БАКТЕРИОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ Ralstonia solanacearum ПРОУЗРОКОВАЧА УВЕЛОСТИ И МРКЕ ТРУЛЕЖИ КРОМПИРА

УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Сања Јањатовић, дипл. биолог БАКТЕРИОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ Ralstonia solanacearum ПРОУЗРОКОВАЧА УВЕЛОСТИ И МРКЕ ТРУЛЕЖИ КРОМПИРА Нови Сад, 2015. `

УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за фитомедицину и заштиту животне средине Кандидат Сања Јањатовић Балаж Ментор Проф. др Јелица БАКТЕРИОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ Ralstonia solanacearum ПРОУЗРОКОВАЧА УВЕЛОСТИ И МРКЕ ТРУЛЕЖИ КРОМПИРА Нови Сад, 2015. 2

КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ МАСТЕР РАДА Др Јелица Балаж, редовни професор у пензији Ментор Ужа научна област: Фитопатологија Пољопривредни факултет, Нови Сад Др Стеван Маширевић, редовни професор Председник комисије Ужа научна област: Фитопатологија Пољопривредни факултет, Нови Сад Др Жарко Илин, редовни професор Члан комисије Ужа научна област: Повртарство Пољопривредни факултет, Нови Сад 3

БАКТЕРИОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ Ralstonia solanacearum ПРОУЗРОКОВАЧА УВЕЛОСТИ И МРКЕ ТРУЛЕЖИ КРОМПИРА РЕЗИМЕ У Србији се кромпир гаји на око 100. 000 ха (Рекановић и сар., 2012) и једна је од најзначајнијих гајених биљака код нас.у структури површина под поврћем 2011. кромпир доминира са 32%. Принос кромпира последњих година показује благи тренд раста (2011/2012. 11,6 т/ха), али је ипак за око 45% мањи од оствареног европског просека. За то постоји више разлога, а један од њих су и бројни паразити. У европским земљама, у подручјима умерено континенталне климе највећи значај има карантинска бактерија Ralstonia solanacearum (Smith, 1896; Yabuuchi et al., 1996), проузроковач бактериозне увелости и мрке трулежи кромпира. R. solanacearum се налази на EPPO А2 карантинској листи штетних организама (Commission Directive 2006/63/CE), док се у Србији налази на А1 листи карантинских штеточина, јер је још увек присутна само на ограниченом простору и под ерадикацијом (Правилнико мерама откривања, спречавања ширења и сузбијања штетног oрганизма R. solanacearum ;"Сл. гласник РС", br. 107/2009). Балаж и сар.(2010) наводе да се појава бактерије R. solanacearum може очекивати и у Србији, јер је присутна у више европских земаља из којих се увози семенски материјал кромпира. У складу са овим наводима у западној Србији је у јесен 2010. по први пут константована појава ове карантинске бактеријена семенском усеву кромпира. 4

Полазна основа овог истраживања је утврђивање прве појаве карантинске бактерије R.solanacearum на територији АП Војводине. Циљеви рада били су: прикупљање сумњивих узорака кромпира, изолација и идентификација патогена коришћењем стандардних бактериолошких, серолошких и молекуларних метода и утврђивање раса и биовара, испитиваних изолата R. solanacearum. Имајући у виду последице које проузрокује ова значајна карантинска бактерија, задатак овог истраживања је био доказивање присуства R. solanacearum на кртолама кромпира које испољавају симптом мрке трулежи праћењем процедуре коју прописује Директива 98/57 (ЕU, 1998) и Правилник (2009). Из кртола прикупљених током истраживања са симптомима мрке трулежи рађене су изолације на уобичајене и селективне хранљиве подлоге и добијен велик број изолата бактерија. Детекција и идентификација изолата је извршена испитивањем фенотипских карактеристика (морфолошке, одгајивачке, биохемијско-физиолошке и патогене одлике на биљци домаћину и разним тест биљкама) и потврђена савременим, молекуларним методама (PCR) и имунофлуоресценцијом IF. На основу одређених диференцијалних, патогених и биохемијско-физиолошких одлика, утврђена је припадност изолата расама и биоварима. Резултати ових испитивања су показали да је кромпир у локалитету Српски Милетић (Lady Claire), заражен бактеријом R. solanacearum, раса 3, биовар 2. Кључне речи: R. solanacearum, проузроковач бактериозне увелости и мрке трулежи кромпира, карантинска бактерија. 5

САДРЖАЈ 1.УВОД 10 2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 13 2.1. РАСПРОСТРАЊЕНОСТ ПАТОГЕНА И ЕКОНОМСКИ ЗНАЧАЈ 13 2.2. R. solanacearum БАКТЕРИЈСКИ КОМПЛЕКС 20 2.3. ДЕТЕКЦИЈА И ИДЕНТИФИКАЦИЈА БАКТЕРИЈЕ 23 2.4. ТАКСОНОМСКЕ И БАКТЕРИОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ 29 2.5. ЕПИДЕМИОЛОШКО-ЕКОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ 30 2.6. СИМПТОМИ ОБОЉЕЊА 32 2.7. КОНТРОЛА И СУЗБИЈАЊЕ 34 3. ЦИЉЕВИ И ЗАДАТАК РАДА 36 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА 37 4.1. САКУПЉАЊЕ УЗОРАКА 37 4.2. ИЗОЛАЦИЈА ПАТОГЕНА 38 4.3. ПАТОГЕНОСТ 40 4.3.1. Инокулација кртола кромпира 41 4.3.2. Провера патогености на биљакама 41 4.3.3. Инокулација стабла кромпира 42 4.3.4. Инокулација стабла парадајза 42 4.3.5. Инокулација стаблаплавог патлиџана 42 4.3.6. Инокулација стабла мушкатле 43 4.3.7. Провера патогености на одвојеним листовима биљака из фамилије Solanaceae 43 6

4.3.8. Реизолација патогена из парадајза и мушкатле 43 4.3.9. Хиперсензитивна реакција (Hypersensitivity Reaction-HR) на Листовима дувана (сорта Samsun) 44 4.4. МОРФОЛОШКЕ ОДЛИКЕ 44 4.5. ОДГАЈИВАЧКЕ ОДЛИКЕ 45 4.6. БИОХЕМИЈСКО-ФИЗИОЛОШКЕ ОДЛИКЕ 45 4.6.1. Оксидативно-ферментативни метаболизам глукозе 45 4.6.2. Стварање оксидазе 46 4.6.3. Активност каталазе 46 4.6.4. Активност аргинин дехидролазе 46 4.6.5. Стварање индола 47 4.6.6. Стварање Н2Ѕ из пептона 47 4.6.7. Редукција нитрата 47 4.6.8. Хидролиза скроба 47 4.6.9. Детекција гранула poli-β-hidroksibutirata (PHB) 48 4.7. ОДРЕЂИВАЊЕ БИОВАРА 48 4.8. СЕРОЛОШКЕМЕТОДЕ ИДЕНТИФИКАЦИЈЕ(IF test) 49 4.9. МОЛЕКУЛАРНЕ МЕТОДЕ ИДЕНТИФИКАЦИЈЕ 50 4.9.1. Идентификација изолованих сојева PCR методом 50 4.9.1.1. Екстракција ДНК 50 4.9.1.2. Припрема прајмера и PCR смеше 51 4.9.1.2. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) анализа 52 4.9.1.3. PCR специфични протокол за одређивање биовара R. solanacearum 53 4.9.1.4. Хоризонтална електрофореза 55 5. РЕЗУЛТАТИ 56 5.1. СИМПТОМИ 56 5.2. ИЗОЛАЦИЈА ПАТОГЕНА 58 5.3. ПАТОГЕНОСТ 60 7

5.3.1. Инокулација кртола кромпира 60 5.3.2. Провера патогености на биљакама 63 5.3.3. Инокулација стабла кромпира 63 5.3.4. Инокулација стабла парадајза. 66 5.3.5. Инокулација стаблаплавог патлиџана 71 5.3.6. Инокулација стабла мушкатле 72 5.3.7. Провера патогености на одвојеним листовима биљака из фамилије Solanaceae 74 5.3.8. Реизолација патогена из парадајза и мушкатле 76 5.3.9. Хиперсензитивна реакција (Hypersensitivity Reaction-HR) на Листовима дувана (сорта Samsun) 76 5.4. МОРФОЛОШКЕ ОДЛИКЕ 76 5.5. ОДГАЈИВАЧКЕ ОДЛИКЕ 77 5.6. БИОХЕМИЈСКО-ФИЗИОЛОШКЕ ОДЛИКЕ 79 5.6.1. Оксидативно-ферментативни метаболизам глукозе 79 5.6.2. Стварање оксидазе 80 5.6.3. Активност каталазе 81 5.6.4. Активност аргинин дехидролазе 82 5.6.5. Стварање индола 82 5.6.6. Стварање Н2Ѕ из пептона 82 5.6.7. Редукција нитрата 82 5.6.8. Хидролиза скроба 83 5.6.9. Детекција гранула poli-β-hidroksibutirata (PHB) 85 5.7. ОДРЕЂИВАЊЕ БИОВАРА 85 5.8. СЕРОЛОШКЕ МЕТОДЕ ИДЕНТИФИКАЦИЈЕ(IF test) 87 5.8.1. Резултати IF теста 87 5.9. МОЛЕКУЛАРНЕ МЕТОДЕ ИДЕНТИФИКАЦИЈЕ 88 5.9.1. PCR тест са специфичним прајмерима Ps-1/Ps-2 88 8

6. ДИСКУСИЈА 91 7. ЗАКЉУЧАК 101 8. ЛИТЕРАТУРА 103 9. ПРИЛОЗИ 114 9

1. УВОД Кромпир (Solanum tuberosum L.) припада породици Solanaceae, роду Solanum. Пoреклом је из западних делова Јужне Америке, где се гаји од најдавнијих времена. У Европу је унет око 1580. године. У XVII и XVIII веку се почео ширити у Средњој Европи. У наше крајеве кромпир је прво доспео у Банат и Бачку, где су га 1759. донели досељени Немци (Лазић и сар., 1998). У Србији се кромпир гаји на око 100. 000 ха (Рекановић и сар., 2012) и једна је од најзначајнијих гајених биљака код нас.у структури површина под поврћем 2011. кромпир доминира са 32%. Принос кромпира последњих година показује благи тренд раста (2011/2012. 11,6 т/ха), али је ипак за око 45% мањи од оствареног европског просека. За то постоји више разлога, а један од њих су и бројни паразити. Према Милошевићу (1998) од свих гајених биљака у свету, највеће губитке проузроковане болестима трпи кромпир. Губици у приносу се процењују на око 21,8%. Болести кромпира значајно смањују принос како током вегетације, тако и после вађења кртола, током чувања у складишту. На успех производње кромпира значајно утичу разни проузроковачи болести као и правовремена примена одговарајућих мера заштите. На кромпиру се редовно сваке године поједина обољења јављају у мањој или већој мери. Временске прилике током вегетације имају велики утицај на интензитет појаве биљних патогена (Марић и сар., 10

2001). Обољења могу бити изазвана фитопатогеним гљивама, бактеријама и вирусима, а поред тога кромпир је редовно подложан нападу разних инсекатских врста. У циљу заштите од свих штетних организама потребно је познавање начина њиховог одржавања и услова за појаву одређених организама, биологије, начина преношења, познавање услова за остваривање инфекције и развој, као и симпитома и оштећења које проузрокују на биљкама (Мијатовић и сар., 2007). На кромпиру је описано неколико економски значајних фитопатогених бактерија. Посебно су значајне на садном материјалу, због чега некe од њих спадају међу најзначајније карантинске паразите. У производним условима уколико је време кишовито и температуре ниске, бактериозе проузрокују умањење приноса, а понекад доводе и до потпуног пропадања усева. Значајне штете настају и током складиштења када може доћи и до потпуног пропадања кртола. Фитопатогене бактерије се у складишту преносе са заражених на здраве кртоле и доводе до њиховог пропадања. Нарочиту опасност представљају кртоле са латентном заразом, јер се због одсуства симптома бактерије могу неометано ширити у складишту. У европским земљама, у подручјима умерено континенталне климе највећи значај имају карантинске бактерије Ralstonia solanacearum (Smith, 1896; Yabuuchi et al., 1996), проузроковач бактериозне увелости и мрке трулежи кромпира и Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spiek. и Kotth., 1914; Davis, et al., 1984), проузроковач прстенасте трулежи (Smith et al., 1988; Aрсенијевић, 1988; Aрсенијевић, 1997; Koike et al., 2007; Бaлаж и сар., 2010). Осим наведених карантинских бактерија на кромпиру се редовно јавља и неколико економски значајних бактерија као што су Pectobacterium carotovorum subsp. сarotovorum (Jones, 1901; Hauben et al., 1999; emend. Gordon et al., 2003), проузроковач бактериозне влажне трулежи, Pectobacterium carotovorum subsp atrosepticum(van Hall 1902; Hauben et al., 1999), проузроковач црне трулежи приземног дела стабла и влажне трулежи кртола кромпира и Dickeya chrysanthemi (Burkholder et al., 1953; Samson et al. 2005), проузроковач бактериозне кржљавости, влажне трулежи и увелости биљака (Aрсенијевић, 1988; Aрсенијевић, 1997; Smith et al., 2008; Бaлаж и сар., 2010). Смањење тржишне вредности кромпира, без већег утицаја на принос може 11

