ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΤΟΠΩΝ ΜΕ ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΥΤΟΑΝΟΣΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ.

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Δ/ΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. Χ. ΣΙΑΜΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΤΟΠΩΝ ΜΕ ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΥΤΟΑΝΟΣΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ. ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΡΟΥΤΣΙΑΣ ΧΗΜΙΚΟΣ, ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 1998

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Δ/ΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. Χ. ΣΙΑΜΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΤΟΠΩΝ ΜΕ ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΥΤΟΑΝΟΣΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΤΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ. ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΡΟΥΤΣΙΑΣ ΧΗΜΙΚΟΣ, ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΙΩΑΝΝΙΝΑ 1998

Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα (Νομός 5343/32, άρθρο 202, 2).

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Σιαμόπουλος Κωνσταντίνος, Καθηγητής Παθολογίας/Νεφρολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, επιβλέπων. 2. Μουτσόπουλος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογικής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, μέλος. 3. Δρόσος Αλεξανδρός, Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας/Ρευματολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος.

ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Μουτσόπουλος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογικής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, μέλος. 2. Σακαρέλλος Κωνσταντίνος, Καθηγητής Οργανικής Χημείας Χημικού Τμήματος, Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος. 3. Σακαρέλλου-Δαϊτσιώτου Μαρία, Καθηγήτρια Βιοχημείας Χημικού Τμήματος Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος. 4. Σιαμόπουλος Κωνσταντίνος, Καθηγητής Παθολογίας/Νεφρολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστήμιου Ιωαννίνων, επιβλέπων. 5. Τσόλας Ορέστης, Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος. 6. Δρόσος Αλέξανδρος, Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας/Ρευματολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, μέλος. 7. Τζιούφας Αθανάσιος, Επίκουρος Καθηγητής Παθολογικής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών, μέλος.

Στους γονείς μου Σε όσους με στήριξαν στην προσπάθεια μου αυτή

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ADCC: AIDS: ANA: ΒΗΑ: BOC: cdna: CDRs: DCC: DMF: dsdna: EAE: ELISA: ENA: Fab: Fc: Fmoc: HLA: IgA: IgE: IgG: IgM: Κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από το αντίσωμα Σύνδρομο επίκτητης ανοσοποιητικής ανεπάρκειας Αντιπυρηνικά αντισώματα Βενζυδρυλαμίνη ρητίνη t-βουτυλοξυκαρβόνυλο ομάδα Συμπληρωματικό DNA Συμπληρωματικές καθορίζουσες την αντιγονικότητα περιοχές Δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο Διμεθυλοφορμαμίδιο DNA διπλής έλικας Πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα Ανοσοενζυμική μέθοδος στερεάς φάσεως Αυτοαντισώματα κατά εκχυλισμάτων πυρήνα Περιοχή αντισώματος που αλληλεπιδρά με το αντιγόνο Σταθερή περιοχή αντισώματος 9-φλουορενυλομεθυλοξυκαρβόνυλο ομάδα Ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα Ανοσοσφαιρίνη A Ανοσοσφαιρίνη E Ανοσοσφαιρίνη G Ανοσοσφαιρίνη M IL-1: Ιντερλευκίνη 1 IL-10: Ιντερλευκίνη 10 IL-2: Ιντερλευκίνη 2 IL-3: Ιντερλευκίνη 3 IL-4: Ιντερλευκίνη 4

IL-5: Ιντερλευκίνη 5 IL-6: Ιντερλευκίνη 6 IL-10: Ιντερλευκίνη 10 IL-13: Ιντερλευκίνη 13 INF-γ: MHC-I: MHC-IΙ: ΜΝΣΙ: MPS: PAGE: PAM: Pfp: ΡΑ: RGD: RIA: rrna: SDS: ΣΕΛ: ΣΣ: TCR: TFA: T H1 : T H2 : TNF: VSV: Ιντερφερόνη γ Μέγιστο σύμπλεγμά ιστοσυμβατότητας τάξεως Ι Μέγιστο σύμπλεγμά ιστοσυμβατότητας τάξεως ΙΙ Μικτή νόσος του συνδετικού ιστού Τεχνική πολλαπλής πεπτιδικής σύνθεσης Ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου 4-υδρόξυ-φαίνυλο-ακετάμιδο-μέθυλο ρητίνη Πενταφθοροφαινυλεστέρας Ρευματοειδής Αρθρίτιδα Αλληλουχία προσκόλλησης (Arg-Gly-Asp) Ραδιοανοσολογική μέθοδος Ριβοσωματικό RNA Δωδεκυλοθειϊκό νάτριο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος Σύνδρομο Sjogren Υποδοχέας Τ-λεμφοκυττάρου Τριφθοροοξεικό οξύ Τ-βοηθητικά 1 λεμφοκύτταρα Τ-βοηθητικά 2 λεμφοκύτταρα Παράγοντας νέκρωσης των όγκων Ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή εκπονήθηκε στο Ανοσολογικό Εργαστήριο του τομέα Παθολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων και εν μέρει στο Ερευνητικό Εργαστήριο Χημείας Πεπτιδίων και τομέα Οργανικής Χημείας και Βιοχημεία του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων στη περίοδο 1991-1998 όπου εργάσθηκα ως Ειδικός Μεταπτυχιακός Υπότροφος (Ε.Μ.Υ.) του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ) (έτη 1992-1998). Το θέμα της Διδακτορικής Διατριβής μου ανέθεσε ο καθηγητής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών κ. Χαράλαμπος Μ Μουτσόπουλος σε συνεργασία με τον καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Σακαρέλλο και την καθηγήτρια κ. Μαρία Σακαρέλλου-Δαϊτσιώτου του Χημικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, στους οποίους εκφράζω και την βαθιά μου ευγνωμοσύνη για την ανάθεση της διατριβής και τη μύηση μου στα δύσβατα πεδία της έρευνας. Ιδιαίτερα υποβάλω τις θερμές ευχαριστίες μου στο καθηγητή κ. Χαράλαμπο Μουτσόπουλο για την αμέριστη, γεμάτη οξυδέρκεια και συνεχή συμπαράσταση του στην εκπόνηση της διατριβής και τη καθοριστική συμβολή του στην επιστημονική μου κατάρτιση και σταδιοδρομία. Επίσης θερμότατες ευχαριστίες υποβάλω στην καθηγήτρια κ. Μαρία Σακαρέλλου-Δαϊτσιώτου και στον

καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Σακαρέλλο για την ακούραστη παρακολούθηση, καθοδήγηση και την πολύτιμη βοήθεια τους σε όλη την περίοδο της πραγματοποίησης της διατριβής μου. Τις θερμές μου ευχαριστίες και τα ευγνώμονα αισθήματα μου ακόμη απευθύνω στον Επίκουρο Καθηγητή της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών κ. Αθανάσιο Γ Τζιούφα για την παρακολούθηση, τις πολύτιμες συμβουλές και την ακαταπόνητη και συνεχή συνδρομή του στην εκπόνηση και ολοκλήρωση της διατριβής αυτής. Θερμές ευχαριστίες επίσης οφείλω στον καθηγητή Παθολογίας/Νεφρολογίας κ. Κωνσταντίνο Σιαμόπουλο και στον αναπληρωτή καθηγητή Παθολογίας/Ρευματολογίας κ. Αλέξανδρο Δρόσο για την ειλικρινή συμπαράσταση που μου προσέφεραν. Ιδιαίτερα θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Επίκουρο καθηγητή του Χημικού τμήματος κ. Βασίλειο Τσίκαρη για τη μεγάλη βοήθεια, τις πολύτιμες οδηγίες και συμβουλές καθώς και την αμέριστη συμπαράσταση που μου έδειξε. Ακόμα ευχαριστώ τους μεταπτυχιακούς συνεργάτες Έφη Γιαννάκη, Δήμητρα Μπούμπα, Κώστα Κίστη, Δημήτρη Τζοβάρα, Κατερίνα Ρίζου, Άρη Κονίδη και το προσωπικό του Ανοσολογικού Εργαστηρίου Τζένη Σπύρου, Κλ. Γκαραλέα, Αλ. Μάγκου, και Γλ. Παπατζίμα για την ηθική υποστήριξη, την άριστη συνεργασία και την πολύτιμη συμπαράσταση τους. Ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στον Γιώργο Παπανικολάου για την συμβολή του στην εμφάνιση του κειμένου και τον Θανάση Παγώνη για τη συμβολή του στην δημιουργία ορισμένων σχημάτων. Τέλος θερμότατες ευχαριστίες οφείλω στους φίλους μου και σε όσους με στήριξαν στην προσπάθεια μου αυτή. Η εργασία αυτή υποστηρίχτηκε οικονομικά από τα ερευνητικά προγράμματα (i) ΕΠΕΤ ΙΙ ΕΚΒΑΝ-ΙΙ Π #45 της Γενικής Γραμματείας Έρευνας και Τεχνολογίας (ΓΓΕΤ) με τίτλο «Προτυποποίηση μεθόδων ανίχνευσης αυτοαντισωμάτων με τη χρήση συνθετικών πεπτιδίων», (ii) ΓΓΕΤ: 3526 (ΕΡΕ) με τίτλο «Ανάπτυξη μοριακών τεχνικών και ανοσοδραστικών συνθετικών πεπτιδίων για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων κατά Ro/SSA» και (iii) Ε339/Α 2 /5664/1992/Υπ. Υγείας Προν. Κοιν. Ασφ. με τίτλο «Παραγωγή και

χρήση συνθετικών πεπτιδίων στην ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων: Εφαρμογές στη διάγνωση και πρόγνωση των αυτοάνοσων ρευματικών νόσων και της βαρειάς μυασθένειας» με υπεύθυνους τους καθηγητές κ. Χ. Μ. Μουτσόπουλο και κ. Κ. Σακαρέλλο.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Γενικό Μέρος Α. ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ Α.Ι. Συνθετικά πεπτίδια και εφαρμογές τους στην ιατρική 1 Α.Ι.1 Γενικά...1 Α.Ι.2 Διαγνωστικές μέθοδοι...2 Α.Ι.3 Ανοσοποιήσεις-Εμβόλια...3 Α.Ι.4 Θεραπευτικές χρήσεις πεπτιδίων...6 Α.Ι.4.1 Νεοπλασίες-Καρκίνος...6 Α.Ι.4.2 Αυτοάνοσες νόσοι...7 Α.Ι.4.3 Μεταμοσχεύσεις...8 Α.I.4.4 Άλλες χρήσεις...8 Α.ΙΙ. Πεπτιδική σύνθεση... 10 Α.III. Τεχνικές πεπτιδικής σύνθεσης... 12 Α.ΙΙI.1 Σύνθεση σε υγρή φάση... 12 Α.ΙII.2 Σύνθεση σε στερεά φάση... 13 Α.ΙΙI.2.1 Το αδιάλυτο πολυμερές... 15 Α.ΙΙI.2.2 Προστατευτικές ομάδες... 16

Α.ΙΙI.2.3 Μέθοδοι σύζευξης... 17 Α.IV. Σύνθεση πολλαπλών πεπτιδίων... 20 Α.IV.1 Γενικά... 20 Α.IV.2 Σύνθεση σε «Σακουλάκι τσαγιού»... 21 Α.IV.3 Σύνθεση σε «Κηλίδες κυτταρίνης»... 22 Α.IV.4 Σύνθεση σε δίσκους κυτταρίνης ή βαμβακιού... 23 Α.IV.5 Σύνθεση σε φιλμ πολυστυρολίου-πολυαιθυλενίου... 23 Α.IV.6 Σύνθεση σε ράβδούς... 23 A.V. Βιβλιοθήκες πεπτιδίων... 30 Β. ΑΝΟΣΙΑ-ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑ Β.Ι. Η φυσιολογική απόκριση... 33 Β.Ι.1 Γενικά... 33 Β.Ι.2 Η Ανοσολογική απόκριση... 35 Β.Ι.2.1 Αναγνώριση του αντιγόνου... 35 Β.Ι.2.2 Παρουσίαση του αντιγόνου... 39 Β.Ι.2.3 Ενεργοποίηση ανοσοδραστικών κυττάρων... 40 B.I.2.4 Ρυθμιστικοί μηχανισμοί... 43 Β.Ι.2.5 Θυμοανεξάρτητη ανοσολογική απάντηση... 45 Β.ΙΙ. Η αυτοάνοση ανοσολογική απόκριση... 46 Β.ΙΙ.1 Αιτιολογικοί μηχανισμοί... 47 B.II.2 Γενετικές Συσχετίσεις... 51 Γ. ΑΝΤΙΓΟΝΑ-ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ Γ.I Αντιγόνα και η αλληλεπίδραση τους με τα αντισώματα... 55 Γ.II Μέθοδοι αντιγονικής χαρτογράφησης... 61 Γ.II.1 Γενικά... 61 Γ.II.2 Αντιγονική χαρτογράφηση με αλγόριθμους πρόβλεψης αντιγονικότητας... 61 Γ.II.3 Αντιγονική χαρτογράφηση με ενζυματική πέψη... 63 Γ.II.4 Αντιγονική χαρτογράφηση με ανασυνδιασμένες πρωτεϊνες... 64 Γ.II.5 Αντιγονική χαρτογράφηση με συνθετικά πεπτίδια... 65 Γ.II.5.1 Εντοπισμός των επιτόπων... 67

