ИСПИТИВАЊЕ СЕРОЛОШКОГ ОДГОВОРА НА S И R АНТИГЕНЕ БРУЦЕЛА КОД ПАСА СА ПОДРУЧЈА ЈУЖНОБАЧКОГ ОКРУГА

Transcript

1 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за ветеринарску медицину Драган Бокан ИСПИТИВАЊЕ СЕРОЛОШКОГ ОДГОВОРА НА S И R АНТИГЕНЕ БРУЦЕЛА КОД ПАСА СА ПОДРУЧЈА ЈУЖНОБАЧКОГ ОКРУГА Дипломски рад Нови Сад, 2018.

2 УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Департман за ветеринарску медицину Кандидат: Драган Бокан Ментор: Др Александар Поткоњак ИСПИТИВАЊЕ СЕРОЛОШКОГ ОДГОВОРА НА S И R АНТИГЕНЕ БРУЦЕЛА КОД ПАСА СА ПОДРУЧЈА ЈУЖНОБАЧКОГ ОКРУГА Дипломски рад Нови Сад, 2018.

3 КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ ДИПЛОМСКОГ РАДА Др Александар Поткоњак, ванредни професор - Ментор за ужу научну област Ветеринарска микробиологија и заразне болести животиња Пољопривредни факултет, Нови Сад Департман за ветеринарску медицину Др Весна Лалошевић, редовни професор Председник комисије за ужу научну област Ветеринарска микробиологија и заразне болести животиња Пољопривредни факултет, Нови Сад Департман за ветеринарску медицину Др Љубица Спасојевић Косић, ванредни професор III члан за ужу научну област Болести животиња и хигијена анималних производа Пољопривредни факултет, Нови Сад Департман за ветеринарску медицину

4 Драган Бокан Дипломски рад Кратак садржај КРАТАК САДРЖАЈ Бруцелоза паса је инфективно и контагиозно обољење светске дистрибуције, узроковано бактеријама из рода Brucella. Примарни узрочник, B. canis, откривена је средином шездесетих година прошлог века на подручју САД. Јединствена антигена грађа која се огледа у постојању R антигена, издваја је од осталих S-класичних бруцела (B. abortus, B. mlitensis и B. suis) које такође могу инфицирати пса и изазвати обољење. Први случај бруцелозе код паса у Србији дијагностикован је године. У циљу раног откривања и ерадикације обољења неопходно је спровођење сталног серолошког мониторинга. Због чињенице да је у питању зооноза, дијагностика обољења има како епизоотиолошки тако и епидемиолошки значај. Како на подручју Јужнобачког округа до сада нису рађена слична серолошка испитивања, намеће се потреба за истим. У овом истраживању испитана су 102 узорка крвних серума паса са поменутог подручја на присуство антитела против S и R антигена бруцела. Употребом методе брзе аглутинације на плочици, позитивна реакција на S антигене забележена је код 2 узорка, што чини 1,96% од укупног броја паса. Кључне речи: бруцелоза, серолошки мониторинг, антитела, крвни серум, брза аглутинација

5 Драган Бокан Дипломски рад Summary SUMMARY ASSESSMENT OF THE SEROLOGICAL RESPONSE OF DOGS TO S AND R ANTIGENS OF BRUCELLA IN THE AREA OF JUZNOBACKA DISTRICT Canine brucellosis is infectious and contagious widespread diseases, caused by Brucella spp. Primary pathogen, Brucella canis, was found in mid-sixties in USA. Specific antigen structure, that implies presence of R antigens, distinguish B. canis from the other classical Brucella spp (B. abortus, B. mlitensis и B. suis) that also can infect a dog and cause troubles. The first case of Brucella canis in Serbia was diagnosed in For the purpose of the early detection and eradication of the disease, continuous serological monitoring is necessary. Due to the fact that zoonosis is concerned, diagnosis of the disease has both epizootiological and epidemiological significance. As so far, no similar serological tests have been performed in the area of Juznobacka district, the need for them is imposed. In this study, 102 samples of dogs' blood serum from the aforementioned area were examined for the presence of antibodies against S and R antigens of brucella. Using a rapid slide agglutination method, a positive reaction to the S antigen was observed in two samples, which is 1,96 percent of the total. Key words: brucellosis, serological monitoring, antibodies, blood serum, rapid agglutination

6 Драган Бокан Дипломски рад Садржај САДРЖАЈ 1.0. УВОД ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ СИСТЕМАТИКА РОДА МОРФОЛОШКЕ И КУЛТУРЕЛНЕ ОСОБИНЕ АНТИГЕНСКА ГРАЂА БРУЦЕЛОЗА ПАСА Етиологија Распрострањеност Трансмисија Патогенеза Клиничка слика Дијагностика Лечење ЦИЉ И ЗАДАЦИ ИСТРАЖИВАЊА ЦИЉ ИСТРАЖИВАЊА ЗАДАЦИ ИСТРАЖИВАЊА МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ ИСТРАЖИВАЊА МАТЕРИЈАЛ МЕТОДЕ РЕЗУЛТАТИ ДИСКУСИЈА ЗАКЉУЧАК ЛИТЕРАТУРА... 30

7 Драган Бокан Дипломски рад Увод 1.0. УВОД Бруцелоза је инфективна, контагиозна болест узрокована ситним бактеријама из рода бруцела. У питању је обољење светске дистрибуције које се примарно јавља код домаћих и дивљих животиња али се може пренети и на човека. Спада у групу веома опасних зооноза. Болест се најчешће јавља у хроничној форми и може трајати месецима, па и годинама. Осим опасности по здравље људи и животиња, значајна је и са економског аспекта јер наноси велике штете у сточарској производњи. За бруцелозу се може рећи да има карактеристике пандемије с обзиром да не постоји континент на коме није забележена епидемија ове болести код домаћих животиња. Ипак, медитеранска регија сматра се ендемским подручјем и местом на ком је болест присутна вековима уназад, пре свега у популацији коза и оваца. Хипократ је још у V веку п.н.е. описао обољење у својој књизи Епидемије. Етиологија бруцелозе остаје непозната све до друге половине XIX века када болест постаје актуелна на Малти, манифестујући се као медитеранска грозница, од које су обољевали искључиво људи. Након једног смртног случаја године, први пут је изолован и описан узрочник, Micrococcus melitensis (касније Brucella melitensis). Тек 20 година након изолације узрочника утврђено је да су извор обољења за човека биле козе, тј. некувано козје млеко. Медитеранска, малтешка, напуљска, ундулентна грозница, ензоотски аботрус, само су неки од синонима овог обољења животиња односно људи. Клиничка слика обољења је варијабилна у зависности од врсте животиње и обухвата појаву таласасте температуре, побачаје, запаљенске и друге промене на гениталним органима, вимену, зглобовима и тетивним овојницама. Негравидне животиње међутим често не показују симптоме болести и делују на изглед здраво што у многоме отежава правовремено откривање и лечење ове болести. Узимајући у обзир притом и зоонотски карактер обољења, дијагностика бруцелозе 1