настати и услед присуства обичне краставости кромпира. Проузроковач ове болести је Streptomyces scabiei (ex Thaxter 1981; Lambert and Loria 1989). Балаж и сар.(2010) наводе да се појава бактерије R. solanacearum може очекивати и у Србији, јер је присутна у више европских земаља из којих се увози семенски материјал кромпира. У складу са овим наводима у западној Србији је у јесен 2010. по први пут константована појава ове карантинске бактеријена семенском усеву кромпира. Узимајући у обзир да је R. solanacearum једна од економски најштетнијих патогена кромпира и да је тек од пре 4-5 година ова бактерија присутна у нашој земљи, постоји висок ризик од њеног даљег ширења. R. solanacearum се налази на EPPO А2 карантинској листи штетних организама (Commission Directive 2006/63/CE), док се у Србији налази на А1 листи карантинских штеточина, јер је још увек присутна само на ограниченом простору и под ерадикацијом (Правилнико мерама откривања, спречавања ширења и сузбијања штетног oрганизма R. solanacearum ;"Сл. гласник РС", br. 107/2009). У циљу локализације и спречавања ширења ове бактерије, потребно је познавати симптоматологију и овладати методама за брзу и поуздану идентификацију бактерије како би се благовремено спречило ширење ове најзначајније бактериозе кромпира. 12

2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2.1. РАСПРОСТРАЊЕНОСТ ПАТОГЕНА И ЕКОНОМСКИ ЗНАЧАЈ R. solanacearum представља једну од најштетнијих фитопатогених бактерија (Grover, 2006). Сматра се карантинском врстом од стране многих водећих међународних организација као што су: APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service), NAPPO (North American Plant Protection Organization), EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organisation), APPPC (Asia and Pacific Plant Protection Commission) и IAPSC (Inter-African Phytosanitary Council). Термофилна је врста, због чега је углавном распрострањена у тропским, суптропским и умерено топлим подручјима широм света (Hayward, 1991; Swanson et al., 2005) (Табела 1). Према доступним информацијама R. solanacearum је присутна на свим континентима (изузев Антарктика) у мањој или већој мери (CABI-Centre for Agriculture and Biosciences International, 2015) (Слика 1). 13

Слика 1. Дистрибуција R. ѕolanacearum у свету (Извор: CABI, 2015.) Присутна, нема више детаља Распрострањена Локализована Повремено појављивање у неколико извештаја На северноамеричком континенту R. solanacearum раса 1 је распрострањена у САД-у, jeр je ендемски паразит у јужном делу државе. Раса 3 биовар 2 у Северној Америци се налази на карантинској листи USDA-APHIS (US Agricultural Bioterrorism Protection Act of 2002), означена је као Select Agents (United States Department of Agriculture, 2005). У САД је интродукованатоком 1999. и 2000. године преко резница мушкатле које су биле пореклом из Кеније и Гватемале (Norman et al., 1999; Kim et al., 2002; Williamson et al., 2002). У Мексику ова бактерија је ограничене дистрибуције.у Јужној Америци, присутна је у скоро свим државама, осим у Чилеу, Еквадору и Парагвају где је локализована.у Африци је распрострањена у државама Мали, Малави и Камеруну, док је у Зимбабвеу и Јужноафричкој Републици ограничене дистрибуције. На азијском континенту је присутна у већини држава, распрострањена је у Бангладешу, Индији, Малезији и Тајвану, а локализована у Јапану и Шри Ланци (CABI, 2015). 14

Табела 1. Географска дистрибуција R. ѕolanacearumраса 3 биовар 2 Континент Статус патогена Држава Aзија Eвропа Aфрика Северна Америка Централна Америка Јужна Америка Најприсутнија са ограниченом дистрибуцијом Присутна, прва интродукција на Кипар; искорењена из Шведске Најприсутнија Искорењена Најприсутнија Најприсутнија Кина, Индија, Индонезија, Иран, Шри Ланка, Филипини, Непал, Пакистан Белгија, Француска, Немачка, Мађарска, Холандија, Русија, Словенија, Словачка, Велика Британија Египат, Кенија, Либија, Јужноафричка Република Мексико Костарика, Гвадалупе Аргентина, Боливија, Бразил, Чиле, Колумбија, Перу, Уругвај, Венецуела Oкеанија Најприсутнија Аустралија, Папуа Нова Гвинеја У Европској Унији је законом прописана контрола и искорењивање R. solanacearum (Commission Directive 2006/63/CE). Према EPPO (1998) сматра се карантинским организмом и налази се на А2 листи штеточина. У Европи бактерија R. solanacearum раса 3 се појавила 1990-тих година. Према Janse et al. (2004) интродукована је на исти начин као и у САД, преко резница мушкатли увезених из Кеније. Раса 3 ове бактерије је најзначајнија за поменути регион, јер је то раса која се адаптирала на ниже температуре и појављује се у вишим подручјима тропских региона и у Медитеранском подручју (Grousset et al., 1998; Hayward et al., 1998; Stefani et al., 2005). Такође, постоји опасност да и раса 1 може бити интродукована у Европу преко 15

украсних биљака које паразитира (EPPO, 2004). Према CABI (2015), R. solanacearum је ограничене дистрибуције у Холандији и Русији, присутна је у Португалу, Србији, Украјини; неколико пута се појавила у Аустрији, Белгији, Француској, Немачкој, Грчкој, Мађарској, Румунији, Словачкој, Словенији и Шведској; док је одсутна у Бугарској, Финској, Малти и Шпанији (Слика 2). Слика 2. Дистрибуција R. solanacearumу Европи (Извор: CABI, 2015.) Присутна, нема више детаља Распрострањена Локализована Повремено појављивање у неколико извештаја Од земаља бивше Југославије ова карантинска бактерија је прво детектована у Словенији током 2000. године (EPPO, 2001). Поменуте године је приликом узорковања домаћег и увозног кромпира један узорак показивао присуство бактерије R. solanacearum са латентном инфекцијом. У питању је кромпир из домаће производње пронађен у магацину у северном делу Словеније, али је семе пореклом из иностранства. У Хрватској је током 2003. године спроведено детаљно истраживање на присуство бактерије R. solanacearum, али су сви резултати су били негативни (EPPO,2004). Према Јелковић и сар. (2011) у Хрватској није утврђено присуство ове бактерије и она се налази на А1 листи карантинских патогена. У Бих је на узорцима 16

младог меркантилног кромпира пореклом из Египта (11.05.2011.) утврђено је присуство R. solanacearum. На основу лабораторијског извештаја Пољопривредног института Р. Српске, Бања Лука, Федерална управа за инспекцијске послове је целокупну пошиљку ставила под контролу и одредила мере забране промета на територији БиХ. Током 2011-2013. споведен је посебан надзор над најзначајнијим карантинским штетним организмима на кромпиру који се узгаја у БиХ и том приликом није утврђено њихово присуство. За остале државе бивше Југославије (Црна Гора и Македонија), нема релевантних литературних података о присуствуове карантинске бактерије. Према CABI (2015) R. solanacearum раса 3 биовар 2 је присутна у Србији. Милијашевић и сар. (2013) наводе детаљне резултате о појави и методама идентификације R. solanacearum у Војводини. Такође, према истраживању Милијашевић и сар. (2013а), патоген је детектован и идентификован 2012. у једној пошиљци младог меркантилног кромпира који је био пореклом из Египта, а увезен је из Грчке. Исти аутори наводе да је током 2013. присуство бактерије потврђено у једном узорку са симптомима некрозе пореклом из Словачке. Највећи економски губици изазвани бактериозним увенућем проузрокованим бактеријом R. solanacearum су забележени на кромпиру, парадајзу, дувану, бананама, кикирикију и ђумбиру. Губици зависе од локалних климатских услова, типа земљишта, агротехничких мера, избора сорте и вирулентности бактерије. У земљама где је патоген описан као карантински губици су мањи (EU, 1998; 2006). Осим што директно изазива смањење приноса, бактерију R. ѕolanacearum је веома тешко контролисати и спречавати њено ширење, јер су превенција и искорењивње веома скупи. Према Еlphinstone (2005) глобална штета услед појаве болести износи 950 милиона долара годишње, а инфицирани усеви се простиру на 3.75 милиона хектара у 80 земаља. Сечењем кртола кромпира за садњу ризик од настанка болести се повећава за 250%, а на тај начин и смањење приноса за око 40% (Vijayakumar et al., 1985). У Холаднији су током 1999. године забележени губици преко 4 милиона евра на 50 парцела кромпира (Elphinstone, 2001). У Боливији губитак у приносу кромпира се креће од 30 до 90%, а губици приликом складиштења и до 98% (Coelho и Nutter, 2005). Према Еlphinstone 17

(2005) извештаји из Бангладеша показују да је преко 30% усева кромпира заражено овом карантинском бактеријом, док је губитак у приносу око 14%. У Непалу трулеж кртола захвата око 10 до максималних 50% кртола. Губици на њивама на малим непалским фармама процењују се на 100% у случајевима лоше пољопривредне праксе и коришћења заражених кртола за садњу (Еlphinstone, 2005). Grover et al. (2012) наводе да губици у приносу у Индији достижу и до 75% на појединим фармама. У Индији пропадање на зараженим биљкама парадајза се креће од 10-100%, а губитак у приносу и до 91% (Еlphinstone, 2005). Према анкетама у Уганди на 88% фарми су пронађене заражене биљке парадајза (Katafiire et al., 2005). На Филипинима у периоду од 1966-1968. штете на парадајзу су биле 15% (Smith et al., 2008). Појава бактерије на украсним биљкама је изазвала велику забринутост у цвећарској производњи, нарочито за оне који се баве производњом мушкатли (Daughtrey, 2003; Kim et al., 2002; Williamson et al., 2002; Kim, 2002). У складу са наведеним размерама штете коју причињава ова бактерија и због могућности њеног ширења у незаражена подручја, неопходно је спроводити мере ерадикације на површинама на којима је ова бактерија детектована и идентификована. У раним 1970-им, ова бактерија је утврђена у неколико области под кромпирому Израелу, али је успешно искорењена. У току 1993. је спроведено детаљно истраживање широм земље и није пронађен ниједан заражени узорак (EU, 1999; Hong, 2005). Према литературним наводима Janse (2006) успешна ерадикација је спроведена у Шведској у периоду од 1972/1977. Бактерија је пронађена на узорцима кромпира у јужним деловима Шведске на наводњаваним површинама. Даљим истраживањем утврђено је да је зараза потекла из коровске врсте Solanum dulcamara који је растао у каналима за наводњавање. Коров је уклоњен механичким и хемијским путем из 30 км канала. Након поновљених анализа бактерија није утврђена. Сличне методе ерадикације извршене су и у Белгији, Енгледкој, Француској, Немачкој, Италији, Холандији и Португалу (након појаве болести 1989, 1992, 1995 и 1996) (Sletten, 1998). 18

У САД-у је током 2003-2004. године спроведено искорењивање бактерије R. ѕolanacearum која се појавила на мушкатлама у расадницима. Ерадикација је коштала око 10 милиона долара (Swanson et al., 2007). Тада су креиране стратегије за борбу против овог патогена, које подразумевају додатне анализе, прописано руковање сумњивим узорцима и додатну обуку произвођача, а резнице мушкатле морају бити означене бар кодом. У Европи је бактерија у процесу искорењавања где год се појавила. Извор зараза је углавном контаминирана вода за наводњавање (Elphinstone, 1996). Успешна ерадикација према наводима EPPO (2015) спроведена је у Аустрији, док се у Пољској, Француској и Великој Британији још увек спроводи (САВI, 2015). У Србији је током марта 2011. након појаве карантинске бактерије R. solanacearum донета наредба о одређивању граница зараженог и угроженог подручја штетним организмом и мерама које се предузимају у случају његове појаве ( Службени гласник РС, 32/2010). Ради спречавања ширења, сузбијања и ерадикације на подручју зараженом штетним организмом, предузете су следеће мере: за време од најмање четири вегетационе сезоне после године у којој је потврђена зараза уклањане су самоникле биљке кромпира и парадајза, као и друге самоникле биљке домаћини штетног организма, укључујући и корове из породице Solanaceae; забрањена је садња кртола или биљака кромпира, као и сетва семена кромпира у ботаничком смислу; садња биљака парадајза и сетва семена парадајза, као и сетва других биљака домаћина (врста из рода Brassica) за које је утврђено да омогућавају преживљавање штетног организма и биљака за које је утврђено да омогућавају његово ширење. На осталим површинама унутар места производње које је означено као заражено, у вегетационој сезони која следи после године у којој је потврђена зараза, такође је забрањена садња кртола и биљака кромпира и сетва и садња других биљака домаћина штетног организма. Најмање три вегетационе године спроводило се уклањање самониклих биљака главног домаћина и других биљака домаћина штетног организма, вршен је преглед усева током производње у одговарајућим временским периодима, преглед свих поља на којима се гаји кромпир, као и лабораторијско испитивање извађених биљака и кртола са сваког поља. 19

