, όπως θερμοκρασία, ph, συστατικά του ορού, ύπαρξη πηγών άνθρακα, μερική τάση CO 2, κυτταροκίνες (INF-γ, - 19 -

προσταγλανδίνες Ε 2 ) και έκθεση σε αντιμυκητιακά φάρμακα (15, 16). Για τους μύκητες του γένους Candida, η ανάπτυξη ψευδοϋφών/υφών αποτελεί σημαντικό παράγοντα παθογονικότητας, διότι προάγει τη διείσδυσή τους και εμποδίζει τη δράση των ουδετεροφίλων/μακροφάγων του ξενιστή, λόγω του μεγέθους της υφής που δυσχεραίνει τη φαγοκυττάρωση. Ανάλογη σημασία αποδίδεται στο σχηματισμό βλαστικού σωλήνα, ιδιότητα που χαρακτηρίζει τα είδη C. albicans και C. dubliniensis (16, 17). Γενικότερα ισχύει ότι η παρουσία υφών σχετίζεται θετικά με τη διεισδυτικότητα των στελεχών στους ιστούς, ενώ η παρουσία μόνο ή κυρίως βλαστοκυττάρων σχετίζεται και με αποικισμό, χωρίς όμως οι παρατηρήσεις αυτές να είναι απόλυτες. Σε ορισμένες έρευνες διαπιστώνεται ότι η παρουσία υφών στα αρχικά στάδια συστηματικής λοίμωξης σχετίζεται κυρίως με διείσδυση στους ιστούς, ενώ η παρουσία βλαστοκυττάρων σχετίζεται με τη διασπορά στην κυκλοφορία του αίματος (18). Έκκριση λυτικών ενζύμων και τοξινών. Οι πρωτεϊνάσες που παράγονται από τους μύκητες του γένους Candida συμμετέχουν στη διαδικασία διείσδυσης στα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας, ενώ παράλληλα μπορεί να αυξήσουν τη διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος μέσω ενεργοποίησης του συστήματος καλλικρεΐνης-κινίνης. Όσον αφορά το είδος C. albicans, η πρωτεολυτική δράση αυτών των ενζύμων, που κωδικοποιούνται από τα γονίδια SAP1-SAP9, με σημαντικότερο από αυτά το SAP2, προάγει την ανάπτυξη επίμονων επιπολής καντιντιάσεων, πιθανόν προκαλώντας διάσπαση πρωτεϊνικών μορίων του ξενιστή (κερατίνη, κολλαγόνο, ένζυμα αναστολείς των μακροφάγων) (19). Παραγωγή πρωτεϊνασών έχει τεκμηριωθεί επίσης από τα είδη C. dubliniensis, C. tropicalis και C. parapsilosis, ενώ υπό ορισμένες συνθήκες, την ιδιότητα αυτή εμφανίζουν και τα είδη C. lusitaniae και C. guilliermondii (20). Επιπλέον, οι λιπάσες και οι φωσφολιπάσες του είδους C. albicans διευκολύνουν τη διείσδυση στους ιστούς και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο τόσο στην παθογένεια όσο και στην εξέλιξη των συστηματικών καντιντιάσεων. Στελέχη του είδους C. albicans παράγουν ποικίλες τοξίνες, που διακρίνονται σε υψηλού μοριακού βάρους (την καντιτοξίνη, που μπορεί να προκαλέσει το θάνατο σε πειραματόζωα μέσω αναφυλακτικού shock) και σε τοξίνες χαμηλού μοριακού βάρους, οι οποίες είναι τοξικότερες των προηγουμένων και μειώνουν τη χημειοταξία και συνεπώς τη φαγοκυττάρωση της C. albicans (21). - 20 -