8 Драган Бокан Дипломски рад Увод представља велики изазов, а поред епизоотиолошког има и епидемиолошки значај. Први случајеви бруцелозе паса у нашој држави забележени су године, налазом специфичних антитела против Brucella canis. Истраживања вршена у наредним годинама указала су на пораст преваленције антитела. Последња оваква студија рађена је године и од тада не постоје званични подаци о бруцелози паса на територији републике Србије. 2

9 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе 2.0. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2.1. СИСТЕМАТИКА РОДА Род Brucella припада фамилији Brucellaceae, реду Rhizobiales, класи Alpha- Proteobacteria. На основу примарних домаћина, биохемијских особина и генетичке структуре узрочника, установљено је да род садржи 6 врста [1]. 1. B. melitensis 2. B. abortus 3. B. suis 4. B. neotomae 5. B. canis 6. B. ovis Прве 4 врсте познате су као класичне бруцеле. Јединствена грађа ћелијског зида ових бактерија условљава бољу адаптираност на организам домаћина, чинећи их отпорнијим и патогенијим од осталих врста из овог рода. B. melitensis је прва позната врста из овог рода. Енглески војни лекар David Bruce и малтешки доктор Caruana-Scicluna су године, на Малти, успешно изоловали новог узрочника под првобитним називом Micrococcus melitensis [2]. Узрочник је изолован из слезине погинулог војника. Скоро 20 година било је потребно да се реши мистерија порекла болести да би коначно године, Themistocles Zammit, члан Комисије за медитеранску грозницу која је основана због тешке клиничке слике и утицаја ове болести на енглеске војнике, открио да је извор болести некувано млеко пореклом од коза. 3

10 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Примарни домаћини за B. melitensis су козе и овце мада и друге животиње, као што су говеда и свиње, а изузетно ретко и пси могу бити носиоци и показивати извесне клиничке симптоме. Они су случајни домаћини и не могу преносити узрочника унутар своје популације или на популацију других животињских врста, са изузетком говеда која могу пренети B. melitensis и на друге животиње. Деценију касније, године, дански ветеринар Бернхард Банг изоловао је нову врсту под називом Bacillus abortus [3] (касније Brucella abortus). Узрочник примарно изазива обољење говеда, бизона, лосова, али и друге животиње, попут оваца, свиња и паса могу бити случајни домаћини [4]. Ипак, његова трансмисија између ових животињских врста није уобичајена и сматра се да нема велику епизоотиолошку важност. Болест има више назива а један од њих је и Бангова болест, у част поменутог лекара. Примарни узрочник бруцелозе свиња, Brucella suis, изолована је године на подручју САД [5]. Осим домаћих и дивљих свиња, овај микроорганизам може инфицирати и говеда [6], док се случајеви обољења коза,оваца и паса [7] изузетно ретко дешавају. Последње откривена бруцела из групе класичних бруцела јесте B. neotomae. Изолована је године из пустињског пацова [8]. Једина је врста из ове групе која није патогена за човека. Остале три врсте могу да изазову озбиљно обољење код људи, поготово B. melitensis, која се сматра најпатогенијом од свих. Почетком друге половине 20. века, тачније године, изолована је B. ovis, нова врста јединствене грађе [9]. Узрочник је везан искључиво за овцу и нема другог домаћина. Уз B. neotomae, ово је једина врста из овог рода која није патогена за човека. Примарни узрочник бруцелозе паса, B. canis, изолована је и описана године, на подручју САД [10]. Опширније о узрочнику, као и о самом обољењу паса, биће говора у даљем тексту. Ова подела рода на 6 врста још увек је актуелна у делима многих аутора иако најновија истраживања указују на постојање већег броја врста. Велики број сојева изолован је из морских сисара и предложено је да они чине нову врсту под називом B. maris [11]. Новоизоловани сојеви бруцела су према молекулским и фенотипским карактеристикама године подељени у две нове врсте: B. ceti и B. pinnipedialis. Први су изоловани из китова а други из фока и морских лавова [12]. Наредних година откривене су B. microti, изолована из пољске волухарице 4

11 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе [13] и B. inopinata, изолована године из жене са инфекцијом грудног имплантата [14]. Најновија истраживања бележе још 2 врсте: B.vulpis и B. papionis, изоловане из лисице, односно бабуна. У табели 1. приказане су све врсте овог рода заједно са постојећим биоварима као и њихов зоонотски потенцјал. Табела 1. Систематика рода и природни домаћини одређених врста бруцела [15] Врсте Биовар/Серовар Природни домаћин Патогенe за човека Brucella abortus 1-6,9 Говече, бизон, буфало Да B.melitensis 1-3 Овца, коза Да 1,2,3 Свиња Да B.suis 2 4 Европски зец Јелен Да Да 5 Глодари Да B.canis / Пси, други месоједи Да B.ovis / Овца Не B.neotomae / Глодари Не B.pinnipediae B.ceti B.microti B.inopinata Фока Китови Волухарица Грудни имплант Да 5

12 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе 2.2. МОРФОЛОШКЕ И КУЛТУРЕЛНЕ ОСОБИНЕ Бактерије из рода Brucella спадају у ситне, непокретне и аспорогене Грам негативне микроорганизме. Облика су кокобацила, дужине 0,5-1,5 µm, ширине 0,5-0,7 µm. Најчешће се налазе појединачно распоређене, али могу формирати и парове, а некада и мање групе. Бруцеле не поседују капсулу (осим када се налазе у глаткој-s форми, што је могуће уочити применом електронске микроскопије). Бојење у црвено, осим по Граму, постиже се и модификованом методом по Ziehl- Neelsen-u [16]. Раст бактерија захтева аеробне и микроаерофилне услове а већина сојева захтева атмосферу са повећаном концентрацијом CO 2. За разлику од осталих аеробних микроорганизама, период примоизолације је прилично дуг, некада и до 14 дана, тако да се бруцеле генерално сматрају спорорастућим бактеријама, тешким и избирљивим за култивисање. Расту на обогаћеним хранљивим подлогама као што су крвни агар, серум декстрозни агар и триптоза агар. Одређене врсте захтевају додатак тиамина, никотинамида и биотина [16]. У циљу инхибиције непожељних микроорганизама некада је неопходно култивацију вршити на селективним подлогама као што је Фарелов медијум (триптоза агар + бацитрацин, натамицин, полимиксин Б и ванкомицин ). Оптимална температура за раст износи 37 C при вредности ph 6,8-7,2. Након 2-5 дана инкубације, уочавају се ситне, округле, прозирне и конвексне, беле до светло плаве колоније глатких ивица (слика 1). Ово је глатка (S) форма колоније и образују је класичне бруцеле у примарној изолацији. Временом, међутим колоније мењају облик и боју, постају жућкасте, храпаве, грубих ивица и губе прозирност, што одликује R форму колоније. B.canis и B. ovis примарно дају колоније изгледа R форме. Ова разлика у изгледу колонија класичних и осталих бруцела условљена је антигенском структуром ових бактерија. 6