2.2. R. solanacearum БАКТЕРИЈСКИ КОМПЛЕКС R. solanacearum се сматра бактеријским комплексом ( species complex ) због велике генетичке варијације између изолата ове бактерије. Gillings и Fahy (1994) су први почели да користе термин species complex. У протекле четири деценије коришћена су два различита система за разликовање изолата, односно подела бактеријске популиције на расе и биоваре. R. ѕolanacearum паразитира више од 450 биљних врста груписаних у 54 фамилије (Wicker et al., 2007). Према домаћинима које паразитира, ова бактерија је подељена у 5 раса (Buddenhagen et al., 1964; Hayward 1991). За расу 1 карактеристичан је највећи број домаћина. Од врста из фамилије Solanaceae R. ѕolanacearum паразитира бибер, плави патлиџан, кромпир, дуван и парадајз. Од врста које не припадају фамилији Solanaceae паразитира: пасуљ, кикирики и сунцокрет; украсне биљне врсте из родова Anthurium, Dahlia, Heliconia, Hibiscus, Lesianthus, Lilium, Pothos, Strelitzia, Verbena и Zinnia, а од дрвенастих врста еукалиптус. Раса 1 је ендемског порекла из јужних делова САД-а, као и Азије, Африке и Јужне Америке (Patrice et al., 2010). Температурни оптимум ове расе је 35 C, као и код раса 2, 4 и 5. Раса 2 паразитира банане (познато Моко обољење), боквицу, дивље и украсне Heliconia spp. Ова раса се јавља углавном у тропским областима Јужне Америке и на Филипинима. Раса 3 паразитира Capsicum spp., плави патлиџан, мушкатлу, парадајз и кромпир; коровске врсте као што су S. dulcamara и S. nigrum. Температурни оптимум ове расе је 27 C. Ова раса je широко распрострањена у Азији, Африци, Централној и Јужној Америци. Према наводима Patrice et al. (2010) раса 3 води порекло из брдских делова Анда. Раса 4 је специјализована за ђумбир, појављује се у Азији и на Хавјима, а раса 5 за Morus и појављује се само у Кини (Deny, 2006). 20

На основу различитих способности да користи и оксидира неколико дисахарида (целобиозу, лактозу и малтозу) и хексозних алкохола (дулцитол, манитол и сорбитол) бактерија R. solanacearum се дели на 5 биовара (Hayward, 1964) (Табела 2). Биовар 1 метаболише само декстрозу од наведених дисахарида и алкохола; биовар 2 метаболише само дисахариде; биовар 3 метаболише све наведене дисахариде и алкохоле; биовар 4 метаболише само хексозне алкохоле, док биовар 5 метаболише све осим дулцитола и сорбитола (Hayward, 1964). Исти аутор 1994. године наводи да је откривена нова група изолата из Амазона која је различита од биовара 2, јер метаболишу рибозу и трехалозу. Нова група названа је 2-Т или N2 биовар, а оригинални биовар 2 назван је 2-А. Осим биовара 2-А, коме одговара раса 3 и биовара 5 коме одговара раса 5, не постоји корелација између биовара и раса. Табела 2. Подела R. solanacearum на биоваре (Hayward, 1964) БИОВАР Метаболише: I II III IV V Малтоза - + + - + Лактоза - + + - + Целобиоза - + + - + Манитол - - + + + Сорбитол - - + + - Дулцитол - - + + - Најновији филогенетски систем класификацијекоји се састоји од четири филотипа заснован је на основу филогенетске анализе RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), секвенце 16Ѕ-26Ѕ и анализе секвенце ендонуклеаза тзв. еgl гена, 21

hrpb генаи muts гена (Poussier et al., 2000; Allen и Priror, 2005; Priror и Fegan, 2005; Janse 2005). Janse (2005) приказује специфичну разноликост R. solanacearum засновану на RFLP анализи (Табела 3). Tабела 3. Специфична разноликостr. solanacearum: заснована на RFLP анализи (Janse, 2005) Раса Биолошки RFLP шаблон Спектар Распрострањеност варијетети домаћина 1 1 1-7 Широк Jужна Aмерика, САД 1 3 8-14 Широк Aзија, Aмерика, Aустралија, Кина и неки делови САД 1 4 11,15,18,21-23 Широк Jугоисточна Aзија, Kина, Aустралијаи неки делови САД 1 5 19,20 Morus alba Kина 2 1 24,25 Musa sp., Heliconia Jужнаи Филипини ЦентралнаAмерика, 3 2A 26 A, Б Ограничен На свим континентима 3 2A 27 A, Б, Ц Ограничен Чиле, Колумбија Између 1 и 3 2T (2Н) 29-33 Ограничен Бразил, Перу На основу анализе секвенце одређена су 4 филотипа који су у корелацији са географском пореклом изолата, и то: филотип I обухвата изолате из Азије; филотип II 22

из Америке; филотип III из Aфрике и околних острва Индијског океана и филотип IV из Индонезије (Слика 3). Сваки филотип се дели на секвеваре, који су дефинисани као изолати са мање од 1% нуклеотидне варијације еgl (ендоглуканазе) у локусу. Систем филотипова је стабилна и филогенетски значајна класификациона шема која репрезентује еволутивне линије између изолата у бактеријском комплексу. Слика 3. Филотипови бактерије R. solanacearum(priror and Fegan, 2005) 2.3. ДЕТЕКЦИЈА И ИДЕНТИФИКАЦИЈА БАКТЕРИЈЕ Због специфичности и великог економског значаја, детекција и идентификација R. ѕolanacearum се врши по строго утврђеним правилима које регулише Директива 98/57 (ЕU,1998). У нашој земљи je за детекцију и идентификацију ове бактерије Министарство пољопривреде Правилником о мерама откривања, спречавања ширења и сузбијања штетног oрганизма R. ѕolanacearum (Smith) Yabbuchi et al. проузроковача 23

мрке трулежи кртола кромпира и бактеријског увенућа кромпира и парадајза, начину одређивања граница зараженог, угроженог и подручја без штетног организма, условима за окончање наложених мера, као и начину обавештавања о предузетим мерама и престанак мера ("Сл. гласник РС", br. 107/2009), тачно регулисало поступак тестирања за утврђивање присуства бактерије на биљкама кромпира и парадајза, као и кртола кромпира са типичним симптомима. За наше услове где се реално очекује присуство ове бактерије само на кромпиру и парадајзу поступак детекције подразумева визуелни преглед биљака кромпира у пољу, преглед кртола кромпира у складиштима и дистрибутивним центрима намењеног за продају и прераду, преглед семенског кромпира, расада парадајза, других биљака домаћина и површинских вода. Сумња на појаву штетног организма постоји, ако су при визуелном прегледу уочени типични симптоми или ако је резултат једног од брзих тестова позитиван. У Правилнику (2009) се налазе шеме задетекцију и идентификацију R. ѕolanacearum у води и земљишту, као и шема за утврђивање присуства проузроковача мрке трулежи кртола и бактеријског увенућа (R. solanacearum) у кртолама и биљкама кромпира, парадајза или другим биљкама домаћинима са симптомима мрке трулежи или бактеријског увенућа (Слика 4), шема за утврђивање присуства и идентификацију R. ѕolanacearum у узорцима кртола кромпира без видљивих симптома (Слика 5) и шема за утврђивање присуства и идентификацију R. ѕolanacearum у узорцима биљака кромпира, парадајза или других биљака без симптома (Слика6). 24

Слика 4. Шема утврђивања присуства проузроковача мрке трулежи кртола и бактеријског увенућа (R. solanacearum) у кртолама и биљкама кромпира, парадајза или другим биљкама домаћинима са симптомима мрке трулежи или бактеријског увенућа 25

Слика 5. Шема за утврђивање присустваи идентификацију R. ѕolanacearumу узорцима кртола кромпира без видљивих симптома 26

Слика 6. Шема за утврђивање присуства и идентификацију R. ѕolanacearumу узорцима биљака кромпира, парадајза или других биљака без симптома Ток анализе подразумева: сакупљање узорака кртола кромпира или биљака кромпира, парадајза или других домаћина, спровођење брзих дијагностичких тестова (истицање бактеријског ексудата, детекција PHB гранула, IF, FISH, ELISA, и PCR тест), изолацију патогена на хранљиве подлоге, молекуларне тестове идентификације и тестове патогености. 27

Традиционалне методе дијагнозе мрке трулежи кртола кромпира и бактеријског увенућа заснивају се на изолацији бактерије на стандардне бактериолошке подлоге као што су: хранљиви агар (Nutrent Аgar-NA), агар са квасцем, пептоном и глукозом (Yeast Peptone Glucose Agar-YPGA) (Lelliot и Stead, 1987), агар са сахарозом и пептоном (Sucrose Peptone Agar-SPA) (Schaad, 1980), Kelmanova тетразолијум-подлога (Triphenyl Тetrazolium Chloride-TТC) (Kelman, 1957) или селективну подлогу ЅМЅА (Semiselective Medium, South Africa) (Elphinstone et al., 1996). Даља идентификација изолата бактерије R. ѕolanacearum се врши на основу биохемијско-физиолошких и патогених одлика (Schaad et al., 2001). Најважније разлике на основу којих је могуће извршити диференцијацију R. ѕolanacearum комплекса, испољавају се у способности коришћења неколико дисахарида на основу чега су подељене у биоваре, као што је већ наведено (Hayward, 1964). Друге методе које се тренутно користе за детекцију и идентификацију R. solanacearum укључују неколико серолошких метода као што су: имунофлоресценција (immunoflourescence-if), имуноензимска метода на плочи (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-ELISA) (Chun,1982; Kaneshiro и Alvarez, 2001; Alvarez et al., 2005; Kaneshiro et al., 2006), као и молекуларне методе засноване на хибридизацији нуклеинских киселина или ланчаној реакцији полимеразе (Рolymerase Сhain Reaction- PCR) (Dreier et al., 1995; Dreier et al., 1997; Santos et al., 1997; Louws et al., 1998; Bach et al., 2003). Све ове методе имају своје предности и недостатке. Класичне бактериолошке методе захтевају доста рада, материјала и времена. Развој бактерија могу инхибирати други микроорганизми чак и на селективним подлогама, нпр. сапрофитне бактерије које се развијају знатно брже (Alvarez et al., 2005). Са друге стране, изолација и провера патогености изолованих сојева су главни тестови за потврду дијагнозе болести. Серолошке методе такође имају позитивна и негативна својства. Позитивна страна је свакако у добијању брзих резултата великог броја узорака, али у случају коришћења поликлоналних антитела постоји и могућност укрштених реакција са другим врстама бактерија (Hampton, 1990). 28

Нове молекуларне технике као што су PCR омогућавају специфичну и осетљиву детекцију, међутим, ове процедуре су скупе, захтевају специфичну опрему и специјално обучено особље (de Leon et al., 2006). Према Seal et al. (1993) за PCR тестoве коришћени су олигонуклеотидни прајмери за умножавање региона 16S rdna. Међутим, касније је откривено да ови прајмери нису довољно поуздани за детекцију R. solanacearum у кромпиру, јер кромпир поседује полисахариде и фенолна једињења који инхибирају Taq полимеразу (Pastrik и Maiss, 2000; Poussier et al., 2005). Према стандардним протоколима EPPO (2004) за PCR тест користи се процедура према Pastrik и Maiss (2000), која подразумева коришћење PS-1/PS-2 прајмера за умножавање 16Ѕ RNK региона. Велика разноликост сојева фитопатогених бактерија генерално отежава развој поузданих метода за детекцију и идентификацију патогена. Најбоља комбинација подразумева изолацију патогена на одговарајуће селективне подлоге и доказивање патогености, а потом потврда резултата коришћењем серолошких или молекуларних метода (Балаж и Делибашић, 2005). 2.4. ТАКСОНОМСКЕ И БАКТЕРИОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ R.solanacearum припада разделу Proteobacteria, класи Betaproteobacteria, реду Burkholderiales, фамилији Burkholderiaceae и роду Ralstonia (Garrity et al., 2004). Име бактерије и њена таксономска припадност су се у прошлости више пута мењали. Проузроковач бактериозне увелости и мрке трулежи кромпира први пут је описан од стране Е. F. Smith 1896. на кромпиру, парадајзу и плавом патлиџану, а 1908. на дувану, кao Bacillus solanacearum и сврстан у род Bacillus (Аlvarez et al., 2010). Касније је ова бактерија увршћена у род Bacetrium, а затим у род Pseudomonas под именом P. ѕolanacearum. Након тога је привремено класификован у родове Phytomonas и Xanthomonas, а касније поново враћен у род Pseudomonas 1948. Године (Kelman, 1953). 29

Током 1992. Укључен је у род Burkholderia (Yabuuchi et al., 1992), међутим 1995. на основу филогенетске и фенотипске анализе ова бактерија је сврстана у новоформирани род Ralstonia. Од тада ова бактерија носи назив R. ѕolanacearum (Аlvarez et al., 2010). Бактерија је штапићастог облика, грамнегативна, са једном поларном цилијом (Martin и French, 1985). Припада групи нефлуоресцентних, аеробних бактерија. Величина бактерије се креће између 0,5-0,7 х 1,5-2,0. R. ѕolanacearum, не ствара споре и не образује капсуле (Оlson, 2005). Редукује нитрате, ствара Н2Ѕ и амонијак, не хидролизује желатин и скроб, а из већег броја угљених хидрата ствара киселину. Реакције у млеку нису конзистентне. Оптимална температура за раст бактерије се креће између 28 и 32 С у аеробним условима (Schaad et al., 2001). 2.5. ЕПИДЕМИОЛОШКО-ЕКОЛОШКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ Болест се најчешће преноси слабије зараженим кртолама или латантним инфекцијама (Graham et al., 1979; Swanson et al., 2005). Патоген може бити лоциран само у зони окаца, а да се при томе симптоми на кртолама не уочавају. У ширењу заразе значајну улогу има и инфицирано семе, а као преносиоци заразе највећу улогу имају кишне капи и инсекти, међу којима нарочит значај има кромпирова златица (Leptinotarsa decemlineata) Say. (Wale, 2008) и нематоде (Нussain и Bora, 2009; Singh и Siddiqui, 2012; Siddiqui et al.,2013). Ширење паразита може бити и преко контаминираног земљишта у којем бактерија може да задржи виталност и преко годину дана (Graham и Lloyd, 1979; van Elsas et al., 2000), као и путем контаминиране воде која се користи за заливање биљака (Janse, 2005; Alvarez et al., 2010). Према истраживању Milling et al. (2009) R. ѕolanacearum може да преживи у стерилној лабораторијској води неколико година. 30