4 ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΜΕΝΙΑ 4.1 Ιστορική αναδρομή Κατά την ιστορία της μικροβιολογίας, στο μεγαλύτερο μέρος της, οι μικροοργανισμοί χαρακτηρίζονται ως πλανκτονικοί (ελεύθεροι) κινούμενοι μεμονωμένα σε διάφορα θρεπτικά υλικά. Πρώτος ο van Leeuwenhoek, το 17 ο αιώνα με το απλό του μικροσκόπιο, περιέγραψε τα «ζωύφια» (animalcules) σε υλικό της οδοντικής του πλάκας. Πολύ αργότερα οι Heukelekian και Heller, περιέγραψαν το «φαινόμενο της φιάλης» μια σημαντική δηλαδή αύξηση της ανάπτυξης θαλάσσιων μικροοργανισμών όταν αυτοί έρχονται σε επαφή με μία επιφάνεια στην οποία μπορούσαν να προσκολληθούν (22). Σχεδόν συγχρόνως ο Zobell παρατήρησε ότι ο αριθμός των βακτηρίων στις επιφάνειες είναι σημαντικά μεγαλύτερος από ό,τι στο υλικό που τα περιβάλλει (στην προκειμένη περίπτωση, στο θαλάσσιο νερό) (23). Μια πραγματικά νέα ώθηση στην περιγραφή των βιολογικών υμενίων (ΒΥ) δόθηκε με την ανακάλυψη του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Ο Jones και συν. (24) χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, για την εξέταση ΒΥ από φίλτρα νερού, διαπίστωσαν ότι αυτά αποτελούνται από ποικιλλία οργανισμών. Με τη χρήση κατάλληλων χρωστικών, οι ερευνητές αυτοί μπόρεσαν να δείξουν ότι η εξωκυττάρια ουσία, που περικλείει τους οργανισμούς στο ΒΥ, είναι κυρίως πολυσακχαρίτης. Το 1973 ο Characklis και συν., μελετώντας εξωκυττάριες ουσίες από μικροβιακά ΒΥ από αποχετεύσεις εργοστασίων, έδειξαν ότι τα ΒΥ είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά σε απολυμαντικά, όπως η χλωρίνη. Βασισμένοι σε παρατηρήσεις στην οδοντική πλάκα και σε μικροβιακές αποικίες σε ρυάκια, ο Costerton και συν., το 1978 αναπτύσσουν τη θεωρία των ΒΥ, όπου εξηγούν τους μηχανισμούς προσκόλλησης σε έμψυχες ή άψυχες επιφάνειες και τα πλεονεκτήματα που προκύπτουν από αυτόν τον αποκισμό (25). Το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας πάνω στα ΒΥ, τις τελευταίες δύο δεκαετίες, βασίστηκε σε εργαλεία, όπως το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και οι συνήθεις μικροβιολογικές καλλιεργητικές τεχνικές. Την τελευταία δεκαετία όμως δύο σημαντικές ανακαλύψεις συνέβαλαν ακόμα περισσότερο στην προώθηση της έρευνας στα ΒΥ: α) η χρήση του συνεστιακού μικροσκοπίου και β) η ανακάλυψη γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική προκόλληση και το σχηματισμό ΒΥ. - 21 -

4.2 Τα Βιολογικά Υμένια - Γενικά Τα ΒΥ αποτελούν μορφή διαβίωσης των μικροοργανισμών. Πρόκειται για αποικίες μικροοργανισμών (βακτηρίων ή μυκήτων ή και μεικτών πληθυσμών), που είναι προσκολλημένες σε μία επιφάνεια (είτε έμψυχη είτε άψυχη). Οι αποικίες αυτές των μικροοργανισμών περιβάλλονται από εξωκυττάρια ουσία (που άλλoτε αναφέρεται και ως «γλυκοκάλυκας»). Η εξωκυττάρια ουσία εκκρίνεται από τους ίδιους τους μικροοργανισμούς του ΒΥ και περιβάλλει, κατά μια έννοια, προστατευτικά τις μικροαποικίες των