Διδάσκων: Καθηγητής Εμμανουήλ Μ. Παπαμιχαήλ

Τίτλος Μαθήματος Ενζυμολογία Ενότητα Μηχανισμοί Διδάσκων Καθηγητής Εμμανουήλ Μ. Παπαμιχαήλ Τμήμα Χημείας

103 4. ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ 4.1 Οξειδοαναγωγάσες Τα ένζυμα της τάξης αυτής χρησιμοποιούν κατά κανόνα συνένζυμα για την κατάλυση των οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων. Έτσι θα αρχίσουμε το κεφάλαιο αυτό με τη παρουσίαση και την ανάλυση της δράσης των κυριοτέρων συνενζύμων, που χρησιμοποιούν οι οξειδοαναγωγάσες. Εκτός βέβαια από αυτά, που θα αναφέρουμε, υπάρχουν και άλλα συνένζυμα των οξειδοαναγωγασών με πιο εξειδικευμένη δράση και των οποίων η μελέτη είναι πέρα από τους σκοπούς του βοηθήματος αυτού. Τα πλέον γνωστά συνένζυμα των οξειδοαναγωγασών είναι τα AD (νικοτιναμιδοαδενινοδινουκλεοτίδιο) και ADP (φωσφορυλιωμένο νικοτιναμιδοαδενινοδινουκλεοτίδιο), τα οποία με αναγωγή μετατρέπονται σε AD και ADP, αντίστοιχα. Έχουν την παρακάτω σχετικά απλή δομή 2 R 2 P P 2 3 2 4 5 1 6 2 Η δομή των οξειδωμένων μορφών των συνενζύμων AD [R = ] και ADP [R = P() 2 ]. Τα μόρια δεν είναι φορτισμένα. Το θετικό φορτίο του νικοτιναμιδικού δακτυλίου εξισορροπείται από τον ιονισμό μιας από τις φωσφορικές ομάδες. Στο μόριο φαίνεται η αρίθμηση του νικοτιναμιδικού δακτυλίου. Η αναγωγή των οξειδωμένων μορφών των συνενζύμων αυτών απαιτεί τη μεταφορά δύο ατόμων υδρογόνου, ένα πάνω στο Ν 1 του δακτυλίου του

104 νικοτιναμιδίου και ένα δεύτερο στον 4 του ίδιου δακτυλίου, κατά τις αντιδράσεις [ζ] 2 2 2 R R R 2 [ζ] Η δεύτερη αντίδραση, συμβαίνει σε ουδέτερα και αλκαλικά διαλύματα άρα είναι και η πιο συνηθισμένη μορφή των ανηγμένων συνενζύμων (ADΗ και ADPΗ). Γι αυτό αντί AD 2 και ADP 2 γράφουμε AD και ADP. Οι παρακάτω αντιδράσεις [η] αποτελούν ένα παραστατικό παράδειγμα, όπου φαίνεται η δράση των συνενζύμων αυτών. Πρόκειται για την οξείδωση αιθανόλης δευτεριωμένης στον 4 από το ένζυμο της αλκοολικής αφυδρογονάσης (E 1.1.1.2) με τη βοήθεια του συνενζύμου ADP. Δεν χρειάζονται περιττά λόγια για να φανεί, εκτός των άλλων και η στερεοεξειδίκευση στη δράση των συνενζύμων αυτών.

105 D D 2 D D 2 2 2 R R [η] D 2 2 2 2 D R R Μια άλλη ομάδα συνενζύμων των οξειδοαναγωγασών είναι τα γνωστά ως φλαβινοσυνένζυμα FM (φλαβινομονονουκλεοτίδιο) και FAD (φλαβινο αδενινοδινουκλεοτίδιο), τα οποία έχουν τις παρακάτω δομές P P () 3 2 3 3 Η οξειδωμένη ενολική δομή του FM. Η κετονική μορφή σχηματίζεται με τη μεταφορά του υδρογόνου, του υδροξυλίου του πυριμιδινικού δακτυλίου, στο πλησιέστερο ετεροάτομο αζώτου, και τη μετατροπή του διπλού δεσμού σε απλό.

106 2 2 P P () 3 2 3 3 Η οξειδωμένη ενολική δομή του FAD. Η εναλλαγή μεταξύ ενολικής και κετονικής μορφής γίνεται όπως στο FM. Η αναγωγή των οξειδωμένων μορφών των φλαβινοσυνενζύμων μπορεί να αναπαρασταθεί με τις παρακάτω αντιδράσεις. Για ευκολία θα αναγράφεται μόνο η ενεργή φλαβινομάδα, ενώ το υπόλοιπο τμήμα του μορίου αναφέρεται ως R. 3 3 R.. R.... p e 3. 3.. [θ] p e 3 3 R...... 3 3 R..... Η αναγωγή γίνεται με την ενσωμάτωση δύο μορίων υδρογόνου ανά μόριο φλαβινοσυνενζύμου. Για την αναπαράσταση του μηχανισμού υποθέτουμε ότι κάθε άτομο υδρογόνου, που συνίσταται από ένα πρωτόνιο (p ) και ένα ηλεκτρόνιο (e ), ενσωματώνεται ξεχωριστά και σε σειρά.