13 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Слика 1. Изглед глатких колонија B. melitensis на крвном агару [17] 2.3. АНТИГЕНСКА ГРАЂА Ћелијски зид представља заштитни омотач бактеријске ћелије који јој даје облик и чврстину и штити је од неповољних спољашњих утицаја. Грам негативне бактерије имају комплексан ћелијски зид који се састоји из спољашње мембране, периплазматичног простора и муреина [18]. Спољашња мембрана представља прву заштитну баријеру и у њеној грађи учествују липополисахариди, липопротеини и порин протеини. Липополисахарид представља главни фактор вируленције бруцела, значајан за структурални и функционални интегритет спољашње мембране ћелијског зида. Његова полисахаридна компонента делује као површински антиген (соматски, О антиген), што је значајно у детерминацији бактерија, док липидни део представља ендотоксин (липид А). Површински антигени подстичу стварање хуморалног имунитета, па се користе у сврху испитивања истог. На слици 2. приказана је структура липополисахарида. 7

14 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Слика 2. Грађа липополисахарида [19] Заједничко за све класичне врсте бруцела, а пре свега за B. melitensis, B. abortus и B. suis јесте постојање комплетног S-LPS (липополисахарида), односно S површинског антигена. Захваљујући оваквој структури, наведене врсте имају високу вируленцију и инвазивну моћ, те поред примарних домаћина могу изазвати обољење и код других животиња. Полисахаридни ланац чине А и М антигени (епитопи) који су присутни у различитим количинама у зависности од бактеријске врсте (слика 3). Слика 3. Антигена структура S форми бруцела [20] 8

15 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе За разлику од класичне S форме, бруцеле се могу јавити и у R облику. Ове врсте (B. canis и B. ovis) показује неке јединствене карактеристике у односу на остале чланове, као што су изразита мукоидност и антигено промењен, некомплетан липополисахарид (R-LPS) који поседује R антигене [21]. Оваква грађа чини их мање патогеним у поређењу са осталим врстама, а уједно и мање инвазивним, тако да су уско везане само за једног домаћина без могућности ширења на друге животиње. На слици 4. приказана је разлика у структури S и R липополисахарида. Слика 4. Разлика у структури S и R LPS [22] 2.4 БРУЦЕЛОЗА ПАСА Етиологија Бруцелоза паса је контагиозно ланчасто обољење паса и дивљих месоједа изазвано бактеријом B. canis. Узрочник је први пут описан године у САД [10]. Наиме, у једној одгајивачници у месту Њу Џерзи (New Jersey) појавила се нова болест која се манифестовала абортусима куја и репродуктивним 9

16 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе поремећајима паса расе бигл. Обољење је попримало облик епизоотије и у периоду од само две године, оболело је више од 800 паса пореклом из више од 35 земаља САД. Тада је утврђено да расна предиспозиција није од значаја и да су све расе подједнако осетљиве. Пар година након тога, пријављен је и први случај инфекције код човека. Мачке, зечеви и човеколики примати сматрају се осетљивим само на експерименталну инфекцију [23]. Поред B. canis, која се сматра примарно одговорном и епизоотиолошки најважнијом врстом, у етиологији бруцелозе паса своје место пронашле су и већ поменуте класичне бруцеле, пре свега B. abortus, B. melitensis и B. suis [24]. Ове врсте су примарно патогене у S форми и као такве имају већу инвазивност па нису стриктно везане само за примарне домаћине. До природне инфекције долази након ингестије контаминираних побачених плаценти и побачених фетуса пореклом од стоке. Сматра се чак да и атенуирани сојеви B. melitensis и B. abortus могу инфицирати пса [23]. Иако се могу задржати у организму у току дужег временског периода, пас се не сматра домаћином важним за одржавањем и ширењем узрочника унутар своје популације Распрострањеност Бруцелоза паса представља космополитско обољење, присутно у многим земаља широм света (слика 5). Примарни узрочник, B. canis, за разлику од других врста бруцела није стриктно везан за одређено географско подручје и јавља се свуда где постоји природни домаћин [24]. Ипак, поједине земље, пре свега Мексико, као и земље Јужне и Централне Америке, бележе највећу учесталост обољења и сматрају се најугроженијим [25, 26]. Разлог овоме је велики број паса луталица и неорганизованост ветеринарских служби на овим просторима. У САД највиша преваленција болести уочена је на југу и југозападу. Посебно су погођене приватне одгајивачнице. 10

17 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Слика 5. Географска распрострањеност бруцелозе паса [27] Увозом инфицираних паса из ових земаља, бруцелоза се појавила у Словачкој, Јапану, Немачкој, Мадагаскару, Тунису [28]. Тестирањем паса из 8 одгајивачница у Турској, болест је потврђена у чак шест. Узрочник је изолован и у Румунији, Шведској, Шпанији, Француској са тенденцијом даљег ширења на европске земље. Обољење паса је пријављено у Русији и Кини. Аустралија и Нови Зеланд сматрају се слободним од бруцелозе [29]. У Србији су први серопозитивни случајеви дијагностиковани на подручју Старе Пазове године, а исте године изведена је и прва изолација B. canis [30]. У питању је био мужјак краткодлаког немачког птичара. Истраживања рађена у наредним годинама, пре свега на територији Београда, али и других градова само су потврдила присутност обољења и у Србији. Бруцелоза паса захтева спровођење сталног серолошког мониторинга у циљу раног откривања и ерадикације болести. Због чињенице да је у питању опасна зооноза, дијагностика овог обољења има, како епизоотиолошки, тако и епидемиолошки значај. Имајући у виду да на подручју Јужнобачког округа до сада нису рађена слична серолошка испитивања, намеће се потреба за истим. 11

