ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕ ΤΙΤΛΟ

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕ ΤΙΤΛΟ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΓΕΝΟΥΣ ΝΕΥΡΩΝΙΚΟΥ ΔΙΚΤΥΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΠΑΠΑΛΕΩΝΙΔΟΠΟΥΛΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2018

2 ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕ ΤΙΤΛΟ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΓΕΝΟΥΣ ΝΕΥΡΩΝΙΚΟΥ ΔΙΚΤΥΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΠΑΠΑΛΕΩΝΙΔΟΠΟΥΛΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2018 ii

3 Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Ιατρικής Βασίλειος Παπαλεωνιδόπουλος Με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος iii

4 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΠΑΠΑΘΕΟΔΩΡΟΠΟΥΛΟΣ - Καθηγητής, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΑΔΑΜΑΝΤΙΑ ΜΗΤΣΑΚΟΥ - Καθηγήτρια, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΣ - Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΠΑΠΑΘΕΟΔΩΡΟΠΟΥΛΟΣ - Καθηγητής, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΑΔΑΜΑΝΤΙΑ ΜΗΤΣΑΚΟΥ - Καθηγήτρια, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΣ - Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΒΟΥΚΕΛΑΤΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ - Επίκουρη Καθηγήτρια, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΚΟΝΣΟΥΛΑΣ ΧΡΗΣΤΟΣ - Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών ΚΟΣΜΙΔΗΣ ΕΥΣΤΡΑΤΙΟΣ - Επίκουρος καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. ΨΑΡΡΟΠΟΥΛΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ - Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών & Τεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. iv

5 Περιεχόμενα Περίληψη... 1 Abstract... 4 Πρόλογος Εισαγωγή Γενικά περί ιπποκάμπου Ιππόκαμπος και Μνήμη Ανατομία του ιπποκάμπου Συνδέσεις ιπποκάμπου Συναπτική διαβίβαση και νευροδιαβιβαστές Συναπτική Πλαστικότητα Βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα Μακρόχρονη συναπτική πλαστικότητα Διάφραγματο-κροταφική διαφοροποίηση Σκοπός της μελέτης Υλικά και μέθοδοι Πειραματόζωα In vitro τομές ιπποκάμπου Παρασκευή Τομών Ιπποκάμπου Εξωκυττάριες καταγραφές στην περιοχή CA1 τομών ιπποκάμπου Διαλύματα και φαρμακολογικοί παράγοντες Ανοσοαποτύπωση κατά Western Απομόνωση πρωτεϊνών CA1 περιοχής τομών ιπποκάμπου Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (q-pcr) Αποτελέσματα Μελέτη της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας στον ιππόκαμπο του επίμυος Βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα του ιππόκαμπου Βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα στο ραχιαίο, ενδιάμεσο και κοιλιακό τμήμα του ιπποκάμπου Συζήτηση Συμπεράσματα v

6 3.2 LTP και β-αδρενεργικοί υποδοχείς Η ενεργοποίηση των β-ar μειώνει το κατώφλιο επαγωγής LTP στον VH Η ενδογενής ενεργοποίηση των β-ar συνεισφέρει στην σταθεροποίηση της LTP μόνο στον VH Το πλάτος της επαγόμενης LTP από ισχυρό πρωτόκολλο TBS αυξάνεται από την ενεργοποίηση των β-ar στον VH και στον DH, όμως κατά τον αποκλεισμό των β-ar το πλάτος μειώνεται μόνο στον VH Η ενεργοποίηση των β-ar διευκολύνει την επαγωγή LTP που εξαρτάται από VDCC μόνο στον VH Οι β-ar ελέγχουν την τονική συναπτική διαβίβαση περισσότερο στον DH σε σχέση με τον VH Η ενεργοποίηση των β-ar αυξάνει σημαντικά τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα κατά την επίδοση του TBΤ πρωτοκόλλου στον VH αλλά όχι στον DH Η αύξηση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας που επάγεται από την ενεργοποίηση των β- AR κατά την επίδοση του ΤΒΤ είναι ανεξάρτητη της GABAεργικής αναστολής Η ενεργοποίηση των β-ar διευκολύνει την επαγωγή LTP από υψηλής συχνότητας ερεθισμό (HFS) στον VH αλλά όχι στον DH Η έκφραση της LTP δεν περιλαμβάνει αλλαγές στη διευκόλυνση που παρατηρείται κατά τη σύζευξη παλμών (PPF) Πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων οι β-ar διευκολύνουν την επαγωγή LTP Λειτουργικές συνέπειες της τροποποίησης της επαγωγής της LTP από τους β-ar για τον VH και τον DH Συμπεράσματα LTP και υποδοχείς ντοπαμίνης Η ενεργοποίηση των υποδοχέων D1/D5 από την ενδογενή ντοπαμίνη συνεισφέρει εξίσου στην επαγωγή της LTP στον VH και στον DH Εξωγενής ενεργοποίηση των υποδοχεών D1/D5 ενισχύει την επαγωγή LTP μόνο στον VH και όχι στον DH Η έκφραση του D1 υποδοχέα σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης είναι υψηλότερη στον VH σε σχέση με τον DH Συζήτηση Συζήτηση-Συμπεράσματα Βιβλιογραφία vi

7 Πίνακας Συντομεύσεων-Ακρωνύμια AMPA NMDA HFS fepsp FV GABA LTP PS TBS VDCC α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid N-methyl-D-aspartic acid High Frequency Stimulation Field Excitatory postsynaptic potential Fiber volley γ-aminobutyric acid Long-term potentiation Population Spike Theta Burst Stimulation Voltage-dependent calcium channel vii

8 Περίληψη Ο ιππόκαμπος αποτελεί εγκεφαλική δομή που εμπλέκεται σημαντικά σε μνημονικές διεργασίες, με λειτουργική ετερογένεια κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα. Ο ραχιαίος ιππόκαμπος είναι υπεύθυνος για τη χωρική πλοήγηση ενώ ο κοιλιακός ευθύνεται για την επεξεργασία συγκινησιακών πληροφοριών μέσω μηχανισμών που ακόμα δεν έχουν διευκρινιστεί. Στην παρούσα διατριβή, που αποτελείται από τρεις επιμέρους μελέτες, χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία της in vitro ηλεκτροφυσιολογίας σε λεπτές τομές ιπποκάμπου με καταγραφή του μετασυναπτικού διεγερτικού δυναμικού στις συνάψεις της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου, ώστε να προσδιορίσουμε παράγοντες που ευθύνονται για τη ραχιαιοκοιλιακή διαφοροποίηση. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήσαμε τις ιδιότητες της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας των συνάψεων κατά μήκος ολόκληρου του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου, χρησιμοποιώντας πρωτόκολλο ερεθισμού των προσυναπτικών ινών του Schaffer, που αποτελούταν από δέκα παλμούς που επιδίδονταν σε διαφορετικά διαπαλμικά διαστήματα. Το αποτέλεσμα από την επίδοση παλμών σε συχνότητες από 0,1-100 Hz ήταν σταδιακή αλλαγή των μετασυναπτικών απαντήσεων από συναπτική διευκόλυνση στο ραχιαίο πόλο σε συναπτική καταστολή στον κοιλιακό πόλο του ιπποκάμπου. Επίσης ο δεύτερος παλμός παρουσίαζε διευκόλυνση σε όλο το μήκος του ιπποκάμπου για τις συχνότητες 1-40 Hz. Πιο συγκεκριμένα οι συνάψεις από το ραχιαίο ιππόκαμπο παρουσίασαν διευκόλυνση σε συχνοτικούς ερεθισμούς μέχρι και τα 50 Hz και καταστολή στα Hz, με μέγιστη διευκόλυνση στα 20Hz. Αντίθετα οι συνάψεις του κοιλιακού ιππόκαμπου παρουσίασαν μετασυναπτική καταστολή σε όλο το φάσμα συχνοτικών ερεθισμών που χρησιμοποιήθηκαν. Οι συνάψεις από τον ενδιάμεσο ιππόκαμπο εμφάνισαν ενδιάμεση μετασυναπτική συμπεριφορά σε σχέση με τον ραχιαίο και τον κοιλιακό ιππόκαμπο. Συμπερασματικά η βραχύχρονη πλαστικότητα εμφανίζει σταδιακή μεταβολή κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου, γεγονός το οποίο στηρίζει περαιτέρω τη λειτουργική διαφοροποίηση του ραχιαίου από τον κοιλιακό ιππόκαμπο στην επεξεργασία της πληροφορίας. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η μακρόχρονη συναπτική πλαστικότητα στο ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο, έπειτα από επίδοση ερεθισμών στο πρότυπο του θήτα 1

9 ρυθμού αλλά και σε υψίσυχνο ερεθισμό σε συνθήκες ενεργοποίησης και αποκλεισμού των β αδρενεργικών υποδοχέων (β-ar). Οι β-ar ενεργοποιούνται κάτω από καταστάσεις συγκινησιακής φόρτισης όπου απελευθερώνεται νοραδρεναλίνη στον ιππόκαμπο τροποποιώντας τη συναπτική πλαστικότητα και την παγίωση της μνήμης. Η μακρόχρονη συναπτική ενδυνάμωση επηρεάζεται περισσότερο στον κοιλιακό ιππόκαμπο από την ενεργοποίηση των β- AR, σε σχέση με τον ραχιαίο. Πιο συγκεκριμένα η ενεργοποίηση των β-ar από τον αγωνιστή ισοπροτερενόλη μειώνει το κατώφλιο επαγωγής μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης μόνο στον κοιλιακό ιππόκαμπο, μέσω αύξησης της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας και ενεργοποίησης των καναλιών ασβεστίου L-VDCC. Η μείωση του κατωφλίου στον κοιλιακό ιππόκαμπο δεν περιλαμβάνει αλλαγές σε προσυναπτικούς μηχανισμούς, ούτε στην αναστολή. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι β-ar δρουν ως διακόπτης που επάγει τη συναπτική πλαστικότητα στον κοιλιακό ιππόκαμπο και παρέχει ένα στοιχείο στους μηχανισμούς που υπόκεινται την εμπλοκή του κοιλιακού ιππόκαμπου σε συγκινησιακές καταστάσεις. Στο τρίτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η δράση των ντοπαμινεργικών υποδοχέων στη μακρόχρονη συναπτική ενδυνάμωση στον ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο, καθώς η ντοπαμίνη τροποποιεί τη συναπτική πλαστικότητα και η ντοπαμινεργική εννεύρωση είναι διαφορετικά κατανεμημένη μεταξύ των δύο πόλων του ιπποκάμπου. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η ενδογενής ντοπαμίνη, που απελευθερώνεται κατά την επίδοση παλμών σε πρότυπο θήτα ρυθμού για την επαγωγή μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης, παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στο ραχιαίο όσο και στον κοιλιακό ιππόκαμπο. Η ενεργοποίηση των D1/D5 ντοπαμινεργικών μέσω του αγωνιστή SKF38393 σε χαμηλή, μέτρια και αυξημένη συγκέντρωση δεν είχε κάποια επίδραση στην επαγωγή της μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης. Αντίθετα ο ειδικός αγωνιστής των D1 υποδοχέων SKF82958 αύξησε την επαγόμενη μακρόχρονη συναπτική ενδυνάμωση μόνο στον κοιλιακό ιππόκαμπο, αποτέλεσμα το οποίο συνάδει με την αυξημένη έκφραση του D1 υποδοχέα στον κοιλιακό ιππόκαμπο τόσο σε επίπεδο mrna αλλά και σε επίπεδο πρωτεΐνης. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η δράση της ντοπαμίνης είναι μεγαλύτερη στον κοιλιακό ιππόκαμπο, ώστε να αποκρίνεται σε πληροφορίες που επιδίδονται από ισχυρά ερεθίσματα του περιβάλλοντος που σηματοδοτούνται από το ντοπαμινεργικό σύστημα. 2

10 Λέξεις-κλειδιά: Ιππόκαμπος, ραχιαιοκοιλιακός άξονας, επιμήκης άξονας, βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα, συναπτική διαβίβαση, διευκόλυνση, καταστολή, φιλτράρισμα συχνοτήτων, δυναμική των συνάψεων, in vitro, τομές ιπποκάμπου επίμυ, μαρκόχρονη συναπτική πλαστικότητα, μακρόχρονη συναπτική ενδυνάμωση, β αδρενεργικοί υποδοχείς, νοραδρεναλίνη, ντοπαμίνη, ντοπαμινεργικοί υποδοχείς D1/D5, ερεθισμός θήτα ριπών. 3

11 Abstract The hippocampus is a functionally heterogeneous structure with the cognitive and emotional signal processing ascribed to the dorsal (DH) and the ventral hippocampus (VH) respectively. However, the underlying mechanisms are poorly understood. In the present study, which is consisted of three parts, we used field excitatory postsynaptic potentials (fepsps) from transverse rat hippocampal slices, which were maintained in a recording chamber, in order to determine which proteins might play a role in dorsoventral diversification. In the first part of this study we examined the short-term synaptic plasticity, which plays fundamental roles in information processing and may be importantly involved in diversifying the properties of local neuronal network along the hippocampus long axis. Therefore, we aimed to examine the properties of the CA1 synapses along the entire dorsoventral axis of the rat hippocampus and a frequency stimulation paradigm. Applying a ten-pulse stimulus train at frequencies from 0.1 to 100 Hz to the Schaffer collaterals we found a gradually diversified pattern of frequency-dependent synaptic effects along the dorsoventral hippocampus axis. The first conditioned response was facilitated along the whole hippocampus for stimulus frequencies Hz. However, steady-state responses or averaged responses generally ranged from maximum synaptic facilitation in the most dorsal segment of the hippocampus to maximum synaptic depression in the most ventral hippocampus. In particular, dorsal synapses facilitated for stimulus frequency up to 50 Hz while they depressed at higher frequencies ( Hz). Facilitation at dorsal synapses was maximal at stimulus frequency of 20 Hz. On the contrary, the most ventral synapses showed depression regardless of the stimulus frequency, only displaying a transient facilitation at the beginning of Hz stimulation. Importantly, the synapses in the medial hippocampus displayed a transitory behavior. Finally, as a whole the hippocampal synapses maximally facilitated at 20 Hz and increasingly depressed at Hz. The aforementioned results indicate that the short-term synaptic dynamics change gradually along the hippocampal long axis conveying distinct properties of information processing to successive segments of the structure crucially supporting functional segregation along the dorsoventral axis of the hippocampus. In the second part of this study we analysed the effects of β adrenergic receptors activation and blockade in long term potentiation, induced after theta burst stimulation and high 4

