في الموت الخموي المبرمج لألشكال أمامية السوط الليشمانيا المدارية

Transcript

1 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم دور البروتين كيناز )PKC( C في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية الممخص 119 محمد أنس المعمم* شادي سكرية** محمود قويدر*** تعد الميشمانيا المدارية Leishmania tropica من الطفيميات وحيدات الخمية واسعة االنتشار في سورية والكثير من دول العالم والتي تسبب داء الميشمانيات الجمدية من النمط الجاف. ما ي ازل التوصل إلى عالج نوعي بدون آثار جانبية أو إلى لقاحات فعالة ضد داء الميشمانيات ىدف بعيد المنال لذلك ىناك الكثير من األبحاث الحديثة تركز اىتماميا في د ارسة اآلليات البيولوجية ليذا الطفيمي الستيدافيا بشكل موجو عند تطوير مثل ىذا العالج أو المقاح. ييدف ىذا العمل إلى التحري عن دور السبيل الخموي الخاص بالبروتين كيناز (PKC) C في الموت الخموي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيمي الميشمانيا المدارية من خالل د ارسة تأثير مادة مثبطة ليذا السبيل وىي.(STS) Staurosporine 10µM ب أظيرت النتائج أن معالجة األشكال أمامية السوط المستنبتة من المثبط كافية لكبح السبيل اإلشاري ل PKC بشكل كمي بينما أظير اختبار السمية أن تركيز المثبط القاتل لمنصف كان 2.146µM).(IC 50 = وبينت نتائج مقياس التدفق الخموي أن المعالجة بيذا المثبط تؤدي لدخول الخاليا بالموت الخموي المبرمج حيث ارتفعت نسبة الطفيميات متشدفة المادة الو ارثية بشكل كبير بعد المعالجة بيذا المثبط. تشير نتائجنا إلى إمكانية تطوير است ارتيجيات عالجية لداء الميشمانيات معتمدة عمى استخدام ىذا المثبط كدواء قاتل لمطفيمي أو استخدامو في تحضير لقاح

2 دور البروتين كيناز C )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية مكون من طفيميات الميشمانيا المضعفة بالمعالجة بيذا المثبط. *طالب ماجستير - قسم عمم الحياة الحيوانية كمية العموم جامعة دمشق **أستاذ مساعد في عمم المناعة الطفيمية قسم عمم الحياة الحيوانية ***مدرس في عمم البيولوجيا الجزيئية قسم عمم الحياة الحيوانية كمية العموم - جامعة دمشق كمية العموم - جامعة دمشق 121

3 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم The inhibition role of protein kinase C (PKC) in programmed cell death of Leishmania tropica promastigotes Mohamed Anas AL Moalem, Mahmoud Kweider, Chadi soukkarieh Abstract Leishmania tropica is a protozoan parasite which is widespread in Syria and many countries in the world, and causes dry cutaneous leishmaniasis disease (CL). Getting specific treatment without side effects or effective vaccines against leishmaniasis is still far aim to gain. Therefore, many researches have focused on studying the biological mechanisms for the parasite as targets to develop novel drugs or vaccine. The aim of this work was determining the role of Protein kinase C (PKC) signaling pathway in apoptosis of Leishmania tropica promastigotes, through studying effects of PKC specific inhibitor Staurosporine (STS) on the parasite. Our results showed that treated L. tropica with 10µM Staurosporine was enough to inhibit PKC pathway completely, while viability test showed that the concentration of STS to inhibit cell growth by 50% (IC 50 = 2.146μM). Flow cytometry result demonstrated that STS induces apoptosis in Leishmania, where the ratio of parasites with fragmented DNA increased after treatment with inhibitor. These results indicate to the possibility of developing therapeutic strategies for leishmaniasis by using PKC inhibitor as 121

4 دور البروتين كيناز C )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية antileishmaniasis drug or using it in preparation of a vaccine consisting of attenuated Leishmania with STS. الكممات المفتاحية :Key words كيناز الميشمانيا المدارية Leishmania tropica بروتين Staurosporine التموت Apoptosis الميشمانيا الجمدية (PKC) C.cutaneous leishmaniasis 122

