تأثیر ترانس سینامیک اسید بر شاخصهای آپوپتوزی در سلولهای سرطانی رده ی MCF-7

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی سللهای سرطانی رده ی MCF-7 *3 2 1 فائزه زینیند محمد رضا تابنده مریم کالهی 1 -دانشآمخته دامپزشکی. 2 -دانشیار گره علم پایه. 3 -استادیار گره زیستشناسی. 1 0 - گره بیشیمی سللی-ملکلی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهاز اهاز ایران. 3 -گره زیستشناسی دانشکده علم دانشگاه شهید چمران اهاز اهاز ایران. * نیسندۀ مسؤل: مریم کالهی گره زیستشناسی دانشکده علم دانشگاه شهید چمران اهاز اهاز ایران. چکیده زمینه هدف: سینامیک اسید )CA( محصل دآمیناسین فنیلآالنین تمام فتهای گیاهی جزء اصلی فعال ماد غذایی گیاهی مرد استفاده انسان است. سینامیک میتاند رشد سللهای تمر های مختلف انسان مانند سرطان رده بزرگ لسمی تمر کبدی همچنین مالنم را مهار کند. هدف از این مطالعه بررسی اثر مکانیسم عمل سینامیک بر آپپتز سلل MCF-7 سرطان پستان است. رش بررسی: به منظر بررسی اثر مکانیسم عمل سینامیک سلل های سرطان سینه غلظت های مختلف سینامیک )10 0 100 00 000 میلی- مالر( به مدت 02 ساعت تیمار شدند. زندهمانی سللها استفاده از رش MTT بررسی شد. شاخصهای آپپتز شامل قطعه قطعه شدن DNA تظاهر فسفاتیدیلسرین الیه بیرنی غشای پالسمایی به ترتیب استفاده از تستهای TUNEL فلسایتمتری ارزیابی اتصال Annexin V ارزیابی گردید. یافتهها: مقدار LC50 سینامیک سللهای MCF-7 بر اساس ارزیابی زندهمانی به رش MTT حدد 00 میلیمالر تعیین شد. تیمار سللها دز 100 میلیمالر سینامیک سبب القا معنیدار شاخصهای آپپتز گردید. بطری که سللهای + TUNEL سللهای مراحل انتهایی آپپتز Annexin + V ) + (PI Propium Iodide بطر معنیداری افزایش یافتند. نتیجهگیری: نتایج این تحقیق نشان داد که سینامیک اسید القای آپپتز دارای فعالیت ضدتمری مثری برابر سللهای MCF-7 است. این نتایج می- تاند ک بهتر مکانیسم ضدسرطانی سینامیک تایید بیخطر بدن استفاده آن به عنان یک داری جایگزین مکمل مان سرطان مفید شد. کلیداژگان: آپپتز سینامیک اسید سلله یا سرطان سینه.MCF-7 تلفن: 00986133331020 Email: m.kolahi@scu.ac.ir یافت مقاله: 9394/9/22 یافت مقالۀ اصالحشده: 9391/91/99 اعالم قبلی: 9391/99/91

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی... 664 مقدمه یکی از مهمترین بحث برانگیزترین مشکالت سالمتی زنان سراسر دنیا سرطان سینه میشد. سرطان سینه یک بیماري چندعاملی است که ژنتیک عامل هرمنی تقابل بین اشخاص محیط ایجاد آن نقش دارد )1(. سرطان سینه دنیا ایران بین سرطانهاي زنان رتبه ال ابتال مرگ میر را به خد اختصاص داده است. این بیماري 22 صد از مارد سرطان تازه تشخیص دادهشده را شامل شده است. به طري که جهان میزان برز آن 33 صد هزار نفر است مسئل 11 صد از مرگهاي مرتبط سرطان زنان میشد. هرچند ایران یکی از کشرهایی است که میزان برز سرطان سینه کمتري نسبت به سایر کشرها دارد اما افزایش میزان برز آن سالهاي اخیر این بیماري را به عنان رایجترین بدخیمی میان زنان ایرانی تبدیل کرده است )3(. تحقیقات انجامشده نشان میدهند که 12/2 صد تمام مارد سرطانها را ایران سرطان سینه تشکیل میدهد )4(. برز این بیماري ایران حدد یک دهه قبل از کشرهاي تسعهیافته اتفاق میافتد بیش از 33 صد بیماران زیر 33 سال سن دارند )1(. طب گیاهی اغلب به عنان مان مکمل یا جایگزین مانهاي استاندارد استفاده میشد. مان گیاهی قدیمیترین رش مانی مرداستفاده جهان بیش از 2333 سال سابقه است )2(. سینامیک اسید محصل دآمیناسین فنیلآالنین تحت تأثیر آنزیم فنیلآالنینآمنیملیاز میشد که از مسیرهاي متابلیسمی مؤثر فیزیلژي عملکردي گیاهی تلید میشد. این ترکیب الین پیش- ساز بیسنتز هزاران ترکیب فنیلپرپانئید گیاهی از جمله فالنئیدها فلنها کمارینها است که تمام فتهاي گیاهان به فر یافت میشد )7 3(. اسیدهاي سینامیک به عنان ترکیت مهمی خاص آنتیاکسیدانی ضدالتهابی سیتتکسیک ضد کتري آنتی متاژنیک تعدیلکنندهي ایمنی همچنین براي اصالح بیماريهاي دیگر بهطر گسترده طب سنتی به کار میرند )7(. سللهاي لسمی سینامیک اسید تکثیر )9( آدنکارسینماي ردهي بزرگ گلیلستما مالنم پرستات سرطان ریه )13( سارکم استخان )11( سللهاي G2 هپاتیت )12( سللهاي اپیتلیال کلیه VErda RenO or ( )VERO را مهار