12 frequency stimulation in dorsal and ventral pole of the hippocampus. Noradrenaline is released during emotional arousal in the hippocampus and through activation of β adrenergic receptors (β- AR) modulates synaptic plasticity and memory consolidation. We demonstrate that long-term potentiation (LTP) induced either by theta-burst stimulation (TBS) that mimics a physiological firing pattern of hippocampal neurons or by high-frequency stimulation is remarkably more sensitive to β-ar activation in VH than in DH. Thus, pairing of subthreshold primed burst stimulation with activation of β-ar agonist isoproterenol (1 μm) resulted in a reliable induction of NMDA receptor-dependent LTP in the VH without affecting LTP in the DH. Activation of β- AR by isoproterenol during intense TBS increased the magnitude of LTP in both hippocampal segments but facilitated voltage-gated calcium channel-dependent LTP in VH only. Endogenous β-ar activation contributed to the stabilization and increased the magnitude of LTP in VH but not DH as demonstrated by the effects of the β-ar antagonist propranolol (10 μm). Exogenous (but not endogenous) β-ar activation strongly increased TBS-induced facilitation of postsynaptic excitability in VH. In DH, isoproterenol only produced a moderate and GABAergic inhibition-dependent enhancement in the facilitation of synaptic burst responses. Paired-pulse facilitation did not change with LTP at any experimental condition, suggesting that expression of LTP does not involve presynaptic mechanisms. These findings suggest that β-ar may act as a switch that selectively promotes synaptic plasticity in the VH through multiple mechanisms and provide thus a first clue to mechanisms that underlie VH involvement in emotionality. In the third part of this study we analysed the effects of dopaminergic receptors D1/D5 in long term potentiation in dorsal and ventral pole of the hippocampus, since dopamine modulates synaptic plasticity and dopaminergic innervation appears to be disproportionally segregated along the hippocampal longitudinal (dorsoventral) axis with unknown consequences for synaptic plasticity. In this part of the study we examined the actions of endogenously released dopamine and the effects of exogenous D1/D5 dopamine receptor agonists on theta-burst stimulationinduced long-term potentiation (LTP) of field excitatory synaptic potential (fepsp) at Schaffer collateral-ca1 synapses in slices from dorsal (DH) and ventral hippocampus (VH). Furthermore, we quantified D1 receptor mrna and protein expression levels in DH and VH. We found that blockade of D1/D5 receptors by SCH (20 μm) significantly reduced the magnitude of LTP in both DH and VH similarly suggesting that endogenously released dopamine exert a homogeneous modulation of LTP along the hippocampal long axis. Moderate to high 5

13 concentrations of the selective partial D1/D5 receptor agonist SKF ( μm) did not significantly change LTP in either hippocampal segment. However, the full D1 receptor selective agonist SKF (10 μm) significantly enhanced LTP in VH but not DH. Furthermore, the expression of D1 receptor mrna and protein was considerably higher in VH compared to DH. These results suggest that the dynamic range of D1/D5 receptor-mediated dopamine effects on LTP may be higher in VH than DH and that VH may be specialized to acquire information about behaviorally relevant strong stimuli signaled by the dopamine system. Keywords: Hippocampus, dorsoventral, septotemporal, longitudinal axis, short-term plasticity, synaptic transmission, facilitation, depression, frequency filtering, synaptic dynamics, in vitro, rat slices, long term synaptic plasticity, long-term potentiation, beta adrenergic receptor, noradrenaline, dopamine, D1/D5 receptor, theta-burst stimulation. 6

14 Πρόλογος Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Νευροφυσιολογίας στο τμήμα Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών από τον Μάρτιο του 2015 έως τον Ιούλιο του Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Παπαθεοδωρόπουλο που πριν τρία χρόνια αποκρίθηκε θετικά στην πρόθεσή μου να συμμετάσχω στην ερευνητική του ομάδα ως υποψήφιος διδάκτωρ. Μου έδωσε την ευκαιρία να ασχοληθώ με το άκρως ενδιαφέρον πεδίο της ηλεκτροφυσιολογίας στον ιππόκαμπο και στη μελέτη της βραχύχρονης αλλά και της μακρόχρονης συναπτικής πλαστικότητας. Τον ευχαριστώ εγκάρδια γιατί χωρίς τις ανεκτίμητες συμβουλές του και τη συνεχή του υποστήριξη, τόσο ηθική όσο και υλική, θα ήταν αδύνατη η πραγματοποίηση της εν λόγω διδακτορικής διατριβής. Επίσης τον ευχαριστώ για τις συζητήσεις μέσω των οποίων κατανόησα την μεθοδολογία και την αξία της ορθής πρακτικής της έρευνας. Όσες ευχαριστίες και να γράψω, θεωρώ ότι δεν θα είναι ποτέ επαρκείς ώστε να καταδείξω το πόσο θετικά με έχει επηρεάσει ο κ. Παπαθεοδωρόπουλος και πόσο με έχει στηρίξει αυτά τα τρία χρόνια. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, κ. Μητσάκου Αδαμαντία και κ. Σταθόπουλο Γεώργιο για την καθοδήγηση, τις συμβουλές τους και για την κριτική σκέψη κατά την συγγραφή του κειμένου. Επιπλέον, ευχαριστώ θερμά τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, κ. Βουκελάτου Γεωργία, κ. Κόνσουλα Χρήστο, κ. Κοσμίδη Ευστράτιο, κ. Ψαρροπούλου Αικατερίνη που δέχτηκαν εγκάρδια να συμμετάσχουν στην επιτροπή ώστε να ολοκληρωθεί η διδακτορική μου διατριβή. Επιπρόσθετα θα ήθελα να ευχαριστήσω το Ελληνικό Ίδρυμα Έρευνας και Καινοτόμιας (ΕΛΙΔΕΚ) και την Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας (ΓΓΕΤ) για την υποτροφία που μου παρείχαν, μέσω της οποίας μπόρεσα καλύψω τις οικονομικές μου ανάγκες κατά το τελευταίο έτος εκπόνησης της διδακτορικής μου διατριβής Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τα άτομα τα οποία με στήριξαν και με ώθησαν ώστε να περατώσω αυτή τη διατριβή. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω την Δρ. Γιοπάνου Ιωάννα που με ανέχεται όλα αυτά τα χρόνια τόσο σε προσωπικό όσο και σε επαγγελματικό επίπεδο. Ακόμα θέλω να ευχαριστήσω τον αδελφικό φίλο και συνεργάτη Δρ. Κούβαρο Στυλιανό, ο οποίος μου συμπαραστάθηκε σε πολλές στιγμές και στη συνέχεια με εκπαίδευσε και μου έδειξε τα μυστικά 7

15 της ηλεκτροφυσιολογίας. Επιπρόσθετα θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη του εργαστηρίου Γεώργιο Τρομπούκη και Ανδριάννα Κουτσούμπα για το ευχάριστο κλίμα που επικρατούσε στο εργαστήριο και τις πολύωρες συζητήσεις. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου τους γονείς μου για την υπομονή τους, για την αμέριστη συμπαράσταση και για την ατελείωτη υποστήριξή τους όλα αυτά τα χρόνια, ώστε να καταφέρω να εκπληρώσω τα ονειρά μου και τελικά να γίνω καλύτερος άνθρωπος. 8

16 9

17 Στους γονείς μου Στην Ιωάννα 10

18 1. Εισαγωγή 1.1. Γενικά περί ιπποκάμπου Ο ιππόκαμπος έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε μνημονικές διαδικασίες στον άνθρωπο (Penfield and Mathieson 1974), κατά συνέπεια αποτελεί μια ελκυστική εγκεφαλική δομή για την έρευνα των διαδικασιών μνήμης και μάθησης, για την διερεύνηση της συναπτικής και νευρωνικής πλαστικότητας και λειτουργίας, καθώς επίσης και για την κατασκευή μοντέλων νευρωνικών δικτύων. Ο ιππόκαμπος στις ημέρες μας αποτελεί μία από τις καλύτερα μελετημένες περιοχές του εγκεφαλικού φλοιού, διότι η σχετικά απλή οργάνωση των στιβάδων των κυρίαρχων (principal) κυττάρων σε συνάφεια με την υψηλά οργανωμένη στρωματώδη κατανομή πολλών από τις εισόδους του, ενθάρρυνε τους ερευνητές στη χρήση του ως σύστημα μοντέλο για την σύγχρονη νευροβιολογία Ιππόκαμπος και Μνήμη Πολλές μελέτες αποδεικνύουν τον σημαντικό ρόλο του ιπποκάμπου στην επεισοδιακή μνήμη στα ζώα και τους ανθρώπους. Ο πιο αξιοσημείωτος ασθενής ήταν ο H.M, ένας νεαρός άντρας που έπασχε από φαρμακοανθεκτική (intractable) επιληψία και υπέστη χειρουργική επέμβαση με αμφίπλευρη αφαίρεση του μέσου κροταφικού λοβού, συμπεριλαμβανομένων τμημάτων των δυο ιππόκαμπων. Η επέμβαση, προκάλεσε στον Η.Μ ανικανότητα να σχηματίσει καινούριες μνήμες (εμπροσθόδρομη αμνησία, anterograde amnesia), μαζί με μία σημαντική αλλά όχι ολική απώλεια παλιών μνημών (οπισθόδρομη αμνησία, retrograde amnesia) (Scoville and Milner 1957). Άλλες περιπτώσεις ασθενών έχουν επιβεβαιώσει ότι ο ιππόκαμπος είναι αναγκαίος για τον σχηματισμό νέων επεισοδιακών μνημών και ίσως έχει ρόλο στην μακροπρόθεσμη αποθήκευση τους. Μελέτες σε ζώα αποκάλυψαν ότι ελεγχόμενες βλάβες, φαρμακολογική απενεργοποίηση ή μοριακοί χειρισμοί απενεργοποίησης γονιδίων (knockout) αποκλειστικά στον ιππόκαμπο είχαν ως αποτέλεσμα την αποτυχία εκμάθησης ή την απώλεια χωρικής μνήμης (Morris, Anderson et al. 1986; Tsien, Huerta et al. 1996; Martin, de Hoz et al. 2005; Pastalkova, Serrano et al. 2006). Ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές (Berger, Rinaldi et al. 1983), μοριακές απεικονίσεις σε ζώα (Guzowski, Setlow et al. 2001; Vazdarjanova and Guzowski 2004) καθώς επίσης και μελέτες με τη χρήση μαγνητικής τομογραφίας (MRI) σε ανθρώπους (Gabrieli, 11

19 Brewer et al. 1997; Henke, Buck et al. 1997; Maguire 2001) παρέχουν αποδείξεις ότι η επεισοδιακή μνήμη και μάθηση περιλαμβάνει την ιπποκάμπεια δραστηριότητα. Μία άλλη αισθητικό/συμπεριφορική συσχέτιση της ιπποκάμπειας νευρωνικής δραστηριότητας είναι το «πεδίο θέσης». Τα πυραμιδικά κύτταρα πυροδοτούν με ρυθμούς που ποικίλουν ανάλογα με τη συγκεκριμένη τοποθεσία του αρουραίου, καθώς αυτός κινείται σε ένα δεδομένο περιβάλλον. Περιοχές του περιβάλλοντος όπου ένα κύτταρο πυροδοτεί με υψηλή συχνότητα καθορίζουν το πεδίο θέσης αυτού του κύτταρου και οι νευρώνες που επιδεικνύουν αυτό το πρότυπο δραστηριότητας ονομάζονται κύτταρα θέσης ή κυτταρα περιοχής (place cells) (O'Keefe and Dostrovsky 1971; O'Keefe 1979). Η παρατήρηση των κυττάρων θέσης και η εξασθένιση μάθησης και απόδοσης στην χωρική διάκριση μετά από βλάβες του ιπποκάμπου οδήγησε στην θεωρία του χωρικού χάρτη. Αυτή η θεωρία υποστηρίζει ότι ο ιππόκαμπος συνεισφέρει στην μνήμη κωδικοποιώντας τοποθεσίες μέσα σε ένα χωροταξικό πλαίσιο. Ενώ πολλά συμπεριφορικά και ηλεκτροφυσιολογικά δεδομένα είναι σύμφωνα με την θεωρία του χωρικού χάρτη, άλλα πειραματικά αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι τα ιπποκάμπεια κύτταρα κωδικοποιούν πληροφορίες ανεξάρτητες της τοποθεσίας και είναι αναγκαία για την μάθηση και ανάκληση άλλων μη χωρικών τύπων πληροφορίας (Winocur 1990; Bunsey and Eichenbaum 1995; Bunsey and Eichenbaum 1996) Ανατομία του ιπποκάμπου Ο ιππόκαμπος είναι μία εξελικτικά συντηρημένη εγκεφαλική δομή ανάμεσα στους οργανισμούς που ανήκουν στις τάξεις των τρωκτικών και των πρωτευόντων και επιτελεί με παρόμοιο τρόπο διεργασίες μνήμης και μάθησης (Clark and Squire 2013). Η θέση του ιπποκάμπου στους εγκεφάλους των τρωκτικών και των πρωτευόντων είναι διαφορετική, γεγονός που οφείλεται στον καλύτερα ανεπτυγμένο εγκεφαλικό φλοιό των πρωτευόντων, που τείνει να εξαναγκάζει την οδοντωτή έλικα και τον ιππόκαμπο μέσα στον κροταφικό λοβό (Εικόνα 1). Ο ιππόκαμπος είναι μια επιμηκυμένη κυλινδρική δομή με τον μακρύ του άξονα να εκτείνεται σε σχήμα ημικυκλικό από τη μέση γραμμή του εγκεφάλου κοντά στους διαφραγματικούς πυρήνες (πρόσθιο-ραχιαίως) πάνω και πίσω από τον θάλαμο στο έσω τμήμα του κροταφικού λοβού (οπίσθιο-κοιλιακά). Συγκροτείται από έξι διακριτές περιοχές που περιλαμβάνουν την οδοντωτή έλικα (Dentate Gyrus-DG), τις περιοχές Αμμώνιου κέρατος 1-3 (Cornus ammonis, CA1, CA2, CA3), το υπόθεμα (Subiculum), το προϋπόθεμα (Presubiculum), 12