18 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Трансмисија Пренос бруцелозе код паса одвија се на неколико начина. Заражене кује излучују узрочника B. canis током еструса, путем млека или преко побачених фетуса у контакту са оронзалном слузницом. Ово је најчешћи пут преноса с обзиром да побачени материјал садржи бакт. / ml. Излучивање се наставља до 6 недеља након абортуса. Млеко заражених куја садржи низак број бактерија и сматра се да је од мање важности на ширење узрочника на преживелу штенад. Већина њих је већ инфицирано интраутерино [23]. Мушке јединке преносе бруцеле спермом и урином, у којима се налазе узрочници пореклом из простате и епидидимиса. Проценат изолације из семена пса је обично висок у првих 6-8 недеља по инфекцији. Повремено излучивање у нижем проценту наставља се све до 60. недеље, а може потрајати и 2 године. Бактерије се могу наћи у урину 4-8 недеље од почетка бактеријемије. а излучивање путем мокраће траје минимум 3 месеца [31]. Урин мушких паса садржи бакт./ ml, што је мањи број него код женских јединки, али довољан да би се сматрао извором инфекције путем ороназалне слузнице. Овај начин преноса је вероватно у вези са локализацијом самог узрочника (простата и епидидимис), која је у блиској вези са мокраћном бешиком. Други начини преноса ретко се дешавају под природним условима. Фецес, носни и очни ексудат садрже низак број B. canis. Вештачки начин преноса инфекције забележен је приликом вагиноскопије, трансфузије крви, вештачког осемењавања, као и код коришћења контаминираних шприцева [23] Патогенеза До инфекције паса најчешће долази преко ороназалне мукозе, ређе преко вагиналне слузнице и коњуктива. Интактни епител представља добру заштиту од продора микроорганизама, међутим и најмање абразије, односно ерозије омогућавају улазак узрочника. Након продора у организам пса, узрочници бруцелозе бивају фагоцитовани од стране ткивних макрофага и других фагоцита, а затим се транспортују до регионалних лимфних чворова. За разлику од већине патогених бактерија, бруцеле немају класичне факторе вируленције попут капсуле, 12

19 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе егзотоксина, цитолизина и др. Са друге стране, поседују специфичан LPS који им омогућава интрацелуларно преживљавање у ћелијама макрофага и несметано размножавање. Бруцеле спречавају образовање фаголизозома и на тај начин супримирају функцију мијелопероксидазног система ћелије домаћина. Поред тога, инхибишу стварање TNF-α и ометају одговор NK ћелија [23]. Умножавање бактерија одиграва се у ендоплазматском ретикулуму. Након 1-4 недеље по инфекцији настаје бактеријемија која траје 6-36 месеци (некада и до 64 месеца). Тада долази до ширења процеса, генерализоване лимфоретикуларне хиперплазије и развоја хиперглобулинемије [23]. Као и код других интрацелуларних паразита, најважнији механизам одбране представља ћелијски посредован имунитет. Хуморални одговор у виду антитела нема превелику улогу у одбрани организма. За овакве инфекције карактеристичан је перзистентни титар незаштитних антитела која по свему судећи не утичу на ниво бактеријемије или број узрочника у ткиву. Хуморални одговор примарно се јавља у виду IgM и то већ током прве недеље по инфекцији. Упоредо са тим долази и до синтезе IgG који након друге недеље постају доминантна фракција антитела у циркулацији. Највећи број бактерија налази се у лимфним чворовима, слезини и репродуктивном тракту. Гравидни утерус идеално је место за раст и размножавање бруцела зато што садржи полихидроксилни алкохол еритритол. Он представља добар медијум за развој узрочника и налази се у плаценти кује. Код мушких јединки, бруцеле насељавају макрофаге и епителне ћелије у тестисима, пасеменику и простати. Умножавањем и разарањем епитела простате, B. canis доспева у лумен жлезде и доводи до аглутинације сперматозоида, која се може доказати у семеној течности, урину и семеводу. Овако слепљени и исталожени сперматозоиди активирају имуни систем, доводећи до стварања антиспермалних антитела [32] и развоја хиперсензитивне реакције одложеног типа. Овакав имуни одговор доприноси настанку епидидимитиса, неплодности и може да заустави сперматогенезу код већине инфицираних мужјака [23]. На шеми 1. приказана је патогенеза обољења код пса. 13

20 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Шема 1. Патогенеза бруцелозе код паса [23] Осим гениталног тракта, и други органи, као што су интервертебрални дискуси (дискоспондилитис), очи (увеитис), бубрези (гломерулонефритис) и менинге (менингоенцефалитис) могу бити инфицирани и развити запаљење Клиничка слика Бруцелоза паса је хронично обољење које се одликује варијабилним периодом инкубације. Иако је у питању мултисистемска болест, одрасли пси веома ретко обољевају у тежем облику. Клиничка слика обољења је често нејасна. Повишена телесна температура може да се јави, али није уобичајена. Сува длака без сјаја, губитак енергије и летаргија неки су од неспецифичних симптома овог обољења. Негравидне кује не показују знаке осим отока и увећања лимфних чворова, што је карактеристично за оба пола. Код полно зрелих животиња болест се манифестује променама на репродуктивним органима. Кује обично побаце између дана гестације. 14

21 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Плодови су делимично аутолизирани, са поткожним едемима. Абортус се често превиди јер кује могу да поједу побачен материјал. Присутан је браон до зеленкаст вагинални исцедак који се задржава још 1-6 недеља. Поред абортуса, јавља се и поремећај у концепцији плода након наводно успешног парења. Много ређе дешава се да мајка, носећи инфициране кучиће, оштени и живе и мртве у једном леглу. Они су авитални, већином угињавају у првим часовима или данима, а ако преживе, развијају генерализовану периферну лимфаденомегалију као основни знак све до постизања полне зрелости. Уз то, кучићи обично имају перзистентну хиперглобулинемију, леукоцитозу и пролазну грозницу. Мужјаци делују здраво, а најизраженије промене јављају се у виду увећања скротума, као резултат накупљања серохеморагичног ексудата. Пас константно лиже ову регију, па тако може доћи до скроталног дерматитиса као последице секундарних бактеријских инфекција. Треба истаћи да је примарни разлог отока скротума увећање репа пасеменика (слика 6). Примарно тестикуларно увећање односно орхитис ређе се јавља, а код већине оболелих паса обично се развија унилатерална до билатерална атрофија тестиса. Палпацијом тестиса не провоцира се бол, али се може приметити нелагодност код пса у фази ејакулације. Количина ејакулата је смањена док је либидо углавном непромењен. Осим репродуктивних, бруцеле могу изазвати и низ других компликација у зависности од места локализације. У случају дискоспондилитиса јавља се бол у пределу кичме док се атаксија и пареза екстремитета развијају услед компресије кичмене мождине. Отежано кретање јавља се и у случају полиартритиса, односно остеомијелитиса. Запаљење мозга и можданих овојница изузуетно је редак случај код паса и манифестује се променама у понашању, атаксијом, хиперестезијом, кретањем у круг и др [23, 29]. 15