میکند )13(. سینامیک اسید داراي اثر زدارنده بر سللهاي سرطان گردن رحم )U14( مش است که منجر به آپپتز تمري میشد )14(. سللهاي مشتقات مربط به سینامیک اسید همچن اسیدها استرها آمیدها هیازیدها داراي خاص آنتی- اکسیدان هستند به حداقل رساندن اکسیداسین لیپپرتئینهاي چگالی پایین Low-( )DensityLipoprotein or LDL فعالیت آنتیاکسیدانی خد شامل از بین بردن مستقیم گنههاي اکسیژن فعال Reactive Oxygen Species or ( )ROS را ارائه میدهند )11(. سمیت سللی سینامالدئید مالنم سرطان رده بزرگ سینه تمر کبدي سرطان خن سرطان دهانه رحم ریه تخمدان سیستم عصبی مرکزي لنفم لسمی مش سرطان ریه مش سرطان لنفسیتها سللهاي کبدي سللهاي جنینی سرطان حنجره تأیید شدهاست. استرها آمیدهاي سینامیک اسید سمیت سللی معنیدار انتخابی ردههاي سللی بدخیم را نشان میدهند )7(. مشتقاتی چن 2'- هیکسی سینامالدئید)-' 2 Hydroxycinnamaldehyde ( آنالگ 2' بنزئیل اکسی سینامالدئید)-' 2 مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

661 فائزه زینیند همکاران )Benzoyloxycinnamaldehyde تحریک گنههاي اکسیژن فعال سللی )ROS( منجر به نفذپذیري میتکنیایی انتشار سیتکرمC سللهاي لسمی انسانی (Human Leukemia or HL-60) القاي آپپتز میشند )12(. همچنین سینامالدئید کاهش گلتاتین )Glutathione( منجر به القاي پراکسیداسین )Peroxidation( چربی سللهاي کبدي جداشده از رت نر میشد. نتیجه سمیت سللی القا شده از تنفس میتکنیایی ممانعت میشد )11(. مطالعه خاص ژنتکسیک )Genotoxic( نشان میدهد که سینامالدئید عث تقف چرخه سللی فاز G2/M سللهاي HCT 116 القا تقسیم کاسپاز 3 )Poly ADP Ribose Polymerase( PARP میشد )17(. سللهاي سرطان گردن رحم U14 تقف سیکل سللی مرحله G2-M مبین این امر است که سینامیک اسید چرخه سللی تمر را تحت تأثیر قرار میدهد) 14 (. سینامیک اسید تکثیر سنتز DNA سللهاي Caco-2 )رده بزرگ انسان( را مهار میکند )13(. همچنین نفذ سللهاي ایمنی به فت کبد تسط مشتقات سینامالدئید منجر به افزایش تلید محرکهاي ایمنی طالنی اثر بر ري سللهاي T اثرات زدارندهي شیمیایی شکلگیري سرطان هپاتسلالر مشهاي ژنیک Hras12V میشد) 19 (. سینامالدئید عث تمایز سلل T از سللهاي د مثبت CD4-CD8 به CD4 یا سللهاي یک مثبت CD8 میشد )13(. مطالعه حاضر هدف بررسی فعالیت ضدسرطانی سینامیک اسید برابر سللهاي MCF-7 انجام گردید. رش بررسی سللهاي رده MCF-7 از نک سللی انستیت پاستر ایران خریداري گردید پس از شمارش تعیین صد بقا محیط کشت DMEM حاي ده صد شدند. کشت FBS سللهاي 92 پلیت MCF-7 خانهاي هر خانه به تعداد 13 3 4 سلل حجم 113 μl محیط DMEM کشت داده شدند. پس از پر شدن حداقل 13 صد فضاي فالسک غلظتهاي مختلف سینامیک اسید ) جه خلص 99/9% سیگما آمریکا( شامل 133 13 13 3 233 میلی- مالر که غلظت نهایی حالل مناسب )آب به همراه DMSO 3/2 24 حل صد( گردیده بد به محیط کشت فالسکهاي محتي این سللها اضافه به مدت ساعت انکبه گردید. صرت محلل استک غلظت سینامیک 133x اسید به تهیه گردید براي هر غلظت میزان مناسب از آن به هر فالسک اضافه شد. ارزیابی زندهمانی تعیینLC50 تست MTT به منظر تعیین LC50 از ارزیابی فعالیت حیاتی سلل استفاده از تست احیا MTT استفاده شد. اساس این تست احیا MTT به رنگ فرمازن حضر آنزیمهاي دهیژناز میشد. میزان فرمازن تلید شده شاخصی از فعالیت حیاتی زنده مانی سلل میشد بدین منظرپس از تیمار سللها غلظتهاي مختلف سینامیک اسید )13 13 133 233 میلی- مالر( به مدت 24 ساعت سللها تریپسینه پس از سانتریفیژ رسب داده شدند. سللی )تست( 13 میکرلیتر فر 13 میکرلیتر رسب به )لنک( PBS صرت جداگانه به پلیتهاي 92 خانه منتقل سپس 13 میکرلیتر 3/331 1mg /ml( MTT MTT گرم میکرلیتر 1333 )PBS افزده حداقل 2 ساعت دماي 37 جه سانتیگراد انکبه شد. سپس 133 میکر لیتر دي متیل سلفکسید افزده دقیقه دماي 13 آزمایشگاه انکبه شدند پس از آن جذب طل مج مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی... 666 123 نانمتر قرائت گردید. نتایج بر اساس مقایسه جذب نمنهها طل مج 123 نانمتر نسبت به گره کنترل گزارش گردید. غلظتی از سینامیک اسید که سبب کاهش میزان تلید فرمازن به میزان 13 صد گردید به عنانLC50 نظر گرفته شد. یک جمعیت بررسی آپپتز به رش فلسایتمتري به منظر تعیین صد سلله يا جمعیت سللی تیمار