οργανισμών (26-29). Οι οργανισμοί στα ΒΥ διαφέρουν από τους αντίστοιχους πλανκτονικούς όσον αφορά το ρυθμό ανάπτυξής τους και την έκφραση των γονιδίων τους. Οι μικροοργανισμοί αποτελούν συνήθως το 5-35% του όγκου του ΒΥ ενώ το μεγαλύτερο μέρος του αποτελείται από την εξωκυττάρια ουσία. Η σύσταση και οι ιδιότητες της εξωκυττάριας ουσίας διαφέρουν ανάλογα με το είδος του μικροοργανισμού που συνιστά το ΒΥ και το φυσικό περιβάλλον όπου αυτό αναπτύσεται (30). Σε όλες όμως τις περιπτώσεις η εξωκυττάρια ουσία αποτελείται κατά κύριο λόγο από νερό (έως και 97%) και πολυσακχαρίτες (1-2%) και, ανάλογα με τις συνθήκες ανάπτυξης του ΒΥ, από πρωτεΐνες, νουκλεϊνικά οξέα, λιπίδια, φωσφολιπίδια, ιόντα και διάφορα συστατικά του αίματος (30, 31). Η εξωκυττάρια ουσία περιβάλλοντας τις αποικίες των μικροοργανισμών, λειτουργεί ως «φίλτρο», όπου παγιδεύονται τα απαραίτητα για τη διατήρηση του ΒΥ θρεπτικά συστατικά. Από σειρά μελετών είναι πλέον ξεκάθαρο ότι μεταλλαγμένοι οργανισμοί, που αδυνατούν να συνθέσουν εξωκυττάρια ουσία, δεν μπορούν να σχηματίσουν και ΒΥ (32). Την τελευταία δεκαετία, με τη χρήση σύγχρονων μικροσκοπικών τεχνικών, φάνηκε ότι ΒΥ δημιουργούνται σε πολλές επιφάνειες, όπως επεμβατικά ιατρικά εργαλεία (π.χ. καθετήρες, τεχνητές προθέσεις και βαλβίδες), ζωντανές επιφάνειες (π.χ. ενδοθήλιο καρδιάς, αδαμαντίνη δοντιών), αποχετευτικά συστήματα βιομηχανιών ή φυσικά οικοσυστήματα (30). Η δομική ετερογένεια των ΒΥ απεικονίζεται χαρακτηριστικά στις ηλεκτρονικές φωτογραφίες της εικόνας 4. Φαίνεται λοιπόν ότι τα ΒΥ αποτελούν πολύπλοκες τρισδιάστατες δομές, όπου οι μικροαποικίες των μικροοργανισμών περιβαλλόμενες από την εξωκυττάρια ουσία, εμφανίζονται ως «πύργοι σε σχήμα μανιταριού» (εικόνα 4Γ). Επίσης οι «κοινότητες» των μικροαποικιών διασχίζονται από δίκτυο διαύλων με νερό, που συντελούν στην προσαγωγή και απαγωγή θρεπτικών συστατικών αλλά και στη διατήρηση μιας - 22 -

βαθμίδωσης στο οξυγόνο και ph κατά μήκος του ΒΥ έτσι ώστε οι επιφανειακές στιβάδες να εμφανίζονται μεταβολικά πιο δραστήριες. Γενικά τα ΒΥ θεωρούνται «δυναμικές οντότητες», ετερογενείς στο χώρο και στο χρόνο, που υπόκεινται σε πολλαπλές ενδογενείς (μέσω συμμετοχής μορίων διακυτταρικής χημικής επικοινωνίας, quorum sensing) αλλά και περιβαλλοντικές επιδράσεις (26, 33, 34). A B Γ Εικόνα 4. Α, φωτογραφία βιολογικού υμενίου πάνω σε μεταλλική επιφάνεια αποχετευτικού σωλήνα βιομηχανίας με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Το βιολογικό υμένιο είναι ιδιαίτερα ετερογενές, περιέχει προϊόντα αποδόμησης του μετάλλου, συστατικά του εδάφους και βακτήρια σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης (35). Β, φωτογραφία βιολογικού υμενίου από σταφυλόκοκκο στην εσωτερική επιφάνεια καθετήρα