107 ή π.χ. [ι] υπόθεση αυτή δεν απέχει πολύ από την αλήθεια. Aρκεί να σκεφθούμε ότι σ ένα διάλυμα δεν μπορούν να υπάρχουν ως αυθύπαρκτες οντότητες ούτε μόρια υδρογόνου ούτε, βέβαια, πρωτόνια ή ηλεκτρόνια. Σ ένα διάλυμα μπορούν να υπάρχουν οι ολιγομερείς μορφές των συναθροισμάτων (cluster) του νερού, δηλαδή ( 2 ) ν, τα οποία είναι και οι μεταφορείς των πρωτονίων είτε και των ηλεκτρονίων κατά τις αντιδράσεις [ι]. Έτσι, με βάση τις αντιδράσεις [θ], η αναγωγή αρχίζει με πρωτονίωση του ατόμου του αζώτου του διαζωλικού δακτυλίου το οποίο διαθέτει ένα ελεύθερο ζεύγος ηλεκτρονίων με sp 2 υβριδισμό των εξώτατων τροχιακών του

108 και την ταυτόχρονη δημιουργία μιας ελεύθερης ρίζας από το γειτονικό του άτομο άνθρακα, που δεσμεύει το e. Στη συνέχεια το ίδιο φαινόμενο επαναλαμβάνεται με το ένα άτομο αζώτου του πυριμιδινικού δακτυλίου, που διαθέτει τροχιακά με sp 2 υβριδισμό και το γειτονικό του άτομο άνθρακα. Ο υβριδισμός των εξώτατων τροχιακών του δεύτερου ατόμου αζώτου του πυριμιδινικού δακτυλίου, που συμμετέχει στην εναλλαγή μεταξύ ενολικής και κετονικής μορφής του συνενζύμου, είναι sp 3 και έτσι δεν ευνοείται η δέσμευση, σ αυτό, του πρωτονίου. Τέλος οι δύο ελεύθερες ρίζες άνθρακα αντιδρούν μεταξύ τους και σταθεροποιούν το μόριο με τη δημιουργία ενός διπλού δεσμού. Μια τρίτη ομάδα περιλαμβάνει συνένζυμα τα οποία περιέχουν στο μόριό τους θειομάδες (σουλφιδικές ομάδες) και είναι γνωστά ως Λιποαμίδιο [Lip(S) 2 ] και Γλουταθειόνη (GS), αντίστοιχα. Οι δομές και οι γενικές αντιδράσεις οξειδοαναγωγής τους είναι οι παρακάτω (τα δύο άτομα υδρογόνου συμβολίζονται ως 2Η για οικονομία του χώρου) S S S S Lip 2 [ια] 2 2 2 2 S (GS) 2 GSS 2 [ιβ]

109 Ας δούμε κάποια παραδείγματα μηχανισμών ενζυμικών αντιδράσεων, που καταλύονται από οξειδοαναγωγάσες. Η μεταφορά ενός υδρογόνου από το υπόστρωμα (αιθυλική αλκοόλη) στο ADP με τη καταλυτική δράση του ενζύμου της αλκοολικής αφυδρογονάσης (E 1.1.1.2), που ήδη έχουμε περιγράψει γενικά με τις αντιδράσεις [η], γίνεται με τον παρακάτω μηχανισμό

110 Zn Ḅ. 3 1 2 Zn Ḅ. 3 2 2 [ιγ] Zn Ḅ. 3 4 2 Zn Ḅ. 3 2 3 Σχηματική παράσταση της αμφίδρομης αντίδρασης μεταφοράς υδρογόνου. Το ένζυμο της αλκοολικής αφυδρογονάσης περιέχει στο καταλυτικό του κέντρο ένα δισθενές κατιόν (Zn ) και μια βασική ομάδα Β, δότη ζεύγους ηλεκτρονίων. Αυτό το κατιόν συγκρατεί το υπόστρωμα με ιονικό δεσμό, μετά τη πυρηνόφιλη προσβολή του αλκοολικού υδροξυλίου από την ομάδα Β, προσανατολισμένο έτσι ώστε να καταστεί εύκολη η μεταφορά του υδρογόνου στον δακτύλιο του νικοτιναμιδίου. Το ένζυμο αλκοολική αφυδρογονάση περιλαμβάνει εντός της ενεργού περιοχής του και άλλες θέσεις δέσμευσης π.χ. για το υδρόφοβο τμήμα της αλκοόλης, για το συνένζυμο ADP κλπ. Στις αντιδράσεις [ιδ] δίνονται σχηματικά τα κύρια χαρακτηριστικά του μηχανισμού της οξειδοαναγωγικής δράσης της αφυδρογονάσης του λιποαμιδίου (E 1.6.4.3). Εδώ φαίνεται καθαρά η συνδυασμένη δράση του νικοτιναμιδοαδενινοδινουκλεοτιδίου AD() με το φλαβινοσυνένζυμo FAD(Η 2 ) και το λιποαμίδιο. Ανάλογοι μηχανισμοί αντιστοιχούν και στις δράσεις άλλων ενζύμων,

111 που χρησιμοποιούν όμοια συνένζυμα. Για παράδειγμα, η δράση του ενζύμου αναγωγάση της γλουταθειόνης (E 1.6.4.2) μπορεί να περιγραφεί με τον ίδιο μηχανισμό και τη συνδυασμένη δράση του φωσφορυλιωμένου νικοτιναμιδοαδενινοδινουκλεοτιδίου ADP() με το φλαβινοσυνένζυμo FAD(Η 2 ) και την Γλουταθειόνη. Η όλη σειρά αντιδράσεων είναι πλήρως αντιστρεπτή, αλλά η φυσιολογική φορά της ροής τους είναι αυτή των δεικτών του ωρολογίου. Οι μορφές (2) και (3) παρίστανται ως σύμπλοκα μεταφοράς φορτίου μεταξύ ενός θειοανιόντος και του FAD. Αυτό δεν είναι πλήρως διευκρινισμένο γι αυτό και κρίθηκε σκόπιμη η εισαγωγή του επεξηγηματικού σχήματος κάτω από τις αντιδράσεις. Ωστόσο, το όλο σύστημα των αντιδράσεων [ιδ] δείχνει ότι η αφυδρογονάση του λιποαμιδίου δρα διαμέσου του μηχανισμού ενός απλού δυαδικού συμπλόκου.