5 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم المقدمة :Introduction التموت ىي عممية حيوية تسمى بالموت الخموي المبرمج وىي أحد أشكال الموت الخموي المشابو لالنتحار حيث درست ىذه العممية 123 بكثرة عند الحيوانات الفقارية والالفقارية كالديدان الخيطية والحش ارت والبرمائيات والثدييات] 1 2[. تشير الد ارسات إلى ان التموت حادثة ىامة بالنسبة لمكائنات كثي ارت الخاليا وخاصة أثناء م ارحل وكذلك حيوية لتنظيم نمو النسج واستق اررىا] 3 [. تت ارفق عممية التموت تصيب الخمية التنامي الجنيني بتغي ارت شكمية وكيميائية كانكماشيا وظيور انتفاخات عمى سطح الغشاء الخموي ال تمبث أن تنفصل عنيا عمى شكل فقاعات )Blebbing( باإلضافة لفقدان وظيفة الميتاكوندرية. أما عمى مستوى النواة فيحدث تكثف لمجينوم لتبدأ بعدىا المادة النووية بالتشدف] 4 5[. ساد االعتقاد بأن التموت يحدث في الحيوانات كثي ارت الخاليا فقط لكن في السنوات األخيرة أصبح ىناك كثير من الشواىد عمى حدوث التموت في الكائنات وحيدات الخمية كالميشمانيا والتريبانوزما حيث أكدت الد ارسات حدوث التغي ارت الشكمية والكيميائية الحيوية الم ارفقة لمتموت والتي تنتيي بتشدف المادة الو ارثية والموت عند ىذه الكائنات] 6 7[. إن خاصية التموت التي تتميز بيا الكائنات وحيدة الخمية كالميشمانيا تتم بغية ضبط نمو وتكاثر خاليا النوع في نفس الوسط حيث يتم اإلبقاء عمى الخاليا األصمح واألقوى والتي تكون قادرة عمى مقاومة اآللية المناعية لمكائن المضيف] 4 المواد المحفزة أىم من لمتموت لبعض األم ارض كداء الميشمانيا يعد استعمال 6[. االست ارتيجيات المتبعة في الد ارسات الحديثة إليجاد دواء ومن ىذه المواد Pentavalent antimony ]9 8[ miltefosi amphotericin B تعد من أشير المواد المحفزة لمتموت الخموي الخاص بالبروتين كيناز ويعتمد كذلك فأن مادة عمل ىذه المادة مبدأ (STS) Staurosporine (PKC) C وذلك من خالل عمى تثبيط السبيل التنافس مع جزيئات األدينوزين ثالثي الفوسفات ATP في االرتباط مع موقع ربط ATP عمى الكيناز وبالتالي يصبح الكيناز غير قادر عمى فسفرة الركيزة الخاصة بو] 10 11[ وتؤكد الد ارسات عمى الدور اليام لمسبيل الخموي لPKC حدوث التموت في باشت ارك الميتاكوندريا فعند نزع

6 دور البروتين كيناز C استقطاب )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية غشائيا يتحرير السيتوكروم ضمن C السيتوبالسما مما يؤدي إلى الكاسباز الذي ينتيي بتشدف المادة الو ارثية وبالتالي حدوث التموت] 12 أن معالجة بعض أنواع الميشمانيا بمادة.]13 تؤدي إلى STS تأثير سمي كبير إال أنو تفعيل فقد تبين كان متفاوتا من نوع آلخر كما أشارت د ارسة إلى أن معالجة الطفيمي بيذه المادة تحدث تغي ارت شكمية بحجم الخمية ومظير جيب السوط [ (flagellar pocket).]14 الجمدية والداء إن الميشمانيات طفيمي في سورية الميشمانيا المدارية ىو و مستمر في االنتشار أحد األنواع المسؤولة عن اإلصابات بالميشمانيا تبعا لمنظمة الصحة العالمية فإن عدد اإلصابات في زيادة مطردة لم يتم إيجاد دواء فعال في أماكن جديدة من دون ]15[ آثار جانبية آمن وفعال والكثير من األبحاث العالمية تحاول حاليا باالعتماد عمى طفيميات مضعفة بالرغم من كما (attenuated vaccine) معين أو من خالل إحداث طفرة معينة] 16 17[. تم في ىذا البحث ساللة عزل لمتأكد من أنيا لميشمانيا مدارية المدارية إيجاد االىتمام العالمي بداء لم يتم التوصل إلى لقاح لقاح ضد ىذا الداء بواسطة المعالجة بعقار ليشمانيا من أحد المرضى بداء الميشمانيات عمى برىنا ومن ثم دور البروتين كيناز عمى المحافظة عمى حياة الطفيمي من خالل حساب قدرة عمى تثبيط فسفرة الكيناز مثبط C ثم تنميطيا في الميشمانيا PKC نوعي ل ثم C التركيز القاتل لنصف الخاليا يتبعيا الميشمانيا حساب التأثير السمي لممثبط عمى الطفيمي وحساب د ارسة تأثير المدارية من خالل مقارنة عينة شاىدة PKC.PKC -3 المواد والط ارئق :Materials and methods 1-3 المواد المستخدمة في البحث وسط زرع خموي عمى زيادة نسبة التموت عند مع عينة معالجة بالمثبط النوعي ل RPMI1640 مصل بقري جنيني fetal Bovine serum مجموعة لقياس MTT قابمية الحياة شركة Sigma األمريكية. محمول موقي آغار PBS جميع المواد السابقة من إنتاج 124

