RAPORT DE FAZA Etapa a IV-a Ianuarie-Iunie 2013

RAPORT DE FAZA Etapa a IV-a Ianuarie-Iunie 2013 Existenta unor agenti patogeni, recunoscuti a avea activitate imunosupresoare, in populatiile porcine, pot determina slabirea capacitatii de aparare a organismului, dar mai ales pot contribui la cresterea riscurilor de aparitie si evolutie grava a unor boli. Inducerea unei imunitati protectoare contra diferitelor infectii la porcine depinde de cativa factori. Unii patogeni (PRRS, circovirusul porcin, Mycoplasma etc.), micotoxinele si chimicalele sunt cunoscute a modula negativ sistemul imun si astfel, pot interfera semnificativ cu eficacitatea oricarui protocol de vaccinare. Cele mai multe informatii cu privire la mecanismele imunologice implicate in protectia contra infectiei cu diferite virusuri au aratat ca, in unele cazuri, protectia indusa prin vaccinare a fost atinsa in absenta anticorpilor neutralizanti la momentul infectiei cu o tulpina virulenta. Aceste observatii implica rolul vital al imunitatii mediate celular in protectia virala in timpul fazei timpurii a imunitatii. Imunitatea mediata celular este cunoscuta a avea un rol efector si de reglare asupra sistemului imun si se crede ca este esentiala pentru imunitatea contra agentilor patogeni, inclusiv virusurile. Informatiile anterioare cu privire la rolul imunitatii mediate celular in protectia virala indusa de vaccinuri la porci sunt foarte limitate, datorita faptului ca tehnicile conventionale sunt impracticabile pentru detectia imunitatii mediate celular la porcine. Mai mult, s-a demonstrat activitatea limfoproliferativa specifica fata de un antigen in 1 P a g e

limfocitele din sangele periferic de la porci vaccinati care au fost protejati contra infectiei cu virus PPC. A fost demonstrata existenta limfocitelor T citotoxice pentru PPC (CTL) in celulele mononucleare din sangele periferic (PMBC) de la porci imunizati. In vivo, virusul PRRS se replică în macrofagele alveolare pulmonare, celulele dendridice din amigdale, limfonoduli, timus, splină, plăci Peyer, ficat, rinichi, cord. Diagnosticul de certitudine se realizează prin izolare virală sau, recent, prin utilizarea testului PCR (detecţia genomului viral in probele biologice). Testele serologice, bazate pe detecţia anticorpilor faţă de virus, realizate prin metode imunoenzimatice şi testele de imunofluorescenţă, directă sau indirectă, sunt utilizate în programele de supraveghere a efectivelor porcine de reproducţie. Indiferent de testul utilizat, pot fi inregistrate erori de diagnostic datorate variabilităţii antigenice şi genetice (virusul PRRS fiind se pare virusul cu cea mai înaltă rată de mutageneză, de 10-2/situs/an, faţă de alte virusuri ARN, la care evoluţia inregistrează indici de 10-3/situs/an; Laboratorul de referinţă OIE, Canada, nu a stabilit inca un protocol de diagnostic genetic standardizat). În ceea ce priveşte combaterea şi controlul bolii, în zonele cu prevalenţă ridicată şansele de eliminare a infecţiei sunt minime. Niciuna dintre metodele de eradicare utilizate (depopularea secvenţială a adăposturilor, înţărcare precoce, cu transfer în alte adăposturi, vaccinare) nu a dat rezultate pozitive în totalitate. Vaccinurile inactivate existente nu conferă protecţie decât asupra manifestărilor de reproducţie, iar cele vii doar asupra manifestărilor respiratorii. Virusul PRRS/infecţiile asociate acestuia fac obiectul unor cercetări intense. Tulpinile tip EU nu induc manifestări respiratorii in infecţii unice. Nivelul răspunsului mediat celular (evidenţiat prin detecţia gif) 2 P a g e

protejează faţă de manifestările respiratorii in cazul tulpinilor NA. In răspunsul imun la nivelul ţesutului pulmonar un rol major il au limfocitele T citotoxice. In model celular s-a constatat că induce apoptoză, iar in model animal s-a inregistrat creşterea citokinelor pro-inflamatorii (IFNa şi TNFa), asociată unui aspect sever al leziunilor pulmonare. Numeroase studii sunt dedicate tehnicilor de detecţie, epidemiologiei moleculare (prezenţa concomitentă in anumite regiuni a ambelor tipuri virale, absenţa clusterilor pe criterii geografice sau temporale, ca şi corelaţia negativă intre evoluţia genetică a virusului si presiunea selectivă datorată vaccinărilor). Au fost construite variante ELISA cu peptide sintetice iar in prevenţia / controlul bolii sunt incercate vaccinurile ADN cu secvenţe izolate din tulpini sălbatice sau cu secvenţe sintetice in care s-au introdus substitutii, si chiar serumizări. Un alt virus implicat în infecţiile respiratorii la porc, adeseori asociat cu PRRS este circovirusul porcin 2 (PCV- 2), considerat în prezent ca agent etiologic al sindromului caşectizant multisistemic al purceilor înţărcaţi (Postweaning multisystemic wasting syndrom - PMWS), al sindromului tremurului congenital al purceilor nou-născuţi şi implicat în infecţiile respiratorii la porc. CVP2 are ca celule ţintă monocitele şi macrofagele, având de asemenea efect supresor, iar la nivel celular, efect apoptotic. Date experimentale arată că vaccinările pot exacerba agresivitatea PCV 2. Circovirusul porcin (PCV) a fost descris pentru prima data in urma cu peste 20 de ani ca fiind un contaminant picornavirus-like permanent al liniei celulare renale de porc PK15 (ATCC-CCL 33). Dupa cativa ani, s-a raportat ca PCV este un virus mic, fara anvelopa, icozaedric, continand un genom ADN monocatenar circular. Dupa aceasta PCV a fost atribuit familiei Circoviridae. 3 P a g e

Recent, aparitia unui virus PCV distinct antigenic si genomic in populatiile de porcine ce a fost asociat cu un numar de stari clinice a crescut interesul pentru studierea PCV. Virusul descoperit nou a fost denumit PCV2, iar contaminantul original PCV al celulelor PK15 a fost denumit PCV1. Diferenta antigenica a acestor izolate noi fata de PCV1 a fost confirmata cu anticorpi monoclonali si policlonali. Virusurile PCV2 au fost izolate de la porci bolnavi in America de Nord, Europa, Taiwan si Coreea de Sud. PCV1 si PCV2 sunt virusuri mici (17 nm), icozaedrice, fara anvelopa, continand un genom ADN monocatenar circular. Densitatea PCV1 in CsCl a fost raportata a fi de 1.37 g/cm3 de catre Tischer si de 1.33-1.34 g/ml de catre Allan et al., iar coeficientul de sedimentare de 57S comparativ cu coeficientul de sedimentare cunoscut al enterovirusului bovin. PCV1 nu hemaglutineaza eritrocitele de la o gama de animale si este rezistent la inactivare dupa expunere la ph 3, cloroform, 56 o C si 70 o C. Secventa nucleotidica completa (1759 nt) a genomului circular al contaminantului PCV1 al celulelor PK15 este cunoscuta si PCV1 poate replica printr-o forma replicata dublucatenara (RF). S-a demonstrat o forma RF PCV1 si ambele catene ale RF PCV1 sunt transcrise si proteinele de codificare sunt cunoscute. Sunt recunoscute cateva cadre de citire deschise (ORF) pentru PCV1 cu un potential de a codifica proteine mai mari de 5 kda, codificate pe una dintre catenele RF PCV. Analiza secventei de proteine codificate de catre ORF1 a indicat un grad de omologie cu nanovirusul plantelor ORF cunoscut a codifica proteinele asociate replicarii. Intr-adevar, infectia cu PCV la porci poate fi initiata de catre un nanovirus al plantelor care isi schimba gazda pentru a infecta o vertebrata si apoi se recombina cu un virus infectant al vertebratelor. Aceasta omologie cu 4 P a g e

nanovirusurile plantelor si similaritatea inalta a secventei de aminoacizi intre un produs proteic potential al ORF1 al virusului bolii ciocului si penelor si produsul ORF1 al PCV1 a fost raportata. Micoplasmele sunt cele mai mici si cele mai simple organisme ce pot sa se multiplice singure si se disting fenotipic de alte bacterii prin marimea lor si lipsa unui perete celular. Ele sunt caracterizate prin marimea mica si un continut mic in G+C ale genomului. In timpul evolutiei, Mycoplasma spp a pierdut toate genele implicate in biosinteza de acizi grasi si aminoacizi. M. hyopneumoniae, cea mai importanta specie de Mycoplasma la porcine, este agentul primar al pneumoniei enzootice porcine si, in asociere cu unele virusuri respiratorii, joaca un rol important in complexul de boli respiratorii porcine (PRDC). Ambele afectiuni cauzeaza pierderi economice majore pentru industria de crestere a porcului in intreaga lume datorita scaderii performantei si cresterii susceptibilitatii la alte infectii. Alte micoplasme patogene importante la porcine includ M. hyorhinis, ce produce poliserozita si artrita, M. hyosynoviae, o cauza a artritei la porcii in crestere si M. suis care este asociata in principal cu anemia. Aceste date conduc la necesitatea stabilirii implicatiilor agentilor microbieni imunosupresori asupra eficientei programelor de imunoprofilaxie aplicate in unitatile de crestere a pentru a se obtine date care sa fundamenteze masuri adecvate de control care sa limiteze pierderile economice si care sa aiba un impact pozitiv asupra sanatatii si bunastarii efectivelor de porcine si asupra cresterii calitatii si sigurantei alimentare prin obtinerea si aplicarea unor metode de profilaxie eficiente. 5 P a g e