سللی کنترل شده منفی دار آپپتز شده رنگآمیزي آن قیاس سللها د رنگ Annexin-V پرپیدیم یدید (PI) انجام گرفت. به این صرت که بعد از تیمار کردن سللها از میلیمالر 233 133 13 13 غلظت چهار سینامیک اسید 24 ساعت انکسین سللها تریپسینه شدند فر فسفات سالین استریل (PBS) شستشي سانتریفیژ سللها سللها انجام 133 به گرفت. میکرلیتر رسب فر حاصل یندینگ از میکرتیب 1/1 میکرلیتر اضافه گردید. به دنل اضافه کردن فر یندینگ 13 میکر لیتر از رنگ پرپیدیم یدید )PI( 1 میکرلیتر از رنگ آنکسین Annexin-( )V سپس تکان نمده به راحتی اتاق تاریکی دستگاه محتیات تمامی دادن به 21( مجد محتیات میکرتیب طري مخلط جه انکبه که شد. را رسب سانتیگراد( شدند فلسایتمتري به میکرتیب آرامی یکدیگر مرحله سللها به نهایت بعد حرکت مخلط مدتزمان آنالیز ماد اضافه نمنهها 13 FACScan شرکت سللی دست شد. یکدست مجد دقیقه به دماي تسط Becton Dickinson کشر امریکا انجام گرفت )23(. تجزیه تحلیل دادهها استفاده از نرمافزار دستگاه تقسیم نقاط ثبتشده منحنی دبعدي به چهار ناحیه تا Q1 Q4 نمایانگر سلله يا نحي به گرفت. صرت نکرزي یژگی: ناحیه که + PI ناحیهي Q 2 نمایانگر سلله يا آپپتز شده دیررس یا نکرزي یژگی: + Annexin-V + PI ناحیه Q3 نمایانگر سلله يا سالم یژگی: ناحیه Q 4 PI Annexin-V نمایانگر سلله يا آپپتز شده جان یژگی: + Annexin-V PI میشد. فلئرکرمهاي مرد استفاده فلئرسین ایزتیسیانات (FITC) کنژگه Annexin-V بد که کانال FL 1 PI FL 2 مرد ارزیابی قرار گرفتند. به منظر تعیین اثرات سینامیک اسید جهت القا آپپتز یا نکرز صد سلله يا مستقر هر ناحیه تسط نرمافزار دستگاه فلسایتمتر ( FCS )Express محاسبه بر اساس صد گزارش گردید. ارزیابی قطعهقطعهشدن DNA کرمزمی رش TUNEL بدین منظر از کیت In Situ Cell TUNEL Death Detection Kit, Fluorescein محصل شرکت Roche آمریکا استفاده شد. پس از کشت سللهاي MCF-7 تعداد 13 1 7 هر میلیلیتر مجارت آنها غلظتهاي مختلف سینامیک اسید به مدت 24 ساعت ابتدا سللها تریپسینه جداسازي شدند. سللها استفاده از فرهاي تثبیت- کننده نفذپذیر کننده آماده سازي PBS 133µl شستش گردیدند. به هر خانه 13 میکرلیتر مخلط اکنش TUNEL حاي آنزیم داکسی نکلئتید فراز انتهایی نکلئتید نشاندار فلرسین اضافه به مدت 23 دقیقه دماي 37 جه سانتیگراد نگه- داري شدند. سپس سللها PBS د ر شستش نهایت 13 میکرلیتر PBS به هر نمنه اضافه گردید. 23 میکرلیتر از نمنه حاي سلل به منظر ارزیابی شمارش صد سللهاي مثبت ( + )TUNEL استفاده از الم همسیتمتر مرداستفاده قرار گرفتند. بهمنظر تعیین صد سللهاي مثبت ابتدا تعداد کل سللها Q 1 - Annexin-V مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

666 فائزه زینیند همکاران استفاده دستگاه از بر سللهاي به نتایج میکرسکپ ري مثبت صرت حالت فلرسنت صد سللها گزارش گردید )21(. اینرت فلئرسنت سبزرنگ سللهاي شمارش تنظیم شمارش مثبت نسبت سپس تعداد گردیدند. کل به تمامی آزمایشات بصرت سه ر تکرار انجام شد براي تجزیه تحلیل آماري نتایج به دست آمده این پژهش از نرمافزار کامپیتري SPSS version 14 براي بررسی اختالف مختلف گرههاي مرد آزمایش از آماري بین میانگین پارامترهاي Two Way ANOVA and Tukey استفاده شد. یافته ها نشان سینامیک نتایج مرفلژي نتایج مرفلژي استفاده از میکرسکپ نري داد که سللهاي اسید مرفلژیکی ن داشتهاد. اسید سینامیک MCF-7 تیمار شده نسبت به نمنه کنترل تفاتهاي تغییرات شکل سللها تحت اثر دزي به ابسته رز یکدیگر نشان دادند. تغییرات مرفلژي سللهاي MCF-7 سایتتکسیک 24 زمان را غلظت سللهاي تحت تیمار ساعت 133 بیشترین میلیمالر غلظتهاي الي اثرات بد. دارا سینامیک اسید نشان دهنده تغییرات مرفلژیکی رز از جمله تغییرات عمده حالت طبیعی غشاي سللی گرانله شدن سللها چرکیده شدن غشاي هسته کاهش حجم سلل را نشان دادند. ضمن تعدادي از سللها از کف فالسک جدا شده شنار بدند. ارزیابی میزان زندهمانی میزان سمیت سللی بر اساس نتایج تست LC50 MTT سینامیک اسید مدت زمان 24 ساعت مرد سلل هاي MCF-7 13 میلیمالر تعیین گردید. نتایج ارزیابی میزان زندهمانی سللها بر اساس تست سللهاي تحت تیمار غلظتهاي مختلف سینامیک اسید )نمدار 1-A ( است. آمده MTT حداکثر سمیت سللی غلظت 233 میلیمالر سینامیک اسید دیدهشد )نمدار 1-B (. تانل سللهيا غلظتهيا ارزیابی شکست نتایج تست DNA TUNEL MCF-7 13 13 DNA )3/31<p( اما سینامیک میلیمالر کرمزمی رش نشان داد که مان سینامیک اسید تأثیري بر شکست کرمزمی مقایسه گره کنترل نداشت غلظته يا اسید سبب 133 القا 233 DNA کرمزمی ) p 3/31 (.