με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (φωτογραφία του Janice Carr, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA). Γ, σχηματική απεικόνιση του βιολογικού υμενίου, φαίνεται η τρισδιάστατη δομή, τα βιολογικά υμένια εμφανίζονται ως «πύργοι σε σχήμα μανιταριού» που διασχίζονται από δίκτυο διαύλων (Center for Biofilm Engineering, Montana State University, Bozemann, Montana). Όπως φαίνεται στην εικόνα 5, ο «κύκλος ζωής» του ΒΥ συνοπτικά μπορεί να διακριθεί σε 3 φάσεις ανάπτυξης. Στην αρχική φάση της προσκόλλησης (στάδιο 1 και 2), που είναι σημαντικός ο ρόλος της επιφάνειας προσκόλλησης (σύσταση, υφή, στρώμα επικάλυψης). Στην ενδιάμεση φάση ωρίμανσης (στάδιο 3 και 4), που τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται, σχηματίζουν μικροαποικίες και περιβάλλονται από την εξωκυττάρια ουσία. Στη φάση αυτή τα ΒΥ αποκτούν τρισδιάστατη δομή και εμφανίζονται οι «πύργοι» και τα «δίκτυα». Στην τελική φάση ωρίμανσης (στάδιο 5) κύτταρα από το ΒΥ είναι δυνατό να αποσπαστούν (υπό την επίδραση μηχανικών ή υδροδυναμικών αποσπαστικών δυνάμεων ή λόγω έλλειψης θρεπτικών συστατικών) να μεταφερθούν σε άλλες περιοχές που θα αποικίσουν εκ νέου οπότε και θα ξεκινήσει ένας νέος «κύκλος ζωής ΒΥ» (35). Στην κλινική πράξη, τα ΒΥ απέκτησαν ιδιαίτερη σημασία εξαιτίας της συσχέτισής τους με τη χρήση επεμβατικών ιατρικών εργαλείων και τη σύγχρονη αύξηση των λοιμώξεων, που σχετίζονται με τα εργαλεία αυτά, που συχνά είναι επιμένουσες και ανθεκτικές στην αντιμικροβιακή αγωγή. - 23 -

Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση του «κύκλου ζωής» του βιολογικού υμενίου. Στάδιο 1: αρχική αντιστρεπτή προσκόλληση κυττάρων στην επιφάνεια. Στάδιο 2: παραγωγή της εξωκυττάριας ουσίας (μη-αντιστρεπτή προσκόλληση στην επιφάνεια). Στάδιο 3: έναρξη φάσης ωρίμανσης βιολογικού υμενίου. Στάδιο 4: ώριμο βιολογικό υμένιο. Στάδιο 5: Αποκόλληση και διασπορά μεμονωμένων κυττάρων από τις μικροαποικίες του ώριμου βιολογικού υμενίου. [Τροποποιημένο από (35)]. Αν και η βιολογία και παθογένεση των βακτηριακών ΒΥ έχει μελετηθεί εκτενώς (26, 30, 36), τα μυκητιακά ΒΥ πρόσφατα έχουν προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον. 4.3 Ρόλος των Βιολογικών Υμενίων στις λοιμώξεις Τα ΒΥ, που έχουν κλινική σημασία για τον άνθρωπο, μπορούν να διακριθούν σε αυτά που αναπτύσσονται στην επιφάνεια ιστών και αυτά που αναπτύσσονται στην επιφάνεια διάφορων επεμβατικών ιατρικών εργαλείων και βιοπροσθετικών υλικών. Τα τελευταία 20 χρόνια ολοένα και περισσότερες χρόνιες λοιμώξεις σχετίζονται με το σχηματισμό ΒΥ. Σύμφωνα με εκτιμήσεις του CDC (Κέντρο Eλέγχου και Πρόληψης Νόσων) τουλάχιστο το 65% όλων των βακτηριακών λοιμώξεων περιλαμβάνουν το σχηματισμό ΒΥ (37). Το φάσμα των μικροοργανισμών που σχηματίζουν ΒΥ, και στους δύο αυτούς τύπους επιφανειών (έμψυχες και άψυχες) είναι ιδιαίτερα ευρύ, όπως φαίνεται και στον πίνακα 6 και περιλαμβάνει μεγάλο αριθμό γνωστών παθογόνων βακτηρίων και μυκήτων. Ένα ΒΥ μπορεί να είναι μονο- ή πολυ-μικροβιακό (38). - 24 -