112 1 2 FAD S FAD S S Lip(S) 2 S S LipS AD LipS 2 [ιδ] AD 4 FAD S AD 3 FAD S S S FAD S S FAD.. S S FAD S S Το μόριο του ενζύμου Ε (1), εκτός από το συνένζυμο FAD και μια γέφυρα κυστίνης (SS) διαθέτη και μια θέση δέσμευσης για το συνένζυμο AD. Το σύμπλοκο ενζύμου υποστρώματος ΕΗ 2 S (2) είναι η ανηγμένη ενδιάμεση μορφή, που έχει ήδη δεχθεί δύο άτομα υδρογόνου από το υπόστρωμα Lip(S) 2, σε αναλογία προς τις αντιδράσεις [θ]. Το ανηγμένο ένζυμο ΕΗ 2 (3) μεταφέρει διαμέσου του δεύτερου ενδιάμεσου (4) τα δύο άτομα υδρογόνου στο μόριο του AD.

113 4.2 Μεταφοράσες ή Τρανσφεράσες Πολλά ένζυμα και της τάξης αυτής χρησιμοποιούν συνένζυμα για την κατάλυση της μεταφοράς ομάδων από ένα υπόστρωμα σε άλλο υπόστρωμα. Έτσι ας ξεκινήσουμε πάλι με τη παρουσίαση και την ανάλυση της δράσης των κυριοτέρων συνενζύμων, που χρησιμοποιούν οι τρανσφεράσες. Από τα πλέον γνωστά συνένζυμα των τρανσφερασών είναι η πυροφωσφορική υδροξυαιθυλθειαμίνη (TPP), η φωσφορική πυριδοξάλη (PLP) και το αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ (ATP). Οι συντακτικοί τύποι των δύο πρώτων συνενζύμων είναι οι αμέσως παρακάτω 3 2 S 2 2 2 P P 3 3 P (PLP) 2 3 (TPP) Ας παρακολουθήσουμε τη δράση ορισμένων τρανσφερασών αρχίζοντας με ένα τυπικό παράδειγμα μεταφοράς ομάδας δύο ατόμων άνθρακα. Πρόκειται για την αμφίδρομη αντίδραση μετατροπής του σακχάρου ριβόζη (πεντόζη) σε σεδοεπτουλόζη (επτόζη), με την καταλυτική δράση του ενζύμου τρανσκετολάση (E 2.2.1.1). Η τρανσκετολάση χρησιμοποιεί ως συνένζυμο την πυροφωσφορική

114 υδροξυαιθυλθειαμίνη, η δραστική ομάδα της οποίας είναι ο θειαζολικός δακτύλιος. Η αντίδραση πραγματοποιείται με την μεταφορά της κετονικής ομάδας από την ξυλουλόζη στην ριβόζη, ενώ έχει προηγηθεί φωσφορυλίωση των δύο αντιδρώντων σακχάρων, κατά το γενικό σχήμα 2 ()(=)() 2 2 P 3 (=)() 3 2 P 3 2 ()(=)() 4 2 P 3 (=)() 2 P 3 Η αντίδραση [ιε] ξενικά με την πυρηνόφιλη προσβολή του αλκοολικού υδρογόνου της ελεύθερης υδροξυλομάδας της 5φωσφορικής ξυλουλόζης από μια βασική ομάδα του ενζύμου και τη δημιουργία του πρώτου οξυανιόντος. Με τη δημιουργία του πρώτου οξυανιόντος ξεκινά η πυρηνόφιλη προσβολή του υποστρώματος και η δημιουργία ενός δεύτερου οξυανιόντος από τη καρβονυλομάδα του. Μετά, το οξυανιόν της καρβονυλομάδας υφίσταται την πυρηνόφιλη προσβολή του θειαζολικού δακτυλίου, η οποία ως αποτέλεσμα έχει τη διάσπαση του δεσμού μεταξύ (=) και (), την απομάκρυνση της αλδόζης, που απομένει από το λοιπό μόριο και τη δημιουργία ενός ενδιάμεσου συντονισμού μεταξύ δύο μεσομερών μορφών. Με τη προσθήκη στην αντίδραση μιας άλλης αλδόζης, μεταφέρεται σε αυτήν η ομάδα που αποσπάσθηκε από το αρχικό σάκχαρο. Αλλιώς ακολουθεί αναδιοργάνωση του μορίου του ενζύμου έως ότου προστεθεί μια νέα αλδόζη ώστε να συμπληρωθεί η αντίδραση.

115 [ιε] Στις αντιδράσεις [ιε] παρουσιάζεται, συνοπτικά, ο πιθανός μηχανισμός δράσης της τρανσκετολάσης. Για απλοποίηση των αντιδράσεων εμφανίζεται μόνο ο δραστικός θειαζολικός δακτύλιος του συνενζύμου, και οι υπό μεταφορά ομάδες των σακχάρων.