20 το παραϋπόθεμα (Parasubiculum) και τον ενδορρινικό φλοιό (Entorhinal Cortex-EC) που έχει δύο ή περισσότερες υποδιαιρέσεις (Εικόνα 2). Το υπόθεμα, το προϋπόθεμα και το παραϋπόθεμα αναφέρονται συνήθως μαζί και ως υποθεματικό σύμπλοκο (Amaral and Witter 1989). Α Β Εικόνα 1: A. Κοιλιακή όψη εγκεφάλου ανθρώπου (κορυφή), εγκεφάλου πιθήκου (μέση), και πλάγια όψη εγκεφάλου επίμυος (κάτω μέρος). Στην εικόνα φαίνονται τα κύρια τμήματα του μέσου κροταφικού λοβού: 13

21 περιρινικός φλοιός (κοκκινο), παραιπποκάμπειος φλοιός (μπλε) και ενδορινικός φλοιός (πράσινο). Η οργάνωση και οι συνδέσεις των παραπάνω δομών είναι πολύ συντηρημένες σε αυτά τα είδη. Οι εγκέφαλοι δεν βρίσκονται στην ίδια κλίμακα. Από (Clark and Squire 2013). B. Πλάγια όψη εγκεφάλου ποντικού, πιθήκου και ανθρώπου. Με κόκκινο απεικονίζεται η θέση του ιπποκάμπου ενώ με μπλέ ο ενδορινικός φλοιός. Τροποποιημένη από:(strange, Witter et al. 2014) Ο ιππόκαμπος είναι διαιρεμένος μέσα σε οριοθετημένη περιοχή. Η κυρίαρχη κυτταρική στιβάδα ονομάζεται πυραμιδική στιβάδα (stratum pyramidale-pcl), στην οποία εδράζονται τα κυτταρικά σώματα των πυραμιδικών νευρώνων. Κάτω από την πυραμιδική στιβάδα ακολουθεί μία στενή, σχετικά ακυτταρική στιβάδα, η στιβάδα πολυμορφικών κυττάρων (stratum oriensso), που περιέχει τους βασικούς δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων και πολλές κλάσεις ενδονευρώνων. Η ακτινωτή στιβάδα (stratum radiatum-sr) τοποθετείται αμέσως πάνω από το Εικόνα 2: Απεικόνιση των τμημάτων και συνδέσεων του ιπποκάμπειου σχηματισμού: Α) στη φυσική του μορφή, Β) σε ευθύγραμμη διάταξη. Από: The Hippocampus Book p. 38 πυραμιδικό στρώμα στις περιοχές CA1 και CA2. Η ακτινωτή στιβάδα καθορίζεται ως η υπερπυραμιδική περιοχή στην οποία εδράζονται οι CA3-CA3 αντίπλευρες συνειρμικές (associational) συνδέσεις και οι CA3-CA1 παράπλευρές ίνες Schaffer. Η εξώτατη στιβάδα του ιππόκαμπου καλείται μοριώδης-βοθριώδης στιβάδα (stratum lacunosum moleculare-slm) και εκεί καταλήγουν οι ίνες από τον ενδορρινικό φλοιό και από άλλες περιοχές του εγκεφάλου. Στην ακτινωτή και στη μοριώδη-βοθριώδη στιβάδα εδράζεται πληθώρα ενδονευρώνων (Εικόνα 3). 14

22 Υπάρχουν αρκετοί τύποι ενδονευρώνων με τα πιο χαρακτηριστικά να είναι τα πυραμιδικά καλαθοειδή κύτταρα (basket cells) που εδράζονται μέσα ή πλησίον της πυραμιδικής στιβάδας και νευρώνουν το σώμα και τους εγγυς δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων. Αυτού του τύπου οι ενδονευρώνες ενεργοποιούνται από παλίνδρομους κλάδους των πυραμιδικών νευρώνων αλλά και από προσαγωγές ίνες, διερχόμενες από την περιοχή της στιβάδας των πολυμορφικών κυττάρων και την ακτινωτή στιβάδα, και είναι υπεύθυνοι για την ισχυρή αναστολή των πυραμιδικών κυττάρων. Ένα καλαθοειδές κύτταρο δέχεται συνάψεις περίπου από 2-15 πυραμιδικά κύτταρα και νευρώνει μέχρι 1000 πυραμιδικά κύτταρα, ασκώντας την ανασταλτική του δράση. Εικόνα 3: Μορφολογία των στιβάδων της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου και σχηματική απεικόνιση της θέσης και του προσανατολισμού ενός πυραμιδικού κυττάρου του ιππόκαμπου. Τροποποιημένη από (Ishizuka, Weber et al. 1990) Δεύτερος τύπος ενδονευρώνα είναι το κύτταρο πολυέλαιος (chandelier) ή αξονοαξονικό κύτταρο, που εντοπίζεται στην πυραμιδική στιβάδα και πραγματοποιεί συμμετρικές συνάψεις αποκλειστικά στην αρχική περιοχή του άξονα του πυραμιδικού κυττάρου, ασκώντας ανασταλτικό έλεγχο στην εξερχόμενη πληροφορία από τα κύτταρα αυτά. Ένας άλλος τύπος είναι το διστιβαδωτό κύτταρο (bistratified cell). Αυτά τα κύτταρα έχουν ίνες που καταλήγουν στις δενδριτικές άκανθες και στους κορμούς των πυραμιδικών κυττάρων. Παρόλο που οι είσοδοι αυτών των κυττάρων δεν έχουν μελετηθεί, οι δενδρίτες τους διανέμονται μέσα στη ζώνη των αντίπλευρων συνδέσεων στην CA3 περιοχή και στις παράπλευρες ίνες του Schaffer στην CA1. 15

23 Συνεπώς, πιστεύεται ότι έχουν μία πρόσσω (feed-forward) και ανάδρομη (feed-back) δράση. Τέλος, υπάρχει μία ποικιλία ενδονευρώνων που εντοπίζονται στην ακτινωτή, και την μοριώδηβοθριώδη στιβάδα ή στο όριο αυτών. Αυτοί οι νευρώνες φέρουν δενδρίτες που προσανατολίζονται οριζόντια αλλά περιστασιακά σχηματίζουν κλάδους που εκτείνονται στην πυραμιδική στιβάδα (Lacaille and Schwartzkroin 1988) Συνδέσεις ιπποκάμπου Η εισαγωγή πληροφορίας από τις νεοφλοιικές περιοχές στον ενδορρινικό φλοιό χωρίζεται σε δύο ομάδες (Εικόνα 4): οι πληροφορίες που καταλήγουν στις επιφανειακές στιβάδες (Ι-ΙΙΙ) και αυτές που καταλήγουν σε βαθύτερες στιβάδες (IV-VI). Πιο συγκεκριμένα η πρώτη κατηγορία μεταφέρει πληροφορίες στους επιφανειακά τοποθετημένους ενδορρινικούς νευρώνες, που προβάλλουν με την σειρά τους στην οδοντωτή έλικα, στον ιππόκαμπο και το υπόθεμα. Στα ανώτερα στρώματα καταλήγουν σημαντικές πληροφορίες από δομές όπως, ο οσφρητικός βολβός και ο πρόσθιος οσφρητικός πυρήνας. Άλλες κρίσιμες πληροφορίες που καταλήγουν στα επιφανειακά στρώματα προέρχονται από τις όμορες περιρρινικές και μεταρρινικές περιοχές, που αποτελούν πολύαισθητικά κέντρα σύγκλισης λαμβάνονοντας πληροφορίες από μία μεγάλη ποικιλία φλοιϊκών δομών. Ο ΕΦ προβάλλει ανάδρομα στις οσφρητικές δομές μέσω ινών που προέρχονται κυρίως από τις στιβάδες ΙΙ, ΙΙΙ και Va. Η δεύτερη κατηγορία επιδρά κυρίως στους βαθύτερα τοποθετημένους ενδορρινικούς νευρώνες, που λαμβάνουν επεξεργασμένες πληροφορίες από άλλα ιπποκάμπεια πεδία και προβάλλουν με την σειρά τους σε συγκεκριμένες φλοιϊκές περιοχές. Φλοιϊκές προβολές σε αυτά τα στρώματα προέρχονται από πολλές δομές, όπως τη νήσο του Reil και τη μέση προμετωπιαία περιοχή (μεταιχμειακό σύστημα) (Insausti, Herrero et al. 1997). Πρόσθετα με τις φλοιϊκές πληροφορίες, ο ΕΦ δέχεται και μηνύματα από υποφλοιϊκές δομές. Ενώ κάποιες είσοδοι όπως οι μονοαμινεργικές και οι χολινεργικές φαίνονται ως τροποποιητικές, όπως οι ίνες από το σύμπλοκο της αμυγδαλής, ίσως να αποτελούν και επιπρόσθετες πηγές πληροφοριών. Οι σημαντικές είσοδοι από το σύμπλοκο της αμυγδαλής, που προέρχονται κυρίως από τους πλάγιους και βασικούς πυρήνες της, αποτελούν κατεξοχήν 16

24 πληροφορίες για την συγκινησιακή κατάσταση του οργανισμού (Pikkarainen, Ronkko et al. 1999). Εικόνα 4: Η ενδογενής λειτουργική οργάνωση του ιπποκάμπου βασίζεται σε ένα τρισυναπτικό κύκλωμα με κύριο χαρακτηριστικό τις μονόδρομες προβολές μεταξύ των περιοχών του. Η διατιτραίνουσα οδός, η οποία μεταφέρει πληροφορίες από τον ενδορρινικό και τον περιρρινικό φλοιό θεωρείται γενικά η κύρια πηγή εισαγωγής πληροφορίας στον ιππόκαμπο. Οι ίνες της διατιτραίνουσας οδού συνάπτονται με τους δενδριτες των κοκκωδών κυττάρων της οδοντωτής έλικας. Στη συνέχεια, τα κοκκώδη κύτταρα μέσω των νευραξόνων τους, τις βρυώδεις ίνες, συνάπτονται με τους δενδρίτες των πυραμιδικών νευρώνων της CA3 περιοχής. Οι άξονες των κυττάρων αυτών, οι ίνες του Schaffer, άγονται προς την CA1 περιοχή όπου και δημιουργούν συνάψεις με τους δενδρίτες των CA1 πυραμιδικών κυττάρων. Το παραπάνω απλουστευμένο κύκλωμα αποτελείται από τρείς μονόδρομες διεγερτικές συνάψεις. Επί προσθέτως, σε αυτό το τρισυναπτικό κύκλωμα υπάρχει ένα πυκνό συνειρμικό δίκτυο (associative, commissural network) συνδεδεμένων CA3 κυττάρων. Οι CA3 νευρώνες νευρώνονται επίσης από άμεση είσοδο από τη στοιβάδα ΙΙ του ΕΦ, ενώ οι απώτεροι δενδρίτες των CA1 κυττάρων λαμβάνουν άμεση είσοδο από την στοιβάδα ΙΙΙ του ΕΦ. Επίσης στον ιππόκαμπο λαμβάνουν χώρα πληθώρα αλληλεπιδράσεων μεταξύ ενδονευρώνων, οι κυριότεροι των οποίων είναι ανασταλτικοί. Πηγή: (Neves, Cooke et al. 2008) Ο ΕΦ προβάλλει αμφίπλευρα στο ραβδωτό (μέσω ινών από την στιβάδα V), κυρίως στον επικλινή πυρήνα και στα παρακείμενα τμήματα του οσφρητικού φύματος, ενώ δέχεται χολινεργική εννεύρωση κυρίως από το διάφραγμα και προβάλλει με τη σειρά του (μέσω ινών από την στιβάδα Va και ΙΙ) πίσω σε αυτό. Επίσης δέχεται διάχυτες πληροφορίες από ποικίλες δομές του υποθαλάμου, όπως τον υπερχιασματικό πυρήνα που καταλήγει στις στιβάδες ΙΙΙ-VI, και από την πλάγια υποθαλαμική περιοχή. Οι σημαντικότερες θαλαμικές είσοδοι προέρχονται από τον ενωτικό (reuniens) και τον κεντρικό διάμεσο πυρήνα (centralis medialis nucleus) (Van der Werf, Witter et al. 2002) ενώ δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι το σύστημα είναι αναδραστικό. Επιπλέον, χολινεργικές ίνες από κύτταρα της κοιλιακής καλυπτρικής περιοχής 17

25 καταλήγουν κατά κύριο λόγο στην πλάγια ενδορρινική περιοχή. Οι σεροτονινεργικές ίνες προέρχονται από τους πυρήνες ραφής και καταλήγουν διάχυτα σε όλες τις στιβάδες αλλά με μία προτίμηση στις επιφανειακές. Οι νοραδρενεργικές ίνες από τον υπομέλαινα τόπο (locus coeruleus) καταλήγουν στην στιβάδα Ι του ΕΦ. Στη συνέχεια η οδοντωτή έλικα (ΟΕ) λαμβάνει τις κύριες εισόδους της από τον ΕΦ μέσω της διατιτραίνουσας οδού. Στην μοριώδη στιβάδα της ΟΕ, οι ίνες του ΕΦ σχηματίζουν συνάψεις κυρίως στις δενδριτικές άκανθες των κοκκιωδών κυττάρων. Παρόλα αυτά ένας μικρός αριθμός ινών σχηματίζει συνάψεις με τους δενδριτικούς κορμούς GABAεργικών ενδονευρώνων. Η διατιτραίνουσα οδός μπορεί να διακριθεί σε δύο μέρη βασιζόμενη στην περιοχή προέλευσης και του προτύπου κατάληξης των ινών. Στον αρουραίο, οι δύο υποδιαιρέσεις έχουν ονομαστεί ως πλάγια και διάμεση διατιτραίνουσα οδός προερχόμενες από πλάγιες (LEC) και διάμεσες (MEC) ενδορρινικές περιοχές, αντίστοιχα. Ίνες της πλάγιας διατιτραίνουσας οδού καταλήγουν κυρίως στο επιφανειακό 1/3 τμήμα της μοριώδους στιβάδας της ΟΕ, ενώ ίνες της διάμεσης οδού καταλήγουν στο βαθύτερο 1/3 τμήμα της μοριώδους στιβάδας (Εικόνα 4). Μία μεγάλη ποικιλία καλαθοειδών κυττάρων εντοπίζονται στην κοκκιώδη στιβάδα της ΟΕ και φαίνεται να συμμετέχουν στο υπερβολικά πυκνό τελικό πλέγμα της κοκκιώδους στιβάδας (Struble, Desmond et al. 1978). Οι τελικές συνάψεις αυτού του πλέγματος γίνονται σε GABAεργικούς νευρώνες και σχηματίζουν συμμετρικές ανασταλτικές συνάψεις με τα κυτταρικά σώματα και τους εγγύς δενδριτικούς κορμούς των κορυφαίων δενδριτών των κοκκιωδών κυττάρων. Αυτός ο πολυσυναπτικός καταρράκτης των ανασταλτικών ενδοσυνδέσεων καταδεικνύει ότι το κύκλωμα του ιππόκαμπου παρέχει έναν πολύπλοκο ανασταλτικό και δισανασταλτικό έλεγχο της διεγερσιμότητας. Περαιτέρω η ΟΕ προβάλλει μόνο στο CA3 πεδίο και σε καμία άλλη περιοχή του ιππόκαμπου. Οι άξονες που προβάλλουν στην CA3, οι βρυώδεις ίνες, προέρχονται αποκλειστικά από τα κοκκιώδη κύτταρα και καταλήγουν σε μία σχετικά στενή ζώνη τοποθετημένη κυρίως μόλις πάνω από την CA3 πυραμιδική στιβάδα (Blackstad, Brink et al. 1970; Claiborne, Amaral et al. 1986) που καλείται φωτεινή ή διάφανη (lucidum) στιβάδα εξαιτίας της έλλειψης μυελίνης των βρυωδών ινών. Μία μοναδιαία βρυώδης ίνα μπορεί να πραγματοποιήσει το πολύ 37 συνάψεις με ένα και μόνο δενδρίτη πυραμιδικού κυττάρου. Επίσης εντοπίζονται σπάνιες λεπτές ίνες που πηγάζουν από τις κύριες βρυώδεις ίνες που φαίνεται να καταλήγουν κατά προτίμηση σε 18

26 GABAεργικά καλαθοειδή κύτταρα της CA3 περιοχής. Τέλος πρέπει να αναφερθεί ότι τα κοκκιώδη κύτταρα είναι διεγερτικά καθώς χρησιμοποιούν το γλουταμινικό οξύ ως νευροδιαβιβαστή. Εικόνα 5: Σύνοψη των παράλληλων και σειριακών μονοπατιών αγωγής της πληροφορίας στον ιπποκάμπειο σχηματισμό (Πηγή: Hippocampus Book, page 109). Επιπρόσθετα όλα τα τμήματα της CA3 και CA2 περιοχής προβάλλουν στην CA1 περιοχή. Στην πραγματικότητα, κάθε CA3 πυραμιδικό κύτταρο δίνει γένεση σε άξονες που διασχίζουν το εγκάρσιο και το οβελιαίο επίπεδο της CA1 περιοχής. Παρόλο που οι παράπλευρες ίνες του Schaffer φαίνεται να επεκτείνονται μόνο διαμέσου της ακτινωτής στιβάδας, θα πρέπει να δοθεί έμφαση στο γεγονός ότι η ακτινωτή και η ακυτταρική στιβάδα της CA1 περιοχής δέχονται πυκνή εννεύρωση από CA3 άξονες. Συνεπώς, οι ίνες Schaffer είναι υψηλά συνδεδεμένες με τους κορυφαίους δενδρίτες των CA1 κυττάρων στην ακτινωτή στιβάδα, καθώς και με τους βασικούς δενδρίτες της ακυτταρικής στιβάδας (Εικόνα 4). Οι παχιές ίνες του Schaffer προέρχονται μόνο από τα εγγύς CA3 κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα δίνουν γένεση σε έναν παχύ άξονα που ανέρχεται από την ακυτταρική στιβάδα μέσα στο πιο επιφανειακό τμήμα της ακτινωτής στιβάδας και ταξιδεύει προς το μακρινό τμήμα της CA1, όπου και συνεισφέρει πολλές ίνες. Οι άξονες από τα μακρινά CA3 κύτταρα τείνουν να είναι πιο λεπτοί και να 19

27 προβάλλουν άμεσα στην εγγύς CA1, είτε μέσα στην ακυτταρική στιβάδα είτε διαμέσου του βαθέος τμήματος της ακτινωτής στιβάδας. Ένα πλέγμα από ένα και μόνο CA3 νευρώνα έχει 150 μέχρι 300 mm συνολικό αξονικό μήκος, στο οποίο σχηματίζονται από μέχρι συνάψεις (Li, Somogyi et al. 1994). Επίσης στον αρουραίο, τα CA3 πυραμιδικά κύτταρα δίνουν γένεση σε προβολές προς την CA3, CA2 και CA1 πεδία του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Οι CA3 ίνες ιππόκαμπο σχηματίζουν ασύμμετρες συνάψεις στις άκανθες των πυραμιδικών κυττάρων της CA3 και CA1 περιοχής, αλλά επίσης καταλήγουν πάνω στους λείους δενδρίτες των ενδονευρώνων. Στη συνέχεια η CA1 περιοχή δίνει γένεση σε δύο ενδοϊπποκάμπειες προβολές. Η πρώτη είναι μία τοπογραφικά οργανωμένη προβολή στο παρακείμενο υπόθεμα, ενώ η δεύτερη είναι προς τα βαθειά στρώματα του ΕΦ (Εικόνα 5). Αυτό που είναι ξεκάθαρο, είναι ότι οι προβολές από την CA1 περιοχή και το υπόθεμα προς τον ΕΦ είναι και αυτές τοπογραφικά οργανωμένες. Τα κοιλιακά τμήματα της CA1 και του υποθέματος προβάλλουν κυρίως στα πλευρικά τμήματα του ΕΦ, ενώ τα πιο κροταφικά τμήματα προβάλλουν σε πιο διάμεσα μέρη του ΕΦ. Επιπλέον, οι προβολές από το εγγύς τμήμα της CA1 και το μακρινό τμήμα του υποθέματος διανέμονται αποκλειστικά στον διάμεσο ΕΦ, ενώ κύτταρα του μακρινού τμήματος της CA1 και του εγγύς υποθέματος προβάλλον κυρίως στον πλάγιο ΕΦ. Το σημαντικό σημείο για αυτές τις προβολές εξόδου είναι ότι υπόκεινται σε κοινή ρύθμιση με τις ενδορρινικές εισόδους σε αυτές τις περιοχές. Έτσι, σε σφαιρικό επίπεδο, όλο το σύστημα-βρόχος είναι διαθέσιμο για την εγκατάσταση κυκλωμάτων, τα οποία αρχίζουν και τελειώνουν στον ΕΦ. Αυτή η αξιοθαύμαστη τοπογραφία επιβεβαιώνει τον κρίσιμο ρόλο του ΕΦ όσον αφορά την είσοδο και έξοδο της πληροφορίας από τον ιπποκάμπειο σχηματισμό Συναπτική διαβίβαση και νευροδιαβιβαστές Ως συναπτική διαβίβαση (synaptic transmission) ορίζεται η διαδικασία κατά την οποία το προσυναπτικό κύτταρο ενεργοποιείται μέσω αλλαγής του δυναμικού της μεμβράνης του και με τη σειρά του ενεργοποιεί ένα κύτταρο στόχο. Στην προκειμένη περίπτωση το κύτταρο που ενεργοποιείται είναι ένας μετασυναπτικός νευρώνας, ο οποίος έρχεται σε επαφή με τον προσυναπτικό μέσω της σύναψης. Η συναπτική διαβίβαση χωρίζεται σε διεγερτική και σε ανασταλτική και μπορεί να αναλυθεί περαιτέρω σε στάδια, δηλαδή σε απελευθέρωση 20

28 νευροδιαβιβαστή από το προσυναπτικο στοιχείο, διάχυση του νευροδιαβιβαστή κατά μήκος της συναπτικης σχισμής και ενεργοποίηση των μετασυναπτικών υποδοχέων. Η διεγερτική διαβίβαση επιτελείται κυριώς από το νευροδιαβιβαστή γλουταμινικό οξύ, που αποτελεί τον κύριο διεγερτικό νευροδιαβιβαστή στον ιππόκαμπο, καθώς και σε ολόκληρο το ΚΝΣ, και προκαλεί την ταχεία διεγερτική διαβίβαση στις γλουταμινεργικές συνάψεις. Τρεις βασικοί τύποι ιοντοτροπικών υποδοχέων γλουταμινικού έχουν βρεθεί, των οποίων η ονομασία προέρχεται από τους εξωγενείς αγωνιστές τους (Watkins and Evans 1981; Nakanishi, Nakajima et al. 1998; Ozawa, Kamiya et al. 1998): ο υποδοχέας AMPA (ή κισκαλικού οξέος), ο υποδοχέας καϊνικού οξέος και ο υποδοχέας NMDA (Ν-μέθυλ-D-ασπαρτικού οξέος). Οι υποδοχείς AMPA και καϊνικού οξέος θεωρούνται υπεύθυνοι για την ταχεία συναπτική διαβίβαση, δηλαδή την ταχεία ανάπτυξη ενός σύντομου (<1 msec) ρεύματος εισροής ιόντων νατρίου στο μετασυναπτικο στοιχείο. Αντίθετα το μετασυναπτικο ρεύμα που προκαλείται από την ενεργοποίηση του υποδοχέα NMDA εμφανίζει μια πιο βραδεία ανάπτυξη και διάρκεια (20-30 msec). Οι υποδοχείς NMDA διαφέρουν από τους AMPA σε αρκετές σημαντικές ιδιότητες, όπως: στο εξαρτώμενο από την τάση αποκλεισμό του ιοντικού πόρου από το ιόν Mg 2+, την υψηλή διαπερατότητα σε ιόντα ασβεστίου, την βραδεία αλλά και μεγαλύτερης διάρκειας ενεργοποίηση του καθώς και στην μεγαλύτερη χημική συγγένεια ως προς το γλουταμινικό (Dingledine, Borges et al. 1999). Με μεμβρανικό δυναμικό κοντά στο δυναμικό ηρεμίας, ο υποδοχέας NMDA παραμένει αποκλεισμένος από τα ιόντα Mg 2+ (που βρίσκονται στο έξω- και ενδοκυττάριο υγρό), ακόμα και όταν ο υποδοχέας έχει ενεργοποιηθεί από την πρόσδεση του γλουταμινικού οξέος. Σε καταστάσεις μετασυναπτικής εκπόλωσης, όπως συμβαίνει με την είσοδο του νατρίου από τους μετασυναπτικούς υποδοχείς των AMPA και του καϊνικού οξέος, προκαλείται η απομάκρυνση του Mg 2+ επιτρέποντας την διέλευση ιόντων από τους υποδοχείς NMDA. Το ρεύμα διάμεσου των υποδοχέων αυτών αποτελείται από ιόντα νατρίου καθώς και ασβεστίου με τελικό αποτέλεσμα την εντονότερη εκπόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης. Οι AMPA και οι NMDA υποδοχείς συνεντοπίζονται με πυκνότητα 100 φορές μεγαλύτερη στη σύναψη απ ότι στις εξωσυναπτικές περιοχές. Το γλουταμινικό δρα επίσης στους πιο βραδέως ενεργοποιούμενους υποδοχείς που είναι συζευγμένοι με G-πρωτεΐνη, οι οποίοι δρουν μέσω δεύτερου αγγελιοφόρου μηνύματος. Αυτοί οι γλουταμινεργικοί υποδοχείς τροποποιούν την νευρωνική διεγερσιμότητα και την συναπτική 21

29 διαβίβαση (τροποποιώντας την απελευθέρωση του γλουταμινικού και του GABA) και αναφέρονται ως μεταβοτροπικοί υποδοχείς γλουταμινικού (mglu) (De Blasi, Conn et al. 2001). Παρουσιάζουν ευρεία κατανομή στο ΚΝΣ και παίζουν βασικούς ρόλους σε ποικίλες νευρωνικές διαδικασίες όπως η συναπτική πλαστικότητα και ο σχηματισμός μνήμης. Ένας mglu υποδοχέας, αποτελείται από μία εξωκυττάρια αμινοτελική περιοχή, μία περιοχή που διαπερνά τη μεμβράνη 7 φορές και ένα καρβοξυτελικό άκρο. Οι mglurs έχουν κατηγοριοποιηθεί σε τρεις μεγάλες ομάδες με βάση την αμινοξική τους αλληλουχία, τους μηχανισμούς μεταγωγής σήματος και τις φαρμακολογικές ιδιότητες. Η ομάδα Ι περιέχει τους mglu1 και mglu5, που ενεργοποιούν Gq πρωτεΐνες, ενώ οι υποδοχείς των ομάδων II (mglu2,3) και ΙΙΙ (mglu4, 6, 7, 8) συζεύγνυνται με Gi-πρωτεΐνες (Shigemoto, Kinoshita et al. 1997). Οι mglu υποδοχείς εντοπίζονται κυρίως έξω από τις προ- και μετασυναπτικές μεμβράνες, καταδεικνύοντας ότι ενεργοποιούνται επιλεκτικά κατά τη διάρκεια έντονης συναπτικής ενεργοποίησης, όπως οι επαναλαμβανόμενες υψηλής συχνότητας πυροδοτήσεις, οδηγώντας σε διάχυση του νευροδιαβιβαστή στον περισυναπτικό χώρο (Baude, Nusser et al. 1993; Lujan, Nusser et al. 1996; Shigemoto, Kinoshita et al. 1997). Οι παραπάνω υποδοχείς όντας διεγερτικοί έχουν ως αποτέλεσμα την εκπόλωση του μετασυναπτικού κυττάρου και την επακόλουθη εισροή ιόντων Ca 2+. Η είσοδος Ca 2+ εντός του κυτταροπλάσματος των δενδριτών και των δενδριτικών ακάνθων ρυθμίζει μια ευρεία γκάμα νευρωνικών λειτουργιών, όπως η συναπτική σηματοδότηση, η επαγωγή LTD και LTP και η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (Sabatini, Maravall et al. 2001). Η συσσώρευση του Ca 2+ σε αυτές τις δομές προκαλείται μέσω δυναμικών ενέργειας και συναπτικών ερεθισμάτων τα οποία προκαλούν είσοδο του Ca 2+ διαμέσου πολλών τύπων ιοντικών διαύλων καθώς και απελευθέρωση από τις ενδοκυττάριες αποθήκες (Higley and Sabatini 2008). Η συναπτικά προκαλούμενη αύξηση του κυτταροπλασματικού Ca 2+ στα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 και CA3 περιοχής του ιπποκάμπου προκύπτει από πηγές όπως οι υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος (NMDARs και μη-nmdars) που εντοπίζονται στις δενδριτικούς άξονες και άκανθες (Reid, Fabian-Fine et al. 2001; Bloodgood and Sabatini 2007), με αποτέλεσμα την εκπόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης. Επίσης η εισροή ασβεστίου προκαλείται από τους τασεοελεγχόμενους διαύλους ασβεστίου (voltage-gated calcium channels-vdccs), οι οποίοι εντός των δενδριτικών ακάνθων 22

30 και αξόνων ανοίγουν μετά από ισχυρή μετασυναπτική εκπόλωση (Miyakawa, Ross et al. 1992; Regehr and Tank 1992; Markram and Sakmann 1994; Denk, Sugimori et al. 1995; Eilers, Augustine et al. 1995; Yuste and Denk 1995; Finch and Augustine 1998; Reid, Fabian-Fine et al. 2001). Επαρκής εκπόλωση για την ενεργοποίηση των VDCCs μπορεί να προέλθει από τα αντίδρομα σωματικά παραγόμενα δυναμικά ενέργειας (back-propagated action potentials-baps) (Callaway and Ross 1995; Schiller, Helmchen et al. 1995; Yuste and Denk 1995; Svoboda, Denk et al. 1997; Helmchen, Svoboda et al. 1999; Koester and Sakmann 2000; Carter and Sabatini 2004; Nevian and Sakmann 2004; Bloodgood and Sabatini 2007). Πολλές μελέτες έχουν προτείνει ότι η ύπαρξη των δενδριτικών δυναμικών ενεργείας μπορεί να συνεισφέρει στην παραγωγή ειδικής ως προς τη θέση πλαστικότητας των ιπποκάμπειων συναπτικών εισόδων. Για παράδειγμα τρένα θ ρυθμού ή υψηλής συχνότητας δραστηριότητα είναι ικανά να παράξουν δενδριτικά Ca 2+ δυναμικά στους κορυφαίους δενδρίτες των CA1 πυραμιδικών νευρώνων. Ο αποκλεισμός των υποδοχέων NMDA και των L-τύπου VDCCs μειώνει σημαντικά και το πλάτος των Ca 2+ δενδριτικών δυναμικών και την επαγωγή μακροχρόνιας συναπτικής ενδυνάμωσης, προτείνοντας ότι τα τοπικά Ca 2+ δυναμικά παρέχουν έναν μηχανισμό επαγωγής συναπτικής πλαστικότητας απουσία παραγωγής μετασυναπτικών δυναμικών μέσω διαύλων Na + (Remy and Spruston 2007). Στα CA1 πυραμιδικά κύτταρα, η εισροή Ca 2+ στις δενδριτικές άκανθες συμβαίνει μέσω των L-τύπου, R-τύπου και των χαμηλής ουδού Τ-τύπου VDCCs (Christie, Eliot et al. 1995; Magee, Christofi et al. 1995; Sabatini and Svoboda 2000), ενώ στις δενδριτικές κεφαλές φαίνεται να συμμετέχουν κυρίως οι R-τύπου με τη μικρή συνεισφορά των L-τύπου vdccs (Sabatini and Svoboda 2000; Yasuda, Sabatini et al. 2003; Hoogland and Saggau 2004; Bloodgood and Sabatini 2007). Τα L-τύπου VDCCs έχουν δειχθεί ότι εμπλέκονται στην επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης. Αυτοί οι υποδοχείς έχουν πολλές ιδιότητες που τους κάνουν ιδιαίτερα ταιριαστούς για τη μεταφορά του σήματος Ca 2+ από το σημείο εισόδου του στη πλασματική μεμβράνη μέχρι το εσωτερικό του πυρήνα για γονιδιακή επαγωγή. Για παράδειγμα, οι L-τύπου VDCCs έχουν σχετικά αργό ρυθμό απενεργοποίησης και υψηλή αγωγιμότητα για το Ca 2+, επιτρέποντας την είσοδο μεγάλων ποσοτήτων ασβεστίου στους νευρώνες (Gallin and Greenberg 1995). Πρόσθετα, αυτά οι δίαυλοι είναι τοποθετημένοι σωματοδενδριτικά, οπότε είναι ικανοί να αυξήσουν τα επίπεδα Ca 2+ μέσα στο κυτταρικό σώμα σε εγγύτητα με τον πυρήνα, επιτρέποντας έτσι την αποδοτική διάδοση του σήματος εντός του πυρήνα (Westenbroek, 23

31 Ahlijanian et al. 1990; Catterall 2000). Επίσης, ένας μεγάλος αριθμός σηματοδοτικών πρωτεϊνών συσχετίζονται με τους L-τύπου VDCCs, όπως η Src κιναση τυροσίνης, η φωσφατάση της καλσινευρίνης και άλλες (Greer and Greenberg 2008). Η συνεισφορά του Ca 2+ που απελευθερώνεται από τις ενδοκυττάριες αποθήκες στους δενδρίτες μετά από συναπτική ενεργοποίηση είναι αμφιλεγόμενη. Σε τομές ιπποκάμπου, ισχυρή ενεργοποίηση των ινών Schaffer οδηγεί σε ενεργοποίηση των mglurs, οι οποίοι στη συνέχεια μέσω της φωσφολιπασης C και της τριφωσφορικής ινοσιτόλης (IP 3 ) επάγουν την απελευθέρωση του Ca 2+ από τις ενδοκυττάριες αποθήκες και συνεισφέρουν στην μακροπρόθεσμη ετεροσυναπτική πλαστικότητα (Dudman, Tsay et al. 2007; Hong and Ross 2007). Αντιθέτως, άλλες μελέτες απέτυχαν να αποδείξουν την απελευθέρωση του Ca 2+ από τις ενδοκυττάριες αποθήκες ακολουθώντας μία πιο ήπια συναπτική ενεργοποίηση των ινών (Mainen, Malinow et al. 1999; Yuste, Majewska et al. 1999; Kovalchuk, Eilers et al. 2000). Πέρα από τη διεγερτική διαβίβαση υπάρχει και η ανασταλτική, της οποίας ο ρόλος έγκειται στον ακριβή έλεγχο της συναπτικής διαβίβασης και της εξάλειψης της πιθανότητας πρόκλησης τοξικότητας λόγω έντονης διεγερσιμότητας. Ο κυριότερος ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής στο ΚΝΣ, είναι το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) και συντίθεται από την αποκαρβοξυλίωση του γλουταμινικού. Η ροή της διέγερσης στον ιππόκαμπο ρυθμίζεται από τους GABAεργικούς ενδονευρώνες οι οποίοι δρουν απελευθερώνοντας GABA που προκαλεί μια ταχεία αναστολή μέσω των ιοντοτροπικών GABA A υποδοχέων που εισάγουν ιόντα Cl - (ταχύ ανασταλτικό μετασυναπτικό δυναμικό, IPSP) (Kaila 1994). Αυτή η ταχεία GABA A ενεργοποίηση ελέγχει την συχνότητα των δυναμικών ενεργείας και αναστέλλει τα δενδριτικά Ca 2+ εξαρτώμενα δυναμικά. Βραδύτερες αποκρίσεις (βραδέα ανασταλτικά μετασυναπτικά δυναμικά, IPSPs, που προκαλούνται με το άνοιγμα των καναλιών καλίου) που διαρκούν από 500 έως 2000 msec, προκαλούνται από τους μεταβοτρόπους GABA B υποδοχείς. Οι προσυναπτικοί GABA B υποδοχείς είναι παρόντες στις ανασταλτικές και διεγερτικές απολήξεις, όπου και λειτουργούν ως αυτοϋποδοχείς και ετεροϋποδοχείς, αντίστοιχα. Το απελευθερούμενο GABA μπορεί να κινηθεί ανάδρομα προς τους προσυναπτικούς GABA B αυτοϋποδοχείς και να αναστείλει την περαιτέρω απελευθέρωση του GABA. Το GABA επίσης μπορεί να διαχυθεί στις γειτονικές διεγερτικές απολήξεις και να ενεργοποιήσει τους ετερουποδοχείς GABA B οι οποίοι αναστέλλουν την 24

32 απελευθέρωση του γλουταμινικού. Η ενεργοποίηση των μετασυναπτικών GABA B υποδοχέων οδηγεί στο άνοιγμα των καναλιών GIRKs (G protein-activated inwardly rectifying potassium channels), οι οποίοι αναστέλλουν την νευρωνική δραστηριότητα παράγοντας βραδέα IPSPs που υπερπολώνουν την μεμβράνη (Andrade, Malenka et al. 1986; Misgeld, Bijak et al. 1995; Kullmann, Ruiz et al. 2005; Gassmann and Bettler 2012). Σε γενικές γραμμές, η ηλεκτροφυσιολογική ενεργοποίηση των GABA B αυτόϋποδοχέων απαιτεί έντονης έντασης ερεθίσματα και απελευθερούμενο GABA από πολλούς ενδονευρώνες (Scanziani 2000; Kohl and Paulsen 2010), που συμφωνεί με την απομακρυσμένη θέση τους σε σχέση με τα σημεία απελευθέρωσης του GABA (Kulik, Vida et al. 2006). Σε φυσιολογικές καταστάσεις, τέτοια παρατεταμένη συναπτική ενεργοποίηση συναντάται κατά τη διάρκεια πυροδοτήσεων ρυθμικής φλοιικής και ιπποκάμπειας δικτυακής δραστηριότητας, όταν ομάδες GABAεργικών ενδονευρώνων πυροδοτούν συγχρονισμένα (Scanziani 2000; Kohl and Paulsen 2010). Τα νευρογλοιακά κύτταρα αποτελούν εξαίρεση καθώς μπορούν να αποκριθούν σε μοναδιαία δυναμικά ενέργειας και να απελευθερώσουν GABA προκαλώντας IPSPs στους γειτονικούς νευρώνες (Price, Scott et al. 2008; Olah, Fule et al. 2009). Αυτή η μαζική διαβίβαση (volume transmission) είναι πολύ αποδοτική για την ενεργοποίηση των GABA B υποδοχέων με τρόπο παρακρινή και έτσι τα νευρογλοιακά κύτταρα δεν απαιτούν συναπτικές συνδέσεις με τα γειτονικά τους κύτταρα για να προκαλέσουν βραδέα IPSPs. Οι GABA B υποδοχείς εκφράζονται σχεδόν από όλους τους νευρώνες και τα γλοία κύτταρα στο ΚΝΣ και η ενεργοποίηση τους επηρεάζει πολλά νευρωνικά συστήματα και συμπεριφορικές καταστάσεις. Συνεπώς δεν μας προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι οι GABA B υποδοχείς έχουν εμπλακεί σε ποικιλία νευρολογικών και ψυχιατρικών ασθενειών όπως, την επιληψία, το άγχος, την κατάθλιψη, τη σχιζοφρένεια, την ιδεοψυχαναγκαστική διαταραχή, τον εθισμό και τον πόνο. Επιπρόσθετα υπάρχουν και άλλα μόρια που λειτουργούν ως νευροδιαβιβαστές και έχουν ως αποτέλεσμα την τροποποίηση της συναπτικής διαβίβασης, αναλόγα με τον τύπο του υποδοχέα που ενεργοποιούν. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι κατεχολαμίνες και συγκεκριμένα η νοραδρεναλίνη και η ντοπαμίνη. Η νοραδρεναλίνη αναγνωρίστηκε ως νευροδιαβιβαστής και νευροτροποποιητής του ΚΝΣ καθώς τροποποιεί κυτταρικές αποκρίσεις στους νευρώνες και λειτουργίες στο επίπεδο των 25