Осим садног материјала и семена, бактерија се може одржати и у зараженим биљним остацима и на неким коровским врстама. S. dulcamara се наводи као један од корова на чијем корену ова карантинска бактерија може преживети (Elphinstone et al.,1998; Wenneker et al., 1999). Јаnse et al. (2004) наводи бројне коровеиз породице Solanaceae на којима R.ѕolanacearum преживљава: Datura stramonium, S. carolinense, S. cinereum, S. nigrum, као и неке корове који не припадају породици Solanaceae: Brassica rapa, Chenopodium spp., Phaseolus vulgaris, Portulaca oleracea. Поред ових корова Mulder и Turkensteen (2005) наводе да и Galinsoga parviflora и Ranunculus scleratus могу да буду домаћини ове бактерије. Ипак најзначајнији начин ширења се остварује зараженим семенским кртолама са латентним инфекцијама. Садњом таквих кртола у повољним условима болест прогресивно напредује, јер се са заражених биљака бактерија преко столона преноси до нових кртола. Патоген се одржава и у складишту кромпира, а сама инфекција се остварује преко повреда перидерма, контаминацијом заражених транспортних средстава, преко зараженог ножа за сечење кртола и сл. (Милошевић, 2009). Према истраживању Ciampi et al. (1981) бактерија може да преживи у складишту у кртолама кромпира на 4 C и до 40 дана. Најчешће бактерија доспева у биљке преко поверда корена, стабла или преко стома. Бактерија се у инфицираној биљци креће васкуларним путем. Овај процес је бржи на вишим температурама. Ширење бактерије такође зависи од дела биљке који је заражен. Према истражвању Ono et al. (1984) бактерија се брже креће у лисним дршкама дувана него у корену. Ширење паразита кроз биљку праћено је колонизацијом ксилема (Xiao et al., 1983) и адхезијом бакетријских ћелија за зидове спроводних судова и продирањем у ћелије мезофила (Petrolini et al., 1986). Блокирање васкуларних судова је један од главних разлога увенућа биљака. Ширењу паразита одговара топло и влажно време. Оптимална влажност земљишта за развој патогена је између -0,5 bar и -1 bar, док су вредности од -5 до -15 bar неповољне (Nesmith и Jenkins, 1985). Оптимална температура за развој патогена (расе 1, 2, 4 и 5) је између 34 и 37 C, а минимална 10 C (Swanepol, 1990). Болест се јавља на различитим типовима земљишта, а њеном развоју доприноси слаба дренажа. 31

2.6. СИМПТОМИ ОБОЉЕЊА Симптоми се на кромпиру у пољу испољавају у виду увелости, заостајању биљака у порасту и жућењу лишћа. Ови симптоми се могу појавити у свим фазама развоја биљака (Hooker, 1981). Нагло вењење лишћа и изумирање целог стабла долази до изржаја када су паразитиране младе биљке. Понекад се на листовима може уочити појава бронзане боје коју прати епинастија лисних дршки (Smith, 1920). Код старијих биљака прво вене најмлађе лишће и то у најтоплијем делу дана. Током ноћи биљке се привремено опорављају, а после извесног времена настаје трајна увелост (Agrios, 2005). Код тако заражених биљака у основи стабла долази до појаве мрке трулежи, а при попречном пресеку стабла уочава се мрка некроза (Gota, 1992). Mulder и Turkensteen (2005), наводе да постоје разлике у времену манифестовања симптома у односу на то одакле је потекла зараза. У случају да је зараза потекла из заражених кртола биљке почињу да вену убрзо након ницања. Ако је до инфекције дошло преко земљишта или воде за наводњавање, увенуће наступа у каснијој фази развоја биљака. Под утицајем болести код јаче заражених биљака не долази до формирања кртола (Милошевић, 2009). До заразе кртола може доћи преко васкуларног система мајке биљке или преко спољашњих извора заразе за време раста, вађења или складиштења (Mulder и Turkensteen 2005). Око судовних ткива у сржном ткиву и кори образују се шупљине испуњене бактеријама, а исти процес се наставља и у корену. Из зараженог стабла судовним ткивима преко столона паразит доспева и у кртоле. На пресеку заражене кртоле спонтано истиче кремаст бактеријски ексудат, а мрка некроза се постепено шири, захватајући околна ткива. Ексудат који истиче из оболелих кртола се суши и слепљује са честицама земље око окаца (Champoiseau et al., 2009). У даљем развоју болести плутасти слој покожице се одваја, такве кртоле насељавају разни секундарни микроорганизми проузрокујући трулеж непријатног мириса. У неким случајевима не долази до испољавања карактеристичних симпитома, таква зараза се означава као латентна. Rodriguse-Neto et al. (1984), наводе појаву нетипичних симптома болести у виду некротичних пега на епидермису које су вероватно изазване као последица инфекције лентицела. 32

Симптоми на парадајзу се испољавају у виду увелости најмлађих листова. У условима који су повољни за патогена (температура земљишта око 25 C; засићеност влагом) у року од неколико дана долази до епинастије и увенућа целе биљке (Alvarez et al., 2010). У мање повољним условима (температура земљишта мања од 21 C) увенуће се ређе појављује, али се на стабљици може развити велики број адвентивних корена. Могуће је уочити пруге које изгледају као натопљене водом и протежу се дуж стабла, од основе, а доказ је некроза спроводног ткива. Ако се стабљика пресече попречно, из спроводних судова чија је боја промењена у мрку, цури бели или жућкасти бактеријски ексудат (МcCarter, 1991). Први симптоми на мушкатлама се јављају у виду увенућа лишћа, док се хлороза јавља касније. Вењењем лишће добија изглед кишобрана. Развојем болести појављује се црнило на стабљици и она постаје некротична. На попречном пресеку уочава се васкуларна некрза спроводних судова. У последњој фази развоја болести цела биљка постаје некротична и изумире (Williamson et al., 2002; Јаnse, 2004; Swanson, 2005). Један од главних симптома на дувану је једнострано вењење и преурањено жућење. Лишће може да вене на једној страни биљке или чак може само један део листа да вене. У тежим случајевима, лишће вене без промене боје и остаје везано за стабљике. Као и код парадајза, васкуларна ткива показују промену боје у мркуна уздужном пресеку. Примарни и секундарни коренови у неким случајевима добијају мрку до црну боју (Echandi, 1991). Моко болест на бананама проузрокована бактеријом R. ѕolanacearum може се лако заменити са симптомима које проузрокује Fusarium oxysporum sp. сubense. На младим биљкама, уочавају се симптоми у виду вењења најмлађих листова. У року од недељу дана целокупно лишће може да увене. На стаблу на попречном пресеку се уочава мрка васкуларна обојеност (Hayward, 1983). Код биљака S. dulcamara и S. nigrum у природним условима се веома ретко уочавају симптоми увенућа, осим ако температура земљишта прелази 25 C или ако је ниво инокулума изузетно висок (нпр. ако S. nigrum расте близу оболеле биљке кромпира или парадајза). Ако дође до увенућа, симптоми су исти као и код парадајза. 33

На биљкама S. dulcamara које расту са стабљикама и корењем у води није видљиво увенуће, али се на попречном пресеку стабљике види мрка боја спроводног ткива. У неким случајевима из пресечене стабљике цури бактеријски ексудат (Правилник, 2009). 2.7. КОНТРОЛА И СУЗБИЈАЊЕ Све чланице ЕPPO организације су преузеле обавезу да ће вршити мониторинг кромпира и парадајза у пољу, меркантилних кртола кромпира, осталих биљака домаћина и воде како би се установило што раније откривање патогена (Weller et al., 2000). Контрола бактериозне увелости и трулежи кртола кромпира није једноставна, посебно уколико се ради о раси 1 која има изразито широк круг домаћина. Постоји неколоко отпорних сорти кромпира, плавог патлиџана, дувана и кикирикија, као и других биљака, али су расе и сојеви овог патогена веома различити што отежава да се ова отпорност искористи у различитим климатским условима (Janѕе, 2005). Отпорне сорте створене су у Колумбији и то укрштањем биљака S. phureja и S. Demissum (Hartman и Elphistone, 1994). Међутим, селекцијски рад на стварању отпорних сорти је компликован, пре свега због хетерогености бактеријске популације. Осим тога, на отпорност утичу и спољашњи фактори, јер се при повећању температуре и смањењу светлости повећава осетљивост кромпира према бактериозној увелости. Милошевић (1998) наводи да су за отпорност кромпира одговорна три доминантна и независна гена и то само према одређеним сојевима бактериозне увелости. Хемијска контрола не даје добре резултате, као ни примена антибиотика, као што су стрептомицин, ампицилин, тетрациклин и пеницилин (Farag et al., 1982). Примена активатора системичне отпорности биљака уз примену осталих превентивних мера даје задовољавајуће резултате. У ту сврху се могу применити препарати на бази ацибензолар-с-метила, биљна есенцијална уља (нпр.тимол) или фосфорна киселина, 34

услед чије примене долази до смањења бактеријске популације. Недостаци ове методе су високи трошкови и инпути. Последњих година се све више испитује примена биолошке борбе употребом антагонистичких бактерија (Bacillus polymyxa и Pseudomonas fluorescens), које су показале задовољавајуће резултате како при примени у лабораторијским, тако и пољским услoвима (Smith et al., 2008). Поред наведених бактерија, Kabeil et al.(2008) наводе још неке одврста Erwinia spp. и Pseudomonas syringae. Аутори Dong et al.(1999), указују на могућност коришћења авирулентних мутаната бактерије R. ѕolanacearum, док Kang et al.(1995) наводе генетички модификоване антагонисте ове бактерије. У земљама у којима је патоген присутан основне мере заштите обухватају примену дугогодишњег плодореда, од 5 до 7 година (Graham и Lloyd, 1979). Неопходна је контрола коровских врста икоренових нематода који се наводе као вектори R. ѕolanacearum (Janse, 1996). Према Champoiseau et al., (2009) избор одговарајућег садног материјала, сетва здравих кртола које не потичу са заражених терена и дезинфекција ножева (уколико се за сетву користи сечен кромпир); дубоко орање и уклањање остатака усева; одводњавање и почетком и крајем сезоне наводњавање, веома субитне превентивне мере заштите. Семенски кромпир набављен из увоза може се користити само ако поседује фитосанитарни сертификат, тј.уверење да биљни материјал није заражен. Поред успостављања стратегије, узгајивачи треба да перманентно надгледају стање усева како би открили почетак заразе. Локације за праћење обухватају земљишта у којима су биле утврђене заражене биљке, реке и друге површинске воде које се користе за наводњавање, домаће и индустријске отпадне продукте (укључујући течности за прање и воду) (Champoiseau et al., 2009). 35

3. ЦИЉЕВИ И ЗАДАТАК РАДА Полазна основа овог истраживања је утврђивање првепојаве карантинске бактерије R.solanacearum на територији АП Војводине, јер је у западној Србији 2010. уоколини Горњег Милановца први пут у нашој земљи доказано присуство ове бактерије на кромпиру. Циљеви рада били су: - Прикупљање сумњивих узорака кромпира, изолација и идентификација патогена коришћењем стандардних бактериолошких, серолошких и молекуларних метода; - Утврђивање раса и биовара, испитиваних изолата R. solanacearum. Имајући у виду последице које проузрокује ова значајна карантинска бактерија, задатак овог истраживања је биодоказивање присуства R.solanacearum на кртолама кромпира које испољавају симптом мрке трулежи праћењем процедуре коју прописује Директива 98/57 (ЕU,1998) и Правилник (2009). 36

4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ РАДА 4.1. САКУПЉАЊЕ УЗОРАКА Током 2013. године у периоду од априла до новембра вршен је мониторинг здравственог стања кромпира на осам локалитета: Маглић (229 hа), Лугово (67 hа), Нова Гајдобра (31 hа), Бачки Петровац (42 hа), Надаљ (65 hа), Српски Милетић (98 hа), Фекетић (45 hа) и Лукићево (38 hа). Током јула и августа са свих површина прикупљани су узорци кртола кромпира, један узорак са сваких 5 ха површине. У току вађења кромпира (крај јула-средина октобра) вршено је узорковање кромпира са сваког хектара површине. Укупно је прегледано 615 узорка. На прикупљеним узорцима кртола кромпира из локалитета Маглић, Лугово, Нова Гајдобра, Бачки Петровац, Надаљ, Фекетић, Лукићево нису утврђени симптоми болести, само су на кромпиру из локалитета Српски Милетић (сорта Lady Claire) на појединим узорцима запажени сумњиви симптоми. Детекција и идентификација R. solanacearum вршена у Лабораторији за фитобактериологију, Департмана за заштиту биља и животу средину, Пољопривредног факултета у Новом Саду и у Институту зазаштиту биља и животу средину у Београду током 2013. и 2014. 37

4.2. ИЗОЛАЦИЈА ПАТОГЕНА Изолације су извршене из прикупљених узорака (кртоле кромпира) са симптомима мрке трулежи у складу са Правилником (2009). Кртоле кромпира су уздужно (од пупка) пресецане (по пола) стерилним ножем. Узимани су делови ткива спроводних судова кртола кромпира и бактеријски ексудат, и затим потапани, мацерирани и остављени 10 минутау стерилној дестилованој води, ради дифузије бактерија. Припремљени мацерат (50-100 µl) је засејаван на храњиву подлогу SPA (Schaad, 1980) (Прилог 1) и селективну храњиву подлогу SMSA (Elphinstone et al., 1996) (Прилог 2), стандардном методом размаза по површини храњиве подлоге у Петри кутије пречника 90 mm (Hayward, 1983). Упоредо су засејавани су и референтни изолати R.solanacearum (PD2762 и RS267 из Колекције фитопатогених бактерија Planth Protection and Soil Conservtion Service of Baranya County, Hungary, посредством др Jozsef Nemeth). Засејане подлоге су инкубиране 7 дана на температури 28 С. Преглед развоја колоније бактерија вршен је трећег, петог и седмог дана. Од већег броја добијених изолата, за даљи рад је одабрано десет (Табела 4). У рад су такође укључена два референтна изолата бактерије R. solanacearum (PD2762 i RS267 из Колекције фитопатогених бактерија Planth Protection and Soil Conservtion Service of Baranya County, Hungary, посредством др Jozsef Nemeth) и већи број тест изолата који потичу из колекције Лабораторије за фитобактериологију, Пољопривредног факултета у Новом Саду (Табела 5). 38

Табела 4. Испитивани изолати бактерија Шифре изолата Бактерија Колекција КBNS271 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS272 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS273 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS274 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS275 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS276 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS277 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS278 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS279 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад КBNS280 R. solanacearum Лабораторија за фитопатологију, Н.Сад 39

Табела 5. Kонтролни изолати бактерија коришћени у истраживању Шифра Бактерија Колекција изолата PD2762 R. solanacearum Planth Protect. & Soil Conserv. HU RS267 R. solanacearum Planth Protect. & Soil Conserv. HU KBNS201 Pseudomonas fluorescens Лаб. за фитобактер., Н.Сад KBNS203 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Лаб. за фитобактер., Н.Сад KBNS204 Xanthomonas axonopodis pv. рhaseoli Лаб. за фитобактер., Н.Сад KBNS205 Escherichia coli Лаб. за фитобактер., Н.Сад KBNS206 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Лаб. за фитобактер., Н.Сад 4.3. ПАТОГЕНОСТ Провера патогености добијених изолата има велик значај у поступку идентификације фитопатогених бактерија, јер показује да ли изоловане бактерије имају паразитна или сапрофитна својства. Само у случају позитивне реакције патогености, оправдана су даља истраживања. У ту сврху врши се инокулација разних тест биљака и биљке домаћина, добијеним изолатима. 40

4.3.1. Инокулација кртола кромпира Кртоле кромпирасу инокулисане инфилтрацијом бактеријске суспензије (концентрације 10 6-10 7 бактерија/ml) у клице или зоне окаца. Након тога кртоле су засађене у стерилни Klasmann-ов супстрат и гајене собним условима. Појава симптома је праћена од ницања до потпуног пропадања биљака (6-8 недеље). За инокулацију кртола коришћени су изолати KBNS271, KBNS272, KBNS273, KBNS274, KBNS275, KBNS276, KBNS277, KBNS278, KBNS279, KBNS280, као и референтни изолати (PD2762 и RS267) претходно гајени на косом хранљивом агару 48-72 сата (Прилог 3). Као негативна контрола послужиле су кртоле кромпира инокулисане на исти начин стерилном дестилованом водом. Оглед је постављен у 3 понављања. 4.3.2. Провера патогености на биљакама Патогеност изолата проверавана је на биљкама кромпира, парадајза, плавог патлиџана и мушкатле. За инокулацију биљака кромпира, парадајза и мушкатле коришћени су изолати KBNS271, KBNS272, KBNS273, KBNS274, KBNS275, KBNS276, KBNS277, KBNS278, KBNS279, KBNS280, као и референтни изолати (PD2762 и RS267) гајени на косом хранљивом агару 48-72 сата (Прилог 3). За инокулацију биљака плавог патлиџана коришћени су само референтни изолати. Бактеријска суспензија је припремљена у стерилној дестилованој води, концентрације 10 6-10 7 бактерија/ml. Као негативна контрола служиле су исте биљне врсте инокулисане на исти начин стерилном дестилованом водом. Након инокулације биљке су одржаване у клима комори на температури 25-30 С, у условима високе влажности ваздуха (>90%) уз адекватно заливање. Биљке су гајене у пластичним саксијама, величине 8x8x8 cm у супстрату Klasmann, на температури од 26 С и релативној влажности ваздуха 60-70%. Сва испитивања су вршена на по три до пет биљака, односно листова. Почев од првих симптома, па до увелости биљака свакодневно је праћен развој болести. 41

4.3.3. Инокулација стаблакромпира Биљке кромпира старости 6 недеља, висине око 30-50 цм инокулисане су убризгавањем бактеријске суспензије медицинским шприцем у средишњи део стабљике. Почев од треће недеље па до осме, свакодневно је праћена појава симптома увелости на биљкама. 4.3.4. Инокулација стабла парадајза За ова испитивања коришћени су сејанци парадајза сорте Moneymaker и Cristal. Сорта Moneymaker се искључиво препоручује за доказивање патогености R. solanacearum на кромпиру према методи коју наводи Janse (1988). Биљке парадајза (Moneymaker) старости 6 надеља, висине око 15 цм, су инокулисане у фази развоја 4-6 листова убризгавањем бактеријске суспензије (концентрације 10 6-10 7 бактерија/ml) медицинским шприцем у стабљику непосредно изнад котиледоних листова. Ширење симптома праћено је до десетог дана након инокулације. У лабораторијским испитивањима коришћене су и биљке парадајза (сорта Cristal) старости 11-12 недеља, висине 30-35 cm, инокулисане на исти начин. Развој симптомапраћен је две недеље након инокулације. 4.3.5. Инокулација стаблаплавог патлиџана Инокулација плавог патлиџана вршена је на сорти Black Beauty, која се такође препоручује према протколу Janse (1988). Биљке плавог патлиџана старости 6 надеља, висине око 15 cm, су инокулисане у фази развоја 4-6 листова, убризгавањем бактеријске суспензије (концентрације 10 6-10 7 бактерија/ml) медицинским шприцем у стабљику, непосредно изнад котиледоних листова. Почев од 5-ог, па све до 10-ог дана, свакодневно је праћена појава симптома увелости на биљкама. 42

4.3.6. Инокулација стабла мушкатле Мушкатле старости 10-12 недеља, висине око 15 cm, инокулисане су убризгавањем бактеријске суспензије (концентрације 10 6-10 7 бактерија/ml) медицинским шприцем у средишњи део стабла. Ширење симптома праћено је до 10- ог дана по инокулацији. 4.3.7. Провера патогености на одвојеним листовима биљака из фамилије Solanaceae Циљ ових испитивања је био да се испита спектар домаћина у оквиру биљака из фамилије Solanaceae. Вештачка инокулација је вршена на одвојеним листовима биљака парадајза, паприке, плавог патлиџана, дувана, татуле и мушкатле. Испитивања су извршена према модификованој методи Yеssad et al. (1992), који је одвојене младе листове крушке инокулисао бактеријом Pseudomonas syringae pv. syringae засецањем главног нерва и стављањем капи бактеријске суспензије. У овом раду модификована метода тако што су млади листови засецани стерилним маказама до главног нерва и потaпани у бактеријску суспензију концентрације 10 8-9 бакт./ml у трајању од 5 минута. За испитивање круга домаћина коришћени су само референтни изолати ове бактерије (PD2762 и RS267). Инокулисани листови одржавани су у затвореним пластичним посудама у лабораторији у условима амбијенталне температуре и високе влажности ваздуха (>90%). Као негативна контрола коришћени су листови биљака инокулисани на исти начин стерилном дестилованом водом. Почев од трећег до седмог дана, свакодневно је праћено појава и ширење мрке трулежи дуж спроводног система листа. 4.3.8. Реизолација патогена из парадајза и мушкатле Након појаве симптома увелости на биљкама парадајза и мушкатлепатоген је реизолован из фрагмента оболелихлисних дршки биљака. Изолација (реизолација) је вршена према уобичајеном лабораторијском поступку (Шутић и Панић, 1967), на хранљиву подлогу. Идентификација три реизолата је потврђена стандардним 43

бактериолошким методама. Добијени реизолати су коришћени за реинокулацију биљке домаћина-парадајзу складу са Коch-овим постулатима. 4.3.9. Хиперсензитивна реакција (Hypersensitivity Reaction-HR) на листовимадувана (сорта Samsun) Детерминација расе урађена је на основу методе коју наводе Lozano и Seqeira (1970) на листовима дувана сорте Samsun. Листови дувана старости 10-12 недеља инокулисани су инфилтрацијом суспензије бактерија (концентрације 10 8-9 бакт./ml) у мезофил листа. Као позитивна контрола коришћени су референтни изолати бактерије R. solanacearum (PD2762 и RS267). Негативну контролу су чинили листови инфилтрирани стерилном дестилованом водом. Дуван је након инокулације одржаван у лабораторијским условима при амбијенталној температури. Према реакцији листова дувана уколико је раса 1 у питању долази до појаве некрозе након 48 часова и увенућa након 7-8 дана; ако је у питању раса 2 појава хиперсензитивне реакције настаје у року од 12-24 часова, а ако је у питању раса 3, долази до појаве хлорозе након 2-8 дана (ЕU, 1998). 4.4. МОРФОЛОШКЕ ОДЛИКЕ Морфолошке одлике обухватиле се испитивање реакције по Gramu при чему је урађен КОН тест (Suslow et al., 1982) и утврђивање облика бактеријских ћелија уобичајеним лабораторијским поступком које за оваква испитивања наводе Шутић и Панић (1967). 44

4.5. ОДГАЈИВАЧКЕ ОДЛИКЕ Одгајивачке одлике подразумевају утврђивање облика, величине и боје колонија бактеријских изолата на хранљивим подлогама SPA (Schaad, 1980) (Прилог 1) и одређеним селективним подлогама, а првенствено подлози SMSA (Elphinstone еt al., 1996) (Прилог 2), као и испитивање стварања зеленог, флуоресцентног пигмента на косој King B подлози (King, 1954) (Прилог 4). 4.6. БИОХЕМИЈСКО-ФИЗИОЛОШКЕ ОДЛИКЕ Биохемијско-физиолошке одлике су испитане на основу бројних нутритивних и ензиматских тестова (О/F тест, стварање оксидазе, утврђивање присуства каталазе и аргинин-дехидролазе, стварањеиндола, Н2Ѕ, редукција нитрата, хидролиза скроба) према класичним бактериолошким поступцима која за оваква испитивања наводе Шутић и Панић (1967), Schaad (1980), Lelliot и Stead (1987), Арсенијевић (1997). Детектоване су и PHB (poli-β-hidroksibutirat) грануле и одређенбиовар бактерије R. solanacearum (Hayward, 1964; Hayward et al., 1990). Сви огледи су постављени у термостату при темпаратури од 26 С. 4.6.1. Оксидативно-ферментативни метаболизам глукозе Способност разлагања глукозе оксидативно или ферментативно тј. у аеробним или анаеробним условима, испитивана је коришћењем Hugh-Leifson-ове подлоге (1953), у коју је је након стерилизације и хлађења на 50 С, додат филтрацијом 45

стерилисан раствор глукозе до концентрације 1%. Подлога је засејавана у по две епрувете бактеријском културом испитиваних и контролних сојева, старости 24 часа, од којих је једна заливена стерилним течним парафинским уљем ради стварања анаеробних услова, а друга је без додатка уља (аеробни услови). Резултати су очитавани након седам дана (Прилог 5). 4.6.2. Стварање оксидазе Стварање оксидазе је испитано према Кovasc-евој методи(1956). За доказивање оксидазе коришћене су филтер траке Торлак Београд. Бактериолошком петљом је узет пун захват колоније старе 24 часа и размазан на филтер папир. Реакција се одређује наком 5-10 секунди. 4.6.3. Активност каталазе Способност испитиваних сојева бактерије да стварају фермент каталазу испитана је хомогенизацијом културе бактерије, старе 24 часа у капи 20% водоникпероксида на микроскопској плочици (Lelliott и Stead, 1987). Реакција је тренутна. 4.6.4. Активност аргинин дехидролазе У епрувете се сипа по 5 ml анорганске подлоге којој је додат L-аргинин, а засејавање се врши убодом бактериолошком петљом са сваким од испитиваних изолата. Једна епрувета залије се стерилним парафинским уљем да се постигну анаеробни услови средине, док се друга епрувета држи у аеробним условима. Формирање база из аргинина, односно његово разлагање дејством фермента аргининдехидролазе под оба услова (аеробно и анаеробно), доказује се променом боје индикатора (phenol red) (Lelliott и Stead, 1987). Промена боје индикатора се прати у периоду од 2-14 дана (дато у Прилогу 6). 46

4.6.5. Стварање индола За овај тест коришћена је пептонска вода, у којусу засејани испитивани изолати. (Прилогу 7) (Шутић и Панић, 1967). Резултати су очитани 7 дана након засејавања. 4.6.6. Стварање Н2Ѕ из пептона Културе бактерије старости 24 часа засејаване су у течну подлогу са квашчевим екстрактом и минералним солима (Yeast Salts Broth YS) (Прилогу 8) у коју је додато0,5g/l пептона (Schaad et al., 2001). Траке филтер папира навлажене су у 10% раствору олово-ацетата и причвршћене за затвараче епрувета тако да је доњи крај папира био на висини 5 mm од површине течне подлоге. Културе се инкубирају у термостату у трајњу од две недеље (Шутић и Панић, 1967). Резултати су очитавани након 3, 6, и 14 дана. 4.6.7. Редукција нитрата Редукција нитрата је испитана на подлози хранљивог буљона са одређеним процентом нитрата. Резултати су очитани после десет дана од засејавања, уз додавањеодређеног реагенса(натријум-нитрита) (Прилог 9). (Шутић и Панић, 1967) 4.6.8. Хидролиза скроба На хранљиву подлогу која садржи 1% скроба (Прилог 10) врши се засејавање свежих култура испитиваних бактерија. Након седам дана развоја у термостату око колоније бактерије се додаје неколико капи Lugol-oвог реагенса. Разлагање скроба врше бактерије које поседују способност хидролизе овог једињења до простих шећера. При томе помоћу фермента α-амилазе, разградња тече до декстрина, иуз учешће β- амилазе до малтозе (Aрсенијевић, 1997). Резултати су очитани после 5-7 дана. 47

4.6.9. Детекција гранула poli-β-hidroksibutirata (PHB) Карактеристична зрнца PHB у ћелијама R. ѕolanacearum постају видљива при бојењу (Нилскo плавим А) термички фиксираног размаза бактеријског ексудата из зараженог ткива на микроскопској плочици. На микроскопско стакалце припремљен је размаз бактеријског ексудата из 48-часовне културе са храњиве подлоге ЅРА. За позитивну контролу припремљен је размаз R. solanacearum референтних изолата (PD2762 и RS267). Размази су остављени на ваздуху да се осуше, а затим је извршено фламбирање. Препарат је затим обојен Нилски плавим, тако што је свако стакалце преливено овим 1% раствором и инкубирано 10 минута на 55 С. Након тога препарати су затим кратко испрани под млазом воде из славине, док је вишак воде отклоњен. Затим је размаз преливен 8% раствором сирћетне киселине и инкубиран 1 минут на собној температури, након чега је следило кратко испирање под млазом воде, и уклањање вишка воде. Размаз је затим навлажен капљицом воде и покривен покровним стакалцем. Преглед је вршен под eпифлуоресцентним микроскопом на 450 nm, имерзијским објективом повећања 600х1000 (уљана или водена имерзија). PHB грануле флуоресцирају светло наранџасто (Ostle и Holt, 1982). 4.7. ОДРЕЂИВАЊЕ БИОВАРА R. solanacearum се дели на биоваре на основу способности искоришћавања и/или оксидације три дисахарида или три хексозна алкохола (Hayward, 1964; Hayward et al., 1990). У истраживању је коришћена храњива подлога за одређивање биовара (Carbohydrate Media For Biovar Determination) (Hayward, 1964; 1976) (Прилог 11). Тест је обављен тако што је подлога инокулисана чистим културама изолата бактерије R.solanacearum и инкубирана на 28 С. Од дисахарида као извори су коришћени лактоза и малтоза, док су од алкохола коришћени манитол и сорбитол. Као позитивна контрола 48

коришћени су референтни изолати (PD2762 и RS276), а као негативна контрола коришћене незасејане подлоге. Резултати су оцењени после 72 часа. 4.8. СЕРОЛОШКЕМЕТОДЕ ИДЕНТИФИКАЦИЈЕ(IF test) Тестирање је извршено на свеже припремљеним екстрактима из испитиваних узорака кромпира. У раду су коришћене микроскопске плочице са више бунарчића. На одвојеним микроскопским стаклима пропремљена је позитивна контрола-референтни изолат R. solanacearum, растворен у IF пуферу (Прилог 12). На микроскопске плочице је у један ред бунарчића пипетом додавано по 20 µl ресуспендованог талога и децималних разређења (1/10 i 1/100) овог талога (Слика 7). Слика 7. Микроскопска плочица Микроскопске плочице су остављене на собној температури да се капљице осуше, а ћелије су затим фиксиране провлачењем кроз пламен. Затим је припремљено радно разређење антитела у IF пуферу, према упутству произвођача. На поређане плочице на навлаженом папиру, вршено је пуњење бунарчића са по 20 µl разређењем антитела. Затим су прекривене плочице инкубиране на влажном папиру 30 минута на собној 49

температури (18-25 C). Након инкубације, капљице са сваке плочице отресане су потапане у IF pufer-tween (Прилог 13), па у IF пуфер, у трајању од 5 минута. Бунарчићи су попуњени са по 20 µl FITC коњугованим антителом разређеним према упутрсву произвођача. Покривене плочице поново су инкубиране у истим условима,након чега су отресене капљице са плочица и испране,како је претходно описано. Плочице су пажљиво осушене на собној температури, после чега је на сваки бунарчић пипетом наношено по 5-10 µl 0,1 M глицерола са фосфатним пуфером (Прилог 14), а затим постављено покровно стакло. Овако припремљене плочице посматране су под епифлуоресцентним микроскопом са одговарајућим филтерима за ексцитацију FITC-a, под уљаном имерзијом. Прво је прегледана плочица са позитивном контролом, где се јасно виде бактеријске ћелије, изразито флуоресцентне и потпуно обојене на утврђеном титру антитела. Затим су прегледане микроскопске плочице са испитиваним узорцима и праћено присуство/одсуство флуоресцентних ћелија. Потпуно тамни отвори без присуства ћелија, или непотпуно обојене или слабо флуоресцентне ћелије оценјиване су као негативне. 4.9. МОЛЕКУЛАРНЕ МЕТОДЕ ИДЕНТИФИКАЦИЈЕ 4.9.1. Идентификација изолованих сојева PCR методом 4.9.1.1. Екстракција ДНК Екстракција DNK из репрезентативних изолата и реизолата вршена је загревањем бактеријске суспензије (10 6 CFU/ml) на 100 C током 4 минута, а из мацерата биљног ткива применом стандардне процедуре са хлороформом. 4.9.1.2. Припрема прајмера и PCR смеше Лиофилизиран пар прајмера Ps-1/Ps-2 (PS1/5'-AGTCGAACGGCAGCGGGGG-3' и PS2/5'-GGGGATTTCACATCGGTCTTGCA-3 ) специфичних за детекцију R. 50

solanacearum (Pastrik et al., 2000) растворен је у води и направљен је шток прајмера 100 µм концетрације. За директну употребу прајмера припремљена је серија разређења 1:10 штока прајмера, тј. концетрацију од 10µМ, додавањем стерилне воде без нуклеаза. Тубице са прајмерима чуване су на -20 C. За припрему PCR смеше коришћени су готови састојци комерцијалног PCR микса. Односи састојака у PCR смеши су одређени протоколом за R. solenacearum (Табела 6) (Pastrik et al., 2000). Табела 6. Односи састојака у PCR смеши за R.solenacearum Реагенс Стерилна ултра чиста вода Количина по реакцији Коначна концентрација 16,025 μl 10 x PCR пуфер (15 mm MgCl2) 2,5 μl 1 X (1,5 mm MgCl2) BSA (фракција V) (10%) 0,25 μl 0,1% Смеша d-ntp (20 mm) 0,125 μl 0,1 mm Прајмер Ps-1 (10 μm) 0,5 μl 0,2 μm Прајмер Ps-2 (10 μm) 0,5 μl 0,2 μm Taq полимераза (5 U/μl) 0,1 μl 0,5 U Запремина узорка Укупна запремина 5,0 μl 25,0 μl корака: PCR протокол за умножавање DNK за R. solenacearum се састојао од следећих 51

1. 1 циклус 5 минута на 95 С - примарна денатурација 2. 1. 30 секунди на 95 С - денатурација 2. 30 секунди 58 С хибридизација 35 циклуса 3. 45 секунди 72 С елонгација 3. 1 циклус 5 минута 72 С - финална елонгација Очекивана дужина умноженог производа из ланца DNK бактерије R. solenacearum је 553 bp. 4.9.1.2. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) анализа PCR производи умножени из DNK R. solanacearum испољавају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикционих фрагмената са ензимом ТаqI после инкубације на 65 C 60 min (Cook et al., 1989). Рестрикциони фрагменти добијени из специфичног фрагмента R. solanacearum су величине 457 bp и 96 bp. Табела 7. Протокол за дигестију PCR продукта PCR микс 10 µl Стерилна ултра чиста вода 16 µl 10x Buffer TaqI 2 µl TaqI 1 µl 52

4.9.1.3. PCR специфични протокол за одређивање биовара R. solanacearum За утврђивање биовара добијених изолата коришћени су олигонуклеотидни прајмери: Узводни прајмер Rs-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3' Низводни прајмер Rs-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3' Низводни прајмер Rs-3-R 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3' Очекивана дужина умноженог производа из DNK R. solanacearum: са Rs-1-F/Rs-1- R je 718 bp, a са Rs-1-F/Rs-3-R je 716 bp. Табела 8. PCR реакциони микс (Специфични PCR за биовар ½) Реагенс Стерилна ултра чиста вода Количина по реакцији Коначна концентрација 12,925 μl 10 x PCR пуфер (15 mm MgCl2) 2,5 μl 1 X (1,5 mm MgCl2) BSA (фракција V) (10%) 0,25 μl 0,1% Смеша d-ntp (20 mm) 0,125 μl 0,1 mm Прајмер Rs-1-F (10 μm) 2 μl 0,8 μm Прајмер Rs-1-R (10 μm) 2 μl 0,8 μm Taq полимераза (5 U/μl) 0,2 μl 1,0 U Запремина узорка Укупна запремина 5,0 μl 25,0 μl 53

Табела 9. PCR реакциони микс (Специфични PCR за биовар 3/4/5) Реагенс Стерилна ултра чиста вода Количина по реакцији Коначна концентрација 14,925 μl 10 x PCR пуфер (15 mm MgCl2) 2,5 μl 1 X (1,5 mm MgCl2) BSA (фракција V) (10%) 0,25 μl 0,1% Смеша d-ntp (20 mm) 0,125 μl 0,1 mm Прајмер Rs-1-F (10 μm) 1 μl 0,4 μm Прајмер Rs-3-R (10 μm) 1 μl 0,4 μm Taq полмераза (5 U/μl) 0,2 μl 1,0 U Запремина узорка Укупна запремина 5,0 μl 25,0 μl PCR протокол за умножавање DNK I 5' 95 C - примарна денатурација II 1. 30" 95 C - денатурација 2. 30" 58 C - хибридизација 35 циклуса 3. 45" 72 C - елонгација III 5' 72 C - финална елонгација 54

Табела 10. Протокол за дигестију PCR продукта PCR микс 10 µl Стерилна ултра чиста вода 18 µl 10x Buffer R 2 µl BsmI 1 µl 4.9.1.4. Хоризонтална електрофореза Електрофоретско раздвајање продуката амплификације урађено је у 2% (v/v) агарозном гелу при напону од 95V на 45 минута. Гел је посматран на UV трансилуминатору. На основу DNK маркера (ДНА Ladder Fermentas, Литванија) одређена је приближна молекулска маса PCR производа. Позитивним је оцењен сваки узорак у коме је амплификован фрагмент величине 553 bp. 55

5. РЕЗУЛТАТИ 5.1. СИМПТОМИ Током 2013. у периоду од априла до јула вршен је мониториг здравственог стања кромпира на свим површинама (Маглић, Лугово, Нова Гајдобра, Бачки Петровац, Надаљ, Српски Милетић, Фекетић и Лукићево). Прегледом надземних делова биљака за време вегетације у пољу појава оболелих биљака није констатована. Током јула и августа са свих површина прикупљани су узорци кртола кромпира и том приликом нису уочени симптоми болести. У току вађења кромпира (септембар, 2013. године) на кртолама сорте Lady Claire из Српског Милетића кoд појединих узорaка уочени су сумњиви симптоми болести. На појединим кртолама на попречном пресеку запажена је промена боје спроводног ткива. Боја спроводног прстена на неким кртолама је била стакласто-жута, док је на другим била светлосмеђа. На неким кртолама из спроводних судова се након наколико минута,спонтано, појавио бактеријски ексудат, крем беличаст (Слика 8-10), док је надругим кртолама уочена појава мрке некрозе спроводног ткива кртоле, која се ширила на околно паренхимско ткиво које је постајало светло смеђе. У зони прстенастог спроводног система уочене су шупљине у 56

виду трошне трулежи (Слика 11). Констатоване су и кртоле код којих се одваја спољашњи део (кора) од унутрашњег (срж). Одмах по уочавању симптома на лицу места је урађен један од брзих тестова провере прописан Правилником (2009), а који подразумева сечење сумњивих кртола и потапање пресека у стаклену чашу са дестилованом водом. Након неколико секунди, уочено је истицање кончастог бактеријског ексудата, што је један од доказа да је у питању заразабактеријом R. solenacearum (Слика 12 и 13). Слика 8. Промена боје спроводног ткива на попречном пресеку кртоле (Природна инфекција) Слика 9. и 10. Истицање бактеријског ексудата из спроводних судова кртола (Природна инфекција) 57

Слика 11. Појава мрке некрозе спорводног ткива и ширење на паренхимско ткиво кртола (природна инфекција) Слика 12. и 13. Појава бактеријског ексудата у чаши са водом (природна инфекција) 5.2. ИЗОЛАЦИЈА ПАТОГЕНА Два дана након засејавања суспензије на селективну хранљиву подлогу SMSA (Elphinstone еt al., 1996) код узорака Lady Claire као и код референтних изолата R. solanacearum појављују се колоније, неправилног облика, воденасте, пљоснате, 58

провидно млечно беле боје, величине око 1mm. Трећег и четвртог дана јасно се уочава центар колоније који је црвено-љубичаст. Старењем, колоније постају округле, нефлиудне, сјајне и испупчене. Величина колонија је око 1-1,5 mm (Слика 14 и 15). На храњивој подлози SPА, три дана након извршене изолације образују се пљоснате, округле до неправиле и течне колоније бисерно, крем-беле боје. Колоније бактерија су величине 0,8-1,5 mm. У подлози се након 3-4 дана код свих колонија у већини сличајева уочава мрки пигмент (Слика 16 и 17). Из заражених кртола сорте Lady Claire добијен је већи број изолата, од којих је за даље проучавање одабрано 10 репрезентативних (Табела 4). Слика 14. и 15. Изглед колонија R. solanacearum на SMSA подлози (трећи дан од засејавања) 59

Слика 16. и 17. Изглед колонија R. solanacearum на SPА подлози (трећи дан од засејавања) 5.3. ПАТОГЕНОСТ Провера патогености испитиваних изолата вршена је на кртолама кромпира и биљкама кромпира, парадајза, плавог патлиџана и мушкатле. 5.3.1. Инокулација кртола кромпира Вештачка инокулација кртола кромпира је вршена у циљу доказивања патогености на биљци домаћину и праћењу симптома на надземним биљним деловима. Ницање биљака из заражених кртола је уочено три недеље након садње. Биљке су никле из неких кртола које су инокулисане референтним изолатима (PD2762 и RS267) 60

и из кртола које су инокулисане испитиваним изолатима KBNS271, KBNS273, KBNS275 и KBNS277. Из кртола инокуласаних изолатима KBNS272, KBNS274, KBNS276, KBNS278, KBNS279 и KBNS280 биљке нису никле, односно дошло је до потпуног пропадања кртола пре њиховог ницања. У случајевима где је дошло до ницања у првих десет дана уочен је неједнак пораст изданака. Код биљака инокулисаних референтним изолатима и изолатима KBNS271 и KBNS273, запажено је да су биљке заостајале у порасту и биле кржљаве, док биљке инокулисане изолатима KBNS275 и KBNS277 нису испољавале симптоме заостајања у порасту (Слика 18). Међутим, 6 недеља након садње на овим биљкама су уочени први симптоми вењења и увијања вршних, најмлађих листова (Слика 19). Након 3 дана исти симптоми су уочени и код биљака инокулисаним изолатима PD2762, RS267, KBNS271 и KBNS273, односно на биљкама које су још раније испољавале заосталост у порасту и кржљавост. На неким биљкама уочена је појава епинастије. Седам недеља након садње све биљке су почеле да вену у целости ида се суше. На стаблима је уочена мрка некроза која се постепено ширила према вршним деловима биаљка и преко листних дршки до листова. Увели листови су висили на стаблу (Слика 20). У року од 14 дана (након првих симптома вењења), све биљке су се осушиле. На попречном пресеку стабла могла се уочити мрка некроза спроводних судова. Након пропадања и вађења биљака, код биљака инокулисаним изолатом KBNS275 уочено је присуство заметнутих кртола. На тим кртолама је примећена промена боје спроводних судова у светло смеђу, а на пресеку кртола из спроводног суда се јављао бактеријски ексудат, светло-крем боје (Слика 21). Између испитиваних изолата постојала је одређена разлика у порасту изданака и динамици појаве симптома, али јеосновни симптом био идентичан, а то су увелост и сушење биљака. 61

Слика 18. Биљке које су никле из заражених кртола кромпира (Са лева на десно: PD2762, RS267, KBNS271, KBNS273, KBNS275 и KBNS277) Слика 19. Вењење вршних листова Слика 20. Сушење листова и мрка некроза 62

Слика 21. Нова генерација кртола: кртоле биљке заражене изолатом KBNS275 5.3.2. Провера патогености на биљакама Провера патогености испитиваних изолата вршена је и на биљкама кромпира, парадајза, плавог патлиџана и мушкатле. 5.3.3. Инокулација стаблакромпира Симптоми на биљкама кромпира старости 6 недеља, инокулисани инфилтрацијом бактеријске суспензије у стаблопочели су се јављати после 3 недеље након инокулације. На свим инокулисаним биљкама болест се манифестовала на надземним деловима у виду благе увелости целих биљака (Слика 22). На неким биљкама уочена је и појава епинастије. После три недеље од инокулације, симптоми су били јасно видљиви и на стаблу. На месту инфилтрације бактеријске суспензије код свих биљака јасно се уочавала тамно зелена воденаста пега, нејасних ивица величине око 1 cm. Два дана касније на месту где је раније уочена пега појавила се мрка боја, величине 1-2 cm, која се ширила ка вршном и доњем делу биљке. Истовремено са појавом некрозе стабљике, листови су још више венули. Након 4 недеље од момента инокулације констатована је разлика у агресивности изолата. Изолати KBNS271, KBNS275 и KBNS277су показали највећу агресивност, референтни PD2762и RS276 мању, док су изолати KBNS273и KBNS280 показали најмању агресивност. Најагресивнији изолати су први проузроковали повијање биљака на месту убода, потпуно увенуће и некрозу 63

лишћа, затим су се следећи дан исти симптоми појавили на биљкама инокулисаним осталим изолатима (Слика 23-26). Код контролних изолата уочена је и појава ексудата. Развој симптома је праћен је до 8. недеље, након чега је дошло до потпуног пропадања свих биљака. На биљкама инокулисаним стерилном дестилованом водом (негативна контрола) нису констатоване никакве патолошке промене. Слика 22. Инокулација кромпира старости 9 недеља ( 4 недеље након инокулације) 64

Слика 23. Појава првих симптома увелости Слика 24. Некроза и повијање стабла (3 недеље након инокулације) (4 недеље након инокулације) Слика 25. Појава ексудата Слика 26. Потпуно пропадање биљке (4 недеља након инокулације) (5 недеља након инокулације) 65

5.3.4. Инокулација стабла парадајза Симптоми на биљкама парадајза старости 6 недеља (сорте Moneymaker) инокулисаним инфилтрацијом бактеријске суспензије у стабло, појавили су се 4.дана након инокулације. Болест се на свим инокулисаним биљкама манифестовала на надземним биљним деловима у виду благе увелости целих биљака (Слика 27 и 28). Петог дана након инокулације на месту инфилтрације бактеријске суспензије, код биљака инокулисаним изолатима KBNS271, PD2762, RS267 стабло се повијало, акод свих осталих биљака је билавидљива тамно зелена воденаста пега, нејасних ивица величине 0,5-1 cm, а листови су код свих биљака били хлоротични и венули. После дан-два, све биљке су се повиле, на месту инфилтрације уочена је мрка некроза стабла, величине 1-2 cm, која се ширила ка вршном и доњем делу биљке. Истовремено са појавом некрозе стабљике, листови су још више венули (Слика 29 и 30). На неким биљкама седмог дана после инокулације на месту ифилтрације се јављао провидан беличаст бактеријски ексудат. Даљим развојем болести, 7. дана након инокулације, на неким биљкама у делу стабла око места убода, појављују се пукотине и шупљине у сржи. Лишће је већ сасвим увенуло и некротирало (Слика 31 и 32). Десетог дана од момента инфилтрације биљке су потпуно пропале (Слика 33). Код позитивне контроле симптоми су били идентични, а код негативне није било никаквих промена. Слика 27 и 28. Инокулација парадајза старости 6 недеља: симптом увелости (4. дан након инокулације; лево-контроле, десно инокулисане биљке) 66

Слика 29. и 30. Инокулација парадајза старости 6 недеља (5. дан) (Симптом повијања стабла; лево-контрола, десно-инокулисана биљка) Слика 31. и 32. Инокулација парадајза старости 6 недеља (7. дан) 67

Слика 33. Инокулација парадајза старости 6 недеља сорте Moneymaker (7. дан након инокулације; у средини-контрола, лево и десно-инокулисане биљке) Код парадајза сорте Crystal која је инокулисана у фази 11-12 недеље старости први симптоми су уочени седам дана након инокулације. Код свих испитиваних изолата симптоми су се испољавали губитком тургора и благе увелости целих биљака. Следећег дана на инокулисаним стабљикама је уочена мрка некроза спроводних судова, величине око 1 cm. Некроза се ширила од места инокулације. На појединим биљкама у стабљици се јављају пукотине величине око 2 cm и долази до појаве бактеријског ексудата. У даљем развоју болести уочено је ширење инфекције преко лисних дршки у виду некрозе, на којима лишће вене и суши се. Током 9. и 10. дана на стаблу, на месту инокулације, пукотина се повећала и до 3 cm на неким биљкама. Са појавом шупљина у сржи, уочено је и интензивно сушење листова. Две недеље након инокулације све инфилтриране биљке су пропале (Слика 34-38). Контролне биљке инокулисане референтним сојем R. solanacearum су испољиле потпуно идентичне симптоме, а биљке инокулисане стерилном дестилованом водом, нису испољавале никакве патолошке промене. 68

Слика 34. Инокулација парадајза сорте Crystal старости 11-12 недеља (8 дана након инокулације; лево-инокулисане биљке, десно-контрола) Слика 35. и 36. Инокулација парадајза старости 11-12 недеља (након 8 дана) (Симптоми увенућа биљака ипромена боје стабла) 69

Слика 37. и 38. Инокулација парадајза старости 11-12 недеља: Симптом сушења биљака и некроза стабла - лево; појава ексудата-десно) (9. дан након инокулације) Поређењем патогености изолата на парадајзу старости 6 и 11-12 недеља, уочено је да су се симптоми код млађих биљака појавили три дана раније него код старијих биљака. Осим тога, код млађих биљака симптоми су се испољавали у виду воденастих пега и повијања стабла, а код групе биљака старости 11-12 недеља дошло је до појавемрке некрозе и пуцање стабла. Потпуно пропадање биљака код млађих биљака наступило је након 7 дана, а код старијих након две недеље. Из свега наведеног може се закључити да су биљке старости 6 недеља погодније за испитивање патогености него биљке старости 11-12 недеља, јер је бактерија агресивнијана млађим биљкама и симптоми се раније испољавају, на основу чега се раније моглу донети закључци о патогености изолата. Мада, се не може се искључити и утицај сорте (Moneymaker и Crystal). 70

5.3.5. Инокулацијастабла плавог патлиџана Симптоми на стаблу плавог патлиџана (старости 6 недеља при инокулацији) појавили су се након 5 дана од инокулације, код биљака инокулисаних референтним изолатом PD2762, док су се код биљака инокулисаних референтним изолатом RS267, симптоми појавили наредног дана у виду нејасне воденасте тамно зелене пеге на месту инокулације. Следећег дана пега је постала уочљивија и констатована је појава мрке некрозе стабла, која се ширила на горе и на доле од места инокулације. Истовремено је уочено вењење листова. Седмог дана већина биљака из групе биљака инокулисаних референтним изолатом PD2762, повијала се на месту инокулације, док су се код групе биљака инокулисаних изолатом RS267 повиле само поједине биљке. У обе групе уочена је појава беличастог ексудата код неких биљака (Слика 41). Осмог и деветог дана након инокулације листови су код обе групе биљака потпуно увели (Слика 39 и 40). Развој симптомa је праћен до 10ог дана након инокулације, када је уочена потпуна некроза и пропадање свих биљака. У току испитивања патогености на сејанцима плавог патлиџана констатовано је да оба референтна изолата проузрокују идентичне симптоме, али је уочена разлика у динамици ширења симптома и агресивности између два референтна изолата. Изолат PD2762 показао већу агресивност од изолата RS267. Поређењем ефикасности деловања изолата на биљке парадајза и плавог патлиџана исте старости, констатовано је да су се први симптоми раније уочили код парадајза (четвртог дана) у односу наплави патилиџанкод кога су се први симптоми појавили дан или два касније. Такође, код парадајза је петог дана уочено повијање, док је исти симптом код плавог патлиџана уочен тек седмог дана. Добијени резултети указују да су биљке парадајза адекватније за доказивање патогености бактерије R. solanacearum, јер се симптоми на њима раније појављују. 71