Obiectivul etapei a IV-a a fost: Evaluarea răspunsului imun indus prin vaccinare la porci convenţionali (vaccin antirujetic), în absenţa şi în prezenţa tulpinilor de microorganisme cu efect imunosupresor şi cuantificarea parametrilor imunologici post vaccinali la animalele vaccinate din sistemul intensiv de creştere a porcinelor, în prezenţa microorganismelor imunosupresoare. Atingerea acestui obiectiv s-a realizat prin indeplinirea urmatoarelor activitati: Activitatea IV.1.: Experimente de vaccinare efectuate pe porci convenţionali infectaţi/neinfectaţi cu germeni patogeni imunosupresori. Activitatea IV.2.: Evaluarea parametrilor imunologici post vaccinali la animale vaccinate din sistemul intensiv de creştere a porcinelor, în prezenţa şi în absenţa microorganismelor imunosupresoare. Activitatea IV.3.: Analiza statistică a datelor obţinute în experimentele efectuate. Activitatea IV.1.: Experimente de vaccinare efectuate pe porci convenţionali infectaţi/neinfectaţi cu germeni patogeni imunosupresori. Pentru desfăşurarea lucrărilor s-au achiziţionat din import: Kituri ELISA, pentru detecţia anticorpilor specifici pentru PRRS, Circovirus şi Mycoplasma hyopneumoniae. Medii de cultură pentru izolarea bacteriei Mycoplasma hyopneumoniae. Kituri pentru testul PCR. 6 P a g e

Alte materiale aferente lucrărilor: tuburi pentru recoltarea probelor de sânge, din organe, secreţii, tampoane pentru recoltarea secreţiilor nazale şi bucale, seringi, vacutainere, instrumente chirurgicale. S-a efectuat documentarea ştiinţifică, programarea şi desfăşurarea lucrărilor în teren şi în laborator Recomandari privind efectuarea acţiunilor de imunoprofilaxie specifică într-o unitate de creştere şi îngrăşare a porcinelor I. ANIMALE ÎN PERIOADA DE CARANTINĂ Scrofiţele şi vieruşii cumpăraţi vor fi supuşi următoarelor acţiuni. - vaccinare antileptospirică, antiparvo +antirujetica la 20 zile de la cumpărare - vaccinare antileptospirică, antiparvo+antirujetica la 50 zile de la cumpărare Acţiunea de prelevare a probelor de sânge pentru examene serologice se va realiza în primele 14-20 zile de la preluare. Se recomandă ca, cel puţin animalele nou achiziţionate să fie vaccinate cu un vaccin antileptospiric tetravalent. II. SCROFIŢE ÎN AŞTEPTARE (producţie proprie) - vaccinare antileptospirică, antiparvo* şi contra PRRS* - vaccinarea I - la 210 zile vârstă; - vaccinarea a II-a - la 240 zile vârstă (ultima vaccinare cu 14-21 zile III. VIERI înainte de montă) - vaccinare antileptospirică - trimestrial; 7 P a g e

- vaccinare anti-prrs de două ori pe an (primăvara şi toamna) cu rapel la 21 zile*. IV. SCROAFE GESTANTE - vaccinare antileptospirică I - Ia 50 zile de la montă; - vaccinare antileptospirică II - la 65 zile de la montă; - vaccinare anti-coli I - la 70 zile de la montă; - vaccinare anti-coli II - la 90 zile de la montă; În funcţie de situaţia epidemiologică a unităţii se pot aplica vaccinări de necesitate contra pleuropneumoniei infectioase, poliserozitei infectioase (boala lui Glasser) şi anaerobiozelor o dată cu vaccinarea I şi a II-a anti E. coli. V. SCROAFE LACTANTE, AŞTEPTARE - vaccinare antiparvo si/sau antirujetica (o singură inoculare) cu 5 zile înainte de înţărcare*; VI. PURCEI SUGARI - vaccinare contra Mycoplasma hyopneumoniae (PEP) I la 7 zile vârstă* - vaccinare contra Mycoplasma hyopneumoniae (PEP) II la 21 zile vârstă* - vaccinare contra Mycoplasma hyopneumoniae +circovirus (PCV2) la 21 zile de varsta (conform recomandarilor firmelor care produc vaccinurile respective)* VII. TINERET CRESCĂTORIE Nu este cazul 8 P a g e

VIII. PORCI GRAŞI Nu este cazul * vaccinări opţionale în funcţie de situaţia epidemiologică si recomandarile firmelor producatoare de vaccinuri. S-a făcut documentarea pentru metodele de izolare a virusului PRRS şi Circovirus, întocmindu-se şi procedura de izolare a germenilor Mycoplasma hyopneumoniae la suine. De asemenea, s-au continuat investigaţiile privind existenţa şi ponderea germenilor circulanţi patogeni cu efect imunosupresor în ferme de porcine. S-a continuat recoltarea de probe biologice (sânge şi organe) din diferite locatii, atât din ferme de crestere intensivă, cât şi de la animale sălbatice (mistreţi): - probe recoltate dintr-o fermă de porcine cu crestere intensivă Pigcom Satu Nou - avand in vedere ca vanatoarea la mistreti este sezoniera, s-au prelevat in avans probe in vederea analizelor de laborator cuprinse in activitatile fazei V a proiectului. Probele au fost recoltate de la mistreţi din 8 judeţe: Prahova, Bacău, Suceava, Vâlcea, Brasov, Mureş, Covasna şi Giurgiu, dupa cum urmeaza: 66 probe organe mistreţi de la Directia Silvica Prahova (AVPS Câmpina, FV 22 Orjogoaia, AVPS Pisica salbatică, FV 30 Slon, FV 10 Sicriţa, FV 9 Drăgăneşti, FV 28 Telejenel, FV 35 Paltineţ, FV 35 Şoimari, FV 24 Comarnic, FV 19 Mislea, FV 36 Cosmina, FV 29 Basca, FV 11 Gherghita, FV 42 Malu Rosu, FV 31 Caldaruşi) 4 probe organe si 4 probe sânge mistreţi de la Directia Silvică Bacău (fondul de vanatoare Coţofeneşti), 9 P a g e

47 probe sânge mistreţi de la Directia Silvică Vâlcea (FV 47 Răcoasa - Oc. Silvic Dragaşani, FV 36 Padina - AVPS Băniceana, FV 32 N. Bălcescu - Ocolul silvic Stoiceni, FV 37 Mitrofani - CVPS Dragasani, FV 41 Dozesti - AJVPS Valcea, Balcesti, FV 44 Draganu - AJVPS Valcea Balcesti, FV 39 Usurei, AJVPS Valcea - Ladesti, FV 13 Cozia Calimanesti, FV 19 Olanesti - AVPS Brai, FV 38 Dobrusa - Oc. silvic Dragasani, FV 2 Dobrunu Oc. silvic Voineasa, FV 45 Fauresti, FV 37 Mitrofani, FV 27 Cernisoara - Horezu, FV 25 Stroesti- Horezu, FV18 Cazanesti - AJVPS Valcea, FV 9 Caineni - AJVPS Valcea Brezoi, FV 8 Malaia - FVPS Cinegetica Lovistea Brezoi, FV 4 Babuiesti - AVPS Sitarul Bucuresti, FV 21 Romani - AVPS Pajura Horezu, FV 13 Cozia - Oc. silvic Calimanesti, FV 20 Bistrita, Oc. silvic Romani, Costesti) 12 probe organe mistreţi de la DSVSA Suceava (FV 24 Frasin, FV 54 Pătrăuţi, FV 23 Negrileasa Stulpicani, FV 47 Voroneţ, FV 16 Valea Cârlibabei) 23 probe organe mistreţi de la DSVSA Brasov 146 probe organe mistreţi de la DSVSA Mureş 92 probe organe mistreţi de la DSVSA Covasna 2 seturi organe si 4 probe sânge de la mistreţi, FV 4 Căscioarele, ocolul silvic Bolintin Vale, Jud. Giurgiu PROBE RECOLTATE DIN SISTEMUL DE CRESTERE INTENSIV Pentru studiul nostru am luat ca referinţă ferma PIGCOM SA Satu Nou, judetul Tulcea, în care PRRS a fost confirmată în urmă cu 4 ani. 10 P a g e