22 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Слика 6. Увећање репа пасеменика (cauda epidydimis) [23] Опис: Лево-тестис инфицираног пса; десно-нормалан тестис Дијагностика Дијагностиковање бруцелозе код паса проблематично је из више разлога. Непотпуни епизоотиолошки подаци и неспецифични симптоми обољења у многоме отежавају откривање инфицираних јединки. Имајући притом у виду и зоонотски потенцијал узрочника, јасно је да су рано откривање и ерадикација обољења од изузетне важности како за здравље животиња, тако и за здравље људи [24]. У ту сврху, серолошка дијагностика представља најчешће коришћену методу и базира се на детекцији специфичних антитела уз коришћење познатих антигена бруцела. Упркос бактеријемији која је присутна од друге недеље по инфекцији, серолошки резултати добијени већином серолошких метода негативни су првих 3-4 недеље. Тек након осме недеље, титар антитела се повећава и она се могу детектовати већином серолошких тестова. Антигени који се користе у овим тестовима најчешће су делови ћелијског зида бактерија (LPS). Предности и мане појединих тестова, као и њихова ограничења приказани су у табели 2. 16

23 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Табела 2. Поређење најчешће коришћених серолошких тестова за рану дијагностику бруцелозе паса [23] Серолошки тест Методе детекције Антитела Брза аглутинација на плочици са МЕ Употребљени антигени Најранија детекција антитела након инфекције (недеље) Предности Ћелијски зид 3-4 Брз, висока осетљивост, мали број лажно-негативних налаза Спора аглутинација Ћелијски зид 3-6 Семиквантитативна метода Ћелијски зид 5-8 Семиквантитативна Спора аглутинација са метода повећане МЕ специфичности Агар-гел имунодифузија Индиректна имунофлуоресценција ELISA Недостаци Чести лажнопозитивни налази, обавезна потврда другим тестовима Лажно-позитивни резултати Дужина трајања теста Ћелијски зид 5-10 Висока осетљивост Извођење и тумачење теста сложено, ниска специфичност Цитоплазматски протеини 8-12 Тест највише специфичности, детектује хроничне случајеве Ћелијски зид непознато Погодан и приступачан за лабораторијску дијагностику Ћелијски зид / цитоплазматски протеини непознато Поуздани налази антитела на спољашње антигене ћелијског зида B. canis, односно на цитоплазматске протеине B. abortus Сложена процедура, тест најниже осетљивости, позитиван и годину дана након опоравка Ниска осетљивост, није широко прихваћен Чистоћа и припрема антигена критична Резултати тестова, осим потвде присуства или одсуства антитела, могу бити и квантитативне природе и подразумевају одређивање титра антитела у испитујућем серуму. Титар 1:50 указује или на рану тренутну инфекцију или на претходну болест и захтева понављање теста. Вредности од 1:50 до 1:100 су сумњиве на ннфекцију док титри 1:200 и већи, представљају сигуран знак активне инфекције бруцелама. Код мужјака, бруцела може бити локализована у простати и епидидимису дужи временски период, након бактеријемије. У таквим случајевима титар 17

24 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе антитела опада и даје лажно негативан налаз. Код куја се јавља пролазна бактеријемија и повећање титра антитела током проеструса, еструса, гравидитета и абортуса, чинећи овај период поузданим за тестирање. Лечење антибиотицима такође може утицати на резултате узрокујући лажно негативан резултат. Разлог је супресија бактеријемије односно имуног одговора домаћина. Зато лечење не би требало започињати све док се не обаве сви дијагностички тестови. Најсигурнији начин постављања дијагнозе било ког бактеријског обољења јесте директно доказивање узрочника. Ово се постиже култивисањем бактерија на подлогама и прављењем микроскопског размаза. Испитујући материјал представљају ткива побаченног фетуса, вагинални исцедак, крв, урин, узорци млечне жлезде, лимфних чворова и полних органа. Ови узорци који се шаљу у лабораторију могу садржати велики број бактерија те ова испитивања захтевају велики опрез, специјалне услове за рад, време и висок степен обучености с обзиром на професионални карактер обољења. Према овим критеријумима бруцела је сврстана у III групу ризика [16]. Из наведених разлога, ове методе се користе само код животиња сумњивих на бруцелозу док у рутинској дијагностици односно мониторингу обољења немају велику примену. Хематолошки и биохемијски налази већином су непромењени односно неспецифични за ово обољење. Хиперглобулинемија (бета и гама), са истовременом хипоалбуминемијом најчешћи је налаз код хронично инфицираних паса. Резултати анализе цереброспиналне течности указују на плеоцитозу, пре свега са доминацијом неутрофила. Узорковањем увећаних лимфних чворова обично се установи лимфоидна хиперплазија са великим бројем плазма ћелија [23]. Испитивањем семена, почевши од пете недеље по инфекцији могу се увидети бројне абнормалности по питању грађе и облика сперматозоида. Акрозоми су деформисани, средњи део сперматозоида је проширен, долази до савијања репа и на крају до одвајања главе. Велики број инфламаторних ћелија, пре свега неутрофила, окружују макрофаге који садрже фагоцитоване сперматозоиде. До 20-те недеље, више од 90 процената сперматозоида је промењеног облика. 18

25 Драган Бокан Дипломски рад Преглед литературе Лечење Имајући у виду да су узрочници бруцелозе интрацелуларни патогени који вероватно доживотно остају локализовани у организму домаћина, исход терапије бруцелозе је врло неизвестан. Код кућних паса примењује се антибиотско лечење у комбинацији са стерилизацијом односно кастрацијом животиња. Бруцеле су осетљиве на поједине антибиотике, али ни један третман не гарантује потпуно излечење, поготово ако се користи само један антибиотик. За што бољи исход потребна је комбинација терапеутика, а као најбоља показала се примена тетрациклинских антибиотика (тетрациклин хидрохлорид, доксициклин, миноцилин и стрептомицин) [24]. Терапија траје 4 недеље, а успешност се прати серолошким тестирањем и поновљеним хемокултурама након завршетка терапије. Међутим, и поред оваквог третмана врло често долази до поновљених епизода бактеријемије и ширења узрочника до циљних органа као што су тестиси, епидидимис и утерус. Решење је хируршко уклањање ових ткива (кастрација или оварихистеректомија). На овај начин се у великој мери смањује трансмисија узрочниика међу популацијом паса. Како антибиотска терапија може да буде скупа, неизвесна и дуга, најчешће се не примењује у комерцијалним одгајивачницама. Сумњиви пси се тестирају и у случају позитивног налаза искључују се из приплода. Уколико показују клиничке симптоме бруцелозе индикована је еутаназија. Превентивне мере најзначајније су у спречавању појаве и ширења бруцелозе. Њихова примена је од велике важности пре свега у великим одгајивачницама паса и састоји се из редовног серолошког тестирања свих паса, карантинирања увежених паса док им се не утврди серолошки статус, дезинфекције и др. Решавање проблема паса луталица тј. њихова контрола и мониторинг смањују циркулацију узрочника међу овом популацијом. 19