7 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم مجموعة استخالص (Wizard genomic DNA purification kit) DNA آغاروز واسمة أطوال معيارية Ethidium bromide Loading buffer DNA Ladder المحمول المحل المكون من )%1 تريتون 100X كموريد الصوديوم بتركيز 150mM تريس- حمض كمور الماء بتركيز 50mM دي أوكسي كوالت الصوديوم %1 )ph:7.5 مثبط بروتياز ىذه المواد من إنتاج شركة Promega األمريكية. مجموعة كشف تشدف (DNA fragmentation) DNA صنع شركة Roche األلمانية مجموعة كشف نشاط البروتين كينازC إنتاج شركة.Enzo life science 2-3 الطرق عزل الميشمانيا وز ارعتها: تم عزل عينة دموية من آفة جمدية لمريض مصاب بالميشمانيا حيث زرعت العينة في وسط استنبات نصف صمب يحتوي آغار ووسط ز ارعة خموية RPMI-1640 في درجة ح اررة 26 مئوية لمدة أسبوعين حيث تتمايز الميشمانيا داخمية السوط إلى ليشمانيا أمامية السوط ثم تنقل الخاليا أمامية السوط إلى وسط ز ارعة سائل RPMI-1640 والمدعم ب % 10 مصل بقري جنيني. تنميط الميشمانيا: استخالص :DNA تم استخالص المادة الو ارثية لخاليا الميشمانيا المدارية المعزولة باستعمال مجموعة استخالص (Wizard genomic DNA purification kit) DNA من إنتاج شركة WI) (Promega, Madison, وفق الخطوات التالية: يؤخذ 10 مل وسط االستنبات ثم نرسب وتغسل الرسابة بمحمول موقي PBS باستخدام المثفمة 800Xg( 15 د( تعمق الرسابة بمحمول حل النوى Nuclei Lysis Solution مع التحريك بمطف ثم نقوم بترسيب البروتينات بالحضن مع 200µl من محمول ترسيب البروتين protein precipitation solution لمدة 5 دقائق نثفل وينقل السائل الطافي ألنبوب يحتوي 600µl من االيزوبروبانول لترسيب DNA عمى شكل خيوط بيض حيث 125

8 دور البروتين كيناز C تغسل باستخدام محمول اإليتانول )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية الرسابة بإضافة تحل تثفل و ثم %70 100µl محمول اإلماىة Rehydration Solution والتسخين عند الدرجة 65 C لمدة ساعة. المدور الح ارري :PCR يتم تضخيم الدنا المعزول بالمدور الح ارري و الب اريمرين CGAGTAGCAGAAACTCCCGTTCA-3' CSB2 '5 و CGCAGAACG-3' CSB1 5'-ATTTTTCGCGATTTT النوعيين المتغيرة variable region الحمقي DNA من.minicircle kinetoplast DNA (kdna) المحمية باإلضافة لساللتين مرجعيتين األولى لصانعة السوط يتم تضخيم لميشمانيا kdna من باستعمال لمقطعة الخاص بالميشمانيا الخاص بالعزلة كبرى Leishmania major (MH/SY/91/LEM2397) والثانية لميشمانيا مدارية L.tropica (MHOM/SY/90/LEM2066) لجامعة مونبمييو الفرنسية(. )مصدر العزالت المرجعية ترحل نواتج التضخيم من البنك المرجعي بجياز الرحالن الكيربائي األفقي عمى ىالم آغاروز %1 ويتم حساب طول شدف DNA المضخم باالعتماد عمى واسمة أطوال معيارية.(Promega, USA) DNA Ladder تأثير المثبط STS عمى فعالية :PKC يتم تحضير معمق خموي )حالت خموية( لطفيمي الميشمانيا شاىدة بت اركيز مت ازيدة من مادة )5, 10, 15µM( STS 5 ولمدة التثفيل من خاليا الميشمانيا المدارية وتغسل بالمحمول الموقي وأخرى لخاليا معالجة ساعات. PBS 2500rpm( المحمول المحل تركيز البروتين يقاس 15 د( والمدعوم لمعينات الرسابة ت عمق بمثبط البروتياز بطريقة لمدة عشرة دقائق عمى الثمج التالي ب اردفورد باستعمال يرسب حيث مرتين بواسطة من 0.5ml ب.(protease inhibitor cocktail) جياز السبيكتروفوتومتر عمى طول الموجة 590 نانومتر. بعد ذلك يتم قياس نشاط البروتين كيناز C لممعمقات الخموية باستخدام أطباق الحفر حفرة 96 ويضاف ليا جزيئات مطمية بالركيزة الخاصة بPKC لتبدأ عندىا ATP حيث توضع العينات في عممية الفسفرة وعند نياية التفاعل تضاف 126

9 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم أضداد ترتبط بشكل نوعي مع الركيزة المفسفرة فقط ثم يضاف أضداد اتجاه أضداد الركيزة مقترنة بأنزيم البيروكسيداز )أضداد ثانوية( بعدىا تضاف الركيزة الخاصة باألضداد الثانوية وىي ركيزة تت ارميتيل البنزيدين TMB-substrate ليتم إيقاف التفاعل بعد نصف ساعة باستخدام محمول إيقاف التفاعل Stop soluation وبالنياية يتم قياس الكثافة الضوئية بطول موجة 450 نانومتر باستعمال قارئ األلي از. يحسب نشاط البروتين كيناز بالعالقة: نشاط الكيناز = )امتصاصية العينة امتصاصية الشاىد( /كمية البروتين. سمية اختبار :STS استخدم اختبار الطريقة المونية 3-(4, 5-methylthiazol-2-yl)-2, 5-( MTT )diphenyltetrazolium bromide لقياس قابمية الحياة Viability في عينات من الميشمانيا المعالجة بت اركيز مت ازيدة من مادة,1(,2,3,4 5µM( STS لمدة 24 ساعة ولكل تركيز ثالث مكر ارت. يعتمد ىذا االختبار عمى تحويل صبغة MTT الصف ارء إلى بمو ارت الفورما ازن البنفسجية بوساطة األنزيمات الميتاكوندرية لمخاليا الحية فقط. باختصار نيائي االختبار يبدأ بحضن العينات المعالجة وعينة مع صبغة الشاىد MTT %10 لمدة 3 ساعات بدرجة ح اررة 26 C بتركيز وعند نياية الزمن يتم حل بمو ارت الفورما ازن المتشكمة بمذيب خاص solvent( )MTT ليتم ق ارءة امتصاصية العينات عمى طول الموجة 540 نانومتر وحساب متوسط النسبة المئوية لقابمية الحياة لكل عينة باستخدام المعادلة التالية: )امتصاصية العينة / امتصاصية الشاىد( 100. تركيز الSTS القاتل لنصف الخاليا IC 50 ± االنح ارف المعياري. تشدف المادة الو ارثية :DNA fragmentation ي حسب باستخدام برنامج Excel والقيم تعطى كمتوسطات 127

10 دور البروتين كيناز C تعد عممية تشدف DNA خمية ما لذلك تم تطوير عدة تقانات دقة تقانة تعتمد عمى بناء النيايات )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية من أىم المؤش ارت التي تدل عمى حدوث عممية التموت في لكشف تشدف المادة الو ارثية كان من أىميا وأكثرىا أنزيم باستخدام DNA لشدف '3 الحرة Terminal (TDT) deoxynucleotidyl transferase وتدعى ىذه التقانة TUNEL مع نكميوتيدات موسومة بمادة مفمورة.(TDT-mediated dutp nick end labeling) يؤخذ 2 مميون خمية من الميشمانيا المدارية من عينتان األولى معالجة بالمثبط بتركيز STS IC 50 PBS الثانية و غير معالجة )شاىدة( ثالثة م ارت وتمدد ب 100µM با ارفورم الدىيد 4 ويتم غسل الخاليا محمول موقي باستخدام من وسط الزرع ت ثبت الخاليا بالحضن لساعة مع % بح اررة الغرفة تغسل العينات من جديد وتحضن الخاليا مع 100µM من محمول االنفاذية Permeabilisation solution لمدة دقيقتين عمى الثمج ت غسل العينات وتوضع في أنابيب عاتمة لتبدأ الوسم )النكميوتيدات الموسومة( حاضنة محتوى سيتم مضاف ليا 5µM عممية الوسم بإضافة من إنزيم البناء 45µM TDT بعدىا 37 C تغسل العينات وتمدد في PBS 250µM DNA في خاليا العينات باستخدام جياز من محمول لمدة ساعة في وفي النياية يتم ق ارءة مقياس الجريان الخموي Flow cytometry حيث يقوم ىذا الجياز بفرز وعد األنماط المختمفة من الخاليا وفي عممنا التمييز FACSCalibaur برنامج خاص بالجياز بين الخاليا الحية والخاليا الداخمة في سبيل الموت الخموي المبرمج وتعرض النتائج عمى شكل مخطط إحصائي يدعى Histogram CellQuest software من إنتاج باستخدام (BD.biosciences) الد ارسة اإلحصائية: في ىذه الد ارسة تم قياس ثالثة مكر ارت لكل عينة في كل التجارب. تم حساب التركيز القاتل لمنصف لممثبط STS.Excel النتائج و المناقشة: باستخدام تحميل االنحدار الموغاريتمي ببرنامج األكسل 128

11 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم تنميط الميشمانيا باستخدام الPCR : تم تنميط طفيميات الميشمانيا بعد عزليا من المرضى واستنباتيا في الزجاج بواسطة تقانة ال PCR باستعمال الب اريمرين النوعيتين CSB2/ CSB1 كما ذكر في الط ارئق حيث تظير نتائج عممية الرحالن الكيربائي شدفة بطول 750 شفع من األسس اآلزوتية (bp) بالمقارنة مع ساللتين مرجعيتين األولى لميشمانيا مدارية والثانية لميشمانيا كبرى وتبين أن العزلة المحمية تنتمي لميشمانيا المدارية )الشكل 1(. انشكم )1(: صىسة هالو ا غبسوص نىبحج حفبػم PCR ببسخخذاو انبشا مش ه.CSB2/ CSB1 انبئش 1: واسمبث أطىال مؼ بس ت. انبئش 2: ػ ىت نسالنت محه ت حظهش ػصببت طىنهب.057bp انبئش 3: سالنت نشمبو ب مذاس ت مشجؼ ت وحظهش ػصببت طىنهب.750bp انبئش 4: سالنت نشمبو ب كبشي مشجؼ ت وحظهش ػصببت طىنهب.560bp أثر مثبط البروتين كيناز C في كبح عممية الفسفرة: بينت التجربة أن المثبط Staurosporine يكبح عمل البروتين كيناز C لميشمانيا المدارية بفعالية عالية في الزجاج. أظيرت النتائج النيائية أن نشاط الكيناز قد انعدم تماما عند معالجة الخاليا بت اركيز 15µM(.10( ولمدة 5 ساعات أي أن عممية الفسفرة بواسطة ىذا الكيناز قد كبحت تماما أما عند معالجة الميشمانيا بالتركيز 5µM فأن عممية الفسفرة قد انخفضت ح ىت %21 فقط مقارنة مع العينات الشاىدة الغير معالجة بالمثبط النوعي )الشكل 2(. 129

12 دور البروتين كيناز C )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية انشكم )2(: حأث ش مثبظ انPKC انىىػ Staurosporine ػه ػمه ت انفسفشة مه خالل ق بط وشبط هزا انك ىبص: انؼ ىت انغ ش مؼبنجت وشبط انك ىبص %177 انؼ ىت انمؼبنجت ب 5 مكشومىل اوخفبض ف انىشبط إن %21 انؼ ىبث انمؼبنجت ب 15µM),10) اوؼذو وشبط انك ىبص. اختبار السمية :Viability عولجت الميشمانيا بت اركيز متدرجة من المثبط STS وىي 5µM(,0(,1,2,3,4 لمدة 24 ساعة ثم تم حضن العينات مع ممون MTT لثالثة ساعات حيث سجمت قابمية الحياة انخفاضا بنسبة )73 %23.3( عمى التوالي )الشكل 3A(. بعد ذلك وباستخدام المنحني الموغاريتمي لبرنامج اإلكسل تم حساب التركيز القاتل لنصف الخاليا ±0.02) =2.162µM, IC ()الشكل 50.)3B 131

13 العيوشية % مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم y = ln(x) R² = تركيز المثبط µm IC 50 انشكم )3(: انخأث ش انسم نهمثبظ Staurosporine ػه خال ب انه شمبو ب انمذاس ت. (A) ب ه حأث ش مؼبنجت انه شمبو ب انمذاس ت بخشاك ض مخضا ذة مه Staurosporine مه خالل اسخخذاو انمهىن MTT ح ث اوخفضج قببه ت انح بة ببنمقبسوت مغ ػ ىت غ ش مؼبنجت ورنك ػىذ انمؼبنجت ببنخشاك ض انخبن ت 5µM( (B),1(.,2,3,4 حسبة انخشك ض انقبحم نهىصف ببسخخذاو مىحى نىغبس خم ببشوبمج اإلكسم. دور البروتين كيناز C في كبح تموت الميشمانيا: د رس تأثير المثبط STS في تحفيز التموت عند الميشمانيا المدارية باستعمال تقانة TUNEL التي تكشف عن التموت من خالل تحميل تشدف الدنا وذلك عن طريق وسم 131

14 دور البروتين كيناز C )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية النيايات المتشدفة بنكميوتيدات مفمورة ثم حساب نسبة الخاليا المتفمورة )المتموتة( باستخدام جياز قياس الجريان الخموي.Flow cytometry بينت التجربة التي استخدمت خاليا الميشمانيا المدارية المعالجة بالتركيز القاتل لمنصف IC 50 من المثبط لمدة 5 ساعات وخاليا غير معالجة أن نسبة الخاليا التي دخمت بالموت الخموي المبرمج ارتفعت بشكل حاد بعد المعالجة ففي حين لم تتجاوز نسبة الخاليا الداخمة بالتموت في العينات الغير معالجة %0.3 من مجموع الخاليا ارتفعت ىذه النسبة ألكثر من %86 في داللة واضحة عمى دور ىذا المثبط في تحفيز التموت في الميشمانيا المدارية )الشكل 4(. 132

15 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم انشكم )4(: انمؼبنجت بمبدة Staurosporine حض ذ ػذد خال ب انه شمبو ب انمذاس ت انذاخهت ببنخمىث وانخ ححخى DNA مخشذف. (A) مخطظ نؼ ىت غ ش مؼبنجت ح ث حظهش أن انىكه ىح ذاث انمفهىسة وانخ حم ض ػمه ت انخمىث حكبد حكىن مؼذومت. (B) ػ ىت مؼبنجت ببنمبدة ببنخشك ض انقبحم نهىصف وانخ حظهش اوض بح انمخطظ بشكم كب ش وحى ص بدة انفهىسة وببنخبن اسحفبع وسبت انخال ب انذاخهت ببنخمىث بشكم كب ش. (C) شكم حىض ح نهمخطط ه انسببق ه بشكم مخذاخم نخب ه انفشق ب ىهمب. المناقشة :Discussion 133

16 دور البروتين كيناز C )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية قمنا في ىذا العمل بعزل واستنبات ساللة من الميشمانيا الجمدية وتنميطيا بوساطة PCR حيث تبين أنيا تنتمي إلى نوع الميشمانيا المدارية ومن ثم درس دور المثبط النوعي لمبروتين كيناز Staurosporine C في تحريض الموت الخموي لألشكال أمامية السوط حيث بينت نتائجنا قدرة ت اركيز منخفضة )10µM( ليذا المثبط عمى كبح السبيل اإلشاري المفعل بوساطة البروتين كيناز C. كما تم في مرحمة قتل األشكال أمامية السوط إذ بين اختبار قابمية الحياة الكشف عن قدرة الحقة STS IC 50 =2.162µM ±0.02 وباستعمال اختبار بمسار الموت الخموي المبرمج متبوعا بقياس التدفق الخموي تبين في أن التركيز القاتل لمنصف يبمغ TUNEL المميز لمخاليا الداخمة تحريض الموت الخموي المبرمج في حوالي %89 من الخاليا المعالجة القادرة عمى تمييز الخاليا متشدفة.DNA قمنا المدارية ل نوعية في ىذا البحث بتنميط عزلة الميشمانيا لتحديد نوعيا وتبين أنيا من حيث تم استخدام تقانة التفاعل السمسمي لمبوليم ارز PCR (kdna) لمطفيمي تشير د ارسة سابقة إلى وجود حوالي و بواسطة نوع الميشمانيا ب اريم ارت ىذا من الDNA عند الميشمانيا وتقسم كل منيا إلى قسم ثابت وقسم متغير في النوع الواحد فيما تشير د ارسات أخرى الذي يختمف بين أنواع الميشمانيا] 18 لمبوليم ارز الجمدية] 20 [. في ىذا البحث المعتمد عمى ال تم إلى إمكانية تنميط أنواع الميشمانيا من خالل تضخيم القسم أثبات الخاص بالميشمانيا المدارية النعدام كافية ]19 kdna فاعمية مادة يمثل STS المتغير وتبين الد ارسة أن التفاعل التسمسمي الطريقة األكثر حساسية لتشخيص الميشمانيا حيث كانت المعالجة بتركيز نشاط السبيل الخموي الخاص بPKC في تثبيط السبيل الخموي لمبروتين كيناز C 10µM بشكل كمي لمدة خمس ساعات وىذا يشير إلى الفعالية الكبيرة ليذا المثبط وتتفق نتائجنا مع الد ارسة التي استخدم فييا ىذا المثبط عند الميشمانيا دونوفاني Leishmania donovani حيث انخفض نشاط المعالجة بنفس المثبط وبتركيز 15µM لمدة 3 ساعات] 12 [. %95 عند البروتين إلى 134

17 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم أثبتت التجارب التباين الكبير في التأثير السمي ليذا المثبط عمى أنواع الميشمانيا المختمفة فقد أشا ارت د ارسة سابقة أن تركيز المثبط القاتل لنصف خاليا الميشمانيا دونوفاني L. donovani ىو 0.261µM) (IC 50 = ]10[ أما بالنسبة لميشمانيا الكبرى.L major فأن التركيز القاتل لمنصف يرتفع ليصل إلى 5.3µM) (IC 50 = ]21[ بينما بينت نتائجنا أن معالجة الميشمانيا المدارية بالمثبط STS بتركيز 2.162µM كانت كافية لقتل نصف عدد خاليا الطفيمي في وسط الزرع المعالج كذلك أكدت د ارسة أن مادة Withaferin A ذات التأثير المشابو لممثبط STS أدت لقتل %98 من خاليا الميشمانيا دونوفاني في الزجاج عند معالجتيا بيذه المادة بتركيز 15µM لمدة سبع ساعات فقط] 12 [ كل ما سبق يؤكد الدور اليام لمسبيل الخموي الخاص بالبروتين كيناز C في قابمية حياة الميشمانيا والذي يختمف من حيث شدة التأثير من نوع آلخر. لتفسير كيفية موت الخاليا بتأثير ىذا المثبط قمنا في ىذه الد ارسة بالكشف عن تشدف الدنا الذي يميز دخول الطفيمي بالموت الخموي حيث أثبتنا ان كبح السبيل الخموي لPKC يؤدي لتموت الخمية وبالتالي نستنتج الوظيفة اليامة ليذا البروتين والذي يمنع الطفيمي من الدخول في الموت الخموي المبرمج وىذا يتوافق مع د ارسات سابقة عمى الميشمانيا دونوفاني والكبرى أشارت إلى أن المعالجة بأحد مثبطات الPKC أدى لحدوث نزع في استقطاب غشاء الميتاكوندري وتحرر السيتوكروم C إلى السيتوبالسما والتي تؤدي زيادة تركيزه في السيتوبالسما لتفعيل الكاسباز الذي يقود لتحطم الدنا وبالتالي حدوث التموت] 7 12[. عمى العكس من ذلك تشير إحدى الد ارسات التي أجريت عمى الميشمانيا دونوفاني إلى أن تثبيط سبيل PKC يؤدي إلى ظيور بعض عالمات التموت عند الطفيمي ويكبح دارتو الخموية] 10 [. االستنتاجات والتوصيات: نستنتج من ىذه الد ارسة الفعالية الكبيرة لممثبط Staurosporine في كبح نشاط PKC عند الميشمانيا المدارية حيث كانت المعالجة ب 10µM كافية لتثبيط الكيناز بشكل تام 135

18 دور البروتين كيناز C )PKC( في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية كذلك بينت د ارستنا عمى الدور اليام الذي يمعبو المثبط في كبح دخول الطفيمي في الموت الخموي المبرمج وأثبتت أن التركيز القاتل لنصف عدد خاليا الميشمانيا المدارية ىو.IC50 = 2,16µM بناء عمى النتائج السابقة فإننا نوصي بإج ارء عمميات تمنيع لمنماذج الحيوانية التجريبية باستعمال لقاحات مضعفة من طفيميات الميشمانيا المدارية المعالجة بالمثبط Staurosporine واعتماد التركيز القاتل لمنصف من المثبط في عالج الداء في النماذج الحيوانية والعمل عمى تصميم عقاقير في إطار است ارتيجية عالجية ونوصي كذلك بضرورة التحري عن وظائف األنواع االخرى من الكينا ازت عند الميشمانيا المدارية. 136

19 مجلة جامعة البعث المجلد 73 العدد شادي سكرية محمود قويدر محمد أنس المعلم انمشاجغ :References. 0 Steller, H., Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 267(5203): p Vaux, D.L., Toward an understanding of the molecular mechanisms of physiological cell death. Proc Natl Acad Sci U S A, 90(3): p Vaux, D.L. and A. Strasser, The molecular biology of apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 93(6): p Shaha, C., Apoptosis in Leishmania species & its relevance to disease pathogenesis. Indian J Med Res, 123(3): p Heussler, V.T., P.Kuenzi, and S. Rottenberg, Inhibition of apoptosis by intracellular protozoan parasites. Int J Parasitol, 31(11): p Zangger, H., J.C. Mottram, and N. Fasel, Cell death in Leishmania induced by stress and differentiation: programmed cell death or necrosis? Cell Death Differ,. 9(10): p Arnoult, D., et al., On the evolution of programmed cell death: apoptosis of the unicellular eukaryote Leishmania major involves cysteine proteinase activation and mitochondrion permeabilization. Cell Death Differ,. 9(1): p Berman, J., Current treatment approaches to leishmaniasis. Curr Opin Infect Dis, 16(5): p Khademvatan, S., et al., Miltefosine-induced apoptotic cell death on Leishmania major and L. tropica strains. Korean J Parasitol, 49(1): p Foucher, A.L., et al., Apoptotic marker expression in the absence of cell death in staurosporine-treated Leishmania donovani. Antimicrob Agents Chemother, 57(3): p Karaman,M.W., et al., A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity. Nat Biotechnol, 26(1): p Sen, N., et al., Apoptosis is induced in leishmanial cells by a novel protein kinase inhibitor withaferin A and is facilitated by apoptotic topoisomerase I-DNA complex. Cell Death Differ, 14(2): p

20 دور البروتين كيناز )PKC( C في تثبيط الموت الخلوي المبرمج لألشكال أمامية السوط لطفيلي الليشمانيا المدارية. 07 Debatin, K.M., D. Poncet, and G. Kroemer, Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene, 21(57): p Becker, S. and C.L. Jaffe, Effect of protein kinase inhibitors on the growth, morphology, and infectivity of Leishmania promastigotes. Parasitol Res, 83(3): p WHO, Cutaneous leishmaniasis in the Syrian Arab Republic.. 06 Naula, C., M. Parsons, and J.C. Mottram, Protein kinases as drug targets in trypanosomes and Leishmania. Biochim Biophys Acta, 1754(1-2): p Nagill, R. and S. Kaur, Vaccine candidates for leishmaniasis: a review. Int Immunopharmacol, 11(10): p Noyes, H.A., et al., A nested-pcr-based schizodeme method for identifying Leishmania kinetoplast minicircle classes directly from clinical samples and its application to the study of the epidemiology of Leishmania tropica in Pakistan. J Clin Microbiol, 36(10): p Brewster, S. and D.C. Barker, Analysis of minicircle classes in Leishmania (Viannia) species. Trans R Soc Trop Med Hyg, 96 Suppl 1: p. S Bensoussan, E., et al., Comparison of PCR assays for diagnosis of cutaneous leishmaniasis.j Clin Microbiol, 44(4): p Pimentel-Elardo, S.M., et al., Anti-parasitic compounds from Streptomyces sp. strains isolated from Mediterranean sponges. Mar Drugs, 8(2): p