Γ.II.5.2 Περιορισμός του μήκους των επιτόπων... 69 Γ.II.5.3 Καθορισμός των σημαντικών για τη δέσμευση του αντισώματος αμινοξέων.... 71 Γ.II.5.4 Η στρατηγική των μιμοτόπων... 71 Δ. ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Ro/SSA ΚΑΙ ΚΑΛΡΕΤΙΚΟΥΛΙΝΗΣ Δ.I. Αυτοαντισώματα... 75 Δ.I.1 Γενικά... 75 Δ.Ι.2 Η ποικιλομορφία των αυτοαντισωμάτων... 76 Δ.I.3 Αυτοντισώματα κατά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων... 77 Δ.II Το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο Ro RNP... 79 Δ.ΙΙ.1 Δομή του συμπλόκου Ro RNP... 79 Δ.II.1.1 Τα hy RNAs... 80 Δ.II.1.2 Η πρωτεΐνη Ro60KD... 81 Δ.II.1.3 Η πρωτεΐνη Ro52KD... 83 Δ.II.1.4 Η πρωτεΐνη La48KD... 85 Δ.II.1.5 Η πρωτεΐνη καλρετικουλίνη 46KD... 86 Δ.II.2 Πιθανός λειτουργικός ρόλος του RoRNP... 87 Δ.II.2.1 Πιθανός βιολογικός ρόλος της La πρωτεϊνης... 88 Δ.II.2.2 Πιθανός βιολογικός ρόλος της Ro60 πρωτεϊνης... 88 Δ.II.2.3 Πιθανός βιολογικός ρόλος της Ro52 πρωτεϊνης... 89 Δ.II.2.4 Πιθανός βιολογικός ρόλος της καλρετικουλίνης... 90 Δ.II.3 Σχηματισμός των RoRNP συμπλόκων... 92 Δ.IIΙ Αυτοαντισώματα κατά Ro/SSA και καλρετικουλίνης...95 Δ.III.1 Τα αυτοαντισώματα αντί-ro/ssa... 95 Δ.ΙΙI.1.1 Ιστορική αναδρομή Ποσοστά εμφάνισης... 95 Δ.III.1.2 Ετερογένεια της αντί-ro ανοσολογικής απόκρισης... 96 Δ.III.1.3 Γένεση των αυτοαντισωμάτων αντί-ro... 97 Δ.III.1.3.1 Μοριακή μίμηση με τον ιό της Φυσσαλιδώδους Στοματίτιδας... 97 Δ.III.1.3.2 Αλλαγές στην ποσοτική και ποιοτική έκφραση του Ro αντιγόνου κάτω από συνθήκες στρές ή ορμονικής διέγερσης... 98

Δ.III.1.3.3 Τα αντί-ro/ssa αυτοαντισώματα σαν αντί-ιδιότυποι των αντί-dna αυτοαντισωμάτων... 100 Δ.III.1.3.4 Τα αντί-ro αυτοαντισώματα σαν αντί-hla αυτοαντισώματα... 101 Δ.ΙΙI.1.4 Μοριακή δομή των αντί-ro αυτοαντισωμάτων... 103 Δ.III.1.5 Κλινικές συσχετίσεις των αυτοαντισωμάτων αντί-ro... 104 Δ.III.1.5.1 Συσχετίσεις στον Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο... 104 Δ.III.1.5.2 Συσχετίσεις στο Σύνδρομο Sjogren... 107 Δ.III.1.5.3 Συσχετίσεις Ρευματοειδή Αρθρίτιδα... 107 Δ.III.2 Τα αυτοαντισώματα αντί-καλρετικουλίνης... 108 Δ.ΙIΙ.2.1 Ιστορική αναδρομή Ποσοστά εμφάνισης... 108 Δ.III.2.2 Γένεση των αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης... 109 Δ.III.2.2.1 Μοριακή μίμιση... 109 Δ.III.2.2.2 Αλλαγές στην ποσοτική και ποιοτική έκφραση της καλρετικουλίνης κάτω από συνθήκες στρές... 110 Δ.III.2.3 Κλινικές συσχετίσεις των αυτοαντισωμάτων αντί-καλρετικουλίνης... 111 Δ.ΙV Ανίχνευση των αυτοαντισωμάτων... 113 Δ.IV.1 Γενικά... 113 Δ.IV.2 Ανοσοδιάχυση και αντίθετή ανοσοηλεκτροφόρηση... 113 Δ.IV.3 ELISA... 117 Δ.ΙV.3.1 Μη ανταγωνιστική έμμεση ELISA για τον προσδιορισμό αντισώματος... 117 Δ.IV.3.1.1 Κάλυψη του πλακιδίου... 117 Δ.IV.3.1.2 Αλληλεπίδραση αντιγόνου αντισώματος... 121 Δ.IV.3.1.3 Η ενζυμική αντίδραση... 123 Δ.IV.3.2 Παραλλαγές της ELISA... 124 Δ.IV.3.2.1 ELISA με ομοιοπολική σύνδεση... 124 Δ.IV.3.2.2 ELISA με βιοτινυλιωμένα πεπτίδια... 125 Δ.IV.4 Ανοσοαποτύπωση... 126 Δ.IV.4.1 Ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου... 126 Δ.IV.4.2 Μεταφορά των πρωτεϊνών σε φύλλα νιτροκυτταρίνης... 129 Δ.ΙV.4.3 Ανοσοαποτύπωση... 129 Δ.V Επίτοποι των αυτοαντισωμάτων που στρέφονται ενάντια στο σύμπλοκο Ro RNP.... 130