26 Бокан Драган Дипломски рад Циљ и задаци истраживања 3.0. ЦИЉ И ЗАДАЦИ ИСТРАЖИВАЊА 3.1. ЦИЉ ИСТРАЖИВАЊА На основу прегледа литературе и досадашњих истраживања у Србији, постављени су следећи циљеви: 1. да се испита присуство антитела на R и S антигене бруцела у крвним...,,,серумима паса са подручја Јужннобачког округа 2. да се израчуна преваленција антитела на R и S антигене бруцела код паса 3.2. ЗАДАЦИ ИСТРАЖИВАЊА Ради извођења истраживања, постављени су следећи задаци: 1. да се одреди величина узорка 2. да се насумично одаберу крвни серуми паса 3. да се изведе тест брзе аглутинације на плочици са R и S антигенима бруцела 4. да се израчуна серопреваленција бруцелозе код паса на R и S антигене nnn].бруцела 20

27 Бокан Драган Дипломски рад Материјал и методе 4.0. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ ИСТРАЖИВАЊА 4.1. МАТЕРИЈАЛ Истраживање је изведено са насумично одабраним крвним серумима, из банке серума, од 102 улична пса са подручја Јужнобачког округа (Нови Сад, Ђурђево и Бечеј). Број серума је одређен применом OpenEpi софтвера (Dean AG, Sullivan KM, Soe MM. OpenEpi: Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health, Version. updated 2013/04/06, accessed 2017/11/14) на основу претпостављеног броја уличних паса од 4000 са очекиваном серопреваленцијом од 7% и интервалом поверења од 95% МЕТОДЕ Испитивање серума паса вршено је методом брзе аглутинације на плочици. Реч је о квалитативном дијагностичком поступку у којем се познатим антигенима бруцела врло једноставно и брзо могу идентификовати специфична антитела у испитујућем крвном серуму. У случају позитивне реакције, антитела, најчешће IgG и IgM, унакрсно се везују за одговарајуће антигене, скупљајући их у крпице (аглутинате) који се примећују голим оком или под микроскопом (слика 7). У случају одсуства антитела, не долази до аглутинације и реакција је хомогеног изгледа, једнако замућена. За доказивање присуства специфичних антитела у серуму паса коришћена су два типа антигена: S антигени B. abortus и R хомотипски антигени B. canis [21]. 21

28 Бокан Драган Дипломски рад Материјал и методе Слика 7. Приказ реакције аглутинације [32] За доказивање класичних S бруцела користи се антиген Brucella abortus (BAB тест). Интернационални назив је Rose Bengal тест, који се користи у рутинској дијагностици бруцелозе изазване искључиво класичним врстама бруцела (слика 8). Слика 8. Rose Bengal тест, Опис: Поље 1- позитивна контрола; поље 2-негативна контрола; остала поља-негативни налази испитујућих серума 22

29 Бокан Драган Дипломски рад Материјал и методе Дијагностички тест кит садржи: 1. Rose Bengal антиген (инактивисана и пуферисана суспензија B. abortus биовар 1 Weybridge сој 99 обојена са rose bengal бојом) 2. Позитивна контрола ( B. abortus позитиван контролни серум) 3. Негативна контрола ( B. abortus негативан контролни серум) Уз ове основне компоненте, комплет садржи и плочице (картице), штапиће као и наставке за пипету. Пре почетка извођења реакције потребно је благо измешати/промућкати све бочице са реагенсима. Оптимална амбијентална температура износи 22 С. Картица на којој се врши тестирање има укупно 6 тест поља у виду кружића, што значи да се максимално 6 узорака серума може испитати истовремено. Притом, ради сигурне интерпретације резултата потребно је на свакој картици поставити позитивну и негативну пробу што оставља места за 4 узорка. Имајући у виду велики број серума и потребу да се сваки од њих испита на 2 антигена, тест брзе аглутинације рађен је на већим стакленим плочама. На једној од њих вршено је испитивање присуства антитела на S антигене класичних бруцела док је друга служила за претрагу антитела створених на R антигене B. canis. По једна кап испитујућих серума, запремине 30µl пренесе се пипетом на сваку од плоча. Да би се спречила унакрсна контаминација, обавезно је сваки пут коришћење новог наставка за пипету. Након тога, у истој количини (30µl) додају се познати антигени, B. abortus на серуме на првој а B. canis на серуме на другој плочи. Користећи штапиће, потребно је што пре измешати ове реагенсе, водећи опет рачуна о унакрсној контаминацији. Плочу затим треба полако и равномерно ротирати кружним покретима током 4 минута а затим очитати резултате теста. 23

30 Драган Бокан Дипломски рад Резултати 5.0. РЕЗУЛТАТИ Након одрађеног серолошког испитивања 102 крвна серума, пореклом од уличних паса са подручја Јужнобачког округа (Нови Сад, Ђурђево и Бечеј) методом брзе аглутинације на плочици, дошло се до следећих резултата: Позитивна реакција у виду аглутинације забележена је код 2 узорка крвног серума што чини 1,96% од укупног броја тестираних серума (слика 9). Оба узорка била су позитивна на S антигене B. abortus. Сви серуми испитани на R хомотипске антигене B. canis били су негативни. Слика 9. Позитивна реакција аглутинације на класичне S бруцеле (оком видљиви аглутинати) 24

31 Драган Бокан Дипломски рад Дискусија 6.0. ДИСКУСИЈА Применом серолошке реакције брзе аглутинације на плочици (BAB тест), у овом истраживању доказана су 2 серопозитивна пса на S антигене B. abortus, са подручја Ђурђева, односно Бечеја. Анамнестички подаци, као и евентуална клиничка слика узоркованих паса нису били познати. Истраживања на ову тему актуелна су у свету годинама уназад. На могућност инфекције паса класичним врстама бруцела, пре свега B. abortus и B. suis посумњало се већ средином друге половине 20. века, када су и забележени први покушаји изолације B. abortus [33, 34]. У истраживању рађеном године, крвни серум пса са значајно увећаним левим епидидимисом испитан је брзим аглутинацијским тестом на B. abortus и добијени резултат био је позитиван. Након угинућа пса, из простате и епидидимиса изолована је B. suis биотип 1 [35]. Хоризонтални пренос узрочника B. abortus између говечета и пса, пса и пса као и између пса и човека доказан је године у склопу истраживања рађеног у Канади. Применом стандардног аглутинацијског теста (SAT), од укупно 14 фармских паса који су тестирани више пута током дужег периода, њих 10 је било серопозитивно на B. abortus биовар 4, са титрима 1:50 до 1:200 или више [36]. Овако висока преваленција од 71,4% није меродаван податак с обзиром да су пси потицали са фарми бруцелозних говеда. Током године, испитивање серолошког одговора на B. abortus спроведено је и у Нигерији и обухватило је 366 кућних паса. Употребом Rose Bengal теста дошло се до следећих резултата: 20 од 366 (5,46%) паса било је серопозитивно на B. abortus [37]. Из анамнестичких података дошло се до сазнања да је 36 од укупног броја паса било храњено побаченим материјалом крава а RB тестом је инфекција потврђена код њих 11 ( 30,6%). Серопреваленција код паса луталица са руралног подручја Ирака, испитаних RB тестом и техником индиректне ELISA била је изразито висока, 28,89%, односно 39,26% на узорку од 135 паса [38]. 25