116 Η μεταφορά αζωτούχων ομάδων είναι από τις σημαντικότερες αντιδράσεις της ζώσης ύλης. Πολλές αμινοτρανσφεράσες ή αλλιώς τρανσαμινάσες χρησιμοποιούν ως συνένζυμο τη φωσφορική πυριδοξάλη. Στο παράδειγμα των αντιδράσεων [ις], που ακολουθεί, παρουσιάζεται σχηματικά ο πιθανός μηχανισμός δράσης του ενζύμου ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (E 2.6.1.1). Το ένζυμο αυτό καταλύει τη μεταφορά της ααμινομάδας του LΑσπαρτικού οξέος (Asp) στο α Κετογλουταρικό οξύ. Παράγεται έτσι ένα νέο αμινοξύ, το LΓλουταμινικό οξύ (Glu) και Πυροσταφυλικό οξύ. Η αντίδραση ξεκινά με την δημιουργία μιας βάσης του Schiff (1), που σχηματίζεται από την αντίδραση της αλδεϋδικής ομάδας της φωσφορικής πυριδοξάλης με μια εαμινομάδα μιας Λυσίνης της ενεργού περιοχής του ενζύμου. Το ολοένζυμο (το σύστημα ενζύμου και συνενζύμου) που δημιουργείται αντιδρά ταχύτατα με το υπόστρωμα LΑσπαρτικό οξύ προς σχηματισμό μιας αλδίμης (2). Στη συνέχεια η αλδίμη μετατρέπεται σε κετιμίνη (4), με ενδιάμεσο σχηματισμό ενός προϊόντος (3) που ενίοτε μπορεί να απομονωθεί και στο οποίο ο πυριδινικός δακτύλιος της φωσφορικής πυριδοξάλης έχει χάσει τον αρωματικό του χαρακτήρα. Τέλος, η κετιμίνη υδρολύεται ταχύτατα προς Πυροσταφυλικό οξύ και ένα νέο ολοένζυμο ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης φωσφορικής πυριδοξαμίνης (5). Το νέο αυτό ολοένζυμο μπορεί να αντιδράσει με ακετογλουταρικό οξύ και με την εντελώς αντίστροφη πορεία να παραχθεί LΓλουταμινικό οξύ. Αν και όλες οι αντιδράσεις [ις] πραγματοποιούνται με τις χημικές ενώσεις, οι οποίες συμμετέχουν σε αυτές, να είναι συνεχώς συνδεδεμένες στο ένζυμο, ωστόσο αυτό δεν είναι εμφανές για λόγους απλούστερης αναπαράστασης του σχήματος των αντιδράσεων.

117 [ις] Σχηματική αναπαράσταση του ελάχιστου μηχανισμού δράσης του ενζύμου ασπαρτική αμινοτρανσφεράση. Οι αντιδράσεις [ις] δείχνουν το πρώτο μισό της συνολικής αντίδρασης. Το δεύτερο μισό πραγματοποιείται με την αντίστροφη πορεία.

118 Μια άλλη σπουδαία υποομάδα τρανσφερασών είναι οι φωσφοτρανσφεράσες ή κινάσες. Αυτές καταλύουν τη μεταφορά φωσφορικών ομάδων με δότη το αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ (ATP), που είναι και το συνένζυμό τους, και δέκτη είτε μια αλκοόλη (σχηματισμός εστέρα), είτε μια καρβοξυλομάδα (σχηματισμός μικτού ανυδρίτη) κ.α., κατά το γενικό σχήμα R ATP RP 3 2 ADP ή R ATP RP 3 2 ADP Όλες οι κινάσες διαθέτουν ένα ιόν Mg στο καταλυτικό τους κέντρο, ενώ ο γενικός μηχανισμός δράσης τους μπορεί να παρασταθεί με την αντίδραση [ιζ]. [ιζ]

119 Το κατιόν Mg της φωσφοφρουκτοκινάσης (E 2.7.1.1) προσανατολίζει και συγκρατεί το ATP ώστε να υποστεί τη πυρηνόφιλη προσβολή της βασικής ομάδας Β του ενζύμου. Στη συνέχεια και με αντίστροφη πορεία, μεταφέρεται η φωσφορική ομάδα στο τελικό δέκτη. 4.3 Υδρολάσες Τα ένζυμα της τάξης αυτής δεν χρησιμοποιούν, κατά κανόνα, συνένζυμα και όπως έχουμε ήδη τονίσει από την αρχή διακρίνονται για τη σχετικά μικρή εξειδίκευσή τους, σε σχέση με τα ένζυμα άλλων τάξεων. Ας δούμε, όμως, μερικά παραδείγματα τρόπων δράσης κάποιων αντιπροσωπευτικών υδρολασών. Στις αντιδράσεις [ιη] δίνεται ο πιθανός μηχανισμός δράσης μιας εστεράσης, της ακετυλοχολινεστεράσης (E 3.1.1.7). Το υπόστρωμα της αντίδρασης, η ακετυλοχολίνη, δεσμεύεται στο μόριο του ενζύμου σε δύο κυρίως περιοχές, μια ανιονική (για την φορτισμένη τριμεθυλαμινομάδα) και μια υδρόφοβη (για την ακετυλομάδα) (1). Η υδρόλυση ξεκινά με την πυρηνόφιλη προσβολή του καρβονυλικού άνθρακα του υποστρώματος από μια ομάδα ενεργού σερίνης του καταλυτικού κέντρου του ενζύμου, ως αποτέλεσμα της δράσης μιας βασικής ομάδας Β 2 (του ενζύμου). Αυτή η ομάδα Β 2 ενδέχεται να είναι μέρος ενός συμπλόκου μεταφοράς φορτίου, μαζί με την ενεργό σερίνη. Μια άλλη όξινη ομάδα ΑΗ βοηθά στη διάσπαση του εστερικού δεσμού (2). Με αναδιάταξη της διαμόρφωσης του ενζυμικού μορίου επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της χολίνης και η δημιουργία του ακυλενζύμου (3). Με τη βοήθεια μιας άλλης βασικής ομάδας Β 1 αρχίζει μια νέα πυρηνόφιλη προσβολή ενός μορίου Η 2 Ο με τελικό αποδέκτη και πάλι τον καρβονυλικού άνθρακα της ακετυλομάδας, ενώ εντωμεταξύ το μόριο του ενζύμου αναδιατάσσεται εκ νέου με την μεταφορά