Δ.V.1 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο Ro60... 130 Δ.V.2 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο Ro52... 131 Δ.V.3 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο La... 132 Δ.V.4 Επίτοποι στο αυτοαντιγόνο καλρετικουλίνη... 133 Δ.V.5 Επίτοποι στα hyrna... 133 Δ.V.6 Επίτοποι με ειδικότητα για νόσο... 134 Δ.V.7 Ενδομοριακή και διαμοριακή εξάπλωση των επιτόπων... 135 Δ.V.8 Ρόλος της εξάπλωσης των επιτόπων στην παθογένεση των αυτοάνοσων ασθενειών... 138 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 147 Ειδικό Μέρος ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ... 199 Ε.I ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΚΑ ΑΝΑΛΟΓΑ ΤΗΣ ΚΑΛΡΕΤΙΚΟΥΛΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙ-ΠΕΠΤΙΔΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΣΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ... 201 Ε.I.1 Εισαγωγή... 202 Ε.I.2 Ασθενείς και μέθοδοι... 204 Ε.I.2.1 Οροί ασθενών... 204 Ε.I.2.2 Πεπτιδική σύνθεση και καθαρισμός των αναλόγων της CaR.... 204 Ε.I.2.3 Σύζευξη πεπτιδίου σε πρωτεΐνη-φορέα... 205 Ε.I.2.4 ELISA... 205 Ε.I.2.5 Ανοσοαποτύπωση κηλίδων... 206 Ε.I.3 Αποτελέσματα... 206 Ε.I.3.1 Ποιοτική ανάλυση των αυτοαντισωμάτων ενάντια στα πεπτιδικά ανάλογα της CaR (SP24, SP18)... 206 Ε.I.3.2 Αντιγονικότητα των πεπτιδικών αναλόγων της CaR... 207 Ε.I.4 Συζήτηση... 209 Ε.I.5 Βιβλιογραφία... 211

Ε.II ΤΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΕΝΑΝΤΙΑ ΣΤΟ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΟ ΜΕ ΤΟΝ ΙΟ ΤΗΣ ΦΥΣΣΑΛΙΔΩΔΟΥΣ ΣΤΟΜΑΤΙΤΙΔΑΣ ΠΕΠΤΙΔΙΟ EYRKKMDI ΑΠΟΤΕΛΟΥΝ ΕΝΑ ΜΙΚΡΟ ΜΟΝΟ ΜΕΡΟΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΝΤΙ-Ro 60KD.... 215 Ε.II.1 Εισαγωγή... 217 Ε.II.2 Ασθενείς και μέθοδοι... 219 Ε.II.2.1 Οροί... 219 Ε.II.2.2 Πεπτιδική σύνθεση και καθαρισμός του οκταπεπτιδίου EYRKKMDI (8p)... 219 Ε.II.2.3 Καθαρισμός της πρωτεΐνης Ro/SSA... 220 Ε.II.2.4 Εκχύλισμα κυττάρων και ανοσοαποτύπωση... 220 Ε.II.2.5 Καθαρισμός των αντισωμάτων αντί-8p... 220 Ε.II.2.6 ELISA... 221 Ε.II.2.7 Πειράματα αναστολής... 222 Ε.II.2.8 Στατιστική ανάλυση... 222 Ε.II.3 Αποτελέσματα... 222 Ε.II.3.1 Συσχετίσεις μεταξύ των αντισωμάτων αντί-ro 60kD και αντί-8p... 222 Ε.II.3.2 Δραστικότητα αντί-ro 60kD των αντισωμάτων αντί-8p... 224 Ε.II.3.3 Μελέτες αναστολής των αντισωμάτων αντί-8p... 225 Ε.II.4 Συζήτηση... 225 Ε.II.5 Βιβλιογραφία... 229 Ε.III Η ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΤΟΥ ΑΥΤΟΑΝΤΙΓΟΝΟΥ RO/SSA 60kD ΑΠΟΚΑΛΥΠΤΕΙ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΑ ΓΙΑ ΝΟΣΟ... 233 Ε.III.1 Εισαγωγή... 235 Ε.III.2 Υλικά και μέθοδοι... 237 Ε.III.2.1 Οροί και καθαρισμός της IgG... 237 Ε.III.2.2 Πεπτιδική σύνθεση... 238 Ε.III.2.3 Κυτταρικό εκχύλισμα και ανοσοαποτύπωση... 239 Ε.III.2.4 ELISA... 239 Ε.III.2.5 Καθαρισμός του αντιγόνου Ro/SSA και πειράματα αναστολής... 240 Ε.III.2.6 Προβλέψεις με ηλεκτρονικούς υπολογιστές και έρευνα ομολογιών... 240 Ε.III.3 Αποτελέσματα... 241

Ε.III.3.1 Προσδιορισμός των αντιγονικών περιοχών... 241 Ε.III.3.2 Προσδιορισμός του ελάχιστου απαιτούμενου μήκους των αντιγονικών καθοριστων... 243 Ε.III.3.3 Αναστολή της δέσμευσης αντισώματος στα αντιγονικά πεπτίδια... 244 Ε.III.3.4 Προβλεπόμενα χαρακτηριστικά των αντιγονικών επιτόπων του Ro60kD... 245 Ε.III.3.5 Ομοιότητες αλληλουχίας των ανοσοκαθοριστικών επιτόπων... 245 Ε.III.4 Συζήτηση... 246 Ε.III.5 Βιβλιογραφία... 251 Ε.IV ΔΟΜΙΚΕΣ, ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΓΡΑΜΜΙΚΩΝ Β-ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΕΠΙΤΟΠΩΝ ΤΟΥ ΑΥΤΟΑΝΤΙΓΟΝΟΥ RO60KD.... 255 Ε.IV.1 Εισαγωγή... 257 Ε.IV.2 Υλικά και μέθοδοι... 259 Ε.IV.2.1 Οροί ασθενών και καθαρισμός της IgG 259 Ε.IV.2.2 Πεπτιδική σύνθεση... 260 Ε.IV.2.3 ELISA... 262 Ε.IV.2.4 Πειράματα κυκλικού διχρωισμού (CD) και μοντελοποιήσης... 264 Ε.IV.2.5 Ανοσοποιήσεις ζωών... 264 Ε.IV.3 Αποτελέσματα... 265 Ε.IV.3.1 Υποκαταστάσεις Αλανίνης... 265 Ε.IV.3.2 Αντί-Ro 60kD δραστικότητα της ομόλογης με τον επίτοπο Ro 60kD 169-190 περιοχής του HLA-DR... 266 Ε.IV.3.3 Δομικά χαρακτηριστικά των επιτόπων Ro 60kD και του ομολόγου HLA DR3... 266 Ε.IV.3.4 Δραστικότητα αντίορων κατά των πεπτιδικών επιτόπων NGWSHKDLLR (175-184) και KALSVETEKLLKYLEAV (216-232)... 269 Ε.IV.3.5 Συχνότητα των αντιπεπτιδικών αντισωμάτων σε αυτοάνοσους ορούς... 269 Ε.IV.4 Συζήτηση... 271 Ε.IV.5 Βιβλιογραφία... 275 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 279

SUMMARY... 287

Α ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ Α.Ι. ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Α.Ι.1 Γενικά Τα πεπτίδια είναι οργανικά μόρια που αποτελούνται από αμινοξέα συνδεόμενα μεταξύ τους με αμιδικό δεσμό. Στη φύση είναι ευρέως διαδεδομένα κυρίως με τη μορφή των πρωτεϊνών (πεπτίδια μεγέθους >100 αμινοξέων) καλύπτοντας δομικές και λειτουργικές ανάγκες των έμβιων όντων. Πεπτίδια μικρού σχετικά μήκους ανευρίσκονται στον ανθρώπινο οργανισμό: (i) στις ορμόνες του υποθαλάμου και τους εκλυτικούς τους παράγοντες (π.χ. σωματοστατίνη), (ii) στα πεπτίδια της υπόφυσης (πχ αδενοκορτικοτροπίνη, ωκυτοκίνη) και (iii) σε άλλους ιστούς (πχ γλυκαγόνη, αγγειοτενσίνη II, βραδυκινίνη).

Το 1953 έγινε η πρώτη συνθετική παραγωγή των πεπτιδικών ορμονών οξυτοκίνη και βασοπρεσίνη από τον Vincent du Vingneaud. Από τότε έως σήμερα η πεπτιδοχημεία αναπτύχθηκε ραγδαία. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη στροφή ενός μεγάλου τμήματος της ιατρικής έρευνας σε μελέτες μοριακού επιπέδου οδήγησε στην ευρεία χρήση των συνθετικών πεπτιδίων στην ιατρική. Η κύρια χρήση τους είναι η αποκάλυψη και τροποποίηση των βιολογικών διαδικασιών που συμβαίνουν στον ανθρώπινο οργανισμό, είτε φυσιολογικά, είτε κατά την έναρξη και διαδρομή μιας νόσου. Επιπλέον τα συνθετικά πεπτίδια σαν τμήματα των πρωτεϊνών που είναι, είναι δυνατόν να δράσουν βιολογικά όμοια με αυτές, έχοντας όμως το μεγάλο πλεονέκτημα της συνθετικής παρασκευής και της χημικής καθαρότητας. Έτσι εκτός από τις πεπτιδικές ορμόνες και παράγωγα τους που λειτουργούν σαν αγωνιστές ή ανταγωνιστές, έχουν παρασκευαστεί πεπτίδια με ενζυμική δράση (1,2) και πεπτίδια με ανοσολογική δράση [ανάλογα της Ιντερλευκίνης 1 (3)]. Τα συνθετικά πεπτίδια στην ιατρική μπορούν να χρησιμοποιηθούν κυρίως σε διαγνωστικές μεθόδους (διαγνωστικοί δείκτες), σε εμβόλια και ως θεραπευτικά. Πολλές από τις εφαρμογές αυτές στην πλειοψηφία τους σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με το ανοσοποιητικό σύστημα και στη συνέχεια θα περιγράψουμε τις σημαντικότερες από αυτές. Α.Ι.2 Διαγνωστικές μέθοδοι Τα συνθετικά πεπτίδια συνήθως χρησιμοποιούνται σαν αντιγόνα για την ανίχνευση ποικίλων αντισωμάτων με διαγνωστικό ενδιαφέρον. Το πραγματικό πρωτεϊνικό αντιγόνο συχνά είναι δύσκολο να απομονωθεί. Τυπικά τέτοια παραδείγματα είναι ανθρώπινα αυτοαντιγόνα ή αντιγόνα ιών που προσβάλλουν τον άνθρωπο και που δύσκολα εκφράζονται σε μη ανθρώπινα κύτταρα ή κυτταρικές σειρές. Η παραγωγή των αντιγόνων αυτών σε επαρκή ποσότητα για εμπορικά διαθέσιμες διαγνωστικές τεχνικές μπορεί να γίνει είτε με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες

είτε με πεπτιδική σύνθεση, η οποία είναι μια πλήρως ελεγχόμενη χημική διαδικασία, σε αντίθεση με την in vivo παραγωγή μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Έτσι τα πεπτίδια που προκύπτουν συνθετικά υπερτερούν από άποψη καθαρότητας σε σχέση με τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που συχνά εμπεριέχουν προσμίξεις βακτηριακών πρωτεϊνών. Επιπλέον τα πεπτίδια είναι πιο σταθερά μόρια και μπορούν να τροποποιηθούν ή να υποβληθούν σε κάποια χημική επεξεργασία για την εφαρμογή τους σε διαφορετικές διαγνωστικές τεχνικές (πχ ειδική ομοιοπολική σύζευξη τους σε μικροπλακίδια τιτλοποιήσης ανοσοενζυμικής μεθόδου ELISA). Οι ανοσοχημικές μέθοδοι στερεάς φάσης (π.χ. RIA, ELISA) που στηρίζονται στη χρήση συνθετικών πεπτιδίων είναι πολύ ευαίσθητες, εξειδικευμένες και επιτρέπουν τον ποσοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων (4). Τέτοιες μέθοδοι εφαρμόζονται σήμερα: (i) στην ιολογία (5) και κυρίως στην ανίχνευση αντισωμάτων κατά του ιού της ηπατίτιδας C (6,7) ή του ιού του συνδρόμου της επίκτητης ανοσοποιητικής ανεπάρκειας (AIDS) (8). (ii) στον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων, τόσο σε οργανοειδικές αυτοάνοσες ασθένειες όπως η βαριά μυασθένεια (Myasthenia Gravis) (9) και η νόσος του Graves (εξώφθαλμος βρογχοκήλη ) (10), όσο και σε πολυσυστηματικές αυτοάνοσες ασθένειες όπως η μικτή νόσος του συνδετικού ιστού (MCTD) (11). (iii) μια άλλη χρήση των συνθετικών πεπτιδίων για διαγνωστικούς σκοπούς που δεν εμπίπτει στο πλαίσιο αλληλεπίδρασης αντιγόνου αντισώματος είναι η χρήση ραδιοσεσημασμένων πεπτιδίων σε απεικονιστική τεχνική (σπινθηρογράφημα), όπως στην περίπτωση διάγνωσης εν τω βάθει θρομβώσεων ή πνευμονικών εμβολών (12). Α.Ι.3 Ανοσοποιήσεις-Εμβόλια Ενα από τα σημαντικότερα επιτεύγματα της ανοσολογίας είναι η χρήση των εμβολίων για την ανάπτυξη τεχνητής ενεργητικής ανοσίας στον άνθρωπο έναντι πολλών λοιμογόνων παραγόντων. Τα υπάρχοντα εμβόλια σήμερα αποτελούνται κυρίως

από εξασθενημένα μικρόβια, νεκρά μικρόβια και τοξίνες ή ατοξίνες μικροβίων. Η παρασκευή των εμβολίων αυτών όμως παρουσιάζει ορισμένα προβλήματα όπως (i) δυσκολίες ελέγχου της λοιμογόνου δύναμης των εξασθενημένων ή νεκρωμένων μικροβίων που τυχόν παραμένει, (ii) δυσκολίες παρασκευής επαρκούς ποσότητας εμβολίων από ιούς και παράσιτα που δεν αναπτύσσονται σε καλλιέργειες και (iii) την γενετική και αντιγονική μεταβλητότητα που παρουσιάζουν οι ιοί και τα παράσιτα με αποτέλεσμα να αναπτύσσονται καινούργια ανθεκτικά στελέχη που απαιτούν τη δημιουργία νέων εμβολίων. Για αυτούς τους λόγους σήμερα υπάρχει τάση ανάπτυξής συνθετικών εμβολίων είτε με τη παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών είτε με χημική σύνθεση πεπτιδίων (13). Η θεμελίωση της χρήσης των συνθετικών πεπτιδίων σαν εμβόλια έγινε ήδη από τη δεκαετία του 1960 όταν μελετήθηκε η αντιγονικότητα σε μοριακό επίπεδο (14). Από τότε, λόγω και της ραγδαίας ανάπτυξης των μοριακών τεχνικών, έγινε δυνατόν να προσδιοριστεί η πρωτοταγής δομή πολλών χιλιάδων πρωτεϊνών, γεγονός που έδωσε βάση στη συνθετική προσέγγιση της παρασκευής εμβολίων. Έτσι σήμερα έχουν προσδιοριστεί οι αντιγονικοί καθοριστές πολλών μικροβιακών και ιικών πρωτεϊνών, η πλειοψηφία των οποίων έχει παρασκευαστεί συνθετικά και μπορεί δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για εμβολιασμό. Τέτοια εμβόλια είναι: (i) Αντι-βακτηριάκα εμβόλια. Συνθετικά τμήματα της στρεπτοκοκκικής Μ πρωτεΐνης (15), της τοξίνης της διφθερίτιδας (16) και της τοξίνης της χολέρας (17) έχει βρεθεί ότι είναι αντιγονικά και ικανά να επάγουν τον σχηματισμό αντισωμάτων με εξουδετερωτική δράση που παρέχει προστασία από τον αντίστοιχο βακτηριακό παράγοντα. (ii) Αντι-ιικά εμβόλια. Αντιγονικά δραστικά πεπτιδικά ανάλογα έχουν παρασκευαστεί για το HBs αντιγόνο του ιού της ηπατίτιδας Β (18), την αιμοσυγκολιτίνη του ιού της γρίπης (19) και της VP1 πρωτείνης του Foot and Mouth Disease Virus (20). (iii) Αντι-παρασιτικά εμβόλια. Για το παράσιτο της ελονοσίας P. falciparum έχουν βρεθεί συνθετικά πεπτίδια με προστατευτική από το παράσιτο δράση (21)

Ένα γενικό πρόβλημα που παρουσιάζει ο εμβολιασμός με ανασυνδυασμένες πρωτείνες ή συνθετικά ανάλογα τους είναι η ανάγκη χρήσης ανοσοενισχυτικού για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της ανοσίας που επιδιώκεται. Έτσι ενώ σε πειραματόζωα χρησιμοποιείται το ανοσοενισχυτικό του Freund (ειδικό γαλάκτωμα που εμπεριέχει νεκρά μυκοβακτηρίδια), στον άνθρωπο δεν είναι δυνατό αυτό να χρησιμοποιηθεί. Για το σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί συνθετικά ανοσοενισχυτικά, όπως πεπτίδια ανάλογα της Ιντερλευκίνης 1 (3), ανάλογα της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (HSP70) (22) ή ολιγοπεπτίδια συζευγμένα με λιπίδια (23), τα οποία μπορούν να ενσωματωθούν στο συνθετικό πεπτίδιο - εμβόλιο προσδίδοντας του και ενδογενή ανοσοενισχυτική δράση. Για να επιτευχθεί αποτελεσματική ανοσοποιήση, θα πρέπει επίσης να υπάρχει άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ Τ-βοηθητικών και Β-λεμφοκυττάρων, τα οποία για το σκοπό αυτό θα πρέπει να αναγνωρίζουν αντιγονικούς καθοριστές (επιτόπους) στο ίδιο μόριο. (24). Η αναγνώριση επιτόπων από τα Τ-λεμφοκύτταρα όμως παρουσιάζει εξάρτηση από τον απλότυπο του μεγίστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας με αποτέλεσμα η ανοσολογική απάντηση στον εμβολιασμό να εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο του κάθε ανθρώπου (25). Παρόλα αυτά υπάρχουν ορισμένοι επίτοποι Τ λεμφοκυττάρων, που δεσμεύονται σε πληθώρα διαφορετικών αντιγόνων ιστοσυμβατότητας, όπως κάποιοι επίτοποι από την τοξίνη του τετάνου (26). Οι επίτοποι αυτοί μπορούν με τη χρήση της πεπτιδικής σύνθεσης να συνδυαστούν με ένα ειδικό επίτοπο Β-λεμφοκυττάρων σε ένα πεπτίδιο-υβρίδιο που ξεπερνά τον περιορισμό των απλοτύπων στην ανοσολογική απόκριση (27). Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι η χρήση συνθετικών πεπτιδίων ως εμβόλια παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα όπως (i) η παρασκευή αντιγόνου σε επαρκή ποσότητα για ιούς και παράσιτα που δύσκολα αναπτύσσονταί σε καλλιέργειες, (ii) η δυνατότητα σύνδεσης διαφορετικών πεπτιδίων στο ίδιο μόριο φορέα επιτρέποντας έτσι την παρασκευή πολυδύναμων συνθετικών εμβολίων, (iii) ο περιορισμός ανάπτυξης αντισωμάτων από άσχετα αντιγόνα-προσμίξεις λόγω της υψηλής καθαρότητας των συνθετικών πεπτιδίων, (iv) η δυνατότητα παρασκευής εμβολίων

με ενδογενή ανοσοενισχυτική δράση και (v) η δυνατότητα σύνθεσης πεπτιδίων που να ξεπερνούν γενετικούς περιορισμούς στη παραγωγή αντισωμάτων. Α.Ι.4 Θεραπευτικές χρήσεις πεπτιδίων Τα τελευταία χρόνια διαφαίνεται η δυνατότητα χρήσης συνθετικών πεπτιδίων με βιολογική δραστικότητα και ικανότητα τροποποίησης της ανοσολογικής απόκρισης για θεραπευτικούς σκοπούς. Έτσι πολλά συνθετικά πεπτίδια σε μελέτες με πειραματόζωα και σε κλινικές δοκιμές έχει βρεθεί ότι διαθέτουν σαφή θεραπευτικά αποτελέσματα, όπως στις παρακάτω περιπτώσεις: Α.Ι.4.1 Νεοπλασίες-Καρκίνος: Τα συνθετικά πεπτίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε περιπτώσεις κακοήθους όγκου με τρεις κυρίως τρόπους: (i) με απευθείας δράση κατά του όγκου, (ii) με ενίσχυση - καθοδήγηση της άμυνας του οργανισμού προς τον όγκο και (iii) με παρεμπόδιση των μεταστάσεων του όγκου προς απομακρυσμένα όργανα και ιστούς. (i) Απευθείας δράση κατά των καρκινικών κυττάρων έχουμε στην περίπτωση λεμφώματος Β-λεμφοκυττάρων, όπου έχουν βρεθεί συνθετικά πεπτίδια που δεσμεύονται σε ειδικές ανοσοσφαιρίνες επιφανείας των κυττάρων του λεμφώματος. Τα πεπτίδια αυτά όταν παρασκευασθούν σε σύνδεση με μια ραδιενεργή ένωση επιτρέπουν την ειδική καταστροφή των κυττάρων στόχων τους (28). Άλλα πεπτίδια με αντι-νεοπλασματική δράση είναι πεπτίδια-τμήματα της C-αντιδρώσας πρωτείνης (CRP). Τα πεπτίδια αυτά έχει βρεθεί ότι περιορίζουν την ανάπτυξή του όγκου, τις μεταστάσεις και αυξάνουν την επιβίωση των πειραματοζώων σε προκλινικά μοντέλα νεοπλασμιών (29). (ii) Με την ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος και καθοδήγηση του προς τον όγκο μπορούμε να έχουμε ειδική επαγωγή είτε της κυτταρικής είτε της χυμικής

ανοσίας. Έτσι επαγωγή αντινεοπλασματικών κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων που καταστρέφουν καρκινικά κύτταρα μελανώματος μπορεί να επέλθει με τη χρήση συνθετικού πεπτιδίου - αναλόγου προϊόντος του ογκογονιδίου MAGE-3 (30). Παρόμοια χυμική ανοσολογική απάντηση με τη μορφή αντισωμάτων εναντίον νεοπλασματικών κυττάρων καρκίνου των ωοθηκών ή του μαστού μπορεί να επέλθει με τη βοήθεια πεπτιδίου που εμπεριέχει τις αλληλουχίες ενός ειδικού επιτόπου Β- λεμφοκυττάρων της MUC-1 πρωτείνης και ενός γενικού επιτόπου Τ- λεμφοκυττάρων (31). (iii) Η μετάσταση των καρκινικών κυττάρων είναι πορεία που περιλαμβάνει αρχικά την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων τόσο σε ειδικά μόρια πρόσδεσης που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων του ενδοθηλίου του αγγειακού και λεμφικού δικτύου, όσο και σε γλυκοπρωτεΐνες του μεσοκυττάριου χώρου και στη συνέχεια την διείσδυση τους διαμέσου της βασικής μεμβράνης. Συνθετικά πεπτίδια που εμποδίζουν την μετάσταση μπορούν να παραχθούν με βάση την πρωτοταγή δομή τμημάτων των γλυκοπρωτεϊνών του μεσοκυττάριου χώρου και ειδικότερα της φιμπρονεκτίνης, λαμινίνης, και του κολλαγόνου τύπου IV (32). Έτσι διάφορα πεπτιδικά ανάλογα της «RGD» αλληλουχίας συγκόλλησης που εμπεριέχεται στη φιμπρονεκτίνη έχει βρεθεί ότι εμποδίζουν την μετάσταση νεοπλασματικών κυττάρων μελανώματος (33). Επίσης, πεπτίδια με ανάλογη δράση έχουν παραχθεί συνθετικά με βάση τις αλληλουχίες της λαμινίνης και του κολλαγόνου τύπου IV (34, 35). Α.Ι.4.2 Αυτοάνοσες νόσοι: Οι αυτοάνοσες ασθένειες χαρακτηρίζονται κυρίως από την ενεργοποίηση του ανοσολογικού συστήματος κατά ιδίων αντιγόνων υπό την μορφή αυτοαντισωμάτων ή και αυτοδραστικών κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυτταρικών κλώνων. Ορισμένοι τύποι των αυτοάνοσων ασθενειών συσχετίζονται με ορισμένους απλοτύπους του μεγίστου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (HLA). Στις περιπτώσεις αυτές συνθετικά πεπτίδια που συνδέονται ισχυρά με τα συγκεκριμένα HLA μπορούν

να περιορίσουν την ποσότητα των διαθέσιμων αντιγόνων ιστοσυμβατότητας για την εκδήλωση της αυτοάνοσης αντίδρασης, χωρίς ωστόσο να προκαλούν γενικευμένη ανοσοκαταστολή λόγω της συνύπαρξης και άλλων HLA ισοτύπων που δεν παρεμποδίζονται από τα συγκεκριμένα πεπτίδια (36). Μία άλλη θεραπευτική εφαρμογή των συνθετικών πεπτιδίων στις αυτοάνοσες ασθένειες είναι η δέσμευση των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων. Έτσι στη βαρεία μυασθένεια (μυασθένεια Gravis) τα αυτοαντισώματα κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AChR) μπορούν να απομακρυνθούν εν μέρει με μία διαδικασία κάθαρσης του πλάσματος, όπου δεσμεύονται σε στήλη πεπτιδικού αναλόγου του κύριου αντιγονικού καθοριστή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AchR). (37). Τέλος, έχουν αναφερθεί συνθετικά πεπτίδια ανάλογα τμημάτων της φιμπρονεκτίνης (πχ RGD πεπτίδια), που προκαλούν ύφεση της ρευματοειδούς αρθρίτιδας εμποδίζοντας την ικανότητα προσκόλλησης των λεμφοκυττάρων, που στη νόσο αυτή εμφανίζεται αυξημένη (38). Α.Ι.4.3 Μεταμοσχεύσεις Η απόρριψη αλλομοσχεύματος οφείλεται στην ειδική αναγνώριση των αντιγόνων ιστοσυμβατότητας (MHC) των ιστών του μοσχεύματος από κυτταροτοξικά CD8+ Τ-λεμφοκύτταρα του δέκτη. Η κυτταρική απάντηση καθορίζεται από την μοριακή αλληλεπίδραση του υποδοχέα Τ-λεμφοκυττάρων (TCR) του δέκτη με τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας των ιστών του μοσχεύματος. Για την παρεμπόδιση της αντίδρασης αυτής έχουν χρησιμοποιηθεί πεπτίδια - ανάλογα περιοχών του MHC (μεταβλητών και μη) (39) καθώς και πεπτιδικό ανάλογο της μεταβλητής περιοχής του TCR με πολύ καλά αποτελέσματα (40). Α.I.4.4 Άλλες χρήσεις Συνθετικά πεπτίδια έχουν επίσης τις παρακάτω θεραπευτικές χρήσεις:

(i) Αντιθρομβωτικά. Πεπτίδια που εμπεριέχουν την RGD αλληλουχία μπορούν να παρεμποδίσουν την συγκόλληση των αιμοπεταλίων και κατά συνέπεια τη θρόμβωση και διάφορες θρομβοεμβολικές καταστάσεις (41). (ii) Αντιφλεγμονώδη. Συνθετικά πεπτίδια ανάλογα της σελεκτίνης μπορούν να παρεμποδίσουν την προσκόλληση των ουδετερόφιλων στα κύτταρα του ενδοθηλίου, και την εμφάνιση έτσι της αντιφλεγμονώδους δράσης τους (42).

Α.ΙΙ. ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ Τα πεπτίδια είναι αμίδια που σχηματίζονται με ακυλίωση της αμινομάδας ενός αμινοξέος από την καρβοξυλομάδα ενός άλλου, σύμφωνα με την αντίδραση: Η ομάδα -CONH- που προκύπτει ονομάζεται πεπτιδικός δεσμός. Η αντίδραση αυτή δεν ευνοείται θερμοδυναμικά και ενώ στο κύτταρο καταλύεται από κατάλληλο σύμπλεγμα t-rna-ριβοσώματος-mrna, στο εργαστήριο απαιτεί δραστικές συνθήκες. Οι δραστικές συνθήκες όμως δημιουργούν μια σειρά από παράπλευρες αντιδράσεις και παραπροϊόντα, και έτσι στην πράξη χρησιμοποιούνται ηπιότερες συνθήκες με ταυτόχρονη ενεργοποίηση των ομάδων πού συμμετέχουν στο πεπτιδικό δεσμό. Επειδή πρακτικά δεν υπάρχει μέθοδος κατάλληλη για την ενεργοποίηση της αμινομάδας, εφαρμόζεται ενεργοποίηση του καρβοξυλίου. Κατά τη σύζευξη δύο αμινοξέων, εκτός από τις ομάδες του ενεργοποιημένου καρβοξυλίου και της αμινομάδας που αντιδρούν, υπάρχουν και άλλες ομάδες που μπορούν να δώσουν ανεπιθύμητες αντιδράσεις. Αυτές είναι η αμινομάδα του αμινοξέος που δίδει το καρβοξύλιο, η καρβοξυλομάδα του αμινοξέος που δίδει την αμινομάδα καθώς και οι δραστικές ομάδες των παράπλευρών αλυσίδων που τυχόν υπάρχουν. Έτσι είναι αναγκαία η παροδική προστασία των ομάδων αυτών. Τα στάδια της πεπτιδικής σύνθεσης συμφωνά με τα παραπάνω είναι: (i) Παροδική προστασία της α-αμινομάδας του Ν-τελικού αμινοξέος. Σκοπός αυτού του σταδίου είναι η μείωση της πυρηνοφιλίας της αμινομάδας με μια προστατευτική ομάδα, η οποία αφενός θα είναι σταθερή στις συνθήκες της σύζευξης, αφετέρου θα απομακρύνεται εύκολα μετά το τέλος της. Η πρώτη τέτοια ομάδα πού χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία είναι η βενζυλοξυκαρβονυλική ή Ζ-ομάδα, ενώ στην ίδια κατηγορία ανήκουν οι t-βουτυλοξυκαρβόνυλο (BOC), 2- διφαινυλισοπροπυλοξυκαρβόνυλο (Bpoc) και η 9-φλουορενυλομεθυλοξυκαρβονυλο (Fmoc) ομάδες.