BAZE CONCEPTUALE SI ACTUALITATI IN INTERPRETAREA VARIATIILOR PATOLOGICE ALE ENZIMELOR SERICE Prof. Dr. LILIANA FOIA si colaboratorii UMF GR. T. POPA IASI
TEMATICA ABORDATA Concepte de bază privind activitatea şi specificitatea enzimatică Bazele biochimice si fiziopatologice ale diagnosticului enzimatic Valoarea diagnostica si limitele determinarii profilului enzimatic Utilitatea determinarilor enzimatice si evaluarea critica a comportamentului enzimelor in afectiunile hepatice si miocardice
CURS 1 Concepte de bază privind activitatea şi specificitatea enzimatică Bazele biochimice şi fiziopatologice ale diagnosticului enzimatic
INTRODUCERE Preocuparea principala a oamenilor de stiinta aflati in slujba sanatatii populatiei o reprezinta 2 obiective majore : 1. intelegerea si mentinerea starii de sanatate 2. intelegerea si tratamentul efectiv al starii de boala Interrelatia Biochimie-Medicina se poate descrie ca o cale in ambele sensuri. Progresele in biochimie au putut releva si ilumina arii intregi din medicina si invers, adeseori studierea bolilor a condus la relevarea unor noi aspecte biochimice care anterior nu fusesera prospectate. Utilizarea rationala a variatelor teste de laborator este o componenta integrala in diagnosticul si tratamentul bolilor.
Reactiile enzimatice au fost folosite din timpurile cele mai vechi pentru fabricarea vinului, a otetului, a berii si a branzei. O cercetare sistematica a lor a fost intreprinsa abia in epoca moderna. In 1713, Réaumur a observat dizolvarea carnii in sucul stomacal al ciorii Lavoisier (1789) - bilant de materiale al fermentatiei: O, H, C din zahar se regasesc in alcoolul si CO2 ce iau nastere. Continuarea acestor idei a condus la ecuatia lui Gay-Lussac a fermentatiei alcoolice. Lucrarile lui Pasteur - deosebire intre fermentii formati sau figurati presupusi legati inseparabil de anumite elemente din celule sau chiar considerati identici cu celula vie, si fermenti neformati sau solubili, de tipul acelora din sucurile digestive sau din extractele apoase ale diferitelor materiale biologice. Fermentii neformati sunt deci substante care isi exercita actiunea si in afara celulei vii. Termenul enzima, pentru a desemna fermentii neformati, a fost introdus de Kühne, in 1878.
Buchner (1897) a izolat din drojdia de bere un suc liber de orice celula si totusi capabil sa provoace fermentatia. Acest suc contine deci o enzima pe care Buchner a numit-o zimaza. Aceasta este de fapt un amestec de mai multe enzime (s-a dovedit mai tarziu) In urma acestor descoperiri, deosebirea dintre termenii ferment si enzima a pierdut semnificatia sa. In cursul secolului al XIX-lea, au fost preparate multe extracte de enzime. 1820 - Kirchoff a observat ca o componenta glutinoasa din bobul de orez incoltit, numit malt, transforma cantitati de amidon mult mai mari decat propria sa greutate, intr-un zahar solubil, maltoza.
1830 - Dubrunfaut - extractul apos, limpede, de malt are aceeasi actiune solubilizanta asupra amidonului ca maltul insusi. Din acest extract, Payen si Persoz (1833) au izolat prin precipitare cu etanol, amilaza, sub forma unui material solid alb, amorf, capabil sa solubilizeze o cantitate de amidon de 2000 de ori mai mare decat propria sa greutate Printre primele enzime izolate - pepsina (Schwann, 1836); tripsina (Kühne, 1848); lipaza (Claude Bernard, 1849); ureeaza (Musculus, 1882). Berzelius 1835 - moment istoric - recunoasterea clara a caracterului catalitic al reactiilor enzimatice, precum si a rolului esential pentru viata animalelor si a plantelor jucat de aceste reactii.
Generalitati Enzimele sunt catalizatori biochimici propriu-zisi, asadar sunt compusi care maresc viteza reactiilor chimice ce se desfasoara in sistemele biologice, fara sa se consume in cursul lor. Enzimologia constituie studiul bazelor moleculare ale vietii. Enzimele sunt probabil mai importante decat orice alt element activ ca ajutor al digestiei si sanatatii. Pana acum s- a aratat ca sute de enzime au un rol vital in construirea sanatatii, datorita contributiei lor la procesul de digestie. Studiile viitoare probabil vor arata ca enzimele au un rol mult mai important pentru sanatate decat se cunoaste in prezent.
Viata fara enzime? Ele functioneaza ca un catalizator care face ca celulele corpului sa functioneze eficient. Din momentul nasterii, enzimele fac viata posibila prin actiunile lor, reparand si construind structurile organismului. Enzimele reprezinta insasi forta intangibila a vietii. Omul nu poate reusi sa creeze enzime vii asa cum natura poate crea. Daca ar fi putut, ar fi reusit sa creeze viata sau sa readuca la viata materia moarta. Exista miliarde de enzime in organism Corpul nostru produce enzime atunci cand sanatatea nostra este echilibrata. Responsabile de: repararea tesuturilor/aparare impotriva infectiilor/digestie/detoxifiere/aparare antioxidanta, etc
ROLURILE ENZIMELOR LOCALIZAREA ENZIMELOR 1. Intra-celulare: Transformarea provitaminelor in vitamine Transformarea vitaminelor hidrosolubile in forma activa: COENZIME Desfasurarea normala a cailor metabolice Stocarea si eliberarea din depozite a ionilor de Ca Formarea substantei fundamentale a celulelor (matricea celulara) Transportul ionilor prin membrana: pompele ionice Enzime Marker pt anumite organe 2. Extra-celulare Coagulare si fibrinoliza Digestia nutrientilor (sucurile digestive)
DEFECTELE ENZIMATICE (boli moleculare) ACTIUNEA CATALITICA - E = catalizatorii reactiilor din organismele vii - implicate in desfasurarea celor mai multe din reactiile biochimice care mentin homeostazia organismului. DENUMIREA ENZIMELOR: numele substratului + numele reactiei catalizate + sufixul aza STRUCTURA E = proteine specializate, clasificate in : Enzime simple Enzime complexe - Holoenzime, formate din: Apoenzima (parte proteica determina specificitatea E) + Coenzima (parte neproteica - forma biologic activa a vitaminelor hidrosolubile, metale partea activa-asig. mecanismul de reactie) CLASIFICAREA ENZIMELOR dupa tipul de reactie
ACTIVITATEA CATALITICA : Substrat- molecula asupra careia actioneaza enzima Produs Centru activ = situs catalitic locul din suprafata E (ApoE) unde se leaga S - un grup de aa pe suprafata apoe care conditionează activitatea acesteia (aa pot fi la distanţă in cadrul structurii primare dar apropiati în structura tertiara) Ser, Glu, Asp. Situsuri allosterice: situsuri de legare a unor molecule mici, care determina o modificare a afinitatii de legare a S. Specificitatea legarii si actiunii enzimelor sunt explicate de doua modele : Modelul lacat-cheie (preformat, rigid modelul Fischer) Modelul schimbarilor conformationale inducedfit (in dinamica, modelul Koschland)
CARACTERISTICI ALE ENZIMELOR: Acţionează ȋn celulele vii Acţionează ȋn cantităţi mici (şi transformă cantităţi apreciabile de S) Acţionează specific asupra unui anumit S (specificitate de S) ABSOLUTA/ DE GRUP/ STEREOCHIMICA Catalizează un singur tip de reacţie (specificitate de acţiune) NU se consumă ȋn reacţie NU modifică echilibrul unei reacţii ci doar ajută la atingerea acestui echilibru Pot fi reglabile (susceptibile la reglarea biologica) prin activatori (metalici, sau care actioneaza prin proteoliza limitata) si inhibitori
SPECIFICITATEA ENZIMELOR Specificitate de substrat Specificitatea de substrat a enzimelor reflecta abilitatea unei enzime de a distinge intre unul sau mai multe substrate Specificitatea absoluta: enzimele actioneaza asupra unui singur substrat (ureaza: uree tiouree) Specificitate de grup: enzimele actioneaza asupra unui anumit tip de legatura si catalizeaza o anumita reactie (anhidraza carbonica-ach, Butiril Ch / CHT Phe, Tyr) Stereospecificitatea: enzimele actioneaza numai asupra unui stereoizomer sau determina formarea numai unui anumit stereoisomer (Ex: Maltaza: acţionează numai asupra legaturilor glicozidice (nu şi β); E caii glicolitice: acţionează numai asupra esterilor fosfatici ai D hexozelor; LDH din muşchi, acţionează numai pe ac. L lactic ac.piruvic)
E = APOE + CoE (Cofactor) COENZIMA (COFACTOR): T -stabila si dializabila ( E care este T -labila, nedializabilă) indeplineste functiunea catalitica asupra S numai in prezenta unei E E este specifică unui singur S - CoE poate cataliza reactiile unui număr mare de S ApoE fixeaza si uneori activeaza S, CoE participa la reactie, (sufera o transformare chimică). In stadiul urmator, CoE modificata revine la starea initiala, fiind gata pentru o noua reactie (reactiile fiind foarte rapide, sunt suficente concentratii mici de CoE).