Слика 39. и 40. Инокулација патлиџана (6. дан) (Симптом повијање стабла и мрка некроза; лево-контрола, десно-инокулисана биљка) Слика 41. Појава ексудата (8. дан након инокулације) 5.3.6. Инокулација стабла мушкатле Први симптоми на мушкатлама појавили су се 7.дана након инокулације стабла у виду вењења и жућења листова биљака. Лишће које је увело имало је облик кишобрана. Осмог дана након инокулације на стаблу су уоченетамно зелене воденастепеге нејасних ивица, величине 0,5-1 cm. Следећег дана након појаве симптома констатована је лако уочљива мрка некроза стабла која се ширила од места инокулације према вршним деловима биљака. Некроза се преко лисних дршки ширила до спроводних судова листова. Листови на свим иноклусаним биљкама су увели и пожутели. На неким биљкама уочена је појава епинастије. Развој болести праћен је до 72

10ог дана након инокулације, при чему је уочено све веће пропадање биљака у виду вењења и некрозе листова, као и повијања стабљика на месту инокулације (Слика 42-45). Код позитивне контроле (референтни изолати) симптоми су били идентични, а код негативне контроле није било никаквих промена. Слика 42. и 43. Инокулација мушкатле (након 8 дана): увенуће биљака и жућење листова (Лева слика: лево-контрола, десно-инокулисана биљка; десна слика: левоинокулисана биљка, десно-контрола) Слика 44. и 45. Инокулација мушкатле (након 8 дана) (Симптом мрке некрозе стабла, лисних дршки и лисних нерава) 73

5.3.7. Провера патогености на одвојеним листовима биљака из фамилије Solanaceae Први симптоми појавили су се четвртог дана након инокулације на појединачним листовима парадајза и мушкатле у виду мрке некорзе која је видљива на површини спроводних судова и шири се од главног нервана споредне. Следећег дана идентични симптоми уочени су и код листова плавог патлиџана и паприке (али много слабијег интензитета), мрка некроза се од централног нерва врло слабо ширила и на споредне нерве (Слика 46-49). На појединачним листовима дувана и татуле, нису констатоване никакве патолошке промене. У даљем развоју болести седмог дана долази до потпуног пропадања листова мушкатле и парадајза, док су листови плавог патлиџана и паприке пропадали два дана касније. Није уочена разлика у патогености између два испитивана референтна изолата. Листови који су на исти начин третирани стерилном дестилованом водом (негативна контрола) нису испољили никакве промене. Слика 46. Инокулација појединачних листова мушкатле (лево-контрола, десно-инокулисани листови) Слика 47. Инокулација појединачних листова парадајза 74

Слика 48. и 49. Инокулација појединачних листова плавог патлиџана и паприке (након 5 дана) (лево-контрола, десно-инокулисани листови) Слика 50. и 51. Инокулација појединачних листова дувана и татуле (након 6 дана) (лево-контрола, десно-инокулисани листови) 75

5.3.8. Реизолација патогена из парадајза Из инокулисаних биљака парадајза (сорте Moneymaker) код којих је петог дана након инокулације констатована појава карактеристичних симптома (ширење некрозе уз стабло), узети су делови стабла и урађена је реизолација на ЅРА подлогу (Слика 52). Три дана након засејавања на подлогама су уочене карактеристичне колоније R. solanacearum. Идентификација реизолата потврђена је стандарднм бактериолошким тестовима. 5.3.9. Хиперсензитивна реакција (Hypersensitivity Reaction-HR) на листовимадувана(сорта Samsun) Проучавани изолати проузрокују хиперсензитивну реакцију на листу дувана (Samsun). Након 24 часа, промене се испољавају прво у виду хлоротичних зона инокулисаног ткива, што је праћено некрозом и колапсом лисног ткива после 48 часова. Референтни изолат PD2762 такође проузрокује HR након 24 часа. На месту инокулације стерилном дестилованом водом није било промена. На основу ове реакције проучавани изолати према Lozano и Sequeira (1970) припадају раси бактерије R. solanacearum. 5.4. МОРФОЛОШКЕ ОДЛИКЕ Испитивани изолати бактерије су у виду кратких штапића са заобљеним крајевима. Формирају слузаст кончић мацерирањем у 3% КОН, на основу чега је утврђено да припадају грамнегативним бактеријама (Слика 53). 76

Слика 52. Реизолација на ЅРА подлогама Слика 53. Реакција по Граму: позитивна 5.5. ОДГАЈИВАЧКЕ ОДЛИКЕ На хранљивом агару (SPА), након три дана развоја бактерија образује пљоснате колиније, неправиле и течне, бисерно, крем-беличасте, величине 0,8-1,3 mm. При дужој инкубацији величина колонија се повећава на око 1,5 мм и долази до међусобног спајања. У подлози се уочава мрки пигмент (Слика 54 и 55). Два дана након засејавања суспензије на селективну хранљиву подлогу SMSA (Elphinstone et al., 1996) појављују се неправилне, провидне, розе колоније. Трећег и четвртог дана центар колоније добија црвено-љубичасту боју. Старењем колоније постајуокругле, сјајне и испупчене. Величина колонија је око 1-1,5 mm (Слика 56 и 57). 77

Слика 54. и 55. Изглед колонија R. solanacearum на SPА подлогама Слика 56. и 57. Изглед колонија R. solanacearum на SMSA подлогама На King B подлози, испитивани изолати не стварају зелени флуоресцентни пигмент, што је карактеристично за бактерију R. solanacearum, јер припада групи нефуоресцентних бактерија. Kao позитивна контрола коришћен је сој бактерије P. fluorescens (КBNS201). 78

5.6. БИОХЕМИЈСКО-ФИЗИОЛОШКЕ ОДЛИКЕ 5.6.1. Оксидативно ферментативни тест (О/F test) Промена боје подлоге у жуту (услед смањења рн врeдности), значи да бактерија ствара киселину из глукозе. Појава жуте боје прво се уочава на врху подлоге, а касније подлога у целости добија жуту боју. Према добијеним резултатима сви испитивани изолати разлажу глукозу оксидативним путем (Табела 11) (Слика 58), односно припадају групи аероба. На исти начин је реаговао и тест изолат P. fluorescens (КBNS201). У анаеробним условима реакција је негативна (Слика 59). Тест изолат E. coli (КBNS205) је проузроковао промену боје подлоге у жуту како оксидативним, тако и ферментативним путем, што значи да ова бактерија припада групи факултативних анаероба. Слика 58. и 59. Резултати оксидативно - ферментативног (О/F) теста 79

Табела 11. Резултати оксидативно - ферментативног (О/F) теста Шифра изолата Оксидативно разлагање глукозе (О) Ферментативно разлагање глукозе (F) KBNS271 + - KBNS272 + - KBNS273 + - KBNS274 + - KBNS275 + - KBNS276 + - KBNS277 + - KBNS278 + - KBNS279 + - KBNS280 + - PD2762 + - RS267 + - P. fluorescens + - E.coli + + 5.6.2. Стварање оксидазе Након наношења бактеријске колоније на филтер папир ( Торлак, Београд), одмах је дошло до појаве плаво-љубичасте боје, што је знак позитивне реакције (Табела 12) 80

(Слика 60). Позитивна реакција је добијена и код тест изолата P. fluorescens (КBNS201). 5.6.3. Активност каталазе Појава мехурића гаса, додавањем КОН (3%) на бактеријску колонију (као резултат издвајања слободног кисеоника), знак је позитивне реакције, односно присуства фермента каталазе (Слика61) (Табела 13). Слика 60. Стварање оксидазе Слика 61. Активност каталазе Слика 62. Негативна реакција стварања индола 81

5.6.4. Активност аргинин-дехидролазе Испитивани изолати не стварају аргинин-дехидролазу при анаеробним условима, односно боја подлоге остаје непромењена. Промена боје у ружичасто црвену се јавила само у епруветама са тест изолатом P. fluorescens (КBNS201) (Табела 12). 5.6.5. Стварање индола Испитивани изолати не стварају индол. Додавањем реагенса, позитивна реакција (појава црвено-љубичасте боје) је уочена само код тест изолата Е. сoli (КBNS205) (Слика 62) (Табела 13). 5.6.6. Стварање Н2Ѕ из пептона Сви изолати стварају сумпор водоник. Позитивна реакција (стварање оловоацетата на филтер хартији) се манифестује појавом чађаве боје на филтер папиру. Исти резултат је добијен и код тест изолата P. сarotovorum (КBNS203) (Табела 13). 5.6.7. Редукција нитрата Испитивани изолати врше редукцију нитрата до нитрита. Позитивна реакција, односно, појава жуто-мрке боје (након додавања одређеног реагенса) утврђена је код свих изолата, као и тест изолатаx.c.pv. phaseoli (КBNS204) (Табела 13). 82

Табела 12. Резултати тестова испитиваних изолата Шифра изолата Активност оксидазе Активност аргинин дехидролазе KBNS271 + - KBNS272 + - KBNS273 + - KBNS274 + - KBNS275 + - KBNS276 + - KBNS277 + - KBNS278 + - KBNS279 + - KBNS280 + - PD2762 + - RS267 + - 5.6.8. Хидролиза скроба Испитивани изолати не хидролизују скроб, што је утврђено појавом плаве боје након додавања Lugol-овог раствора на скробну подлогу. Позитивна реакција, светла зона око бактеријске колоније се јавила само код тест изолата X.c.pv. vesicatoria (КBNS206) (Табела 13). 83

Табела 13. Остале биохемијско физиолошке одлике испитиваних изолата Шифра изолата Активност Стварање Стварање Редукција Хидролиза каталазе индола Н2Ѕ из пептона нитрата скроба KBNS271 + - + + - KBNS272 + - + + - KBNS273 + - + + - KBNS274 + - + + - KBNS275 + - + + - KBNS276 + - + + - KBNS277 + - + + - KBNS278 + - + + - KBNS279 + - + + - KBNS280 + - + + - PD2762 + - + + - RS267 + - + + - Е. сoli - + - - - P. carotovorum - - + - - X.c.pv. phaseoli - - - + - X.c.pv. vesicatoria - - - - + 84

5.6.9. Детекција гранула poli-β-hidroksibutirata (PHB) Прегледом микроскопских стакалаца под епифлуоресцентним микроскопом (450 nm) код свих изолатаје утврђено присуство светло наранџасте флуоресценције PHB зрнаца. 5.7. ОДРЕЂИВАЊЕ БИОВАРА У року од 72 часа након засејавања је уочена промена боје подлоге од маслинасто зелене у жуту, што значи да је резултат теста позитиван код свих испитиваних и референтних изолата. Сви испитивани изолати користе малтозу и лактозу, а не користе манитол и сорбитол (Слика 63-66). У складу са тим резултатима испитивани изолати су класификовани као биовар 2 бактерије R. ѕolanacearum (Табела 14). Табела 14. Детерминација биовара Тест коришћења Испитивани изолати (10) Контрола (PD2762/RS267) Малтоза + + Лактоза + + Дулцитол - - Сорбитол - - 85

Слика 63. и 64. Позитивна реакција теста биовара: малтоза и лактоза Слика 65. и 66. Негативна реакција теста биовара: дулцитол и сорбитол 86

5.8. СЕРОЛОШКЕ МЕТОДЕ 5.8.1. Резултати IF теста Резултати IF теста су били позитиви код свих узорка оболелих кртола кромпира. Код позитивне контроле (референтни изолат R. solanacearum PD2762) као и код свих тестираних изолата јасно је уочено присуство флуоресцентних бактеријских ћелија (Слика 67). Слика 67. R. solanacearum: флуоресценција бактеријских ћелија (Popović, 2014) 87

5.9. МОЛЕКУЛАРНЕ МЕТОДЕ 5.9.1. PCR тест са специфичним прајмерима Ps-1/Ps-2 У циљу потврде идентитета изолата бактерије, коришћена су два протокола. Као резултет ланчане реакције полимеразе, коришћењем прајмера Ps-1/Ps-2 амплификовани су фрагменти нуклеинске киселине одговарајуће величине 553 bp (Слика 68). М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М 553bp Слика 68. R. solanacearum: умножавање фрагмената DNK на позицији од 553 bp (1-10-изолати KBNS271-KBNS280,11- референтни изолат PD2762, 12- референтни изолат RS267, 13- негативна контрола, М-маркер) (Поповић, 2014) PCR производи умножени из DNK тестираних изолата R. solanaсearum испољавају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикционих фрагмената са ензимом ТаqI после инкубације на 65 C 60 min. Рестрикциони фрагменти добијени из специфичног фрагмента R. solanacearum су величине 457 bp и 96 bp. 88

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М 457 bp 96 bp Слика 69. R. solanacearum: умножавање фрагмената DNK на позицији од 457 bpи 96 bp (1-референтни изолат PD2762, 2-11 испитивани узорци, 12- негативна контрола, 13- референтни изолат RS267, М-маркер) (Поповић, 2014) PCR производи умножени из DNK тестираних изолата и референтних изолата R. solanacearum са прајмерима Rs-1-F и Rs-1-R испољавају карактеристичне полиморфизме у дужини рестрикционих фрагмената са ензимом BsmI после инкубације на 37 C у трајању од 60 минута. PCR производи умножени из DNK бактерије R. solanacearum са прајмерима Rs-1-F и Rs-3-R немају места рестрикције. 89

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 718 bp Слика 70. R. solanacearum: умножавање фрагмената DNK на позицији од 718 bp (1-7 изолати KBNS271- KBNS277,8- негативна контрола, 9-11KBNS278- KBNS280, 12- референтни изолат PD2762, 13- референтни изолат RS267, М-маркер) (Поповић, 2014) 90