120 ενός πρωτονίου από την Β 2 Η στην Α. Η όξινη ομάδα ΑΗ βοηθά πάλι στη διάσπαση του εστερικού δεσμού της ακετυλομάδας με την αλκοολική ομάδα της ενεργού σερίνης (4). Με μια νέα μεταφορά πρωτονίου από την Β 1 Η στην Α το μόριο του ενζύμου αναδιατάσσεται πάλι, απομακρύνει το οξικό οξύ και καθίσταται έτοιμο για ένα νέο καταλυτικό κύκλο. B.. 1 ( 3 ) 3 2 B 1 ( 3 ) 3 2 3 Ser 1 2 B 2 A 3 Ser 2 2.. B 2 A B.. 1 3 Ser B 2 3 A [ιη] Ser B 1 5 B 2 3 A B 1.. Ser 3.. A 4 B 2 Ο ελάχιστος μηχανισμός δράσης της ακετυλοχολινεστεράσης. Το ένζυμο αυτό υδρολύει, αν και με μικρότερες ταχύτητες, εστέρες της χολίνης με ανώτερα οξέα (π.χ. προπιονικό, βουτυρικό κ.α.).

121 Ένα δεύτερο παράδειγμα δράσης υδρολάσης δίνεται με τις αντιδράσεις [ιθ] όπου περιγράφεται ο μηχανισμός δράσης μιας μόνοφωσφοεστεράσης, (περισσότερο γνωστής ως αλκαλικής φωσφατάσης) (E 3.1.3.1). Η υδρόλυση του μόνοεστέρα του φωσφορικού οξέος είναι και στη περίπτωση αυτή αποτέλεσμα πυρηνόφιλης προσβολής του υποστρώματος όμοιας με το προηγούμενο παράδειγμα. Me R X P A Me P A R X 2 [ιθ] Me P A Me P A Ο μηχανισμός δράσης της αλκαλικής φωσφατάσης. Το ένζυμο δεν υδρολύει διεστέρες του φωσφορικού οξέος. Μια ακόμη σπουδαία ομάδα των υδρολασών είναι τα ένζυμα που υδρολύουν Ο, Ν, και S γλυκοσυλ δεσμούς. Στο παράδειγμα των αντιδράσεων [κ] δίνεται ο ελάχιστος μηχανισμός της κατάλυσης της υδρόλυσης πολυσακχαριτών από το ένζυμο λυσοζύμη ή μουραμιδάση (E 3.2.1.17). Το υπόστρωμα της αντίδρασης είναι ένας πολυσακχαρίτης του οποίου το τέταρτο μονομερές σάκχαρο είναι το Νακετυλμουραμικό οξύ.

122 Η καταλυτική δράση της λυσοζύμης φαίνεται να βασίζεται σε τρία χαρακτηριστικά (α) στην παραμόρφωση της δομής του υποστρώματος, (β) στη γενική κατάλυση οξέος και (γ) στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις της με τη μεταβατική κατάσταση του υποστρώματος. Τα δύο ενεργά αμινοξέα του καταλυτικού κέντρου της λυσοζύμης ευρίσκονται πλησίον του υπό υδρόλυση γλυκοσυλ δεσμού. Όταν αρχίζει η κατάλυση το Glu35 ευρίσκεται σε πιο υδρόφοβο περιβάλλον από το Asp52, ενώ το δεύτερο σε πιο υδρόφιλο περιβάλλον από το πρώτο. Έτσι το βκαρβοξύλιο του Glu35 είναι σε πρωτονιομένη μορφή, σε απόσταση σχηματισμού δεσμού υδρογόνου με το οξυγόνο του υπό υδρόλυση δεσμού και υφίσταται την πυρηνόφιλη προσβολή του. Το βκαρβοξύλιο του Asp 52 ευρίσκεται πλησίον των ατόμων Ο και 1 του σακχαρικού δακτυλίου. Μόλις σχηματιστεί το σύμπλοκο MichaelisMenten η δομή ανακλίντρου (πολυθρόνας) του δακτυλίου παραμορφώνεται. Τότε, τα άτομα 1, 2, 5 και Ο του σακχαρικού δακτυλίου ευρίσκονται σε ένα επίπεδο και ευνοούν έτσι το σχηματισμό του καρβοκατιόντος, στην ουσία οξο καρβοκατιόντος αφού το ηλεκτρικό φορτίο μοιράζεται μεταξύ 1 και Ο. Το Glu35, που όπως διατυπώθηκε αμέσως παραπάνω ευρίσκεται σε πιο υδρόφοβο περιβάλλον, μπορεί σε διαλύματα τιμής p = 5 όπου πραγματοποιούνται οι αντιδράσεις [κ] να δράσει ως όξινος καταλύτης και να δώσει το πρωτόνιό του στο οξυγόνο του υπό υδρόλυση δεσμού. Το Asp52, που ευρίσκεται σε πιο υδρόφιλο περιβάλλον κάτω από τις ίδιες συνθήκες, συμβάλλει στο σχηματισμό και στην σταθεροποίηση του καρβοκατιόντος. Με αναδιάταξη της δομής του ενζυμικού μορίου απομακρύνεται το υπόλοιπο τμήμα του πολυσακχαρίτη και αντικαθίσταται από Η 2 Ο, το οποίο πλησιάζει το καρβοκατιόν με εντελώς όμοια διαδικασία και με πυρηνόφιλη

123 προσβολή του προσθέτει μια υδροξυλομάδα. Εκτός από το Η 2 Ο είναι δυνατόν η αντίδραση να συνεχιστεί με άλλα πυρηνόφιλα αντιδραστήρια. 2 R Ac 2 R Ac Glu35 2 E E R Asp52 Ac [κ] E Glu35 Asp52 Glu35 2.. 2 R Asp52 Ac Ο προτεινόμενος μηχανισμός υδρόλυσης πολυσακχαριτών από τη λυσοζύμη. Θα ασχοληθούμε με μια ακόμη ομάδα των υδρολασών, πολύ σπουδαία από άποψη ερευνητικού ενδιαφέροντος και εφαρμογών. Πρόκειται για ένζυμα που υδρολύουν πεπτιδικούς δεσμούς (κατά περίπτωση και εστερικούς δεσμούς). Από το πλήθος των υποομάδων των ενζύμων αυτών θα εξετάσουμε τις δύο περισσότερο ευρείες υποομάδες αυτές των σερινοπρωτεϊνασών και των κυστεϊνοπρωτεϊνασών. Το γενικό σχήμα δράσης τους δίνεται από τις αντιδράσεις [κα]

124 [κα] Το ένζυμο και το υπόστρωμα σχηματίζουν, κατ αρχήν, το σύμπλοκο ES MichaelisMenten με την αποκατάσταση μιας ταχείας ισορροπίας. Κατόπιν το ES διασπάται προς ακυλένζυμο και ένα προϊόν P 1 (αμίνη ή αλκοόλη). Στη συνέχεια το ακυλένζυμο διασπάται προς ελεύθερο ένζυμο και ένα δεύτερο προϊόν P 2 (οξύ). Αν παράγουμε την εξίσωση MichaelisMenten για τις αντιδράσεις [κα] τότε θα καταλήξουμε στις εξισώσεις (48) K m = KS k 3, όπου K S = 2 k3 k k 1 k 1 k 2 k 1, k cat = Όπως είναι φανερό οι παράμετροι K m, k cat και k 2 E S ES Eacyl E P 2 k 1 2 P 1 k 2 k 3 k 2 k 3 kcat Km και kcat Km = k 2 K S (48) αποκτούν διαφορετική σημασία από αυτή που ως τώρα γνωρίζαμε. Παρόμοια διαδικασία μπορούμε να εφαρμόσουμε για κάθε ξεχωριστή ομάδα ή υποομάδα ενζύμων και να αποδώσουμε την ακριβή σημασία και τη φυσική έννοια των ενζυμικών κινητικών παραμέτρων. Με ποιο μηχανισμό δρουν αυτές οι πρωτεϊνάσες; Το ερώτημα αυτό, με βάση τα όσα έχουμε ήδη αναφέρει γι αυτά τα ένζυμα, έχει περισσότερες από μία απαντήσεις. Ας αναφέρουμε εδώ δύο. Η μία αναφέρεται στις σερινοπρωτεϊνάσες και η δεύτερη στις κυστεϊνοπρωτεϊνάσες. Το καταλυτικό κέντρο των σερινοπρωτεϊνασών συνίσταται από μια τριάδα αμινοξέων (καταλυτική τριάδα), το Asp102, την is57 και την Ser195 (η αρίθμηση αναφέρεται στην Χυμοθρυψίνη, που είναι και το πρότυπο ένζυμο αυτής της υποομάδας). Μετά από σχετικές έρευνες γνωρίζουμε ότι το Asp102 ευρίσκεται σε πολύ περισσότερο υδρόφοβο περιβάλλον από την is57, η οποία και το προστατεύει από το Η 2 Ο, με k 3

125 αποτέλεσμα να παρουσιάζεται ως ισχυρότερη βάση από αυτήν. Αυτό είναι το κλειδί της εξήγησης του μηχανισμού δράσης των σερινοπρωτεϊνασών και αποδίδεται από τις αντιδράσεις [κβ]. is57 Asp102 2 2 Ser195 2 pk a = 6.7 is57 Asp102 2 2 pk a = 3.3 Ser195 2 [κβ] is57 Asp102 2 2 Ser195 2 Σε διαλύματα τιμής p < 6.7 τόσο η βάση Asp102 όσο και το οξύ is 57 ευρίσκονται σε μορφή αποπρωτονιομένη. Σε διαλύματα τιμής 3.3 < p < 6.7 η

126 βάση Asp102 ευρίσκεται πλέον σε μορφή πρωτονιομένη ενώ το οξύ is57 εξακολουθεί να ευρίσκεται σε μορφή αποπρωτονιομένη. Σε διαλύματα τιμής 3.3 < p τόσο η βάση Asp102 όσο και το οξύ is57 ευρίσκονται πλέον σε μορφή πρωτονιομένη. Τα παραπάνω αποτελούν προσπάθεια επεξήγησης του τρόπου δράσης του καλούμενου συμπλόκου μεταφοράς φορτίου των σερινοπρωτεϊνασών και στηρίζονται σε πραγματικά πειραματικά δεδομένα. is57 is57 Asp102 2 2 Ser195 2 I R Asp102 2 2 Ser195 2 R [κγ] is57 is57 Asp102 2 2 Ser195 2 II R Asp102 2 2 Ser195 2 R Όμως αυτό το σύμπλοκο μεταφοράς φορτίου δεν λειτουργεί πάντοτε. Λειτουργεί τότε και μόνο τότε όταν το υπόστρωμα διαθέτει αρκετές ομάδες πρόσδεσης με το ένζυμο (δηλαδή σε περιπτώσεις σχετικά μικρών K m ). Σε αντίθετη

127 περίπτωση η υδρολυτική αντίδραση καταλύεται από ένα μηχανισμό γενικού οξέος γενικής βάσης. Αυτά φαίνονται πιο καθαρά στις αντιδράσεις [κγ]. Τα φυσικά και τα συνθετικά υποστρώματα των πρωτεϊνασών είναι πρωτεΐνες και μικρότερα ή μεγαλύτερα πεπτίδια. Μερικές φορές χρησιμοποιούνται, ως συνθετικά υποστρώματα πρωτεϊνασών, πεπτίδια που περιέχουν και εστερικούς δεσμούς. Στις αντιδράσεις [κγ] περιγράφεται η πυρηνόφιλη προσβολή του καρβονυλικού άνθρακα του υπό υδρόλυση πεπτιδικού (ή εστερικού) δεσμού, ενός πεπτιδικού υποστρώματος. Στην αντίδραση [κγ Ι], που γίνεται με το μηχανισμό γενικού οξέος γενικής βάσης μεταφέρεται ένα πρωτόνιο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης μέχρι τη δημιουργία του ακυλενζύμου, ενώ στην [κγ ΙΙ], που γίνεται με το μηχανισμό του συμπλόκου μεταφοράς φορτίου μεταφέρονται δύο πρωτόνια κατά τη διάρκεια της ίδιας αντίδρασης. Υπάρχει όμως ένα κοινό χαρακτηριστικό, απαραίτητο για την αποτελεσματική κατάλυση και για τους δύο μηχανισμούς. Το καρβονυλικό οξυγόνο του υπό υδρόλυση πεπτιδικού (ή εστερικού) δεσμού σταθεροποιείται με δύο δεσμούς υδρογόνου στην λεγόμενη οπή του οξυανιόντος (oxyanion hole). Οι δεσμοί υδρογόνου της οπής του οξυανιόντος δημιουργούνται συνήθως από υδρογόνα πεπτιδικών δεσμών του κορμού της πρωτεϊνικής αλυσίδας του ενζυμικού μορίου. Το καταλυτικό κέντρο των κυστεϊνοπρωτεϊνασών συνίσταται από μια καταλυτική δυάδα, την ys25 και την is158 (η αρίθμηση αναφέρεται στην Παπαΐνη, που θεωρείται από πολλούς ερευνητές ως το πρότυπο ένζυμο αυτής της υποομάδας). Ο ελάχιστος μηχανισμός δράσης των κυστεϊνοπρωτεϊνασών παρουσιάζεται στις αντιδράσεις [κδ] και αρχίζει με την δημιουργία του λεγόμενου ιονικού ζεύγους του καταλυτικού κέντρου, δηλαδή yss...im is, καθώς το υπόστρωμα πλησιάζει το μόριο του ενζύμου (Α). Τότε δημιουργείται το σύμπλοκο

128 ES ενώ το υπόστρωμα, αφού προσδεθεί στην οπή του οξυανιόντος (δες σχήμα 18), υφίσταται την πυρηνόφιλη προσβολή του θειοανιόντος της ys25 (Β). Κατόπιν σχηματίζεται το ακυλένζυμο (Γ) ενώ απελευθερώνεται μια αμίνη. Τέλος το ακυλένζυμο υδρολύεται με τη δράση του Η 2 Ο προς ελεύθερο ένζυμο και οξύ (Δ). Πιο πρόσφατες πειραματικές και θεωρητικές έρευνες έχουν δείξει ότι η πρόσδεση του υποστρώματος των κυστεϊνοπρωτεϊνασών στην οπή του οξυανιόντος διευκολύνει την κατάλυση αλλά δεν είναι και απαραίτητη προϋπόθεση όπως στην περίπτωση των σερινοπρωτεϊνασών. S Substrate Im A k 1 k 1 R 2 R.. 1 S... Im B k 2 R 1 Γ S.. Im.. R 2 k 3.. S.Ḥ Im R Ȯ. 1.. [κδ] Σχήμα 18

129 S ys(25) Gln(19) Δύο πιθανοί προσανατολισμοί του υποστρώματος των κυστεϊνοπρωτεϊνασών ή προς την οπή του οξυανιόντος ή προς την αντίθετη κατεύθυνση. Παραπάνω, στο σχήμα 18, φαίνεται ότι η οπή του οξυανιόντος στις κυστεϊνοπρωτεϊνάσες δημιουργείται από το υδρογόνο του πεπτιδικού δεσμού της ααμινομάδας της ενεργού ys25 και από το υδρογόνο της αμιδικής ομάδας της πλευρικής αλυσίδας της Gln19. Όμως, ο προσανατολισμός του καρβονυλικού οξυγόνου του υπό υδρόλυση δεσμού μπορεί και να είναι αντίθετος προς την οπή του οξυανιόντος. 4.4 Λυάσες Ο αναγνώστης θα θυμάται ότι τα ένζυμα αυτής της τάξης καταλύουν την μη υδρολυτική διάσπαση δεσμών ή τη σύνθεση δεσμών. Τυπικό δείγμα των ενζύμων αυτών αποτελεί η καρβονική ανυδράση (E 4.2.1.1) της οποίας ο μηχανισμός δράσης μπορεί να αποδοθεί με την αντίδραση [κε]. Το ένζυμο αποσπά ένα μόριο 2 από το υπόστρωμά του. Γι αυτό, η ορθή πορεία της αντίδρασης είναι η αντίστροφη από αυτήν που παρουσιάζεται στην αντίδραση [κε]. Ισχύει, δηλαδή, ότι 2 3 2 (ή 3 3 ) 2 2 2

130.. Zn 0.... Zn 0...... [κε] 2 is 2 is Ο πιθανός μηχανισμός δράσης της καρβονικής ανυδράσης Σημαντικό στοιχεία για την κατάλυση αποτελούν τόσο το ιμιδαζόλιο μιας ιστιδίνης όσο και ένα άτομο Zn, που ευρίσκονται στο καταλυτικό κέντρο του ενζύμου. Το άτομο του Zn εξασφαλίζει τον ορθό στερεοχημικό προσανατολισμό του 2, έτσι ώστε αυτό να παίξει το ρόλο του ως πυρηνόφιλο αντιδραστήριο. 4.5 Ισομεράσες Είναι τα ένζυμα που καταλύουν την ισομερίωση των υποστρωμάτων τους. Η ισομεράση της 6φωσφορικής γλυκόζης (E 5.5.1.9) είναι ένα αντιπροσωπευτικό ένζυμο της τάξης αυτής και καταλύει μια αντίδραση μεταφοράς ενός πρωτονίου μέσα στο ίδιο το μόριο του υποστρώματος.