32 Драган Бокан Дипломски рад Дискусија Најновија истраживања на овом пољу указују на озбиљност ситуације и све већи број земаља у којима се по први пут из популације паса изолују класичне врсте бруцела. Такво једно истраживање, вршено је године, на фарми говеда у Египту. Серолошка испитивања вршена SAT методом потврдила су присуство специфичних антитела на B. abortus биовар 1 што је први случај серопозитивног пса у Египту [39]. Осим тога, истовремено је на фарми идентификована и серопозитивна мачка, што је први овакав случај уопште. У Србији, прво испитивање серопреваленције код паса на класичне бруцеле урађено је године, на територији општине Пожаревац. Том приликом није доказан ни један серопозитиван случај [40]. Вредност серопреваленције у нашем истраживању износила је 1,96%. Међутим, важно је истаћи да на њено утврђивање у великој мери утиче начин тестирања и интерпретација резултата. Употребом BAB теста који има високу осетљивост а ниску специфичност јавља се могућност појаве лажно позитивних налаза. Из тог разлога потребно је ове налазе проверити другим серолошким тестовима (аглутинација на плочици са додатком 2-меркаптоетанола, спора серумска аглутинација у епрувети са или без 2-меркаптоетанола, AGID и ELISA). Употреба 2-меркаптоетанола често се препоручује у циљу повећања специфичности реакције. Разарањем дисулфидне везе у IgM, 2-ME редукује концентрацију ових имуноглобулина који су најчешћи разлог лажно позитивних реакција. Испитивањем серолошког одговора на R антигене B. canis, применом брзог аглутинацијског теста, у нашем истраживању није запажена ниједна позитивна реакција. Сви серуми паса са подручја Јужнобачког округа били су серонегативни. Бруцелоза паса узрокована B. canis присутна је у већини земаља света. Вредности серопреваленције посебно су високе у јужним деловима САД, Мексику и Јужној Америци. Истраживање рађено у савезној држави Џорџији године указало је на високу серопреваленцију од 9% [41]. Годину касније, у Мексику године, на узорку од 59 паса луталица доказано је 7 серопозитивних ( 11,8%) методом SAT скрининг теста [42], док је у Мемфису серопреваленца износила 10% [26]. Осим у популацији уличних паса, обољење је у великој мери присутно у приватним одгајивачницама, поготово у САД. У једном од најугроженијих подручја у Аргентини, граду Морену, по 26

33 Драган Бокан Дипломски рад Дискусија истраживањима рађеним године забележена је екстремно висока серопреваленција од 30,5% [43]. Испитивања вршена последњих година и даље указују на висок проценат серопозитивних паса. Током године, у Буенос Ајресу тестирана су 224 улична пса брзим аглутинацијским тестом. Позитиван налаз уочен је у 33 случаја (14,7%), док је индиректном ЕLISA техником потврђена серопреваленција код 24 пса [44]. Једно од најмасовнијих истраживања на овом пољу одрађено је године у Бразилу. У њему је учествовало укупно 753 пса, пореклом из 38 приватних одгајивачница са подручја Сао Паула. Резултати су били забрињавајући. Од 38 одгајивачница, у њих 16 постојао је бар један пас са изолованом B. canis (42,1%), а серопреваленца у свакој од њих износила је од 3,8%-62,6%. Више од 20% паса имало је изражен бар један клинички знак бруцелозе. Сматра се да ниједна одгајивачница није спроводила програм контроле бруцелозе а продаја заражених паса била је уобичајена пракса [45]. На територији Србије, прво серолошко испитивање изведено је године на подручју Београда. На узорку од 164 пса познатих власника, преваленција антитела против B. canis износила је 4,27% [46]. Прво испитивање паса луталица, такође на територији Београда, завршено је године. Реакцијом споре аглутинације у епрувети са додатком 2-МЕ откривено је 10,87% сигурно позитивних (титар 1:200) и 26,63% сумњивих паса (титар 1:50) што представља необично велику разлику [21]. Исте године, на територији града Пожаревца испитано је присуство инфекције са B. canis код 151 пса. Од тога, 77 паса били су луталице а 74 је имало власника. Позитиван резултат употребом брзог аглутинацијског теста дало је 16,55% односно 25 паса. Потврдним тестом споре аглутинације у епрувети доказано је 17 серопозитивних паса што је износило 11,25% од укупног броја [40]. Последње велико истраживања на подручју Београда обухватило је 313 паса. Већи број, њих 193 били су пси познатих власника. Током седмогодишњег испитивања које је завршено године, добијени резултати су указали на висок ниво преваленције од 15%. Осталих 120 паса луталица тестирани су у току једне године и 6,67% њих показивало је позитивну реакцију [47]. Необично велика преваленција у првом случају последица је намерног одабира узорка и није од великог значаја за ово истраживање. Ови пси већ су показивали клиничке знаке 27

34 Драган Бокан Дипломски рад Дискусија бруцелозе па је самим тим и вероватноћа позитивних резултата код њих била већа. Приликом испитивања серолошког одговора на B. canis, добијене вредности у великој мери зависе од начина тестирања. B. canis дели R- антигенску структуру са неколико других микроорганизама као што су Yersinia enterocolitica, Francisella sp, Pseudomonas sp. Из тог разлога, примена аглутинацијских тестова који се заснивају на детекцији антитела на R спољашње антигене, доводи до могућих унакрсних реакција, односно добијања лажно позитивних резултата. Како серолошка дијагностика бруцелозе паса није јасно дефинисана у погледу стандардизације тестова, тако добијени резултати не могу се интерпретирати на исти начин. Зато се за поређење тестова користи kappa статистичка анализа. 28

35 Драган Бокан Дипломски рад Закључак 7.0. ЗАКЉУЧАК На основу спроведеног истраживања може да се закључи следеће: 1. није доказана серопозитивност паса на R антигене бруцела 2. утврђена је преваленција антитела на S антигене бруцела код паса са подручја Јужнобачког округа од 1,96% 3. резултати овог истраживања, иако добијени искључиво методом брзе аглутинације на плочици услед чега се не могу сматрати и дефинитивним, представљају важан податак и основу за будућа истраживања 29