33 νευρικών συστημάτων και της συμπεριφοράς. Η βιοσύνθεσή της λαμβάνει χώρα κυρίως στον υπομέλανα τόπο (locus coeruleus) και ξεκινάει από το αμινοξύ τυροσίνη, το οποίο μεταβολίζεται από το ένζυμο υδροξυλάση της τυροσίνης σε DOPA. Η DOPA με τη σειρά της μεταβολίζεται σε ντοπαμίνη και στη συνέχεια σε νοραδρεναλίνη, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 6 (Gelinas and Nguyen 2007). Η νοραδρεναλίνη δρα μέσω μεταβοτροπικών υποδοχέων, οι οποίοι είναι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες και ενεργοποιούν ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια ανάλογα με τον υπότυπο του υποδοχέα στον οποίο προσδένεται. Οι υποδοχείς χωρίζονται σε α1, α2, β1, β2. Οι α αδρενεργικοί υποδοχείς είναι συζευγμένοι με Gi πρωτεΐνες, οι οποίες δρουν αναστέλοντας τη δράση της αδενυλικής κυκλάσης. Οι β αδρενεργικοί υποδοχείς (β-ar) ενεργοποιούν Gs πρωτεΐνες, οι οποίες ενεργοποιούν την αδενυλική κυκλάση που παράγει κυκλικό ΑΜΡ, αυξάνοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδά του. Το κυκλικό ΑΜΡ ενεργοποιεί άμεσα την PKA και έμμεσα την κινάση ERK. Επίσης η ERK μπορεί να ενεργοποιηθεί από τους β-ar μέσω της πρωτεΐνης β-αρρεστίνης. Εικόνα 6: Βιοσυνθετικό μονοπάτι των κατεχολαμινών ντοπαμίνης, νοραδρεναλίνης και αδρεναλίνης. Από:(Gelinas and Nguyen 2007) Οι κινάσες PKA και ERK παίζουν σημαντικό ρόλο στη μακρόχρονη συναπτική πλαστικότητα (O'Dell, Connor et al. 2015). Πιο συγκεκριμένα η PKA φωσφορυλιώνει τους 26

34 υποδοχείς NMDA και επιτρέπει την ενδοκυττάρια εισροή Ca 2+, γεγονός που οδηγεί στην ενεργοποίηση της CamKII και στην καταστολή της PKC. Επίσης η ΡΚΑ φωσφορυλιώνει του L- VDCC που εντοπίζονται στους δενδρίτες και έτσι αυξάνεται περισσότερο η ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca 2+ (Qian, Patriarchi et al. 2017). Τέλος αποκλείει την ενεργοποίηση των ασβέστιο-εξαρτώμενων διαύλων καλίου που συμμετέχουν στο φαινόμενο της μεθυπερπόλωσης. Με όλα τα παραπάνω μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η ενεργοποίηση των β-ar έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της διεγερσιμότητας των πυραμιδικών κυττάρων (Gelinas and Nguyen 2007). Άλλη κατεχολαμίνη με σημαντικό ρόλο στη συναπτική διαβίβαση είναι η ντοπαμίνη, που όπως φαίνεται και στην Εικόνα 6 συντίθεται από το αμινοξύ τυροσίνη και αποτελεί πρόδρομμο μόριο της νοραδρεναλίνης. Η σύνθεση της ντοπαμίνης λαμβάνει χώρα στην κοιλιακή καλυπτρική περιοχή (ventral tegmental area-vta), στην μέλαινα ουσία (SNr) καθώς και στον υπομέλανα τόπο. Η ντοπαμίνη ασκεί τη δράση της μέσω πέντε υποδοχέων D1-D5 που φέρουν επτά διαμεμβρανικές επικράτειες και είναι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες. Οι υποδοχείς ντοπαμίνης διαχωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τους όμοιους με D1 (D1 και D5) και τους όμοιους με D2 (D2, D3, D4). Η πρώτη κατηγορία ενισχύει τη δράση της αδενυλικής κυκλάσης αυξάνοντας τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του κυκλικού ΑΜΡ, ενώ η δεύτερη κατηγορία ρυθμίζει αρνητικά τη δράση της αδενυλικής κυκλάσης μειώνοντας τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του κυκλικού ΑΜΡ (Edelmann and Lessmann 2018). Λόγω της έλλειψης αρκετά ειδικών αγωνιστών και ανταγωνιστών δεν είναι εύκολο να αποσαφηνιστούν οι φυσιολογικοί ρόλοι των ντοπαμινεργικών υποδοχέων. Ένα νευρικό κύτταρο έχει πολλές διαφορετικές συνάψεις στις οποίες έχουμε το φαινόμενο της συναπτικής διαβίβασης. Κάθε σύναψη, όταν ενεργοποιηθεί, δημιουργεί ένα τοπικό ηλεκτρικό σήμα. Αυτό το ηλεκτρικό σήμα πρέπει να διαδοθεί μέχρι το κυτταρικό σώμα, ώστε να επηρεάσει το νευρώνα προς ή κατά της έκλυσης του δυναμικού ενεργείας. Όταν πολλές συνάψεις ενεργοποιούνται στο χώρο και στο χρόνο, τα διαφορετικά ηλεκτρικά σήματα αθροίζονται χωροχρονικά, φαινόμενο που ονομάζεται συναπτική ολοκλήρωση. Αν η διαφορά του δυναμικού στο σημείο του εκφυτικού κώνου υπερβεί την ουδό του δυναμικού ενεργείας, τότε το συγκεκριμένο νευρικό κύτταρο εκλύει δυναμικό ενεργείας. Η ικανότητα του νευρώνα να παράγει δυναμικά ενέργειας καλείται νευρωνική διεγερσιμότητα και εξαρτάται από την πυκνότητα και την ετοιμότητα των τασεοελεγχόμενων διαύλων Νa +. Για αυτό το λόγο ο 27

35 εκφυτικός κώνος έχει τη μεγαλύτερη διεγερσιμότητα αφού η πυκνότητα των διαύλων αυτών σε εκείνο το σημείο είναι αρκετά μεγάλη. Η διεγερσιμότητα επηρεάζεται και από άλλους παράγοντες όπως οι ηλεκτροτονικές ιδιότητες της μεμβράνης, οι ενδο- και εξωκυττάριες συγκεντρώσεις των ιόντων (Na +, Κ +, Cl -, Ca 2+ ), καθώς και διαφορά ενδογενή και συναπτικά (ταχεία και βραδεία αναστολή) ιοντικά ρεύματα, τα οποία καθορίζουν κάθε στιγμή το μεμβρανικό δυναμικό ηρεμίας και την απόσταση από το κατώφλιο (ουδό). Με τους παραπάνω τρόπους ρύθμισης, οι νευρώνες μπορούν να απαντούν ή όχι στο ίδιο ερέθισμα αλλά και να κωδικοποιούν την απάντησή τους στο ίδιο ερέθισμα με ποικίλα πρότυπα διαδοχής δυναμικών ενέργειας στον χρόνο (απλή εκφόρτιση ή υψίσυχνες ριπές δυναμικών ενέργειας) Συναπτική Πλαστικότητα Ως συναπτική πλαστικότητα ορίζεται η ιδιότητα των χημικών συνάψεων να μεταβάλλονται ως αποτέλεσμα της νευρωνικής δραστηριότητας, δηλαδή η ικανότητα να αποκρίνονται με συγκεκριμένο τρόπο αναλόγως της πρώτερης δραστηριότητάς τους. Ο βασικός ρόλος της συναπτικής πλαστικότητας θεωρείται ότι είναι η διαμόρφωση της συναπτικής εξόδου, δηλαδή της επίπτωσης της διέγερσης του προσυναπτικού νευρώνα επί του μετασυναπτικού με τον οποίο συνδέεται. Γενικά, τα φαινόμενα συναπτικής πλαστικότητας κατηγοριοποιούνται σε δύο μεγάλες ομάδες με κριτήριο την διάρκεια διατήρησης της μεταβολής της συναπτικής διαβίβασης, τη βραχύχρονη και μακρόχρονη συναπτική πλαστικότητα. Τα χρονικά όρια μεταξύ των δύο αυτών μεγάλων κατηγοριών είναι ασαφή και κυμαίνονται μεταξύ δευτερολέπτων και αρκετών δεκάδων λεπτών Βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα Στην κατηγορία της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας κατατάσσονται φαινόμενα συναπτικής μεταβολής, τα οποία διαρκούν από μερικές δεκάδες χιλιοστών του δευτερολέπτου μέχρι αρκετά λεπτά της ώρας (~30), με τα χρονικά όρια μεταξύ της βραχύχρονης και μακρόχρονης συναπτικής πλαστικότητας να παραμένουν ασαφή. Τα φαινόμενα βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας περιλαμβάνουν τόσο φαινόμενα ενδυνάμωσης όσο και καταστολής. Το πιο μελετημένο είδος βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας και φαινομενικά το πιο απλό από μηχανιστική άποψη είναι η καλούμενη διευκόλυνση μέσω σύζευξης παλμών (paired-pulse facilitation). Η διευκόλυνση με σύζευξη παλμών παρατηρείται ως μία αύξηση στη συναπτική αποτελεσματικότητα, η οποία επάγεται, όταν ενεργοποιείται μία σύναψη δύο φορές 28

36 συνεχόμενα σε σύντομο χρονικό διάστημα (~ ms). Με αυτόν τον τρόπο, το μετασυναπτικό διεγερτικό δυναμικό που παρατηρείται με την επίδοση του δεύτερου ερεθισμού είναι μεγαλύτερη από αυτή που προκαλείται από τον πρώτο ερεθισμό (Εικόνα 7). Με μια ευρύτερη έννοια, ως διευκόλυνση μπορεί να αναφέρεται και το φαινόμενο αύξησης της συναπτικής απάντησης μετά την επίδοση μιας αλληλουχίας ερεθισμών. Αυτό, όμως, το φαινόμενο είναι πιο πολύπλοκο από τη διευκόλυνση με σύζευξη δύο παλμών και μπορεί να περιλαμβάνει φαινόμενα καταστολής. Το φαινόμενο της διευκόλυνσης παρατηρήθηκε για πρώτη φορά στη νευρομυϊκή σύναψη και ο μηχανισμός της εντοπίστηκε μεταξύ της άφιξης του δυναμικού ενέργειας στην προσυναπτική απόληξη και της απελευθέρωσης του νευροδιαβιβαστή από αυτή. Η διευκόλυνση αποτελεί συνέπεια της εισροής ασβεστίου στην προσυναπτική απόληξη που προκαλείται από τον πρώτο ερεθισμό, γεγονός που αποδεικνύεται από την απομάκρυνση των Ca 2+ από το εξωκυττάριο διάλυμα που αποκλείει το φαινόμενο της διευκόλυνσης (Katz and Miledi 1968). Αυτός ο ρόλος του ασβεστίου συμβάλλει και σε άλλα φαινόμενα βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας, όπως η επαύξηση και η μετατετανική ενίσχυση. Εικόνα 7: Σύζευξη παλμών με διαπαλμικό διάστημα 50ms. Παρατηρείται το φαινόμενο της μετασυναπτικής διευκόλυνσης καθώς η δεύτερη διεγερτική μετασυναπτική απάντηση είναι μεγαλύτερη της πρώτης. Γραμμές κλίμακας 1mV, 5ms. 29

37 Αυτές, καθώς και ακόλουθες παρατηρήσεις, οδήγησαν στη διαμόρφωση μιας θεωρίας γύρω από τον κυτταρικό μηχανισμό της διευκόλυνσης που είναι γνωστή ως υπόθεση του εναπομείναντος ασβεστίου (residual calcium hypothesis). Σύμφωνα με την υπόθεση αυτή ένα μέρος του Ca 2+ που εισέρχεται στην προσυναπτική απόληξη μετά τον πρώτο ερεθισμό παραμένει εκεί και αθροίζεται με μη γραμμικό τρόπο στο Ca 2+ που εισρέει ως απόκριση στον δεύτερο ερεθισμό. Αυτή η άθροιση έχει ως συνέπεια τη μεγαλύτερη απελευθέρωση νευροδιαβιβαστή κατά την επίδοση του δεύτερου ερεθισμού σε σύγκριση με τον πρώτο και συνεπώς τη μεγαλύτερη μετασυναπτική απάντηση, δηλαδή αύξηση της συναπτικής διαβίβασης. Το ενισχυτικό αυτό αποτέλεσμα της παροδικής αύξησης της συγκέντρωσης του Ca 2+ στην προσυναπτική απόληξη διαρκεί μερικά δέκατα του δευτερολέπτου, όσο δηλαδή απαιτείται για τη διεργασία άντλησης του Ca 2+ από το κυτταρόπλασμα και την επαναφορά των επιπέδων του σε επίπεδα ηρεμίας. Σε συμφωνία με την υπόθεση, όσο μικρότερο είναι το χρονικό διάστημα μεταξύ των δύο παλμών τόσο μεγαλύτερη είναι η διευκόλυνση, ενώ με επιμήκυνση του διαστήματος αυτού υφίσταται εκθετική μείωση της διευκόλυνσης (Zucker and Regehr 2002). Επίσης πέρα από τη θεωρία του εναπομείναντος ασβεστίου, η διαφορετική συναπτική συμπεριφορά ως προς τις μετασυνατικές απαντήσεις, κατά τη σύζευξη παλμών, μπορεί να αποδοθεί και σε διαφορετικές ενδογενείς ιδιότητες της εκάστοτε σύναψης που μελετάται. Μία από αυτές τις ιδιότητες είναι η πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή (transmitter release probability) από τον προσυναπτικό νευρώνα. Πιο συγκεκριμένα οι συνάψεις με υψηλή πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή τείνουν να συμπεριφέρονται με καταστολή κατά την επίδοση του δεύτερου συζευγμένου παλμού, σε αντίθεση με τις συναψεις οι οποίες παρουσιάζουν χαμηλή πιθανότητα απελευθέρωσης και κατά συνέπεια παρουσιάζουν διευκόλυνση της μετασυναπτικής απάντησης κατά την επίδοση του δεύτερου συζευγμένου παλμού (Regehr 2012). Επιπρόσθετα στο φαινόμενο της συναπτικής πλαστικότητας παίζει σημαντικό ρόλο και η ανάκαμψη του προσυναπτικού νευρώνα από την εμμένουσα καταστολή (refractory depression). Αυτή η καταστολή είναι συνέπεια της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή από τις ενεργές ζώνες της μεμβράνης του προσυναπτικού νευρώνα, στις οποίες γίνεται σύντηξη κυστιδίων νευροδιαβιβαστή, οι οποίες γίνονται παροδικά ανενεργές έπειτα από τη σύνητηξη του κυστιδίου. Αυτές οι ζώνες ανακάμπτουν από την καταστολή σε συγκεκριμένο χρονικό πλαίσιο, το οποίο όμως επιταχύνεται όσο αυξάνεται η ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca 2+. Η διευκόλυνση και η 30

38 εμμένουσα καταστολή εξαρτώνται αμφότερες από την ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca 2+ και η αυξημένη πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή οδηγεί σε μεγαλύτερη συναπτική καταστολή λόγω των παραπάνω γεγονότων (Dittman, Kreitzer et al. 2000). Ένα άλλο χαρακτηριστικό φαινόμενο βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας είναι η μετατετανική ενίσχυση, η οποία παρατηρείται όταν οι συνάψεις ενεργοποιούνται επαναλαμβανόμενα από μια αλληλουχία προσυναπτικών ερεθισμών, που επιδίδονται σε σχετικά υψηλή συχνότητα. Το φαινόμενο της μετατετανικής ενίσχυσης περιλαμβάνει τόσο προσυναπτικούς όσο και μετασυναπτικούς μηχανισμούς με την εμπλοκή των υποδοχέων NMDA, ενώ η βραχύχρονη καταστολή φαίνεται ότι εμπλέκει μηχανισμούς εξάντλησης νευροδιαβιβαστή στην προσυναπτική απόληξη. Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, στη βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα κατηγοριοποιούνται φαινόμενα συναπτικής μεταβολής, τα οποία διαρκούν από μερικές δεκάδες χιλιοστών του δευτερολέπτου μέχρι αρκετά λεπτά. Τα φαινόμενα αυτά, και ιδίως η διευκόλυνση, παρατηρούνται σε όλο το νευρικό σύστημα. Η πειραματική και θεωρητική διερεύνηση δείχνει ότι τα φαινόμενα βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας έχουν σημαντική εμπλοκή σε διάφορες διεργασίες, από τη ρύθμιση της λειτουργίας των τοπικών νευρωνικών δικτύων μέχρι τη συμπεριφορά (Klug, Borst et al. 2012). Για παράδειγμα, έχει προταθεί ότι μπορεί να δρα σταθεροποιητικά στη δραστηριότητα των νευρωνικών δικτύων και να λειτουργεί ως φίλτρο περιορίζοντας την αποτελεσματικότητα των συναπτικών εισόδων κατά την επαναλαμβανόμενη ενεργοποίησή τους, καθότι αποτελεί μια διεργασία παροδικής ενδυνάμωσης της συναπτικής διαβίβασης (Klyachko and Stevens 2006). Οι βραχύχρονες αλλαγές της συναπτικής αποτελεσματικότητας παίζουν θεμελιώδη ρόλο στην επεξεργασία πληροφορίας από τα νευρικά δίκτυα, επηρεάζοντας τη δυναμική τους (Anwar, Li et al. 2017). Επίσης, θεωρείται ότι αυξάνει το δυναμικό μνημονικής αποθήκευσης και την ικανότητα μνημονικής ανάκτησης στα νευρωνικά δίκτυα (Torres and Kappen 2013), ενώ στον ιππόκαμπο θα μπορούσε να συμβάλλει στην συγκράτηση νεοαποκτηθείσας πληροφορίας για σύντομα χρονικά διαστήματα (Eichenbaum 2013). Επίσης, μπορεί να αποτελεί έναν σημαντικό νευρωνικό μηχανισμό που υποστηρίζει τη διεργασία της ενεργού μνήμης. 31

39 Μακρόχρονη συναπτική πλαστικότητα Η μακρόχρονη συναπτική πλαστικότητα αφορά σε συναπτικά φαινόμενα τα οποία διαρκούν για μεγάλο χρονικό διάστημα, δηλαδή πάνω από 30 λεπτά. Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα μακρόχρονης συναπτικής πλαστικότητας αποτελεί η μακρόχρονη συναπτική ενδυνάμωση (Long Term Potentiation-LTP), συναπτικό φαινόμενο το οποίο εμπλέκεται σημαντικά στις διεργασίες της μνήμης και μάθησης. Πιο συγκεκριμένα ως μακρόχρονη συναπτική ενδυνάμωση ορίζεται το φαινόμενο κατά το οποίο ενισχύεται το μετασυναπτικό διεγερτικό δυναμικό που παράγεται σε συνάψεις έπειτα από επανηλειμένη ενεργοποίηση των προσυναπτικών νευρώνων μέσω ερεθισμών που επιδίδονται σε υψηλή συχνότητα (τετανικός ερεθισμός). Η επαγόμενη μέσω του υψίσυχνου ερεθισμού μεταβολή στη συναπτική αποτελεσματικότητα μπορεί να διατηρείται για μικρό ή μεγάλο χρονικό διάστημα. Για να ορίσουμε τη μεταβολή αυτή ως μακρόχρονη, θα πρέπει να διατηρείται για περίπου τουλάχιστον μισή ώρα. Η LTP είναι ένα φαινόμενο που συνίσταται σε μία αλληλουχία διαδοχικών μοριακών και κυτταρικών διεργασιών, που τελικά οδηγούν σε συναπτική ενδυνάμωση διαρκείας. Οι διεργασίες αυτές κατηγοριοποιούνται σε φάσεις όπως είναι η επαγωγή και η διατήρηση της LTP. Τα εναρκτήρια γεγονότα στην πορεία ανάπτυξης LTP οδηγούν σε αύξηση της κυτταροπλασματικής συγκέντρωσης Ca 2+. Πιο συγκεκριμένα είναι απαραίτητη η ενεργοποίηση του υποδοχέα NMDA, μέσω της δέσμευσης γλουταμικού στον υποδοχέα και μέσω της εκπόλωσης της μετασυναπτικής μεμβράνης, που θα απομακρύνει τα ιόντα μαγνησίου από τον δίαυλο του υποδοχέα. Αυτά τα γεγονότα είναι κρίσιμα για την πυροδότηση της έναρξης των επόμενων διεργασιών, που θα οδηγήσουν σε LTP. Η είσοδος του ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα μέσω συναπτικής δραστηριότητας πυροδοτεί δύο κατηγορίες βιοχημικών διεργασιών που συνίστανται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, ουσιαστικά φωσφορυλιώσεις προϋπαρχόντων πρωτεϊνών και διεργασίες πρωτεϊνοσύνθεσης είτε από προϋπάρχον mrna είτε εκ νέου έκφραση γονιδίων. Ένα από τα πιο σημαντικά μόρια των οποίων η ενεργότητα επάγεται από το Ca 2+ που εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα είναι μία κινάση που ενεργοποιείται από το σύμπλοκο της ασβεστιοκαλμοδουλίνης (Ca 2+ /CaM) και καλείται CaMKII, η οποία οδηγεί στην εγκατάσταση LTP και παίζει σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό μνήμης (Sanhueza and Lisman 2013). Πιο 32

40 συγκεκριμένα, η CaMKII μπορεί να συμβάλει στην ενίσχυση της συναπτικής διαβίβασης μέσω φωσφορυλίωσης του υποδοχέα AMPA (Derkach 2011). Η δράση αυτή μπορεί να περιλαμβάνει αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωση του υποδοχέα, οι οποίες να επιτρέπουν μεγαλύτερα ποσά ρεύματος δια μέσω του διαύλου του υποδοχέα. Η δράση της CaMKII και άλλων κινασών, όπως είναι η PKC και η PKA, οδηγούν σε κινητοποίηση της διεργασίας διακίνησης των υποδοχέων από το κυτταρόπλασμα προς τη συναπτική μεμβράνη. Γενικά θεωρείται ότι η πρώιμη LTP διαρκεί περίπου 1-2 ώρες, ενώ η όψιμη LTP μπορεί να διαρκεί τουλάχιστον 4-5 ώρες (Reymann & Frey, 2007). Έτσι, το Ca 2+ που επάγει την πρώιμη LTP, με διάρκεια (1-2 ώρες), εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα δια μέσου των υποδοχέων NMDA και επίσης απελευθερώνεται από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ) με την ενεργοποίηση υποδοχέων ρυανοδίνης. Ο μηχανισμός αυτός περιορίζεται στην περιοχή της σύναψης. Για την επαγωγή πιο μακρόχρονης LTP απαιτείται ενεργοποίηση μεταβοτροπικών υποδοχέων τύπου Ι του γλουταμικού σε συνεργασία με τους υποδοχείς NMDA, που οδηγούν σε απελευθέρωση Ca 2+ από το ενδοπλασματικό δίκτυο μέσω υποδοχέων τριφωσφορικής ινοσιτόλης (IP3). Επίσης, μέσω του Ca 2+ και της διακυλογλυκερόλης, που ενεργοποιείται από τον μεταβοτροπικό υποδοχέα, ενεργοποιείται η PKC και στη συνέχεια επάγεται τοπική πρωτεϊνοσύνθεση στον δενδρίτη. Η όψιμη LTP, που διαρκεί ακόμα περισσότερο (>6 ώρες), απαιτεί μηχανισμούς σηματοδότησης που εξαρτώνται από το ασβέστιο στην περιοχή του σώματος όπου βρίσκεται ο πυρήνας του κυττάρου. Η ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ενδοκυττάριου camp, το οποίο οδηγεί στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α(PKA), η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί την MAP κινάση, οι οποίες μετατοπίζονται στον πυρήνα και ενεργοποιούν τελικά τον μεταγραφικό παράγοντα CREB (camp response element-binding protein) με τελικό αποτέλεσμα τη μεταγραφή γονιδίων (Reymann and Frey 2007). Όπως μπορεί να υποτεθεί, οι μηχανισμοί αυτοί απαιτούν εισροή Ca 2+ στη σωματική περιοχή μέσω τασεοελεγχόμενων διαύλων Ca 2+, οι οποίοι μπορούν να ενεργοποιηθούν με έντονη εκπόλωση της μεμβράνης. Πειραματικά, η εκπόλωση αυτή μπορεί να επιτευχθεί μέσω έντονης συναπτικής ενεργοποίησης, εκπόλωσης του μετασυναπτικού κυττάρου συζευγμένη με συναπτική ενεργοποίηση. Πρέπει να αναφερθεί ότι οι μακρόχρονες μορφές LTP περιλαμβάνουν και δομικές αλλαγές στους δενδρίτες, περιλαμβανομένων αλλαγών στη μορφολογία των συναπτικών ακάνθων (Yang and Zhou 2009). 33

41 Πρωτόκολλα επαγωγής της μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης Το LTP μπορεί να προκληθεί από μία ευρεία γκάμα πρωτοκόλλων ερεθισμού. To πιο κοινά χρησιμοποιούμενο είναι μία ακολουθία παλμών (ποικίλου αριθμού) στα 100 Hz για 1 δευτερόλεπτο (High frequency stimulation-hfs). Δύο άλλα ευρέως χρησιμοποιημένα πρωτόκολλα είναι o ερεθισμός με ριπή προπαιδευσης (primed burst stimulation-pbs) και ο ερεθισμός υπο μορφή ριπής θητα ρυθμού (Theta Burst stimulation-tbs), στα οποία το κοινό χαρακτηριστικό είναι το διάστημα των 200msec είτε ανάμεσα στο ερέθισμα προπαίδευσης (priming stimulus) και της σύντομης ριπής ερεθισμών όπως στο PBS (Larson and Lynch 1986), είτε ανάμεσα σε διαδοχικές σύντομες ριπές (συνήθως των τεσσάρων παλμών) σε ένα TBS (Rose and Dunwiddie 1986). Το διάστημα των 200msec εμπίπτει στην περιοδικότητα του θ ρυθμού, μίας ενδογενούς ιπποκάμπειας δραστηριότητας που παράγεται κατά την εξερευνητική κίνηση. O ερεθισμός προπαίδευσης ή η ριπή προπαίδευσης ενεργοποιεί τους GABAεργικούς ενδονευρώνες, οδηγώντας σε υπερπόλωση του πυραμιδικού κυττάρου μέσω των μετασυναπτικών GABA A και GABA B υποδοχέων, αλλά κυρίως οδηγεί στην ενεργοποίηση των προσυναπτικών GABA B αυτοϋποδοχέων, οι οποίοι οδηγούν με τη σειρά τους στην μείωση της απελευθέρωσης του GABA που είναι βέλτιστη στα msec. Με αυτόν τον τρόπο η επόμενη σύντομη ριπή ερεθισμών προκαλεί μικρότερη υπερπόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης με τελικό αποτέλεσμα την ενίσχυση του ρεύματος διαμέσου των τασεοελεγχόμενων υποδοχέων NMDA. Μικρότερα πρότυπα διέγερσης αυτού του είδους είναι πιθανότερο να συμβαίνουν φυσιολογικά σε σχέση με τα HFS πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται κυρίως για λόγους συνήθειας και ευκολίας. Μεταξύ των πρωτοκόλλων επαγωγής LTP με πρότυπο θήτα ρυθμού και με υψίσυχνο ερεθισμό στη συχνότητα των 100Ηz υπάρχει σημαντική επικάλυψη των σηματοδοτικών μονοπατιών που ενεργοποιούνται καθοδικά. Όμως υπάρχουν και κάποιες καταστάσεις στις οποίες η LTP που επάγεται από πρωτόκολλα με πρότυπο θήτα ρυθμού είναι πιο ευαίσθητη σε παράγοντες όπως είναι η ηλικία, το στρες αλλά και σε φαρμακολογικούς χειρισμούς που επηρεάζουν τη συναπτική διαβίβαση που εξαρτάται από ενδοκανναβινοειδή, σεροτονίνη και αδενοσίνη. Πολλοί από τους προαναφερθέντες παράγοντες επηρεάζουν και τις διαδικασίες μνήμης και μάθησης, υποδεικνύοντας ότι η LTP που επάγεται με πρότυπο θήτα ρυθμού φαίνεται να είναι καλύτερο μοντέλο για τη διερεύνηση των μηχανισμών που υπόκεινται της μνήμης και 34