Probele biologice (sânge şi organe) au fost prelevate la anumite intervale de timp, ţinând cont de vârstă, fluxul tehnologic şi dinamica vaccinărilor din fermă. Activităţile de reproducere, creştere şi îngrăşare a porcinelor din această exploataţie se derulează în 13 spaţii de cazare (hale), astfel: - 3 hale pentru reproducţie, unde se aplică în exclusivitate însămânţările artificiale, materialul seminal fiind asigurat de la cei 28 vieri terminali. In perioada anterioară materialul seminal a fost achizitionat şi din import, constituind probabil sursa de infecţie cu PRRS, circovirus; - 2 hale de maternitate destinate fătării si creşterii descendenţilor până la vârsta de inţărcare (30-32 zile); - 2 hale pentru creşterea tineretului de unde se selectau din punct de vedere fenotipic, cele mai reprezentative exemplare de scrofite pentru inlocuirea matcii; - 6 hale pentru porcinele la ingrasat Materialul de reproducţie femel este reprezentat de tineretul femel obţinut în unitate care constituie materialul de înlocuire al reformelor de scroafe, exploatate de 2,1 ori pe an şi vierii terminali donatori de material seminal, achiziţionati de la SC PIG Romania, SC Dan Bred SRL din judetul Argeş, în perspectiva de la unităţi de profil din Ungaria, cu care se negociază condiţiile de achiziţie. Între o depopulare şi urmatoarea populare se asigură repaosul tehnologic pentru executarea decontaminării spaţiilor de cazare,"odihna tehnologică" a spaţiilor de cazare pentru asigurarea unor conditii optime pentru o noua serie de purcei care intră pe fluxul de productie. Pentru verificarea eficacităţii acesteia se efectueaza testele specifice de laborator. 11 P a g e

gestante În maternitate actul fătării se produce în boxe individuale, unde scrofele deparazitate sunt introduse cu cel putin 2 zile înainte de fătare, încălzirea în pardoseală find asigurată de către o reţea de calorifere care realizează temperatura tehnologică pentru nou-născuţi, până la ciclului (înţărcarea). încheierea Trecerea la categoria tineret creştere se face la vârsta de 30-32 de zile de şedere în maternitate, practicându-se procedeul tehnologic "totul plin totul gol" când un procent redus dintre aceştia îl reprezintă exemplarele rămase în creştere pe care se grefează o anumita flora care determina un procent totuşi ridicat de pierderi prin mortalitate de 8-10%, fenomen cantonat în proporţie ridicată la această categorie de purcei. Se practică creşterea la baterii, şi la sol, un mijloc sigur de contaminare a purceilor aproape la fiecare serie, o cauză care poate influenţa condiţiile de microclimat. Porcii grasi sunt crescuti la sol până la atingerea varstei şi a greutăţii de livrare, când sunt valorificaţi la tăiere. Condiţiile de furajare sunt bune, nutreţurile combinate producându-se pe plan local în staţia proprie de măcinare unde se înglobează premixurile necesare fiecărei categorii de porcine din exploatare, în funcţie de statusul de sănătate existent la un moment dat sau eventualele perioade cu sporuri de creştere nefavorabile. Situaţia vaccinărilor în fermă: La matcă: la vârsta de 180 de zile, - Vaccinare contra PRRS, cu rapel cu 2 săptămâni înainte de montă. - Vaccinare contra parvovirozei - Vaccinare contra circovirozei - Vaccinare contra leptospirozei 12 P a g e

La scroafe şi scrofiţe pentru însămânţare: - Vaccin antileptospiric la vârsta de 55 de zile - Vaccin contra PRRS şi rapel cu vaccin antileptospiric, la vârsta de 70 de zile. - Vaccin contra anaerobiozelor şi contra colibacilozelor la vârsta de 75 de zile cu rapel la 95 de zile. În maternitate, la purcei cu 2 săptămâni PARVORUVAX- contra parvovirozei şi rujetului. înainte de înţărcare: vaccin - La purcei, vârsta de 21 zile- vaccin Flexcombo contra circovirozelor şi micoplasmei. - la tineret- vaccin contra pleuropneumoniei la vârsta de 42 de zile cu rapel la 72 de zile. - la porcul gras nu se face vaccinare. Deparazitarea internă şi externă se face o singură dată, cu premixuri cu ivermectină, după vârsta de inţărcare. Nu se face deparazitarea adăpostului. Din ancheta epizootologică efectuată în fermă s-au constatat tulburări respiratorii la scroafe iar la purcei, la scurt timp după naştere, pe lângă aceste tulburări, prezintă anorexie, febră pasageră şi o dezvoltare redusă. De asemenea, apar tulburări de reproducţie la scroafe (avorturi, fătări de purcei mumifiaţi, număr mic de progeni din cauza mortalităţii embriofetale parţiale sau purcei neviabili). Semnele clinice sunt frecvent agravate de infecţii secundare. S-au prelevat probe biologice (sânge şi organe) de la suine din fermă, in vederea punerii in evidenta a virusurilor PRRS, Circovirus, M. hyopneumoniae. 13 P a g e

05.12.2012 PIG COM SATU NOU 4 seturi organe tineret porcin varsta 2 luni proba 1: pulmoni + ganglioni => PCR (PRRS, Circovirus, Mycoplasma hyopneumoniae) => Virusologic (PRRS, Circovirus) => Bacteriologic -Mycoplasma hyopneumoniae proba 2: pulmoni => PCR (PRRS, Circovirus, Mycoplasma hyopneumoniae) => Virusologic (PRRS, Circovirus) => Bacteriologic -Mycoplasma hyopneumoniae proba 3: pulmoni => PCR (PRRS, Circovirus, Mycoplasma hyopneumoniae) => Virusologic (PRRS, Circovirus), => Bacteriologic -Mycoplasma hyopneumoniae proba 4: pulmoni => PCR (PRRS, Circovirus, Mycoplasma hyopneumoniae) => Virusologic (PRRS, Circovirus) => Bacteriologic -Mycoplasma hyopneumoniae 14.12.2012 PIG COM SATU NOU Probe prelevate Seturi de organe de la purcei cu leziuni de PRRS dupa cum urmeaza: - 3 probe din hala 6 compartimentul 4 de la purcei in varsta de 42-45 de zile; -2 probe de la purcei cu leziuni de PRRS din hala 7, in varsta de 65 de zile. 14 P a g e

In ambele cazuri, probele prelevate au fost: ggl. mandibulari, mediastinali, mezenterici, portiuni de trahee, pulmon, ficat, rinichi. Seturi organe suine (ganglioni mandibulari, mediastinali, mezenterici, trahee, pulmoni, ficat, rinichi H6C4, varsta 42-45 zile 3 probe H7, varsta 65 zile 2 probe Analize: Proba 1 purcel de 40 zile, intarcat, H6 leziuni congestive si pneumonie(hepatizatie pe zone reduse) => PCR (pulmoni si trahee) Proba 2 purcel de 44 zile, intarcat, H6 leziuni congestive si pneumonie(hepatizatie rosie si cenusie la varful lobilor apical si cardiac)) => PCR, virusologic (pulmoni, gg traheobronhici si trahee) Proba 3 purcel de 65 zile, intarcat, H7 leziuni de pneumonie, aspect mozaicat cu zone de hepatizatie si edem pulmonar) => PCR, virusologic (pulmoni, gg traheobronhici si trahee) Proba 4 purcel de 75 zile, intarcat, H7 leziuni de pneumonie cu zone de hepatizatie in diverse stadii) => PCR (pulmoni, gg traheobronhici si trahee) 27.02.2013 Pig Com SATU NOU, Tulcea 9 avortoni suine 37 probe sange suine, tineret inţărcat, înainte şi după vaccinare antirujetică Avortoni: hepatoză, ficat friabil, congestie intestinală 15 P a g e

virusologic (pulmoni, trahee, splina, rinichi) probele 5/1 si 5/2 PCR (pulmoni, trahee, splina, rinichi) probele 5/1 si 5/2 Mycoplasma hyopneumoniae (pulmoni) probele 5/4 si 5/5 37 probe sânge H7 C10 (1-16 inainte de vaccinare antirujetica, varsta 92 zile; 1-21 dupa vaccinarea antirujetica, varsta 109 zile) serologic PRRS, Circovirus, M. hyo, Rujet (37 probe) PCR (probele 7, 14 92 zile si 1, 5-109 zile) 15.05.2013 BA 1407 PICOM SATU NOU, TULCEA S-au recoltat probe de sânge, din confluentul jugular de la: - purcei cu vârsta de 180 de zile, probele 1-21. - tineret cu vârsta de 85 de zile( hala 12, compartimentul 17), probele 22-42 - scroafe în aşteptare( înainte de montă) 5 probe: S1,S2,S3,S4,S5. S-au prelevat, de asemenea, probe din organe cu leziuni de la doi purcei cu vârste de aproximativ 45 de zile, din ficat, pulmoni, ganglioni mezenterici, intestin subţire. 46 probe ser sanguin: 20 probe tineret x 180 zile, 21 probe tineret x 85 zile, 5 probe scroafe in asteptare Rezultate teste ELISA: M. hyopneumoniae, Circovirus, PRRS 16 P a g e