36 Драган Бокан Дипломски рад Литература 8.0. ЛИТЕРАТУРА 1. VERGER, JEAN-MICHEL, et al. Brucella, a monospecific genus as shown by deoxyribonucleic acid hybridization. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1985, 35.3: NIELSEN, Klaus; DUNCAN, J. Robert. Animal brucellosis. CRC press, BANG, B. The etiology of epizootic abortion. Journal of Comparative Pathology and Therapeutics, 1897, 10: 125-IN2. 4. NICOLETTI, P. Brucellosis in animals. In: Madkour s Brucellosis. Springer, Berlin, Heidelberg, p TRAUM, J. Report of the Chief of the Bureau of Animal Industry. USDA. Washington, DC, 1914, FORBES, Lorry B.; TESSARO, Stacy V. Evaluation of cattle for experimental infection with and transmission of Brucella suis biovar 4. Journal of the American Veterinary Medical Association, 2003, 222.9: RAMAMOORTHY, Sheela, et al. Brucella suis infection in dogs, Georgia, USA. Emerging infectious diseases, 2011, 17.12: STOENNER, H. G.; LACKMAN, D. B. A new species of Brucella isolated from the desert wood rat, Neotoma lepida Thomas. American journal of veterinary research, 1957, 18.69: MCFARLANE, Davld, et al. Investigation into sheep abortion in New Zealand during the 1950 lambing season. Australian Veterinary Journal, 1952, 28.9: CARMICHAEL, L. E. Abortions in 200 beagles. J Am Vet Med Assoc, 1966, 149: JAHANS, K. L.; FOSTER, G.; BROUGHTON, E. S. The characterisation of Brucella strains isolated from marine mammals. Veterinary microbiology, 1997, 57.4: FOSTER, Geoffrey, et al. Brucella ceti sp. nov. and Brucella pinnipedialis sp. nov. for Brucella strains with cetaceans and seals as their preferred hosts. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2007, 57.11:

37 Драган Бокан Дипломски рад Литература 13. SCHOLZ, Holger C., et al. Brucella microti sp. nov., isolated from the common vole Microtus arvalis. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2008, 58.2: SCHOLZ, Holger C., et al. Brucella inopinata sp. nov., isolated from a breast implant infection. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2010, 60.4: YOUNG, Edward J. Brucella spp. Gillepsie SH, Hawkey PM. Principles and practice of clinical bacteriology, 2006, 2: VIDIĈ, Branka., Genus Brucella, Laloševic Vesna: Mikrobiologija za studente veterinarske medicine, 2011, 5: JARAK, Mirjana., Opšta bakteriologija, Lalošević Vesna: Mikrobiologija za studente veterinarske medicine, 2011, 1: RADOJIĈIĆ, S., et al. Ispitivanje prevalencije antitela na B. canis kod pasa lutalica na teritoriji grada Beograda. Veterinarski glasnik, 2006, : The-lipid-A-moiety-consist-of-two-parts-a_fig1_ GREENE, Craig E. Infectious Diseases of the Dog and Cat-E-Book. Elsevier Health Sciences, RADOJIĈIĆ, Sonja. Bruceloza pasa: Epizootiološke karakteristike, dijagnostika, terapija i kontrola bolesti. Veterinarski glasnik, 2006, : LUCERO, N. E., et al. Brucella isolated in humans and animals in Latin America from 1968 to Epidemiology & Infection, 2008, 136.4: LOVEJOY, George S., et al. Serosurvey of dogs for Brucella canis infection in Memphis, Tennessee. American journal of public health, 1976, 66.2: CARMICHAEL, L. E. Brucellosis (Brucella canis)[dogs, humans]. CRC handbook series in zoonoses, GREENE CE, Carmichael LE. Canine brucellosis. In: Greene, CE (Ed.), Infectious diseases of the dog and cat. (3 rd Edn.), 2006, Philadelphia, W. B. Saunders Co., RADOJIĈIĆ, S.; LAKO, B.; VALĈIĆ, M. Bruceloza pasa-stanje i mogućnost praćenja trenutne epizootiološke slike. u: I jugoslovenski epizootiološki dani, oktobra. Žabljak, Zbornik radova, 1999,

38 Драган Бокан Дипломски рад Литература 31. SERIKAWA, T., et al. Significance of urine-culture for detecting infection with Brucella canis in dogs. Japanese Journal of Veterinary Science (Japan), SALEM, A.; HAMED, O.; ABDEL-KARIM, A. Studies on some Brucella carriers in Egypt. Assiut Vet. Med. J, 1974, 1: PRIOR, M. G. Isolation of brucella abortus from two dogs in contact with bovine brucellosis. Canadian journal of comparative medicine, 1976, 40.1: BARR, S. C., et al. Brucella suis biotype 1 infection in a dog. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1986, 189.6: FORBES, L. B. Brucella abortus infection in 14 farm dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1990, 196.6: CADMUS, S. I. B., et al. Seroprevalence of Brucella abortus and B. canis in household dogs in southwestern Nigeria: a preliminary report. Journal of the South African Veterinary Association, 2011, 82.1: ALI, S. A. Brucella abortus Detection by Indirect Competitive ELISA and Rose-bengal tests in Stray Dogs of Some Rural Areas in Wasit, Al-Qadisiyah and Dhi-Qar Provinces-Iraq. Sci. J. Med. Res, 2017, 1.2: WARETH, G., et al. Isolation of brucella abortus from a Dog and a Cat Confirms their Biological Role in Re emergence and Dissemination of Bovine Brucellosis on Dairy Farms. Transboundary and emerging diseases, 2017, ŽIVOJINOVIĆ, S., et al. Ispitivanje rasprostranjenosti bruceloze pasa izazvane bakterijom Brucella canis na teritoriji opštine Požarevac. Veterinarski glasnik, 2006, : BROWN, J., et al. A serologic survey of a population of Georgia dogs for Brucella canis and an evaluation of the slide agglutination test. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1976, : FLORES-CASTRO, R., et al. Canine brucellosis: bacteriological and serological investigation of naturally infected dogs in Mexico City. Journal of clinical microbiology, 1977, 6.6: MYERS, Donald M.; VARELA-DIAZ, Victor M. Serological and bacteriological detection of Brucella canis infection of stray dogs in Moreno, Argentina. The Cornell veterinarian, 1980, 70.3: LÓPEZ, G., et al. A serological and bacteriological survey of dogs to detect Brucella infection in Lomas de Zamora, Buenos Aires province. Rev Argent Microbiol, 2009, 41.2: KEID, L. B., et al. Brucella canis infection in dogs from commercial breeding kennels in Brazil. Transboundary and emerging diseases, 2017, 64.3: