ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΚΡΗΤΗΣ Σχολή Μηχανικών Περιβάλλοντος

Transcript

1 ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΚΡΗΤΗΣ Σχολή Μηχανικών Περιβάλλοντος

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. 1. Ορισμοί 1 2. Χημική σύσταση του κυττάρου Τα μόρια του κυττάρου Νουκλεϊκά οξέα & νουκλεοτίδια Πρωτεΐνες & αμινοξέα Πολυσακχαρίτες & υδατάνθρακες Λιπίδια Εισαγωγή στη μικροβιολογία Κυτταρική δομή Προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί Βακτήρια Ακτινομύκητες Κυανοφύκη Ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί Μύκητες Φύκη Πρωτόζωα Ιοί Εξελικτική πορεία μικροοργανισμών Βιολογική εξέλιξη & δημιουργία της ζωής Συστηματική κατάταξη των μικροοργανισμών - Ονοματολογία Ταξινόμηση των μικροοργανισμών Φαινοτυπικές μέθοδοι ταξινόμησης μικροοργανισμών Γονοτυπικές μέθοδοι ταξινόμησης μικροοργανισμών Μεταβολισμός ετερότροφων μικροοργανισμών Γλυκόλυση Μεταβολισμός του πυροσταφυλικού οξέος Οξειδωτικές διεργασίες: Κύκλος του Krebs Κύκλος του γλυοξυλικού οξέος Οξείδωση της γλυκόζης μέσω του μονοπατιού των φωσφορικών πεντοζών Οξειδωτική φωσφορυλίωση Ενεργειακή απόδοση του οξειδωτικού μεταβολισμού 67 i

3 9. Θρέψη και φυσιολογία μικροοργανισμών Ο μεταβολισμός των μικροοργανισμών Τροφική κατάταξη μικροοργανισμών Μικροβιακή ανάπτυξη Μικροβιακή ανάπτυξη σε κλειστή καλλιέργεια (batch culture) Μικροβιακή ανάπτυξη σε συνεχή καλλιέργεια (continuous culture) Μέτρηση της μικροβιακής ανάπτυξης Μικροοργανισμοί ως βιογεωχημικοί παράγοντες Μικροβιολογία υδάτινου περιβάλλοντος (Νερό λύματα) Εξυγίανση προβλημάτων κοπρανώδους μόλυνσης των υδάτων προστασία περιβάλλοντος Βιολογικός Καθαρισμός Αστικών Αποβλήτων Απολύμανση Χλωρίωση Όζον Υπεριώδης ακτινοβολία Απομάκρυνση παθογόνων μικροοργανισμών κατά την επεξεργασία των λυμάτων Άλλοι τρόποι εξυγίανσης των λυμάτων και της ενεργού ιλύος Επαναχρησιμοποίηση Επεξεργασμένων Αποβλήτων Ιοί Εντερικής προέλευσης στα λύματα Παράγοντες που επηρεάζουν την επιβίωση των ιών στο περιβάλλον Τύχη των παθογόνων μικροοργανισμών στο έδαφος Εφαρμογές μικροοργανισμών 130 Βιβλιογραφία 134 ii

4 Πρόλογος Η ύλη, που περιλαμβάνεται στις σημειώσεις του μαθήματος της Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας, απευθύνεται στους προπτυχιακούς φοιτητές της Σχολής Μηχανικών Περιβάλλοντος του Πολυτεχνείου Κρήτης. Το παρόν βοήθημα παρέχει βασικές γνώσεις Γενικής - Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας, καθώς και βιοχημείας σε εφαρμογές για την προστασία του περιβάλλοντος. 1. Ορισμοί Μικροβιολογία: Η επιστήμη, που μελετά τους μικροοργανισμούς, οι οποίοι δεν είναι ορατοί με γυμνό μάτι (διάμετρος μικρότερη του 1mm), καθώς και τις αλληλεπιδράσεις τους με άλλους οργανισμούς και με το περιβάλλον τους. Ο όρος προέρχεται από τις ελληνικές λέξεις μικρός, βίος (ζωή) και λόγος (επιστήμη). Ειδικότερα ασχολείται με τη δομή, θρέψη, την αναπαραγωγή, την κληρονομικότητα, τη χημική δραστηριότητα, τον προσδιορισμό, την αναγνώριση και την κατανομή όλων των μικροοργανισμών. Η μοντέρνα Μικροβιολογία μπορεί να διακριθεί σε ειδικότητες, όπως Ιολογία, Βακτηριολογία, Μυκητολογία, Ανοσολογία, Περιβαλλοντική Μικροβιολογία ή Μικροβιακή Οικολογία, Γεωργική Μικροβιολογία, Μικροβιολογία Τροφίμων κ.α. Μελετάται ως βασική και ως εφαρμοσμένη βιολογική επιστήμη. Η Μικροβιολογία ως εφαρμοσμένη βιολογική επιστήμη έχει μεγάλη συμβολή στην Ιατρική, Γεωργία, στην επιστήμη Τροφίμων, Οικολογία, Γενετική, Βιοχημεία, Βιοτεχνολογία και άλλους κλάδους. Μερικά παραδείγματα αναφέρονται στην συνέχεια. Η μελέτη των μικροοργανισμών έχει οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι ο ρόλος τους είναι διττός για τον άνθρωπο και το περιβάλλον. Η παρουσία τους συσχετίζεται άμεσα με την πρόκληση λοιμώξεων (παθογόνοι). Εντούτοις, πλήθος μικροοργανισμών συνυπάρχει στο σώμα του ανθρώπου, των ζώων και των φυτών, αποτελώντας τη φυσική μικροχλωρίδα του κάθε οργανισμού. Αν και η φυσική μικροχλωρίδα δεν είναι επιβλαβής και σε μερικές περιπτώσεις θεωρείται ωφέλιμη, συνίσταται κυρίως από δυνητικά παθογόνους μικροοργανισμούς, οι οποίοι όταν υπερβούν κάποια όρια δύνανται να προκαλέσουν σοβαρές ασθένειες των ανθρώπων, των φυτών και των ζώων. Η καταπολέμηση των μολυσματικών ασθενειών βασίζεται στην μεγαλύτερη κατανόηση του τρόπου δράσης των παθογόνων μικροοργανισμών. Παράλληλα, οι μικροοργανισμοί παίζουν σημαντικό ρόλο στη γονιμότητα του εδάφους, στην ανάπτυξη των φυτών, στην πέψη και στην παραγωγικότητα των ζώων, ενώ εξίσου σημαντική είναι η παρουσία τους στη βιομηχανία τροφίμων. Συμβάλλουν στην παραγωγή τροφίμων (π.χ. γαλακτοκομικών, ζύθου, κρασιού, άρτου κ.α.) και στη βελτίωση των οργανοληπτικών τους χαρακτηριστικών κατά τη συντήρηση (πχ ζύμωση), ενώ συγχρόνως είναι σε θέση να αλλοιώσουν το τρόφιμο θέτοντας σε κίνδυνο την υγεία του καταναλωτή. Μια ένδειξη της σημαντικότητας της Μικροβιολογίας στον εικοστό αιώνα είναι ότι το 1/3 των βραβείων Nobel των θετικών επιστημών αφορούν θέματα Μικροβιολογίας. 1

5 Περιβαλλοντική Μικροβιολογία: Η επιστήμη που μελετά τους έμβιους μικροοργανισμούς, οι οποίοι βρίσκονται σε συγκεκριμένα φυσικά ή τεχνητά περιβάλλοντα (οικοσυστήματα), όπως π.χ. στο έδαφος, στο νερό, στην θάλασσα, στον αέρα κ.α. Μελετά αφενός την ύπαρξη και τον προσδιορισμό αυτών των μικροοργανισμών και αφετέρου τις μεταβολικές τους δράσεις. Η Περιβαλλοντική Μικροβιολογία ασχολείται επίσης με την συμβολή των μικροοργανισμών στους γεωχημικούς κύκλους άνθρακα, αζώτου, θείου και νερού καθώς και με την μελέτη των επιπτώσεων της μόλυνσης περιβάλλοντος. Τα τελευταία χρόνια η ανάπτυξή της ως βασικής επιστήμης εντοπίζεται κυρίως στο πεδίο μικροβιολογίας του υδάτινου περιβάλλοντος (νερό λύματα) και αφορά στην προάσπιση της Δημόσιας Υγείας και την προστασία του περιβάλλοντος, καθώς οριοθετούνται οι ανθρώπινες ενέργειες και υποδεικνύονται τρόποι εξυγίανσης περιπτώσεων μολύνσεων (πχ κοπρανώδης μόλυνση του υδάτινου περιβάλλοντος διάκριση προέλευσής της). Βιοτεχνολογία: Η Βιοτεχνολογία είναι η επιστήμη που μελετά την εφαρμογή βιολογικών διεργασιών (μέσω μικροοργανισμών, ευκαρυωτικών κυττάρων ή ενζύμων) στην παραγωγή βιολογικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην φαρμακοβιομηχανία όπως π.χ. αντιβιοτικών, πρωτεϊνών, ενζύμων, βιοχημικών ουσιών κ.α. Η Ευρωπαϊκή Ομοσπονδία Βιοτεχνολογίας (European Federation of Biotechnology) όρισε το 1981 τη Βιοτεχνολογία σαν «ολοκληρωμένη χρήση της Βιοχημείας, Μικροβιολογίας και Γενετικής Μηχανικής για την τεχνολογική εφαρμογή των δυνατοτήτων των μικροβίων και των κυτταροκαλλιεργειών ζωικών κυττάρων». Παραδείγματα από τις «αρχαιότερες» εφαρμογές της βιοτεχνολογίας είναι η παραγωγή κρασιού και τυριού. Η ανάπτυξη και συμβολή των μεθόδων της γενετικής μηχανικής στο γενετικό υλικό των μικροοργανισμών, που χρησιμοποιούνται στις βιολογικές διεργασίες, έδωσε καινούργιες δυνατότητες και ώθηση στη βιοτεχνολογία. Π.χ., Παραγωγή βιοχημικών ουσιών / φαρμάκων σε μεγάλες ποσότητες Παραγωγή εμβολίων και αντισωμάτων Παραγωγή καλύτερων φυτών ή σπόρων Παραγωγή μικροοργανισμών με υψηλές ικανότητες βιοαποικοδόμησης αποβλήτων. Θεραπεία γονιδίων (Gene therapy) Κυτταρική Θεωρία (Schleiden & Schwann, 1938): Υποστήριξαν ότι η θεμελιώδης δομική και λειτουργική μονάδα όλων των οργανισμών είναι το κύτταρο. Αυτό σημαίνει ότι το κύτταρο είναι η μικρότερη δομή όλων των έμβιων όντων στη φύση όπου εκδηλώνεται το φαινόμενο της ζωής. Η σύγχρονη κυτταρική θεωρία υποστηρίζει ότι: Όλοι οι οργανισμοί αποτελούνται από κύτταρα και από κυτταρικά παράγωγα. Όλα τα κύτταρα δομούνται από τις ίδιες χημικές ενώσεις και εκδηλώνουν παρόμοιες μεταβολικές διεργασίες. 2

6 Η λειτουργία των οργανισμών είναι το αποτέλεσμα της συλλογικής δράσης και αλληλεπίδρασης των κυττάρων που τους αποτελούν. Κάθε κύτταρο προέρχεται από τη διαίρεση ενός προϋπάρχοντος κυττάρου. Κυτταρική Δομή: Τα κύτταρα με βάση την εσωτερική τους πολυπλοκότητα χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τα ευκαρυωτικά και τα προκαρυωτικά κύτταρα. Κύρια διαφορά είναι η ύπαρξη ή μη σχηματισμένου πυρήνα οργανιδίου που να περικλείει το γενετικό υλικό του κυττάρου. Εικόνα 1: Τυπικό προκαρυωτικό κύτταρο Εικόνα 2: Τυπικό ευκαρυωτικό κύτταρο 3

7 Η χρήση του ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου καθώς και η ανάπτυξη των μεθόδων και των γνώσεων της Μοριακής Βιολογίας, Γενετικής, Βιοχημείας και των Μαθηματικών οδήγησε στην επέκταση των γνώσεων σχετικά με την Περιβαλλοντική Μικροβιολογία. Η Χρήση του Μικροσκοπίου Ο Ολλανδός έμπορος Antony Van Leeuwenhook ( ) ήταν ο πρώτος που παρατήρησε κύτταρα σε απλά μικροσκόπια που έφτιαχνε ο ίδιος. Οι φακοί των μικροσκοπίων αυτών είχαν μία μεγέθυνση φορές μεγαλύτερη από αυτή του γυμνού οφθαλμού. Με αυτά τα μικροσκόπια περιέγραψε σπόρους έμβια φυτών και ασπόνδυλων ζώων, σπερματοζωάρια, ερυθροκύτταρα και μικροοργανισμούς. Πρωτόζωα, φύκη, ζύμες και βακτήρια περιγράφηκαν με τέτοια ακρίβεια που είναι δυνατόν από τις περιγραφές τους ακόμη και σήμερα να καταλάβουμε για ποια είδη επρόκειτο. Από εκείνη την εποχή μέχρι σήμερα η εξέλιξη ήταν ραγδαία. Τα όρια των σύγχρονων μικροσκοπίων φτάνουν τα 0,2 μm. To ηλεκτρονικό μικροσκόπιο επιτρέπει μια ανάλυση δειγμάτων της τάξεως των 0,2 nm. Μέθοδοι μικροσκόπησης μικροοργανισμών Η μικροσκόπηση γίνεται με δύο βασικές κατηγορίες μικροσκοπίου, α) του φωτονικού και β) του ηλεκτρονικού, τα οποία βασίζονται στις ίδιες αρχές για το σχηματισμό του ειδώλου. Στο φωτονικό μικροσκόπιο οι φακοί (γυάλινοι) χρησιμοποιούνται για να κατευθύνουν τη δέσμη φωτονίων και στο ηλεκτρονικό ένα σύστημα ηλεκτρομαγνητικών φακών χρησιμοποιείται για να εστιάσει τη δέσμη των ηλεκτρονίων. Ανάμεσα στις μεθόδους μικροσκόπησης μικροοργανισμών αναφέρουμε τις εξής: Μικροσκόπηση αντίθεσης φάσεων Μικροσκόπηση φθορισμού Μικροσκόπηση μετά από χρώσεις μικροοργανισμών Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση με Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση Διαπέρασης (ΤΕΜ - Transmission Electron Microscope) και Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση Σάρωσης (SΕΜ - Scanning Electron Microscope) 4

8 2. Χημική σύσταση του κυττάρου Τα χημικά στοιχεία, που συμμετέχουν στη δομή των βιολογικών μορίων, συγκαταλέγονται στα στοιχεία που συνθέτουν τον φλοιό της γης. Όλοι οι οργανισμοί από τον πιο απλό μέχρι τον πιο σύνθετο αποτελούνται από τα ίδιο είδος χημικών μορίων, πράγμα που υποδηλώνει την κοινή τους προέλευση. Από τα 108 στοιχεία της φύσης, που μας είναι γνωστά, εκείνα που αποτελούν συστατικά των κυττάρων είναι περίπου 20. Στα κύτταρα έχουν βρεθεί μονό 6 στοιχεία σε μεγάλες ποσότητες: υδρογόνο (Η), οξυγόνο (Ο), άνθρακας (C), άζωτο (N), φώσφορος (P) και θείο (S). Τα στοιχεία αυτά συνδέονται μεταξύ τους με χημικούς δεσμούς και συνθέτουν τις διάφορες χημικές ουσίες. Οι σχηματιζόμενες ενώσεις ορίζονται ως ανόργανες όταν δεν περιέχουν άνθρακα και οργανικές όταν περιέχουν άνθρακα. Οι χημικές ενώσεις που συναντάμε στο κύτταρο ποικίλλουν. Υπάρχουν μόρια μικρού μοριακού βάρους όπως οξέα, βάσεις, άλατα και ενώσεις μεγάλου μοριακού βάρους τα μακρομόρια. Τα μακρομόρια είναι πολυμερή που αποτελούνται από μονομερή. Αυτά τα μακρομόρια είναι κοινά για όλα τα είδη κυττάρων και είναι τα νουκλεΐκά οξέα, οι πρωτεΐνες, οι πολυσακχαρίτες και τα λιπίδια. Τα αντίστοιχα μονομερή τους είναι τα νουκλεοτίδια, τα αμινοξέα, τα σάκχαρα και τα λιπαρά οξέα. Οι χημικοί δεσμοί μεταξύ των ατόμων των μορίων και μεταξύ των μονομερών των μακρομορίων είναι ομοιοπολικοί ή ετεροπολικοί. Στους ομοιοπολικούς δεσμούς είναι τα ηλεκτρόνια ισότιμα διαμοιρασμένα ανάμεσα στα άτομα του μορίου ενώ στους ετεροπολικούς δεσμούς τα ηλεκτρόνια είναι ανισότιμα διαμοιρασμένα. Ένας τρίτος τύπος χημικού δεσμού που συναντάται στα βιολογικά συστήματα είναι ο δεσμός υδρογόνου και δημιουργείται μεταξύ ατόμων υδρογόνου και ατόμων οξυγόνου ή αζώτου διαφορετικών μορίων. Ενώ οι δεσμοί υδρογόνου είναι σε σύγκριση με τους ομοιοπολικούς και ετεροπολικούς ασθενείς προσφέρουν σταθερότητα στα μακρομόρια και συμβάλουν μαζί με άλλους δεσμούς στην δημιουργία της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των βιομορίων (π.χ. πρωτεϊνών, DNA). Σε ορισμένα βιομόρια αναπτύσσονται επίσης δυνάμεις Van der Waals και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Οι δεσμοί αυτοί όπως και οι δεσμοί υδρογόνου είναι ηλεκτροστατικής φύσεως, διαμοριακοί δεσμοί και αναπτύσσονται μεταξύ μορίων. Έτσι ενώ δεν συμμετέχουν στην συνένωση των ατόμων των μορίων, παίζουν σημαντικό ρόλο στην τελική διαμόρφωση των μακρομορίων. Από τους δεσμούς που αναπτύσσονται οι ομοιοπολικοί είναι ισχυροί και υπεύθυνοι για τη δημιουργία των μακρομορίων ενώ οι μη ομοιοπολικοί είναι ασθενείς κι ευθύνονται για τη λειτουργικότητα και στερεοδομή των μακρομορίων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι τα ένζυμα. Η πλειονότητα των ενζύμων οφείλει τη διαμόρφωσή τους στο χώρο στους ασθενείς δεσμούς. Είναι δε γνωστό ότι η ειδική διαμόρφωση των ενζύμων είναι που τους προσδίδει την πολύ εξειδικευμένη λειτουργικότητα. Η ένωση του ενζύμου-υποστρώματος οφείλεται επίσης σε ασθενείς δεσμούς. Η περιεκτικότητα του κυττάρου σε νερό (H 2 O) είναι ιδιαίτερα υψηλή και κυμαίνεται από 70% έως 90% κατά βάρος. Το νερό είναι το υγρό υπόστρωμα μέσα στο οποίο λαμβάνουν χώρα 5

9 όλες οι βιοχημικές αντιδράσεις του κυττάρου και συμμετέχει σε όλες τις βιοχημικές δραστηριότητες του (π.χ. υδρόλυση μορίων κ.α.) Τα μόρια του κυττάρου Οι χημικές ενώσεις οι οποίες συνθέτουν τα κύτταρα όλων των οργανισμών έχουν κοινή χημική σύσταση και μπορούν να χωριστούν σε κατηγορίες ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Τα μικρότερα μόρια, τα οποία οι οργανισμοί παραλαμβάνουν από το περιβάλλον τους, έχουν μοριακό βάρος και είναι το νερό, το διοξείδιο του άνθρακα, η αμμωνία και το μεθάνιο. Από αυτές τις ενώσεις συνθέτονται στο κύτταρο τα επόμενα σε τάξη μεγέθους συστατικά με μοριακό βάρος και είναι οι πεντόζες, το φωσφορικό οξύ, οι αζωτούχες βάσεις, τα α- κετονοξέα, το πυροσταφυλικό οξύ και το οξικό οξύ. Οι δομικές μονάδες των βιομορίων (τα μονομερή με μοριακό βάρος ) είναι και όπως προαναφέρθηκε τα νουκλεοτίδια, τα αμινοξέα, οι μονοσακχαρίτες, τα λιπαρά οξέα και η γλυκερίνη. Τα μακρομόρια ή πολυμερή έχουν μοριακό βάρος και είναι τα νουκλεΐκά οξέα, οι πρωτεΐνες, οι πολυσακχαρίτες και τα λιπίδια. Αυτά τα μακρομόρια δημιουργούν μεγαλύτερα συμπλέγματα μακρομορίων, όπως γλυκοπρωτεΐνες, νουκλεοπρωτεΐνες κ.α. Από το συνδυασμό των τελευταίων προκύπτουν τα οργανίδια του κυττάρου, τα οποία αποτελούν ανώτερα επίπεδα οργάνωσης μακρομορίων που συνθέτουν το κύτταρο Νουκλεϊκά οξέα (nucleic acids) και νουκλεοτίδια (nucleotides) Υπάρχουν δύο είδη νουκλεϊκών οξέων, το δεσοξυριβονουκλεϊκό (DNA, deoxyribonucleic acid) και το ριβονουκλεϊκό οξύ (RNA, ribonucleic acid). Οι δομικές μονάδες των νουκλεϊκών οξέων είναι τα νουκλεοτίδια. Τα νουκλεοτίδια (εικόνα 3) προέρχονται από την σύνδεση με ομοιοπολικούς δεσμούς τριών διαφορετικών μορίων, μίας πεντόζης (ενός σακχάρου με πέντε άτομα άνθρακα), ενός μορίου φωσφορικού οξέος και μίας οργανικής αζωτούχας ένωσης. Τα νουκλεοτίδια του DNA (δεσοξυριβονουκλεοτίδια) περιέχουν την πεντόζη δεσοξυριβόζη, ενώ τα νουκλεοτίδια του RNA (ριβονουκλεοτίδια) περιέχουν την πεντόζη ριβόζη. Εικόνα 3: Δομή νουκλεοτιδίου 6

10 Οι αζωτούχες βάσεις των νουκλεοτιδίων είναι η αδενίνη (Α), η γουανίνη (G), η θυμίνη (Τ), η κυτοσίνη (C) και η ουρακίλη (U). Οι αζωτούχες βάσεις αδενίνη και γουανίνη ανήκουν στις πουρίνες (αζωτούχες βάσεις με έναν ετεροκυκλικό δακτύλιο) ενώ οι άλλες τρεις (θυμίνη, κυτοσίνη και ουρακίλη) ανήκουν στις πυριμιδίνες (αζωτούχες βάσεις με δύο ετεροκυκλικούς δακτυλίους). Η θυμίνη υπάρχει μόνο στο DNA και η ουρακίλη μόνο στο RNA. Οι άλλες τρεις βάσεις αδενίνη, γουανίνη κυτοσίνη είναι κοινές και για τα δύο είδη των νουκλεϊκών οξέων. Τα νουκλεοτίδια συνδέονται μεταξύ τους με ομοιοπολικούς δεσμούς και σχηματίζουν τις αλυσίδες των πολυνουκλεοτιδίων (κλώνους). Το DNA αποτελείται από μία δίκλωνη αλυσίδα που σχηματίζει μία διπλή έλικα σε όλα τα κύτταρα. Εξαίρεση αποτελεί το DNA μερικών ιών που συναντάται υπό μορφή μονόκλωνου μορίου DNA. Οι δύο κλώνοι του DNA συγκρατούνται με δεσμούς υδρογόνου, που σχηματίζονται μεταξύ των αζωτούχων βάσεων. Δεσμοί υδρογόνου δημιουργούνται μόνο μεταξύ αδενίνης και θυμίνης, γουανίνης και κυτοσίνης και τέλος μεταξύ αδενίνης και ουρακίλης. Αυτά τα ζευγάρια Α-Τ, G-C και Α-U χαρακτηρίζονται συμπληρωματικά. Οι δεσμοί υδρογόνου σταθεροποιούν την χωροδιάταξη του μορίου. Η δευτεροταγής δομή του DNA είναι μία διπλή έλικα. Για την ανακάλυψη της δευτεροταγούς δομής του DNA, της διπλής έλικας, τιμήθηκαν το 1962 με βραβείο Νόμπελ ο Αμερικάνος James Watson και ο Άγγλος φυσικός Francis Crick. Τα μόρια του DNA φέρουν όλες τις γενετικές πληροφορίες (το γενετικό υλικό) ενός κυττάρου. Το DNA βρίσκεται στο πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων υπό μορφή χρωματοσωμάτων και εν μέρει στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες, ενώ στα προκαρυωτικά κύτταρα βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα. Εικόνα 4: Πρωτοταγής δομή του DNA - Δεσμοί υδρογόνου ενώνουν τις δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες μεταξύ τους 7

11 Εικόνα 5: Δευτεροταγής δομή του DNA (διπλή έλικα) Το RNA βρίσκεται ως μονόκλωνο μόριο μέσα στα κύτταρα, εκτός από τις περιπτώσεις κάποιων ιών οι οποίοι μπορούν να περιέχουν και δίκλωνο μόριο RNA. Στο μονόκλωνο μόριο του RNA σχηματίζονται επίσης δεσμοί υδρογόνου μεταξύ μερικών αζωτούχων βάσεων με αποτέλεσμα να σχηματίζει αναδιπλώσεις που του δίνουν την δευτεροταγή του δομή. Το RNA εμφανίζεται στο κύτταρο σε τρεις διαφορετικές μορφές, σαν αγγελιαφόρο RNA (mrna, messanger RNA), σαν μεταφορικό RNA (trna, transfer RNA) και σαν ριβοσωμικό (rrna, ribosomal RNA). Το mrna είναι μονόκλωνο συμπληρωματικό μόριο του DNA, περιέχει την γενετική πληροφορία και την μεταφέρει από το DNA στα ριβοσώματα όπου γίνεται η σύνθεση των πρωτεϊνών. Το trna μεταφέρει στα ριβοσώματα τα αμινοξέα προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στην σύνθεση των πρωτεϊνών. Είναι υπεύθυνο για την προσαρμογή της γενετικής πληροφορίας από τη γλώσσα των νουκλεοτιδίων στην γλώσσα των αμινοξέων. Το rrna αποτελεί το σύστημα σύνθεσης των πρωτεϊνών στο κύτταρο. Τα μόρια του rrna συνδέονται με τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες και σχηματίζουν το ριβόσωμα, που είναι το απαραίτητο σωματίδιο για την πρωτεϊνοσύνθεση. Οι διεργασίες που πραγματοποιούνται κατά τη σύνθεση νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών υπακούουν μ ένα πολύ ακριβή και καθορισμένο τρόπο στο κεντρικό δόγμα της βιολογίας : DNA RNA πρωτεΐνες 8

12 Οι πρωτεΐνες παράγονται με βάση τις πληροφορίες που είναι κωδικοποιημένες στο DNA, διαμέσου του RNA. Το RNA βιοσυντίθεται επίσης από το DNA. Το DNA αυτοδιπλασιάζεται. Η αλληλουχία λοιπόν των δομικών λίθων των πρωτεϊνών είναι απόρροια της αλληλουχίας των δομικών λίθων του μηνύματος RNA (mrna) και αυτή με τη σειρά της είναι απόρροια της αλληλουχίας των δομικών λίθων του DNA. Άρα, στην αλληλουχία των δομικών λίθων των νουκλεϊκών οξέων εμπεριέχεται η πληροφορία για τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Για την ιδιότητα τους αυτή τα νουκλεϊκά οξέα χαρακτηρίζονται ως πληροφοριακά μακρομόρια. Μία τέταρτη μορφή RNA εμφανίζεται μόνο στα ευκαρυωτικά κύτταρα και είναι το μικρό πυρηνικό RNA (snrna, small nuclear RNA). Τα μόρια του snrna είναι μικρά μόρια που συνδέονται με πρωτεΐνες και σχηματίζουν μικρά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωματίδια. Τα σωματίδια αυτά λειτουργούν σαν ένζυμα και καταλύουν την λεγόμενη «ωρίμανση» του ευκαρυωτικού mrna, που είναι η διαδικασία της αποκοπής των εσωνίων (introns) και συρραφής των εξωνίων (exons) στο mrna. Το RNA βρίσκεται τόσο στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων όσο και στο κυτταρόπλασμα, στα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες. Εικόνα 6: Σχηματική παράσταση πρωτοτογούς δομής ενός trna 2.3. Πρωτεΐνες και αμινοξέα Οι πρωτεΐνες είναι τα πιο διαδεδομένα μακρομόρια στο κύτταρο. Διακρίνονται σε δομικές και λειτουργικές πρωτεΐνες (π.χ. ενζυμικές, ορμονικές, συσταλτικές, αμυντικές, αποθηκευτικές κα). Αποτελούνται από αμινοξέα που είναι οι δομικές τους μονάδες. Στη φύση συναντώνται μόνο 20 διαφορετικά αμινοξέα (εικόνα 8), τα οποία συνδεόμενα σε διαφορετικούς συνδυασμούς σχηματίζουν έναν τεράστιο αριθμό πρωτεΐνικών μορίων. Τα αμινοξέα έχουν δύο χαρακτηριστικές ομάδες στο μόριο τους, την αμινομάδα (-NH 2 ) και την καρβοξυλομάδα (-COOH) (εικόνα 7) και εμφανίζουν αμφολυτικό χαρακτήρα, δηλαδή τόσο όξινο όσο και βασικό χαρακτήρα. Ανάλογα με το ph του υδάτινου διαλύματος μέσα στο οποίο βρίσκονται μπορούν να είναι σε ουδέτερη, θετικά ή αρνητικά φορτισμένη μορφή. Το 9

13 διηλεκτρικό τους σημείο (pι) είναι εκείνη η τιμή του ph, όπου όλα τα μόρια ενός αμινοξέος βρίσκονται σε ουδέτερα φορτισμένη μορφή. Ο γενικός χημικός τύπος ενός αμινοξέος είναι NH 2 -CHR-COOH. Το R είναι οργανική ρίζα. Σε αυτή την περίπτωση παρατηρούνται δύο οπτικά ισομερή για κάθε αμινοξύ, το -D και το L. Έχει παρατηρηθεί, ότι όλα τα αμινοξέα που συναντώνται στις πρωτεΐνες, είναι L ισομερή. Αν το R είναι ένα άτομο υδρογόνου, τότε το αμινοξύ είναι η γλυκίνη, το μικρότερο αμινοξύ και στο μόριο του δεν παρατηρείται οπτική ισομέρεια. Εικόνα 7: Δομή μορίου αμινοξέος & ένωση δύο αμινοξέων με πεπτιδικό δεσμό Εικόνα 8: Τα 20 αμινοξέα που απαντώνται στη φύση 10

14 Εικόνα 9: Πρωτοταγής, δευτεροταγής (πτυχωτή ή ελικοειδής μορφή) τριτοταγής και τεταρτοταγής δομή μίας πρωτεΐνης Τα αμινοξέα είναι δυνατόν να περιέχουν στη ρίζα R ομάδες όπως υδροξύλια ( OH), σουλφυδρύλια (-SH), φαινύλια (-C 6 H 5 ) ή και επιπλέον καρβοξυλομάδες και αμινομάδες. Ανάλογα με την πολικότητα της ρίζας R διακρίνονται σε αμινοξέα με μη πολικές ή υδρόφοβες ομάδες, σε αμινοξέα με πολικές μη ιονιζόμενες ομάδες και σε αμινοξέα με πολικές και ιονιζόμενες ομάδες. Τα αμινοξέα συνδέονται με πεπτιδικούς δεσμούς (εικόνα 7), που γίνονται με αντιδράσεις συμπύκνωσης μεταξύ της καρβοξυλομάδας και της αμινομάδας με ταυτόχρονη αφαίρεση μορίων νερού. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες που δημιουργούνται απαρτίζουν τις πρωτεΐνες. Η αλληλουχία των αμινοξέων στην πολυπεπτιδική αλυσίδα είναι η πρωτοταγής δομή μίας πρωτεΐνης. Η ελικοειδής ή πτυχωτή μορφή, που παίρνει η πολυπεπτιδική αλυσίδα μετά από 11

15 αναδίπλωση της στον χώρο υπό την επίδραση δεσμών υδρογόνου μεταξύ των καρβοξυλομάδων και των αμινομάδων, λέγεται δευτεροταγής δομή (εικόνα 9). Η περαιτέρω αναδίπλωση της ήδη αναδιπλωμένης πολυπεπτιδικής αλυσίδας στον χώρο, που δημιουργείται με χημικούς δεσμούς ανάμεσα στις πλευρικές ομάδες των αμινοξέων, λέγεται τριτοταγής δομή (εικόνα 9). Στην τριτοταγή δομή συμβάλλουν δεσμοί υδρογόνου, υδρόφοβοι, δυνάμεις Van der Waals και δισουλφιδικοί ομοιοπολικοί δεσμοί μεταξύ των ατόμων του θείου των κυστεΐνών. Αν η πρωτεΐνη αποτελείται από περισσότερες πολυπεπτιδικές αλυσίδες, ο συνδυασμός των επιμέρους πολυπεπτιδικών αλυσίδων σε ένα ενιαίο πρωτεΐνικό μόριο δίνει την τεταρτοταγή δομή σε μία πρωτεΐνη. Το τελικό σχήμα των πρωτεΐνών είναι σφαιρικό ή ινώδες Πολυσακχαρίτες και Υδατάνθρακες Οι ενώσεις που περιέχουν άνθρακα, υδρογόνο και οξυγόνο σε μία αναλογία 1:2:1 (CH 2 O) x λέγονται υδατάνθρακες. Οι υδατάνθρακες διακρίνονται σε απλά σάκχαρα ή μονοσακχαρίτες και σε διασπώμενα σάκχαρα ή πολυσακχαρίτες. Οι μονοσακχαρίτες είναι ενώσεις που περιέχουν πολλές υδροξυλομάδες και μία καρβονυλομάδα. Ανάλογα αν η καρβονυλομάδα είναι αλδεϋδομάδα ή κετονομάδα διακρίνονται σε αλδόζες ή κετόζες. Αποτελούνται από 3-6 άτομα άνθρακα και ονομάζονται αντίστοιχα σε τριόζες, τετρόζες, πεντόζες και εξόζες. Οι γνωστοί μονοσακχαρίτες είναι η τριόζη γλυκεριναλδεΰδη και διυδρόξυκετόνη, η πεντόζη ριβόζη και δεσοξυριβόζη και οι εξόζες γλυκόζη, φρουκτόζη και γαλακτόζη. Οι μονοσακχαρίτες διαλύονται εύκολα στο νερό και έχουν γλυκιά γεύση. Συνδέονται με γλυκοζιτικούς δεσμούς με την απόσπαση μορίων νερού από υδροξυλικές ομάδες (εικόνα 10). Οι δεσμοί αυτοί υπάρχουν ως άλφα και βήτα μεταξύ του C 1 και του C 4 ή C 6 ατόμου του μορίου τους. Τα πολυμερή που δημιουργούνται, είναι οι ολιγοσακχαρίτες και οι πολυσακχαρίτες και είναι τα άνυδρα παράγωγα των μονοσακχαριτών, που μπορούν πάλι με υδρόλυση να διασπαστούν σε μονοσακχαρίτες. Αλφα-1,4-γλυκοζιτικό δεσμό έχει το γλυκογόνο και το άμυλο που είναι σημαντικά αποταμιευτικά υλικά των βακτηρίων, ενώ βήτα-1,4- γλυκοζιτικό δεσμό έχει η κυτταρίνη που είναι το άκαμπτο υλικό του κυτταρικού τοιχώματος των φυκών και ανωτέρων φυτών. Οι υδατάνθρακες έχουν ποικίλους ρόλους στο κύτταρο. Αποτελούν πηγή ενέργειας για το κύτταρο και είναι και δομικά υλικά για πολλά βιομόρια. Σε συνδυασμό με πρωτεΐνες και λιπίδια σχηματίζουν γλυκοπρωτεΐνες και γλυκολιπίδια. 12

16 Εικόνα 10: Ένωση δύο μονοσακχαριτών με γλυκοζιτικό δεσμό Εικόνα 11: Δισακχαρίτες 2.5. Λιπίδια Τα λιπίδια αποτελούν είτε δομικά συστατικά των κυττάρων (π.χ. συστατικά των μεμβρανών) είτε μέσο αποθήκευσης χημικής ενέργειας. Τα λιπίδια είναι πρακτικά αδιάλυτα στο νερό. Διαλύονται εύκολα σε μη πολικούς διαλύτες (π.χ. βενζίνη, χλωροφόρμιο, αιθέρας). Στους μικροοργανισμούς συναντώνται δύο κατηγορίες λιπιδίων τα ουδέτερα λίπη (τριγλυκερίδια, απλά λιπίδια - Εικόνα 12 & 13) και τα σύνθετα λιπίδια όπως είναι τα φωσφολιπίδια, γλυκολιπίδια και οι λιποπρωτεΐνες. Τα (ουδέτερα) λίπη είναι εστέρες, που σχηματίζονται από την σύνδεση τριών μορίων λιπαρών οξέων με ένα μόριο γλυκερίνης: 13

17 CH 2 OH HOOCR 1 R 1 COCH 2 O CHOH + HOOCR 2 R 2 COCHO + 3H 2 O CH 2 OH HOOCR 3 R 3 COCH 2 O Ανάλογα με τον αριθμό ακόρεστων δεσμών (C=C) τα λίπη διαχωρίζονται σε κορεσμένα (περιέχουν μόνο απλούς δεσμούς) και ακόρεστα (με διπλούς δεσμούς, π.χ. μονοακόρεστα ή πολυακόρεστα). Τα σύνθετα λιπίδια αποτελούνται από ένα μόριο γλυκερόλης συνδεδεμένο με δύο μόρια λιπαρών οξέων και ένα άλλο μόριο (π.χ. φωσφορικό οξύ, πρωτεΐνη ή υδατάνθρακα). Τα φωσφολιπίδια αποτελούνται από ένα μόριο γλυκερόλης συνδεδεμένο με δύο μόρια λιπαρών οξέων, ένα μόριο φωσφορικού οξέος συνδεδεμένο με ένα μικρότερο πολικό μόριο. Κύριο χαρακτηριστικό των φωσφολιπιδίων είναι ότι η κεφαλή τους είναι υδρόφιλη ενώ η ουρά τους υδρόφοβη. Επομένως έχουμε συσσώρευση σε διεπιφάνειες με το υδρόφιλο μέρος μέσα στο νερό και τις υδρόφοβες ουρές να προβάλλουν έξω από την ελεύθερη επιφάνεια του νερού. Μπορούν να δημιουργήσουν μία θερμοδυναμικά σταθερή δομή (διπλοστιβάδα) όπου τα μόρια προσεγγίζουν το ένα πολύ κοντά στο άλλο, ώστε το υδρόφοβο μέρος του φωσφολιπιδίου να μην έρχεται σε επαφή με το νερό (Εικόνα 14). Σημαντικό για την συγκρότηση και λειτουργικότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Εικόνα 12: Ομαδοποίηση λιπιδίων 14

18 Εικόνα 13: Δομή ενός τριγλυκεριδίου Εικόνα 14: Δομή κυτταρικής μεμβράνης όπου διακρίνεται η διπλοστιβάδα των φωσφολιπιδίων. 15

19 3. Εισαγωγή στη Μικροβιολογία Ως μικροοργανισμοί ορίζονται εκείνοι οι οργανισμοί, οι οποίοι δεν είναι ορατοί με γυμνό μάτι (μέγιστο μέγεθος ~ 100 μm). Η δομή τους χαρακτηρίζεται γενικά απλή. Μερικά κύρια στοιχεία για τους μικροοργανισμούς είναι τα παρακάτω: Υπάρχει μεγάλη ποικιλομορφία μικροοργανισμών. Βρίσκονται σε μεγάλους αριθμούς σε κάθε περιβάλλον (έδαφος, νερό, αέρας, σε άλλους οργανισμούς). Η ολική βιομάζα των μικροοργανισμών επάνω στη γη είναι περίπου 25 φορές μεγαλύτερη από την ολική βιομάζα των ζώων. Ο κόσμος μας είναι γεμάτος μικροοργανισμούς και το ανθρώπινο σώμα συνυπάρχει με πλήθος μικροοργανισμών τα οποία αποτελούν τη φυσική μικροχλωρίδα του. Πάνω στους ζωικούς ιστούς υπάρχουν τεράστιοι αριθμοί μικροβίων (π.χ. το ανθρώπινο σώμα περιέχει 10 τρισεκατομμύρια κύτταρα και 100 τρισεκατομμύρια μικροοργανισμούς!). Μόνο ένα 1% των μικροοργανισμών είναι καλλιεργήσιμοι. Οι μικροοργανισμοί συμβάλλουν στην ανακύκλωση της ύλης, στην υγεία των ανθρώπων, ζώων και φυτών, στην γεωργία, στην βιομηχανία τροφίμων, στην ανακύκλωση του νερού με βιολογικό καθαρισμό, στην βιοεξυγίανση οικοσυστημάτων, στην παραγωγή ενέργειας (βιοαέριο, βιοκαύσιμα, βιομάζα) και βιοτεχνολογικών προϊόντων. βακτηριοφάγος βακτήρια Εικόνα 15: Ποικιλότητα μικροβιακού κόσμου πρωτόζωα Η σύγχρονη ταξινόμηση των μικροοργανισμών τους χωρίζει στια παρακάτω ομάδες: 1. Ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί (οργανισμοί που δομούνται με βάση το ευκαρυωτικό κύτταρο): Πρωτόζωα, Μύκητες, Φύκη. 2. Προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί (οργανισμοί που δομούνται με βάση το προκαρυωτικό κύτταρο) με μέγεθος 0,5-5μm: Κυανοβακτήρια/κυανοφύκη, Βακτήρια ή Σχιζομύκητες (Βακτήρια, Μυκόπλασμα, Σπειροχαιτιακά, Μυξομύκητες, Ρικέτσιες, Χλαμύδια). 16

20 3. Ιοί με μέγεθος nm. Οι ιοί παλαιότερα χαρακτηρίζονταν από το εξαιρετικά μικρό μέγεθος τους, αλλά στις μέρες μας τα κριτήρια είναι τα ακόλουθα: η παρουσία ενός μόνο τύπου νουκλεϊκού οξέως DΝΑ ή RΝΑ, με περίβλημα, η απουσία σαφούς μεταβολισμού και τέλος η απουσία κυτταρικής διαίρεσης. Σχηματικά τα επίπεδα οργάνωσης των οργανισμών απεικονίζονται ως εξής: ΙΟΙ, ΙΟΕΙΔΗ, ΑΚΚΥΤΑΡΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΟΝΤΟΤΗΤΕΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΙ ΚΥΑΝΟΦΥΚΗ ΦΥΚΗ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΙ ΠΡΩΤΟΖΩΑ ΜΥΚΗΤΕΣ Πίνακας 1: Βιολογική σχέση διαφόρων ομάδων οργανισμών 17

21 4. Κυτταρική δομή Όλα τα κύτταρα έχουν ένα φραγμό, την κυτταροπλασματική μεμβράνη (ή κυτταρική μεμβράνη), που διαχωρίζει το εσωτερικό τους από τον περιβάλλοντα χώρο (εικόνα 16). Μέσω της μεμβράνης εισέρχονται στο κύτταρο τα θρεπτικά συστατικά και οι υπόλοιπες ουσίες που αυτό χρειάζεται και παράλληλα, εξέρχονται διάφορα προϊόντα του κυττάρου, άχρηστα ή μη. Εικόνα 16: Εσωτερική δομή των μικροβιακών κυττάρων. (α) Διαγραμματική απεικόνιση ενός προκαρυωτικού και (β) ενός ευκαρυωτικού κυττάρου. Στο εσωτερικό του κυττάρου βρίσκεται ένα σύνθετο μίγμα ουσιών και δομών που συλλογικά ονομάζεται κυτταρόπλασμα. Το κυτταρόπλασμα περιβάλλεται από την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Αυτές οι δομές που είναι διαλυμένες ή αιωρούνται στο νερό, επιτελούν τις λειτουργίες του κυττάρου. Κύρια συστατικά του κυτταροπλάσματος, πλην του νερού είναι τα μακρομόρια, τα ριβοσώματα, διάφορα μικρά οργανικά μόρια (κυρίως πρόδρομες ενώσεις των μακρομορίων) και διάφορα ανόργανα ιόντα. Τα ριβοσώματα είναι τα κυτταρικά «εργοστάσια» σύνθεσης των πρωτεϊνών. Αποτελούνται από ριβονουκλεϊκό οξύ (RNA) και πρωτεΐνες, οι οποίες αλληλεπιδρούν με άλλες διαλυτές πρωτεΐνες και με αγγελιαφόρο RNA κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης. 18

22 Το κυτταρικό τοίχωμα προσδίδει δομική αντοχή σε ένα κύτταρο. Είναι ένα σχετικά αδιαπέραστο στρώμα που βρίσκεται εξωτερικά της κυτταροπλασματικής μεμβράνης κι έχει πολύ μεγαλύτερη ανθεκτικότητα από αυτήν. Κυτταρικό τοίχωμα διαθέτουν τα φυτικά κύτταρα και οι περισσότεροι μικροοργανισμοί, ενώ τα ζωικά κατά κανόνα δεν έχουν. Η προσεκτική παρατήρηση της εσωτερικής δομής των κυττάρων αποκαλύπτει ότι υπάρχουν δύο δομικοί τύποι κυττάρου: τα προκαρυωτικά & τα ευκαρυωτικά Προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί Είναι μονοκύτταροι οργανισμοί και αναπαράγονται αγενώς με απλή διαίρεση των κυττάρων (εικόνα 17). Σε αντίθεση με τους ευκαρυωτικούς έχουν απλή εσωτερική δομή στο κύτταρό τους και δεν διαθέτουν οργανίδια. Χαρακτηριστικό τους γνώρισμα είναι η έλλειψη κυτταρικού πυρήνα, με αποτέλεσμα το γενετικό τους υλικό να βρίσκεται ελεύθερο στο κυτταρόπλασμα. Το γενετικό υλικό αποτελείται από ένα κυκλικό μόριο DNA. Μερικές φορές μέσα στο κύτταρό τους παρατηρείται επιπλέον γενετικό υλικό που ονομάζεται πλασμίδιο. Εικόνα 17: Διαίρεση προκαρυωτικού / βακτηριακού κυττάρου κατόπιν διπλασιασμού του γενετικού του υλικού Οι προκαρυωτικοί οργανισμοί χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, οι οποίες περιλαμβάνουν: 1. Αρχαιοβακτήρια Πρόκειται για μια ετερογενή ομάδα, η οποία αποτελείται από 3 υποομάδες (τα μεθανιοβακτήρια, τα υπεραλόφιλα και τα θερμοοξινόφιλα). Αντιπρόσωποι αυτής της ομάδας διαβιούν σε ακραία, από άποψη συνθηκών, περιβάλλοντα. 2. Ευβακτήρια ή απλά βακτήρια (Gram+, Gram-) Τα Ευβακτήρια συχνά κατατάσσονται με βάση ορισμένα χαρακτηριστικά όπως είναι η χρώση του κυττάρου τους κατά Gram, οι απαιτήσεις τους σε οξυγόνο, το σχήμα τους και ο μεταβολισμός τους. Στη συγκεκριμένη ομάδα ανήκουν μεταξύ άλλων και τα Κυανοβακτήρια (φωτοαυτότροφα, έχουν χλωροφύλλη και μπορούν να χρησιμοποιούν το CO 2 ), τα Μυκοπλάσματα (χωρίς κυτταρικό τοίχωμα), οι Ρικέτιες και τα Χλαμύδια (παράσιτα) και οι Σπειροχαίτες (χαρακτηριστική κατασκευή του κυττάρου). 19

23 Εικόνα 18: Φυλογενετικό δέντρο της ζωής, όπως προκύπτει από τη σύγκριση τα αλληλουχίας του ριβοσωμικού RNA Βακτήρια Είναι μικροί και απλοί μονοκύτταροι μικροοργανισμοί (δεν έχουν πυρήνα ούτε άλλα οργανίδια πλην ριβοσωμάτων). Το μέγεθος των βακτηρίων είναι από 0,5-5μm συνήθως, αλλά υπάρχουν και βακτήρια εκτός αυτού του ορίου. Οι μορφές στις οποίες εμφανίζονται είναι: - κοκκοειδή (πχ. Staphylococcus) - βακτηριοειδή ή βακιλλοειδή (πχ. Clostridium) - σπειροειδή (πχ. Treponema pallidum) - βακτήρια φέροντα διακλαδώσεις (πχ. Actinomycetes) Εικόνα 19: Μορφές βακτηριακών κυττάρων 20

24 Το κύτταρο περιβάλλεται από κυτταρικό τοίχωμα, στο οποίο υπάρχουν συχνά όργανα προσκόλλησης, τα ινίδια και όργανα κίνησης, τα μαστίγια. Αναπαράγονται με διχοτόμηση, η οποία υπό ευνοϊκές συνθήκες διαβίωσης μπορεί να γίνεται κάθε 20 λεπτά. Υπάρχει ευρεία ποικιλία ως προς τις συνθήκες διαβίωσης. Μερικά γένη σχηματίζουν κάτω από αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες ενδοσπόρια. Τα ενδοσπόρια είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στην ζέστη, κρύο, ακτινοβολίες. Κάτω από ευνοϊκές συνθήκες μετατρέπονται σε κανονικά κύτταρα. Η κυτταρική τους δομή χαρακτηρίζεται από: Κυτταρικό τοίχωμα (cell wall) σταθερό σχήμα και περιέχει πάντα το πολυσακχαρίδιο πεπτιδογλυκάνη. Κυτταρική μεμβράνη (cytoplasmic membrane) - έλεγχος εισερχομένων & εξερχόμενων υλών από το κύτταρο. Κυτταρόπλασμα υδατικό διάλυμα που περιέχει όλα τα συστατικά του κυττάρου. Χρωμόσωμα κυκλικό μόριο DNA (cdna) με διπλή έλικα (double stranded DNA) χωρίς ιστόνες (χρωμοσωμικές πρωτεΐνες). Ριβοσώματα (ribosomes) μέρος αντιδράσεων για την παραγωγή πρωτεϊνών. Κενοτόπια (storage granules) σωματίδια για αποθήκευση ουσιών. Φωτοσυνθετικές μεμβράνες (μόνο στα φωτοσυνθετικά κύτταρα) Εικόνα 20: Το προκαρυωτικό / βακτηριακό κύτταρο. Γλυκοκάψουλα (Κάψουλα): Οργανικά πολυμερή, που προκαρυωτικοί οργανισμοί συνθέτουν και διαμορφώνουν ένα "μαλακό" στρώμα έξω από το κυτταρικό τοίχωμα. Σχηματίζουν λείες ή βλεννοειδείς αποικίες. Η γλυκοκάψουλα προσφέρει: Προστασία έναντι αποξήρανσης Ικανότητα προσκόλλησης σε επιφάνειες και δημιουργία αποικιών Προστασία από φαγοκυττάρωση 21

25 Μαστίγια (Flagella): Είναι εξωκυτταρικές τριχοειδείς προσθήκες, που έχουν μερικά γένη βακτηρίων και τους δίνουν την ικανότητα να κινούνται από μόνα τους. Έχουν ελικοειδή κίνηση και περιστρέφονται στην ίδια φορά ή αντίθετα από τους λεπτοδείκτες του ρολογιού γύρω από τον άξονα τους με περιστροφή του βασικού άξονα. Τα μαστίγια έχουν μήκος 5-30 nm με διάμετρο nm. Αποτελούνται από 3 μέρη: 1. Το επίμηκες τμήμα του μαστιγίου (ινίδιο), που αποτελείται από φλαγγελίνη (=πρωτεΐνη διατεταγμένη σαν αλυσίδα γύρω από ένα κεντρικό σωλήνα) 2. Το άγκιστρο, που περιβάλλει το ινίδιο. 3. Το βασικό σώμα, μια ράβδος που περιβάλλεται από ένα σύστημα δακτυλίων (Gram (+): ένα ζεύγος δακτυλίων, Gram (-): δύο ζεύγη δακτυλίων). Ινίδια & σωληνίσκοι (Fibriae & Pili): Τριχοειδείς προεκτάσεις των Gram(-) βακτηρίων, πού είναι μικρότερες των μαστιγίων που χρησιμοποιούνται κυρίως για προσκόλληση. Αποτελούνται από την πιλίνη (=πρωτεΐνη), που είναι διατεταγμένη ελικοειδώς αφήνοντας ένα κενό κεντρικό σωλήνα. Τα ινίδια εμφανίζονται στους πόλους ή είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στην επιφάνεια του βακτηρίου. Κυρίως χρησιμοποιούνται για προσκόλληση σε επιφάνειες ή και μεταξύ τους. Η παθογένεια των μικροοργανισμών συσχετίζεται με την ύπαρξη ινιδίων. Οι σωληνίσκοι είναι 1 έως 2 ανά κύτταρο και συνδέουν βακτηριακά κύτταρα προετοιμάζοντας την μεταφορά του DNA στα πλαίσια της σύζευξης (γι αυτό και ονομάζονται γόνο-σωληνίσκοι (sex-pili). Κυτταρικό τοίχωμα Το προκαρυωτικό κυτταρικό τοίχωμα είναι δυσδιάκριτο στο οπτικό μικροσκόπιο, αλλά μπορεί να παρατηρηθεί ευχερώς με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε λεπτές τομές κυττάρων. Τα βακτήρια υποδιαιρούνται σε δύο μεγάλες ομάδες: τα θετικά κατά Gram και αρνητικά κατά Gram. Η διάκριση αυτή βασίστηκε αρχικά στην τεχνική της χρώσης κατά Gram, η οποία ουσιαστικά διακρίνει τα κύτταρα βάσει διαφορών στη δομή του κυτταρικού τοιχώματος. Η διαφορά στην εμφάνιση του κυτταρικού τοιχώματος μεταξύ θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων είναι χαρακτηριστική. Το τοίχωμα του αρνητικού κατά Gram κυττάρου είναι μι δομή πολύστιβη και πολυσύνθετη, ενώ το τοίχωμα του θετικού κατά Gram κυττάρου είναι παχύτερο και συγκροτείται κυρίως από ένα τύπο μορίου. Τα κυτταρικά τοιχώματα ων βακτηρίων έχουν μια στιβάδα άκαμπτη, η οποία αποτελείται ένα πολυμερές, ονομαζόμενο πεπτιδογλυκάνη (μουρεΐνη). Η πεπτιδογλυκάνη συντίθεται από δύο παράγωγα σακχάρων την Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (ΝΑG) και το Ν-ακετυλομουραμικό οξύ (ΝΑΜ) και από μια μικρή ομάδα αμινοξέων, αποτελούμενη από L-αλανίνη, D-αλανίνη D- γλουταμικό οξύ και λυσίνη ή διαμινοπιμελικό οξύ. Τα συστατικά αυτά συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας μια επαναλαμβανόμενη δομή, το τετραπεπτίδιο γλυκάνης. 22

26 Εικόνα 21: Κυτταρικά τοιχώματα των βακτηρίων. (α, β) Σχεδιαγράμματα θετικών και αρνητικών κατά Gram κυτταρικών τοιχωμάτων. (γ, ε) Εικόνες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνουν το κυτταρικό τοίχωμα θετικού κατά Gram βακτηρίου. (δ, στ) Εικόνες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που δείχνουν το κυτταρικό τοίχωμα αρνητικού κατά Gram βακτηρίου. Τοίχωμα Gram (+) βακτηρίων Αποτελείται από πολλά στρώματα πεπτιδογλυκάνης (μουρεΐνη) σχηματίζοντας ένα παχύ στερεό στρώμα. Επιπρόσθετα περιέχουν επίσης τειχοϊκά οξέα, που αποτελούν μέχρι και 50% του συνολικού ξηρού βάρους του τοιχώματος. 23

27 Τοίχωμα Gram (-) βακτηρίων Αποτελείται από ένα έως δύο στρώματα πεπτιδογλυκάνης (μουρεΐνη) χωρίς τειχοϊκά οξέα και μία εξωτερική μεμβράνη. Η μουρεΐνη βρίσκεται στο κυτταροπλασματικό χώρο μεταξύ εξωτερικής και εσωτερικής κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Η εξωτερική μεμβράνη αποτελείται από λιποπρωτεΐνες, λιποπολυσακχαρίτες και φωσφολιπίδια. Περιέχει διακεκριμένες οπές, που σχηματίζονται από συγκεκριμένες πρωτεΐνες (πορίνες) και επιτρέπουν την ανταλλαγή ύλης. Στον περιπλασματικό χώρο περιέχονται υψηλές συγκεντρώσεις αποικοδομητικών ενζύμων και πρωτεϊνών μεταφοράς. Το τοίχωμα των Gram (-) βακτηρίων είναι περισσότερο ευάλωτο σε μηχανική καταπόνηση, αλλά περισσότερο ισχυρό απέναντι σε λυτικά ένζυμα και αντιβιοτικά επειδή περιβάλλεται από την εξωτερική μεμβράνη. Βλάβες του κυτταρικού τοιχώματος μπορούν να προκληθούν από λυτικά ένζυμα και αντιβιοτικά: Λυσοζύμη: υδρολύει τον γλυκοζιτικό δεσμό της μουρεΐνης. Επιδρά βασικά στα Gram (+) βακτήρια. Τα Gram (-) βακτήρια προστατεύονται από την εξωτερική μεμβράνη. Αντιβιοτικά τύπου β-λακτάμης (π.χ. πενικιλίνη): παρεμποδίζουν την σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος. Κυτταροπλασματική μεμβράνη: Η κυτταροπλασματική μεμβράνη είναι μια λεπτή δομή που περιβάλλει πλήρως το κύτταρο. Αυτή η ζωτικής σημασίας δομή, πάχους 8 nm, αποτελεί το φραγμό ανάμεσα στο εσωτερικό του κυττάρου (κυτταρόπλασμα) και στο περιβάλλον του. Αν διαφραγεί η μεμβράνη η συνοχή του κυττάρου καταστρέφεται, τα εσωτερικά συστατικά του διαρρέουν στο περιβάλλον και το κύτταρο πεθαίνει. Η μεμβράνη δεν είναι ένας απλός φραγμός αλλά ένας ιδιαίτερα επιλεκτικός φραγμός, που καθιστά το κύτταρο ικανό να συγκεντρώνει ειδικούς μεταβολίτες και να αποβάλλει άχρηστα υλικά. Η γενική δομή των βιολογικών μεμβρανών είναι μια διπλοστιβάδα φωσφολιπιδίων. Τα φωσφολιπίδια περιέχουν τόσο υδρόφοβα (λιπαρό οξύ) όσο και σχετικά υδρόφιλα μέρη (γλυκερόλη) και είναι δυνατόν να απαντούν σε πολλές διαφορετικές χημικές μορφές, λόγω της ποικιλομορφίας των λιπαρών οξέων ή των φωσφορικών ομάδων που μπορούν να συνδέονται στο δομικό σκελετό της γλυκερόλης. Κατά τη συσσώρευσή τους σε ένα υδατικό διάλυμα, τα φωσφολιπίδια τείνουν να σχηματίζουν αυθορμήτως δομές διπλοστιβάδας τα λιπαρά οξέα στρέφονται το ένα προς το άλλο σε ένα υδρόφοβο περιβάλλον, ενώ τα υδρόφιλα μέρη παραμένουν εκτεθειμένα στο εξωτερικό υδρόφιλο περιβάλλον (εικόνα 22). Η διπλοστιβάδα είναι πιθανότατα η σταθερότερη διευθέτηση που μπορούν να υιοθετήσουν τα λιπιδικά μόρια σε ένα υδατικό περιβάλλον. Επιπλέον, η κυτταροπλασματική μεμβράνη περιέχει πρωτεΐνες, καθώς και ένζυμα που συμμετέχουν στην αναπνευστική αλυσίδα για παραγωγή ATP και στη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος. 24

28 Εικόνα 22: Διάγραμμα δομής της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Κυτταρόπλασμα: Το εσωτερικό των κυττάρων, που περικλείεται από την κυτταροπλασματική μεμβράνη και περιέχει τις διάφορες δομές του κυττάρου (DNA, ριβοσώματα, έγκλειστα). Είναι ένα ημιδιαφανές, παχύρρευστο υγρό. Αποτελείται κατά 80% από νερό και περιλαμβάνει πρωτεΐνες (ένζυμα), λιπίδια, υδατάνθρακες, ανόργανα συστατικά και χαμηλομοριακές ενώσεις. Πυρηνοειδές: Σχηματισμός ορατός (με απλό μικροσκόπιο) μετά από κατάλληλη χρώση. Ουσιαστικά πρόκειται για την περιοχή όπου υπάρχει το γενετικό υλικό. Εικόνα 23: Δομή προκαρυωτικού κυττάρου Ριβοσώματα: Όλα τα κύτταρα περιέχουν ριβοσώματα, τα οποία είναι τα χημικά εργοστάσια της πρωτεϊνοσύνθεσης του κυττάρου. Έχουν 2 υποομάδες, που αποτελούνται από πρωτεΐνες και ριβοσωμικό RNA (rrna). Προκαρυωτικά ριβοσώματα είναι 70S και αποτελούνται από τις 2 υποομάδες 30S και 50S. Αναπτυσσόμενα κύτταρα έχουν ένα μεγαλύτερο αριθμό ριβοσωμάτων. 25

29 Έγκλειστα: 1. Κενοτόπια, για να επιπλέουν στο υδάτινο περιβάλλον. 2. Καρβοξυσώματα, περιέχουν το ένζυμο καρβοξυδισμουτάση που δεσμεύει το CO Μαγνητοσώματα, κρύσταλλοι μαγνητίτου (Fe 3 O 4 ). 4. έγκλειστα με αποθεματικά υλικά, όπως: πολυφωσφορικά (βακτήρια με τέτοιες ιδιότητες του γένους Αcinetobacter χρησιμοποιούνται στην απομάκρυνση φωσφορικών κατά την επεξεργασία υγρών αποβλήτων / κάτω από αναερόβιες συνθήκες απελευθερώνουν πάλι τον φώσφορο) θείο (θειοβακτήρια του γένους Thiobacillus συσσωρεύουν θείο από την οξείδωση του H 2 S, S, S 2 O -2 3 / όταν χρειάζονται θείο οξείδωση σε Η 2 SO 4 και διάθεση) πολύ-β-d-υδροξυβουτυρικό οξύ σχηματισμός του πολυμερούς πολύ-β-dυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), που χρησιμοποιείται από τα κύτταρα σαν πηγή άνθρακα και ενέργειας. πολυσακχαρίτες (π.χ. άμυλο, γλυκογόνο). Ενδοσπόρια: Ορισμένα είδη θετικών κατά Gram βακτηρίων παράγουν κατά τη διεργασία της λεγόμενης σπορίωσης ειδικές ενδοκυτταρικές δομές που καλούνται ενδοσπόρια. Τα ενδοσπόρια είναι διαφοροποιημένα κύτταρα, με ιδιαίτερη αντοχή στα υψηλές θερμοκρασίες και ανθεκτικότητα έναντι πολλών ισχυρών χημικών αντιδραστηρίων που καταστρέφουν τα συνήθη κύτταρα. Βακτήρια που σχηματίζουν ενδοσπόρια απαντούν πολύ συχνά μεταξύ των εδαφο-βακτηρίων και ουσιαστικά κάθε δείγμα χώματος που παίρνει κανείς περιέχει κάποια ποσότητα ενδοσπορίων. Διεξοδικότερα μελετημένα από αυτά είναι τα γένη Bacillus και Clostridium. Συγκεκριμένα, πρόκειται για αναπαυόμενα, αδρανή κύτταρα υψηλής αντοχής με ιδιαίτερα ανθεκτικά τοιχώματα. Περιέχουν DNA, μικρή ποσότητα RNA, ριβοσώματα, ένζυμα, μερικά μικρομοριακά μόρια, Ca ++ και διπικολονικό οξύ και δημιουργούνται κάτω από συνθήκες έλλειψης νερού ή θρεπτικών συστατικών. Μπορούν να επιζήσουν σε ξηρό περιβάλλον, υψηλή θερμοκρασία, ακτινοβολία, έκθεση σε τοξικά. Όταν επανέλθουν σε ευνοϊκές συνθήκες περιβάλλοντος ενεργοποιούνται και παράγουν ένα βλαστικό κύτταρο (βλάστηση). Εικόνα 24: Ώριμο ενδοσπόριο από Bacillus megaterium 26

30 Εικόνα 25: Στάδια στο σχηματισμό του ενδοσπορίου Ακτινομύκητες Οι ακτινομύκητες είναι αερόβιοι οργανισμοί και μοιάζουν με τους μύκητες στην κυτταρική τους δομή αλλά το μέγεθος τους μοιάζει με των βακτηρίων. Είναι σημαντικοί για την παραγωγή αντιβιοτικών, ενώ παράλληλα, μερικοί ακτινομύκητες μπορούν και υδρολύουν το άμυλο και την κυτταρίνη. Είναι ευρύτατα διαδεδομένοι στα φυσικά νερά και στο έδαφος. Η παρουσία τους στο νερό είναι ενοχλητική διότι προκαλούν προβλήματα δυσάρεστης οσμής και γεύσης Κυανοφύκη Πρόκειται για τη μόνη κατηγορία προκαρυωτικών οργανισμών που φωτοσυνθέτουν (φωτοαυτότροφα). Διαθέτουν σύστημα χρωμοφόρων όμοιο με το αντίστοιχο ευκαρυωτικών οργανισμών. Διαβιώνουν σε θερμές πηγές. Πολλά καθηλώνουν το άζωτο (μετατροπή του αέριου μοριακού αζώτου σε αμμωνία, η οποία είναι απαραίτητη για την ενσωμάτωση του αζώτου στα συστατικά του κυττάρου). Βρίσκονται σε αφθονία σε εδάφη και νερά που είναι φτωχά σε άζωτο. 27

31 4.2. Ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί Η βασική δομική και λειτουργική μονάδα των ευκαρυωτικών οργανισμών είναι το ευκαρυωτικό κύτταρο. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι κατά πολύ μεγαλύτερα των προκαρυωτικών κυττάρων (συνήθως από μέχρι φορές μεγαλύτερα). Παρουσιάζουν μεγάλη εσωτερική οργάνωση με την ύπαρξη διαμερισμάτων, όπου γίνονται συγκεκριμένες και διαφορετικές λειτουργίες. Απαντώνται είτε σε μονοκυτταρικούς οργανισμούς (μικροοργανισμούς) είτε σε πολυκυτταρικούς (ανώτεροι οργανισμοί). Τα ζωικά κύτταρα έχουν μόνο κυτταρική μεμβράνη (δεν έχουν κυτταρικό τοίχωμα), ενώ οι μονοκυτταρικοί ευκαρυωτικοί οργανισμοί έχουν κυτταρική μεμβράνη και κυτταρικό τοίχωμα. Οργανίδια ευκαρυωτικών κυττάρων Ενδοπλασματικό Δίκτυο Δίκτυο αναδιπλωμένων μεμβρανοειδών κυστιδίων, που συνθέτει και αποθηκεύει πρωτεΐνες και λιπίδια. Παρέχει τον μηχανισμό μεταφοράς αυτών των μορίων σε άλλα μέρη του κυττάρου. Ξεχωρίζουμε 2 τύπους το αδρό και το λείο. Το ΕΔ παρέχει μεγάλη επιφάνεια για τις αντιδράσεις που οδηγούν στην σύνθεση λιπιδίων στο λείο (smooth ER) και πρωτεϊνών στο αδρό (rough ER). Το Λείο Ενδοπλασματικό Δίκτυο (smooth Endoplasmic Reticulum) είναι ένα πολύπλοκο σύστημα μεμβρανών, που αρχίζει από την κυτταρική μεμβράνη και εκτείνεται στο εσωτερικό του κυττάρου. Το αδρό ΕΔ (rough Endoplasmic Reticulum) είναι ένα πολύπλοκο σύστημα μεμβρανών, όπου τα ριβοσώματα είναι προσκολλημένα στις μεμβράνες. Εικόνα 26: Δομή τυπικού ευκαρυωτικού κυττάρου 28

32 Ριβοσώματα Αποτελούν τους υποδοχείς για την σύνθεση των πρωτεϊνών. Είναι είτε ελεύθερα στο κυτταρόπλασμα, είτε προσκολλημένα στο ΕΔ. Τα ευκαρυωτικά είναι 80 S και αποτελούνται από 2 υποομάδες 40S και 60S. Πυρήνας Ο πυρήνας (~5 nm) χωρίζεται από το κυτταρόπλασμα με την πυρηνική μεμβράνη και εσωκλείει το πυρηνόπλασμα, το χρωμοσωμικό DNA, τις χρωμοσωμικές πρωτεΐνες (ιστόνες) και τον πυρηνίσκο (αποτελείται από DNA & RNA, υπεύθυνος για την σύνθεση του rrna). Το χρωμοσωμικό DNA + οι χρωμοσωμικές πρωτεΐνες δημιουργούν την χρωματίνη. Νουκλεόσωμα είναι ο συνδυασμός ~ 165 ζευγών μορίων DNA και 9 μορίων ιστόνης. Τα νουκλεοσώματα είναι οι υποομάδες, που σχηματίζουν τα χρωματοσώματα. Τα χρωματοσώματα είναι ορατά κατά την κυτταρική διαίρεση σαν παχιά ραβδοειδή σώματα. Μιτοχόνδρια Σφαιρικά ή ραβδοειδή οργανίδια, έχουν διπλή μεμβράνη, είναι τα ενεργειακά κέντρα των ευκαρυωτικών κυττάρων, όπου γίνεται ο μεταβολισμός, η διεργασία της αναπνοής, όπου παράγεται ενέργεια υπό μορφή ATP. Περιέχουν δικά τους 70S ριβοσώματα, δικό τους DNA και πρωτεΐνες. Αναπτύσσονται και διαιρούνται αυτόνομα. Χλωροπλάστες Μεμβρανικές δομές, που περιέχουν χλωροφύλλη και τα ένζυμα της φωτοσύνθεσης. Έχουν δικά τους 70S ριβοσώματα, DNA και πρωτεΐνες. Φύκη και φυτά έχουν την δυνατότητα παραγωγής ενέργειας με φωτοσύνθεση και γίνεται στους χλωροπλάστες. Σύμπλεγμα Golgi Σύμπλεγμα Golgi (complex) είναι μικρά σωματίδια αποτελούμενα από συμπλέγματα μεμβρανών όπου επεξεργάζονται ορισμένα ένζυμα και πρωτεΐνες. Κενοτόπια / Χυμοτόπια (vacuoles) Κενοτόπια / Χυμοτόπια (vacuoles) προέρχονται από το σύμπλεγμα Golgi, είναι οργανίδια (αποθήκες) χαμηλής πυκνότητας προσκολλημένα στην κυτταροπλασματική μεμβράνη και χρησιμοποιούνται για την χώνευση τροφών, τη ρύθμιση της οσμωτικής πίεσης και για την αποθήκευση απορριμμάτων έτσι (στα φυτικά κύτταρα καταλαμβάνουν μέχρι και το 90% του συνολικού όγκου). 29

33 Λυσοσωμάτια (lysosomes) Λυσοσωμάτια (lysosomes) είναι μικρά σωματίδια προσκολλημένα σε πολύ μικρές μεμβράνες και περιέχουν ισχυρά ένζυμα χώνευσης (digestive enzymes). Ο πιο σημαντικός ρόλος τους είναι η ενδοκυτταρική πέψη σωματιδίων (ενδοκυττάρωση). Διασπούν πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα, πολυσακχαρίτες κ.α. Μαστίγια και βλεφαρίδες Κάνουν κυματοειδή ταλάντωση και καλύπτονται από πλασματική μεμβράνη. Περιέχουν μικροσωλήνες, που ξεκινούν από το βασικό σωμάτιο. Μαστίγια υπάρχουν 1-2 ανά κύτταρο και είναι σχετικά μεγάλου μήκους. Οι βλεφαρίδες είναι πολυάριθμες ανά κύτταρο και μικρού μήκους. Κυτταρικό τοίχωμα και γλυκοκάλυκας Η δομή είναι απλούστερη από τα προκαρυωτικά. Στα φύκη αποτελείται από κυτταρίνη. Στους μύκητες από ένα ετεροπολυσακχαρίδιο με βασικό του πολυμερές την Ν- ακετυλογλυκοζαμίνη, τη χιτίνη. Στους ζυμομύκητες περιέχει γλυκάνες. Πολλοί ευκαρυωτικοί οργανισμοί έχουν μόνο πλασματική μεμβράνη, η οποία επικαλύπτεται από ένα στρώμα υδατανθράκων, τον γλυκοκάλυκα. Πλασματική μεμβράνη Όμοια με των προκαρυωτικών. Διαφέρει στον τύπο των πρωτεϊνών και στην παρουσία υδρογονανθράκων και στερολών (λιπιδίων). Η μεταφορά της ύλης γίνεται με παθητική διάχυση, επιταχυμένη διάχυση, όσμωση, ενεργό μεταφορά ή ενδοκυττάρωση. Κυτταρόπλασμα Το υλικό, που βρίσκεται μέσα στα κυτταρικά συστατικά. Διασχίζεται από τον κυτταροσκελετό (νήματα, μικρονήματα, μικροσωληνίσκοι), που συγκρατεί τα κυτταρικά οργανίδια και ριβοσώματα. Η διαμερισματοποίηση του ευκαρυωτικού κυττάρου, ο καταμερισμός εργασίας και η συντονισμένη σύμπραξη διαφορετικών συστημάτων συντελούν στην αποτελεσματικότητα της κυτταρικής λειτουργίας. Κυτταρόπλασμα: γλυκόλυση, γλυκονεογένεση, κύκλος των φωσφορικών πεντοζών, σύνθεση λιπαρών οξέων. Ενδοπλασματικό δίκτυο: σύνθεση λιπιδίων, μεταφορά προϊόντων βιοσύνθεσης. 30

34 Μιτοχόνδρια: κύκλος Krebs, οξειδωτική φωσφορυλίωση, οξείδωση αμινοξέων και λιπαρών οξέων και πυροσταφυλικού οξέος. Σύστημα Golgi: γλυκοξυλίωση πρωτεϊνών, ταξινόμηση και διανομή πρωτεϊνών. Ριβοσώματα: σύνθεση πρωτεϊνών. Κυτταροπλασματική μεμβράνη: σύστημα μεταφοράς. Μικροσώματα: οξείδωση αμινοξέων. Έγκλειστα γλυκογόνου: σύνθεση γλυκογόνου. Λυσοσώματα: υδρολυτικά ένζυμα. Πυρήνας: αντιγραφή DNA και σύνθεση t-rna, m-rna. Πυρηνίσκος: σύνθεση r-rna Μύκητες Οι μύκητες είναι ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί και ανήκουν σε ξεχωριστό βασίλειο. Για τους μύκητες χρησιμοποιείται ο όρος fungus (πληθυντικός: fungi). Τα κύρια χαρακτηριστικά των μυκήτων συνοψίζονται στα παρακάτω στοιχεία: Είναι ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί μονοκύτταροι ή πολυκύτταροι κοινοκυτταρικοί, οι οποίοι χαρακτηρίζονται μυκηλιακοί επειδή σχηματίζουν μυκήλια. Το μυκήλιο είναι η βλαστική μορφή των μυκήτων, η οποία είναι ουσιαστικά μια πολυπυρηνική μάζα κυτταροπλάσματος. Πρόκειται για σποριογόνους οργανισμούς. Τα σπόρια ονομάζονται κονίδια και είναι η βασική μονάδα αναπαραγωγής τους Τα σπόρια έχουν μεγάλη ανθεκτικότητα στη ζέστη, κρύο, ξηρασία και χημικές ενώσεις Οι πολυκύτταροι μύκητες δημιουργούν νηματώδεις διακλαδιζόμενες υφές (hyphae) που περιβάλλονται από κυτταρικά τοιχώματα. Το σύνολο των υφών επάνω σε στερεό υπόστρωμα άγαρ ονομάζεται μυκήλιο (mycelium). Το μυκήλιο είναι ένα σύστημα διακλαδισμένων σωλήνων όπου περιέχονται πολλοί πυρήνες και το διακινούμενο κυτταρόπλασμα και είναι ορατό με γυμνό οφθαλμό. Ορισμένες διακλαδώσεις μπορούν να βγαίνουν και στον αέρα. Έτσι το μυκήλιο διακρίνεται στο αέριο και βλαστικό μυκήλιο. Το σχηματιζόμενο σώμα τους ονομάζεται θαλλός (thallus). Τα κονίδια σχηματίζονται στις άκρες των υφών. Τα κονίδια μπορούν υπό κατάλληλες συνθήκες να βλαστήσουν και να δημιουργήσουν νέες υφές, με συνέπεια την εξάπλωση του μυκηλίου. Οι μύκητες δεν διαθέτουν χλωροφύλλη (αχλωρόφυλλοι). Εικόνα 27: Διαδοχικά στάδια ανάπτυξης μυκηλίου μύκητα. Από το κύτταρο αναπαραγωγής ή κονίδιο α, β, προκύπτουν οι υφές γ, οι οποίες σχηματίζουν τα μυκήλια δ, ε. 31

35 Έχουν ετεροτροφικό μεταβολισμό (χημειοετερότροφοι μικροοργανισμοί). Συνήθως πολλαπλασιάζονται αγενώς με σχηματισμό μονοπύρηνων ή πολυπύρηνων σπορίων που ελευθερώνονται από τις κορυφές των υφών. Τα κυτταρικά τους τοιχώματα αποτελούνται σχεδόν εξ ολοκλήρου από τον πολυσακχαρίτη χιτίνη. Πολλαπλασιάζονται κυρίως στο σκοτάδι, σε υγρά περιβάλλοντα πλούσια σε οργανικό υλικό και σε στερεά υποστρώματα. Το όξινο ph είναι ευνοϊκό περιβάλλον γι αυτούς εν αντιθέσει με τα βακτήρια. Είναι ανθεκτικότεροι των βακτηρίων στην ωσμωτική πίεση και έτσι μπορούν να αναπτυχθούν σε υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων και σακχάρων. Είναι κυρίως εδαφικοί μικροοργανισμοί, πολύ λίγοι έχουν σαν φυσικό τους περιβάλλον το γλυκό ή θαλάσσιο νερό. Όταν αναπτύσσονται σε υδατικό διάλυμα θρεπτικών ουσιών (π.χ. ανάπτυξη σε βιοαντιδραστήρα) τότε δημιουργούν κυτταρικά συσσωματώματα (cell aggregates) ή κυτταρικά σφαιρίδια (pellets). Τα τελευταία δημιουργούν προβλήματα παροχής θρεπτικών ουσιών (κυρίως οξυγόνου) στο κέντρο του σφαιριδίου αλλά συγχρόνως ελαττώνουν το ιξώδες της υγρής φάσης (που επιτρέπει την καλύτερη μεταφορά οξυγόνου από τις φυσαλίδες στην υγρή φάση). Οι περισσότεροι είναι σαπροφυτικοί και αποκτούν τα θρεπτικά συστατικά τους από την νεκρή ύλη. Αποικοδομούν πολύπλοκα οργανικά υλικά του περιβάλλοντος, κυρίως από την νεκρή φύση, και έτσι συμβάλλουν στην ανακύκλωση της οργανικής ύλης. Πολλοί παράγουν μυκοτοξίνες και προκαλούν μυκώσεις σε ζώντες οργανισμούς (φυτά, ζώα και άνθρωπο). Έχουν σημαντικές βιοτεχνολογικές και βιομηχανικές εφαρμογές. Οι σημαντικότερες εφαρμογές τους είναι στην αρτοποιεία, στην παρασκευή τυριών, στην οινοποιεία και ζυθοποιεία και παραγωγή φαρμάκων (αντιβιοτικών κα), που επιτυγχάνονται με τις ζυμώσεις. Εικόνα 28: Βλάστηση των σπορίων του μύκητα Alternaria alternata. Διακρίνονται τα σπόρια, οι βλαστικοί σωλήνες και οι διακλαδώσεις τους (x240). 32

36 Ταξινόμηση Μυκήτων ΜΥΚΗΤΕΣ (Fungi) ΦΥΚΟΜΥΚΗΤΕΣ (Water Molds) ΖΥΓΟΜΥΚΗΤΕΣ (Zygomycetes) ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ (Ascomycetes) ΒΑΣΙΔΙΟΜΥΚΗΤΕΣ (Basidiomycetes) ΜΥΞΟΜΥΚΗΤΕΣ (Myxomycetes) ΚΥΤΤΑΡΟΜΥΞΟΜΥΚΗΤΕΣ (Cellular slime molds) ΔΕΥΤΕΡΟΜΥΚΗΤΕΣ (Fungi Imperfecti) Η ταξινόμηση των μυκήτων είναι ακόμη και σήμερα ιδιαίτερα δύσκολη και πολύπλοκη. Γι αυτό στη συνέχεια αναφέρονται οι εφτά ομάδες (κλάσεις) μυκήτων που είναι μέχρι σήμερα διεθνώς αναγνωρισμένες: Οι φυκομύκητες (phycomycetes) θεωρούνται εξελικτικά κατώτεροι μύκητες, είναι υδρόβιοι και μοιάζουν με φύκη χωρίς να έχουν την δυνατότητα φωτοσύνθεσης. Οι ζυγομύκητες (zygomycetes) με χαρακτηριστικό τους γνώρισμα ότι παράγουν ζυγοσπόρια περιλαμβάνουν πολλά είδη που χρησιμοποιούνται στην βιομηχανική προϊόντων, όπως ένζυμα, οργανικά οξέα, αμινοξέα κ.α. Οι ασκομύκητες (ascomycetes), ανήκουν στους ανώτερους μύκητες και αναπαράγονται με την δημιουργία ασκοσπορίων (όπως οι ζυμομύκητες), π.χ., τα γένη Neurospora, Aspergillus και Penicillium. Στην κλάση των ασκομυκήτων ανήκουν και οι ζύμες στις οποίες θα αναφερθούμε ιδιαίτερα. Το μεγαλύτερο ποσοστό ζυμώσεων που γίνονται σε βιομηχανική κλίμακα είναι με ασκομύκητες (π.χ. παραγωγή πενικιλίνης από Penicillium chrysogenum), κιτρικού οξέος από Aspergillus niger). Οι βασιδιομύκητες (basidiomycetes) είναι οι πιο εξελιγμένοι μύκητες και παράγουν βασιδιοσπόρια επάνω σε ειδικές αναπαραγωγικές δομές τα βασίδια. Στους βασιδιομύκητες ανήκουν και τα μανιτάρια που χρησιμοποιούνται στην διατροφή του ανθρώπου. 33

37 Εικόνα 29: Σχηματική παράσταση ενός τυπικού μανιταριού (Βασιδιομύκητα), διακρίνονται το μυκήλιο και οι πυκνές υφές του θαλλού. Οι δευτερομύκητες (deuteromycetes, Fungi imperfecti) αναπαράγονται μόνο με αφυλετικά σπόρια (asexual spores) τα κονίδια. Oι κυτταρομυξομύκητες (cellular slime molds) είναι μονοκύτταροι, μονοπύρηνοι, απλοειδείς μικροοργανισμοί χωρίς κυτταρικό τοίχωμα. Τα κύτταρα, που ονομάζονται μυξαμοιβάδες (myxamoebae), περιβάλλονται μόνο από κυτταρική μεμβράνη, τρέφονται με βακτήρια (φαγοκυττάρωση) και συσσωματώματα που ονομάζονται ψευδοπλασμόδιο. Ζυμομύκητες - Ζύμες: Οι ζύμες είναι μία ειδική κατηγορία μυκήτων, οι οποίοι ανήκουν στους ασκομύκητες. Είναι μικροί (5-10 μm) μονοκύτταροι μύκητες (μεγαλύτεροι των βακτηρίων) με απλό πυρήνα. Μορφολογικά είναι σφαιρικοί, κυλινδρικοί ή ελλειψοειδείς. Αναπαράγονται ως επί το πλείστον με εκβλάστηση (budding), σπάνια με διχοτόμηση (ορισμένα είδη μόνο) ή αμφιγονικά με την δημιουργία ενός ζυγώτη (zygote) δηλ. ενός διπλοειδούς κυττάρου (diploid cell) από την ένωση δύο απλοειδών κυττάρων (haploid cells) όπου το καθένα έχει από ένα σύνολο χρωματοσωμάτων. Ο πυρήνας του διπλοειδούς κυττάρου διχοτομείται πολλές φορές και έτσι δημιουργούνται τα ασκοσπόρια (ascospores). Το κάθε ασκοσπόριο γίνεται τελικά ένα καινούργιο απλοειδές κύτταρο που μπορεί να αναπαράγεται με εκβλάστηση, διχοτόμηση ή αμφιγονικά. Οι ζύμες πάνω σε στερεοποιημένο θρεπτικό άγαρ αναπτύσσουν αποικίες παρόμοιες με εκείνες των βακτηρίων. Ο πλέον δημοφιλής ζυμομύκητας είναι ο Saccharomyces cerevisiae (μαγιά), που χρησιμοποιείται ευρέως για την παραγωγή αλκοολούχων ποτών (αναερόβια ζύμωση) ή για την παρασκευή του ψωμιού (αερόβια ζύμωση). 34

38 Εικόνα 30: Διάγραμμα της αγενούς αναπαραγωγής των μυκήτων με τρία διαφορετικά είδη σπορίων. Εικόνα 31: Διάγραμμα του κύκλου ζωής ενός μύκητα Φύκη Τα φύκη είναι μια μεγάλη και ανομοιογενής ομάδα ευκαρυωτικών οργανισμών που διαθέτουν χλωροφύλλη και διενεργούν αερόβια φωτοσύνθεση. Τα φύκη δεν πρέπει να συγχέονται με τα κυανοβακτήρια, που είναι επίσης αερόβιοι φωτοτροφικοί οργανισμοί, αλλά προκαρυωτικοί. Στη φύση τα φύκη ζουν είτε ως μεμονωμένα κύτταρα είτε σε αποικίες αποτελούμενες από συναθροίσεις κυττάρων. Περιέχουν χλωροφύλλη και γι αυτό έχουν πράσινο χρώμα. Ωστόσο, σε κάποιες περιπτώσεις η παρουσία και άλλων χρωστικών τους προσδίδει φαιό ή κόκκινο χρώμα. Περιλαμβάνουν μικρο- και μακρο- σκοπικά είδη. Η πλειοψηφία των ειδών που ζουν στα γλυκά νερά είναι οι κύριοι παραγωγοί οργανικής ύλης που ανιχνεύεται στο νερό. Επίσης, είναι οι κύριοι παραγωγοί οξυγόνου για τη γήινη ατμόσφαιρα, μια και ο μεταβολισμός τους είναι φωτοσυνθετικός. Τα μικροσκοπικά φύκη είναι μονοκύτταρα, είναι γνωστά με το όνομα φυτοπλαγκτόν και αποτελούν βασικό κομμάτι της τροφικής αλυσίδας των μεγαλύτερων οργανισμών που διαβιώνουν στο νερό. Η συστηματική τους κατάταξη στηρίζεται στις κυτταρικές τους ιδιότητες, τον τύπο του κυτταρικού τοιχώματος, τα είδη των χρωστικών που χρησιμοποιούν για την φωτοσύνθεση και την οργάνωση των μαστιγίων στις κινητές μορφές. Αν 35

39 κάποιο είδος πολλαπλασιαστεί υπέρμετρα τότε μπορεί να δώσει χαρακτηριστικό χρώμα στο νερό (π.χ. κόκκινες παλίρροιες). Ορισμένα φύκη (Chlorella, Scenedesmus, Spirullina & Dunaliella) χρησιμοποιούνται στην επεξεργασία υγρών αποβλήτων με ταυτόχρονη παραγωγή μονοκυτταρικής πρωτεΐνης (single cell protein). Ορισμένα πήγματα (gelling agents) όπως το άγαρ και το αλγινικό οξύ (agar & alginic acid) παράγονται από θαλάσσια φύκη. Πολλές φορές συμβιώνουν με μύκητες προς δημιουργία λειχήνων. Οι λειχήνες βοηθούν στην αποσάθρωση των πετρωμάτων και εμφανίζουν ευαισθησία στην ατμοσφαιρική ρύπανση. Εικόνα 32: Σχηματικές παραστάσεις διαφόρων ειδών φυκών Πρωτόζωα Τα πρωτόζωα είναι μονοκύτταροι ευκαρυωτικοί μικροοργανισμοί χωρίς κυτταρικό τοίχωμα και με μέγεθος μm, οι οποίοι πολλαπλασιάζονται με διχοτόμηση. Θεωρούνται κατώτερα ζώα. Τα περισσότερα είναι αερόβια και ετερότροφα, παίρνοντας τις θρεπτικές τους ουσίες καταναλώνοντας άλλους μικροοργανισμούς (π.χ., βακτήρια) και έχουν την δυνατότητα κίνησης. Η κύρια δράση τους είναι ο έλεγχος του πληθυσμού των βακτηρίων και μυκήτων. Για αυτόν τον λόγο χρησιμοποιούνται στην απομάκρυνση βακτηρίων από βιολογικές διεργασίες καθαρισμού υγρών αποβλήτων. Οι αμοιβάδες, τα φλεβαριδωτά και τα μαστιγωτά είναι οι πιο γνωστές κατηγορίες μονοκύτταρων πρωτόζωων, που λαμβάνουν μέρος στην αερόβια επεξεργασία αποβλήτων. Ορισμένα πρωτόζωα είναι παρασιτικοί οργανισμοί για τον άνθρωπο, δεν έχουν δυνατότητα κίνησης και λαμβάνουν τις θρεπτικές ουσίες από την μεμβράνη τους. Προκαλούν ορισμένες ασθένειες (π.χ., μαλάρια, δυσεντερία). 36

40 Εικόνα 33: Σχηματική παράσταση διαφόρων κατηγοριών μονοκύτταρων πρωτόζωων. Στη Μικροβιολογία του υδάτινου περιβάλλοντος ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν ορισμένα πρωτόζωα, τα οποία μεταδίδονται με το νερό και τα λύματα, όπου οι κύστεις τους διατηρούνται λοιμογόνες για παρατεταμένο χρόνο, παίζοντας σημαντικό ρόλο για τη Δημόσια Υγεία. Τέτοια πρωτόζωα είναι: 1. Giardia lamblia 2. Cryptosporidium parvum 3. Entamoeba histolytica (υδατογενές παθογόνο) Η Giardia lamblia (ή αλλιώς Giardia duodenalis και Giardia intestinalis) είναι το πιο κοινό εντερικό παράσιτο στον άνθρωπο. Προκαλεί τη διαρροϊκή ασθένεια Γιαρδίαση ή Λαμβλίαση που εκδηλώνεται συνήθως με διάρροιες, κοιλιακές κράμπες, φούσκωμα και απώλεια βάρους. Σε παγκόσμιο επίπεδο, είναι το παράσιτο που σχετίζεται περισσότερο από οποιοδήποτε άλλο με τις επιδημίες υδατογενών ασθενειών. Ο κύκλος ζωής της G. lamblia περιλαμβάνει τις κύστεις (cysts) και τα τροφοζωίδια (trophozoites) (εικόνες 34 & 35). Οι κύστεις έχουν σχήμα οβάλ και μήκος περίπου 7-10 μm. Είναι ανθεκτικές στο περιβάλλον και ευθύνονται για τη μετάδοση της Γιαρδίασης. Μπορούν να επιβιώσουν ακόμη και στις συνηθισμένες δόσεις χλωρίου που χρησιμοποιούνται για την απολύμανση του πόσιμου νερού. Εικόνα 34: Κύστεις γιάρδιας ( Εικόνα 35: Τροφοζωίδιο γιάρδιας ( 37

41 Η μόλυνση λαμβάνει χώρα μετά την κατάποση των κύστεων που σηματοδοτεί και την έναρξη του κύκλου ζωής της γιάρδιας. Η μολυσματική δόση που χρειάζεται να καταναλώσει ο άνθρωπος για να νοσήσει εκτιμάται σε 10 κύστεις. Για όσο διαρκούν τα συμπτώματα της νόσου, το μολυσμένο άτομο μπορεί να αποβάλλει με τα κόπρανα κύστεις ημερησίως. Η αποβολή, όμως, κύστεων συνεχίζεται ακόμη και για μήνες μετά την υποχώρηση των συμπτωμάτων. Στον κύκλο ζωής της γιάρδιας (εικόνα 36), οι ώριμες κύστεις που επιβιώνουν από την έκθεσή τους στο γαστρικό υγρό απελευθερώνουν στο λεπτό έντερο τα τροφοζωίδια. Τα τελευταία που ευθύνονται για την εκδήλωση των κλινικών συμπτωμάτων της Γιαρδίασης στους ανθρώπους έχουν το σχήμα κουταλιού και το μήκος τους είναι περίπου μm. Αποικίζουν το λεπτό έντερο, πολλαπλασιάζονται με διαμήκη δυαδική σχάση και μετατρέπονται και πάλι σε κύστεις που αποβάλλονται στο περιβάλλον με τα κόπρανα και είναι άμεσα μολυσματικές. Παρόλο που οι τρόποι μετάδοσής της στον άνθρωπο είναι παρόμοιοι με εκείνους του Cryptosporidium, η G. lamblia είναι πιο διαδεδομένη στο περιβάλλον (επιφανειακά νερά, έδαφος). Οι κύστεις γιάρδιας μπορούν να επιβιώσουν στο νερό για περισσότερο από 2 μήνες (<8ºC), καταστρέφονται όμως με βρασμό, ξήρανση, κύκλους ψύξης/απόψυξης και με θέρμανση. Εικόνα 36: Ο κύκλος ζωής της γιάρδιας ( Στην Ευρώπη, η μεγαλύτερη επιδημία Γιαρδίασης καταγράφηκε το 2004 στη Νορβηγία. Η μόλυνση προκλήθηκε από την κατανάλωση μολυσμένου με G. duodenalis πόσιμου νερού, με αποτέλεσμα να νοσήσουν περίπου 1500 άτομα. Η μη ή η ελλιπής επεξεργασία του πόσιμου νερού είναι οι πιο συχνές αιτίες της εμφάνισης κρουσμάτων Γιαρδίασης. Οι διεργασίες διήθησης έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικές στην απομάκρυνση των κύστεων γιάρδιας. 38

42 Τα είδη του γένους Cryptosporidium αποτελούν μια ομάδα παρασιτικών πρωτόζωων που χαρακτηρίζονται ως παθογόνα για τον άνθρωπο και τα ζώα. Περισσότερα από 40 είδη θηλαστικών, μεταξύ των οποίων και ο άνθρωπος, φιλοξενούν αυτά τα παθογόνα. Οι πιο πρόσφατες μελέτες με μοριακές εργαστηριακές μεθόδους έχουν δείξει ότι τα είδη που προσβάλλουν περισσότερο τον άνθρωπο είναι το C. hominis (προσφάτως γνωστό και ως C. parvum genotype I) και το C. parvum (γνωστό και ως C. parvum genotype IΙ). Το κρυπτοσπορίδιο βρίσκεται παντού στο περιβάλλον με τη μορφή των ανθεκτικών του ωοκύστεων, ενώ Κρυπτοσποριδίωση είναι η διαρροϊκή ασθένεια που προκαλείται στον άνθρωπο από την τυχαία κατάποσή τους. Αρχικά, τη θεωρούσαν ως μια νόσο των ζώων και μόλις το 1976 διαγνώσθηκε για πρώτη φορά ως ανθρώπινη ασθένεια που μπορεί να μεταδοθεί στον άνθρωπο μέσω πολλαπλών οδών. Παρόλο που θεωρείται πιθανή και η αερογενής μετάδοση των ωοκύστεων Cryptosporidium, μέσω της εισπνοής, ο πιο συνηθισμένος τρόπος μετάδοσης είναι η κατάποση. Αυτός περιλαμβάνει τη μετάδοση από άτομο σε άτομο και την κατάποση μολυσμένου πόσιμου νερού ή νερού αναψυχής (κολύμβηση) ή μολυσμένης τροφής. Οι ωοκύστεις (oocysts) του κρυπτοσποριδίου έχουν μέγεθος 4-6 μm (εικόνα 37) και μετά την κατάποσή τους αποικίζουν το λεπτό έντερο του ανθρώπου. Εκεί απελευθερώνουν τα σποροζωίδια (sporozoites) που αποτελούν τις λοιμογόνες μορφές του πρωτόζωου (εικόνα 38). Τα σποροζωίδια εισέρχονται κινούμενα στα επιθηλιακά κύτταρα του λεπτού εντέρου (το προτιμώμενο σημείο της λοίμωξης είναι ο ειλεός του λεπτού εντέρου), τα οποία και καταστρέφουν, ενώ μετατρέπονται στα επίσης κινούμενα μεροζωίδια (merozoites) που με τη σειρά τους εισέρχονται σε άλλα κύτταρα του εντέρου. Εικόνα 37: Ωοκύστεις κρυπτοσποριδίου ( cryptosporidium.html) Εικόνα 38: Σποροζωίδια κρυπτοσποριδίου ( minants/) Στη συνέχεια, μέσα στα εντερικά κύτταρα, τα κινούμενα μεροζωίδια εξελίσσονται σε θηλυκούς και αρσενικούς μικρογαμέτες που ενώνονται και σχηματίζονται εκ νέου οι ωοκύστεις. Οι τελευταίες εξέρχονται με τα κόπρανα στο περιβάλλον, ωριμάζουν και ο ως άνω περιγραφόμενος κύκλος ζωής του κρυπτοσποριδίου επαναλαμβάνεται, μετά την κατάποσή τους από κάποιον νέο ξενιστή (εικόνα 39). 39

43 Εικόνα 39: Ο κύκλος ζωής του κρυπτοσποριδίου στον ανθρώπινο οργανισμό ( Η μολυσματική δόση για να νοσήσει ο άνθρωπος είναι μικρή. Κάποιες μελέτες κάνουν λόγο για 10 ωοκύστεις Cryptosporidium και κάποιες άλλες αναφέρουν ότι αρκούν ωοκύστεις για να νοσήσει ένα υγιές άτομο. Ο χρόνος επώασης, δηλ. το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί από την κατάποσή τους μέχρι την εκδήλωση των συμπτωμάτων της νόσου, είναι 2-10 ημέρες. Τα συμπτώματα που εμφανίζονται αρχικά είναι απώλεια της όρεξης, ναυτία και κοιλιακό άλγος. Η Κρυπτοσποριδίωση είναι μια λοίμωξη που διαρκεί περίπου δύο (2) εβδομάδες σε άτομα με υγιές ανοσοποιητικό σύστημα. Εντούτοις, μπορεί να απειλήσει τη ζωή των ανοσοκατεσταλμένων ατόμων (μικρά παιδιά, ηλικιωμένοι, καρκινοπαθείς, ασθενείς με AIDS, ασθενείς με μόσχευμα), δεδομένου ότι δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία. Τα άτομα που έχουν προσβληθεί από Cryptosporidium συνεχίζουν να αποβάλλουν ωοκύστεις μέσω των κοπράνων μέχρι και 50 ημέρες αφού σταματήσει η διάρροια, ενώ με μια μόνο σύσπαση του εντέρου μπορούν να αποβληθούν ωοκύστεις που είναι άμεσα μολυσματικές. Οι ωοκύστεις του κρυπτοσποριδίου στα επιφανειακά νερά προέρχονται κυρίως από τα κόπρανα θερμόαιμων ζώων και ανθρώπων, ενώ μπορούν να επιβιώσουν σε αυτά για μεγάλες χρονικές περιόδους. Μάλιστα, έχει βρεθεί ότι μπορούν να επιβιώσουν σε τεχνητό θαλασσινό νερό για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο του ενός έτους σε θερμοκρασία 4 ºC. Είναι ιδιαίτερα ανθεκτικές στις συνήθεις δόσεις χλωρίου που χρησιμοποιούνται για την απολύμανση του πόσιμου νερού και των νερών αναψυχής (κολυμβητικές πισίνες). Εξαιτίας αυτών των χαρακτηριστικών, η υδατογενής μετάδοση του κρυπτοσποριδίου (ιδιαίτερα του C. parvum) αποτελεί ένα από τα πιο ανησυχητικά ζητήματα της δημόσιας υγείας σε παγκόσμιο επίπεδο. 40

44 5. Ιοί Οι ιοί έχουν μέγεθος μm, δεν έχουν κυτταρική οργάνωση και αποτελούνται βασικά από νουκλεϊκά οξέα και πρωτεΐνες. Το νουκλεϊκό οξύ είναι DΝΑ ή RΝΑ, το οποίο εγκλείεται σε ένα πρωτεϊνικό περίβλημα (καψίδιο, protein coat, capsid). Το πρωτεϊνικό κάλυμμα αποτελείται από δομκές υπομονάδες, έναν ικανό αριθμό πρωτεϊνικών μορίων που διατάσσονται γύρω από το νουκλεϊκό οξύ με μεγάλη ακρίβεια και σε αυστηρά επαναλαμβανόμενα πρότυπα. Εικόνα 40: Δομή των ιών κι σχετικά μεγέθη ιών και κυττάρων. (α) Σωματίδια ραβδοϊού (ιού ευκαρυωτικών κυττάρων). Ένα μεμονωμένο ιόσωμα έχει διάμετρο περίπου 65 nm. (β) Ο ιός λάμδα των βακτηρίων (βακτηριοφάγος). Η κεφαλή του ιοσώματος έχει διάμετρο περίπου 65 nm. (γ) Το μέγεθος των ιών στα (α) και (β) σε σχέση με ένα βακτηριακό κι ένα ευκαρυωτικό κύτταρο. Μερικές φορές το καψίδιο περιβάλλεται από ένα περίβλημα με πρωτεΐνες, λιποειδή και σάκχαρα. Η μολυσματική δόση των ιών καλείται ιόσωμα (virion). Τα ιοειδή είναι μικρά μονόκλωνα κυκλικά μόρια RNA και στερούνται καψιδίου. Το βασικό τους χαρακτηριστικό είναι ότι είναι υποχρεωτικά παρασιτικοί οργανισμοί, δηλαδή ακόμα και αν καταφέρνουν να επιβιώνουν για κάποιο χρόνο στο περιβάλλον, δεν πολλαπλασιάζονται παρά μόνο μέσα σε κάποιον άλλο ζωντανό οργανισμό. Παρουσιάζουν εξειδίκευση ως προς τους οργανισμούς και τα κύτταρα που προσβάλλουν. Ο πολλαπλασιασμός των ιών πραγματοποιείται με προσρόφησή τους στην κυτταρική μεμβράνη και τελειώνει με απελευθέρωση νέων ιών και την καταστροφή ή όχι του ξενιστή. Υπάρχουν ιοί του ανθρώπου, των ζωών, των φυτών αλλά και των βακτηρίων. Οι ιοί που ζουν μέσα σε βακτήρια λέγονται βακτηριοφάγοι και παίζουν σημαντικό ρόλο στη συστηματική κατάταξη και την μελέτη των βακτηρίων. Οι ιοί μπορεί να είναι συμβιωτικοί με τον φορέα τους αλλά μπορεί να είναι και παθογόνοι. Παθογόνοι ιοί του ανθρώπου είναι πάρα πολλοί, π.χ. ο ιός της ηπατίτιδας, του κίτρινου πυρετού, της πολιομυελίτιδας και του AIDS. 41

45 Εικόνα 41: Διάφοροι σχηματισμοί ιών. Α. DNA ιός, Β. Βακτηριοφάγος, Γ. RNA ιός με ελικοειδές νουκλεοκαψίδιο, Δ. DNA ιός με εικοσαεδρικό νουκλεοκαψίδιο, Ε. Ραβδοειδής RNA ιός, Ζ. RNA ρετροϊός με εικοσαεδρικό καψίδιο, Η. DNA ιός με ινίδια στο καψίδιο, Θ. DNA ιός Από τους ιούς που προσβάλλουν ζωικά κύτταρα (άνθρωπο) σημαντικότεροι είναι οι ιοί εντερικής προέλευσης, οι οποίοι εισέρχονται στον οργανισμό μέσω της στοματικής οδού, πολλαπλασιάζονται και τελικά αποβάλλονται στα ούρα και τα κόπρανα σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Πολλοί από τους ιούς μπορούν να επιβιώσουν στο νερό ή τα λύματα και μάλιστα, μετά την επεξεργασία των λυμάτων. Η πιο μελετημένη ομάδα ιών εντερικής προέλευσης είναι οι Εντεροϊοί (που περιλαμβάνουν τους Polio-ιούς 1-2-3, τους Coxsackie-ιούς Α-Β, τους Echo-ιούς Α-Β και τους εντεροϊούς 68-71). Άλλοι ιοί εντερικής προέλευσης είναι ο ιός της ηπατίτιδας Α, οι Ρεο-ιοί, οι Αδενοϊοί, οι Ρότα-ιοί, οι Άστρο-ιοί και οι Nορο-ιοί οι οποίοι όπως και οι εντεροϊοί υπάρχουν στα κόπρανα, έχουν ανιχνευθεί στα λύματα και ευθύνονται για πληθώρα ασθενειών στον άνθρωπο. Εικόνα 42: Στάδια πολλαπλασιασμού του RNA ιού της πολιομυελίτιδας 42

46 Εικόνα 43: Στάδια πολλαπλασιασμού DNA ιού (αδενοϊός). Εικόνα 44: Ο βιολογικός κύκλος ενός βακτηριακού ιού. Επισημαίνονται τα βασικά στάδια του ιικού πολλαπλασιασμού Οι βακτηριοφάγοι (ιοί των βακτηρίων) αποτελούνται συνήθως από μία πολυεδρική πρωτεϊνική κεφαλή που περιέχει το νουκλεϊκό οξύ του βακτηριοφάγου και μία πρωτεϊνική ουρά που καταλήγει σε νημάτια. Ο βακτηριοφάγος προσκολλάται με τα νήματα της ουράς στο βακτηριακό κύτταρο, τρυπάει το κυτταρικό τοίχωμα και προωθεί το νουκλεϊκό του οξύ στο κυτταρόπλασμα, όπου και αρχίζει η παραγωγή του γενετικού του υλικού και των πρωτεϊνών του. 43

47 Εικόνα45 Διάγραμμα βακτηριοφάγου και φωτογραφία στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο δεκάδων βακτηριοφάγων Τ4 που έχουν προσβάλει ένα βακτηριακό κύτταρο της E. coli. α) β) γ) Εικόνα 46: α) Σωματίδια Polio-ιού, β)αδενοϊός ανθρώπινης προέλευσης, γ)σωματίδια Ρότα ιών 44

48 6. Εξελικτική πορεία μικροοργανισμών Βιολογική εξέλιξη & δημιουργία της ζωής Η αρχέγονη γη παρείχε τις συνθήκες για χημική εξέλιξη Πριν από 10-20X10 9 χρόνια το σύμπαν ήταν μια συμπυκνωμένη μάζα. Με τη μεγάλη έκρηξη (Βig Bang) άρχισε η ύλη να διασκορπίζεται στο διάστημα. Από τότε και μέχρι σήμερα το σύμπαν εκτείνεται. Με το χρόνο όμως, η ύλη άρχισε να ψύχεται, οπότε άρχισαν να σχηματίζονται άτομα διαφορετικών στοιχείων και κυρίως υδρογόνου και ηλίου. Περίπου πριν από 4,6ΧΙ0 9 χρόνια δημιουργήθηκε η γη. Η πρώτη ατμόσφαιρα δημιουργήθηκε μόλις άρχισε να ψύχεται η γη καθώς και με τη δραστηριότητα των ηφαιστείων. Η πρώτη ατμόσφαιρα δεν περιείχε καθόλου ή περιείχε πολύ λίγο οξυγόνο. Μια συνθήκη κατάλληλη για τη δημιουργία της ζωής, μια και το οξυγόνο εμποδίζει τη δημιουργία βιομορίων (αμινοξέα, νουκλεοτίδια κλπ.). Τα αέρια που περιείχε η ατμόσφαιρα εκείνον τον καιρό ήταν CO 2, υδρατμοί (H 2 Ο), CΟ, Η 2 και Ν 2. Ίσως να μην υπήρχαν ΝΗ 3, H 2 S και CH 4, γιατί τα ανηγμένα αυτά μόρια διασπώνται γρήγορα από την υπεριώδη ακτινοβολία του ήλιου. Καθώς όμως συνεχιζόταν η ψύξη της γης, το νερό που προερχόταν από την εξάτμιση άρχισε να πέφτει ως βροχή δημιουργώντας τους ωκεανούς. Η ενέργεια είναι μια άλλη προϋπόθεση για τη χημική εξέλιξη. Την εποχή εκείνη της δημιουργίας του ηλιακού μας συστήματος, η ενέργεια ήταν άφθονη (έντονη ακτινοβολία, ηλεκτρικές εκκενώσεις, μετεωρίτες κλπ.). Τέλος, μια άλλη παράμετρος είναι ο χρόνος. Πράγματι ο χρόνος από τη δημιουργία της γης μέχρι την εμφάνιση των πρώτων κυττάρων κρίνεται επαρκής. Στην αρχέγονη γη πρώτα σχηματίστηκαν τα βιομόρια και μετά δημιουργήθηκαν τα κύτταρα Αρκετά από τα βιομόρια πρέπει να υπήρχαν και στην αρχέγονη γη. Το πείραμα του Μiller (1953) συνηγορεί σ' αυτό. Ο Μiller σε κατάλληλη συσκευή (Εικόνα38) έβαλε Η 2, CΗ 4, Η 2 Ο και ΝΗ 3 και βομβάρδισε το μίγμα των ουσιών με ηλεκτρικές εκκενώσεις για χρονικό διάστημα μιας εβδομάδας. Η ανάλυση του μίγματος έδειξε το σχηματισμό βιομορίων όπως αμινοξέα κλπ. Σήμερα βέβαια γνωρίζουμε ότι ΝΗ 3 και CH 4 που χρησιμοποίησε ο Μiller στα πειράματα του, δεν υπήρχαν στην αρχέγονη γη. Όμως, τα ίδια πειράματα με διαφορετικούς συνδυασμούς αερίων, δίνουν το ίδιο αποτέλεσμα. Σχηματίζεται μια μεγάλη ποικιλία βιομορίων, συμπεριλαμβανομένων του DNA και RΝΑ. Το μεγάλο ερώτημα είναι, πώς τα βιομόρια αυτά συγκεντρώθηκαν και οργανώθηκαν κατάλληλα ώστε να έχουν τις ιδιότητες της ζωντανής ύλης. Αρχικά ο Οparin πρότεινε ότι η συγκέντρωση των βιομορίων έγινε στην αρχέγονη θάλασσα, όπου τα βιομόρια αντέδρασαν και σχημάτισαν πολυμερή. Η υπόθεση αυτή δεν πρέπει να είναι αληθής, γιατί οι πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα για παράδειγμα, πολυμερίζονται με αφαίρεση νερού. Αυτή η αντίδραση φαίνεται απίθανο να γίνεται σε υδατικό περιβάλλον χωρίς ένζυμα. Ακόμη 45

49 αμφισβητείται αν η συγκέντρωση των μονομερών στην αρχέγονη θάλασσα ήταν επαρκής για τέτοιες αντιδράσεις. Εικόνα 47: Συσκευή Μiller Η επικρατούσα άποψη είναι, ότι η πρώτη συγκέντρωση βιομορίων έγινε σε αργιλικές επιφάνειες. Η άργιλος εκτός από την ικανότητα δέσμευσης των μορίων, ευνοεί τον πολυμερισμό γιατί περιέχει ιόντα σιδήρου και ψευδαργύρου, που θα μπορούσαν να δράσουν ως καταλύτες. Ακόμη η άργιλος δεσμεύει μόνο τις δομές εκείνες των βιομορίων, που υπάρχουν στο κύτταρο. Με άλλα λόγια το φαινόμενο δεν είναι πλήρως τυχαίο, αλλά γίνεται μια επιλογή. Πειραματική απόδειξη στην υπόθεση αυτή έδωσε ο Fοx, ο οποίος θερμαίνοντας μίγμα αμινοξέων δεσμευμένων σε άργιλο, κατάφερε ν' ανιχνεύσει πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Ο Fox τα προϊόντα του αυθόρμητου πολυμερισμού, τα ονόμασε πρωτεϊνοειδή. Αν στα πρωτεϊνοειδή προστεθεί νερό, τότε σχηματίζονται οι μικροσφαίρες. Οι μικροσφαίρες εμφανίζουν ορισμένα χαρακτηριστικά των κυττάρων όπως α) το φαινόμενο της ώσμωσης, β) το φαινόμενο του δυναμικού των μεμβρανών εμφανίζεται σε μερικές περιπτώσεις και γ) η πρόσληψη ουσιών από το περιβάλλον. Ένας δεύτερος αρχέγονος σχηματισμός μπορεί να θεωρηθούν τα λιποσώματα. Τέλος ένας τρίτος σχηματισμός μπορεί να είναι κυστίδια αποτελούμενα από δύο ή περισσότερα οργανικά μόρια. Οι σχηματισμοί αυτοί συνιστούν τα "πρωτοκύτταρα". Τα πρώτα κύτταρα πολύ πιθανόν να αυτοσυγκροτήθηκαν από βιομόρια Τα "πρωτοκύτταρα", μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλεία για τη μελέτη της προέλευσης των κυττάρων. Όμως, είναι τεράστια η διαφορά μεταξύ των "πρωτοκυττάρων" και των κυττάρων όπως τα γνωρίζουμε σήμερα. Χωρίς αμφιβολία, τα πρώτα κύτταρα που δημιουργήθηκαν ήταν τα προκαρυωτικά. Παρότι είναι άγνωστη η μετάπτωση από τα "πρωτοκύτταρα" στα σημερινά κύτταρα, εντούτοις είναι μάλλον βέβαιο ότι η εξέλιξη των κυττάρων έγινε με διαδοχικά μικρά βήματα. Δύο από τα κυριότερα βήματα της όλης διαδικασίας είναι αναπαραγωγή των βιομορίων και ή ανάπτυξη του μεταβολισμού. 46

50 Η αναπαραγωγή των βιομορίων είναι προαπαίτηση της κυτταρικής εξέλιξης Σε αργιλική επιφάνεια είναι δυνατόν να σχηματισθεί RΝΑ όπως και πρωτεΐνες. Μάλιστα, το RΝΑ αυτό μπορεί να πολυμερίζει νέα μόρια RΝΑ, ιδίως παρουσία ψευδαργύρου. Σε ορισμένες μάλιστα περιπτώσεις τα μόρια του RΝΑ έχουν τέτοια διαμόρφωση στο χώρο, ώστε μπορούν να δεσμεύουν έστω και ασθενώς, ένα αμινοξύ (έναρξη σύνθεσης πρωτεϊνών). Ακόμη, το RΝΑ μπορεί να χρησιμοποιηθεί και, ως γενετικό υλικό (π.χ. RΝΑ - ιοί) και ως μήνυμα RΝΑ (mrνα). Αλλά και η αντιγραφή του RΝΑ είναι ευκολότερη από αυτήν του DΝΑ και μάλιστα δεν απαιτούνται και πρωτεΐνες (ένζυμα), μια και προσφάτως διαπιστώθηκε ότι υπάρχει RΝΑ με καταλυτικές ιδιότητες. Με τη λογική αυτή, το RΝΑ θεωρείται ότι είναι το πρώτο πληροφοριακό βιομόριο που σχηματίστηκε στην αρχέγονη γη και μετά σχηματίσθηκαν οι πρωτεΐνες και το DΝΑ. Βεβαίως το μεγάλο ερώτημα είναι ακόμη, πώς ενσωματώθηκε το DΝΑ στη μεταβίβαση της πληροφορίας. Το ευκαρυωτικό κύτταρο προήλθε από το προκαρυωτικό κύτταρο Σήμερα δεν υπάρχει αμφιβολία ότι στη γη πρωτοεμφανίστηκε το προκαρυωτικό κύτταρο. Τα απολιθώματα που έχουν βρεθεί μέχρι σήμερα δείχνουν ότι το προκαρυωτικό κύτταρο εμφανίστηκε τουλάχιστον πριν από 3,5-3X10 9 χρόνια. Δηλαδή περίπου 10 9 χρόνια μετά από τη δημιουργία της γης. Με άλλα λόγια, η χημική εξέλιξη για το σχηματισμό των βιομορίων και τη συνάθροιση τους σ ένα ενιαίο σύνολο, διήρκεσε περίπου ΙΟ 9 χρόνια. Σύμφωνα με τα υπάρχοντα απολιθώματα, το ευκαρυωτικό κύτταρο θα πρέπει να δημιουργήθηκε τουλάχιστον πριν από 1,5-1,7Χ10 9 χρόνια. Δηλαδή, 10 9 χρόνια μετά την εμφάνιση του προκαρυωτικού κυττάρου. Η συμβιωτική θεωρία είναι η πιο επιτυχής προς το παρόν, για την προέλευση του ευκαρυωτικού κυττάρου. Σύμφωνα με αυτήν τη θεωρία, τα μιτοχόνδρια, οι χλωροπλάστες και ίσως τα κεντροσωμάτια και τα μαστίγια να έχουν προέλθει από συμβίωση με διαφόρους τύπους προκαρυωτικών κυττάρων. Δηλαδή, αρχέγονα βακτήρια, εισήλθαν σε αρχέγονα ευκαρυωτικά κύτταρα και όχι μόνον επιβίωσαν, αλλά και αναπαράγονταν κανονικά όπως και το κύτταρο που τα φιλοξενούσε. Έτσι με τον καιρό, η συμβίωση έγινε μόνιμη και εξαρτημένη κατάσταση. Η θεωρία αυτή στηρίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες που έχουν κάποια αυτοδυναμία. Έχουν δική τους πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή, δικό τους DΝΑ που κωδικοποιεί ορισμένες πρωτεΐνες, μ' ένα κώδικα που ελάχιστα διαφέρει από αυτόν του ευκαρυωτικού κυττάρου. Όμως, δεν ερμηνεύει τη δημιουργία του πυρήνα, ούτε τις δομές των βλεφαρίδων και των μαστιγίων. Αναφορικά με τη διαδοχή των τύπων των κυττάρων που δημιουργήθηκαν, η πιο πιθανή σειρά είναι η ακόλουθη. Το πρώτο κύτταρο θα πρέπει να ήταν ετερότροφο και αναερόβιο προκαρυωτικό, μια και δεν υπήρχε οξυγόνο την εποχή εκείνη. Κατόπιν εμφανίστηκαν τα αυτότροφα προκαρυωτικά κύτταρα (κυανοφύκη) που είχαν φωτοσυνθετικές ικανότητες. Επειδή κατά τη φωτοσύνθεση παράγεται οξυγόνο που συσσωρεύτηκε με τον καιρό στην ατμόσφαιρα, δόθηκε η ευκαιρία της δημιουργίας αερόβιων προκαρυωτικών κυττάρων και ακολούθως του ευκαρυωτικού κυττάρου. 47

51 7. Συστηματική κατάταξη των μικροοργανισμών - Ονοματολογία Όλες οι κατηγορίες των μικροοργανισμών (βακτήρια, μύκητες κ.λπ.) κατατάσσονται σύμφωνα με το σύστημα του Λινναίου. Σύμφωνα με την συστηματική κατάταξη του Λινναίου κάθε οργανισμός ονομάζεται με δύο λατινικά ονόματα. Το πρώτο είναι το όνομα του γένους στο οποίο ανήκει και γράφεται με κεφαλαίο αρχικό γράμμα (π.χ.salmonella) και το δεύτερο είναι το όνομα του είδους και γράφεται με μικρό αρχικό γράμμα (π.χ. Salmonella typhi). Τα ονόματα των γενών και των ειδών πάντα υπογραμμίζονται η τυπώνονται με πλάγια γράμματα. Όταν γράφουμε το όνομα ενός είδους μπορούμε να χρησιμοποιούμε μόνο το πρώτο γράμμα του γένους και ολόκληρο το όνομα του είδους (π.χ. Escherichia coli E. coli, Saccharomyces cerevisiae S. cerevisiae). Ταξινόμηση = Η κατάταξη των ζώντων οργανισμών. Στόχος είναι η εύρεση σχέσεων μεταξύ ομάδων οργανισμών και η διαφοροποίηση τους από άλλους. Επίσης βοηθά στην ταυτοποίηση των μικροοργανισμών (σύγκριση χαρακτηριστικών με καταλόγους από ταξινομημένους μικροοργανισμούς). Η ταξινόμηση αρχικά βασίστηκε στην φαινοτυπική ανάλυση, που βασίζεται στη μελέτη φαινοτυπικών χαρακτηριστικών οργανισμών (μορφολογία, σχήμα, μέγεθος βιότυπος, ανάλυση πρωτεϊνών, ανάλυση λιπαρών οξέων κ.α.). Με την εξέλιξη της Μοριακής Βιολογίας έγινε απαραίτητη η γονοτυπική ανάλυση για αποφυγή λαθών και μεγαλύτερη ακρίβεια. Οι μέθοδοι μοριακής ταυτοποίησης που βασίζονται στη γενετική δομή μικροοργανισμών εφαρμόζονται για τη μελέτη της γενετικής δομής και εξέλιξης των οργανισμών. Είδος = ομάδα στελεχών βακτηρίων που έχουν ομοιότητα φαινοτύπων σε μεγάλο βαθμό, ενώ συγχρόνως διαφέρουν αρκετά από συγγενείς ομάδες ώστε να είναι δυνατή η αναγνώριση τους σαν βασική ταξινομική ομάδα. Στέλεχος = Απομονωμένος μικροοργανισμός, ο οποίος διακρίνεται από άλλα στελέχη του ίδιου γένους και είδους βάσει φαινοτυπικών και γονοτυπικών χαρακτηριστικών. Ουσιαστικά πρόκειται για περιγραφική υπομονάδα του είδους. 48

52 Το όνομα κάθε μικροοργανισμού περιγράφει κάποια χαρακτηριστικά του. Έτσι, για παράδειγμα όταν αναφερόμαστε στο Staphylococcus aureus, παίρνουμε τις εξής πληροφορίες: Staphylo coccus aureus διάταξη κυττάρων σχήμα κυττάρων = λατινικά χρυσός, χρώμα αποικιών Πολλά είδη αποτελούν ένα γένος, πολλά γένη μια οικογένεια και κατόπιν άλλων υποδιαιρέσεων καταλήγουμε στην ευρύτερη ομάδα του «Βασιλείου»: Στέλεχος Είδος Γένος Οικογένεια Τάξη Κλάση Διαίρεση Βασίλειο. Παράδειγμα ταξινόμησης για το μικροοργανισμό Chromatium warmingii: Βασίλειο: Βακτήρια Προκαρυωτικά κύτταρα Διαίρεση: Gracilicutes Gram (-) Τάξη: Rhodospirillales Φωτότροφα ιώδη βακτήρια Οικογένεια: Chromatiaceae Ιώδη βακτήρια θείου Γένος: Chromatium Ραβδοειδή βακτήρια θείου Είδος: warmingii Κύτταρα μm που αποθηκεύουν θείο στους πόλους του κυττάρου. Κάθε νέος μικροοργανισμός που απομονώνεται κατατίθεται σε μια αναγνωρισμένη συλλογή καλλιεργειών (ATCC - American type culture collection, DSMZ - German Collection for Microorganisms and Cell Cultures), ενώ παράλληλα δημοσιεύεται στο International Journal of Systematic Bacteriology Ταξινόμηση των μικροοργανισμών Τα στελέχη ενός είδους μικροοργανισμού που προέρχονται από την ίδια πηγή ή από τον ίδιο ξενιστή ενδεχομένως να συνδέονται κλωνικά έχοντας σημαντικές ομοιότητες στο γενετικό τους υλικό. Αυτό αποτελεί και την αρχή στην οποία βασίζεται η τυποποίηση βακτηριακών στελεχών. Γενικά, πληθυσμοί βακτηρίων που αναπτύσσονται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες εμφανίζουν φαινοτυπικές και γονοτυπικές διαφορές εξαιτίας της ροής γονιδίων, των διαφορετικών μεταλλάξεων στις οποίες υπόκεινται και της πίεσης της φυσικής επιλογής. Οι μέθοδοι τυποποίησης εστιάζουν στις διαφορές αυτές και τα διακριτά χαρακτηριστικά των οργανισμών με απώτερο σκοπό τη διάκρισή τους σε ομάδες. Οι παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη για την τυποποίηση μικροοργανισμών είναι το είδος που πρόκειται να μελετηθεί 49

53 και οι ιδιαιτερότητές του, οι δυνατότητες και περιορισμοί της εκάστοτε μεθόδου τυποποίησης καθώς και το περιβάλλον ανάπτυξης του οργανισμού δεδομένης της φυσικής επιλογής, των μεταλλάξεων και της ροής γονιδίων που λαμβάνουν χώρα στον πληθυσμό. Τα τελευταία χρόνια οι μέθοδοι μοριακής τυποποίησης έχουν αναπτυχθεί και βελτιωθεί σημαντικά καθώς εφαρμόζονται εκτεταμένα για την ανάλυση πολυμορφισμών στο γενετικό υλικό. Παρ όλα αυτά, η ταχεία διαφοροποίησή τους και η ελλιπής σύγκριση αποτελεσματικότητας μεταξύ τους προκαλούν σύγχυση όσον αφορά στην επιλογή της ενδεδειγμένης μεθόδου για την επίλυση του εκάστοτε προβλήματος, είτε αυτό περιλαμβάνει διερεύνηση προέλευσης του μικροοργανισμού είτε κάποια επιδημιολογική μελέτη. Για την επιλογή της βέλτιστης τεχνικής έχουν προταθεί ορισμένα κριτήρια, τα οποία πρέπει να ικανοποιούνται. Τα κριτήρια αυτά περιλαμβάνουν τα εξής: Ικανότητα τυποποίησης: Αναφέρεται στο ποσοστό των υπό εξέταση στελεχών τα οποία δύνανται να ομαδοποιηθούν βάσει των ομοιοτήτων τους σε ομάδες αποτελώντας ένα συγκεκριμένο «τύπο». Επαναληψιμότητα της μεθόδου: Ικανότητα της μεθόδου τυποποίησης να κατατάσσει ένα στέλεχος στην ίδια ομάδα, κατόπιν επαναλήψεων της εφαρμογής της. Σταθερότητα: Πρόκειται για τη δυνατότητα της μεθόδου να ταξινομεί μαζί στελέχη μικροοργανισμών όμοιας γενετικής δομής ανεξάρτητα από το χρόνο και τις γενιές που έχουν παρέλθει. Διακριτική ικανότητα: Είναι το κύριο χαρακτηριστικό της μεθόδου αφού υποδεικνύει την πιθανότητα στελέχη που έχουν κοινές αλληλουχίες στο γενετικό υλικό να αποτελούν μέρος της ίδιας ομάδας. Ακόμη όμως κι αν μια μέθοδος ικανοποιεί όλα τα παραπάνω κριτήρια είναι κοινώς αποδεκτή η αναγκαιότητα σύγκρισης των αποτελεσμάτων της με μία ή περισσότερες τεχνικές. Επιπλέον, λαμβάνονται υπόψη και κάποια πρακτικά χαρακτηριστικά όπως η δυσκολία εφαρμογής και επεξεργασίας αποτελεσμάτων, το κόστος και η διαθεσιμότητα αντιδραστηρίων, καθώς και η ταχύτητα εξαγωγής αποτελεσμάτων, κυρίως όταν πρόκειται για θέματα διασφάλισης της δημόσιας υγείας και αντιμετώπισης περιπτώσεων μολύνσεων. Οι συνολικές εκτιμήσεις δεν καθορίζουν την ιδανική μέθοδο μοριακής τυποποίησης. Αντιθέτως, κάθε φορά εξετάζονται οι περιοριστικοί παράγοντες, τα γενικά χαρακτηριστικά του υπό ανάλυση οργανισμού και οι απαιτήσεις της εκάστοτε τυποποίησης. Γενικά, οι μέθοδοι που ανιχνεύουν πολυμορφισμούς στο γενετικό υλικό θεωρούνται ενδεδειγμένες για την τυποποίηση και ομαδοποίηση κυρίως βακτηριακών στελεχών και ανώτερες από τις μεθόδους που ανιχνεύουν και αναλύουν φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των οργανισμών. 50

54 ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ Μελέτη ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά Ανάλυση βιοτύπου - Φαινοτυπική ανάλυση και προσδιορισμός μεταβολικών ιδιοτήτων Ανάλυση λιπαρών οξέων (FAME) Ανάλυση πρωτεϊνών ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ DNA sequencing analysis Ανάλυση ριβοτύπου Περιεκτικότητα του DNA σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης Υβριδισμός DNA:DNA Μέθοδοι που βασίζονται στην ανάλυση πολυμορφισμών γενετικού υλικού: RFLP, AFLP, αποτύπωμα επαναλαμβανόμενου εξωγονιδιακού παλινδρομικού DNA (Rep-PCR fingerprinting) Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο ολικού χρωμοσωμικού DNA(PFGE) ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 7.2. Φαινοτυπικές μέθοδοι ταξινόμησης μικροοργανισμών Οι παραδοσιακές μέθοδοι μικροβιακής τυποποίησης βασίζονται εξ ολοκλήρου σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του οργανισμού. Κάποια από αυτά θεωρούνται αρκετά αξιόπιστα και ευαίσθητα όπως ο φαινότυπος ανθεκτικότητας σε ποικιλία αντιβιοτικών, η ανάλυση ισοενζύμων και η χρωματογραφική ανάλυση λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης. Οι μέθοδοι αυτές παρουσιάζουν μια πρώτη εικόνα ταξινόμησης στελεχών ανάλογα με την προέλευση και το περιβάλλον ανάπτυξής τους. Μελέτη ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά Το αντιβιόγραμμα είναι από τις πιο συνηθισμένες μεθόδους τυποποίησης και αφορά στον έλεγχο αντοχής βακτηριακών στελεχών σε ποικιλία αντιβιοτικών. Ως μέθοδος χαρακτηρίζεται εύκολη και γρήγορη με δυνατότητα εφαρμογής σε διαδικασία ρουτίνας στο εργαστήριο. Παρόλο που τα αντιβιογράμματα έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για να παρουσιάσουν συσχέτιση βακτηριακών στελεχών, συχνά κρίνονται ως τεχνικές περιορισμένης εμβέλειας, καθώς όμοιοι οργανισμοί ενδεχομένως να παρουσιάσουν διαφορετική συμπεριφορά σε αντιμικροβιακούς παράγοντες. Εντούτοις, τα τελευταία χρόνια η δοκιμή πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά έχει εφαρμοστεί για τον έλεγχο προέλευσης βακτηριακών στελεχών και συγκεκριμένα για το αν προέρχονται από ανθρώπινη πηγή ή όχι. Η προσέγγιση αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι στο περιβάλλον όπου αναπτύσσονται μικροοργανισμοί είτε ασκείται φυσική επιλογή και υποκινούνται μεταλλάξεις στο χρωμοσωμικό και πλασμιδιακό γενετικό υλικό, είτε πραγματοποιείται μεταφορά πλασμιδίων μεταξύ των βακτηρίων, γεγονότα που οδηγούν στη δημιουργία ευαίσθητων/ανθεκτικών στελεχών σε διάφορα αντιβιοτικά. Για την εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθόδου απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην επιλογή των αντιβιοτικών προκειμένου να μην εξαχθούν λανθασμένα συμπεράσματα τυποποίησης των 51

55 υπό εξέταση βακτηριακών στελεχών. Παράλληλα, επιβάλλεται η επανάληψη της τεχνικής και η δοκιμή ανθεκτικότητας των στελεχών από δύο έως τρεις φορές, ώστε να γίνει σωστή εκτίμηση των ζωνών αναστολής. Συνιστάται επίσης η εξέταση μεγάλου αριθμού μικροοργανισμών που έχουν απομονωθεί από όλη την έκταση της εκάστοτε γεωγραφικής περιοχής για να υπάρξει όσο το δυνατόν ολοκληρωμένη εικόνα των μοντέλων ανθεκτικότητας, δεδομένου ότι πρόκειται για φαινοτυπική μέθοδο τα αποτελέσματα της οποίας επηρεάζονται από την πίεση φυσικής επιλογής. Ανάλυση βιοτύπου Πρόκειται για τη μελέτη φαινοτυπικών χαρακτηριστικών μικροοργανισμών όπως μορφολογικά χαρακτηριστικά, παράμετροι ανάπτυξης και βιοχημική χρήση οργανικών υποστρωμάτων. Η ανάλυση βιοτύπου αφορά στη μελέτη όλων αυτών των χαρακτηριστικών, τα οποία όμως δεν είναι σταθερά εξαιτίας περιβαλλοντικών συνθηκών, γενετικών μεταλλάξεων και αλλαγών στο πλασμιδιακό γενετικό υλικό. Γενικά, ο βιότυπος υπόκειται στον υποκειμενικό παράγοντα, δεδομένου ότι ο ερευνητής επιλέγει κάθε φορά το συνδυασμό των χαρακτηριστικών ιδιοτήτων που θα τυποποιήσουν τους μικροοργανισμούς της μελέτης. Γι αυτόν το λόγο απαιτείται η ταυτόχρονη εφαρμογή και άλλων μεθόδων ταυτοποίησης Ανάλυση λιπαρών οξέων (Fatty Acid Analysis, FAME) Η χρωματογραφική ανάλυση και διάκριση των λιπαρών οξέων της κυτταρικής μεμβράνης, κυρίως των αναερόβιων βακτηρίων, αναδεικνύει σχέσεις των στελεχών μεταξύ τους. Η αέριος χρωματογραφία εφαρμόζεται για την τυποποίηση συγκεκριμένων βακτηρίων και κρίνεται αξιόπιστη μέθοδος όταν οι συνθήκες ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών είναι ταυτόσημες και οι τεχνικές εξαγωγής των λιπαρών οξέων από την κυτταρική μεμβράνη αυστηρά καθορισμένες. Οι παράγοντες αυτοί περιορίζουν την ακρίβεια και χρήση της χωρίς όμως να παραγνωρίζεται το γεγονός ότι τα αποτυπώματα των λιπαρών οξέων πολλών βακτηρίων οδηγούν σε συμπεράσματα για το βαθμό συγγένειάς τους και το περιβάλλον ανάπτυξης Ανάλυση πρωτεϊνών Η μελέτη αντιγονικών πρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης μικροοργανισμών καθώς και η χρωματογραφική ανάλυση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου επιτρέπουν τη σύγκριση στελεχών και την ταξινόμησή τους καθώς έτσι αντικατοπτρίζονται διαφορές στο γενετικό υλικό και στην ύπαρξη συγκεκριμένων γονιδίων. Παρ όλα αυτά η απουσία ορισμένων πρωτεϊνών δεν συνεπάγεται απαραίτητα την απουσία του αντίστοιχου γονιδίου, καθώς το ίδιο ενδεχομένως να μην εκφράζεται ενώ παράλληλα μεταλλάξεις στο DNA που δεν επηρεάζουν το πρωτεϊνικό αποτύπωμα δεν θα συμπεριληφθούν στην τυποποίηση των μικροβιακών στελεχών. Έτσι, υπάρχουν επιφυλάξεις ως προς την αξιοπιστία της μεθόδου και τη δυνατότητα που έχει να διαχωρίζει και να ταξινομεί μικροοργανισμούς. 52

56 7.3. Γονοτυπικές μέθοδοι ταξινόμησης μικροοργανισμών Οι μέθοδοι μοριακής τυποποίησης που βασίζονται στη γενετική δομή βακτηρίων εφαρμόζονται για τη μελέτη της γενετικής δομής και εξέλιξης των οργανισμών, για την ανεύρεση τρόπου μετάδοσής τους σε περιπτώσεις επιδημίας και για τον προσδιορισμό της πηγής προέλευσής τους. Η ανάδειξη πολυμορφισμών και τροποποιήσεων στο χρωμοσωμικό γενετικό υλικό των οργανισμών θεωρείται ο πλέον ενδεδειγμένος τρόπος τυποποίησης, κυρίως όταν πρόκειται να πραγματοποιηθούν συγκριτικές μελέτες με μεγάλο αριθμό στελεχών. Το βασικό πλεονέκτημα έναντι της μελέτης φαινοτυπικών χαρακτηριστικών έγκειται στο ότι εντοπίζονται αλλαγές και τροποποιήσεις στο DNA, οι οποίες είτε θα εκδηλωθούν πολύ αργότερα στο βακτηριακό πληθυσμό είτε δεν θα επηρεάσουν καθόλου το φαινότυπο. Παράλληλα, σε ορισμένες περιπτώσεις δεν πραγματοποιείται το στάδιο καλλιέργειας των στελεχών, το οποίο σε ορισμένες περιπτώσεις είναι δύσκολο και προκαλεί ποικίλα προβλήματα. Οι μοριακές αυτές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σήμερα βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό τμημάτων DNA των οργανισμών διαφορετικού μήκους και μοριακού βάρους, τα οποία έχουν προκύψει κατόπιν κατάλληλης επεξεργασίας. Η απεικόνιση των αποτελεσμάτων είναι υπό μορφή ζωνών DNA σε πήκτωμα αγαρόζης δημιουργώντας τα γενετικά αποτυπώματα των οργανισμών, τα οποία με τη σειρά τους συγκρίνονται μεταξύ τους ώστε να εντοπιστούν οι ομοιότητες και διαφορές. Η μοριακή τυποποίηση που βασίζεται στο χρωμοσωμικό DNA εμφανίζει υψηλή διακριτική ικανότητα και επαναληψιμότητα ενώ παράλληλα επιτρέπει τη δημιουργία εκτεταμένων βάσεων δεδομένων που είναι ξεχωριστές για τους διάφορους οργανισμούς. DNA sequencing analysis Πρόκειται για την ανίχνευση συγκεκριμένων γονιδίων στους μικροοργανισμούς και ανάλυση της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας. Τα στοιχεία από την ανάλυση sequencing επεξεργάζονται με εξειδικευμένο πρόγραμμα σε ηλεκτρονικό υπολογιστή, κατατίθενται σε τράπεζα δεδομένων όπου συγκρίνονται με νουκλεοτιδικές αλληλουχίες ήδη γνωστών οργανισμών. Έτσι, επιτυγχάνεται η ταυτοποίησή τους και με τη βοήθεια δενδρογράμματος απεικονίζεται η σχέση με άλλους οργανισμούς. Ανάλυση ριβοτύπου Η ανάλυση του ριβοτύπου των βακτηρίων χρησιμοποιείται εκτεταμένα και αφορά στην ανάλυση με Southern blot και υβριδισμό με ιχνηθέτες (probes) για το ριβοσωμικό RΝΑ. Τα r- DNA γονίδια χαρακτηρίζονται ως εξελικτικά συντηρημένη περιοχή του γονιδιώματος με αποτέλεσμα να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ιχνηθέτες συγκεκριμένων βακτηρίων. Η διακριτική ικανότητα αυτής της μεθόδου περιορίζεται από το γεγονός ότι τα ριβοσωμικά οπερόνια καλύπτουν μικρότερο από το 0.1% του χρωμοσωμικού μήκους και τείνουν να ομαδοποιούνται σε συγκεκριμένη περιοχή στο γονιδίωμα. 53

57 Περιεκτικότητα του DNA σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης 100%* A G T C G C Πρόκειται για την ποσοστιαία αναλογία του αθροίσματος των βάσεων της γουανίνης και κυτοσίνης του DNA ενός οργανισμού. Μπορεί να υπολογιστεί και από την θερμοκρασία τήξης του DNA και αποτελεί χαρακτηριστικό ταξινόμησης. Σε βακτήρια κυμαίνεται από 20% έως 80%. Σε ζώα και φυτά έχει πολύ μικρή διακύμανση <20%. Οι αντίστοιχες τιμές διαφόρων στελεχών ενός είδους είναι σταθερές. Υβριδισμός DNA:DNA Υβριδισμός DNA:DNA είναι ο σχηματισμός δίκλωνων μορίων DNA από 2 είδη μετουσιωμένων μορίων DNA από 2 διαφορετικούς μικροοργανισμούς. Το DNA του ενός μικροοργανισμού είναι ραδιοσημασμένο, ενώ το άλλο όχι. Η μέτρηση της ραδιενέργειας αντιπροσωπεύει την ποσότητα των πολύκλωνων μορίων, που σχηματίζονται και δίνει πληροφορίες για την έκταση των ομόλογων τμημάτων στο γενετικό τους υλικό. Όταν το ποσοστό της ομολογίας DNA:DNA υβριδισμού είναι πολύ χαμηλό, χρησιμοποιείται το ποσοστό DNA:rRNA υβριδισμού, γιατί η αλληλουχία του rrna είναι πολύ σταθερότερη. Πολυμορφισμοί γενετικού υλικού Η ταξινόμηση και ταυτοποίηση μικροοργανισμών πραγματοποιείται βάσει ομοιοτήτων και διαφορών που εμφανίζουν στο γενετικό τους υλικό, το οποίο επεξεργάζεται κατάλληλα. Οι μέθοδοι αυτές αφορούν τη μελέτη και ανάλυση όλου του γενετικού υλικού που φέρουν οι μικροοργανισμοί. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο ολικού χρωμοσωμικού DNA - PFGE Οι μικροοργανισμοί αφού αναπτυχθούν σε υγρό ή στερεό θρεπτικό υλικό εμβυθίζονται σε δίσκους αγαρόζης, λύονται παρουσία ενζύμων και στη συνέχεια ακολουθεί πέψη του χρωμοσωμικού DNA με κατάλληλα ένζυμα περιορισμού. Τα τμήματα του DNA ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο, του οποίου η πολικότητα μεταβάλλεται σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα. Το παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο επιτρέπει τον καλό διαχωρισμό τμημάτων DNA μοριακού βάρους εύρους 10kb έως 800 kb, τα οποία γίνονται ορατά και φωτογραφίζονται στο υπεριώδες. Η σύγκριση των ηλεκτροφορητικών εικόνων των οργανισμών καταλήγει στον προσδιορισμό του βαθμού συγγένειας που έχουν μεταξύ τους όσον αφορά στην επιδημιολογική και γενετική συσχέτιση. Έτσι, όταν δύο οργανισμοί έχουν ακριβώς την ίδια εικόνα PFGE τότε πρόκειται για το ίδιο ακριβώς στέλεχος. Όταν τα τμήματα DNA διαφέρουν από μία έως τρεις ζώνες, γεγονός που δηλώνει μία γενετική διαφορά, τότε οι οργανισμοί έχουν κοντινή συγγένεια. Διαφορές σε ένα έως και σε έξι τμήματα DNA υποδηλώνουν γενετικά συγγενή στελέχη (ένας κλώνος), ενώ περισσότερες από εφτά διαφορές ταυτοποιούν ξεχωριστούς κλώνους. 54

58 8. Μεταβολισμός ετερότροφων μικροοργανισμών Μεταβολισμός: Για την ανάπτυξη ή διατήρηση (ομοιόσταση) των κυττάρων απαιτείται ενέργεια (από φωτοσύνθεση ή χημικές ουσίες). Η βιοαποικοδόμηση των χημικών ουσιών (καταβολισμός) και η σύνθεση πολύπλοκων μορίων (αναβολισμός) αποτελούν τις βασικότερες εκδηλώσεις της ζωής (μεταβολισμός). Διαιρείται στον καταβολισμό (=αντιδράσεις, που συνδέονται με την αποικοδόμηση πολύπλοκων μορίων) και στον αναβολισμό (=αντιδράσεις, που συνδέονται με την σύνθεση μεσαίων μορίων και μακρομορίων). Βιοχημικά Μονοπάτια (Metabolic pathways): Οι αλληλουχίες των αντιδράσεων στον μεταβολισμό συγκεκριμένων ενώσεων. Σε ένα κύτταρο λαμβάνουν χώρα χιλιάδες αντιδράσεις παράλληλα, οι οποίες ρυθμίζονται σε ενζυμικό επίπεδο. Ένζυμα: Βιοκαταλύτες, οι οποίοι επιταχύνουν τον ρυθμό των βιοχημικών αντιδράσεων ελαττώνοντας το ενεργειακό τους δυναμικό (= ενέργεια ενεργοποίησης), έτσι ώστε να λαμβάνουν χώρα οι αντιδράσεις σε ήπιες συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης, θερμοκρασίας και ουδέτερο ph. Εικόνα 48: Εξέλιξη μιας υποθετικής εξώθερμης αντίδρασης. Οι χημικές αντιδράσεις μπορεί να μην εκτελούνται αυθόρμητα, έστω κι αν απελευθερώνεται ενέργεια, διότι οι αντιδρώσες ουσίες πρέπει πρώτα να ενεργοποιηθούν. Μόλις λάβει χώρα η ενεργοποίηση, τότε η αντίδραση εκτελείται αυθόρμητα. Οι καταλύτες, όπως είναι τα ένζυμα, μειώνουν την απαιτούμενη ενέργεια ενεργοποίησης. Τα ένζυμα δεν επηρεάζουν την απόδοση της αντίδρασης σε προϊόντα και δεν μεταβάλλονται κατά την αντίδραση. Τα ένζυμα καταλύουν μόνο μια χημική αντίδραση και είναι εξειδικευμένα για 1. Ένα μόνο υπόστρωμα. 2. Μία μόνο αντίδραση ενός συγκεκριμένου υποστρώματος. 3. Για μια μόνο στερεοχημική δομή του υποστρώματος (π.χ. D- ή L-ισομερές). 55

59 Αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό μέρος (αποένζυμο) και από ένα ή περισσότερα πρόσθετα οργανικά μόρια ή ιόντα (συνένζυμα). Έχουν ένα ενεργό κέντρο, που δημιουργείται μετά από συγκεκριμένη αναδίπλωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Στο ενεργό κέντρο προσδένονται τα αντιδρώντα και δημιουργούν μαζί με το ένζυμο ένα ενεργοποιημένο σύμπλοκο, στο οποίο σχηματίζονται τα προϊόντα της χημικής αντίδρασης μετά από διάσπαση των χημικών δεσμών των αντιδρώντων και δημιουργία νέων χημικών δεσμών στα προϊόντα. Συνένζυμα: Μέρος του ενεργού κέντρου του ενζύμου και άμεσοι δέκτες ή δότες ηλεκτρονίων, πρωτονίων ή διαφόρων άλλων μορίων. Πολύ γνωστά συνένζυμα είναι το FAD, το NAD, NADP, η φωσφορική πυριδοξάλη, το Mg ++, το Zn ++ και άλλα. NADPH σε αναβολικές αντιδράσεις / NADH, FADH 2 στη βιοσύνθεση του ATP. Πολλά συνένζυμα συνίστανται από βιταμίνες, όπως π.χ. το FAD από ριβοφλαβίνη (Β2) το NAD από νικοτιναμίδιο η φωσφορική πυριδοξάλη από πυριδοξάλη (Β6) Εικόνα 49: Ο καταλυτικός κύκλος ενός ενζύμου Αναστολείς και ενεργοποιητές ενζύμων: Χημικές ενώσεις, που προσδένονται στο ενεργό κέντρο ή στο ρυθμιστικό κέντρο του ενζύμου. Αναστολείς, που προσδένονται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου λειτουργούν ανταγωνιστικά στα υποστρώματα και μερικοί δημιουργούν μη αντιστρεπτή πρόσδεση και αδρανοποίηση του ενζύμου. Αναστολείς και ενεργοποιητές, που προσδένονται στο ρυθμιστικό κέντρο του ενζύμου μεταβάλουν την δομή του ενζύμου και την ενζυμική τους δραστικότητα ( αλλοστερικά ένζυμα). 56

60 Ρύθμιση της δραστικότητας των ενζύμων: Επιτυγχάνεται η αποφυγή συσσώρευσης τελικών ή ενδιάμεσων προϊόντων, η εξοικονόμηση υλικών και ενέργειας και η συντονισμένη λειτουργία των κυττάρων. 1. Ρύθμιση με ανάδραση: το τελικό προϊόν μιας σειράς αντιδράσεων προσδένεται στο ρυθμιστικό κέντρο του 1. ενζύμου. 2. Παράλληλη ρύθμιση: ρύθμιση μεταξύ 2 διαφορετικών σειρών αντιδράσεων (συντονισμένη λειτουργία των κυττάρων). 3. Ενεργοποίηση ενζύμου από πρόδρομο συστατικό. 4. Ρύθμιση κεντρικού κορμού ή κλώνου: προϊόν επιδρά με ανάδραση στον κεντρικό κορμό ή κλώνο. ATP (τριφωσφορική αδενοσίνη) Στα κύτταρα η χημική ενέργεια που εκλύεται στις οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις δεσμεύεται συνήθως υπό τη μορφή φωσφορικών δεσμών υψηλής ενέργειας. Στις φωσφορυλιωμένες ενώσεις οι φωσφορικές ομάδες συνδέονται με το υπόλοιπο μόριο μέσω ατόμων οξυγόνου με εστερικούς ή ανυδριτικούς δεσμούς. Κατά την υδρόλυση της φωσφορικής ομάδας απελευθερώνεται ενέργεια, ενώ παράλληλα οι φωσφορικοί δεσμοί δεν είναι όλοι δεσμού υψηλής ενέργειας. Το ΑΤΡ λειτουργεί σαν δείκτης του βιοενεργητικού επιπέδου του κυττάρου. Αποθηκεύει ενέργεια σε μορφή φωσφορικών δεσμών στο κύτταρο. Η διοχέτευση της ενέργειας στα μόρια ATP πραγματοποιείται σε μικρές ποσότητες, έτσι ώστε να αποφεύγονται απώλειες σε θερμότητα. Υψηλά επίπεδα ATP: - Μπλοκάρεται η οξείδωση του άνθρακα στο κύτταρο. - Αποθηκεύεται ο άνθρακας υπό μορφή λιπών και σακχάρων. Χαμηλά επίπεδα ATP: - Λαμβάνει χώρα ο καταβολισμός των υδρογονανθράκων. Εικόνα 50: Δεσμοί υψηλής ενέργειας. Στον πίνακα παρατίθεται η ελεύθερη ενέργεια υδρόλυσης ορισμένων φωσφορικών εστέρων και ανυδριτών. Δίνεται η δομή τεσσάρων ενώσεων για να φανεί η θέση των δεσμών χαμηλής και υψηλής ενέργειας. Το ΑΤΡ περιέχει τρεις φωσφορικές ομάδες αλλά μόνο δύο από αυτές είναι υψηλής ενέργειας ΔG o : είναι το ποσό της μεταβολής της ελεύθερης ενέργειας, που προέρχεται από μια χημική αντίδραση και μετατρέπεται σε άλλες μορφές ενέργειας συμβαίνει σε θερμοκρασία 25 ο C, πίεση 57

61 1 ατμόσφαιρας (1 atm) και ph 7,0, όταν η συγκέντρωση όλων των αντιδρώντων και προϊόντων της αντίδρασης παραμένει σταθερή και ίση με 1 γραμμομόριο (1Μ). ΔG o : είναι η πρότυπη μεταβολή ελεύθερης ενέργειας και χρησιμοποιείται στην Βιοχημεία και Φυσιολογία. ΔG o = ΔG προϊόντων ΔG αντιδρώντων Ενδόθερμες αντιδράσεις: κατανάλωση ενέργειας, ΔG o.έχει θετική τιμή. Εξώθερμες αντιδράσεις: παραγωγή ενέργειας, ΔG o.έχει αρνητική τιμή. Διεθνής μονάδα ενέργειας: Joule (1cal = 4,19 Joule). ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΕΤΕΡΟΤΡΟΦΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Έχουμε τρία επίπεδα πολυπλοκότητας: 1. Αποικοδόμηση πολυμερών και μακρομορίων σε μονομερή - πολυσακχαρίτες - λιπίδια - πρωτεΐνες - DNA & RNA 2. Μετατροπή μονομερών σε απλά οργανικά μόρια - αμινοξέα - νουκλεοτίδια - σάκχαρα - οξέα, γλυκερίνη 3. Διάσπαση απλών οργανικών μορίων σε ανόργανα συστατικά - Πυροσταφυλικό οξύ - ακέτυλο-coa - κιτρικό οξύ Καταβολισμός (CO 2, H 2 O, NH 3, SO 4-2 ) + Ενέργεια Αναβολισμός 58

62 Ενεργειακός μεταβολισμός: ροή ηλεκτρονίων σε μόρια όπως ATP, NADH, NADPH, FADH 2 κ.α., δέσμευση της ενέργειας σε χημικούς δεσμούς και εν συνεχεία διοχέτευση ενέργειας στην σύνθεση μορίων και στην παραγωγή έργου. Οι χημειότροφοι οργανισμοί παράγουν ελεύθερη ενέργεια από την οξείδωση καυσίμων μορίων (γλυκόζη, λιπαρά οξέα... ). Σε αερόβιους οργανισμούς, ο τελικός δέκτης ηλεκτρονίων είναι το οξυγόνο. Τα ηλεκτρόνια δεν μεταφέρονται απ ευθείας από τα καύσιμα μόρια και τα προϊόντα αποικοδόμησής τους στο οξυγόνο. Αντίθετα, αυτά τα υποστρώματα μεταφέρουν ηλεκτρόνια σε ειδικούς μεταφορείς, οι οποίοι είναι είτε νουκλεοτίδια της πυριδίνης είτε φλαβίνες. Οι ανηγμένες μορφές αυτών των φορέων μεταφέρουν τα υψηλού δυναμικού ηλεκτρόνια στο Ο 2 (αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων / κυτταρική μεμβράνη προκαρυωτικών μικροοργανισμών). Τα ΝΑDΗ και FADH 2 είναι οι κυριότεροι φορείς ηλεκτρονίων κατά την οξείδωση καυσίμων μορίων. Βιολογική οξείδωση - καύση Η βιολογική οξείδωση οργανικών υποστρωμάτων είναι συγκρίσιμη με την συνήθη καύση. Η βιολογική οξείδωση είναι μία «ψυχρή» καύση. Π.χ., η χημική καύση ή η βιολογική οξείδωση της γλυκόζης σαν πολυμερές (κυτταρίνη / ξύλο) αποδίδει την ίδια ενέργεια: C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O ; ΔG o = kj/mol (= 36 ATP) Με την καύση του ξύλου, όλη η ενέργεια ελευθερώνεται σαν θερμότητα. Με την βιολογική οξείδωση ένα ποσοστό της ενέργειας δεσμεύεται ως ενέργεια χημικών δεσμών ( σύνθεση 36 μορίων ΑΤΡ). Ένα μεγάλο ποσό ενέργειας ελευθερώνεται όταν το ΑΤΡ υδρολύεται: 1. σε διφωσφορική αδενοσίνη (ΑDΡ) και ορθοφωσφορικό (Ρi) ATP + H 2 O ADP + Pi + H + ; ΔG o = -31 kj/mol 2. σε μονοφωσφορική αδενοσίνη (ΑΜΡ) και πυροφωσφορικό (ΡΡi) ATP + H 2 O AMP + PPi + H + ; ΔG o = -62 kj/mol Οι παραπάνω είναι συνολικές αντιδράσεις και επηρεάζονται από την ιοντική ισχύ του μέσου και τις συγκεντρώσεις Mg ++ & Ca ++. Σε ένα τυπικό κύτταρο: Η ανάλωση του ΑΤΡ γίνεται με μεγάλο ρυθμό. [ένας άνθρωπος σε ανάπαυση καταναλώνει 40 kg ATP / 24 h] [ένας άνθρωπος σε άσκηση καταναλώνει > 0,5 kg ATP / min] 59

63 Τα σημαντικότερα μεταβολικά μονοπάτια είναι: 1. Γλυκόλυση (καταβολισμό υδατανθράκων) 2. Μεταβολισμός πυροσταφυλικού (παραγωγή ενέργειας) 3. Κύκλος του Krebs ή κύκλος του κιτρικού οξέος 4. Κύκλος των φωσφορικών πεντοζών 5. Οξειδωτική φωσφορυλίωση 8.1. Γλυκόλυση Πρόκειται για την διάσπαση της γλυκόζης σε πυροσταφυλικό οξύ, που είναι παρόμοια σε όλους τους οργανισμούς και περιλαμβάνει δέκα διαφορετικές αντιδράσεις, που οδηγούν από την γλυκόζη στο πυροσταφυλικό οξύ. Συνολικά έχουμε: 1. 1 μόριο Γλυκόζη 2 μόρια Πυροσταφυλικό οξύ 2. 2 μόρια ADP 2 μόρια ATP 3. 2 μόρια NAD + 2 μόρια NADH Οι δέκα αντιδράσεις είναι: 1. Γλυκόζη + ΑΤΡ 6-φωσφορική γλυκόζη + ΑDΡ + Η + ένζυμο: εξοκινάση ΔG o =-16.7 kj/mol (φωσφορυλίωση) 2. 6-φωσφορική γλυκόζη 6-φωσφορική φρουκτόζη ένζυμο: ισομεράση φωσφ. γλυκόζης ΔG o =+1.7 kj/mol (ισομερείωση) 3. 6-φωσφορική φρουκτόζη + ΑΤΡ 1,6-διφωσφορική φρουκτόζη + ΑDΡ + Η + ένζυμο: φωσφοφρουκτοκινάση (αλλοστερικό ένζυμο) ΔG o =-14.2 kj/mol (φωσφορυλίωση) 4. 1,6-διφωσφορική φρουκτόζη φωσφορική διυδρόξυακετόνη + 3-φωσφορική γλυκεριναλδεΰδη ένζυμο: αλδολάση ΔG o =+23.9 kj/mol 5. φωσφορική διυδρόξυακετόνη 3-φωσφορική γλυκαλδεϋδη ένζυμο: ισομεράση φωσφοτριόζης ΔG o =+7.6 kj/mol 6. 3-φωσφορική γλυκαλδεϋδη + Pi + NAD + 1,3-διφωσφογλυκερικό + ΝΑDΗ + Η + ένζυμο: αφυδρογονάση της 3-φωσφ. γλυκ. ΔG o =+6.3 kj/mol 7. 1,3-διφωσφογλυκερικό + ΑDΡ 3-φωσφογλυκερικό οξύ + ΑΤΡ ένζυμο: κινάση φωσγογλυκερικ. ΔG o =-18.8 kj/mol 8. 3-φωσφογλυκερικό 2-φωσφογλυκερικό οξύ ένζυμο: μουτάση φωσγογλυκερικ. ΔG o =+4.4 kj/mol 9. 2-φωσφογλυκερικό φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ + Η 2 Ο ένζυμο: ενολάση ΔG o =+1.7 kj/mol 10. φωσφοενολοπυροσταφυλικό + ADP + H + πυροσταφυλικό οξύ + ATP ένζυμο: κινάση πυροσταφυλικού οξέος ΔG o =-31.4 kj/mol 60

64 Η γλυκολυτική πορεία έχει διπλό ρόλο: (ι) Αποικοδομεί την γλυκόζη για την παραγωγή ΑΤΡ (ιι) Προμηθεύει δομικές μονάδες για συνθετικές αντιδράσεις Τα ένζυμα, που καταλύουν τις μη αντιστρεπτές αντιδράσεις της γλυκόλυσης ελέγχουν το ρυθμό της αντίδρασης. εξοκινάση αναστέλλεται από υψηλά επίπεδα 6-φωσφορικής γλυκόζης. φωσφοφρουκτοκινάση αναστέλλεται από υψηλά επίπεδα ΑΤΡ & κιτρικό οξύ (= προϊόν από τον κύκλο του Krebs). Αντίθετα ενεργοποιείται από την β-d-2,6-διφωσφορική φρουκτόζη. Κινάση πυροσταφυλικού οξέος Εικόνα 51: Η πορεία της γλυκόλυσης 61

65 8.2. Μεταβολισμός του πυροσταφυλικού οξέος Το πυροσταφυλικό οξύ παράγει με τον μεταβολισμό του ενέργεια. Δρα κατά τρεις διαφορετικούς τρόπους: 1. Αναερόβια μετατροπή (ζύμωση) Χρησιμοποιεί οργανικά μόρια σαν τελικούς ηλεκτρονιακούς δέκτες και παράγει μικρές ποσότητες ATP. 1α. Αλκοολική ζύμωση Παραγωγή αιθανόλης από το πυροσταφυλικό (κύρια σε ζυμομύκητες): Πυροσταφυλικό + Η + Ακεταλδεΰδη + CO2 (ένζυμο: αποκαρβοξυλάση) Αναγωγή της ακεταλδεΰδης σε αιθανόλη από ΝΑDΗ: Ακεταλδεΰδη + NADH +H + Αιθανόλη + NAD + (ένζυμο: αλκοολική αφυδρογονάση) Μετατροπή γλυκόζης σε αιθανόλη = αλκοολική ζύμωση Το συνολικό αποτέλεσμα της αναερόβιας διεργασίας είναι: Γλυκόζη + 2Ρi + 2 ADP + 2H + 2 αιθανόλη + 2 CO ATP + 2 H 2 O αναγέννηση NAD + 1β. Γαλακτική ζύμωση Παραγωγή γαλακτικού οξέος από το πυροσταφυλικό οξύ (σε μικροοργανισμούς + ζωικά κύτταρα, όταν το οξυγόνο μειώνεται σε οριακές τιμές): Πυροσταφυλικό οξύ + NADH + H + L-Γαλακτικό οξύ + NAD + (ένζυμο: γαλακτική αφυδρογονάση) Το συνολικό αποτέλεσμα της αναερόβιας διεργασίας είναι: Γλυκόζη + 2Ρi + 2 ADP 2 L-Γαλακτικό οξύ + 2 ATP + 2 H 2 O Παραγόμενη ενέργεια από 1 & 2: περίπου 5% από την ενέργεια της γλυκόζης 2. Αερόβια μετατροπή Η περισσότερη ενέργεια απελευθερώνεται υπό αερόβιες συνθήκες μέσω του κύκλου του κιτρικού οξέος. Το σημείο εισόδου στον κύκλο του Krebs πραγματοποιείται με την παραγωγή του ακετυλο-cοα (που λαμβάνει χώρα στα μιτοχόνδρια με την οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση του πυροσταφυλικού): 62