Cinetica enzimatica: se ocupa cu studiul vitezei enzimatice si a factorilor care o influenteaza E + S ES P+E Factorii care inflenteaza activitatea enzimelor: Temperatura ph-ul [E] [S] Modulatori (Efectori, Reglatori)
DEPENDENTA VITEZEI DE REACTIE DE TEMPERATURA SI ph Temperatura: viteza de reactie creste cu cresterea temperaturii si este maxima la o temperatura de 37 C, dupa care, odata cu cresterea temperaturii, prin denaturare, viteza scade pana la oprirea completa. Cele mai multe E devin complet inactive intre 50-80. T optima nu poate fi insa exact definita, caci ea variaza in limite largi, cu concentratia E, cu concentratia ionilor de hidrogen si cu prezenta diferitelor impuritati ale E sau S. ph-ul : viteza de reactie este maxima la un ph optim, care reflecta ph-ul locului unde actioneaza enzima in vivo.
Concentratia enzimei: pentru o concentratie constanta de substrat, viteza de reactie este proportionala cu cantitatea de enzima.
Concentratia substratului (ecuatia Michaelis- Menten): viteza este proportional in orice moment cu concentratia ES si este maxima cand toata enzima se afla sub forma de complex ES. Km [S] necesara ca v = vmax/2 si indica afinitatea E pentru S Influenta Modulatorilor: Activatori si Inhibitori (competitivi sau necompetitivi)
SPECIFICITATE DE REACŢIE Definiţie: capacitatea fiecărei enzime de a cataliza un anumit tip de reacţie proprietatea stă la baza clasificării enzimelor Clase de enzime: 1. OXIDO-REDUCTAZE -catalizează reacţii de oxido-reducere 2. TRANSFERAZE - catalizează transferul unei grupari de la o moleculă pe alta 3. HIDROLAZE - catalizează reacţii de hidroliză 4. LIAZE - catalizeaza scindarea unui S fără ajutorul apei 5. LIGAZE - catalizează legarea S cu formare de noi legături 6. IZOMERAZE - catalizează reacţii reversibile de izomerizare
Nr. Clasa si subclasa Reactii catalizate 1. Oxidoreductaze : oxidoreducere - Dehidrogenaze - Oxidaze - Reductaze - Peroxidaze, Catalaze - Hidroxilaze 2. Transferaze : - Transaldolaze si transcetolaze - Acil-, metal-,glicozil- si aminotransferaze - Kinaze 3. Hidrolaze : - Esteraze - Glicozidaze - Peptidaze - Fosfataze - Tiolaze - Ribonucleaze 4. Liaze : - Decarboxilaze - Aldolaze - Hidrataze 5. Izomeraze : - Racemaze - Epimeraze - Izomeraze - Mutaze 6. Ligaze : - Sintetaze - Carboxilaze Transefrul unei grupari de la un donor la un acceptor Hidroliza Scindarea nehidrolitica a unei legaturi covalente, eliminare de CO 2, NH 3, apa Izomerizare Formarea unei noi legaturi covalente (in prezenta ATP)