Activitatea IV.2.: Evaluarea parametrilor imunologici post vaccinali la animale vaccinate din sistemul intensiv de creştere a porcinelor, în prezenţa şi în absenţa microorganismelor imunosupresoare. REZULTATE EXAMENULUI SEROLOGIC Pentru decelarea anticorpilor specifici din serul animalelor s-a folosit testul imunoenzimatic ELISA. Au fost analizate 83 probe sânge provenite de la porcine crescute in sistem intensiv, dintre care, pentru PRRS, 41 au fost pozitive (37 de la tineret si 4 de la scroafe in asteptare). În cazul infecţiei cu Circovirus la tineret au fost 21 suspecte, iar la scroafe în aşteptare 2 pozitive şi 2 suspecte. La infecţia cu M. hyopneumoniae s-au identificat la tineret 21 probe pozitive şi 2 suspecte, iar la scroafe în aşteptare 2 pozitive. Anticorpi antirujetici s-au detectat la 9 probe din categoria tineret. 17 P a g e

Nr. ELISA Proprietar Varsta Status imun crt. PRRS M. hyo Circovirus Rujet 1 Pig Com Satu Nou 92 zile Nevaccinate Negativ Negativ Negativ Negativ 2 anti Rujet Negativ Negativ Negativ Negativ 3 Negativ Negativ Negativ Negativ 4 Negativ Negativ Negativ Negativ 5 Negativ Negativ Negativ Negativ 6 Negativ Negativ Negativ Negativ 7 Negativ Negativ Negativ Negativ 8 Negativ Negativ Suspect Negativ 9 Negativ Negativ Negativ Negativ 10 Negativ Negativ Negativ Negativ 11 Negativ Negativ Negativ Negativ 12 Negativ Negativ Negativ Negativ 13 Negativ Negativ Negativ Negativ 14 Negativ Negativ Negativ Negativ 15 Negativ Negativ Negativ Negativ 16 Negativ Negativ Negativ Negativ TOTAL POZITIVE 0/16 0/16 0/16 0/16 TOTAL SUSPECTE 0/16 0/16 1/16 (6.25%) 0/16 18 P a g e

Nr. Status ELISA Proprietar Varsta crt. imun PRRS M. hyo Circovirus Rujet 1 Pig Com Satu Nou 109 zile Vaccinate Negativ Negativ Suspect Negativ 2 anti Rujet Negativ Negativ Negativ Negativ 3 Negativ Negativ Negativ Negativ 4 Negativ Negativ Negativ Negativ 5 Negativ Negativ Negativ Negativ 6 Negativ Negativ Negativ Negativ 7 Negativ Negativ Negativ Negativ 8 Negativ Negativ Negativ Negativ 9 Negativ Negativ Negativ Negativ 10 Negativ Negativ Negativ Negativ 11 Negativ Negativ Negativ Negativ 12 Negativ Negativ Negativ Pozitiv 13 Negativ Negativ Suspect Pozitiv 14 Negativ Negativ Suspect Pozitiv 15 Negativ Negativ Negativ Pozitiv 16 Negativ Negativ Negativ Pozitiv 17 Negativ Negativ Negativ Pozitiv 18 Negativ Negativ Negativ Pozitiv 19 Negativ Negativ Negativ Pozitiv 20 Negativ Negativ Suspect Pozitiv 21 Negativ Negativ Negativ Negativ TOTAL POZITIVE 0/21 0/21 0/21 0/21 TOTAL SUSPECTE 0/21 0/21 4/21 (19%) 9/21 (42%) 19 P a g e

Tineret x 180 zile REZULTATE ELISA Pig Com Satu Nou PRRS CIRCOVIRUS M. RUJET HYOPNEUMONIAE 1 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 2 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 3 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 4 Pozitiv Suspect Suspect Negativ 5 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 6 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 7 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 8 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 9 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 10 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 11 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 12 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 13 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 14 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 15 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 16 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 17 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 18 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 19 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 20 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ TOTAL 20 pozitive 9 suspecte 19 pozitive, 1 suspect 0/20 20 P a g e

Tineret x 85 zile REZULTATE ELISA Pig Com Satu Nou PRRS CIRCOVIRUS M. RUJET HYOPNEUMONIAE 1 Negativ Suspect Negativ Negativ 2 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 3 Negativ Negativ Negativ Negativ 4 Negativ Negativ Negativ Negativ 5 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 6 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 7 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 8 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 9 Pozitiv Negativ Suspect Negativ 10 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 11 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 12 Pozitiv Suspect Negativ Negativ 13 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ 14 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 15 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 16 Negativ Suspect Negativ Negativ 17 Pozitiv Suspect Negativ Negativ 18 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ 19 Pozitiv Suspect Negativ Negativ 20 Pozitiv Negativ Negativ Negativ 21 Pozitiv Suspect Negativ Negativ TOTAL 17 pozitive 7 suspecte 2 pozitive, 1 suspect 0/21 21 P a g e

scroafe in asteptare REZULTATE ELISA Pig Com Satu Nou PRRS CIRCOVIRUS M. RUJET HYOPNEUMONIAE S1 Pozitiv Suspect Negativ Negativ S2 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ S3 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ S4 Negativ Pozitiv Negativ Negativ S5 Pozitiv Pozitiv Negativ Negativ TOTAL 4 pozitive 2 pozitive, 2 suspecte 2 pozitive 0/5 REZULTATELE EXAMENELOR ANATOMOPATOLOGIC SI BACTERIOLOGIC Organele examinate de la tineretul porcin in varsta de 45 de zile (ficat, pulmon, ganglioni mezenterici, intestin subţire), au prezentat si infectii bacteriene cu germeni asociati. La examenul anatomopatologic din organe au predominat leziuni de poliserozita serofibrinoasa, pleura, pericardul si peritoneul fiind acoperite de depozite de fibrin cenusii-galbui, usor detasabile. Aceste leziuni au orientat diagnosticul spre o bola infectioasa, specifica porcinelor, produsa de Haemophilus parasuis, confirmata de altfel de catre medical epizootolog al fermei. 22 P a g e

La examenul necropsic efectuat pe unele cadavre de purcei, examinate in ferma, s-au observat si leziuni de pneumonie interstitiala si ganglioni (traheobronhici, mediastinali) mariti, cu aspect marmorat pe sectiune. Pentru izolare s-au utilizat medii de imbogatire: Agar cu sange de oaie 5%, Agar şocolat, Bulion nutritiv cu sange de oaie 5%, iar pentru diferenţierea primară a germenilor s-au utilizat mediile selective: Mac Conkey sau Istrati- Meitert. Insămânţările primare au fost incubate aerob, la 37 C, caracterele culturale fiind examinate la 24 si 48 de ore. Examenul caracterelor morfologice s-a efectuat prin microscopie optică, folosindu-se metoda de colorare Gram. Identificarea tulpinilor izolate s-a realizat utilizand sistemului clasic TSI, MIU si Simmons, precum si sisteme miniaturizate, standardizate, API 20 E pentru identificarea enterobacteriaceelor si API 20NE pentru germeni Gramnegativi non-fermentativi. Rezistenta la antibiotice s-a determinat prin metoda Kirby-Bauer difuzimetrica), pe mediu Mueller-Hinton pentru enterobacteriacee şi Agar triptonat, imbogaţit cu 5% sânge de oaie pentru germenii cu cerinţe speciale de creştere. Rezultate: Din pulmoni si cord (1/2) s-a izolat Mannheimia haemolytica, sensibila la Fosfomicina+Tylosin, Amoxicilina, Ampicilina, moderat sensibila la Enrofloxacin, Flumequine, Florfenicol si rezistenta la Colistin, Doxiciclina, Gentamicina, Oxitetraciclina. Din ficat (1/2)s-a izolat o tulpina de Salmonella spp. (serogrup C), sensibila la Enrofloxacin, Florfenicol, Sulfametoxazol + Trimetoprim, Fosbac + T, Gentamicina, Ampicilina, Amoxicilina si rezistenta la Oxitetraciclina, Colistin, Doxiciclina si Flumequine. 23 P a g e

Fig.1 Identificare Mannheimia haemolytica prin kit API20NE Fig.2 Antibiograma M. haemolytica pe Mueller-Hinton cu 5% sange defibrinat de oaie Fig.3 Salmonella spp. grup C pe medii TSI si MIU 24 P a g e

1. Scop Examenul bacteriologic pentru izolarea M. hyopneumoniae Procedura de lucru: Stabileşte etapele care trebuiesc parcurse pentru a obţine tulpina de Mycoplasma hyopneumoniae, pornind de la probe recoltate de la animale cu leziuni specifice ale infecţiei cu această bacterie. 2. Aplicabilitate 2.1. Procedura se aplică lotului de porci testaţi în cadrul proiectului ADER 7.3.5. 2.2. Procedura se aplică în Laboratorul de diagnostic pe probele recoltate în teren sau de la abator, de la porcii supuşi testului. 3. Responsabilitate 3.1. Recoltarea, prelucrarea probelor şi pregătirea materialelor: Dr. Cătălin Tudoran, Dr. Petru Sevciuc, Biol. Alina Radu, Dr. Nicolae Levandovschi, Dr. Cristian Uluitu. 3.2. Verificarea respectării/ execuţiei corecte a procedurii: Dr. Viorica Chiurciu 4. Definiţii, prescurtări 4.1. Definiţii: - 4.2. Prescurtări/abrevieri utilizate în textul procedurii: 4.2.1. PPLO : Pleuropneumonia like organism 4.2.2. MPS : Pneumonia micoplasmică a suinelor 4.2.3. PRRS : Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome 4.2.4. M. hyo. : Mycoplasma hyopneumoniae 4.2.5. POS: Procedura de Operare Standard 25 P a g e

5. Materiale si echipamente Eprubete Recipiente pentru recoltare probe, prevăzute cu filet şi capac Plăci Petri pentru microscopie Truse de necropsie Truse de microbiologie Genţi pentru transportul probelor (frigorifice) Medii de cultură Termostat 37 C, cu posibilitatea de asigurare a umidităţii şi a atmosferei CO 2 Microscop sau Stereoscop Echipament de protecţie specific locului intervenţiei (fermă, abator, laborator) 6. Procedura 6.1. Considerente de securitate: Precauţii pentru lucrul cu animale, elemente fizice, chimice, biologice periculoase (salopete pentru zonele cu risc înalt, măşti, ochelari, mânuşi, ustensile pentru imobilizarea animalelor, curăţarea scurgerilor accidentale etc.). 6.2. Introducere: Mycoplasma hyopneumoniae agent al pneumoniei enzootice porcine şi co-factor al sindromului PRRS 6.2.1. Pneumonia micoplasmică a porcinelor (MPS) sau pneumonia enzootică, este cauzată de Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo.) şi reprezintă unul dintre cei mai importanţi factori ai bolilor cauzatoare de pierderi în producţia de porcine. Pierderile economice asociate cu MPS sunt adesea rezultatul unei interacţiuni complexe între Mycoplasma şi co-infecţii cu alte bacterii, managementului sănătăţii şi condiţiilor precare de mediu. Studiile 26 P a g e

arată că peste 90% din efectivele de porcine din întreaga lume suferă de pneumonie enzootică, catalogând-o drept una dintre cele mai prevalente şi costisitoare boli. Chiar la niveluri scăzute ale infecţiei, această boală respiratorie cronică prezintă costuri semnificative suplimentare, datorate eficienţei scăzute a asimilării hranei, scăderii globale a sporurilor zilnice de greutate, variabilităţii mărimii, scăderii preţului carcasei şi repetării tratamentului cu antibiotice. 6.2.2. MPS este menţinut în mai multe efective prin transmiterea de la scroafă la purcel a M. hyo. Odată ce infecţia este stabilită la câţiva porci, ea va fi transmisă la porcii din întregul efectiv, mai ales după ce animalele sunt comasate în timpul înţărcării. În sistemele de producţie continuă, M. hyo. şi o serie de alţi agenţi patogeni respiratori importanţi pot fi transmişi în număr mare la porcii tineri. Semne de MPS, de obicei, nu sunt întâlnite la purcei sub vârsta de şase săptămâni. Deşi este de aşteptat ca infecţiile cu M. hyo. să fie întâlnite începând cu etapa de creşă a, dovada microbiologică a prezenţei microorganismului în leziunile pulmonare nu a fost găsită. Factorii care ar putea contribui la prevalenţa uriaşă în etapele de creştere şi de îngrăşare a sunt: perioada lungă de incubaţie a M. hyo., răspândirea lentă a microorganismului la purcei, creşterea densităţii animalelor după etapa de creşă, răspândirea altor agenţi infecţioşi şi factorii de mediu după înţărcare. 6.2.3. Deşi infectate cu Mycoplasma hyopneumoniae, animalele pot deveni co-infectate cu virusul PRRS, virusul gripei porcine şi cu alţi agenţi ai bolilor respiratorii porcine, care conduc la grave 27 P a g e

probleme reproductive. De asemenea, pierderile economice pot fi considerabile în cazul în care apar infecţii bacteriene secundare. Aceste pierderi pot include probleme de reproducţie, cum ar fi avortul şi fetuşii fătaţi morţi în loturile de reproducţie. 6.2.4. La porcii bolnavi germenii se găsesc în pulmon, atât în partea lezată, cât şi în cea normală. În secreţiile aparatului respirator se găsesc în cantitate mai mică şi în mod constant (jetaj, secreţii bronşice din timpul strănutului, tusei, grohăitului). Factorii de microclimat (umiditatea mare şi temperatura scăzută) contribuie la răspândirea bolii. 6.2.5. Mycoplasma hyopneumoniae (identică cu Mycoplasma suipneumoniae) este un germen polimorf, care se colorează prin metoda Giemsa şi creşte pe medii complexe ce conţin ser de porc, colesterol, în condiţii de anaerobioză cu 5-10% CO 2. Bacteria rezistă foarte puţin în mediul extern, este inactivată în 48 de ore la uscăciune, dar poate rezista până la 17 zile în apa de ploaie la 2-7 C. Este sensibilă in vitro la penicilina G, tiamulin, tylosin, lincomicin, spiramicin, enrofloxacin şi la tetracicline. 6.2.6. Confirmarea în laborator a prezenţei bacteriei se poate realiza prin: izolarea Mycoplasmei hyopneumoniae pe medii de cultură specifice din probe recoltate din secreţiile aparatului respirator sau din zonele pulmonare afectate evidenţierea micoplasmelor în amprente sau secţiuni de ţesut pulmonar prin imunofluorescenţă directă sau în secreţii bronşice (spălături bronhiale de la ambii pulmoni) prin PCR 28 P a g e

şi ELISA folosind anticorpi monoclonali, hibridarea ADN/ADN teste serologice - permit detectarea anticorpilor specifici din serul sanguin prin Reacţia de fixare a complementului (este mai puţin specifică decât ELISA), testele ELISA : ELISAs - utilizează ca antigen 36 kda lactat dehidrogenaza, monoclonal ELISAs blocking şi Tween 20 ELISAs. Anticorpii pot fi evidenţiaţi la 10 zile după infecţie şi se menţin cel puţin 80 de zile. 6.3. Principiile procedurii Tehnica de izolare 6.3.1. Izolarea micoplasmelor depinde de bogăţia de germeni din probă. Un inoculum bogat, însămânţat cât mai repede după recoltarea probelor, într-un mediu îmbogăţit cu glucoză şi ser de cal asigură izolarea germenilor. Pentru a inhiba dezvoltarea contaminaţilor obişnuiţi în astfel de probe, în mediul de izolare se adaugă acetat de taliu (500 µg/ml), penicilină G (1.000 UI/ml) şi amfotericină B (5 µg/ml). Incubarea se face la 37 C în atmosferă cu 95 % azot şi 5 % CO 2. 6.3.2. Izolarea M. hyopneumoniae din materialele patologice se realizează mai greu comparativ cu alte micoplasme, iar pe medii solide formează colonii foarte mici, mai rar apărând aspectul clasic de ouă ochiuri. Necesită pentru creştere steroli, aminoacizi, extract de drojdie, hidrolizat de lactalbumină şi ser de porc. Se poate cultiva şi pe culturi celulare primare sau pe linii celulare standardizate pe care produce efect citopatic şi/sau citotoxic. 6.3.3. Mycoplasma hyopneumoniae este identică antigenic cu Mycoplasma flocculare care este nepatogenă. Proprietăţile 29 P a g e

biochimice : fermentează constant glucoza, nu hidrolizează arginina şi ureea. 6.3.4. Mediul de cultură utilizat pentru transportul probelor: 2,5 g heart infusion broth în 70 ml apă deionizată încălzită la 80 C, 10 ml de 25 % extract proaspăt de drojdie, 20 ml ser de cal, 0,2 ml de soluţie 10 % de acetat de thaliu şi 0,5 ml de penicilină (200.000 UI/ml). Se ajustează ph-ul la 7,6 şi se sterilizează prin filtrare. 6.3.5. Medii de cultură: - este recomandată utilizarea în paralel a mai multor variante de mediu, pentru a spori şansele de recuperare a bacteriei Mediul Eaton s: 21 g de Broth base PPLO (fără cristal-violet) dizolvaţi în 700 ml apă deionizată, peste care se adaugă 100 ml extract proaspăt de drojdie, 200 ml ser neinactivat de cal, 10 g glucoză, 0,5 ml de penicilină (200.000 UI/ml), 12,5 ml de soluţie roşu fenol 0,2 % şi 0,02 g de ADN. Se ajustează ph-ul la 7,6-7,8 şi se sterilizează prin filtrare. Mediul Chanock, Hayflick şi Barile, constituit din: 7 părţi Difco PPLO broth, 2 părţi ser de cal neinactivat, 1 parte extract 25 % de drojdie, suplimentat cu acetat de thaliu ad. 1: 2.000, dextroză ad. 1 %, roşu fenol ad. 0,002 %. Mediul Friis modificat 500 ml tampon salin Hank s, 8,2 g brain heart infusion broth (Difco), 8,7 g PPLO fără cristalviolet (Difco) şi 750 ml apă deionizată. Se autoclavează, apoi se adaugă 60 ml extract proaspăt de drojdie, 4,5 ml de soluţie 0,5 % roşu fenol, 250 mg bacitracină şi 250 mg meticiclină. La final, se adaugă ser suin inactivat şi de cal până la o 30 P a g e

concentraţie finală de 10 % din fiecare. Se ajustează ph-ul la valoarea 7,4 şi se sterilizează prin filtrare. Mediul Goodwin: 40 % tampon salin Hank s, 30 % bulion Hartley s, 10 % soluţie 5 % de hidrolizat de lactalbumină, 20 % ser suin, 0,1 % acetat de thaliu, 0,5 % extract de drojdie, 200 unităţi/ml de penicilină. 6.3.6. Mediul solid pentru cultivare (PPLO agar): PPLO broth base, noble agar, extract proaspăt de drojdie, glucoză, L-arginină, sare disodică de ADN şi sare disodică de NAD, cu adăugarea de ser suin inactivat până la o concentraţie finală de 15-20 %. 6.4. Recoltarea de probe de la animalele din experiment: 6.4.1. tampoane sterile din bumbac pentru secreţiile nazale: - se inserează cât mai adânc în fosa/fosele nazale, apoi se imersează în eprubete ce conţin mediu steril de transport 6.4.2. de la animalele aflate în fază acută de boală se poate încerca recoltarea de lichid pleural prin puncţia cavităţii toracice în porţiunea declivă din spaţiul intercostal VII-VIII. 6.4.3. la abator, sunt recoltate probe din leziunile localizate la nivelul pulmonilor: suprafaţa exterioară a organului este sterilizată prin flambare sau opărire. Acolo unde este posibil, se foloseşte un set diferit de instrumente sterile pentru fiecare recoltare. În mod aseptic se recoltează fragmente mici (1-3 cm 3 ) de la nivelul porţiunii de trecere dintre ţesutul normal şi cel afectat. Fiecare fragment este introdus într-un flacon cu filet, conţinând mediu de transport steril. Leziunile încapsulate sunt extrase, după răzuirea suprafeţei cu ajutorul uneui scalpel şi introduse în recipiente cu mediu de transport. 31 P a g e

6.5. Transportul probelor 6.5.1. Probele sunt trimise la laborator cât mai curând după recoltare, preferabil în aceeaşi zi 6.5.2. Păstrarea probelor se face la rece ( 4 C) 6.5.3. Dacă examinarea microbiologică nu se poate realiza imediat, păstrarea probelor la congelatorul de temperaturi joase este absolut necesară. 6.6. Tehnica pentru izolare în medii lichide şi solide: 6.6.1. Se efectuează diluţii zecimale (10-1 10-6 ) din probele recoltate, folosind mediu lichid 6.6.2. Din fiecare probă se inoculează câteva picături pe suprafaţa mediilor solide sau se realizează însămânţarea prin amprenta porţiunii de organ pe suprafaţa agarului nutritiv. De asemenea, este recomandată inocularea cu ajutorul tampoanelor îmbibate cu probe, prin metoda striurilor paralele. 6.6.3. Controalele se menţin la termostat, în condiţii de umiditate, 5 % CO 2, 37 C. 6.6.4. Controalele cu mediu lichid sunt urmărite zilnic pentru a constata semne de dezvoltare a culturii sau virarea culorii mediului dată de indicatorul roşu-fenol. În fascicul de lumină, culturile de Mycoplasma apar între a 3-a şi a 5-a zi de cultivare, conferind o turbiditate slabă mediului, fiind mai uşor de pus în evidenţă prin compararea cu un recipient cu mediu neinoculat. 6.6.5. Controalele cu mediu solid sunt examinate după 2-3 zile cu obiectivul 35x pentru a constata aspectul cultural de ouă ochiuri al coloniilor. 32 P a g e

6.6.6. În funcţie de rezultatele observate, se poate lua una din următoarele decizii: pasajul culturii din mediu lichid în mediu lichid: se transferă un volum egal cu 10 % de inocul pasajul culturii din mediu lichid în mediu solid: o picătură de inocul este folosită pentru a umecta suprafaţa plăcii cu agar pasajul culturii din mediu solid în mediu lichid: colonii izolate, corespunzătoare sunt recoltate cu ajutorul unei spatule sterile sau cu o pipetă Pasteur şi imersate în mediu lichid pasajul culturii din mediu solid în mediu solid: se decolează o porţiune de agar ce conţine colonii corespunzătoare şi se suprapune, cu faţa în jos, pe suprafaţa unei alte plăci cu agar. 6.6.7. culturile cu valoarea ph sub 7 sunt improprii dezvoltării/menţinerii micoplasmelor, astfel încât se evită atingerea acestei valori, realizându-se pasaje repetate. 6.6.8. pasajele care necesită mai mult de trei încercări pentru izolare sunt considerate negative şi sunt eliminate. 6.6.9. pasajul anterior este păstrat în condiţii corespunzătoare, astfel încât, la sfârşitul experimentului, cea mai veche cultură poate avea patru săptămâni. 7. Raportare/Înregistrări 7.1. Rezultatele sunt înregistrate în fişele de experiment 7.2. Eventualele probleme sunt aduse la cunoştinţa responsabililor de proiect. 7.3. Orice deviaţie de la procedură trebuie aprobată şi înregistrată. 33 P a g e

8. Referinţe Lucrări, documente la care s-a făcut apel pentru întocmirea prezentei proceduri. Ex.: 8.1. Bacteriologie Lucrări aplicative Dănuţ Turcu, 2004 8.2. Bacteriologie veterinară specială Simona Ivana, 2007 8.3. Studiul unor tulpini de Mycoplasma izolate de la porc Ioan Jula, 1976 8.4. Isolation of Mycoplasma hyosynoviae from pneumononic lung of swine, Dahlia, H., Tan, L.J., Zarrahimah, Z. and Maria, J. Veterinary Research Institute, 31400 Ipoh Perak, Malaysia, 2009 8.5. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae, Thacker EL. Swine Health Prod., 2004 8.6. Replication of Mycoplasma pneumoniae în Broth Culture, Iolanda E. Low, Monroe D. Eaton, Journal of Bacteriology, 1965 8.7. PORCINE RESPIRATORY DISEASE COMPLEX (PRDC): A REVIEW. II. DIAGNOSTICS, TREATMENT AND PREVENTION - Bulgarian Journal of Veterinary Medicine,2008 8.8. Evaluation of Mycoplasma hyopneumoniae growth by flow cytometry - P. Assuncao, R. Diaz, J. Comas, C.M. Ruiz de Galarreta, O.R. Gonzalez-Llamazares and J.B. Poveda, 2005 8.9. Swine mycoplasmoses, M. KOBISCH, N.F. FRIIS, 1996 8.10. Detection of Mycoplasmas in Cell Cultures by Cultural Methods, Methods in Molecular Biology, Vol. 104 Mycoplasma protocols, Gerald. K. Masover, Frances A. Becker, 8.11. Detection of Mycoplasmas in Cell Cultures by Cultural Methods, Methods in Molecular Biology, Vol. 104 Mycoplasma protocols, Robin Nicholas, Samantha Baker, 34 P a g e

8.12. Isolation of Mycoplasma hyopneumoniae and its association with pneumonia of pigs in Australia, Sue L. Furlong, B. Sc., A.J. Turner, Altwood Veterinary Research Laboratory, Westmeadows, Victoria 8.13. Farmacopeea Europeană 7.0 (European Pharmacopoeia 7.0) 8.14. Manualul Calităţii Romvac Modul de lucru: a. Prelucrare: Probele au fost însămânţate pe controale perechi : tuburi cu mediu selectiv lichid şi plăci cu mediu selectiv agarizat şi menţinute la anaerostat la 37 C. b. Citire la 24 ore: în toate tuburile s-a constatat dezvoltarea unei culturi abundente, cu miros fetid, depozit masiv, turbiditate intensă, făcând imposibilă prelucrarea ulterioară a acestor probe. În frotiuri s-a evidenţiat existenţa unei bacterii cocoide, Gramnegativă, în majoritatea cazurilor. În plăcile cu agar s-a obţinut uniformitate a dezvoltării culturale pe întreaga suprafaţă a mediului. În frotiuri s-a evidenţiat o populaţie bacteriană cocobacilară, Gram-negativă. Într-o singură placă, după 5 zile de termostatare, s-a observat dezvoltarea unor colonii asemanătoare micoplasmelor. S-a încercat pasajul pe mediu lichid şi solid, dar nu a dat rezultate. 35 P a g e

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU IZOLAREA M. HYOPNEUMONIAE Pentru izolarea M. hyopneumoniae din probele de organe recoltate de la porcine, s-au recoltat 12 probe pulmoni şi ganglioni traheobronhici. În urma punerii pe medii speciale a izolatelor din organe (pulmoni şi ganglioni traheobronhici) nu s-au dezvoltat colonii specifice pentru micoplasme. De asemenea, examenul bacterioscopic efectuat din culturi a fost negativ. EXAMENUL VIRUSOLOGIC Au fost prelucrate probe organe recoltate de la porcine provenienta SC PIG COM SA Babadag Jud. Tulcea. Probele de ţesut (pulmon, splină, rinichi) au fost triturate individual şi resuspendate în PBS în diluţie 1/10. Soluţiile triturate se centrifughează la 2000 rpm timp de 20 de minute şi se filtrează prin filtru de clarificare 0,40 µm şi apoi prin filtru steril de 0,22 µm. Pentru clarificare s-au utilizat filtre Durapore HPF Millex HV, iar pentru sterilizare s-au utilizat filtre Millex GS Millipore. Suspensiile filtrate au fost repartizate pe monostrate din liniile celulare VERO (rinichi de maimuţă verde africană, adultă), MARK (rinichi de maimuţă) şi PK15 (rinichi de porc adult), pe plăcuţe pentru culturi celulare cu 12 godeuri pentru fiecare probă (suspensie filtrată). Un godeu a fost inoculat în mediu şi două godeuri au fost inoculate pe monostrat, cu cîte 0,2 ml iar un godeu a rămas martor de cultură, pentru fiecare probă testată. Fişele liniilor celulare utilizate sînt prezentate în anexe. 36 P a g e

Fig.4 Probe de organe recoltate de la suine, provenienta PIGCOM Fig.5 Esantioane inocul prelucrate pentru insamantarea pe culturi celulare Fig.6 Linia celulară Vero 37 P a g e

Plăcile au fost examinate zilnic în vederea urmăririi apariţiei unor modificări ale monostratului datorate inoculului, (prezenţa virusului), cu ajutorul unui microscop ranversat tip ZEISS, cu obiectiv 16X şi ocular 10X.. Pe liniile celulare VERO şi MARK nu au fost observate modificări (prezenţa efectului citopatic) datorate inoculului. Pe plăcile cu linia celulară PK15 în godeurile inoculate s-a observat o modificare a monostratului sub forma unor focare de diferite mărimi cu celule refringente şi cu monostratul desprins de pe suport. Aceste focare au fost prezente la 3 dintre probele analizate. Fig.7 Efect citopatic aparut pe linia celulara PK15 inoculată cu triturat de pulmoni În lucrările viitoare se vor efectua 2 3 pasaje, urmărindu-se transmisibilitatea, prezenţa ECP (efectului citopatic) precum şi caracterizarea izolatelor virale prin IFD (imunofluorescenţă directă) utilizînd kitul: FITC conjugat BIO 268 cu anticorpi monoclonali anti- virus PRRS. 38 P a g e

ROMVAC COMPANY S.A. COMPARTIMENTUL TULPINI VIRALE ŞI REAGENŢI FIŞA Nr. 1 / 04.10.1991 1. PROVENIENŢA ECACC, PHLS, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton, Salisbury Wilts SP40JG UK. 2. CARACTERISTICILE DE BAZĂ 2.1. Ţesutul de bază: rinichi de maimuţă verde africană adultă Japonia (1962). 2.2. Rata de multiplicare: 1:30 în 7 zile cu schimbare de mediu de 3 ori în 7 zile şi ph păstrat la 7.4 (CO 2 + aer). 2.3. Cariotip: frecventa distribuţiei cromozomilor la 50 celule: 2n = 60. 2.4. Mediu de creştere: EMEM + 5% BFS. 2.5. Mediu de congelare: EMEM + 30% BFS + 10% DMSO. 2.6. Pasaje din stocul în azot lichid: - periodic conform necesităţilor şi pentru conservarea aproape de 100% a viabilităţii. 2.7. Susceptibilitate la virusuri: SV 40, SV- 5, rujeolă, arbovirusuri, reovirus, rubeolei, adenovirusuri simiene şi poliovirus. 3. OBSERVAŢII Linia de celule VERO a fost depozitată la ECACC, de către WHO, la pasajul 134 (produs al Institutului Merieux Franţa celule cultivate în fermentor pe micropurtători Cytodex 1). S-a constituit un stoc de celule cultivate conform indicaţiilor ECACC: Şef Compartiment Dr. Gh. MOŢIU 39 P a g e

ROMVAC COMPANY S.A. COMPARTIMENT TULPINI, LINII CELULARE ŞI REAGENŢI Nr. Înregistrare... F I Ş A PENTRU LINIA CELULARĂ PK 15 (Kidney, Porcine Sus scrofa) 1. PROVENIENŢA: American Type Culture Collection 12301 Parklonn Drine, Rockville, Maryland 20852 USA. PK 15 ATCC Nr. CCL 33 pasaj 133 2. CARACTERISTICILE DE BAZĂ 2.1. Ţesutul de bază: Rinichi de porc adult. Linia parentală a PK 15, PK 2a, a fost iniţiată în noiembrie 1955 de către E. Stice de la Cutter Lab. Berkeley California. 2.2. Rata de multiplicare: 1 / 2 1 / 4 cu reîmprospătarea mediului de 2 3 ori pe săptămînă. Subcultivarea se face cu soluţie proaspătă 0.25% tripsină + 0.03% EDTA în film. 2.3. Cariotip: Frecvenţa distribuţiei cromozomilor la 50 celule: 2n = 38 2.4. Mediu de creştere: MEM (Eagle) cu aminoacizi neesenţiali, piruvat de sodiu 1mM, cu Earle BSS 95% + 5% BFS. 2.5. Mediu de congelare: Mediu de creştere 95%+5% glicerină, fără antibiotice. 2.6. Pasaje din stocul în azot lichid: periodic, conform necesităţilor şi pentru conservarea viabilităţii celulelor în azot lichid aproape de 100 %. 2.7. Susceptibilitate la virusuri: Virusul stomatitei veziculare (Indiana Strain), vaccinia, reovirusurile tip 2, 3, adenovirusurile tipurile 4, 5, Coxackie B2, B4, B5, B6 şi virusul pestei porcine, tulpina Thyverval. Nesusceptibilă la poliovirus tip 2. 3. OBSERVAŢII: Linia de cultură celulară PK 15 a fost primită în stare congelată (fiole în gheaţă carbonică). S-a constituit un stoc. 4. RESPONSABIL CU ÎNTREŢINEREA LINIEI: Dr. Gh. MOŢIU 40 P a g e

ROMVAC COMPANY S.A. COMPARTIMENT TULPINI, LINII CELULARE ŞI REAGENŢI Nr. Înregistrare... F I Ş A PENTRU LINIA CELULARĂ MARK 145 1. PROVENIENŢA: AMES NVSL USA MARK 145 provine din MA 104. 2. CARACTERISTICILE DE BAZĂ 2.1. Ţesutul de bază: Rinichi de maimuţă. 2.2. Rata de multiplicare: 1 / 2 1 / 4 cu schimbarea mediului de 2 3 ori pe săptămînă. Subcultivarea se realizează la confluenţă cu soluţie proaspătă T+V în film. 2.3. Cariotip: 2.4. Mediu de creştere: EMEM 90% + BFS 10%. 2.5. Mediu de congelare: Mediu de creştere 95% + DMSO 5%. 2.6. Pasaje din stocul în azot lichid: periodic, conform necesităţilor şi pentru conservarea viabilităţii celulelor în azot lichid aproape de 100 %. 2.7. Susceptibilitate la virusuri:p.a.r.r.s. Şi alte virusuri animale (BIA, Aujeszky etc. Conf Dr. Olaru LCSVD). 3. OBSERVAŢII Linia de cultură celulară MARK - 145 a fost primită sub formă de monostrat pe placă de plastic de la LCSVD. A fost constituit un stoc. 4. RESPONSABIL CU ÎNTREŢINEREA LINIEI: Dr. Gh. MOŢIU 41 P a g e

Raport activitate biologie moleculara Pentru izolarea materialului genetic viral şi bacterian s-a folosit tehnica PCR urmărindu-se protocolul de extracţie, amplificare şi identificare, astfel: 1. Material biologic materialul biologic a fost reprezentat de omogenate pulmon colectate în cadrul proiectului. 2. Extractia ADN viral s-a efectuat prin utilizarea kit-ului PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Life Technologies), conform recomandarilor producatorului (Tabelul 1). 42 P a g e

Tabelul 1 Protocol extractie ADN viral utilizand kit-ul PureLink Genomic DNA Nr. Crt Acţiune μl/probă 1 Pobă biologică 200 μl 2 Proteinaza K 20 μl 3 Rnaza A 20 μl 4 Omogenizare prin vortexare. Centrifugare tip spin pentru colectare Incubare 2 minute la temperatura camerei - 5 Tampon de liza PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer 200 μl 6 Omogenizare prin vortexare. Centrifugare tip spin pentru colectare Incubare 10 minute la 55ºC - 7 Etanol absolut 200 μl 8 Omogenizare prin vortexare. Centrifugare tip spin pentru colectare 9 Transfazare in coloniţele de purificare. Volumul maxim de incărcare al coloniţelor este de 650 ul. - 10 Centrifugare 1 minut la aproximativ 13000 rpm; îndepărtare eluat - 11 Se pipetează tampon spalare I 500 μl 12 Centrifugare 1 minut la aproximativ 13000 rpm; îndepărtare eluat - 13 Se pipetează tampon spalare II 500 μl 14 15 Centrifugare 30 secunde la aproximativ 13000 rpm; îndepărtare eluat. Se înlocuiesc tuburile de colecţie Se centrifughează 3 minute la viteza maximă. Se aruncă tubul de colecţie si se inseră coloniţa într-un tub Eppendorf de 1,5ml. - - 16 Tampon elutie 100 μl 17 Incubare 1 minut la temperatura camerei - 18 Se centrifughează 1 minut la 11.000 13000rpm - 43 P a g e

3. Depozitarea ADN viral s-a efectuat la temperaturi adecvate (-20ºC) pana la efectuarea amplificarii. Amplificarea protocol de screening 1. Primerii utilizati pentru amplificare au fost descrisi anterior, (Mattsson si col., 1995; Holko si col., 2004), cu amplificarea unui fragment de 649 nucleotide de la nivelul 16S ARNr (ARN ribozomal). 2. Kit-ul utilizat pentru aceasta etapa GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega), cu un volum final de 50µl (Tabelul 2) Reagentii utilizati pentru amplificare Tabelul 2 Reagent Volum/proba Numar de probe Volum final Tampon Green Buffer 5x 10µl MgCl2, 25mM 3µl dntp 10 mm 1µl Primer Sens (20 μm) Primer Antisens (20 μm) Apa ultrapura GoTaq DNA Polymerase 1,5µl 1,5µl 27,75µl 0,25µl 45µl mix cu 5µl ADN 3. Profil termic in general, profilul termic a fost cel recomandat de literatură (Tabelul 3). 44 P a g e

Profil termic amplificare Tabelul 3 95ºC pentru 2 minute denaturare initiala 94ºC pentru 35 secunde 60ºC pentru 45 secunde 40 cicluri PCR 72ºC pentru 1 minut 72ºC pentru 5 minute extensie finala 4ºC pana la efectuarea electroforezei 45 P a g e

Bibliografie 1) MATTSSON JENS G., KATRIN BERGSTRO M, PER WALLGREN, AND KARL-ERIK JOHANSSON. Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in Nose Swabs from Pigs by In Vitro Amplification of the 16S rrna Gene. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 1995, p. 893 897 2) Holko I., Urbanova J., Holkova T., Kmet V. Diagnostics of main bacterial agents of porcine respiratory diseases complex (PRDC) using PCR detection of Mycoplasma hyopneumoniae. Vet. Med. Czech, 49, 2004 (2): 35 41 46 P a g e

Analiza probelor recoltate Extracţia şi amplificarea au fost efectuate conform protocoalelor optimizate anterior. Pentru virusul PRRS au fost identificate un număr total de şapte probe pozitive, după cum urmează: Proba 2 = purcel înţărcat x 44 zile, NOTA din 10.01.2013. Proba 3 = purcel înţărcat x 65 zile, NOTA din 10.01.2013. Proba 10 = avorton, 5/1-PIG-COM Tulcea - NOTA din 04.03.2013. Proba 12 = avorton, 5/3-PIG-COM Tulcea - NOTA din 04.03.2013. Rezultatele sunt prezentate în figura 1. Fig.8 rezultatele testului RT-PCR identificare genom specific PRRS În ceea ce priveşte circovirusul porcin tip 2 (PCV2), acesta a fost identificat la un număr total de 5 probe, după cum urmeaza: Proba 2 - PIG-COM Tulcea - purcel înţărcat x 44 zile, NOTA din 10.01.2013. Proba 3 - PIG-COM Tulcea - purcel înţărcat x 65 zile, NOTA din 10.01.2013. 47 P a g e

04.03.2013. 04.03.2013. 04.03.2013. Proba 10 - PIG-COM Tulcea avorton-individualizare 5/1, NOTA din Proba 11 - PIG-COM Tulcea avorton-individualizare 5/2, NOTA din Proba 12 - PIG-COM Tulcea avorton-individualizare 5/3, NOTA din Nicio proba nu a fost pozitiva pentru prezenta genomului specific M. hyopneumoniae. Rezultatele testelor de biologie moleculară pentru PCV2 şi M. hyopneumoniae sunt prezentate în figura 2. Fig. 9 rezultatele testului RT-PCR identificare genom specific PCV2 si M. hyopneumoniae 48 P a g e

Activitatea IV.3.: Analiza statistică a datelor obţinute în experimentele efectuate. Investigaţiile efectuate au fost realizate pe porcine din sistemul de creştere intensivă. Animalele au beneficiat de parametri optimi de producţie şi reproducţie, condiţii de hrănire şi întreţinere corespunzătoare, situaţie sanitarveterinară bună. În tabelele prezentate au fost centralizate rezultatele obţinute în urma determinărilor serologice efectuate prin metoda ELISA. Astfel, la suinele crescute în sistem intensiv, din 83 de probe s-au obţinut următoarele rezultate : 41 probe au fost pozitive la PRRS (49%), 6 pozitive şi 18 suspecte (29%) în cazul infecţiei cu Circovirus iar la infecţia cu M. hyopneumoniae s-au identificat 23 probe pozitive şi 2 suspecte (30%). Fig.10 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor anti-prrs şi anti-rujet ELISA PRRS - Rujet 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 81 0 0 0 0 42 100 85 zile 92 zile 109 zile 180 zile scroafe in asteptare varsta 0 80 0 PRRS Rujet 49 P a g e

Fig.11 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor anti-circovirus şi anti-rujet ELISA Circovirus - Rujet 80 80 70 60 50 40 30 20 33 19 42 45 Circovirus Rujet 10 0 0 6 0 85 zile 92 zile 109 zile 180 zile scroafe in asteptare varsta 0 0 Rujet Fig.12 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor anti-m. hyopneumoniae şi anti- ELISA M. hyopneumoniae - Rujet 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 14 0 0 0 0 85 zile 92 zile 109 zile 180 zile scroafe in asteptare varsta 42 45 0 40 0 M. hyo Rujet 50 P a g e

Fig.13 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor impotriva germenilor imunosupresori şi al anticorpilor antirujetici Rezultate ELISA 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 81 33 14 0 0 6 0 0 0 19 0 42 100 4545 0 8080 85 zile 92 zile 109 zile 180 zile scroafe in asteptare varsta 40 0 PRRS Circovirus M. hyo Rujet În urma însămânţării pe medii speciale a probelor de pulmoni şi ganglioni traheobronhici, nu s-au dezvoltat colonii specifice micoplasmelor. În urma examinarii prin metoda PCR a probelor de organe suine, s-au obtinut urmatoarele rezultate: pentru virusul PRRS s-au identificat 4 probe pozitive, iar Circovirusul porcin tip 2 (PCV2) a fost identificat la un număr total de 5 probe. Nu au fost probe pozitive pentru prezenta genomului specific M. hyopneumoniae. La examenul virusologic, pe plăcile cu linia celulară PK15 în godeurile inoculate s-a observat o modificare a monostratului sub forma unor focare de diferite mărimi cu celule refringente şi cu monostratul desprins de pe suport, la 3 probe. Urmează ca în următoarele lucrări să se investigheze transmisibilitatea, prezenţa ECP (efectului citopatic) precum şi caracterizarea izolatelor virale prin IFD (imunofluorescenţă directă). 51 P a g e

S-au efectuat examene bacteriologice din organe utilizându-se tehnici bacteriologice clasice pe medii de îmbogăţire şi selective, solide şi lichide. Culturile obţinute au fost caracterizate morfo-cultural şi biochimic prin teste clasice si prin sisteme multitest API 20NE. Tulpinile bacteriene studiate au fost identificate ca aparţinând speciilor Salmonella spp. şi Mannheimia haemolytica. 52 P a g e

CONCLUZII 1. Corelatiile clinico-epidemiologice din ferma PIGCOM Satu Nou, au condus la diagnosticul de sindrom respirator si de reproductie porcin. 2. Testele de laborator au urmarit pe de o parte izolarea si identificarea agentilor virali si bacterieni, iar pe de alta parte decelarea anticorpilor specifici: pentru izolarea virusului PRRS au fost realizate suspensii filtrate din probe de ţesut (pulmoni, splină, rinichi), care au fost inoculate pe monostrate din liniile celulare VERO, MARK si PK15, conform tehnicilor amintite. Pe liniile celulare VERO si MARK nu au fost observate modificări (prezenta efectului citopatic) datorate inoculului. Pe plăcile cu linia celulara PK15 inoculate cu triturat de pulmoni s-a observat efect citopatic. prin testul RT-PCR s-au identificat proteine din genomul viral, găsindu-se 4 probe pozitive pentru PRRS şi 5 pentru Circovirusul porcin tip 2 (PCV2). Nicio proba nu a fost pozitivă pentru prezenţa genomului specific M. hyopneumoniae. decelarea anticorpilor specifici din serul animalelor a fost facută prin investigatii serologice care au evidenţiat o incidenţă crescută a infecţiei cu virusurile PRRS, Circovirus si M. hyopneumoniae la porcii în vârstă de 85 zile, 180 zile şi la scroafe în aşteptare. 53 P a g e

54 P a g e

55 P a g e