الترین سلله يا میلیمالر معنیدار شکست سللهاي تیمار شده شدند + TUNEL سلله يا تیمار شده سینامیک اسید 133 میلیمالر پس از آن غلظت 233 میلیمالر مشاهده شد )نمدار 2 (. 1 تصیر TUNEL + سللهيا میشند. تصیر میکرسکپ فلئرسنت MCF-7 سبزرنگ را نشان میدهد نشاندهنده سللهيا ارزیابی میزان آپپتز تست انکسین تصیر سلله يا )تصیر 1 (. TUNEL + 3 2 نتایج تست انکسین سلله يا تیمار شده محیط پایه حاي 3/2 صد DMSO غلظته يا 13 13 133 233 میلی مالر سینامیک اسید پس از آنالیز سلله يا رنگآمیزي شده PI Anexin V رش فلسایتمتري نرمافزار FCS express میدهد. تجزیه تقسیم دستگاه میکرسکپ تحلیل نقاط دادهها ثبتشده فلرسنت استفاده منحنی از را نشان نرمافزار به دبعدي چهار ناحیه نمایانگر Q صرت گرفت. بهنحيکه ناحیه مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی... 661 يا يا يا يا يا 233 133 میلیمالر مشاهده شد. تمام تیمارها صد سلله آپپتزي زس بیش از گره کنترل بد. صد سلله آپپتزي دیررس تمام تیمارها بیش از گره کنترل بد. صد سللهاي آپپتزي سللهاي گره کنترل تیمار شده دیررس 233 میلیمالر 133 13 غلظتهاي مختلف 13 سینامیک اسید به ترتیب 24/12 13/47 7/23 34/12 19/19 بد. بیشترین تعداد سلله آپپتزي دیررس مربط به تیمار 133 میلیمالر بد )تصیر 2.)3 گرههاي تیمار سللهاي نکرتیک صد غلظته اسید تمام سینامیک شده مرداستفاده نزدیک به گره کنترل بد. صد سلله نکرتیک سللهاي گره کنترل تیمار شده غلظتهاي مختلف 133 13 13 233 میلی مالر 3/19 2/29 اسید به ترتیب 1/73 سینامیک 3/17 2/23 بد. نمایانگر Q1 سللهای نکرزی + PI یژگی Annexin-V ناحیه Q2 نمایانگر سلله يا + PI یژگی یا دیررس شده آپپتز + Annexin-V ناحیه نمایانگر Q3 Annexin-V سللهاي سالم یژگی PI ناحیه آپپتز شده جان یژگی Q4 PI نمایانگر سلله يا Annexin-V + میشد. تصایر میکرسکپ فلرسنت سلله يا ( + PI نکرتیک به رنگ قرمز )Annexin-V صرت جد سللهاي آپپتزي + )Annexin-V به رنگ سبز زس سللهيا ( - PI آپپتزي دیررس ( + PI )Annexin-V به رنگ سبز قرمز سللهاي سالم - ( PI )Annexin-V بدن رنگ مشاهده شدند. نتایج این تحقیق نشان داد که صد سللهاي آپپتزي ابتدایی سللهاي گره کنترل تیمار شده غلظتهاي مختلف 13 133 233 13 میلیمالر سینامیک اسید به ترتیب 9/32 1/19 23/37 14/37 24/12 سللهاي آپپتزي زس بد که بیشترین صد به ترتیب تیمارهاي نمدار 9: میزان زنده مانی )A( سمیت سللی )B( سللهای MCF-7 گره های کنترل تحت مان غلظت های مختلف سینامیک اسید) 91 911 211 11 میلی مالر (. IC50 سینامیک اسید حدد 11 میلی مالر بدست آمد. تعداد متفات ستاره ها ری هر ستن بیانگر اختالف معنیدار سطح p 1/11 می شد. مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

669 فائزه زینیند همکاران نمدار 2 : صد سلله یا MCF-7 TUNEL + مان شده غلظته یا 911 11 91 211 میلی مالر سینامیک اسید به مدت 24 ساعت. تعداد متفات ستاره ها ری هر ستن بیانگر اختالف معنیدار سطح >p 1/11 میشد. تصیر 9 : تصیر میکرسکپ فلئرسنت سلله یا + TUNEL MCF-7 گره کنترل 24 ساعت پس از تیمار محیط پایه حای 1/2 DMSO صد )بزرگنمایی 41( )A( پس از تیمار سینامیک اسید 91 میلی مالر )B( 11 میلی مالر) C ( 911 میلی مالر )D( 211 میلی مالر )E( )بزرگنمایی 41(. سلله یا سبزرنگ نشاندهنده سلله یا + TUNEL میشند. مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی... 661 تصیر 2 : نتایج تست فلسایتمتری سللهای گره کنترل تیمار شده محیط پایه حای 1/2 صد DMSO رنگآمیزی شده PI )A( Annexin-V پس از تیمار سینامیک اسید 91 میلی مالر )B( 11 میلی مالر) C ( 911 میلی مالر )D( 211 میلی مالر :Q1.)E( سللهای نکرزی ( + PI )Annexin-V Q2: سللهای آپپتز شده دیررس ( + PI + )Annexin-V Q3: سللهای سالم PI ( )Annexin-V Q4: سللهای آپپتز شده جان PI (.)Annexin-V + مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