131 A. Ḃ A A Ḃ. A Ḃ. Ḃ. [κς] Από καθαρά χημική θεώρηση, η ισομεράση της 6φωσφορικής γλυκόζης, θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως μια ενδομοριακή οξειδοαναγωγάση. Ο μηχανισμός δράσης του ενζύμου αυτού περιγράφεται με τις αντιδράσεις [κς]. Η αντίδραση της ισομερίωσης εξελίσσεται με τη σύνθεση δύο ενδιαμέσων, ενός οξυανιόντος και μιας διολικής μορφής. Με την εμπειρία, που ήδη κατέχει ο αναγνώστης των σημειώσεων αυτών, είναι πολύ εύκολη η ερμηνεία του μηχανισμού. 4.6 Λιγάσες ή Συνθετάσες Όπως φαίνεται και από την ονομασία της, η τάξη αυτή των ενζύμων καταλύει τη σύνθεση δεσμών (ή τη μη υδρολυτική διάσπασή τους). Οι αντιδράσεις που καταλύουν οι Λιγάσες δεν είναι όμοιες με αυτές που καταλύουν οι Λυάσες. Ίσως να παρατηρούσε κάποιος το γεγονός ότι Λυάσες και Λιγάσες καταλύουν τη σύνθεση ή διάσπαση δεσμών,,, S κοκ. Αυτό είναι γενικά ορθό. Όμως, αφορά δεσμούς που εγκλείουν μεγαλύτερο ποσό ενέργειας και βέβαια πραγματοποιούνται με διαφορετικό μηχανισμό. Γι αυτό το λόγο οι Λιγάσες συνθέτουν δεσμούς αντλώντας κυριολεκτικά ενέργεια από τη διάσπαση ενός ή

132 δύο πυροφωσφορικών δεσμών από ATP ή ADP, ενώ την αποδίδουν με αντίστροφη διαδικασία όταν διασπούν τέτοιους δεσμούς. Παράδειγμα δράσης μιας λιγάσης, δίνεται με τις αντιδράσεις [κζ], όπου παρουσιάζεται η σύνθεση του διπεπτιδίου LγλουταμυλLκυστεΐνη, από τα αμινοξέα που το αποτελούν και καταλύεται από το ένζυμο συνθετάση της γ γλουταμυλκυστεΐνης (E 6.3.2.2). Το ένζυμο αυτό χρησιμοποιεί για τη σύνθεση ενός δεσμού την ενέργεια από ένα πυροφωσφορικό δεσμό. ADP P EZYM Glu, ys ADP P Ṉ EZYM Glu P EZYM ys Glu ys P.. 2 EZYM [κζ] Glu ys P Όπως φαίνεται και από τις παραπάνω αντιδράσεις, ο μηχανισμός ξεκινά με φωσφορυλίωση του ενζύμου από ΑΤΡ και τη παρουσία των δύο αμινοξέων του διπεπτιδίου. Κατόπιν, το φωσφορυλιωμένο ένζυμο υφίσταται την πυρηνόφιλη προσβολή του αποπρωτονιωμένου ακαρβοξυλίου του Lγλουταμινικού οπότε σχηματίζεται ένας μικτός ανυδρίτης, ο οποίος υφίσταται την πυρηνόφιλη προσβολή

133 της αποπρωτονιωμένης ααμινομάδας της Lκυστεΐνης οπότε σχηματίζεται το διπεπτίδιο LγλουταμυλLκυστεΐνη. Ένα ερώτημα που μπορεί να τεθεί είναι το εξής Γιατί αντέδρασε πρώτο το Lγλουταμινικό οξύ και όχι η Lκυστεΐνη; Είναι γνωστό ότι η μέθοδος των μικτών ανυδριτών χρησιμοποιείται ευρύτατα κατά τη σύνθεση πεπτιδίων με μεθόδους οργανικής χημείας,. Όμως, οι δραστικές ομάδες των αμινοξέων που χρησιμοποιούνται στη συνθετική διαδικασία έχουν κατάλληλα προστατευθεί ώστε να υπάρχει μονοσήμαντη διαδικασία αντίδρασης. Στο Lγλουταμινικό οξύ π.χ. θα έπρεπε να είναι κατάλληλα προστατευμένες τόσο η ααμινομάδα του όσο και το γ καρβοξύλιό του, ενώ στη Lκυστεΐνη θα έπρεπε να είναι κατάλληλα προστατευμένο τόσο το ακαρβοξύλιό της. Όλα αυτά δεν χρειάζονται εδώ. Η ενεργός περιοχή του ενζύμου είναι κατάλληλη ώστε να πραγματοποιηθεί η συγκεκριμένη συνθετική αντίδραση.

Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Τέλος Ενότητας

Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους. Σημειώματα Σημείωμα Αναφοράς opyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκων Καθηγητής Εμμανουήλ Μ. Παπαμιχαήλ. «Ενζυμολογία. Μηχανισμοί». Έκδοση 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση http//ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1243. Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης reative ommons Αναφορά Δημιουργού Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1] https//creativecommons.org/licenses/bysa/4.0/.