5. Cataliza biochimică

5. Cataliza biochimică 5.1. Interacțiunea enzimă-substrat Enzimele - situsuri de legare Substrat Reactiile enzimatice Intermediari covalenti Formarea unui intermediar covalent acil cbc.arizona.edu https://chem.libretexts.org/

5. Cataliza biochimică 5.1. Interacțiunea enzimă-substrat bazice Interactiunile grupari enzima-substrat acide nucleofile ARNaza pancreatica bovina www.namrata.co

5. Cataliza biochimică 5.1. Interacțiunea enzimă-substrat Enzimele proteine specifice Enzimele structuri flexibile E. Fischer-1894 D. Koshland-1958 Specificitatea enzimelor Complementaritate parteneri Stabilizarea starii de tranzitie?? Modificarea conformatiei situs activ Situs flexibil

5. Cataliza biochimică 5.1. Interacțiunea enzimă-substrat Modelul de inducere a conformatiei www.quora.com

5. Cataliza biochimică 5.1. Interacțiunea enzimă-substrat iws.collin.edu Modificarea conformatiei situsului activ In prezenta substratului Distorsionarea legaturilor chimice ale substratului energie mai mica (clivarea substratului)

5. Cataliza biochimică 5.1. Interacțiunea enzimă-substrat Matsunaga Y, Fujisaki H, Terada T, Furuta T, Moritsugu K, et al. (2012) Minimum Free Energy Path of Ligand-Induced Transition in Adenylate Kinase. PLOS Computational Biology 8(6): e1002555 Sol M. Resnick, and Alexander J. B. Zehnder Appl. Environ. Microbiol. 2000;66:2045-2051

5. Cataliza biochimică 5.2. Teoria starii de tranzitie concentrația speciei în starea de tranziție [X ] = [X] exp - G RT research.cm.utexas.edu

5. Cataliza biochimică 5.2. Teoria starii de tranzitie Rata de descompunere a speciei X -d[x] dt = [X ] = [X] kt h exp Constanta vitezei de reacție de ordinul I - G RT k 1 = kt h exp - G RT k 1 = kt h exp S RT exp - H RT

5. Cataliza biochimică 5.2. Teoria starii de tranzitie Intermediarii Leg chimice formate Energii mai mici Starea de tranzitie maxim energetic

5. Cataliza biochimică 5.2. Teoria starii de tranzitie Starea de tranzitie a E. coli tarn-adenozine Deaminazei http://pubs.acs.org/jacsbeta/

5. Cataliza biochimică 5.2 Postulatul lui Hammond Reactia in etape: A I P I -intermediar instabil Structura I ~ Structura T # Stabilizarea T # http://www.chemguide.co.uk/ Lizozimul Carboxanioni intermediari ~ T # Protein structure and Function, Petsko & Ringe, 2004

5. Cataliza biochimică 5.3. Energia de activare Enzimele reduc E a a reactie ΔΔG = Ea necat - Ea cat Constanta vitezei (k 1 ) ΔΔG = 5,71 KJ/Mol ½ ΔG legatura de H http://www.mtchs.org/bio/ Constanta vitezei (k 1 ) 6x ΔΔG = 34 KJ/Mol 1/10 ΔG C-C http://i.stack.imgur.com/kqsgm.jpg

5. Cataliza biochimică Cataliza bazica 5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza acida Stari de tranzitie nefavorabile Transfer proton (baza) Catena laterala aminoacizi aspartat, glutamat, tirozina histidina si lizina Stabilizarea starii de tranzitie Transfer proton (acid)

Cataliza electrofilă 5. Cataliza biochimică 5.4. Stabilizarea stării de tranziție Carboxipeptidazele Structura situsului activ al Carboxipeptidazei A http://www.open.edu/openlearn/ Anhidraza carbonica

5. Cataliza biochimică 5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza electrofilă Arg 110 si Mg 2+ Wu SL et al. J. Biomed. Sci., 2009 Stabilizarea starii de tranzitie Endonucleaza G Implicata in procesele de proliferare celulara (inclusiv apoptoza) Proteina AIF și endonucleaza G sunt eliberate din mitocondrie si provoaca degradarea ADN-ului http://www.protein.bio.msu.ru/

Cataliza nucleofila Gruparea OH a serinei Serin proteaze Colinesteraze 5. Cataliza biochimică 5.4. Stabilizarea stării de tranziție În enzime- grupări nucleofile (în cataliză): www.atsdr.cdc.gov

Cataliza nucleofila Gruparea OH a serinei Leucocitesteraza (LE) 5.4. Stabilizarea stării de tranziție În enzime- grupări nucleofile (în cataliză): http://slideplayer.com/slide/4366028/ LE Esterul ac. Indolcarboxylic Indoxil + Acid Indoxil + Sare diazoniu azoderivat (violet) existența unei infecții urinare ph, conc. Proteinei, NO 2 - Limita de detecție 10-25 Leu/µl https://drugsdetails.com

Cataliza nucleofila 5.4. Stabilizarea stării de tranziție În enzime- grupări nucleofile (în cataliză): Gruparea OH a serinei Lipaze (situs activ) www.thermofisher.com Fosfataza acida (E coli) www.scielo.br

Thomas, Shafee, (2014). "Evolvability of a viral protease: experimental evolution of catalysis, robustness and specificity". PhD Thesis. University of Cambridge. Cataliza nucleofilă 5.4. Stabilizarea stării de tranziție Triada catalitică

helicase.pbworks.com 5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila gruparea -OH tirozinica topoizomeraze Topoisomerase IB situs activ (PDB 1A36)