Πίνακας 6. Λοιμώξεις που σχετίζονται με το σχηματισμό Βιολογικών Υμενίων Λοίμωξη Ενδοκαρδίτιδα Κυστική ίνωση (βρογχοπνευμονία) Μέση ωτίτιδα Χρόνια παραρινοκολπίτιδα Περιοδοντίτιδα Μυοσκελετικές λοιμώξεις Λοιμώξεις από επεμβατικά εργαλεία Κεντρικοί φλεβικοί καθετήρες- Καθετήρες Hickman Μικροοργανισμός Πρασινίζοντες στρεπτόκοκκοι, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae H. influenzae, S. aureus, P. aeruginosa Gram-αρνητικά αναερόβια βακτήρια Gram-θετικοί κόκκοι (π.χ. σταφυλόκοκκοι) Πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι, S. aureus, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, Candida albicans S. aureus, P. aeruginosa, Candida spp. Καθετήρες περιτοναϊκής διΰλισης Ενδοτραχειακοί σωλήνες Candida spp., P. aeruginosa, Enterococcus, Staphylococcus και Streptococcus spp. Ουροκαθετήρες E. coli και άλλα Gram-αρνητικά βακτήρια Φακοί επαφής P. aeruginosa, Gram-θετικοί κόκκοι, Fusarium spp. Ορθοπεδικές προθέσεις S. aureus, S. epidermidis Αρτηριοφλεβικές αναστομώσεις S. aureus, S. epidermidis Το κύριο κλινικό χαρακτηριστικό των ΒΥ είναι η αξιοσημείωτα αυξημένη αντοχή που εμφανίζουν στους διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε σχέση με τις αντίστοιχες πλανκτονικές (ελεύθερες) μορφές των μικροοργανισμών (39-42). Όπως φαίνεται και συγκριτικά στον πίνακα 7, οι μικροοργανισμοί με τη μορφή του ΒΥ παρουσιάζουν πολύ μεγαλύτερη αντοχή στα αντιμικροβιακά και αντιμυκητιακά φάρμακα τουλάχιστο σε κλινικά αποδεκτές συγκεντρώσεις. Ωστόσο, φαίνεται ορισμένα φάρμακα να είναι πιο δραστικά έναντι των ΒΥ σε σύγκριση με άλλα. Για παράδειγμα, έχει διαπιστωθεί in vitro ότι η σιπροφλοξασίνη και η τομπραμυκίνη είναι πιο αποτελεσματικές έναντι των ΒΥ από Pseudomonas aeruginosa και η γενταμυκίνη έναντι των ΒΥ από Staphylococcus aureus (43). Άλλοι πάλι ερευνητές κατέληξαν ότι η σιπροφλοξασίνη και η κουϊνοπριστίνη/δαλφοπριστίνη είναι αποτελεσματικές έναντι του Staphylococcus epidermidis σε αντίθεση με τη βανκομυκίνη, την τειχοπλανίνη και την ερυθρομυκίνη (44), ενώ άλλοι διαπίστωσαν ότι η κλαρυθρομυκίνη είναι δραστική έναντι του S. epidermidis (45). Το κοινό πάντως σε όλες αυτές τις μελέτες είναι ότι χρειάζονται σαφώς πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις φαρμάκου για τον περιορισμό του ΒΥ σε σχέση με την ελεύθερη μορφή του μικροοργανισμού. Όσον αφορά τα μυκητιακά ΒΥ αρχικές μελέτες έχουν δείξει ότι είναι πιο ευαίσθητα στην κασποφουγκίνη και στη λιπιδική μορφή της αμφοτερικίνης Β σε σχέση με τις αζόλες (φλουκοναζόλη και ιτρακοναζόλη) (29, 46). Τα in vitro αυτά ευρήματα, που ορισμένα - 25 -