66 Πυροσταφυλικό οξύ + NAD + + CoA ακετυλο-coa + CO2 + NADH (ένζυμο: πυροσταφυλική αφυδρογονάση) Μη αντιστρεπτή οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση Ο μηχανισμός αυτής της αντίδρασης είναι πολύ πολύπλοκος και λαμβάνουν μέρος και 3 επιπλέον καταλυτικοί συμπαράγοντες: η πυροφωσφορική θειαμίνη (TPP), το λιποαμίδιο και το FAD Οξειδωτικές διεργασίες: Κύκλος του Krebs Κύκλος του Krebs = κύκλος του κιτρικού οξέος = κύκλος των τρικαρβοξυλικών οξέων (TCA cycle) λαμβάνει χώρα χωρίς οξυγόνο στην μήτρα των μιτοχονδρίων στα ευκαρυωτικά και στο κυτταρόπλασμα στα προκαρυωτικά κύτταρα. Οι 9 αντιδράσεις του κύκλου του κιτρικού οξέος είναι: 1. Ακέτυλο-συνένζυμο CoA + Οξαλοξικό + Η 2 Ο Κιτρικό + συνένζυμο CoA + Η + (κιτρική συνθετάση) (αλδολική συμπύκνωση) 2. κιτρικό cis-ακονοτικό + Η2Ο (ακονιτάση) 3. cis-ακονοτικό + Η 2 Ο ισοκιτρικό (ακονιτάση) 4. ισοκιτρικό + NAD + α-κετογλουταρικό + CO 2 + NADH (ισοκιτρική αφυδρογονάση) 5. α-κετογλουταρικό + NAD + + CoA ηλεκτρυλο-coa + CO 2 + NADH (σύμπλεγμα α-κετογλουταρικής αφυδρογονάσης) 6. ηλεκτρυλο-coa + Pi + GDP ηλεκτρικό + GTP + CoA (συνθετάση του ηλεκτρυλο-coa) (GTP + ADP GDP + ATP) (GTP = τριφωσφορική γουανοσίνη) 7. ηλεκτρικό + FAD + φουμαρικό + FADH 2 (ηλεκτρική αφυδρογονάση) 8. φουμαρικό + Η 2 Ο L-μηλικό (φουμαράση) 9. L-μηλικό + NAD + Οξαλοξικό + NADH + Η + (μηλική αφυδρογονάση) Το οξαλοξικό οξύ αναπαράγεται για το επόμενο γύρο του κύκλου του Krebs. Η ταχύτητα του κύκλου του κιτρικού οξέος ρυθμίζεται επακριβώς ώστε να ανταποκρίνεται στις ανάγκες του κυττάρου για ATP. Η χαμηλή συγκέντρωση NAD + και FAD προειδοποιεί ότι το ενεργειακό φορτίο είναι χαμηλό. 63

67 (1) Το ΑΤΡ είναι αλλοστερικός αναστολέας της κιτρικής συνθετάσης. (2) Το ΑDΡ ενεργοποιεί την ισοκιτρική αφυδρογονάση (ενώ το NADH και το ΑΤΡ είναι αναστολείς). (3) Η α-κετογλουταρική αφυδρογονάση αναστέλλεται από το NADH και το ηλεκτρυλο-coa (υψηλό ενεργειακό φορτίο - ΑΤΡ). Εικόνα 52: Κύκλος του Krebs 64

68 8.4. Κύκλος του γλυοξυλικού οξέος Μια παραλλαγή του κύκλου του Krebs είναι ο κύκλος του γλυοξυλικού οξέος σε βακτήρια και φυτά, που αναπτύσσονται με οξικό οξύ και παράγουν ακετυλο-συνένζυμο CoA. ο κύκλος του γλυοξυλικού οξέος Παρακάμπτει 2 στάδια του κύκλου του Krebs. Σε κάθε γύρο εισέρχονται 2 (αντί 1) μόρια ακετυλο-συνενζύμου CoA. Το συνολικό άθροισμα του κύκλου του γλυοξυλικού οξέος είναι: 2 ακετυλο- CoA + NAD + 2 H 2 O ηλεκτρικό + 2 συνένζυμα CoA + NADH + 2H Οξείδωση της γλυκόζης μέσω του μονοπατιού των φωσφορικών πεντοζών Είναι εναλλακτικό βιοχημικό μονοπάτι της γλυκόλυσης, μπορεί να λάβει χώρα αερόβια και αναερόβια και λαμβάνει μέρος και στον καταβολισμό και στον αναβολισμό του κυττάρου. Με το μονοπάτι αυτό έχουμε (1) παραγωγή της 5-φωσφορικής ριβόζης (αυτό το σάκχαρο και τα παράγωγα χρησιμοποιούνται στην σύνθεση βιομορίων, όπως των νουκλεϊκών οξέων RNA & DNA, ATP, CoA, NAD +, FAD) και (2) παραγωγή του NADPH (είναι δότης ηλεκτρονίων στις αναγωγικές βιοσυνθέσεις του κυττάρου). Το μονοπάτι των φωσφορικών πεντοζών χαρακτηρίζεται (1) από την οξείδωση της 6-φωσφορικής γλυκόζης σε 5-φωσφορική ριβόζη και παραγωγή NADPH. 3 6-φωσφορική γλυκόζη + 6 NADP H2O 2 5-φωσφορική ριβόζη + 6 NADPH + 3 CO H φωσφορική γλυκεριναλδεΰδη (2) αλληλομετατροπή σακχάρων με 3, 4, 5, 6 ή 7 άτομα άνθρακα. (3) Παραγωγή 3- φωσφορικής γλυκεριναλδεΰδης (η οποία είναι ισομερές του πυροσταφυλικού οξέος και μεταβολίζεται όπως το πυροσταφυλικό οξύ περαιτέρω) Τα παραγόμενα μόρια NADH & FADH 2 οξειδώνονται από την αναπνευστική αλυσίδα για τον σχηματισμό ΑΤΡ. Ενώ το NADΡH είναι δότης ηλεκτρονίων στις αναγωγικές βιοσυνθέσεις. Οι αντιδράσεις από το σημείο της 3-φωσφορικής γλυκεριναλδεΰδης, που οδηγούν στην σύνθεση του πυροσταφυλικού οξέος, είναι κοινές με εκείνες της γλυκόλυσης. Το συνολικό άθροισμα της οξείδωσης της γλυκόζης μέσω του μονοπατιού των φωσφορικών πεντοζών είναι: 6-φωσφορική γλυκόζη + 12 NADP H 2 O 6 CO NADPH + 12 H + + Pi 65

69 8.6. Οξειδωτική φωσφορυλίωση Είναι η διεργασία, όπου παράγεται ΑΤΡ (από ADP) κατά την μεταφορά ηλεκτρονίων από το NADH ή το FADH 2 προς το Ο 2 διαμέσου μιας σειράς φορέων ηλεκτρονίων για την τελική δημιουργία νερού. Οι δότες ηλεκτρονίων (NADH και FADH 2, που προέρχονται από την γλυκόλυση, την οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση του πυροσταφυλικού οξέος, τον κύκλο του Krebs κ.α.) οξειδώνονται και τα ηλεκτρόνια, που ελευθερώνονται (συνήθως ζεύγη), και περνούν με ένα σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων στον τελικό δέκτη ηλεκτρονίων το Ο 2. FADH 2 FAD Σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων Ο 2 H 2 Ο 2 ADP + 2 Pi 2 ATP Tο σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων (αναπνευστική αλυσίδα) αποτελείται από πρωτεϊνικούς φορείς (κυρίως κυτοχρώματα) ενσωματωμένους στην εσωτερική μεμβράνη των ευκαρυωτικών ή στην κυτταροπλασματική μεμβράνη των προκαρυωτικών. Στις πρώτες 3 συζεύξεις μεταφέρονται άτομα υδρογόνου, ενώ στις 5 επόμενες μεταφέρονται ηλεκτρόνια με την βοήθεια κυτοχρωμάτων. Η τελική μεταφορά ηλεκτρονίων στο Ο 2 γίνεται από την κυτοχρωμική οξειδάση. Είναι η κύρια πηγή ΑΤΡ σε αερόβιους οργανισμούς. Όταν η γλυκόζη οξειδώνεται σε CO 2 και Η 2 Ο 32 από τα 36 μόρια ΑΤΡ παράγονται από οξειδωτική φωσφορυλίωση. Η οξείδωση του NADH αποδίδει 3 ΑΤΡ στα μιτοχόνδρια ενώ η οξείδωση του FADH 2 ή του NADH στο κυτταρόπλασμα αποδίδει 2 ΑΤΡ. Η οξείδωση και η φωσφορυλίωση είναι διεργασίες συζευγμένες μεταξύ τους. 66

70 8.7. Ενεργειακή απόδοση του οξειδωτικού μεταβολισμού ΓΛΥΚΟΛΥΣΗ (κυτταρόπλασμα) 2 ATP + 2 NADH (= x 2 ATP) = 6 ATP ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΙΩΣΗ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ (μήτρα μιτοχονδρίων) 2 NADH (= x 3 ATP) = 6 ATP ΚΥΚΛΟΣ ΚΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ (μήτρα μιτοχονδρίων) ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ (αναδιπλώσεις εσωτερικής μεμβράνης μιτοχονδρίων) 3 NADH (= x 3 ATP) = 9 ATP 1 FADH 2 (= x 2 ATP) = 2 ATP 1 GTP = 1ATP = 24 ATP X 2 Σύνολο = 36 ATP 67

71 ΠΗΓΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ (Ηλεκτρονιακοί δότες) ΦΩΣ (H 2 S, S, H 2, H 2 O) ΟΡΓΑΝΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ (Υδατάνθρακες, λίπη, πρωτεΐνες) ΑΝΟΡΓΑΝΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ (NH 3, NO 2 -, H 2 S, S, S 2 O 3 --, Fe +2 ) e - e - e - Παραγωγή ΑΤΡ ΦΟΡΕΙΣ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΩΝ NADP + NADPH FAD +, NAD + FADH 2, NADH Παραγωγή ΑΤΡ ΤΕΛΙΚΟΙ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΑΚΟΙ ΔΕΚΤΕΣ CO 2 (Αυτοτροφία) O 2 (Αερόβια Αναπνοή) ΝO 3 -, SO 4 --, HCO 3 - (Αναερόβια Αναπνοή) Οργανικές ενώσεις (Αναερόβια ζύμωση) 68

72 9. Θρέψη και φυσιολογία μικροοργανισμών 9.1. Ο μεταβολισμός των μικροοργανισμών Ο μικροοργανισμοί ζουν σε κατάσταση συνεχούς πολλαπλασιασμού. Για να ζήσουν χρειάζονται ορισμένες προϋποθέσεις. Αν κάποια από τις βασικές συνθήκες της ζωής τους λείψει τότε συχνά απλώς επιβιώνουν, δηλαδή περιέρχονται σε κατάσταση λήθαργου και αναστέλλεται η δυνατότητα πολλαπλασιασμού τους. Αν οι συνθήκες γίνουν και πάλι ευνοϊκές για τον μεταβολισμό τους τότε επαναδραστηριοποιούνται και πολλαπλασιάζονται. Σε αντίθετη περίπτωση αρχίζει η αποσύνθεση του κυττάρου τους και πεθαίνουν. Οι πιο βασικές προϋποθέσεις για τις μεταβολικές λειτουργίες και τον πολλαπλασιασμό των μικροοργανισμών του νερού είναι οι εξής: 1) Νερό η υγρασία. Οι μικροοργανισμοί για να ζήσουν έχουν ανάγκη από υγρασία. Η μονή περίπτωση επιβίωσης χωρίς υγρασία είναι η παραγωγή σπορίων από ορισμένα βακτήρια, τα οποία λέγονται σπορογόνα. Τα σπόρια επιβιώνουν σε πολύ αντίξοες συνθήκες υγρασίας και βλαστάνουν όταν βρεθούν σε ευνοϊκό για την ζωή του βακτηρίου περιβάλλον. 2) Οργανικές ουσίες. Για να τραφούν και να πολλαπλασιαστούν οι μικροοργανισμοί πρέπει στο περιβάλλον στο οποίο ζουν να διατίθενται πηγές άνθρακα και αζώτου, πηγές ενέργειας, ανόργανα ιόντα και αυξητικοί παράγοντες όπως βιταμίνες. Η αποδόμηση οργανικών ουσιών είναι η κύρια πηγή άνθρακα και αζώτου. Έτσι οι οργανικές ουσίες είναι η βάση της διατροφής τους. Ανάλογα με τον τρόπο με τον οποίο τρέφονται χωρίζονται σε: Αυτότροφους μικροοργανισμούς συνθέτουν οργανικές ουσίες από ανόργανες (φωτοσύνθεση ή χημειοσύνθεση) Ετερότροφους μικροοργανισμούς χρησιμοποιούν έτοιμες οργανικές ουσίες από το περιβάλλον. 3)Οξυγόνο - Διοξείδιο του άνθρακα. Οι μικροοργανισμοί ποικίλλουν όσον αφορά στις απαιτήσεις τους σε οξυγόνο ή την ανθεκτικότητά τους σε αυτό. Έτσι, υποδιαιρούνται σε διάφορες ομάδες ανάλογα με την επίδραση που τους ασκεί το οξυγόνο όπως φαίνεται στον πίνακα 3. Οι μικροοργανισμοί χωρίζονται σε αερόβιους, όταν το οξυγόνο είναι απαραίτητο στον μεταβολισμό τους και σε αναερόβιους όταν χρησιμοποιούν C0 2. Ενδιάμεση κατηγορία είναι οι μικροαερόφιλοι μικροοργανισμοί οι οποίοι χρειάζονται C0 2 και μικρή ποσότητα ο- ξυγόνου. Τέλος, πολλοί αερόβιοι είναι προαιρετικά (ή δυνητικά, ή περιστασιακά) αναερόβιοι Αυτό σημαίνει ότι με τις κατάλληλες θρεπτικές ουσίες και συνθήκες καλλιέργειας μπορούν να αναπτυχθούν είτε υπό αερόβιες, είτε υπό αναερόβιες συνθήκες. 69

73 Πίνακας 2: Διάκριση των μικροοργανισμών με βάση τη σχέση τους με το οξυγόνο. 4)Θερμοκρασία. Ο κάθε μικροοργανισμός έχει μια ευνοϊκή θερμοκρασία μεταβολικών λειτουργιών και πολλαπλασιασμού. Όσο η θερμοκρασία αυξάνεται οι χημικές και ενζυμικές αντιδράσεις του κυττάρου εκτελούνται με ταχύτερους ρυθμούς και η αύξηση επιταχύνεται. Ωστόσο, πάνω από μι συγκεκριμένη θερμοκρασία, υπάρχει ενδεχόμενο κάποιες πρωτεΐνες να υποστούν σοβαρές, μη αντιστρέψιμες αλλοιώσεις. Επομένως, όταν η θερμοκρασία αυξάνεται μέσα σε καθορισμένα όρια, η αύξηση και οι μεταβολικές λειτουργίες επιταχύνονται μέχρι ενός σημείου, στο οποίο αρχίζουν να εκτελούνται οι αντιδράσεις απενεργοποίησης. Πέρα από αυτό το σημείο, οι κυτταρικές λειτουργίες πέφτουν ακαριαία στο μηδέν. Για κάθε οργανισμό υπάρχει μια ελάχιστη θερμοκρασία, κάτω από την οποία δεν παρατηρείται αύξηση, μια άριστη θερμοκρασία, στην οποία επιτυγχάνεται η μεγαλύτερη ταχύτητα αύξησης και μια μέγιστη θερμοκρασία, πάνω από την οποία η αύξηση είναι αδύνατη (εικόνα 51). Η άριστη θερμοκρασία βρίσκεται πάντα πλησιέστερα στη μέγιστη παρά στην ελάχιστη. Αυτές οι τρεις ονομάζονται θεμελιώδεις θερμοκρασίες και είναι γενικά χαρακτηριστικές για κάθε είδος οργανισμού, αλλά όχι πλήρως καθοριστικές, αφού ενδέχεται να μεταβάλλονται ελαφρά από άλλους περιβαλλοντικούς παράγοντες και κυρίως από τη σύσταση του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης. Η μέγιστη θερμοκρασία αύξησης δεδομένου οργανισμού πιθανότατα αντανακλά την απενεργοποίησης μιας ή περισσότερων πρωτεϊνών ζωτικής σημασίας. Αντίθετα, οι παράγοντες που ελέγχουν την ελάχιστη θερμοκρασία αύξησης δεν είναι εξίσου σαφείς. Ενδεχομένως, η ελάχιστη θερμοκρασία ενός οργανισμού να οφείλεται σε «ψύξη» της μεμβράνης, έτσι ώστε αυτή να μη λειτουργεί σωστά όσον αφορά στη μεταφορά θρεπτικών συστατικών και τη δημιουργία της διαβάθμισης συγκέντρωσης πρωτονίων. Σε σχέση με άριστη θερμοκρασία αύξησης έχουμε 3 βασικούς τύπους μικροοργανισμών: τους ψυχρόφιλους. οι οποίοι ευνοούνται σε θερμοκρασίες 4-20 C, τους μεσόφιλους σε θερμοκρασίες C (με πιο ευνοϊκή την θερμοκρασία των 37 C) και τους θερμόφιλους σε θερμοκρασίες C. Οι κατηγορίες αυτές όμως δεν είναι πολύ σαφείς σε όλα τα είδη των μικροοργανισμών του νερού. Για παράδειγμα υπάρχουν μικροοργανισμοί οι οποίοι είναι ψυχρότροφοι δηλαδή είναι μεσόφιλοι, αλλά μπορούν να πολλαπλασιαστούν, με βραδύτερους ρυθμούς, και σε χαμηλές θερμοκρασίες. 70

74 Εικόνα 53: Επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό αύξησης και οι μοριακές συνέπειες για το κύτταρο. 5) ph. Κάθε οργανισμός έχει ένα εύρος ph στο οποίο είναι πιθανή η ανάπτυξή του κι έχει συνήθως ένα καλά καθορισμένο άριστο ph. Οι περισσότεροι οργανισμοί έχουν εύρο ph για ανάπτυξη 2-3 μονάδες. Τα περισσότερα φυσικά περιβάλλοντα έχουν τιμές ph μεταξύ 5-9 και είναι πολύ συνηθισμένο οι οργανισμοί να έχουν άριστο σε αυτό το εύρος. Οι οργανισμοί που αναπτύσσονται καλύτερα σε χαμηλές τιμές ph ονομάζονται οξεόφιλοι. Οι μύκητες είναι περισσότερο ανθεκτικοί σε χαμηλές τιμές ph απ ότι τα βακτήρια. Πολλοί μύκητες αναπτύσσονται άριστα σε ph 5 ή και χαμηλότερο. Αρκετά βακτήρια είναι επίσης οξεόφιλα. Αντίστοιχα, οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται άριστα σε υψηλό ph (κοντά στο 10) ονομάζονται αλκαλόφιλοι. Οι τελευταίοι απαντούν συνήθως σε πολύ αλκαλικά περιβάλλοντα, όπως σε λίμνες πλούσιες σε ανθρακικό ασβέστιο και σε εδάφη με υψηλές συγκεντρώσεις ανθρακικών αλάτων. 6) Ωσμωτική πίεση. Στη φύση τα ωσμωτικά φαινόμενα παρουσιάζουν ενδιαφέρον κυρίως σε ενδιαιτήματα με υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων. Το θαλασσινό νερό περιέχει περίπου 3% χλωριούχο νάτριο και μικρές ποσότητες πολλών άλλων ανόργανων συστατικών και χημικών στοιχείων. Οι μικροοργανισμοί που ζουν στη θάλασσα έχουν συνήθως συγκεκριμένες απαιτήσεις για το ιόν του νατρίου, πέραν του ότι για να αναπτυχθούν άριστα χρειάζονται την ενεργότητα του θαλασσινού νερού. Τέτοιου είδους οργανισμοί ονομάζονται αλόφιλοι, οι οποίοι για την ανάπτυξή τους χρειάζονται έστω και λίγο NaCl, ενώ η άριστη ποσότητα ποικίλλει από οργανισμό σε οργανισμό. 71

75 9.2. Τροφική κατάταξη μικροοργανισμών 1. Κατάταξη με βάση την πηγή ενέργειας: Φωτότροφοι = εκείνοι που χρησιμοποιούν την ενέργεια του φωτός Χημειότροφοι = εκείνοι που χρησιμοποιούν οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις οργανικών ή ανόργανων ενώσεων για παραλαβή ενέργειας. 2. Κατάταξη με βάση την πηγή άνθρακα: Αυτότροφοι ή λιθότροφοι = εκείνοι που παράγουν οργανικό άνθρακα από CO 2. Ετερότροφοι ή οργανότροφοι = εκείνοι που χρησιμοποιούν οργανικές ενώσεις. Οι συνδυασμοί πηγής ενέργειας και άνθρακα οδηγούν στην τροφική ταξινόμηση: Φωτοαυτότροφοι ή Φωτολιθότροφοι = χρήση CO 2 και φωτός. Φωτοσυνθετικά βακτήρια (πράσινα και ιώδη βακτήρια του θείου, κυανοβακτήρια) και φύκη. Χρησιμοποιούνται άτομα Η από το νερό για την αναγωγή του CO 2 με ταυτόχρονη παραγωγή Ο 2 (οξυγονογενής). CO H 2O h v (CH 2O) + O 2 h ν Φωτοετερότροφοι ή Φωτοργανότροφοι = χρήση φωτός και οργανικών ενώσεων (δεν παράγουν Ο 2, αντί για Η 2 Ο χρησιμοποιείται Η 2 S, S, H 2 σαν δότης ηλεκτρονίων). Μερικά από τα αναερόβια πράσινα και ιώδη βακτήρια του θείου (μη οξυγονογενής διεργασία). Η 2 S S Σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων ΝΟ 3 -, SΟ 4-2, CΟ 2 ΝH 3, Ν 2, H 2 S, CH 4 ADP + Pi ATP Χημειοαυτότροφοι ή Χημειολιθότροφοι = Χρησιμοποιούν τα ηλεκτρόνια ανηγμένων ανόργανων ενώσεων (Η 2 S, S, ΝH 3, ΝΟ 2 -, H 2, Fe +2 ) ως πηγή ενέργειας, Ο 2 σαν τελικό δέκτη ηλεκτρονίων και CO 2 ως πηγή άνθρακα. Περιλαμβάνει μόνο αερόβια βακτήρια. Χημειοετερότροφοι ή Χημειοοργανότροφοι = Χρήση των ηλεκτρονίων ατόμων υδρογόνου οργανικών ενώσεων για ενέργεια και ταυτόχρονη χρήση των ίδιων ενώσεων σαν πηγή άνθρακα. Συναντάται σε μύκητες, πρωτόζωα και ετερότροφα βακτήρια. 72

76 10. Μικροβιακή ανάπτυξη Ένα ζωντανό κύτταρο είναι ένα ανοιχτό σύστημα, που δέχεται ενέργεια από το περιβάλλον για την διατήρηση & αύξηση της δομής του. Τα εισερχόμενα στοιχεία στο κύτταρο αποτελούν τις θρεπτικές ουσίες, ενώ τα εξερχόμενα είναι τα προϊόντα του μεταβολισμού τους. IN Κύτταρο OUT Οι ρυθμοί ανάπτυξης (μ), ανάλωσης θρεπτικών ουσιών (σ) και παραγωγής προϊόντων μεταβολισμού (q p ) εξαρτώνται από το είδος του μικροοργανισμού ή του κυττάρου, τη θερμοκρασία, το διαλυμένο οξυγόνο, ph, κτλ. Κάθε μικροοργανισμός μπορεί να θεωρηθεί σαν ένας μικρός αντιδραστήρας Μικροβιακή ανάπτυξη σε κλειστή καλλιέργεια (batch culture) Κλειστή καλλιέργεια θεωρείται εκείνη, που αναπτύσσεται σε περιορισμένο χώρο με περιορισμένη ποσότητα θρεπτικού υλικού και για καθορισμένο χρόνο. 1. Αύξηση σε μη περιοριστικές συνθήκες περιβάλλοντος Όλα τα θρεπτικά συστατικά βρίσκονται σε ποσότητες μη περιοριστικές, γεγονός που συντελεί στη συνεχή ανάπτυξη των μικροοργανισμών αφού διαιρούνται συνεχώς. Κάθε νέο κύτταρο αναπτύσσεται και διαιρείται συνεχώς, με αποτέλεσμα η αύξηση του πληθυσμού των μικροοργανισμών να είναι εκθετική. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκφράζεται με μια γεωμετρική πρόοδο: 2 0, 2 1, 2 2, 2 3, 2 4,, 2 n, μετά από n διχοτομήσεις. Δηλαδή, αν ξεκινώντας είχαμε Ν 0 κύτταρα, μετά από n γενεές θα έχουμε Ν 0 2 n κύτταρα. N = Ν 0 2 n (n: αριθμός γενεών, Ν 0 : αριθμός αρχικών κυττάρων, Ν: αριθμός τελικών κυττάρων) Προκειμένου να είναι γραμμική η ανάπτυξη των κυττάρων: lnn = ln Ν 0 + n ln2 ln N - lnn n ln2 0 73

77 Χρόνος διπλασιασμού t d (doubling time): Το χρονικό διάστημα, που απαιτείται για τον t d t n διπλασιασμό του πληθυσμού. (t: χρόνος ανάπτυξης) (n t t d ) (N = Ν 0 2 t/td ) Ειδικός Ρυθμός Ανάπτυξης μ (growth rate): Η μεταβολή του αριθμού των κυττάρων ή της κυτταρικής βιομάζας στην μονάδα του χρόνου [h -1 ]. Η παραγωγή θυγατρικών κυττάρων γίνεται κυρίως κατά την φάση της εκθετικής ανάπτυξης όπου η παραδοχή της «εξισορροπημένης ανάπτυξης» ισχύει. Γι αυτό το λόγο σε βιολογικά συστήματα χρησιμοποιούμε πολύ συχνά τους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης κυττάρων ή παραγωγής προϊόντων κτλ. Εάν dx/dt είναι ο ρυθμός ανάπτυξης βιομάζας [g -biomass /(L h)] και x είναι η συγκέντρωση της αρχικής βιομάζας [g -biomass /L], τότε ορίζουμε τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (specific growth rate), μ, ως dx dt μx [h -1 ] Εάν υποθέσουμε, ότι ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης είναι σταθερός (μ=const.), ολοκλήρωση της παραπάνω διαφορικής εξίσωσης μας δίνει, x(t) μ(t x o e t0) Η εξίσωση προφανώς προβλέπει συνεχή αύξηση της βιομάζας δεδομένου ότι δεν λαμβάνει υπόψη την κατανάλωση του υποστρώματος. Η εξίσωση αυτή μπορεί να μας δώσει τον χρόνο διπλασιασμού (doubling time) της καλλιέργειας, t d. x(t d ) 2x o x o e μtd μt d 2 e t d ln2 μ 0,6931 μ μ 1 xo dx dt lnx - ln x tt - t0 0 ln2 td 0,693 td 74

78 2. Αύξηση σε περιοριστικές συνθήκες περιβάλλοντος Στις περιοριστικές συνθήκες περιβάλλοντος το υπόστρωμα (θρεπτικό υλικό) είναι αυτό που ρυθμίζει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και την αύξηση του πληθυσμού του. Φάσεις μικροβιακής ανάπτυξης σε κλειστό σύστημα (growth patterns in batch culture): Κατά την διάρκεια καλλιέργειας μικροοργανισμών σε κλειστό σύστημα, καταμετρώντας τον αριθμό των μικροβιακών κυττάρων σε τακτά χρονικά διαστήματα μπορούμε να παρατηρήσουμε τις εξής έξι φάσεις: Log (x) Φάση επιβράδυνσης Φάση επιτάχυνσης Φάση εκθετικής ανάπτυξης Φάση στασιμότητας Φάση θανάτου Φάση καθυστέρησης Εικόνα 54: Καμπύλη μικροβιακής ανάπτυξης Χρόνος (h) 1. Λανθάνουσα φάση ή φάση καθυστέρησης (lag phase) Όταν τα μικρόβια βρίσκονται σε ένα νέο περιβάλλον δεν πολλαπλασιάζονται αμέσως αλλά απαιτούν μια περίοδο ρύθμισης. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης υπάρχει αναδόμηση των τραυμάτων που προέκυψαν από προηγούμενες διαδικασίες (π.χ. προηγούμενη ψύξη ή θέρμανση). Επίσης τα παλαιά κύτταρα αποκαθιστούν τα βασικά συστατικά τους, που έχουν μειωθεί ή καταστραφεί. Συνήθως η φάση της καθυστέρησης εμφανίζεται όταν οι μικροοργανισμοί μεταφέρονται σε περιβάλλον, όπου υπάρχουν «φρέσκα» θρεπτικά συστατικά ανάπτυξης. Οι εσω-κυτταρικές συγκεντρώσεις διαφόρων συνενζύμων (π.χ., βιταμίνες, αμινοξέα και κατιόντα όπως Mg 2+, Ca 2+, κτλ) μπορούν να μειωθούν σημαντικά λόγω μεταφοράς τους από το κύτταρο στο διάλυμα διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης. Εάν αυτά τα συνένζυμα δεν είναι στις απαιτούμενες συγκεντρώσεις στο κύτταρο μπορεί να έχουμε σημαντική μείωση ενζυμικών αντιδράσεων και τα κύτταρα είναι υποχρεωμένα να συνθέσουν τα απαιτούμενα ένζυμα ή τους απαιτούμενους μεταβολίτες για τον καταβολισμό της πηγής του άνθρακα για να αναπληρώσουν τις ελλείψεις τους προτού συνεχίσουν με την παραγωγή νέων κυττάρων (μ = 0). 75

79 2. Φάση επιτάχυνσης είναι η φάση όπου αρχίζει η ανάπτυξη του οργανισμού και παρατηρείται συνεχής αύξηση του μ σε μ max. 3. Φάση εκθετικής ανάπτυξης (exponential phase) Χαρακτηρίζεται από έντονο πολλαπλασιασμό των βακτηρίων, ο αριθμός των μικροβίων στο καλλιέργημα διπλασιάζεται καθώς και όλα τα συστατικά του κυττάρου (DΝΑ, RΝΑ και πρωτεΐνες). Ο αριθμός των βακτηρίων σε σχέση με την ταχύτητα ανάπτυξης εκφράζεται από μία ευθεία, δηλαδή υπάρχει γραμμική αναλογία μεταξύ του αριθμού των βακτηρίων και της ταχύτητας ανάπτυξης τους. Ο χρόνος διαίρεσης κατά την φάση αυτή εξαρτάται α) από τη θερμοκρασία επώασης, β) το είδος του θρεπτικού υλικού και γ) το μικροβιακό είδος. Η ανάπτυξη γίνεται στο μέγιστο δυνατό ρυθμό και η παραδοχή της «ισορροπημένης ανάπτυξης» ισχύει. To μ max είναι σταθερό. 4. Φάση της επιβράδυνσης (declining growth phase / deceleration phase) Το υπόστρωμα ελαττώνεται σημαντικά ή έχουμε την παρουσία υψηλής συγκέντρωσης κάποιου αναστολέα / παρεμποδιστή (συνήθως κάποιο «τοξικό» παραπροϊόν της αντίδρασης). Σε μία τυπική καλλιέργεια βακτηρίων, η φάση αυτή είναι πολύ μικρής διάρκειας. Οι γρήγορα μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες οδηγούν σε «μη ισορροπημένη ανάπτυξη» (unbalanced growth). To μ max ελαττώνεται μέχρι μ = Φάση στασιμότητας (stationary phase) Ο μικροβιακός πληθυσμός εισέρχεται σε αυτή τη φάση λόγω μείωσης των θρεπτικών ουσιών και της συσσώρευσης των τοξικών μεταβολιτών. Οι αερόβιοι μικροοργανισμοί συχνά περιορίζονται από τη διαθεσιμότητα σε οξυγόνο. Κατά τη διάρκεια της στάσιμης φάσης, σταθεροί αριθμοί κυττάρων διατηρούνται διότι ο ρυθμός παραγωγής των κυττάρων είναι ισοδύναμος με τον αριθμό των κυττάρων που πεθαίνουν. Τέλος ο ρυθμός ανάπτυξης τείνει στο μηδέν (μ = 0). Η σύνθεση ορισμένων αντιβιοτικών έχει τον μέγιστο ρυθμό παραγωγής σε αυτή την φάση. 6. Φάση απόπτωσης ή θανάτου (death phase) Η συσσώρευση των τοξικών αποβλήτων και η θρεπτική στέρηση οδηγούν στη μείωση του αριθμού των βιώσιμων βακτηριακών κυττάρων. Ο αριθμός των βακτηρίων μειώνεται εκθετικά, αλλά με αργότερους ρυθμούς από την λογαριθμική φάση. Μερικά βακτήρια φέρουν ένζυμα αποκαλούμενα αυτολυσίνες που προκαλούν λύση των κυττάρων καθώς γηράσκουν (μ = αρνητικός). 76

80 3. Μικροβιακή ανάπτυξη με περιορισμό υποστρώματος (substrate-limited growth) Το υπόστρωμα (θρεπτικό υλικό) είναι αυτό που ρυθμίζει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και την αύξηση του πληθυσμού του. Εξίσωση Monod: Με βάση πειραματικά δεδομένα έχει διαπιστωθεί, ότι ο ρυθμός μικροβιακής ανάπτυξης είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος κατά παρόμοιο τρόπο με αυτό στις ενζυμικές αντιδράσεις κατά Michaelis-Menten. Η λεγόμενη κινητική έκφραση του Monod είναι: μ μ K max S [S] [S] μ μ max /2 μ max όπου η σταθερά κορεσμού Κ S αντιστοιχεί στην συγκέντρωση υποστρώματος, που ο ρυθμός ανάπτυξης είναι στο μισό του μεγίστου μ max. Η φυσική σημασία της κινητικής έκφρασης Monod γίνεται προφανής, αν θεωρήσουμε, ότι οι επί μέρους βιοχημικές αντιδράσεις, που λαμβάνουν μέρος στην ανάπτυξη ενός κυττάρου, είναι ενζυμικές και μία από αυτές θα είναι εκείνη, που ελέγχει τον ρυθμό ανάπτυξης. Εάν η παραπάνω εξίσωση μετατραπεί στην ακόλουθη γραμμική σχέση K S [S] 1 μ 1 K S μ S max 1 μ max τo κλάσμα 1/μ σε σχέση με το 1/S δίνει μια ευθεία γραμμή και συναντάει τις τετμημένες 1/μ max και τις τεταγμένες 1/Κ s για 2 διαφορετικούς οργανισμούς Α και Β, που διαφέρουν στην σταθερά κορεσμού τους. 1/μ B A -1/Κ SᾹ 1/ Κ SB 1/μ mα και 1/μ mb 1/S Ακόμη και αν ο μ max είναι όμοιος σε αυτές τις 2 διαφορετικές καλλιέργειες κάτω από τις ίδιες συνθήκες ανάπτυξης, μπορούν οι διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος να περιορίσουν την αύξηση. 77

81 Συντελεστές απόδοσης (yield coefficients) και ενέργεια συντήρησης (maintenance energy): Η στοιχειομετρία της ανάπτυξης μικροοργανισμών μπορεί να γραφτεί ως αcη nο m + βνη 3 + γο 2 CΗ aο bν c + δcη pο qν r + εη 2Ο + κcο 2 } } } } πηγή C πηγή Ν κύτταρο προϊόν Ο συνήθης τρόπος αντιμετώπισης της στοιχειομετρίας στην κυτταρική ανάπτυξη είναι με την χρησιμοποίηση «συντελεστών απόδοσης», που είναι ο λόγος της ποσότητας του παραχθέντος προϊόντος ή βιομάζας ως προς την ποσότητα του υποστρώματος, που καταναλώθηκε. O περισσότερο γνωστός συντελεστής απόδοσης είναι ο συντελεστής απόδοσης ανάπτυξης Υ X/S Υ X/S = g g ( δημιουργηθείσας ( καταναλωθέντος βιομάζας) υποστρώματος) ΔX ΔS ΔX/Δt ΔS/Δt r x r s rs rx Y x/s Ο συντελεστής αυτός Υ X/S δεν παραμένει σταθερός, αλλά αλλάζει, όταν αλλάζουν οι συνθήκες ανάπτυξης. Ο κύριος λόγος είναι, ότι μέρος του υποστρώματος χρησιμοποιείται για συντήρηση των μικροοργανισμών, μέρος για βιοσύνθεση νέων κυττάρων και εκλυόμενων κυτταρικών προϊόντων και μέρος για την παραγωγή ενέργειας (ΑΤΡ). Δηλαδή, το υπόστρωμα καταναλώνεται ως εξής: ΔS = ΔS biomass + ΔS maintenance_energy (biosynthesis & growth_energy) Ρυθμός του ολικού χρησιμοποιηθέντος υποστρώματος = Ρυθμός του υποστρώματος, που χρησιμοποιείται για την παραγωγή βιομάζας + Ρυθμός του υποστρώματος, που χρησιμοποιείται για συντήρηση του κυττάρου Έτσι προκύπτει η διευρυμένη μορφή της κινητικής του Michaelis-Menten για κυτταρικά συστήματα. μ μ K max S [S] [S] m Υ(x/s)max m: συντελεστής συντήρησης (maintenance coefficient) (Mol/g h) Άλλοι συντελεστές απόδοσης, που χρησιμοποιούνται ευρέως, είναι οι εξής: 78

82 ΥΡ/S = ΥΧ/Ο = g g( δημιουργηθέντος ( καταναλωθέντος g ( δημιουργηθείσας g ( καταναλωθέντος προϊόντος) υποστρώματος) βιομαζας) O 2 ) ΔX ΔM ΔP ΔS O2 ΔP/Δt ΔS/Δt O2 r p r s ΔX/Δt ΔM /ΔΔ r x r O2 ( ( r r S P ) Y p/s r rx O2 ) Y x/o Ρυθμοί ανάλωσης υποστρώματος και παραγωγής παραπροϊόντων Ειδικός Ρυθμός Κατανάλωσης Υποστρώματος q S (specific substrate uptake rate) [Mol -S /(h g - drycells)]: Ο ειδικός ρυθμός κατανάλωσης του υποστρώματος S συμβολίζεται με το q S και ισούται με το άθροισμα του ρυθμού κατανάλωσης, που χρησιμοποιείται για (ι) κυτταρική ανάπτυξη (S X), (ιι) παραγωγή προϊόντων (S P j ), και (ιιι) συντήρηση (S ενέργεια συντήρησης): q S μ Y X/S m q P Y P/S Ο ειδικός ρυθμός κατανάλωσης υποστρώματος q S είναι μεταβλητός και έχει μονάδες μέτρησης [Mol -S /(h g -drycells )]. Εάν ο ρυθμός παραγωγής εξωκυτταρικών προϊόντων είναι χαμηλός, η παραπάνω σχέση απλοποιείται ως εξής (Pirt): q S μ Y X / S Επομένως η εξάρτηση του q S από το S είναι παρόμοια (τύπου-monod) του μ από το S. Επίσης παρατηρούμε, ότι ακόμα και όταν ο ρυθμός μικροβιακής ανάπτυξης είναι μηδενικός (μ=0), υπάρχει κατανάλωση υποστρώματος για συντήρηση. m Εάν ορίσουμε τον φαινομενικό συντελεστή απόδοσης (apparent yield coefficient), q S Y μ app X / S καταλήγουμε στη σχέση 1/ Y app X / S m app Y X / S, Y 1 app X / S Y 1 X / S m μ 1/Υ Χ/S 1/μ 79

83 Ο φαινομενικός συντελεστής απόδοσης υπολογίζεται εύκολα, όταν έχουμε πειραματικά δεδομένα της συγκέντρωσης του υποστρώματος (S) και της βιομάζας συναρτήσει του χρόνου (x), εκ των οποίων υπολογίζουμε το q S και μ. Δηλ., μ 1 x dx dt 1 x Δx Δt και q S 1 x ds dt 1 x ΔS Δt app Y X/S μ q S Δx ΔS Επομένως από μία σειρά πειραμάτων, όπου ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης κρατείται σε διαφορετικά επίπεδα (μ 1, μ 2, ), μπορούμε να υπολογίσουμε τον πραγματικό συντελεστή απόδοσης (Y X/S ) και τον συντελεστή συντήρησης (m) με μία γραμμική παλινδρόμηση του 1/ app Y X / S ως προς 1/μ. Τέλος, όταν έχουμε σημαντική έλλειψη υποστρώματος στη φάση της απόπτωσης, πρέπει να λάβουμε υπόψη και τον ενδογενή μεταβολισμό. Η ενέργεια, που απαιτείται για την διατήρηση των κυττάρων, παρέχεται από κύτταρα που «πεθαίνουν». Σε αυτή την περίπτωση η κατανάλωση υποστρώματος είναι λιγότερη Μικροβιακή ανάπτυξη σε συνεχή καλλιέργεια (continuous culture) Συνεχής καλλιέργεια είναι αυτή, που αναπτύσσεται σε ανοιχτό περιβάλλον σε βιοαντιδραστήρα (bioreactor ή χημειοστάτη chemostat) με ρύθμιση της ταχύτητας ροής του εισερχομένου θρεπτικού διαλύματος και ρύθμιση της ταχύτητας ροής των εξερχόμενων κυττάρων και του μη χρησιμοποιηθέντος θρεπτικού διαλύματος. Το υπόστρωμα ρυθμίζει και εδώ την αύξηση της καλλιέργειας. O ρυθμός αραίωσης του υποστρώματος D (h -1 ) είναι το μέτρο του ρυθμού των μεταβολών του όγκου της καλλιέργειας, που επιτελούνται στην μονάδα του χρόνου και αντιστοιχεί με τον ειδικό ρυθμό αύξησης του οργανισμού κάτω από κατάλληλες συνθήκες. F D V F: ρυθμός ροής του υποστρώματος και V: όγκος της καλλιέργειας. 1/D: ο μέσος χρόνος διαμονής του οργανισμού στο δοχείο καλλιέργειας. Σε σχέση με την συγκέντρωση της βιομάζας: Ρυθμός αλλαγής της συγκέντρωσης της βιομάζας στο δοχείο καλλιέργειας dx dt = Ρυθμός παραγωγής βιομάζας (αύξηση) + Ρυθμός απομάκρυνσης βιομάζας (έκπλυση) dx dx S μ x - D x D dt dt Ks S μ D dx dt θετικό μ - D x x μmax μ D dx dt αρνητικό μ D dx dt 0 δυναμικήισορροπία 80

84 Σε σχέση με την συγκέντρωση του υποστρώματος, που περιορίζει την αύξηση στο δοχείο καλλιέργειας: Ρυθμός αλλαγής της συγκέντρωσης του υποστρώματος, που περιορίζει την αύξηση στο δοχείο καλλιέργειας = Ρυθμός εισόδου νέου υποστρώματος - Ρυθμός απoμάκρυνσης του υποστρώματος (έκπλυση) - Ρυθμός χρησιμοποίησης του υποστρώματος από τον οργανισμό (παραγωγή) ds dt D S R μ x - D S Y ds D dt R x/s Yx/s S μ x - S όπου S R είναι η αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, που τροφοδοτεί το δοχείο καλλιέργειας μ D μ D μ D ds dt ds dt ds dt θετικό αρνητικό 0 δυναμικήισορροπία Οι συνθήκες ισορροπίας ροής (steady state phase). Το σύστημα είναι αυτοϊσορροπούμενο και διατηρεί σταθερές τιμές για την συγκέντρωση της βιομάζας και του υποστρώματος μέσα στο δοχείο καλλιέργειας για όσο χρόνο ο ρυθμός αραίωσης διατηρείται σταθερός. Σε συνθήκες δυναμικής ισορροπίας ισχύει: μ = D, dx/dt = 0 και ds/dt = 0. dx dt x μ max S D 0 Ks S D μ S Ks S Επειδή ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης μ max και η σταθερά κορεσμού K s είναι σταθερές, η συγκέντρωση του υποστρώματος S, που περιορίζει την αύξηση για έναν συγκεκριμένο οργανισμό, εξαρτάται μόνο από τον ρυθμό αραίωσης D και είναι ανεξάρτητο από την αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, που τροφοδοτεί το δοχείο καλλιέργειας S R. Όταν ο ρυθμός αραίωσης D αυξάνεται, μειώνεται η συγκέντρωση του υποστρώματος S και η συγκέντρωση της βιομάζας. Η συγκέντρωση του υποστρώματος, που περιορίζει την αύξηση στο δοχείο καλλιέργειας, διαμορφώνεται ως εξής σε συνθήκες δυναμικής ισορροπίας: max και Ks S (μmax D) ds dt D μ x Yx/s SR - S 0 X Y SR - S 81

85 Σε συνθήκες δυναμικής ισορροπίας η συγκέντρωση της βιομάζας Χ εξαρτάται από την συγκέντρωση του υποστρώματος S, την αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, που τροφοδοτεί το δοχείο καλλιέργειας S R και τον συντελεστή απόδοσης ανάπτυξης Υ X/S. Ο κρίσιμος ρυθμός αραίωσης D crit είναι αυτός, που κάτω από την τιμή του οποίου είναι δυνατές οι συνθήκες δυναμικής ισορροπίας της καλλιέργειας (για κάθε διαφορετική τιμή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης μ) και πάνω από την τιμή του οποίου συμβαίνει έκπλυση της καλλιέργειας. Ο κρίσιμος ρυθμός αραίωσης D crit επιτυγχάνεται, όταν S = S R και υπολογίζεται ως ακολούθως: D crit μ max S Ks S R Εάν η σταθερά κορεσμού K s << S R τότε η εξίσωση απλοποιείται: Dcrit μmax Ο κρίσιμος ρυθμός αραίωσης D crit δεν είναι σταθερός, αντίθετα με τον μέγιστο ρυθμό ανάπτυξης μ max, και εξαρτάται από τον τύπο του οργανισμού και την αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, που βρίσκεται σε περιοριστικές συνθήκες. 82

86 11. Μέτρηση της μικροβιακής ανάπτυξης Η ανάπτυξη, των βακτηρίων σε στερεά θρεπτικά υλικά ακολουθεί τους ίδιους κανόνες με την ανάπτυξη των βακτηρίων σε υγρά θρεπτικά υλικά. Από ένα βακτήριο αόρατο με γυμνό οφθαλμό, κατόπιν διχοτομήσεων, παράγεται άθροισμα μικροβιακών κυττάρων που καλείται "αποικία". ΑΠΟΙΚΙΑ = C.F.U. = Colony Forming Unit = Μονάδα σχηματισμού αποικίας Η ανάπτυξη εξαρτάται από το είδος του μικροβιακού κυττάρου, το θρεπτικό υπόστρωμα, τη θερμοκρασία, το pη και άλλους παράγοντες στο στερεό θρεπτικό υλικό. Το σχήμα, η χροιά, η σύσταση της αποικίας στο στέρεο θρεπτικό υλικό αποτελούν χαρακτηριστικά διάκρισης του μικροβιακού είδους (εικόνα 52). Α Β Εικόνα 55: Staphylococcus aureus. Α) Καλλιέργεια σε αιματούχο άγαρ, Β) Μικροσκόπηση μετά από χρώση Gram. Οι αποικίες του S. aureus Gram (+) εμφανίζονται σε σωρούς με μορφολογία «τσαμπιών» σταφυλιού. Άμεσος προσδιορισμός Ο άμεσος προσδιορισμός της μικροβιακής ανάπτυξης σε ένα δείγμα περιλαμβάνει την καταμέτρηση του ολικού αριθμού των μικροβιακών κυττάρων που έχουν αναπτυχθεί σε αυτό. 1. Μικροσκοπικά (μέτρηση ζώντων και νεκρών κυττάρων) Η μικροσκοπική καταμέτρηση γίνεται σε ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα τύπου Petroff- Hausser ή Thoma ή Neubauer Counting Cell. Αυτές οι πλάκες σχηματίζουν 25 μικρά τετραγωνίδια γνωστού όγκου ( cm 3 ). H εκτίμηση του αριθμού των κυττάρων υπολογίζεται με πολλαπλασιασμό του συντελεστή 1, με τον αριθμό των κυττάρων, που μετράται κάτω από το μικροσκόπιο, και υπολογίζεται ανά ml καλλιέργειας. 83

87 Εικόνα 56: Απαρίθμηση σε αντικειμενοφόρο πλάκα Το πλεονέκτημα του άμεσου προσδιορισμού με μικροσκοπική καταμέτρηση είναι ότι δεν απαιτείται επώαση και απώλεια χρόνου. Εντούτοις, υπάρχουν σημαντικοί περιορισμοί όπως: 1. δεν γίνεται διαχωρισμός νεκρών και ζώντων κυττάρων. 2. μικρού μεγέθους κύτταρα δεν είναι ευδιάκριτα. 3. Απαιτείται μικροσκόπιο αντίθετης φάσης. 4. Κύτταρα, που κινούνται είναι δύσκολο να καταμετρηθούν. 5. Απαιτείται συγκέντρωση κυττάρων > 10 6 /ml. 2. Μέτρηση ζώντων κυττάρων Ο προσδιορισμός των βιώσιμων κυττάρων ενός πληθυσμού καθορίζεται από τα κύτταρα, που είναι ικανά να διπλασιαστούν και να δώσουν νέα θυγατρικά. Πραγματοποιείται με καταμέτρηση των αποικιών επί τριβλίου. Η μονάδα μέτρησης είναι σε βιώσιμες μονάδες, που έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες (CFU = colony forming units). Για αξιόπιστα αποτελέσματα απαιτείται η καταμέτρηση αποικιών ανά τριβλίο. Εικόνα 57: CFU μικροοργανισμών σε τριβλίο Petri 3. Μέτρηση ζώντων κυττάρων με διήθηση με μεμβράνες Χρησιμοποιείται για δείγματα με πολύ μικρό αριθμό κυττάρων. Τα κύτταρα συγκρατούνται σε ηθμομεμβράνες με μέγεθος πόρων 0,45 μm και εν συνεχεία επωάζονται σε τριβλία με στερεά υποστρώματα μέχρις ότου σχηματιστούν αποικίες, που μπορούν να καταμετρηθούν. Εικόνα 58: Μέτρηση αποικιών σε μεμβράνες πόρων 0,45μm 84

88 Έμμεσος προσδιορισμός Κατά τον έμμεσο προσδιορισμό υπολογίζεται η βιομάζα των μικροοργανισμών, η οποία συμβαδίζει με την κυτταρική ανάπτυξη. 1. Προσδιορισμός της οπτικής πυκνότητας του αιωρήματος της βιομάζας Τα μικροβιακά κύτταρα απορροφούν ακτινοβολία σε ορισμένο μήκος κύματος. Η απορρόφηση είναι ανάλογη με τον αριθμό των μικροβίων. Η θολερότητα μετράται σε φασματοφωτόμετρο συνήθως στα 560 nm μήκος κύματος. Το αποτέλεσμα καταγράφεται σαν απορρόφηση ή οπτική πυκνότητα (OD = optical density). Εκφράζεται σε μονάδες οπτικής πυκνότητας, που μπορούν να απεικονισθούν λογαριθμικά σε γραφική παράσταση. Εικόνα 59: Υγρή καλλιέργεια E. coli 2. Προσδιορισμός του ξηρού βάρους ανά ml καλλιέργειας. Προσδιορίζεται μετά από συμπύκνωση με φυγοκέντρηση ή διήθηση και ξήρανση του ιζήματος σε C για ώρες για βακτήρια ή 24 ώρες για μύκητες. Εκφράζεται σαν mg ξηρής βιομάζας ανά ml αρχικής καλλιέργειας. 85

89 12. Μικροοργανισμοί ως βιογεωχημικοί παράγοντες Η βιολογική ανακύκλωση της ύλης πραγματοποιείται με τη συμβολή των μικροοργανισμών. Οι μικροοργανισμοί είναι υπεύθυνοι για την συνέχιση της ζωής στον πλανήτη μας και την ανακύκλωση των βασικών χημικών στοιχείων, όπως ο άνθρακας, το υδρογόνο, το άζωτο, ο φώσφορος και το θείο, με την αποικοδόμηση του νεκρού οργανικού υλικού και την επαναφορά των ανόργανων συστατικών στους φυσικούς οργανικούς κύκλους. Τα χημικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για κάθε έμβιο οργανισμό διακρίνονται σε μακροθρεπτικά και μικροθρεπτικά ή ιχνοστοιχεία. Στην πρώτη κατηγορία εντάσσονται τα στοιχεία που απαιτούνται σε μεγάλες ποσότητες για τη δημιουργία της ζώσας ύλης και χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι C, H, O, N. Η πρόσληψή τους γίνεται άμεσα ή έμμεσα από την ατμόσφαιρα σε αέρια μορφή. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν στοιχεία που απαιτούνται σε πολύ μικρές ποσότητες, όπως είναι Fe, Cu, Zn. Δεδομένου ότι οι διαθέσιμες προμήθειες όλων των θρεπτικών στοιχείων εξαντλούνται γίνεται αντιληπτό ότι η λειτουργία των οικοσυστημάτων & των οργανισμών εξαρτάται από την κυκλοφορία αυτών των στοιχείων, η οποία πραγματοποιείται μέσω των βιογεωχημικών κύκλων. Οι βιογεωχημικοί κύκλοι είναι ουσιαστικά η ανταλλαγή των χημικών στοιχείων με τη συμμετοχή των βιοτικών και αβιοτικών συστατικών του οικοσυστήματος. Γενικά, το σύνολο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ εδάφους και ατμόσφαιρας γίνεται με τη συμβολή των μικροοργανισμών, οι οποίοι με τη σειρά τους, διαμέσου των διαδικασιών γέννησης, ανάπτυξης και θανάτου υποβοηθούν στη διακίνηση των θρεπτικών στοιχείων. Ουσιαστικά, το έργο των μικροοργανισμών έγκειται στη μετατροπή των στοιχείων σε μορφές, οι οποίες δύνανται να χρησιμοποιηθούν από ζώα και φυτά. Τα βασικά μέρη των βιογεωχημικών κύκλων είναι η δεξαμενή αποθήκευσης και η δεξαμενή ανταλλαγής. Η δεξαμενή αποθήκευσης (αποθέματα) θεωρείται η ποσότητα κάποιας χημικής ένωσης ή στοιχείου που βρίσκεται αποθηκευμένη σε βιοτικά και αβιοτικά στοιχεία του οικοσυστήματος. Η δεξαμενή ανταλλαγής μεταξύ βιοτικών και αβιοτικών μερών του οικοσυστήματος (ρυθμός μεταφοράς) είναι η ποσότητα του στοιχείου ή χημικής ένωσης που μεταφέρεται από ένα απόθεμα σε άλλο στη μονάδα του χρόνου και στη μονάδα επιφάνειας ή όγκου εντός του οικοσυστήματος. Δύο βασικοί τύποι βιογεωχημικών κύκλων είναι οι αέριοι και οι ιζηματογενείς. Στους αέριους δεξαμενή αποθήκευσης είναι η ατμόσφαιρα και τα θρεπτικά εισέρχονται κι εξέρχονται από τη βιόσφαιρα σε αέρια μορφή. Στους ιζηματογενείς κύκλους δεξαμενή αποθήκευσης είναι ο φλοιός της γης και τα θρεπτικά εισέρχονται στη βιόσφαιρα από τα πετρώματα που αποσαθρώνονται κι εξέρχονται ως ιζήματα. Κύκλος του άνθρακα Ο άνθρακας είναι το χημικό στοιχείο με βάση το οποίο δομούνται όλες οι οργανικές ενώσεις και συνεπώς όλα τα βιολογικά μακρομόρια. Η πορεία του άνθρακα στα οικοσυστήματα ακολουθεί τη ροή της ενέργειας σ' αυτά, για τον απλό λόγο ότι η χημική ενέργεια που μεταβιβάζεται από το ένα τροφικό επίπεδο στο άλλο είναι δεσμευμένη στις οργανικές ενώσεις. Ο κύκλος του άνθρακα σχετίζεται με δύο βασικές μεταβολικές διαδικασίες, τη φωτοσύνθεση και την αναπνοή. Κατά τη φωτοσύνθεση προσλαμβάνεται το διοξείδιο του άνθρακα προκειμένου να 86

90 χρησιμοποιηθεί στην παραγωγή γλυκόζης και κατά την κυτταρική αναπνοή οξειδώνεται η γλυκόζη και επιστρέφει το διοξείδιο του άνθρακα στην ατμόσφαιρα. Η συμμετοχή των μικροοργανισμών στον κύκλο του άνθρακα εστιάζεται στην τέλεση της κυτταρικής αναπνοής και στο μεταβολισμό των οργανικών ενώσεων. Επιπλέον, η νεκρή οργανική ύλη οξειδώνεται από τους αποικοδομητές, οι οποίοι είναι κυρίως βακτήρια και μύκητες. Η έννοια του νεκρού οργανικού υλικού περιλαμβάνει το «χούμο», ο οποίος είναι μίγμα οργανικών υλικών από συστατικά φυτών και μικροοργανισμών του εδάφους, τα οποία αποσυντίθενται βραδέως. Ο χούμος βρίσκεται στα επιφανειακά στρώματα του εδάφους και προέρχεται από συνεχείς διεργασίες αποσύνθεσης και σύνθεσης νέων ουσιών. Κατά το σχηματισμό του χούμου παρατηρούνται δύο κύριες διεργασίες: α) η διάσπαση της αρχικής οργανικής ουσίας σε ορυκτά συστατικά και β) η σύνθεση νέων πολύπλοκων χουμικών ενώσεων (χουμοποίηση). Οι αντιδράσεις που τελούν οι διάφοροι μικροοργανισμοί ανάλογα με την κατηγορία στην οποία ανήκουν είναι οι εξής: Οξυγονογενείς φωτότροφοι οργανισμοί nco 2 + nh 2 O (CH 2 O) n + no 2 Ετερότροφοι μικροοργανισμοί (CH 2 O) n + no 2 nco 2 + nh 2 O Αερόβιοι μικροοργανισμοί μετατροπή οργανικού C σε CO 2 Αναερόβιοι μικροοργανισμοί μετατροπή οργανικού C σε CH 4 & CO 2 (βιοαέριο). Εικόνα 60: Ο κύκλος του άνθρακα O φωτοσυνθετικά δεσμευόμενος άνθρακας τελικά αποικοδομείται από μικροοργανισμούς & προκύπτουν ενώσεις που ανήκουν σε 2 μείζονες καταστάσεις οξείδωσης 4 2 Τα δύο αυτά αέρια δημιουργούνται από τη δράση των μεθανιογόνων ή διαφόρων χημειοργανοτροφικών οργανισμών μέσω της ζύμωσης, της αναερόβιας & της αερόβιας αναπνοής. To μεθάνιο είναι αδιάλυτο και μεταφέρεται εύκολα σε οξυγονούχο περιβάλλον όπου οξειδώνεται σε CO 2 από τα μεθανιότροφα. Επισημαίνεται ότι η ισορροπία μεταξύ οξειδωτικών 87

91 & αναγωγικών τμημάτων του κύκλου του άνθρακα είναι κρίσιμη, καθώς τα προϊόντα μεταβολισμού ορισμένων οργανισμών αποτελούν υποστρώματα για κάποιους άλλους. Εικόνα 61: Οξειδοαναγωγικός κύκλος του άνθρακα Η σημασία του κύκλου του άνθρακα έγκειται α) στη δέσμευση διοξειδίου του άνθρακα, το οποίο είναι απαραίτητο για τη φωτοσύνθεση και την επιβίωση φωτοσυνθετικών αυτότροφων οργανισμών και μέσω αυτών όλων των υπολοίπων και β) στην τέλεση της αναπνοής, η οποία οδηγεί στην παραγωγή υδρατμών και τη διατήρηση θερμοκρασίας στην ατμόσφαιρα. Μεθανιογένεση: Η μεθανιογένεση βιολογικής προέλευσης και το μεθάνιο έχουν καθοριστική σημασία για τη ροή άνθρακα στα περισσότερα ανοξικά ενδιαιτήματα. Η ίδια επιτελείται από τα μεθανιογόνα βακτήρια (ομάδα Αρχαίων), τα οποί είναι αυστηρώς αναερόβια και τα περισσότερα χρησιμοποιούν ως τελικό δέκτη ηλεκτρονίων στην αναερόβια αναπνοή το CO 2 ανάγοντάς το σε μεθάνιο με τη χρήση Η 2. Εκτός από το CO 2 ελάχιστες ενώσεις μπορούν να μετατραπούν σε CΗ 4 από τα μεθανιογόνα, εκ των οποίων η κυριότερη είναι το οξικό. Καθίσταται εμφανές ότι επιβάλλεται συνδυασμένος μεταβολισμός, διαμέσου του οποίου επιτυγχάνεται η δράση πολλών διαφορετικών ειδών αναερόβιων συμβιωτικών μικροοργανισμών (οξεογόνων, οξικογόνων και μεθανιογόνων). Οι οξεογόνοι μικροοργανισμοί διασπούν μακρομόρια σε χαμηλομοριακά οργανικά οξέα, αλκοόλες, οξικό οξύ, CO 2 και H 2. Οι οξικογόνοι μικροοργανισμοί μετατρέπουν τα χαμηλομοριακά οργανικά οξέα σε οξικό οξύ, CO 2 και H 2. Οι μεθανιογόνοι μικροοργανισμοί μετατρέπουν το οξικό οξύ (ετερότροφοι) ή το CO 2 και το H 2 (αυτότροφοι) σε μεθάνιο. Αλληλεπιδράσεις στην συμβίωση οξεογόνων, οξικογόνων και μεθανιογόνων μικροοργανισμών: Οι οξεογόνοι, οξικογόνοι και μεθανιογόνοι μικροοργανιασμοί συμμετέχουν στην αναερόβια κατεργασία λυμάτων στις μονάδες βιολογικού καθαρισμού και αποτελούν την αναερόβια ενεργό ιλύ. Πρόκειται για υποχρεωτικά συμβιωτικούς μικροοργανισμούς, πολλοί από τους οποίους τείνουν στο σχηματισμό συσσωματωμάτων, κόκκων ή τολύπων. 88

92 Σύνθετα πολυμερή μακρομόρια Υδρόλυση από μικροβιακά ένζυμα ή ζύμωση με οξεογόνα βακτήρια Ζύμωση μέσω οξικογόνων βακτηρίων Μονομερή (σάκχαρα, λιπαρά και άλλα οργανικά οξέα) Ζύμωση Οξικό οξύ H 2 + CO 2 Μεθανιογένεση CH 4 + CO 2 CH 4 Εικόνα 62: Παραγωγή μεθανίου από σύνθετα πολυμερή. Κύκλος του αζώτου Το άζωτο αποτελεί ένα σημαντικό χημικό στοιχείο για τη ζωή, καθώς είναι συστατικό πολλών βιομορίων και απαιτείται από τους οργανισμούς για την σύνθεση πρωτεϊνών, νουκλεοτιδίων και άλλων αζωτούχων ενώσεων, όπως είναι τα φωσφολιπίδια. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα και η πλειοψηφία των μικροοργανισμών δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν το μοριακό άζωτο της ατμόσφαιρας (Ν 2 ). Έτσι, ενώ αφθονεί στην ατμόσφαιρα, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί πρέπει να μετατραπεί σε αξιοποιήσιμες μορφές, διαδικασία που γίνεται μέσω της αζωτοδέσμευσης. Η αζωτοδέσμευση διεξάγεται μέσω της ατμόσφαιρας και μέσω μικροοργανισμών. Όσον αφορά στους μικροοργανισμούς, πραγματοποιείται η βιολογική αζωτοδέσμευση από ελεύθερους ή συμβιωτικούς μικροοργανισμούς. Σημαντικότερα αζωτοδεσμευτικά βακτήρια είναι αυτά που ζουν συμβιωτικά στις ρίζες των ψυχανθών (όπως είναι το τριφύλλι, η μπιζελιά, η φασολιά, η φακή, η σόγια) σε ειδικά εξογκώματα (φυμάτια). Αυτά τα βακτήρια έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν το ατμοσφαιρικό άζωτο και να το μετατρέπουν σε νιτρικά ιόντα, τα οποία μπορούν να απορροφηθούν από τα ψυχανθή. Η βιολογική αζωτοδέσμευση κατέχει το 90% της συνολικής αζωτοδέσμευσης. Κατά τη βιολογική αζωτοδέσμευση συμμετέχουν βακτήρια των γενών Αzotobacter ή Rhizobium, Nitrosomonas, Nitrobacter. Η νιτροποίηση περιλαμβάνει τη διαδικασία κατά την οποία η αμμωνία που συγκεντρώνεται στο έδαφος, υφιστάμενη τη δράση των νιτροποιητικών βακτηρίων του εδάφους, μετατρέπεται τελικά σε νιτρικά ιόντα τα οποία παραλαμβάνονται από τα φυτά. Η νιτροποίηση της αμμωνίας πραγματοποιείται από αερόβια Ν- 89

93 - οξειδωτικά βακτήρια. Η οξείδωση της αμμωνίας σε ΝΟ 2 γίνεται από βακτήρια των γενών: Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus & Nitrosovibrio.Η περαιτέρω μετατροπή των ΝΟ - 2 σε ΝΟ - 3 γίνεται από τα βακτήρια των γενών: Nitrobacter, Nitrospira & Nitrococcus. Τα πλέον σημαντικά νιτροποιητικά βακτήρια ανήκουν στα γένη Nitrosomonas και Nitrobacter. Τα νιτροποιητικά βακτήρια είναι χημειολιθότροφα και αποκτούν την απαιτούμενη ενέργεια για την ανάπτυξή τους από την οξείδωση ανόργανων ενώσεων και τον άνθρακα από το CO 2 (κύκλος φωσφορικών πεντοζών). Χαρακτηριστικό τους στοιχείο είναι η βραδεία ανάπτυξη σε υδατική καλλιέργεια και η ακόμα πιο αργή ανάπτυξη τους στο έδαφος. Το ευνοϊκό ph κυμαίνεται από 7 έως 9. Σε τιμές ph μικρότερες από 6 παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξής τους, ενώ η ευνοϊκή θερμοκρασία είναι στο εύρος C. Εκτός από την αυτότροφη νιτροποίηση υπάρχει και η ετερότροφη, η οποία επιτελείται από μύκητες, ακτινομύκητες και βακτήρια. Η απονιτροποίηση πραγματοποιείται από τα απονιτροποιητικά βακτήρια (δυνητικά αναερόβια βακτήρια - π.χ. Pseudomonas aeruginosa) με τη μετατροπή των νιτρικών ιόντων σε μοριακό άζωτο, το οποίο επιστρέφει στην ατμόσφαιρα. (1) ΝΟ 3 - (1) = αναγωγάση νιτρικού. ΝΟ 2 - Ν 2 Ο Ν 2 Η απονιτροποίηση έχει αρνητικές επιπτώσεις στη γεωργία, αφού ουσιαστικά έχουμε απώλεια λιπάσματος. Εντούτοις, είναι απαραίτητη στην επεξεργασία αποβλήτων, ειδάλλως δημιουργούμε συνθήκες ευτροφισμού στον τελικό αποδέκτη των επεξεργασμένων λυμάτων, π.χ. λίμνες, ποτάμια. Τα πλέον συχνά απονιτροποιητικά βακτήρια είναι τα Azotospirillium lipoferum & Rhizobium japonicum. Συνοπτικά, οι διαδικασίες που πραγματοποιούνται στο κύκλο του αζώτου είναι οι εξής: Ν 2 (Αzotobacter ή Rhizobium σε συμβίωση με τις ρίζες των ψυχανθών) NH 3 (Nitrosomonas) NO 2 (Nitrobacter) NO 3 (denitrifying bacteria, Paracoccus denitrificans) Ν 2 Εικόνα 63: Ο κύκλος του αζώτου στο νερό 90

94 Νιτροποιητικά βακτήρια Ελεύθεροι μικροοργανισμοί Αποικοδομητές (βακτήρια και μύκητες του εδάφους) Αζωτοδεσμευτικοί οργανισμοί Απονιτροποιητικά βακτήρια Συμβιωτικοί μικροοργανισμοί. (πχ αζωτοδεσμευτικά βακτήρια στις ρίζες των ψυχανθών) Εικόνα 64: Μικροοργανισμοί που συμμετέχουν στον κύκλο του αζώτου Κύκλος του θείου Το θείο κυκλοφορεί στην ατμόσφαιρα από φυσικές (εκρήξεις ηφαιστείων, αποικοδόμηση οργανικής ύλης) & ανθρώπινες δραστηριότητες (καύση ορυκτών). Το διοξείδιο του θείου των ανωτέρων στρωμάτων ατμόσφαιρας ενώνεται με υδρατμούς και προκαλεί το φαινόμενο της όξινης βροχής. Το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία πολύ χαμηλού ph στο έδαφος, το οποίο με τη σειρά του προκαλεί αύξηση διαλυτότητας των μετάλλων. Τα τελευταία περνούν στις τροφικές αλυσίδες με κίνδυνο εξαφάνισης ολόκληρων πληθυσμών και καταστροφής της βλάστησης. Στον κύκλο του θείου συμμετέχουν αερόβιοι χημειοαυτότροφοι μικροοργανισμοί, οι οποίοι χρησιμοποιούν σαν ηλεκτρονιακούς δότες ανηγμένες ενώσεις θείου (όπως υδρόθειο (H 2 S), μοριακό θείο (S 0 ) και διθειικού (S 2 O 3-2 ) και σιδήρου (ενώσεις με Fe +2 ). Το τελικό προϊόν της βιοχημικής αντίδρασης των ενώσεων του θείου είναι το θειικό ιόν (SO 4-2 ), που οδηγεί στη δημιουργία όξινου περιβάλλοντος (ph < 2). Σημαντικά θειοβακτήρια είναι τα Thiobacillus thiooxidans & Thiobacillus ferrooxidans. Πολλά από αυτά εναποθέτουν ενδοκυττάρια μοριακό θείο σαν ενεργειακό απόθεμα. Εικόνα 65: Οξειδοαναγωγικός κύκλος του θείου 91

95 13. Μικροβιολογία υδάτινου περιβάλλοντος (Νερό λύματα) Τα φυσικά νερά περιέχουν ένα μεγάλο αριθμό μικροοργανισμών. Οι περισσότεροι αποτελούν μέρος της φυσικής χλωρίδας του νερού. Άλλοι καταλήγουν στα φυσικά νερά μέσω φυσικών φαινομένων (βροχές, κατολισθήσεις κλπ) και άλλοι μέσω των ανθρωπίνων δραστηριοτήτων (απόβλητα, αστικά λύματα κλπ). Αν θέλουμε να κατατάξουμε τους μικροοργανισμούς των νερών σε σχέση με την επίδραση τους στον ανθρώπινο οργανισμό μπορούμε να τους χωρίσουμε σε τρεις κατηγορίες: α) τους μικροοργανισμούς που συμβιώνουν με τον άνθρωπο και έχουν θετική επίδραση στον ανθρωπινό μεταβολισμό. Αν αυτοί αποικήσουν το σώμα του ανθρώπου θα αποτελέσουν μέρος της φυσικής χλωρίδας του σώματος. β) τους παθογόνους μικροοργανισμούς που αν βρουν οδούς εισόδου και μηχανισμούς εγκατάστασης στο σώμα μπορούν να προκαλέσουν νόσο. Σε ορισμένες περιπτώσεις οι παθογόνοι μικροοργανισμοί εγκαθίστανται στον οργανισμό αλλά δεν προκαλούν νόσο. Οι άνθρωποι που αποικίζονται από τέτοιους μικροοργανισμούς καλούνται φορείς και παρόλο που οι ίδιοι δεν νοσούν, μπορούν να μεταδώσουν νόσο σε αλλά άτομα. γ) τους δυνητικά παθογόνους μικροοργανισμούς, οι οποίοι μπορεί να αποτελούν φυσική χλωρίδα για ορισμένους ανθρώπους και να είναι παθογόνοι για ορισμένες κατηγορίες του πληθυσμού (παιδιά, ασθενείς, υπερήλικες, ανοσοκατεσταλμένοι). Επειδή λοιπόν μέσω του νερού ο άνθρωπος μπορεί να έρθει σε επαφή με μικροοργανισμούς οι οποίοι ίσως έχουν επίδραση στην υγεία του έχει σημασία να γνωρίζει κανείς τις βασικές αρχές του μεταβολισμού αυτών των μικροοργανισμών και τον τρόπο με τον οποίο μπορούν να μεταδοθούν στον άνθρωπο μέσω του νερού. Μικροβιολογική ποιότητα υδάτων Η διατήρηση της μικροβιολογικής ποιότητας του υδάτινου περιβάλλοντος είναι υψίστης σημασίας δεδομένων των κινδύνων που ενέχονται για τη δημόσια υγεία. Τα υδάτινα συστήματα (πόσιμο νερό, νερά αναψυχής) πρέπει να πληρούν ορισμένες προδιαγραφές όσον αφορά στο μικροβιολογικό φορτίο που φέρουν, ώστε να διασφαλίζεται η ανθρώπινη υγεία. Η μικροβιολογική ποιότητα των υδάτων αξιολογείται με την ανίχνευση της κοπρανώδους μόλυνσης, με τον έλεγχο της παρουσίας και συγκέντρωσης συγκεκριμένων μικροοργανισμών - δεικτών. Τέτοιοι μικροοργανισμοί - δείκτες είναι τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή, η Escherichia coli και οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι. Η παρουσία τους σχετίζεται άμεσα με κοπρανώδες υλικό ποικίλης προέλευσης, το οποίο μπορεί να αποτελέσει ουσιώδες υγειονομικό και περιβαλλοντικό πρόβλημα, λαμβάνοντας υπόψη ότι μπορεί να περιέχει παθογόνα βακτήρια, πρωτόζωα και ιούς. Η κοπρανώδης μόλυνση των υδάτων υποβαθμίζει την ποιότητά τους, θέτει σε κίνδυνο τη δημόσια υγεία, είτε αφορά πόσιμο είτε νερό αναψυχής, ενώ παράλληλα έχει και σοβαρές οικονομικές προεκτάσεις. Η μόλυνση κάποιου υδάτινου συστήματος καθιστά άμεση και απαραίτητη την υπόδειξη μέτρων εξυγίανσης, τα οποία πρέπει να τεθούν σε εφαρμογή για την αντιμετώπιση του εκάστοτε προβλήματος. 92

96 Οι μικροοργανισμοί Δείκτες οφείλουν να πληρούν ορισμένους όρους : Ο μικροοργανισμός θα πρέπει να είναι κατάλληλος για όλους τους τύπους υδάτων Ο μικροοργανισμός θα πρέπει να είναι παρών όποτε υπάρχουν εντερικά παθογόνα Ο μικροοργανισμός θα πρέπει να έχει μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης από το πιο ανθεκτικό εντερικό παθογόνο Ο μικροοργανισμός δεν θα πρέπει να αναπτύσσεται στο νερό Η μέθοδος ανάλυσης θα πρέπει να είναι απλή στην εφαρμογή της Η πυκνότητα του μικροοργανισμού-δείκτη θα πρέπει να σχετίζεται άμεσα με το βαθμό της κοπρανώδους μόλυνσης Ο μικροοργανισμός θα πρέπει να είναι μέλος της εντερικής μικροχλωρίδας θερμόαιμων ζώων Για τον έλεγχο της μικροβιολογικής ποιότητας των νερών χρησιμοποιούνται οι παρακάτω βακτηριακοί δείκτες: 1) Oλικά κολοβακτηριοειδή 2) Kοπρανώδη κολοβακτηριοειδή 3) Kοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι. Ολικά κολοβακτηριοειδή Total coliforms Περιλαμβάνουν όλα τα αερόβια και προαιρετικώς αναερόβια Gram αρνητικά μη σπορογόνα βακτηρίδια τα οποία ζυμώνουν την λακτόζη και παράγουν αέριο όταν επωασθούν στους 37 ο C για 48 ώρες. Περιλαμβάνουν τα γένη Escherichia, Citrobacter, Klebsiella και Enterobacter. Όλοι αυτοί οι μικροοργανισμοί δεν αποικίζουν απαραιτήτως τον γαστρεντερικό σωλήνα των θερμόαιμων ζώων γι αυτό ο δείκτης αυτός έχει τεθεί υπό αμφισβήτηση και αρκετοί ερευνητές δεν τον χρησιμοποιούν πλέον για τον έλεγχο της κοπρανώδους μόλυνσης των νερών. Εικόνα 66: Αποικίες ολικών κολοβακτηριοειδών 93

97 Μειονεκτήματα/προβλήματα χρήσης των ολικών κολοβακτηριοειδών ως δεικτών ποιότητας υδάτων Ανάπτυξη στο υδάτινο περιβάλλον Ανάπτυξη στα συστήματα ύδρευσης Αναστολή ανάπτυξης σε περίπτωση μεγάλου βακτηριακού πληθυσμού στο δείγμα Η καταμέτρησή τους δεν είναι ενδεικτική για τον κίνδυνο που προκαλείται για τη δημόσια υγεία Δεν έχουν σαφή συσχέτιση με την παρουσία πρωτόζωων & ιών Κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή Fecal coliforms Αποτελούν υποομάδα των ολικών κολοβακτηριοειδών και βρίσκονται κυρίως στον γαστρεντερικό σωλήνα των θερμόαιμων ζώων. Διαφέρουν από τα ολικά κολοβακτηριοειδή από την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε υψηλές θερμοκρασίες. Το συχνότερο μέλος αυτής της ομάδας είναι το Escherichia coli αλλά δυνατόν να περιλαμβάνει και διάφορα είδη Klebsiella ή Enterobacter. Εscherichia coli Πρόκειται για ευρέως διαδεδομένο μικροοργανισμό αφού είναι το κυρίαρχο δυνητικά αναερόβιο βακτήριο της ανθρώπινης εντερικής χλωρίδας. Ο ανθρώπινος εντερικός σωλήνας αποτελεί το φυσικό περιβάλλον του μικροοργανισμού όπου αναπτύσσεται ήδη από την εμβρυική ηλικία του ατόμου, αναπτύσσοντας μια σχέση αμοιβαίας αλληλεξάρτησης. Η E. coli διαβιώνοντας στις εντερικές λάχνες συνήθως δεν αποτελεί κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία, εκτός και αν πρόκειται για εξασθενισμένα και ανοσοκατεσταλμένα άτομα ή όταν ο πληθυσμός του βακτηρίου υπερβεί κάποια ανώτατα όρια. Όσον αφορά στα παθογόνα στελέχη του είδους, αυτά δύνανται να προκαλέσουν μεγάλη ποικιλία εντερικών και εξωεντερικών λοιμώξεων. Είναι Gram αρνητικός, οξειδάση αρνητικός μικροοργανισμός και αποτελεί μέλος της ομάδας των κολοβακτηριοειδών. Παράλληλα, ανευρίσκεται φυσιολογικά στον εντερικό σωλήνα πολλών θερμόαιμων ζώων, όπως είναι τα βοοειδή, τα αιγοπρόβατα, οι χοίροι, οι σκύλοι κ.α. Η παρουσία της στο νερό ή στα τρόφιμα θεωρείται ότι δείχνει την άμεση ή έμμεση κοπρανώδη μόλυνση από λύματα και την πιθανή παρουσία άλλων παθογόνων. Επειδή η μολυσματική δόση του κολοβακτηριδίου είναι μεγάλη, η μετάδοση από άτομο σε άτομο δεν είναι συχνή, ενώ θεωρείται σημαντική η μετάδοση διά των τροφών. Η E. coli είναι από τους οργανισμούς που έχουν ενοχοποιηθεί για πρόκληση υδατογενών λοιμώξεων. Γενικά, η συσχέτιση της παρουσίας στο νερό παθογόνων βακτηρίων του γαστρεντερικού συστήματος με τους δείκτες κοπρανώδους μόλυνσης του νερού είναι πολύ καλή. Για παράδειγμα Salmonella spp. ανιχνεύονται πάντα όταν ο αριθμός των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών ξεπεράσει τα 2000/100ml. Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία υδατογενείς λοιμώξεις έχουν προκληθεί από διάφορους ορότυπους της E. coli όπως είναι τα εντεροτοξινογόνα ETEC, τα εντεροπαθογόνα EPEC, τα εντεροδιεισδυτικά EIEC και πιο σπάνια τα αιμορραγικά στελέχη O157:H. 94

98 Κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι - Εντερόκοκκοι Εικόνα 67: Αποικίες Ε. coli σε TBX medium Η ύπαρξή τους στο νερό σημαίνει την ρύπανσή του από κόπρανα των θερμόαιμων ζώων. Οι S. faecalis και S. faecium φαίνεται να προέρχονται κυρίως από τα ανθρώπινα κόπρανα. Ο S. bovis, S. equinus και S. avium υπάρχουν σε μεγάλες πυκνότητες στα κόπρανα ζώων. Οι εντερόκοκκοι αποτελούν σημαντικό βακτηριακό δείκτη για τον έλεγχο της κοπρανώδους μόλυνσης των επιφανειακών νερών. Εκτός των παραπάνω δεικτών, ο συστηματικός προσδιορισμός των ολικών αερόβιων και προαιρετικώς αναερόβιων ετερότροφων βακτηρίων στο νερό δίνει σημαντικές πληροφορίες ως προς την σταθερότητα της ποιότητάς του. Αυξομειώσεις του ολικού αριθμού της τάξεως των 1-2 λογαρίθμων μπορεί να σημαίνουν προβλήματα στην μονάδα επεξεργασίας του νερού, ανάπτυξη βιολογικού υμενίου (βιοφίλμ) στο δίκτυο, επιμόλυνση της πηγής υδροληψίας κλπ. Για τον πληρέστερο έλεγχο της ποιότητας του πόσιμου και του εμφιαλωμένου νερού στις αντίστοιχες υγειονομικές διατάξεις προτείνονται και άλλοι δείκτες όπως η Ρ. aeruginosa, τα θειοαναγωγικά κλωστηρίδια, καθώς και παθογόνοι μικροοργανισμοί. Πλεονεκτήματα χρήσης των κοπρανωδών στρεπτόκοκκων έναντι των ολικών και κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών Σπανίως αναπτύσσονται στο νερό Είναι περισσότερο ανθεκτικοί σε περιβαλλοντικό στρες και σε μεθόδους απολύμανσης (πχ χλωρίωση) σε σύγκριση με τα κολοβακτηριοειδή Γενικά, παραμένουν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στο περιβάλλον Χρήσιμοι δείκτες για την ποιότητα νερών αναψυχής Χρήσιμοι δείκτες παρουσίας ιών εντερικής προέλευσης στο περιβάλλον Συμπληρωματικοί δείκτες μικροβιολογικής ποιότητας Ολική Μικροβιακή Χλωρίδα (ΟΜΧ) Heterotrophic Plate Count (HPC) Πρόκειται για την εκτίμηση των αερόβιων & δυνητικά αναερόβιων ετερότροφων βακτηρίων στο νερό, τα οποία είναι Gram-αρνητικά βακτήρια που ανήκουν στα ακόλουθα γένη: Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, Flavobacterium, Enterobacter, Citrobacter, 95

99 Acinetobacter, Serratia, Proteus, Alcaligens & Moraxella. Συνήθως απομονώνονται από επιφανειακό & υπόγειο νερό και είναι άφθονα στο έδαφος και στα φυτά. Μερικά μέλη είναι «ευκαιριακά παθογόνα». Στο πόσιμο νερό η ΟΜΧ μπορεί να ποικίλλει από <1 έως >104 CFU/mL. Επηρεάζονται κυρίως από τη θερμοκρασία, το επίπεδο οργανικού φορτίου στο νερό καθώς και από το υπολειμματικό χλώριο. Οι μετρήσεις της ΟΜΧ έχουν μικρή ή και καθόλου σημασία για τη δημόσια υγεία. Ωστόσο, είναι χρήσιμος δείκτης, καθώς εκτιμάται η συνολική εικόνα μικροβιακού φορτίου. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι ενδέχεται να παρατηρηθεί μεγάλη αύξησή τους στο εμφιαλωμένο νερό & στα φίλτρα που χρησιμοποιούνται στις οικιακές βρύσες. Επίσης, υψηλά επίπεδα ΟΜΧ μπορεί να παρεμβαίνουν στις αναλύσεις ολικών & κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Όσον αφορά στα όριά τους δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν τα 500 /ml στο πόσιμο νερό δικτύου. Η επώασή τους πραγματοποιείται στους 37 o C για 48h και στους 25 o C για 72h. Clostridium perfringens To C. perfringens είναι ένα υποχρεωτικά αναερόβιο σπορογόνο βακτηρίδιο του εντέρου και αποτελεί έναν καλό δείκτη κοπρανώδους μόλυνσης. Οι σπόροι του είναι γενικά περισσότερο ανθεκτικοί στις περιβαλλοντικές πιέσεις σε σχέση με τους αερόβιους εντερικούς δείκτες με αποτέλεσμα να επιβιώνουν στο περιβάλλον περισσότερο από τους παθογόνους μικροοργανισμούς. Η ανεύρεσή του δεν αποδεικνύει πρόσφατη περιττωματική μόλυνση. Έχει βρεθεί ότι η καμπύλη επιβίωσης του C. perfringens είναι η ίδια με αυτή του κρυπτοσποριδίου με αποτέλεσμα το βακτηρίδιο αυτό να θεωρείται ένας δείκτης που προλέγει την πιθανή ύπαρξη ζωντανών ωοκύστεων κρυπτοσποριδίου στο νερό. Βακτηριοφάγοι Τρεις τύποι βακτηριοφάγων έχουν προταθεί ως ειδικοί δείκτες ιικής μόλυνσης, οι σωματικοί κολιφάγοι, οι F ειδικοί φάγοι RNA (F-specific) και οι φάγοι του Bacteroides fragilis. Το μέγεθος, η δομή και η επιβίωση αυτών των φάγων είναι παράμετροι όμοιες με αυτές των εντεροϊών. Οι βακτηριοφάγοι είναι ιοί που μολύνουν τα βακτήρια και είναι παρόντες όπου υπάρχουν κολοβακτηριοειδή. Οι κολιφάγοι είναι ιοί που μολύνουν τα κολοβακτηρίδια. Επειδή οι κολιφάγοι δεν αναπαράγονται εκτός του ξενιστή τους και έχουν δεδομένα χαρακτηριστικά επιβίωσης αποτελούν έναν καλό δείκτη κοπρανώδους μόλυνσης. Διακρίνονται σε δύο ομάδες: τους σωματικούς φάγους και τους F ειδικούς φάγους (RNA-F-specific). F ειδικοί φάγοι Οι F ειδικοί φάγοι δεν βρίσκονται συχνά σε ανθρώπους και ζώα. Συχνά ανευρίσκονται στα απόβλητα, πράγμα που συνηγορεί υπέρ του πολλαπλασιασμού τους στο σύστημα αποβλήτων. Οι F-ειδικοί φάγοι προτάθηκαν ως βοηθητικοί δείκτες των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών για την επισήμανση ύπαρξης ιϊκής εντερικής μόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον : α) γιατί είναι πλέον ανθεκτικοί στη χλωρίωση και αδρανοποίηση από περιβαλλοντικούς παράγοντες σε σχέση με τα κολοβακτηριοειδή 96

100 β) η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την αρίθμησή τους είναι άμεση, γρήγορη, φθηνή, εύκολη και ακριβής γ) υπάρχουν σε υψηλές πυκνότητες τόσο στα επεξεργασμένα όσο και στα μη επεξεργασμένα λύματα δ) δεν υπάρχει κίνδυνος να μολυνθούν οι διενεργούντες τον έλεγχό τους όπως συμβαίνει με τον έλεγχο των ιών ε) δεν πολλαπλασιάζονται στα στόμια εκβολής ποταμών. Pseudomonas aeruginosa Είναι ένα βακτήριο πολύ διαδεδομένο. Βρίσκεται στο έδαφος, στο νερό, στα απόβλητα, στα φυτά, στο έντερο των θηλαστικών. Δεν είναι τυπικό βακτήριο του θαλασσινού νερού, αλλά μπορεί να το μολύνει με την απόρριψη σε αυτό νερών άλλης προέλευσης, όπως το νερό των ποταμών κλπ. Προκαλεί δερματίτιδα, λοιμώξεις των αυτιών και των ματιών σε άτομα που κολυμπούν σε νερά που έχουν ρυπανθεί.. Η δερματίτιδα από ψευδομονάδα είναι μία θυλακίτις που συνήθως συνδέεται με P. aeruginosa οροτύπων 09 ή 011. Η ωτίτιδα και η επιπεφυκίτιδα από P. aeruginosa είναι πιο συχνή σε άτομα που βυθίζουν το κεφάλι στο νερό. Οι πιθανότητες μόλυνσης από P. aeruginosa αυξάνονται όταν παρατηρείται μεγάλος αριθμός κολυμβητών και το νερό έχει υψηλή θερμοκρασία. Παράλληλα, είναι συχνό ευκαιριακό παθογόνο (πχ σε ανοσοκατεσταλμένα άτομα) και χρησιμοποιείται ως δείκτης ποιότητας εμφιαλωμένου νερού Εικόνα 68: Χαρακτηριστικός φθορισμός της Pseudomonas aeruginosa υπό UV ακτινοβολία 97

101 Εικόνα 69: Νομοθεσία περί μικροβιολογικής ποιότητας πόσιμου και εμφιαλωμένου νερού Ιοί Το υδάτινο περιβάλλον μολύνεται με περισσότερους από 100 διαφορετικούς τύπους ιών μέσω των αποβλήτων (ιός ηπατίτιδας Α, calici-ιοί, αδενοϊοί, rota-ιοί, entero-ιοί). Πολλοί ερευνητές βεβαιώνουν ότι οι δείκτες αυτοί δεν δίνουν πληροφορίες για την ύπαρξη ή την τύχη των ιών εντερικής προέλευσης στο υδάτινο περιβάλλον, για διάφορους λόγους o κυριότερος των οποίων είναι ότι οι ιοί δεν αδρανοποιούνται εύκολα υπό την επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων (φως ώσμωση κλπ) σε αντίθεση με τους βακτηριακούς δείκτες μόλυνσης. Έτσι οι ιοί εντερικής προέλευσης είναι δυνατόν να επιβιώσουν στο θαλασσινό νερό μέχρι και 130 ημέρες ενώ οι βακτηριακοί δείκτες μόλυνσης δεν επιβιώνουν πάνω από δύο εβδομάδες. Αδενοϊοί Οι αδενοϊοί αποτελούν τους μοναδικούς ιούς που περιέχουν DNA ενώ οι υπόλοιπο περιέχουν RNA. Ιδιαίτερα οι αδενοϊοί 40 και 41 αποτελούν σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα γαστρεντερίτιδας σε παιδιά μετά από rota-ιούς. Διάφοροι ερευνητές στην Ευρώπη υποστηρίζουν ότι οι αδενοϊοί αποτελούν έναν καλό δείκτη ανθρώπινης ιϊκής μόλυνσης διότι: α) απομονώνονται συχνά από το υδάτινο περιβάλλον, β) ο αριθμός τους είναι σταθερά υψηλότερος απ ότι ο αριθμός των εντεροϊών στα μη επεξεργασμένα λύματα και γ) επιβιώνουν για μεγαλύτερο χρόνο στο θαλασσινό νερό (2-3 φορές μεγαλύτερο χρονικό διάστημα σε σχέση με τους polio ιούς ή τον ιό της ηπατίτιδας). 98

102 Εντεροϊοί (polio, coxsackie, echo, enteroviruses 68-71) Οι εντεροϊοί απαντώνται σε παγκόσμια κλίμακα. Μεταδίδονται μέσω της στοματο-πρωκτικής και αναπνευστικής οδού και προκαλούν διάφορα νοσήματα όπως παράλυση, μηνιγγίτιδα, αναπνευστικές παθήσεις και οξεία γαστρεντερίτιδα. Προσβάλλουν κυρίως παιδιά σε συνθήκες ανεπαρκούς υγιεινής και υπερπληθυσμού. Εμφανίζουν εποχιακή κατανομή (απομονώνονται συχνότερα το Καλοκαίρι και το Φθινόπωρο). 99

103 14. Εξυγίανση προβλημάτων κοπρανώδους μόλυνσης των υδάτων προστασία περιβάλλοντος Η ανίχνευση κοπρανώδους μόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον δεν είναι επαρκής προκειμένου να οριοθετηθεί ο κίνδυνος για τη δημόσια υγεία και να υποδειχθούν οι κατάλληλοι τρόποι αντιμετώπισης του προβλήματος. Εκείνο που καθίσταται απαραίτητο είναι η διάκριση και δη ο ακριβής προσδιορισμός της προέλευσης της κοπρανώδους μόλυνσης, η οποία εστιάζεται κυρίως στο ανθρώπινο και το ζωικό κοπρανώδες υλικό. Πιο συγκεκριμένα, κοπρανώδης μόλυνση ενδέχεται να προκύψει από εκροή ακατέργαστων λυμάτων, υπερχείλιση υπονόμων, απορροές βιολογικών καθαρισμών και βιομηχανικών μονάδων καθώς και από απορροές αγροτικών περιοχών, απόβλητα κτηνοτροφικών μονάδων, τα οποία μπορεί να διασπείρονται σε εκτεταμένες περιοχές. Οι δύο βασικές παράμετροι, οι οποίες θέτουν την αναγκαιότητα διάκρισης είναι α) ο καθορισμός των πιθανών λοιμώξεων που δύνανται να προκληθούν στον άνθρωπο και β) οι κοινωνικές και οικονομικές επιπτώσεις. Στο κοπρανώδες υλικό ανευρίσκεται μεγάλη ποικιλία παθογόνων ιών, βακτηρίων και παρασίτων, τα οποία μεταδίδονται με το νερό. Εντούτοις, η κοπρανώδης μόλυνση του υδάτινου περιβάλλοντος ενέχει διαφορετικούς κινδύνους για τον καταναλωτή ανάλογα με το εάν είναι ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης. Γενικά, είναι κοινώς αποδεκτό το γεγονός ότι το ανθρώπινο κοπρανώδες υλικό δύναται να προκαλέσει περισσότερες και σημαντικότερες ασθένειες στον άνθρωπο απ ότι το αντίστοιχο ζωικό, δεδομένης της διαπιστωμένης διαφοροποίησης ως προς τους περιεχόμενους μικροοργανισμούς. Το ανθρώπινο κοπρανώδες υλικό περιέχει συνήθως πολλά ανθρώπινα παθογόνα, σημαντικά για τη δημόσια υγεία όπως είναι Salmonella enterica οροτύπου typhi, Shigella spp., ιός Ηπατίτιδας Α και Νοροϊοί. Ο δεύτερος άξονας στον οποίο κινούνται οι μελέτες διερεύνησης της προέλευσης της κοπρανώδους μόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον είναι ο προσδιορισμός μέτρων εξυγίανσης και αντιμετώπισης του εκάστοτε προβλήματος. Όπως έχει ήδη πραγματοποιηθεί σε πολλές έρευνες, ο σωστός και όσο το δυνατόν ακριβής προσδιορισμός πηγής κοπρανώδους υλικού στο νερό έχει οδηγήσει στην αποτελεσματική αντιμετώπιση της μόλυνσης, περιορίζοντας έγκαιρα τις επιπτώσεις στη δημόσια υγεία και καταλήγοντας στην εξοικονόμηση σημαντικού χρηματικού ποσού. Προτεινόμενες μέθοδοι Η απευθείας ανίχνευση των ανθρώπινων εντερικών παθογόνων καθίσταται δύσκολη δεδομένου ότι ανευρίσκονται στο περιβάλλον σε εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις, ενώ παράλληλα η μολυσματική τους δόση κυμαίνεται σε χαμηλά επίπεδα. Προκειμένου να προσδιοριστεί η προέλευση των εντερικών παθογόνων σε κάποιο υδάτινο σύστημα καταφεύγουμε στον προσδιορισμό συγκεκριμένων δεικτών κοπρανώδους μόλυνσης. Οι συνήθεις δείκτες που χρησιμοποιούνται σε μελέτες που αφορούν στο πόσιμο και θαλασσινό νερό είναι οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι και η Escherichia coli, με τις απόψεις πολλών ερευνητών να διίστανται για το ποιος είναι ο πιο ενδεδειγμένος. 100

104 Η προσπάθεια στην οποία έχουν επιδοθεί πολλές ερευνητικές ομάδες προκειμένου να διακρίνουν την προέλευση της κοπρανώδους μόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον έχει συντελέσει στην ανάπτυξη πολλών διαφορετικών μικροβιολογικών και χημικών μεθόδων (βλέπε Πίνακα 4). Οι χημικές μέθοδοι διάκρισης αφορούν στην ανίχνευση συγκεκριμένων ουσιών, οι οποίες υποδηλώνουν κυρίως την παρουσία ανθρώπινης μόλυνσης. Τέτοιες ουσίες είναι η καφεΐνη, οι κοπρανώδεις στερόλες και συστατικά απορρυπαντικών. Παρ όλα αυτά η παρουσία των ουσιών αυτών στο περιβάλλον δεν μπορεί να αποδοθεί με ακρίβεια στον ανθρώπινο παράγοντα. Οι μέχρι τώρα μελέτες δεν έχουν δείξει σαφή συσχέτιση ανθρώπινης κοπρανώδους μόλυνσης και συγκεκριμένων χημικών ουσιών ενώ συγχρόνως οι χημικές μέθοδοι χαρακτηρίζονται από έλλειψη ευαισθησίας καταλήγοντας συχνά σε περιορισμένα κι ενδεχομένως λανθασμένα συμπεράσματα σχετικά με την πηγή της εκάστοτε κοπρανώδους μόλυνσης. Όσον αφορά στις μικροβιολογικές μεθόδους, ο βασικός άξονας όπου κινούνται περιλαμβάνει τη δημιουργία μιας λεγόμενης «βιβλιοθήκης» (βάση δεδομένων), που απαρτίζεται από χαρακτηριστικά γνωρίσματα δεικτών κοπρανώδους μόλυνσης (Escherichia coli, κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι), γνωστής προέλευσης, βάσει της οποίας, πραγματοποιείται διαχωρισμός άγνωστων στελεχών απομονωμένων από το υδάτινο περιβάλλον. Η δημιουργία βάσης δεδομένων μπορεί να αποφευχθεί, όταν επιχειρείται η ανίχνευση και απομόνωση συγκεκριμένων ειδών μικροοργανισμών, οι οποίοι υποδηλώνουν απευθείας την προέλευσή τους. Έτσι για παράδειγμα ο Enterococcus faecium δηλώνει ανθρώπινη κοπρανώδη μόλυνση ενώ ο Streptococcus bovis ζωική. Η αποφυγή δημιουργίας «βιβλιοθήκης» γνωστών στελεχών με την αναζήτηση ορισμένων ειδών μικροοργανισμών κρίνεται ως ένας οικονομικός και γρήγορος τρόπος για τη διερεύνηση πηγής κοπρανώδους μόλυνσης. Εντούτοις, οι προτάσεις των περισσότερων ερευνητών αφορούν στη δημιουργία βάσης δεδομένων γνωστών στελεχών και διακρίνονται σε δύο ευρείες κατηγορίες, τις φαινοτυπικές και γονοτυπικές, οι οποίες ταυτίζονται με τις μεθόδους ταξινόμησης των μικροοργανισμών (ανάλυση βιοτύπου, ανάλυση πρωτεϊνών, ριβότυπος, ανίχνευση πολυμορφισμών στο γενετικό υλικό κ.α. βλέπε κεφάλαιο ταξινόμησης μικροοργανισμών). Πίνακας 3:Κατηγοριοποίηση μεθόδων διάκρισης κοπρανώδους μόλυνσης Μοριακές μέθοδοι διάκρισης βασιζόμενες στην ανάπτυξη βάσης δεδομένων («βιβλιοθήκη») Ανάλυση Ριβοτύπου Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) RAPD-PCR (Randomly amplified polymorphic DNA-PCR) Rep-PCR (repetitive polymerase chain reaction) Μη-μοριακές μέθοδοι βασιζόμενες στην ανάπτυξη βάσης δεδομένων («βιβλιοθήκη») Πολλαπλή ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά Μοριακές μέθοδοι διάκρισης μη βασιζόμενες στην ανάπτυξη βάσης δεδομένων («βιβλιοθήκη») Τυποποίηση φάγων (F specific RNA κολιφάγων) Ανίχνευση ανθρώπινων εντερικών ιών Ανίχνευση συγκεκριμένων μικροοργανισμών-δεικτών Μη-μοριακές ανεξάρτητες μέθοδοι Αναλογία κοπρανωδών βακτηρίων Μη μοριακοί ειδικοί δείκτες (καφεΐνη) 101

105 15. Βιολογικός Καθαρισμός Αστικών Αποβλήτων Ένας από τους πιο αποτελεσματικούς τρόπους αντιμετώπισης της ρύπανσης των υδάτινων πόρων από τα απόβλητα είναι οι Εγκαταστάσεις Επεξεργασίας Αστικών Αποβλήτων (Ε.Ε.Α.Α). Οι εγκαταστάσεις αυτές έχουν ως σκοπό τον καθαρισμό των αστικών αποβλήτων από τα βλαβερά συστατικά που περιέχουν, ώστε αυτά να διατεθούν ακίνδυνα στο περιβάλλον. Ως βλαβερά συστατικά των αποβλήτων θεωρούνται τα ογκώδη αντικείμενα, όπως η άμμος, τα μικρού μεγέθους στερεά που αιωρούνται στη μάζα των αποβλήτων (αιωρούμενα στερεά), τα οργανικά-φυσικά συστατικά (π.χ. υδατάνθρακες, πρωτεΐνες, λίπη), οι παθογόνοι μικροοργανισμοί (όπως οι ιοί εντερικής προέλευσης) και τα θρεπτικά στοιχεία (άζωτο και φώσφορος). Τα ογκώδη στερεά, η άμμος και τα αιωρούμενα στερεά προκαλούν περισσότερο αισθητική δυσαρέσκεια παρά ουσιαστική ρύπανση του υδάτινου φορέα. Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί είναι υπεύθυνοι για τη μετάδοση ασθενειών στον άνθρωπο και σε άλλους οργανισμούς. Τα οργανικά συστατικά, το άζωτο και ο φώσφορος, είναι τα περισσότερο υπεύθυνα για τις δυσάρεστες καταστάσεις ρύπανσης. Κι αυτό γιατί κάθε υδάτινος φορέας, αλλά και τα ίδια τα απόβλητα, περιέχουν μικροοργανισμούς που καταναλώνουν τα οργανικά συστατικά των αποβλήτων, καθώς το άζωτο και το φώσφορο, για να τραφούν και να πολλαπλασιαστούν, καταναλώνοντας παράλληλα το οξυγόνο (αναπνέοντας), που βρίσκεται διαλυμένο στο νερό του φορέα μέχρι να τα εξαφανίσουν τελείως. Αυτό που συμβαίνει σε μια εγκατάσταση επεξεργασίας λυμάτων είναι βασικά το ίδιο με ότι διαδραματίζεται σε ένα ποταμό ή στη θάλασσα. Ο ρόλος μιας τέτοιας εγκατάστασης είναι να επιταχύνει τις φυσικές διεργασίες με τις οποίες τα νερά αυτοκαθαρίζονται και απώτερος στόχος είναι η διάσπαση των οργανικών ουσιών και η μετατροπή τους σε μη τοξικές ουσίες, ώστε να μπορούν να διοχετευθούν σε ποταμούς και θάλασσες. Σ αυτές τις φυσικές διεργασίες αποσύνθεσης βακτήρια και άλλοι μικροοργανισμοί αναγνωρίζουν διάφορα ρυπαντικά σωματίδια σαν πηγή τροφής. Ενώ δεσμεύουν την τροφή τους οι μικροοργανισμοί, παράγουν νέα βακτηριακά κύτταρα, διοξείδιο του άνθρακα και άλλα προϊόντα. Καθώς τα βακτήρια αποδομούνται καταναλώνουν επίσης και οξυγόνο απαραίτητο για όλες τις μεταβολικές τους λειτουργίες. Ο αναλυτικός προσδιορισμός του οργανικού φορτίου μπορεί να πραγματοποιηθεί έμμεσα με τον προσδιορισμό του Βιοχημικώς Απαιτούμενου Οξυγόνου (BOD, Biochemical Oxygen Demand) και του Χημικώς Απαιτούμενου Οξυγόνου (COD, Chemical Oxygen Demand) και άμεσα με τον προσδιορισμό του Ολικού Οργανικού Άνθρακα (TOC, Total Organic Carbon). Το BOD (Biochemical Oxygen Demand) αποτελεί την πιο διαδεδομένη μέθοδο προσδιορισμού του οργανικού φορτίου στα λύματα. Σαν ΒΟD5 (βιοχημικά απαιτούμενο οξυγόνο) ορίζεται η ποσότητα εκείνη του οξυγόνου που απαιτείται για την βιολογική οξείδωση των οργανικών ουσιών που περιέχονται σε ένα δείγμα. Τα οικιακά λύματα είναι φορτισμένα κυρίως με οργανικές ρυπαντικές ουσίες που προέρχονται κυρίως από τους χώρους υγιεινής των κατοικιών και περιέχουν αζωτούχα και θειούχα λευκώματα καθώς επίσης και υδατάνθρακες π.χ. κυτταρίνη, σάκχαρα, άμυλο. Οι περισσότερες απ' αυτές τις ουσίες κατά την βιολογική οξείδωση διασπώνται σε άλλες απλούστερες και δίνουν ανάλογα προϊόντα όπως αμμωνία (ΝΗ3), διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ) και νερό (Η 2 Ο). Οι οξειδωτικές αυτές αντιδράσεις είναι συνυφασμένες με υψηλή κατανάλωση οξυγόνου, η οποία λαμβάνεται σαν μέτρο οργανικής ρύπανσης των νερών. Η κατανάλωση του οξυγόνου στο νερό καθορίζεται με βάση τον προσδιορισμό του βιοχημικά 102

106 απαιτούμενου οξυγόνου σε πέντε (5) ημέρες (BOD 5 ). Το BOD μετράται σε mg O 2 /l λυμάτων. Στην πράξη έχει καθιερωθεί να μετράται το BOD (μανομετρικά, σε συσκευή μέτρησης BOD) μετά από επώαση 5 ημερών στο σκοτάδι και σε θερμοκρασία 20 C. Η βιολογική αποικοδόμηση των ρυπαντικών ουσιών (αποσύνθεση) γίνεται σε δύο στάδια. Στο πρώτο αποικοδομούνται κυρίως οι ενώσεις του άνθρακα, ενώ στο δεύτερο οι ενώσεις του αζώτου. Το πρώτο στάδιο αρχίζει αμέσως και ολοκληρώνεται μετά από 20 ημέρες (για θερμοκρασία 20 C). Το δεύτερο στάδιο αρχίζει (για θερμοκρασία 20 C) μετά την πάροδο 10 ημερών και διαρκεί πολύ περισσότερο χρόνο. Με τον όρο χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (COD - Chemical Oxygen Demand) εννοούμε την ποσότητα του οξυγόνου που απαιτείται για την χημική οξείδωση του δείγματος, δηλαδή το σύνολο των οργανικών ενώσεων που περιέχονται σε ένα δείγμα και μπορούν να οξειδωθούν με ένα ισχυρό οξειδωτικό μέσο. Από τη συσχέτιση του COD και BOD διαπιστώνεται η ύπαρξη τοξικών και δύσκολα βιοαποικοδομούμενων οργανικών ενώσεων στα απόβλητα. Το Συμβούλιο Περιβάλλοντος της Ευρωπαϊκής Ένωσης με την οδηγία που εξέδωσε (19/3/92), προβλέπει των εγκατάσταση Ε.Ε.Α.Α. σε όλες της πόλεις της κοινότητας. Συγκεκριμένα, προτείνεται η πραγματοποίηση βιολογικού καθαρισμού για όλες τις πόλεις μέχρι το Επιπλέον, για τις πόλεις που βρίσκονται σε ευαίσθητες περιοχές προβλέπεται και τριτοβάθμιος καθαρισμός, ενώ για τις πόλεις με λιγότερους από κατοίκους, ο πρωτοβάθμιος καθαρισμός θεωρείται αρκετός. Όπως αναφέρει η οδηγία της Ε.Ε, μια Εγκατάσταση Επεξεργασίας Αστικών Αποβλήτων (Ε.Ε.Α.Α) χαρακτηρίζεται από το βαθμό καθαρισμού, ο οποίος καθορίζεται από τα ποια βλαβερά συστατικά που αναφέρθηκαν προηγουμένως απομακρύνει. Τα ογκώδη στερεά, η άμμος και τα αιωρούμενα στερεά, απομακρύνονται πάντα σε μια Ε.Ε.Α.Α, οπότε ο καθαρισμός χαρακτηρίζεται πρωτοβάθμιος. Ο δευτεροβάθμιος ή συχνά αποκαλούμενος βιολογικός καθαρισμός αποσκοπεί στην απομάκρυνση των οργανικών συστατικών και την εξουδετέρωση των παθογόνων μικροοργανισμών. Ο τριτοβάθμιος καθαρισμός αφορά στην απομάκρυνση των θρεπτικών στοιχείων φωσφόρου και αζώτου. Πρωτοβάθμια Επεξεργασία Οι βασικές μονάδες σε μια εγκατάσταση με πρωτοβάθμιο καθαρισμό είναι οι εσχάρες (μια σειρά από μεταλλικές ράβδους στις οποίες συγκρατούνται τα ογκώδη στερεά), οι εξαμμωτές (ειδικά σχεδιασμένες δεξαμενές στις οποίες δημιουργούνται κατάλληλες συνθήκες ροής που προκαλούν καθίζηση της άμμου) και οι δεξαμενές πρωτοβάθμιας καθίζησης (όπου καθιζάνει και απομακρύνεται το 70% των αιωρούμενων στερεών και το 30% των οργανικών συστατικών). Συχνά ένας εξαμμωτής περιέχει και διάταξη για την απομάκρυνση των ελαίων και λιπών που περιέχονται στα απόβλητα. Τα αιωρούμενα συστατικά που καθιζάνουν στον πυθμένα των δεξαμενών πρωτοβάθμιας καθίζησης αποτελούν την πρωτοβάθμια λάσπη. Τα ογκώδη στερεά που συγκρατούνται στις εσχάρες και η άμμος που καθιζάνει στους εξαμμωτές, αφυδατώνονται και μεταφέρονται σε χωματερές. 103

107 Εικόνα 70: Διάγραμμα λειτουργίας βιολογικού καθαρισμού Βιολογική ή Δευτεροβάθμια Επεξεργασία Μια εγκατάσταση με βιολογικό ή δευτεροβάθμιο καθαρισμό επιτυγχάνει όχι μόνο πρωτοβάθμιο, αλλά και δευτεροβάθμιο καθαρισμό, δηλαδή σχεδόν πλήρη απομάκρυνση (μεγαλύτερη από 95%) των οργανικών συστατικών. Η ιδέα του βιολογικού καθαρισμού στηρίζεται στην πραγματοποίηση των βιοχημικών διεργασιών που γίνονται ανεξέλεγκτα στη φύση (π.χ. κατά τη διοχέτευση αποβλήτων σε έναν υδάτινο αποδέκτη), με ελεγχόμενο τρόπο σε ειδικές για το σκοπό αυτό δεξαμενές. Στις δεξαμενές αυτές δίνονται οι ιδανικές συνθήκες στους μικροοργανισμούς που είναι η τροφή (οργανικά συστατικά αποβλήτων) και το οξυγόνο, για να αναπτυχθούν και να πολλαπλασιαστούν. Έτσι, τη θέση των βλαβερών οργανικών συστατικών παίρνουν οι μικροοργανισμοί κυρίως τα βακτήρια, που όχι μόνο δεν είναι βλαβεροί, όπως οι 104

108 παθογόνοι, αλλά αποτελούν και το εργαλείο καθαρισμού σε μια Ε.Ε.Α.Α. Το οξυγόνο παρέχεται στους μικροοργανισμούς τεχνητά με διατάξεις αερισμού, που καλούνται αεριστήρες, οπότε και οι δεξαμενές ονομάζονται δεξαμενές αερισμού. Το μίγμα των μικροοργανισμών και της τροφής αποτελούν την καλούμενη «ενεργό ιλύ», οπότε και η μέθοδος αυτή του βιολογικού καθαρισμού καλείται μέθοδος Ενεργού Ιλύος. Η ιλύς αυτή απομακρύνεται από τη μάζα των αποβλήτων, αφήνοντας τα απόβλητα να περάσουν σε δεξαμενές δευτεροβάθμιας καθίζησης, όπου η ιλύς καθιζάνει και συλλέγεται στον πυθμένα των δεξαμενών (δευτεροβάθμια λάσπη), ενώ τα καθαρισμένα απόβλητα υπερχειλίζουν από την περιφέρεια των δεξαμενών. Μετά τη δευτεροβάθμια επεξεργασία τα καθαρισμένα απόβλητα μπορεί να διατεθούν ακίνδυνα στον υδάτινο αποδέκτη εφόσον κριθεί ότι δεν είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος, ώστε να απαιτείται τριτοβάθμια επεξεργασία. Τα καθαρισμένα πλέον απόβλητα προκειμένου να διοχετευτούν χωρίς φόβο στον αποδέκτη, υφίστανται μόνο τη διεργασία της απολύμανσης για την εξόντωση των παθογόνων μικροοργανισμών σε επιμήκεις δεξαμενές. Τριτοβάθμια Επεξεργασία Τριτοβάθμια επεξεργασία πραγματοποιείται όταν τα επεξεργασμένα απόβλητα διοχετεύονται σε αποδέκτη, όπου είναι πιθανή η δημιουργία συνθηκών ευτροφισμού ή όταν αναμένονται λειτουργικά προβλήματα στην λειτουργία της εγκατάστασης από διόγκωση της λάσπης. Η πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια λάσπη από τις δεξαμενές καθίζησης υφίσταται συμπύκνωση (αύξηση του ποσοστού των στερεών που περιέχει), σταθεροποίηση (μείωση των παθογόνων μικροοργανισμών, των οσμών και της δυνατότητας της λάσπης να γίνει σηπτική) και αφυδάτωση με ξήρανση. Η σταθεροποίηση γίνεται αερόβια με τον αερισμό της λάσπης σε δεξαμενές όμοιες με τις δεξαμενές αερισμού ή αναερόβια. Σε μια παραλλαγή της μεθόδου ενεργού ιλύος που καλείται παρατεταμένος αερισμός και εφαρμόζεται ευρύτατα στην Ελλάδα, η αερόβια σταθεροποίηση της λάσπης γίνεται στις δεξαμενές αερισμού. Η αφυδάτωση της λάσπης αποσκοπεί στην απομάκρυνση μεγάλου μέρους του νερού που περιέχει. Μετά την ξήρανσή της η λάσπη διατίθεται σε χωματερή ή για λίπασμα. Μικροβιακή αφομοίωση φωσφορικού Κατά την αερόβια επεξεργασία υγρών αποβλήτων αφομοιώνεται ένα μεγάλο μέρος των διαλυτών φωσφορικών από τους μικροοργανισμούς. Ένα μέρος προσροφάται από τις τολύπες της ενεργού ιλύος. Μικροοργανισμοί, που είναι σε θέση να δημιουργήσουν αποθέματα φωσφόρου υπό μορφή πολυφωσφορικού οξέος στο κυτταρόπλασμα (Poly-PO 4 ), παίζουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην βιολογική απομάκρυνση φωσφορικών από υγρά απόβλητα. Η βιομάζα αυτή απομακρύνεται από το σύστημα με την απόρριψη της περίσσιας ιλύος. Η ιλύς, που απομακρύνεται, μπορεί κάτω από αναερόβιες συνθήκες να ελευθερώσει ξανά το δεσμευμένο φώσφορο από τα κύτταρα της χρησιμοποιώντας το σαν πηγή ενέργειας κατά την σύνθεση του αποθηκευτικού λιπιδίου πολύ-β-υδροξυβουτυρικού οξέος. Χαρακτηριστικός αντιπρόσωπος 105

109 αυτών των βακτηρίων είναι ο Acinetobacter sp., ο οποίος συμμετέχει μαζί με ένα ευρύ φάσμα άλλων συμβιωτικών βακτηρίων. Στο παρακάτω σχήμα παρουσιάζεται ένα υπόδειγμα σχεδιασμού των Βασικών Μονάδων Εγκατάστασης Επεξεργασίας Αστικών Αποβλήτων. 1) Προκαταρκτική επεξεργασία 1.1 Φρεάτιο άφιξης - Εσχάρες. 1.2 Αεριζόμενοι εξαμμωτέςλιποσυλλέκτες. 1.3 Δίαυλος μέτρησης παροχής. 2) Βιολογική επεξεργασία. 2.1 Δεξαμενή επιλογής βακτηριδίων (ΔΕΒ). 2.2 Φρεάτιο διανομής Νοί (ΦΔ1). 2.3 Ανοξικές δεξαμενές (ΑΟΔ) - δεξαμενές αερισμού (ΔΑ). 2.4 Φρεάτιο διανομής Νο2 (ΦΔ2). 2.5 Δεξαμενές καθίζησης (ΔΚ). 2.6 Αντλιοστάσιο λάσπης (ΑΝΛ). 2.7 Αντλιοστάσιο ανάμικτου υγρού (ΑΝΑΥ). 3) Απολύμανση με χλωρίωση (ΔΧΛ). 4) Επεξεργασία λάσπης. 4.1 Πάχυνση λάσπης σε δεξαμενές πάχυνσης (ΔΠΧ). 4.2 Αφυδάτωση λάσπης με ταινιοφιλτρόπρεσσες (ΤΦ). 5) Αντλιοστάσιο στραγγιδίων. ΔΙΑΘΕΣΗ ΕΚΡΟΗΣ ΣΤΟΝ ΑΠΟΔΕΚΤΗ Εικόνα 71: Υπόδειγμα Σχεδιασμού Μονάδας Επεξεργασίας Αστικών Αποβλήτων (Στάμου, 1995). 106

110 16. Απολύμανση Η απολύμανση του πόσιμου νερού πριν από την κατανάλωση και η τελική απολύμανση των αποβλήτων πριν αποδοθούν στο περιβάλλον είναι σημαντικές διαδικασίες για την εξασφάλιση της δημόσιας υγείας. Πρέπει να τονιστεί ότι η χλωρίωση ή οποιαδήποτε άλλη τελική επεξεργασία του νερού έχουν σαν σκοπό την απολύμανση, δηλαδή την προστασία του νερού από παθογόνους μικροοργανισμούς, και όχι την αποστείρωση, δηλαδή την καταστροφή όλων των ζωντανών μικροοργανισμών που υπάρχουν στο νερό. Η απολύμανση είναι απαραίτητη διαδικασία για το πόσιμο νερό και αποτελεί ένα μέτρο προφύλαξης νερού που είναι ήδη ελεύθερο από παθογόνους μικροοργανισμούς. Πρέπει όμως πάντα να ελέγχουμε την πιθανότητα δημιουργίας παραπροϊόντων της απολύμανσης, τα οποία συνήθως είναι χημικές ουσίες που προέρχονται από χημικές αντιδράσεις της απολυμαντικής ουσίας με στοιχεία του νερού. Παραπροϊόντα της χλωρίωσης, κυρίως τα τριαλομεθάνια, έχουν ε- νοχοποιηθεί για επιπτώσεις στην υγεία του καταναλωτή. Η απολύμανση αστικών λυμάτων που αποδίδονται στη θάλασσα, σε λίμνες, ποταμούς ή σε καλλιέργειες είναι επίσης απαραίτητη. Η απολύμανση όμως όλων των λυμάτων δεν συνιστάται διότι οι μεγάλες ποσότητες απολυμαντικών ουσιών μπορεί να έχουν αρνητικές επιδράσεις στο περιβάλλον στο οποίο καταλήγουν μαζί με τα λύματα. Οι περισσότερες απολυμαντικές ουσίες εκτός από την προστασία έναντι των παθογόνων βοηθούν και με άλλους τρόπους την βελτίωση της ποιότητας του νερού, όπως με οξείδωση ανόργανων ουσιών (π.χ. σίδηρος, μαγγάνιο), βελτίωση της κροκίδωσης και διήθησης κλπ. Θεωρία της απολύμανσης Ο τρόπος επίδρασης των απολυμαντικών ουσιών στο κύτταρο των μικροοργανισμών δεν έχει εντελώς καθοριστεί. Ορισμένα απολυμαντικά όπως το χλώριο επιδρούν στην διαπερατότητα του κυτταρικού τοιχώματος ενώ οι χλωραμίνες και το διοξείδιο του χλωρίου παρεμβαίνουν στον ενζυμικό μηχανισμό. Η απολυμαντική δράση ενός απολυμαντικού έναντι κάποιου συγκεκριμένου παθογόνου μικροοργανισμού καθορίζεται από την μείωση του αρχικού πληθυσμού του παθογόνου κατά τη διάρκεια συγκεκριμένου χρόνου επαφής. Αν χρησιμοποιήσουμε ένα απολυμαντικό υπό καθορισμένες συνθήκες, η απολυμαντική του δράση ακολουθεί τον Νόμο του Chick: όπου Ν ο = αρχικός αριθμός μικροοργανισμών στο σύστημα Ν= αριθμός μικροοργανισμών μετά από χρόνο (t) της απολύμανσης, Ο συντελεστής αποτελεσματικότητας k εξαρτάται από την συγκέντρωση του απολυμαντικού C: 107

111 Με αυτή την εξίσωση μπορούμε να υπολογίσουμε την συγκέντρωση και τον χρόνο που απαιτείται για να έχουμε μια επιθυμητή μείωση ενός συγκεκριμένου ποσοστού του αρχικού πληθυσμού κάποιου παθογόνου μικροοργανισμού στο νερό. Ο συντελεστής n καθορίζει την πολυπλοκότητα της απολυμαντικής διαδικασίας. Αν n = 1 τότε η μείωση του αρχικού πληθυσμού σε σχέση με τον χρόνο είναι γραμμική. Τα C και t στην απολυμαντική διαδικασία είναι ισοβαρή. Αν n>1 τότε μεγαλύτερη σημασία έχει η συγκέντρωση του απολυμαντικού ενώ αν n<1 τότε ο χρόνος επαφής επηρεάζει κυρίως το αποτέλεσμα της απολύμανσης. Ο συντελεστής k' ο οποίος υπεισέρχεται στην εξίσωση είναι ειδικός για συγκεκριμένο μικροοργανισμό και μπορεί να επηρεαστεί από την θερμοκρασία και το pη του νερού. Η θολερότητα του νερού μπορεί επίσης να επηρεάσει το αποτέλεσμα της απολύμανσης αφού οι αιωρούμενες οργανικές ή ανόργανες ουσίες παίζουν το ρόλο ασπίδας προστασίας των παθογόνων μικροοργανισμών. Ορισμένοι μικροοργανισμοί, όπως πρωτόζωα, οι οποίοι παρουσιάζουν αντοχή στη χλωρίωση, μπορεί να είναι φορείς παθογόνων βακτηρίων και ιών και να τους αποδίδουν στο υδάτινο περιβάλλον. Προσφέρουν επομένως ένα άλλο τρόπο προστασίας των παθογόνων βακτηρίων από την μικροβιοκτόνο δράση του χλωρίου. Συνθήκες απολύμανσης Ο πρωταρχικός σκοπός ενός συστήματος απολύμανσης είναι να αποτελεί φραγμό για οποιονδήποτε παθογόνο μικροοργανισμό προσπαθεί να επιβιώσει στο συγκεκριμένο σύστημα ύδρευσης. Έτσι πρέπει οι τιμές C να έχουν καθοριστεί μετά από πειράματα στο συγκεκριμένο σύστημα ύδρευσης. Οι τιμές 0.1 συνήθως εφαρμόζονται για απολύμανση με χλώριο, διοξείδιο του χλωρίου, χλωραμίνες και όζον με στόχο την καταστροφή του 99.9% του αρχικού πληθυσμού των παθογόνων. Πρέπει όμως να υπάρχει πρόβλεψη μετατροπής αυτών των τιμών διότι μεταβολή της θερμοκρασίας, του pη και της θολερότητας του νερού μπορούν να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα της απολύμανσης. Η σωστή διήθηση του νερού πριν την εφαρμογή της απολύμανσης απομακρύνει μεγάλο ποσοστό των μικροοργανισμών και κατακρατώντας τα αιωρούμενα στερεά και τις οργανικές ουσίες, βοηθάει την καλή λειτουργία της απολυμαντικής διαδικασίας. Η διήθηση κυρίως με φίλτρα χαμηλής ροής και με εφαρμογή προοζόνωσης είναι πολύ αποτελεσματική κυρίως για την απομάκρυνση των Cryptosporidium, Giardia. Το σύστημα ύδρευσης πρέπει να διαθέτει ευελιξία ως προς τα σημεία εφαρμογής της απολύμανσης, και πρόβλεψη για έκτακτες περιπτώσεις που θα χρειαστεί μεγαλύτερος χρόνος εφαρμογής της απολύμανσης (π.χ. δεξαμενές αποθήκευσης του νερού). Επίοης θα πρέπει να υπάρχει έτοιμη δυνατότητα εφαρμογής εναλλακτικού, πιo δραστικού τρόπου απολύμανσης, για 108

112 περιπτώσεις υδατογενών επιδημιών ή φυσικών καταστροφών (σεισμοί, κατακλυσμοί) που υποβαθμίζουν την ποιότητα του νερού Χλωρίωση Το ελεύθερο χλώριο είναι τοξικό στους περισσότερους παθογόνους μικροοργανισμούς. Ελεύθερο ή υπολειμματικό χλώριο ορίζεται το χλώριο στην μοριακή του μορφή (Cl 2 ) και τα παράγωγα του δηλαδή το υποχλωριώδες οξύ (ΗΟCl) και τα υποχλωριώδη ιόντα (ΟCl - ). Το ελεύθερο χλώριο είναι οξειδωτικό και η απολυμαντική του δράση μειώνεται κατά σειρά Cl 2 > ΗΟCl> ΟCl -. Το χλώριο διατίθεται στο εμπόριο σε αέρια μορφή, σαν υγρό υποχλωριώδες νάτριο και σε σκόνη διαφόρων υποχλωριωδών αλάτων. Η περιεκτικότητα μιας ουσίας σε ελεύθερο χλώριο ονομάζεται δραστικό χλώριο. Η επιλογή της μορφής εξαρτάται από το κόστος, τις συνθήκες ασφαλείας και λειτουργικές ιδιαιτερότητες της εγκατάστασης. Όταν εισαχθεί Cl 2 σε νερό και το pη είναι όξινο, το Cl 2 παραμένει στη μοριακή του μορφή. Για ουδέτερο pη το χλώριο αντιδρά με το νερό και δημιουργείται υποχλωριώδες οξύ (Εικόνα 33). Εικόνα 72: Μορφές ελεύθερου χλωρίου ανάλογα με το ph Σε αλκαλικό pη (pη>7) το ΗΟCl διασπάται σε ιόντα H + & OCl -. Για pη>8 τότε τα υποχλωριώδη ιόντα αντικαθιστούν πλήρως το υποχλωριώδες οξύ. (Εικόνα34). Αν υπάρχει στο νερό αμμωνία τότε δημιουργούνται οι χλωραμίνες (ΝΗCl 2 ). Οι χλωραμίνες που δημιουργούνται αποτελούν το συνδεδεμένο χλώριο. Το σύνολο του ελεύθερου και του συνδεδεμένου χλωρίου στο νερό λέγεται ολικό χλώριο. Οι χλωραμίνες οξειδώνονται και δίνουν άζωτο και ιόντα χλωρίου. Αν συνεχιστεί η τροφοδότηση του νερού με Cl 2, τότε οι αντιδράσεις οξείδωσης των χλωραμινών ολοκληρώνονται και αρχίζει η απελευθέρωση ελεύθερου χλωρίου. Η πραγματική απολύμανση του νερού με ελεύθερο χλώριο αρχίζει από αυτό το χρονικό σημείο, το οποίο ονομάζεται οριακό σημείο (breakpoint) (Εικόνα34). 109

113 Εικόνα 73: Εξέλιξη της χλωρίωσης του νερού μέχρι το οριακό σημείο (breakpoint) Η διαδικασία αυτή είναι παρόμοια και όταν η πηγή του χλωρίου είναι υποχλωριώδες νάτριο ή άλλο άλας του χλωρίου. Το προτέρημα της χλωρίωσης έναντι άλλων απολυμαντικών του νερού είναι ότι είναι αρκετά ισχυρό ώστε να απαλλάσσει το νερό από τους πολλούς παθογόνους μικροοργανισμούς ενώ συγχρόνως παρέχει υπολειμματικό απολυμαντικό το οποίο, ανάλογα με άλλες παραμέτρους του νερού, μπορεί να παραμείνει σαν προστατευτικός παράγοντας για κάποιο χρονικό διάστημα. Κατά την μέτρηση του ελεύθερου χλωρίου στο νερό έχει μεγάλη σημασία να χρησιμοποιείται η σωστή τεχνική η οποία να μετρά πράγματι ελεύθερο και όχι συνδεδεμένο ή ολικό χλώριο. Παραπροϊόντα της χλωρίωσης και επίπτωση στην υγεία Ορισμένες χημικές ενώσεις που βρίσκονται διαλυμένες στο νερό (χουμικά και φουλβικά οξέα, υδρόφιλα οξέα, αμινοξέα, υδατάνθρακες κλπ) αντιδρούν με το χλώριο και δημιουργούν τα τριαλομεθάνια (ΤΗΜ). Το πιο σημαντικό τριαλομεθάνιο ως προς τις επιπτώσεις του στη υγεία είναι το χλωροφόρμιο. Ορισμένες από τις χημικές ενώσεις- "προπομπούς" των ΤΗΜ μπορεί να παρέχονται και από ζωντανούς υδρόβιους οργανισμούς όπως φύκη (Anabena, Pediastrum) ενώ ανόργανες ενώσεις (αιθανόλη, ακεταλδεΰδη κλπ) από απόβλητα βιομηχανικών μονάδων δημιουργούν επίσης με το χλώριο ΤΗΜ. Η συνολική ποσότητα αυτών των οργανικών ουσιών σε κάποιο δείγμα νερού αποτελεί τα ολικά τριαλομεθάνια (ΤΤΗΜ). Η συγκέντρωση των ΤΗΜ σε κάποια πηγή υδροληψίας μεταβάλλεται σημαντικά υπό την επίδραση διαφόρων παραγόντων και γι αυτό πρέπει η μέτρηση τους να γίνεται τουλάχιστον 4 φορές το χρόνο σε διάφορες εποχές. Η συγκέντρωση τους είναι μεγαλύτερη σε επιφανειακά από υπόγεια νερά όπου απαντώνται μόνο αν αναμειχθούν με επιφανειακές πηγές ρύπανσης. Στα επιφανειακά νερά παρατηρείται μεγαλύτερη συγκέντρωση μετά από βροχοπτώσεις επειδή γειτονικά προς την πηγή υδροληψίας εδάφη παρασύρονται μέσα στο νερό. Τον σχηματισμό των ΤΗΜ ευνοεί η αύξηση της θερμοκρασίας και έτσι παρατηρούνται μεγαλύτερες συγκεντρώσεις το καλοκαίρι. Η ανησυχία για τις πιθανές επιπτώσεις των ΤΗΜ στην υγεία των καταναλωτών άρχισε με την υπόθεση ότι το χλωροφόρμιο είναι καρκινογόνο. Δεν υπάρχουν προς το παρόν σαφείς ενδείξεις για τις επιπτώσεις των ΤΗΜ στην υγεία. Κατά πολλούς ερευνητές είναι πολύ πιθανόν άλλα παραπροϊόντα του χλωρίου, όπως ορισμένες 110

114 φουρανόνες, καθώς και παραπροϊόντα άλλων απολυμαντικών, να έχουν πολύ ισχυρότερες μεταλλαξιογόνες ιδιότητες από τα ΤΗΜ. Χλωραμίνες Οι χλωραμίνες χρησιμοποιούνται συχνά σε συνδυασμό με το ελεύθερο χλώριο διότι βοηθούν στην απομάκρυνση δυσάρεστων οσμών και γεύσης που αφήνει στο νερό η χλωρίωση. Οι χλωραμίνες έχουν πολύ ασθενέστερη απολυμαντική δράση από το ελεύθερο χλώριο, όμως αφήνουν στο νερό ένα πιο χημικά σταθερό υπολειμματικό απολυμαντικό και δεν ευνοούν την δημιουργία ΤΗΜ και άλλων παραπροϊόντων της απολύμανσης. Η απολύμανση με χλωραμίνωση απαιτεί εγκαταστάσεις που να επιτρέπουν μεγάλο χρόνο επίδρασης. Έχουν αρκετή απολυμαντική ικανότητα έναντι πολλών παθογόνων βακτηρίων αλλά δεν είναι αποτελεσματικές έναντι της Legionella, των πρωτόζωων (Giardia) και των ιών. Η μικροβιοκτόνος δράση της oφείλεται σε αναστολή πρωτεϊνικών αντιδράσεων στον κυτταρικό μεταβολισμό. Έτσι συνιστάται η χρήση τους σαν δευτερογενής απολύμανση, για τη βελτίωση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων του χλωριωμένου νερού και για την παρουσία σταθερού υπολειμματικού α- πολυμαντικού στο νερό. Επίσης έχουν μεγαλύτερη ικανότητα διείσδυσης από το ελεύθερο χλώριο μέσα στο βιολογικό υμένιο των σωλήνων. Ένα μειονέκτημα της χρήσης χλωραμινών είναι ότι ευνοούν τον πολλαπλασιασμό νιτροβακτηρίων στις δεξαμενές του νερού, τα οποία με την σειρά τους μπαίνουν στην τροφική αλυσίδα άλλων μικροοργανισμών και έτσι μεγαλώνει ο ολικός αριθμός μικροοργανισμών του νερού. Οι χλωραμίνες δεν διατίθενται στο εμπόριο σαν έτοιμο προϊόν. Παράγονται επί τόπου στο σημείο χρήσης από χλώριο και αμμωνία. Διοξείδιο του χλωρίου Η χρήση του Cl 2 τα τελευταία χρόνια έχει αρκετά εξαπλωθεί διότι συνδυάζει καλό απολυμαντικό αποτέλεσμα και πολύ περιορισμένη δημιουργία παραπροϊόντων, κυρίως ΤΉΜ. Ένα βασικό πρόβλημα στη χρήση του σαν βασικό απολυμαντικό είναι ότι η χημική μορφή του είναι ένα μάλλον ασταθές αέριο το οποίο δεν μπορεί να παραχθεί σε εμπορεύσιμη μορφή χωρίς να υπάρχουν κίνδυνοι κατά τη μεταφορά και χρήση του. Έτσι πρέπει να παράγεται στο σημείο χρήσης του και υπό υψηλές προδιαγραφές ασφάλειας. Η παραγωγή του γίνεται από σύμφωνα με την αντίδραση: Το ClO 2 θεωρείται ισχυρό απολυμαντικό, αποτελεσματικό έναντι βακτηρίων, πρωτόζωων και ιών. Η ποσότητα διοξειδίου του χλωρίου στο νερό δεν επηρεάζεται από την αμμωνία, όπως γίνεται με την ποσότητα του υπολειμματικού χλωρίου, όμως μπορεί να επηρεαστεί από ανόργανες ουσίες όπως σίδηρος, μαγγάνιο και θειικά ιόντα. Αν το νερό είναι πλούσιο σε κάποια από αυτά τα συστατικά τότε μπορεί να είναι δύσκολο να έχει κανείς σταθερή ποσότητα ClΟ 2 στο νερό. Αντίθετα αυτή η ιδιότητα του μπορεί να το κάνει χρήσιμο, σαν συμπληρωματικό απολυμαντικό, για την βελτίωση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων νερού που περιέχει τέτοιες ανόργανες ουσίες. 111

115 16.2. Όζον Το όζον είναι το ισχυρότερο οξειδωτικό από όλα τα κοινά απολυμαντικά του νερού. Η χρήση του εξαπλώνεται ταχύτατα διότι δεν δημιουργεί ΤΉΜ. Η δράση του όμως επηρεάζεται από το pη, την συγκέντρωση μονοξειδίου και διοξειδίου του άνθρακα και άλλων οργανικών και ανόργανων ουσιών στο νερό. Έτσι έχει μεγάλη σημασία η καλή γνώση των χαρακτηριστικών του νερού πριν εφαρμοστεί οζόνωση για την απολύμανση του. Το όζον (Ο 3 ) σε θερμοκρασία και πίεση του περιβάλλοντος είναι ένα ασταθές αέριο και γίνεται οξυγόνο σε θερμοκρασίες >35 C. Έτσι πρέπει να παράγεται στο σημείο χρήσης του. Μετά τη τροφοδοσία του όζοντος στο νερό παραμένει για ένα μικρό χρονικό διάστημα, αρκετό για τη απολυμαντική δράση του και μετά αποσυντίθεται. Η απολυμαντική του δράση είναι ι- σχυρή και ταχεία. Ο ιός της πολιομυελίτιδας αδρανοποιείται σε ποσοστό 99.99% σε 4-6 λεπτά υπό την επίδραση 0.4ppm όζοντος. Έχει μεγάλη απολυμαντική δράση έναντι των πρωτόζωων. Είναι επίσης πολύ αποτελεσματικό έναντι των βιοεπικαθίσεων. Έχει επίσης προταθεί για την α- πολύμανση κλειστών θαλάσσιων συστημάτων. Σαν οξειδωτικό συμβάλλει στην συντήρηση των φίλτρων. Η απολυμαντική δράση του όζοντος οφείλεται σε οξειδωτικές αντιδράσεις που καταστρέφουν βασικές δομές του μικροβιακού κυττάρου. Έχει επίδραση σε ευρεία κατηγορία μικροοργανισμών και προτείνεται για βασικό απολυμαντικό, αρκεί το νερό να μην έχει αυξημένη θολερότητα. Τα αιωρούμενα σωματίδια του νερού προφυλάσσουν το κύτταρο των μικροοργανισμών από την οξειδωτική επίδραση του όζοντος Υπεριώδης ακτινοβολία Η υπεριώδης ακτινοβολία μπορεί να αδρανοποιήσει βακτήρια και ιούς, έχει όμως μικρότερη αποτελεσματικότητα έναντι των πρωτόζωων. Έχει καλύτερη εφαρμογή στην απολύμανση των υπόγειων νερών, των νερών που προορίζονται για εμφιάλωση καθώς και στην τελική φάση της απολύμανσης των λυμάτων. Το αποτελεσματικότερο μήκος κύματος είναι nm. Το μεγάλο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι δε δημιουργούνται καθόλου παραπροϊόντα. Για πρακτικούς λόγους χρησιμοποιείται κυρίως σε μικρά συστήματα. Η υπεριώδης ακτινοβολία δεν σκοτώνει τους μικροοργανισμούς, όπως τα οξειδωτικά απολυμαντικά, αλλά επιδρά στο πυρηνικό DΝΑ με αποτέλεσμα να μην λειτουργεί ο αναπαραγωγικός μηχανισμός. Πρέπει όμως να δίνεται προσοχή στο φαινόμενο της φωτοενεργοποίησης (photoreactivation). Ορισμένοι μικροοργανισμοί, υπό την επίδραση φωτός ορισμένου μήκους κύματος, επανενεργοποιούνται, πολλαπλασιάζονται και είναι πάλι λοιμογόνοι. Αυτό το φαινόμενο παρατηρείται και σε βακτήρια που έχουν σημασία για τη δημόσια υγεία, όπως τα κολοβακτηριοειδή και οι σιγκέλλες. Δεν παρατηρείται στους ιούς. Επειδή η υπεριώδης ακτινοβολία δεν έχει υπολειμματικό απολυμαντικό πρέπει να χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους απολύμανσης. 112

116 Πίνακας 4: Σύγκριση Μεθόδων Απολύμανσης. Μέθοδος Απολύμανσης Χαρακτηριστικό ΥΠΕΡΙΩΔΗΣ ΟΖΟΝΩΣΗ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΧΛΩΡΙΩΣΗ Απομάκρυνση κολοβακτηριδίων Πολύ καλή Πολύ καλή Πολύ καλή Απομάκρυνση ιών Πολύ καλή Καλή Μέτρια Πιθανότητες ενεργοποίησης μικροοργανισμών Καμία Σημαντική Ελάχιστη Επίδραση στον υδάτινο αποδέκτη Καμία Καμία Αύξηση διαλυτών στερεών Παραπροϊόντα απολύμανσης Κανένα Κανένα Αλογονοφόρμια Επικινδυνότητα παραπροϊόντων Μηδενική Μηδενική Μεγάλη Επικινδυνότητα χρησιμοποιούμενων χημικών Καμία Καμία Μεγάλη Κόστος εγκατάστασης Σημαντικό Σημαντικό Μέσο 113

117 17. Απομάκρυνση παθογόνων μικροοργανισμών κατά την επεξεργασία των λυμάτων Η επεξεργασία των αστικών λυμάτων έχει σκοπό την προστασία του περιβάλλοντος αλλά και της δημόσιας υγείας από επιβαρυντικούς ανθρωπογενείς παράγοντες. Οι κύριοι στόχοι της επεξεργασίας των λυμάτων είναι η μείωση του ΒΟD5 (Biochemical Oxygen Demand) και του αριθμού, των μικροοργανισμών. Ως προς την μείωση των μικροοργανισμών η επιτυχία της επεξεργασίας εξαρτάται από πολλές παραμέτρους όπως τον τύπο της επεξεργασίας, τον αριθμό και τα είδη των παθογόνων μικροοργανισμών, την θερμοκρασία και την χημική σύσταση του λύματος κλπ. Η φιλοσοφία της βελτίωσης της μικροβιολογικής ποιότητας του λύματος, πριν αποδοθεί στο περιβάλλον, είναι ο μικροβιακός πληθυσμός του λύματος, ο οποίος αποτελείται κυρίως από μικροοργανισμούς κοπρανώδους προέλευσης, να μετατραπεί και να αποτελείται από μικροοργανισμούς των επιφανειακών νερών. Ένας βασικός τομέας μελέτης είναι η ανακύκλωση των επεξεργασμένων λυμάτων και των παραπροϊόντων των μονάδων επεξεργασίας (ιλύς). Η ανακύκλωση αυτή επιτυγχάνεται με απόδοση των λυμάτων και της ιλύος στις καλλιέργειες για άρδευση ή λίπανση. Η δραστηριότητα αυτή πρέπει να εξασφαλίζει την επαναχρησιμοποίηση των λυμάτων και της ιλύος, η οποία αποφέρει προφανή περιβαλλοντικά και οικονομικά οφέλη, χωρίς να βάζει σε κίνδυνο την υγεία των ανθρώπων και των ζώων των αγροτικών και κτηνοτροφικών μονάδων. Ο κίνδυνος επιμόλυνσης της ενεργούς ιλύος από μη επεξεργασμένα λύματα με αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό εντερικών βακτηρίων μέσα στις δεξαμενές αποθήκευσης της ιλύος είναι ένα σημαντικό πρόβλημα στις μονάδες επεξεργασίας. Κατά τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας δύο είναι τα βασικά σημεία προσοχής πριν λύματα ή ιλύς διατεθούν στις καλλιέργειες: - Η επεξεργασία να επιτυγχάνει δραστική μείωση των παθογόνων πριν αυτά έρθουν σε επαφή με λαχανικά και φρούτα που καταναλώνονται ωμά. - Πριν την πρόταση και εφαρμογή οποιασδήποτε νομοθεσίας χρειάζεται προσεκτική μελέτη των τοπικών συνηθειών καλλιέργειας, κτηνοτροφικής δραστηριότητας και διατροφικών συνηθειών. Μηχανισμοί εξουδετέρωσης των μικροοργανισμών κατά την επεξεργασία των λυμάτων Η εξουδετέρωση των μικροοργανισμών γίνεται με φυσικούς (προσρόφηση, καθίζηση), χημικούς (μεταβολή του pη, της σκληρότητας, με τοξικές για τους μικροοργανισμούς ουσίες, μεταβολή της θερμοκρασίας, της συγκέντρωσης της αμμωνίας) και βιολογικούς (έλλειψη θρεπτικών και ορισμένων μεταβολικών ουσιών, ανταγωνισμός με άλλους οργανισμούς) μηχανισμούς. Ένας τρόπος για να υπολογίσουμε την ειδική θνησιμότητα (-μ) ενός παθογόνου (-x) σε ένα σύστημα είναι να τον καταμετρήσουμε στην είσοδο και στην έξοδο του συστήματος σε χρόνο (t-to). Ο αριθμός των παθογόνων που επιβιώνουν (x,) σε σχέση με τον αρχικό πληθυσμό μ (t-t0) (x 0 ) δίδεται από την εξίσωση: x 1 = x 0 e Τα λύματα έχουν πολύ σύνθετη σύνθεση. Οι ρυπαντές μπορεί να υπάρχουν με μορφή μεγάλων στερεών αντικειμένων, μικρότερων αιωρούμενων στερεών, διαλυμένων στερεών ή αερίων ουσιών. Οι διάφοροι τύποι επεξεργασιών έχουν σαν στόχο τη μείωση ενός ή 114

118 περισσοτέρων ρυπαντών. Οι περισσότερες επεξεργασίες έχουν κάποια επίδραση και στο μικροβιολογικό φορτίο των λυμάτων. Στις μονάδες βιολογικού καθαρισμού, ανάλογα με την ποσότητα και το είδος των εισερχομένων λυμάτων αλλά και τον αποδέκτη του επεξεργασμένου λύματος εφαρμόζεται μία ή περισσότερες τεχνολογίες εν σειρά. Για κάθε μονάδα υπάρχουν προδιαγραφές για τα χαρακτηριστικά των λυμάτων αλλά και των παραπροϊόντων της μονάδας στο τέλος της επεξεργασίας. Πρωτογενής καθίζηση Δεν γίνονται βιολογικές διεργασίες σε αυτή την φάση. Τα κοπρανώδη βακτήρια μειώνονται κατά 10% περίπου σε αυτό το στάδιο, οι ιοί σχεδόν καθόλου, ενώ η μείωση των παρασίτων εξαρτάται από το μέγεθος των ωών και των κύστεων. Αερόβια επεξεργασία με ενεργό ιλύ Η ενεργός ιλύς περιέχει διάφορα είδη αερόβιων οργανισμών οι οποίοι οξειδώνουν τις θρεπτικές ουσίες του λύματος. Ο όρος ενεργός ιλύς χρησιμοποιείται για κάθε επεξεργασία στην οποία η βιομάζα έχει την μορφή αιωρουμένων συσσωματωμάτων. Πολλά διαφορετικά είδη περιλαμβάνονται στα συσσωματώματα, όπως βακτήρια, μαστιγωτά, βλεφαριδοφόρα και αμοιβάδες. Η επεξεργασία με ενεργό ιλύ είναι πολύ αποτελεσματική στην απομάκρυνση παθογόνων μικροοργανισμών και μπορεί να μειώσει τον αρχικό μικροβιακό πληθυσμό μέχρι και 90%. Ο κύριος μηχανισμός απομάκρυνσης των μικροοργανισμών μέσω της επεξεργασίας με ενεργό ιλύ είναι η προσρόφηση τους στα συσσωματώματα όπου καταναλώνονται από διαφορά πρωτόζωα. Στην εξέλιξη αυτής της διαδικασίας σημαντικό ρόλο παίζουν οι αμοιβάδες. Ειδικά για την Ε. cοli, ερευνητές έχουν αποδείξει ότι έχει τη δυνατότητα πολλαπλασιασμού, έστω και με αργούς ρυθμούς, μέσα στην ενεργό ιλύ. Ο πολλαπλασιασμός όμως αυτός δεν παρατηρείται όταν στη ενεργό ιλύ υπάρχει μεγάλος αριθμός αμοιβάδων. Έχει επίσης παρατηρηθεί ότι η μεγαλύτερη μείωση του αρχικού πληθυσμού της Ε. cοli στο λύμα γίνεται την πρώτη ώρα μετά από την είσοδο του λύματος στην δεξαμενή αερισμού. Μέσα στα συσσωματώματα, εκτός από την κατανάλωσή τους από πρωτόζωα, τα κοπρανώδη βακτήρια εξουδετερώνονται και με άλλους μηχανισμούς, όπως η φυσική τους εξόντωση λόγω έλλειψης θρεπτικών ουσιών και με την αύξηση του pη του λύματος. Η προσρόφηση στα συσσωματώματα είναι και ο κύριος μηχανισμός απομάκρυνσης των ιών. Η προσρόφηση τους γίνεται πολύ γρήγορα, συχνά τα τρία πρώτα λεπτά ανάμιξης του λύματος στη δεξαμενή αερισμού, και μπορεί να εξουδετερώσει το 90-98% του αρχικού πληθυσμού των ιών. Τα ωά και οι κύστεις των πρωτοζώων επιβιώνουν κατά την επεξεργασία με ενεργό ιλύ. 115

119 Πίνακας 5: Γένη βακτηρίων στην ενεργό ιλύ Φίλτρα διήθησης Αποτελούνται από μια μάζα χαλικιών, τεμαχισμένου βράχου ή άλλων υλικών πετρώδους σύστασης, πάχους m. Είναι παρά πολύ αποτελεσματικά στην απομάκρυνση των κολοβακτηριοειδών επιτυγχάνοντας μείωση της τάξεως του 95%.Ο μηχανισμός της απομάκρυνσης είναι παρόμοιος με της ενεργού ιλύος, με την διαφορά ότι η βιομάζα είναι προσκολλημένη στη επιφάνεια των φίλτρων δημιουργώντας βιολογικό υμένιο. Έτσι οι πιθανότητες επαφής της βιομάζας με τα κοπρανώδη βακτήρια είναι κάπως μειωμένη. Η αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας είναι καλύτερη στα φίλτρα χαμηλής ροής (90-97%) από τα φίλτρα υψηλής ροής (6-74%), επειδή είναι μεγαλύτερος ο χρόνος επαφής των κοπρανωδών βακτηρίων με τη βιομάζα. Τα διηθητικά φίλτρα όμως δεν είναι αποτελεσματικά στην απομάκρυνση ωών και κύστεων πρωτόζωων. Αναερόβια επεξεργασία Αυτή η επεξεργασία είναι πολύ αργή σε σχέση με την αερόβια επεξεργασία και ενδείκνυται για λύματα με υψηλό ΒΟD. Ο κύριος στόχος είναι η απομάκρυνση δυσάρεστων οσμών και παθογόνων μικροοργανισμών από τα λύματα. Κατά την αερόβια επεξεργασία οι οργανικές ουσίες μειώνονται με μετατροπή 30-40% των στερεών σε αέρια, κυρίως μεθάνιο. Έτσι το σταθεροποιημένο προϊόν μπορεί ευκολότερα να αποτεθεί στο περιβάλλον ή να ανακυκλωθεί. Η αναερόβια χώνεψη χρησιμοποιεί ένα μίγμα από αναερόβιους μικροοργανισμούς. Συχνά εφαρμόζεται θέρμανση για να επιταχυνθούν οι βιοχημικές αντιδράσεις, σε μεσόφιλες συνήθως θερμοκρασίες ο C. Για να ολοκληρωθεί η μεσόφιλη αναερόβια επεξεργασία συνήθως απαιτούνται ημέρες, αν και συχνά εφαρμόζεται μόνο για ημέρες. Οι μικροοργανισμοί που εμπλέκονται στη διαδικασία είναι κυρίως υδρολυτικά. μεθανογεννητικά βακτήρια, που προέρχονται κυρίως από κόπρανα. Η αναερόβια επεξεργασία εφαρμόζεται συνήθως όταν η ενεργός ιλύς πρόκειται να διατεθεί στις καλλιέργειες για λίπασμα. Σ αυτήν την περίπτωση πρέπει η ενεργός ιλύς να μην περιέχει εντερικούς παθογόνους μικροοργανισμούς. Για τον μικροβιολογικό έλεγχο της ιλύος πριν αποτεθεί στις καλλιέργειες συνήθως χρησιμοποιούνται η Salmonella και η Taenia saginata. 116

120 Η επιβίωση των κοπρανωδών μικροοργανισμών κατά τη αναερόβια επεξεργασία εξαρτάται από πολλούς παράγοντες όπως η θερμοκρασία, ο τύπος και η χρονική της διάρκεια. Κατά μέσο όρο η μείωση του αρχικού πληθυσμού της Salmonella υπολογίζεται σε 90% και της Taenia saginata σε 100%. Ικανοποιητική μείωση παρουσιάζουν οι πληθυσμοί του Vibrio cholerae και των πρωτοζώων ενώ το Mycobacterium παρουσιάζει αντοχή. Η απομάκρυνση των ιών απαιτεί αυξημένη θερμοκρασία. Η καλύτερη απόδοση της αναερόβιας επεξεργασίας έναντι άλλων επεξεργασιών ως προς την μείωση των παθογόνων οφείλεται στους μεγάλους χρόνους εφαρμογής της, το αυξημένο pη που οφείλεται σε φωτοσυνθετικές δραστηριότητες της βιομάζας και στην έντονη παρουσία του ζωοπλαγκτού το οποίο καταναλώνει τους κοπρανώδεις μικροοργανισμούς. Πίνακας 6: Μικροβιακή σύσταση αναερόβιας χώνεψης Δεξαμενές οξείδωσης Είναι δεξαμενές που έχουν σκαφτεί μέσα στο χώμα όπου τα λύματα παροχετεύονται και αποθηκεύονται από 5-50 μέρες. Κατά την διάρκεια της αποθήκευσης ο μεταβολισμός των βακτηρίων προκαλεί αποσύνθεση των πρωτεϊνικών αλυσίδων και άλλων οργανικών υλών, με αποτέλεσμα την παροδική πτώση του pη του λύματος. Η παραγωγή της αμμωνίας προκαλεί αύξηση του pη προς την ουδέτερη περιοχή με αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό των φυκών. Ο πολλαπλασιασμός αυτός θα αυξήσει το pη στην αλκαλική ζώνη ( ). Οι δραστηριότητες στην δεξαμενή οξείδωσης μετρώνται με την μείωση του ΒΟD και του αριθμού των κοπρανωδών βακτηρίων καθώς και με τις μεταβολές του pη και της συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου την μέρα και την νύχτα. Οι μεταβολές αυτές προκαλούν και την αδρανοποίηση των παθογόνων βακτηρίων στις δεξαμενές. Περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως η ηλιακή ακτινοβολία και η θερμοκρασία καθώς και η φυσική εξάτμιση, η οποία αυξάνει την αλατότητα του λύματος, επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας. Η ηλιακή ακτινοβολία καταστρέφει τα κοπρανώδη κολοβακτηριειδή μέσα στις δεξαμενές με ένα μηχανισμό φωτοευαισθητοποίησης. Η ικανότητα του ορατού φάσματος να προκαλέσει αυτούς τους μηχανισμούς εξαρτάται από την παρουσία μέσα στο λύμα διαλυτών ευαισθητοποιητών, συνήθως χουμικών ουσιών. Ο μηχανισμός δραστηριοποιείται μόνο με την παρουσία οξυγόνου και είναι πολύ πιο έντονος σε υψηλό pη. Η θερμοκρασία της επεξεργασίας παίζει σημαντικό ρόλο στην μείωση των κοπρανωδών βακτηρίων. 117

121 Εξουδετέρωση των ιών εντερικής προέλευσης με τη μέθοδο ενεργού ιλύος Η μέθοδος της Ενεργού Ιλύος αποτελεί την πιο κατάλληλη βιολογική επεξεργασία των αποβλήτων για την απομάκρυνση των ιών. Έχει διαπιστωθεί ότι πάνω από το 90% των ιικών σωματιδίων προσκολλώνται στα αιωρούμενα στερεά και μεταφέρονται στη λάσπη κατά την πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμιά καθίζηση. Οι Glass και O Brien (1980) αναφέρουν ότι μετά από 10 ώρες αερισμό, το 25% των ιών απομακρύνθηκε μεταφερόμενο στη λάσπη και το 75% απενεργοποιήθηκε στο στάδιο βιολογικής επεξεργασίας των λυμάτων. Κατά συνέπεια, η μέθοδος της ενεργού ιλύος δεν αρκεί για την πλήρη απομάκρυνση των ιών ούτε για την απενεργοποίησή τους. Στην Ινδία όπως αναφέρουν ο Rao και οι συνεργάτες του (1977) με την εφαρμογή της παραπάνω μεθόδου απομακρύνθηκε το 90%-99% των ιών εντερικής προέλευσης. Επιπλέον, παρόμοια έρευνα στο Χιούστον των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής έδειξε ότι απομακρύνθηκε το 93%-99% των ρότα ιών στα επεξεργασμένα απόβλητα. Σε κάποιες περιπτώσεις όμως όπως για παράδειγμα σε βιολογικό καθαρισμό στη Γαλλία επιτεύχθηκε απομάκρυνση των εντεροϊών σε ποσοστά μόλις 48% και 69%. Είναι γεγονός ότι έχουν απομονωθεί ιοί εντερικής προέλευσης (polio-ιοί, coxsackie-ιοί Α και Β, echo-ιοί, ρότα ιοί, reo-ιοί και αδενοϊοί) σε διάφορες περιοχές σε μερικώς επεξεργασμένα απόβλητα. Επιπλέον, έχουν αναφερθεί περιπτώσεις όπου τα λύματα δεν έχουν απολυμανθεί από ιούς μετά τη δευτερογενή επεξεργασία τους. Συνοπτικά η απομάκρυνση ή η απενεργοποίηση των ιών με τη μέθοδο της ενεργού ιλύος πραγματοποιείται ως εξής : Α) Με την προσρόφηση των ιών στα αιωρούμενα στερεά οπότε μεταφέρονται στη λάσπη. Β) Απενεργοποίηση των ιών ως αποτέλεσμα της δράσης βακτηρίων. Γ) Κατανάλωση των ιών από πρωτόζωα και μετάζωα. 118

122 18. Άλλοι τρόποι εξυγίανσης των λυμάτων και της ενεργού ιλύος Κομποστοποίηση Ως κομποστοποίηση (composting) των οργανικών υπολειμμάτων ορίζετε ως η βιολογική διαδικασία αποδόμησης και σταθεροποίηση των υλικών αυτών. Με τον όρο σταθεροποίηση εννοούμε: 1. Να αποκτήσει μια μορφή που να είναι βιολογικά σχετικά αδρανή, απουσία έντονων μικροβιακών δραστηριοτήτων και διάσπαση των πολύπλοκων οργανικών μεγαλομορίων σε πιο σταθερά οργανικά και ανόργανα συστατικά). 2. Να μειωθεί ή ακόμα και εξαφανιστεί η δυσάρεστη οσμή που μερικά οργανικά υλικά αναδίνουν. 3. Να μειωθεί ή και να καταστραφεί πλήρως το παθογόνο για τον άνθρωπο μικροβιακό φορτίο, καθώς και παθογόνοι μικροοργανισμοί φυτών και ζώων. 4. Να μειωθεί ο όγκος των υλικών αυτών καθώς και η υγρασία τους έτσι ώστε να είναι ευκολότερη και πλέον οικονομική η μεταφορά τους από το σημείο συσσώρευσης-παραγωγής στο σημείο εφαρμογής. 5. Να μειωθεί η φυτοτοξική δράση του οργανικού φορτίου μέσα από διαδικασίες ωρίμανσης του υλικού. 6. Να παραχθεί τελικά ένα οργανικό υλικό που θα μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί σε διάφορες καλλιέργειες καλύπτοντας έτσι ανάγκες σε οργανικό λίπασμα αλλά και την Ευρωπαϊκή Νομοθεσία που απαιτεί την ανάκτηση κέρδους από τα απορρίμματα (ενέργεια ή υλικά). Κατά την κομποστοποίηση η λάσπη αναμιγνύεται με οργανικές ουσίες όπως οικιακά απορρίμματα, ρινίσματα ξύλου ή φύλλα και αποθηκεύεται για 3-4 εβδομάδες ώστε να υποστεί αποσύνθεση. Συγχρόνως γίνεται αερισμός με ανάδευση ή παροχή αέρα. Η χρήση μη σταθεροποιημένης οργανικής ύλης στις καλλιέργειες μπορεί να δημιουργήσει διάφορα προβλήματα όπως ανταγωνισμό των μικροοργανισμών με τις ρίζες των φυτών για τα θρεπτικά συστατικά, φυτοτοξικότητα και διασπορά παθογόνων μικροοργανισμών. Επειδή η κομποστοποίηση γίνεται σε θερμοκρασίες C, έχει σαν αποτέλεσμα την αδρανοποίηση πολλών παθογόνων μικροοργανισμών. Η κομποστοποίηση είναι αποτελεσματική έναντι των κύστεων των πρωτοζώων, των αυγών των σκωλήκων, των παθογόνων βακτηρίων και των ιών αν η επεξεργασία διαρκέσει τουλάχιστον 50 ημέρες. Η κομποστοποίηση είναι μια φυσική βιολογική διαδικασία αποδόμησης που η παρέμβαση του ανθρώπου απλώς έχει εντατικοποιήσει και μεγιστοποιήσει την απόδοση της. Η διαδικασία είναι μικροβιακή, αερόβια και θερμόφιλη, Γιατί μικροβιακή: ένας μεγάλος, ποικιλόμορφος και πολυπληθέστερος συνδυασμός διαφορετικών μικροοργανισμών (μύκητες, βακτήρια, ζύμες, ακτινομύκητες κ.α.) καθώς και οργανισμών (γαιοσκώληκες κ.α.) είναι υπεύθυνοι για τη διαδικασία αυτή. Μελέτες έχουν αποδείξει ότι η θανάτωση των μικροοργανισμών δεν οφείλεται μόνο στη δράση της θερμοκρασίας αλλά και σε άλλα φαινόμενα και κυρίως την ανταγωνιστική δράση των 119

123 μικροοργανισμών. Είναι γνωστό άλλωστε ότι πλειάδα μικροοργανισμών παράγουν αντιβιοτικά ως μέρος της προσπάθειας τους να κυριαρχήσουν έναντι ανταγωνιστικών μικροοργανισμών. Εικόνα 74: Η τροφική αλληλουχία οργανισμών που λαμβάνουν μέρος στη διαδικασία κομποστοποίησης Εικόνα 75: Γενική σχηματική εικόνα του ισοζυγίου κατά τη διάρκεια της κομποστοποίησης. 120