669 فائزه زینیند همکاران تصیر 3 : نتایج میکرسکپ فلرسنت سللهای گره تیمار شده محیط پایه حای 1/2 صد DMSO رنگآمیزی شده PI )A( Annexin-V پس از تیمار سینامیک اسید 91 میلی مالر )B( 11 میلی مالر) C ( 911 میلی مالر )D( 211 میلی مالر )E(. سللهای نکرتیک ( + PI )Annexin-V قرمز سللهای آپپتزی زس ( - PI + )Annexin-V سبز سلله یا آپپتزی دیررس ( + PI )Annexin-V بدن رنگ. - + )Annexin-V سبز قرمز سللهای سالم ( PI بحث نتیجهگیري سالهاي اخیر تحقیقات شناسایی ترکیت طبیعی خاص شده است. گستردهاي ضد به سرطان منظر انجام اینحال به دلیل فقدان اطالعات کافی خصص مکانیسم ملکلی عملکردي بسیاري از این ترکیت ماجه کاربرد گسترده کلینیکی میشد مطالعات بیشتر مکانیسم ملکلی منشأ ضد آنها بهمنظر تردیدهایی شناسایی سرطانی بسیاري از ترکیت طبیعی به یژه ترکیت مشتق از گیاهان ضرري میشد )7(. سینامیک اسید یکی از پرمصرفترین ترکیت گیاهی است که به دلیل خاص سمی پایین آن تسط سازمان به Food and Drug ( FDA )Administration تأیید شده است نتیجه میتاند عنان یک افزدنی اثرات غذایی سرطان اثرات ضد سرطانی مصرف گردد. پیشگیري از اینحال مکانیسم عملکردي ضد سرطانی این ترکیت سطح ملکلی تاکنن تحقیق نشان داد که بهخبی مطالعه نشده است. مقدار نتایج این LC50 سینامیک سللهاي MCF-7 بر اساس ارزیابی زندهمانی به رش حدد MTT اسید دز 13 133 میلیمالر میلی میشد. مالر سبب القاي سینامیک شاخصهاي آپپتز سللهاي سرطان سینه رده MCF-7 پس از مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی... 662 24 ساعت شد. به طريکه شکست DNA کرمزمی تعداد سللهاي آپپتتیک انتهایی حال مرگ بر اساس برز پرتئینهاي ند شنده به Annexin به طر ابسته به دز افزایش یافت. مطالعاتی که اخیرا انجام شده است اثر ضد تمري سینامیک اسید بر برخی از ردهه يا سللی سرطانی شناسایی شده است. تاکنن اثر مهاري سینامیک اسید بر رشد تمرهاي کارسینما رحم سریکس )14( لکمی )9( آدنکارسینما کلن )13( گلیلستما مالنما پرستات کارسینم ریه )13( سارکماي استخان )11( شرایط مدله يا حیانی مرد تأیید قرارگرفته است. Zhang همکاران مطالعه خد اثر مکانیسم عمل رقتهاي مختلف سینامیک اسید بر ري تکثیر آپپتز سلله يا لسمی K562 را بررسی کردند. نتایج این مطالعه نشان داده است که مان طالنی رقت پایین سینامیک منجر به تقف ابسته به دز فاز G0/G1 چرخه سللی سلله يا لسمی K562 القاي تمایز کشت سللهاي لسمی میگردد. همچنین این تحقیق نشان يا داد که سینامیک اسید به عنان یک فاکتر بسیار مهم کاهش احتمال متاستاز سللی میشد )22(. دز مؤثر سینامیک اسید مهار سللهاي لسمی K562 نسبت به دز مؤثر به دستآمده این تحقیق MCF-7 سللهاي سرطانی میلیمالر( )133 Machado-Santelli Niero پایینتر بده است. مطالعه مقایسه پتانسیل سیتتکسیک ژنتکسیک مان اسید سینامیک رقته طیف سیعی از مالنسیت رده سللی انسان )HT-144( مالنم NGM مرد بررسی قرارگرفته است. LC50 سینامیک اسید مرد سللهاي HT-144 2/4 میلی- مالر گزارش شده است. حالیکه همین غلظت تأثیري بر سللهاي رده NGM نداشتهاست. غلظت 3/2 میلی- مالر سینامیک اسید سبب تقف سیکل سللی فاز S رده سللی HT-144 شدهاست. اما همین غلظت تأثیري بر سیکل سللی رده NGM نداشته است )23(. مطالعه حاضر بر ري سللهاي رده MCF-7 مقدار LC50 برابر 13 میلیمالر بد. این یافتهها نشان میدهد که ردههاي سللی مختلف نسبت به سینامیک اسید ممکن است حساس یا مقام شند. همچنین نتایج حاصل از تحقیق Niero Machado-Santelli صد سللهاي رده دز آپپتز القا نشاندهنده 21 HT-144 میلیمالر 3/2 پاسخ به مان بد. اسید سینامیک حالیکه تعداد سللهاي آپپتتیک پاسخ به الترین دز سینامیک اسید زمان 24 ساعت اختالف معنیداري گره کنترل رده )1/3 NGM صد( نداشته است )21(. مطالعه حاضر بر اساس رش فلسایتمتري استفاده از Anexin V پرپیم یدید 34/2 صد سللهاي سرطانی تحت مان سینامیک اسید دز 133 میلیمالر یژگیهاي آپپتز انتهایی را نشان دادند که نشاندهنده مقامت الي رده سللی میشد. MCF-7 Niero سینامیک نسبت به آثار مهار رشد آپپتز اسید مقایسه سللهاي لسمی جد اثرات ژنتکسیک مشاهدهشده مطالعه Machado-Santelli نیز تجه به فعالیت ضد پرلیفراتی سینامیک اسید غلظت مالنم رده سللهاي میکرمالر 3/2 HT-144 استفاده لقه از آن به عنان ادجانت )Adjuvants( مان مالنم پیشنهاد شده است )21(. تجه به نتایج تحقیق حاضر مطالعه اینحال Niero Machado-Santelli حساسیت ردههاي مختلف مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

663 فائزه زینیند همکاران سللهاي سرطانی به سینامیک اسید نمیتان دز یکسانی را مان لینی جهت مان کمکی سینامیک اسید بکار برد. Liu اثرات ضد تمري ا یپ همکاران مطالعه جامعی به بررسی ردهه يا اسید سینامیک مختلف سللی نراکتم )Neuroectodermal( تلیال شامل مالنما )1011 MEL A375 Du 145 PC3( کارسینماي پرستات )SKMEL A172( گلیلستما )LnCaP U251( سرطان ریه )A549( پرداختند. این مطالعه کمترین سینامیک مالنما بیشترین IC50 IC50 اسید )13 میلی مالر( مربط به رده مربط به ردهه يا گلیلستما )43 میلی مالر( به دست آمده است. نتایج این تحقیق نشان داد که نرمال IC50 سللهاي فیبرلست IC50 برابر 23 سللهاي تمري است که نشاندهنده ایمن بدن سینامیک اسید مان سللهاي تمري میشد )13(. همکاران Pontiki به رش سنتزي مشتقات متنعی از سینامیک اسید را تلید فعالیتهاي بیلژیکی آنها مانند خاص آنتیاکسیدانی ضدالتهابی سیتتکسیک قرار بررسی مرد را دادهاند. این مطالعه LC50 سینامیک اسید بر ري ردهه يا مختلف سللهاي سرطانی شامل OAW42 A549 ریه HT-29 کلن تخمدان MDA-MB-231 سرطان سینه کمتر از 243 میکرمالر گزارش گردیده است که نشاندهنده مقامت الي این سللها به سینامیک اسید میشد )11(. صرفنظر از حساسیت یا مقامت ردههاي مختلف سللهاي سرطانی که سبب پاسخ متغیر آنها به مقادیر اسید سینامیک مختلف میشد نتایج تحقیق حاضر نشان میدهد که سینامیک اسید از طریق القا مسیرهاي خارجی داخلی آپپتز سبب برز آپپتز میشد. این مطالعه غلظت 133 میلیمالر سینامیک اسید مقایسه سایر غلظتها سبب افزایش سللهاي حال مرگ TUNEL + ANEXIN + سللهاي + PI گردید. آپپتزي اینحال مکانیسم دقیق القا آپپتز تسط سینامیک اسید ناشناخته میشد. 2314.نشان دادند که منجر به القاي سللهاي Pontiki سینامالدئید پراکسیداسین جدا کبدي همکاران کاهش )Peroxidation( شده از نتیجه سمیت سللی القا شده از تنفس مشتقاتی )11(. میشد ممانعت سال گلتاتین چربی رت نر میشد. 2'- چن سینامالدئید) Hydroxycinnamaldehyde ( آنالگ 2 '- بنزئیل اکسی )Benzoyloxycinnamaldehyde( نفذپذیري به منجر ROS میتکنیایی میتکنیایی هیکسی سینامالدئید تحریک انتشار سیتکرم C سللهاي لسمی انسانی 23 ( Human )Leukemia 60 (HL-60) Ng.)12( Wu مشتق فعال سنتزي سینامالدئید را بر سلل القا مطالعه خد فعالیت هپاتما سینامیک کبدي آپپتز میشد آپپتز القا اسید به نام انسان بررسی نشان دادند که این ترکیب سبب افزایش بیان فاکتر آپپتتیک Bax مهار فاکترهاي آنتی آپپتز Bcl2 Mcl-1 شکست 3 بیان کاسپاز القا نهایتا Bid میشد. مطالعه دیگري تسط همین گره بر ري سللهاي هپاتیت کبدي انسان HepG2 مان این سللها سینامالید سبب مهار بیان پرتئینهاي Bcl- Xl آپپتز آپپتتیک فعال میگردد کردن کاسپاز 3 از طرفی عث P53 Bax منجر به ص فرمان القا پرتئین سطحی پرتئینهاي CD95 گردید )24(. مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی... 664 Chew همکاران استفاده از رش فلسایتمتري نشان دادند که 33 میکرمالر سینامالدئید سبب تقف سیکل سللی مرحله G2/M القا بیان کاسپاز 3 نهایتا آپپتز سللهاي سرطان کلن HCT-116 میشد )17(. سللهاي سرطان گردن رحم U14 تقف سیکل سللی مرحله G2-M مبین این امر است که سینامیکاسید چرخه سللی تمر را تحت تأثیر قرار میدهد )14(. سینامیک- اسید تکثیر سنتز DNA سللهاي Caco-2 )رده بزرگ انسان( را مهار میکند )13(. مطالعه Niero Machado-Santelli مان سللهاي مالنما رده HT-144 دز 3/2 میلیمالر سینامیک اسید سبب افزایش تعداد سللهاي آپپتزي انتهایی + PI گردید. حالیکه این دز تأثیري بر فعالسازي پرتئین ضد آپپتزي کاسپاز - 9 این سللها نداشت. سللهاي NGM این دز هیچ تأثیري بر شاخصهاي آپپتز نداشته است.)21( نتیجهگیري نتایج این تحقیق سایر محققین نشان میدهد که ردههاي مختلف سللهاي سرطانی نسبت به دزهاي مختلف ترکیب سینامیک میتاند سبب القا اسید حساس میشد این شاخصهاي آپپتز مرگ سللی شد. مجمع نتایج این تحقیق نشان داد که میتاند اسید سینامیک بهعنان یکی از فراانترین ترکیت گیاهی مرد استفاده انسان برز MCF-7 آپپتز سللهاي سرطان سینه رده افزایش سللهاي تأم Anexin + PI + TUNEL + نقش داشتهشد. قدانی نگارندگان از معانت پژهشی دانشگاه شهید چمران اهاز به لحاظ تامین هزینههای این پژهش )پژهانههای شماره 92/6/2/636210 92/3/00/86918( تقدیر قدانی مینمایند. 1-Johnson K, Pan S and Mao Y. Risk factors for male breast cancer in Canada, 1994-1998. Eur J Cancer Prev. 2002; 11(3): 253-63. 2-Guinee VF. Epidemiology of breast cancer. In: Comprehensive management of benign malignant disease. 1998; PP: 339-40. 3-Mousavi SM, Montazeri A, Mohagheghi MA, Jarrahi AM, Harirchi I, Najafi M and Ebrahimi M. Breast cancer in Iran: an epidemiological review. Breast J. 2007; 13(4): 383-91. 4-Azizi F, Hatami H and Janghorbani M. Epidemiology and control of common diseases in Iran. 3ed. Tehran: Khosravi publication. 2004; 12-7. 5-Fazeli Z, Najafian-Zade M, Eshrati B and Almasi-Hashiani A. Five-year evaluation of epidemiological, geographical distribution and survival analysis of breast cancer in Markazi Province, 2007-11. AMUJ. 2014;16(80):72-6-Ma H, Carpenter CL, Sullivan-Halley J and Bernstein L. The roles of herbal remedies in survival and quality of life among long-term breast cancer survivors--results of a prospective study. BMC Cancer. 2011; 11: 222. 7-Carvalho AA, Andrade LN, de Sousa EBV and de Sousa DP. Antitumor Phenylpropanoids Found in Essential Oils. Bio Med Res Int. 2014; 2015: 21-42. 8-Liu C, Liu Y and Yan X. Effects of plumbagin on the human breast cancer cell mda-mb-231 in vitro. West China J Pharmaceut Sci. 2008; 23: 1044-47. 9-Zhang LP and Ji ZZ. Synthesis, anti-inflammatory and anticancer activity of cinnamic acids, their derivatives and analogues, Acta Pharmaceutica Sinica. 1992; 27(11): 817-23. 10-Liu L, Hudgins WR, Shack S, Yin MQ and Samid D. Cinnamic acid: a natural product with potential use in cancer intervention, Int J Cancer. 1995; 62(3): 345-50. منابع مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

661 فائزه زینیند همکاران 11-Zhang Q, Wang Y and Chai W. Induced-differentiation effects of cinnamic acid on human osteogenic sarcoma cells cultured primarily in vitro. Zhonghua Zhongliu Fangzhi Zazhi. 2009; 16(9): 668-72. 12-Bemani E, Ghanati F, Boroujeni LY and Khatami F. Antioxidant activity, total phenolics and taxol contents response of hazel (Corylus avellana L.) cells to benzoic acid and cinnamic acid. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 2012; 40 (1): 69-73. 13-Gravina HD, Tafuri NF, Silva Júnior A, Fietto JL, Oliveira TT, Diaz MA and Almeida MR. In vitro assessment of the antiviral potential of trans-cinnamic acid, quercetin and morin against equid herpesvirus 1. Res Vet Sci. 2011; 91(3): 158-62. 14-Zhang, Y.; Yang, XY.; Kunag, ZS. and Xiao, C.). Inhibitory effect of cinnamic acid germanium on growth of uterocervicalcarcinoma (U14) cells in mice. Linchuang Yu Shiyan Binglixue Zazhi. 2010; 26: 467-70. 15-Pontiki E, Litina DH, Litinas K and Geromichalos G. Novel Cinnamic Acid Derivatives as Antioxidant and Anticancer Agents: Design, Synthesis and Modeling Studies. Molecules 2014; 19(7): 9655-74. 16-Ka H, Park HJ, Jung HJ, Choi JW, Cho KS, Ha J and Lee KT. Cinnamaldehyde induces apoptosis by ROSmediated mitochondrial permeability transition in human promyelocytic leukemia HL-60 cells, Cancer Letters. 2003; 196(2): 143-52. 17-Chew EH, Nagle AA, Zhang Y, Scarmagnani S, Palaniappan P, Bradshaw TD, Holmgren A and Westwell AD. Cinnamaldehydes inhibit thioredoxin reductase and induce Nrf2: potential candidates for cancer therapy and chemoprevention. Free Radic Biol Med. 2010; 48(1): 98-111. 18-Ekmekcioglu C, Feyertag J and Marktl W. Cinnamic acid inhibits proliferation and modulates brush border membrane enzyme activities in Caco-2 cells. Cancer Letters. 1998; 128(2): 137-144. 19-Moon EY, Lee MR, Wang AG, Lee JH, Kim HC, Kim HM, Kim JM, Kwon BM and Yu DY. Delayed occurrence of H-ras12V-induced hepatocellular carcinoma with long-term treatmentwith cinnamaldehydes. Eur J Pharmacol. 2006; 530(3): 270-75. 20-Loo DT. In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay: an overview of techniques. Methods Mol Biol. 2011; 682:3-13. 21-Yang DJ, Azhdarinia A, Wu P, Yu DF, Tansey W, Kalimi SK, Kim EE and Podoloff DA. In vivo and in vitro measurement of apoptosis in breast cancer cells using 99mTc-EC-annexin V. Cancer Biother Radiopharm. 2001; 16(1):73-83. 22-Zhang J, Xiao A, Wang T, Liang X, Gao J, Li P and Shi T. Effect and mechanism of action of cinnamic acid on the proliferation and apoptosis of leukaemia cells. Biom Res. 2014; 25(3): 405-8. 23-Niero ELO and Machado-Santelli GM. Cinnamic acid induces apoptotic cell death and cytoskeleton disruption in human melanoma cells. J Experim Clin Cancer Res. 2013; 32: 31. 24-Ng LT and Wu SJ. Antiproliferative activity of Cinnamomum cassia constituents and effects of pifithrinalpha on their apoptotic signaling pathways in Hep G2 cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2011; 492148. مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6

تأثیر سینامیک اسید بر شاخصهای آپپتزی... 666 The Effect of Trans-Cinnamic Acid on Apoptotic Indexes in Cancer Cells MCF7 Faezeh Zeinivand 1, Mohammad Reza Tabandeh 2, Maryam Kolahi 3* 1-Graduate of Veterinary Medicine. 2-Associated Professor of Biochemistry and Molecular Biology. 3-Assistance Professor of Biology. 1,2-Department of Biochemistry and Molecular Bilogy, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran. 3-Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran. Corresponding author: Maryam Kolahi; Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran. Tel:+986133331045 Email: m.kolahi@scu.ac.ir Abstract Backgound and Objective: Trans-cinnamic acid (CA), a deamination product of phenylalanine in all plant tissues, is the main active ingredient used by the human from plantcontaining foods. CA can inhibit the growth of various human tumor cell lines such as colorectal, leukemia, hematoma, as well as melanoma. This study aims to investigate the effect and action mechanism of CA on apoptosis of MCF-7 breast cancer cells. Subjects and Methods: MCF-7 breast cancer cells treated with different concentrations of CA (0, 10, 50, 100 and 200 mm) for 24 h. Cell viability was determined using MTT assay. Apoptosis markers including DNA fragmentation, phosphatidylserine exposure at the outer leaflet of the plasma membrane measured using TUNEL and flow cytometery and Annexin V affinity. Results: Viability assay showed that the IC 50 of CA in MCF-7 cells was about 50 mm. CA at dose of 100 mm significantly induced the apoptosis after 24 h treatment as assessed by TUNEL + cells and evidence of late apoptotic cells with Annexin V + and propium iodide (PI + ). [provide data here] [with P values]. Conclusion: The results showed that CA with apoptotic activity is an effective anti tumor against MCF-7 cells. CA can inhibit the growth of MCF-7 cells by inducing cell apoptosis. The results can be helpful in understanding the anticancer mechanism of CA and gain further support for its safe use as an alternative and complementary drug in cancer therapy. Keywords: Apoptosis, MCF-7 Cancer cell line, Trans cinnamic acid. Please cite this paper as: Zeinivand F, Tabandeh MR, Kolahi M. The Effect of Trans-Cinnamic Acid on Apoptotic Indexes in Cancer Cells MCF7. Jundishapur Sci Med J 2017;15(6):663-676. Received: Dec 13, 2015 Revised: Dec 31, 2016 Accepted: Feb 6, 2017 مجلۀ علمي پزشكي جندیشاپر ۀ 51 شمارۀ 5931 6