Πίνακας 7. Ευαισθησίες μικροοργανισμών σε αντιμικροβιακά/αντιμυκητιακά φάρμακα: σύγκριση πλανκτονικών μορφών με Βιολογικά Υμένια Μικροοργανισμός Αντιμικροβιακό/ PLMIC α MBEC β Αντιμυκητιακό (μg/ml) (μg/ml) Βιβλ. P. aeruginosa ATCC27853 Αμικασίνη 2 16 (39) P. aeruginosa ATCC27853 Αζτρεονάμη 2 >1.024 (39) P. aeruginosa ATCC27853 Κεφταζιδίμη 1 >1.024 (39) P. aeruginosa ATCC27853 Σιπροφλοξασίνη 0,25 4 (39) P. aeruginosa ATCC27853 Ιμιπενέμη 1 >1.024 (39) P. aeruginosa ATCC27853 Τομπραμυκίνη 0,5 2 (39) S. aureus ATCC29213 Κεφαζολίνη 0,5 >1.024 (39) S. aureus ATCC29213 Σιπροφλοξασίνη 0,25 512 (39) S. aureus ATCC29213 Κλινδαμυκίνη 0,12 128 (39) S. aureus ATCC29213 Γενταμυκίνη 0,5 2 (39) S. aureus ATCC29213 Πενικιλλίνη 1 128 (39) S. aureus ATCC29213 Βανκομυκίνη 1 >1.024 (39) E. coli ATCC25922 Αμπικιλλίνη 2 512 (26) C. albicans M61 Φλουκοναζόλη 1 >256 (46) C. albicans M61 Αμφοτερικίνη Β 0,5 4 (46) C. albicans M61 Λιποσωματική Αμφ. Β 0,5 0,25 (46) C. albicans M61 Λιπιδικό σύμπλ. Αμφ. Β 0,25 0,25 (46) C. parapsilosis PA/71 Φλουκοναζόλη 8 >256 (46) C. parapsilosis PA/71 Αμφοτερικίνη Β 0,25 8 (46) C. parapsilosis PA/71 Λιποσωματική Αμφ. Β 0,06 1 (46) C. parapsilosis PA/71 Λιπιδικό σύμπλ. Αμφ.Β 0,06 0,25 (46) α PLΜΙC, Planktonic Μinimal Inhibitory Concentration (Ελάχιστη Ανασταλτική Συγκέντρωση της Πλανκτονικής μορφής), όπως προσδιορίστηκε σύμφωνα με τα κριτήρια NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) β MBEC, Minimal Biofilm Eradication Concentration (Ελάχιστη Συγκέντρωση Εκρίζωσης Βιολογικού Υμενίου). Οι τιμές προέκυψαν, για τα μεν μικρόβια, από μετρήσεις οπτικής πυκνότητας στα 650 nm. Για τους δε μύκητες ως MBEC ορίστηκε η ελάχιστη συγκέντρωση του φαρμάκου που προκαλεί τουλάχιστον 50% ελάττωση της μεταβολικής δραστηριότητας του βιολογικού υμενίου (βλ. αντίστοιχες βιβλιογραφικές παραπομπές). από αυτά έχουν επιβεβαιωθεί και in vivo (47), εξηγούν την αδυναμία εκρίζωσης λοιμώξεων που σχετίζονται με το σχηματισμό ΒΥ. Προκειμένου όμως να αξιολογηθεί η κλινική εφαρμογή των παραπάνω ευρημάτων απαιτείται επιβεβαίωσή τους αρχικά in vivo και στη συνέχεια σε κλινικές μελέτες. Εκτός από την αντοχή στους διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες, πρόσθετο πρόβλημα στην προσπάθεια ριζικής αντιμετώπισης των λοιμώξεων, που σχετίζονται με το σχηματισμό ΒΥ, προκαλεί το γεγονός ότι οι κλασσικές μέθοδοι in vitro ελέγχου της αποτελεσματικότητας και επιλογής του κατάλληλου αντιμικροβιακού φαρμάκου, δεν είναι ιδιαίτερα αξιόπιστες για την in vivo αποτελεσματικότητα του εκάστοτε φαρμάκου. Έτσι, η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (minimal inhibitory - 26 -