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila gruparea -OH tirozinica glutamin sintetaza Homodecamer 2 x pentamer Spodenkiewicz, M. et al, Biology 2016, 5(4), 40

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila glutamin sintetaza deficiență Reprezentarea schematică a fiziopatologiei deficientei GS: scăderea detoxifierii NH3 și împiedicarea reaprovizionării ciclului Gln-Glu-GABA Spodenkiewicz, M. et al, Biology 2016, 5(4), 40

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila gruparea -OH tirozinica Glutamat-cistein ligaza (γ-glutamilcistein sintetaza, EC 6.3.2.2) William B. Musgrave et al. Biochem. J. 2013;450:63-72 Anemie hemolitică moderată 3 surori Biosinteza glutationului Almuafri, F., et al., Blood Cells, Molecules and Diseases 2017;65:73-77

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila Gruparea -SH a cisteinei - tiol proteaze papaina ficina Yao, Q. et al., PNAS, 2009. 106 (10) 3716-3721 Papaina situs activ www.cambridgemedchemconsulting.com

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila tiol proteaze (bromelaina) gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza www.studyblue.com Influenta bromelainei asupra unor mediatori care intervin in inflamatia acuta Srivastava, AK et al., Braz. Arch. Biol. Technol., 59, 2016

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila imidazolul din histidina cresterea nucleofilicitatii gruparilor -OH si -SH Freeman and co, Biochemistry, 2007 Ash, E. L., et al., H-bond: Proposal for reaction-driven ring flip mechanism in serine protease catalysis, PNAS, 2000, 97(19) 10371-10376

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza nucleofila imidazolul din histidina transferul grupei fosfat Fosfoglicerat mutaza Enzimă glicolitică 2,3-BPG eritrocite Controlul afinității Hb-O 2

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza covalentă gruparea NH 2 (lizinica) - cataliza acetoacetat decarboxilazei Highbarger, L.A. and Gerlt, J.A, Biochemistry, 35, 41-46, 2016 Gerlt, J.A. Nature Chemical Biology 5, 454 455, 2009

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza covalentă gruparea NH 2 (lizinica) - cataliza acetoacetat decarboxilazei Dovedirea intermediarului catalitic

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza covalentă gruparea NH 2 (lizinică) - cataliza transladolazei; Transaldolaza situs activ www.nature.com chemwiki.ucdavis.edu

5.4. Stabilizarea stării de tranziție Cataliza covalentă Cataliza electrofilă în cazul piridoxal fosfatului PLP K145 Y31 E177 L201 Situs catalitic DAAtransferazei Bacillus sp. YM-1 https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/mcsa/entry/66/ Richard, J.P. et al., Current Opinion in Chemical Biology, 13(4), 2009, 475-483

Cataliza nucleofila gruparea carboxilica (aspartat) - ATPaze (K + /Na +, Ca 2+ ). www.rpi.edu Structura Na,K-ATPazei cu ouabaina https://www.researchgate.net/

Etape determinanta de viteza Reactia: R1 R2 P

Cinetica starii stationare Starea stationara Sistemele dinamice Populatia tarii Rata formare = rata distrugere

Sisteme biochimice X formare metabolit celula degradare Y v formare = v degradare S > E Stare stationara Stare prestationara Intelegere metabolism Analiza mecanisme de reactie

Ecuatia Michaelis-Menten K S k cat E + S ES P + E v = [E] 0[S]k cat K m + [S] Complex enzimasubstrat Leonor Michaelis (1913) [E] = constant rata de reactie creste cu cresterea [S] pana cand viteza maxima, Vmax, este atinsa

Experimentele starii de ne-echilibru [S] [P] Masurarea activitatii Discontinuu - indepartarea probei la intervale de timp timp - analiza chimica Continuu Modificarea absorbtiei cromoforului (S sau P) Reducerea NAD 340 nm

Masurarea activitatii Absenta cromofor Reactii cuplate Hexokinaza catalizeaza reactia glucoza + ATP glucoz-6-fosfat + ADP Cuplata cu reactia - glucoz-6-fosfat (G-6-P) dehidrogenaza: G-6-P + NAD ox 6-fosfogluconat + NAD red [NAD red ] cresterea DO 340

Reactia enzimei cu un singur substrat K S k cat E + S ES P + E K S = [E][S] [ES] v = k cat [ES] [E] = [E] 0 - [ES] [ES] = [E] 0 [S] K S + [S] v = [E] 0 [S]k cat K m + [S]

Cinetica reactiilor enzimatice -teoria starii stationare k 1 E + S ES P + E k -1 Michaelis-Menten - premiza: ES E + S k 2 << k -1 k 2 G. E. Briggs 1925 J. B. S. Haldane k 2 ~ k -1 [ES] cinetica stationara d[es]/dt = 0 = k 1 [E][S] - k 2 [ES] - k -1 [ES] v = [E] 0 [S]k 2 [S] + (k 2 + k -1 )/k 1 (k 2 + k -1 )/k 1 = K m k 2 << k -1 K m = K s

[S] < < K m v = k cat [E] 0 [S] K m a) Enzima libera + substrat v = [E] 0[S]k cat K m + [S] v = [S] = K m k cat 2 [E] 0 b) Enzima saturata 50% cu substratul [S] >> K m v =k cat [E] 0 c) Enzima saturata cu substratul