concentration, MIC) και η ελάχιστη μικροβιοκτόνος συγκέντρωση (minimal bactericidal concentration, MBC), εκτιμούν την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων έναντι των ελεύθερων (πλανκτονικών) οργανισμών, που βρίσκονται σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, αλλά αδυνατούν να προβλέψουν την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου έναντι του ΒΥ (38). Αν και μέχρι σήμερα λίγα είναι γνωστά σχετικά με την αλληλεπίδραση ΒΥ και των μηχανισμών φυσικής ανοσίας, in vitro μελέτες έδειξαν ότι τα ΒΥ από S. aureus (48) και Candida spp.(49) είναι ανθεκτικά και στη δράση των φαγοκυττάρων. Σε άλλες πάλι μελέτες φάνηκε ότι τα φαγοκύτταρα δρουν ευοδωτικά στο σχηματισμό ΒΥ από P. aeruginosa και C. albicans (49, 50). Επιπλέον τα ΒΥ φαίνεται να ενεργοποιούν την παραγωγή αντισωμάτων και κυτταροκινών (48, 49). Η εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων, που ακολουθεί την παραγωγή αντισωμάτων έναντι του ΒΥ, και η «οξειδωτική έκρηξη» των φαγοκυττάρων έχει ως αποτέλεσμα να προκαλείται τελικά μεγαλύτερη καταστροφή στους γειτονικούς ιστούς από ό,τι προκαλεί άμεσα το ίδιο το ΒΥ. Κλασσικό παράδειγμα τέτοιου τύπου αντίδρασης είναι η ίνωση του πνευμονικού παρεγχύματος που παρατηρείται στην πνευμονία από P. aeruginosa στους ασθενείς με κυστική ίνωση (51). Τα ΒΥ επίσης μπορεί να αποτελέσουν μια εμμένουσα πηγή λοίμωξης καθώς οι μικροοργανισμοί που τα αποτελούν είναι δυνατό, όταν οι συνθήκες το επιτρέψουν, να αποσπαστούν και μέσω της κυκλοφορίας να αποικίσουν άλλους ιστούς ή επιφάνειες (π.χ. καθετήρες ή επιθήλια) προκαλώντας κατά αυτόν τον τρόπο οξεία λοίμωξη ή αναπαράγοντας το σχηματισμό ΒΥ, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω. Τα αντιμικροβιακά μπορούν να σκοτώσουν τους μικροοργανισμούς που έχουν αποσπαστεί από το ΒΥ χωρίς όμως να μπορούν να «εκριζώσουν» τους μικροοργανισμούς που είναι μέσα στο υμένιο. Έτσι μπορεί να εξηγηθεί η υποτροπιάζουσα φύση των χρόνιων λοιμώξεων, που σχετίζεται με το σχηματισμό ΒΥ (52). Το ερώτημα ποιες λοιμώξεις προκαλούνται από ΒΥ και πώς διαπιστώνεται αυτό είναι δύσκολο να απαντηθεί. Αυτό συμβαίνει διότι σε πολλές λοιμώξεις είναι δύσκολη η προσέγγιση και απομόνωση των υπεύθυνων μικροοργανισμών όπως επίσης οι δύο φαινότυποι (ΒΥ και πλανκτονικές μορφές) είναι δυνατό να συνυπάρχουν. Επιπλέον δεν υπάρχει επακριβής βιολογικός δείκτης που να προσδιορίζει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού με τη μορφή του ΒΥ. Τα ΒΥ αποτελούν μια οργανωμένη μορφή ανάπτυξης μικροοργανισμών και συνεπώς ο φαινότυπος αυτός καταστρέφεται όταν αυτοί καλλιεργούνται ex vivo. Δεδομένων των παραπάνω δυσκολιών και με βάση τα - 27 -