42 μάθησης σε σχέση με τα πρωτόκολλα που επάγουν LTP με συνεχή επίδοση υψίσυχνου ερεθισμού (Larson and Munkacsy 2015) Διάφραγματο-κροταφική διαφοροποίηση Ο ιππόκαμπος παρουσιάζει διαχωρισμό των λειτουργιών του κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού του άξονα, γεγονός το οποίο αποδίδεται στις διαφορετικές συνδέσεις που δέχεται το κάθε τμήμα του από τις εξωιπποκάμπειες περιοχές. Πιο συγκεκριμένα ο ραχιαίος ιππόκαμπος (Dorsal Hippocampus-DH) θεωρείται ότι διαμεσολαβεί γνωσιακές διεργασίες, συγκεκριμένα τη χωρική μνήμη και πλοήγηση, ενώ ο κοιλιακός ιππόκαμπος (Ventral Hippocampus-VH) εμπλέκεται σε συγκινησιακές αποκρίσεις όπως είναι ο φόβος και το στρες (Strange, Witter et al. 2014). Η παραπάνω διαφορετική εμπλοκή των δύο πόλων του ιπποκάμπου σε συμπεριφορικό επίπεδο έχει δειχθεί από μελέτες στις οποίες γίνονταν τραυματισμοί σε συγκεκριμένα τμήματα του ιπποκάμπου και παρατηρούταν η ικανότητα εκμάθησης των πειραματοζώων (Moser, Moser et al. 1993; Moser and Moser 1998; Bannerman, Deacon et al. 2002). Πολλές είναι και οι διαφορές της συνδεσιμότητας των δύο πόλων. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω η διαφορετική εμπλοκή των ιπποκάμπειων τμημάτων σε διαφορετικές αποκρίσεις θεωρείται συνέπεια της διαφορετικής συνδεσιμότητας αυτών με τις παραϊπποκάμπειες περιοχές. Πιο συγκεκριμένα ο ραχιαίος ιππόκαμπος δέχεται εννεύρωση από τον μέσο ενδορινικό φλοιό (MEC) που με τη σειρά του δέχεται προβολές από το προϋπόθεμα, το παραϋπόθεμα, τον οπισθοσπλήνιο φλοιό και τον μεταρινικό φλοιό, περιοχές του εγκεφάλου που θεωρούνται ότι ανήκουν στην ευρύτερη περιοχή του εγκεφάλου που επεξεργάζεται τη χωρική μνήμη. Οι πληροφορίες που δέχεται είναι οπτικές και χωρικές και αφορούν την πλοήγηση στον χώρο. Αντίθετα ο κοιλιακός ιππόκαμπος δέχεται εννεύρωση από τον πλάγιο ενδορινικό φλοιό (LEC) ο οποίος με τη σειρά του δέχεται εννεύρωση από τον οσφρητικό φλοιό και τον περιρινικό φλοιό, περιοχές που εμπλέκονται στα στστήματα προσοχής και κινήτρου (Witter, Doan et al. 2017). Επιπρόσθετα όλα τα νευροτροποποιητικά συστήματα παρουσιάζουν διαφορετικά πρότυπα προβολών κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου. Συγκεκριμένα τα νοραδρενεργικά κυτταρικά σώματα εντοπίζονται κυρίως στον υπομέλαινα τόπο (locus coeruleus-lc), ο οποίος προβάλει στον ιππόκαμπο και μάλιστα στον κοιλιακό πόλο (Haring and Davis 1985). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η έκκριση νοραδρεναλίνης στον ιππόκαμπο 35

43 μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στη συναπτική διαβίβαση και κατά συνέπεια στην επεξεργασία της εισερχόμενης πληροφορίας. Επίσης οι ντοπαμινεργικοί άξονες που εννευρώνουν τον ιππόκαμπο και φέρουν ντοπαμίνη, προέρχονται από την κοιλιακή καλυπτρική περιοχή (ventral tegmental area-vta), τη μέλαινα ουσία (striatum nigra-sn) καθώς και τον υπομέλαινα τόπο (LC). Οι ντοπαμινεργικοί αυτοί νευρώνες προβάλουν κυρίως στον κοιλιακό ιππόκαμπο και πολύ λιγότερο στον ραχιαίο. Πέρα όμως από τις συμπεριφορικές διαφορές και τις διαφορές στη συνδέσιμότητα με τις διάφορες περιοχές του φλοιού μεταξύ ραχιαίου και κοιλιακού ιππόκαμπου, έχουν βρεθεί σημαντικές διαφορές στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Έχουν αποκαλυφθεί κατά μήκος του επιμήκους άξονα του ιπποκάμπου πολλαπλές διαχωρισμένες περιοχές έκφρασης γονιδίων, όπου καθεμία περιέχει μία μοναδική ομάδα εκφρασμένων γονιδίων (π.χ. 9 υποπεριοχές εντός της CA3, τρεις κύριες υποπεριοχές εντος της οδοντωτής έλικας και της CA1) (Thompson, Pathak et al. 2008; Dong, Swanson et al. 2009; Fanselow and Dong 2010). Επίσης έχουν γίνει πιο λεπτομερείς μελέτες ως προς τη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των περιοχών CA1 και CA3 του ραχιαίου και του κοιλιακού ιππόκαμπου και αναδεικνύουν βαθμιδωτές διαφορές κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακου άξονα στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με μόρια κυτταρικής προσκόλλησης, μεταγραφικούς παράγοντες, πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη συναπτική διαβίβαση και με διαύλους ιόντων (Cembrowski, Bachman et al. 2016; Cembrowski, Wang et al. 2016). Τα παραπάνω πρότυπα της διαφορικής έκφρασης γονιδίων πιθανότατα οδηγούν σε διαφορετικές λειτουργικές ιδιότητες. Τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν ιοντικούς διαύλους ίσως καθορίζουν τις εγγενείς ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες των διακριτών ιπποκάμπειων νευρωνικών πληθυσμών. Χαρακτηριστικές διαφορές επιπρόσθετα έχουν εντοπιστεί μέχρι σήμερα σε πολλά επίπεδα οργάνωσης όπως, στις κυτταρικές ιδιότητες όπως η διεγερσιμότητα (Liagkouras, Michaloudi et al. 2008; Dougherty, Islam et al. 2012; Honigsperger, Marosi et al. 2015), στους νευροχημικούς δείκτες (Gage and Thompson 1980; Verney, Baulac et al. 1985; Sotiriou, Papatheodoropoulos et al. 2005; Pandis, Sotiriou et al. 2006), στη συναπτική διαβίβαση (Papatheodoropoulos, Asprodini et al. 2002; Petrides, Georgopoulos et al. 2007; Georgopoulos, Petrides et al. 2008; Maggio and Segal 2009), στη συναπτική πλαστικότητα (Papatheodoropoulos and Kostopoulos 2000; Maruki, Izaki et al. 2001; Colgin, Kubota et al. 36

44 2004; Maggio and Segal 2007; Grigoryan, Korkotian et al. 2012; Kenney and Manahan-Vaughan 2013; Keralapurath, Clark et al. 2014; Pofantis and Papatheodoropoulos 2014) και στην δικτυακή αυθόρμητη ηλεκτροφυσιολογική δραστηριότητα (Gilbert, Racine et al. 1985; Bragdon, Taylor et al. 1986; Papatheodoropoulos, Moschovos et al. 2005; Sabolek, Penley et al. 2009; Mikroulis and Psarropoulou 2012; Patel, Fujisawa et al. 2012; Papatheodoropoulos 2015). Αυτή η διαφοροποίηση αναμένεται να έχει σημαντικές επιπτώσεις για την επεξεργασία της πληροφορίας και τους λειτουργικούς ρόλους που επιτελούνται από τα δύο ιπποκάμπεια τμήματα. Η αποκάλυψη λειτουργικών διαφορών στο συναπτικό επίπεδο, συμπεριλαμβανομένων των τροποποιητικών δράσεων της πληθώρας των υποδοχέων και των αλληλεπιδράσεων τους, θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε το πώς τα κυκλώματα των δύο πόλων επεξεργάζονται τις πληροφορίες. 37

45 1.8. Σκοπός της μελέτης Η παρούσα διατριβή συνίσταται από τρείς επιμέρους μελέτες με τις οποίες επιχειρήθηκε α) η διερεύνηση της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας καθόλο το μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου στην CA1 περιοχή με την επίδοση δεκάδων ερεθισμών σε 11 διαφορετικές συχνότητες και β) η διερεύνηση της μακρόχρονης συναπτικής πλαστικότητας και πως διαφοροποιείται η δράση των νευροτροποποιητικών νευροδιαβιβαστών νοραδρεναλίνης και ντοπαμίνης μεταξύ ραχιαίου και κοιλιακού ιπποκάμπου. Με τις μελέτες αυτές επιδιώχθηκε να διασαφηνιστούν περαιτέρω οι μηχανισμοί που υπεισέρχονται στην διαφοροποίηση της λειτουργικής οργάνωσης των τοπικών νευρωνικών δικτύων μεταξύ ραχιαίου και κοιλιακού ιπποκάμπου και να εντοπιστούν πιθανοί μηχανισμοί που σχετίζονται με την λειτουργία του ιπποκάμπου και μπορεί να εμπλέκονται στην μεταβολή της μνημονικής ικανότητας που συνοδεύει την νευροτροποποίηση του δικτύου. 38

46 2. Υλικά και μέθοδοι 2.1. Πειραματόζωα Στις ακόλουθες μελέτες χρησιμοποιήθηκαν αλφικοί Wistar επίμυες ηλικίας από 3 έως 4 μηνών. Τα ζώα διατηρούνταν στο ζωοτροφείο του τμήματος Ιατρικής, σε περιβάλλον σταθερών συνθηκών: θερμοκρασία ο C, σταθερές συνθήκες κύκλου φωτός (12 ώρες φως/12 ώρες σκότος) και ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και τροφή. Η μεταχείριση και οι πειραματικές διαδικασίες για όλα τα ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις Κατευθυντήριες οδηγίες για την φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων εργαστηρίου του Ευρωπαϊκού Κοινοτικού Συμβουλίου (European Communities Council Directive Guidelines (2010/63/EU European Commission)) για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων και εγκρίθηκαν από την Νομαρχιακή Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης των πειραματόζωων ((Prefectural Animal Care και Use Committee (No: EL 13BIO04)). Αναλόγως, πάρθηκαν όλα τα μέτρα για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων και την μείωση του αριθμού τους στην μελέτη αυτή, όπως προβλέπεται από την συνθήκη των 3Rs In vitro τομές ιπποκάμπου Η ανάπτυξη της μεθόδου in vitro διατήρησης τομών εγκεφάλου αποτέλεσε μία μεγάλη τεχνολογική πρόοδο για την έρευνα της ηλεκτροφυσιολογίας εγκεφαλικών δομών. Ο πρωτοπόρος αυτής της ανακάλυψης ήταν ο νευροχημικός Henry Mcllwain που πραγματοποίησε βιοχημικές μελέτες σε τομές εγκεφάλου. Αργότερα ακολούθησαν οι ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές με την επίτευξη συναπτικών απαντήσεων έπειτα από ερεθισμό (Yamamoto and McIlwain 1966; Richards and McIlwain 1967; McIlwain and Snyder 1970), όπου τελικά εφαρμόστηκαν στις τομές ιπποκάμπου από τον Tim Bliss και τον Chris Richards, οι οποίοι κατέδειξαν ότι τα δυναμικά πεδίου που βρέθηκαν σε άθικτα ζώα μπορούσαν να καταγραφούν και σε τομές κατά μήκος του διάφραγματο-κροταφικού άξονα του ιπποκάμπου (Bliss and Richards 1971). Οι in vitro τομές ιπποκάμπου παρουσιάζουν πλεονεκτήματα σε σχέση με τις in vivo καταγραφές όπως είναι η διατήρηση των συναπτικών συνδέσεων ενός πλήρους νευρωνικού κυκλώματος, όπως είναι το τρισυναπτικό δίκτυο του ιπποκάμπου, μηχανική σταθερότητα που επιτρέπει τις πολύωρες καταγραφές, δυνατότητα ακριβούς τοποθέτησης των ηλεκτροδίων ερεθισμού και καταγραφής, ευκολία στην προσέγγιση και ταυτοποίηση των νευρώνων, 39

47 δυνατότητα ελέγχου της χημικής σύστασης του εξωκυττάριου περιβάλλοντος καθώς και συνθηκών όπως η θερμοκρασία, το ph, το οξυγόνο. Επιπρόσθετα οι τομές παρασκευάζονται εύκολα και σε μεγάλο αριθμό από τον ίδιο ιππόκαμπο, γεγονός που ευνοεί την επαναληψιμότητα των πειραμάτων και την ελαχιστοποίηση του αριθμού χρησιμοποιούμενων ζώων. Τέλος δεν χρησιμοποιούνται αναισθητικοί παράγοντες που επηρεάζουν τις μετρήσεις και ελαχιστοποιείται η ταλαιπωρία των ζώων. Ταυτόχρονα οι in vitro τομές παρουσιάζουν κάποια βασικά μειονεκτήματα όπως η απώλεια συνδέσεων με άλλες περιοχές καθώς και η έλλειψη ρυθμιστικών μορίων (π.χ. ορμόνες). Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω αντιλαμβανόμαστε τους λόγους για τους οποίους η ανακάλυψη των in vitro τομών ιπποκάμπου αποτέλεσε την κατεξοχήν μέθοδο επιλογής των περισσοτέρων εργαστηρίων που μελετούν ερωτήματα που αφορούν το επίπεδο οργάνωσης που εμπεριέχεται μέσα σε μία τομή Παρασκευή Τομών Ιπποκάμπου Οι τομές ιπποκάμπου από τον ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο προετοιμάστηκαν όπως αναφέρεται προηγούμενα (Papatheodoropoulos and Kostopoulos 2000). Ειδικότερα, τα ζώα αποκεφαλίζονταν σε λαιμητόμο κάτω από βαθιά αναισθησία με διαιθυλαιθέρα. Το μεγαλύτερο μέρος του κρανίου αφαιρείται με 3 τομές με ψαλίδι ανατομίας, συγκεκριμένα μία κατά μήκος της μέσης οβελιαίας γραμμής και 2 κατά μήκος των δύο έσω καρωτίδων. Για την αφαίρεση των οστών του κρανίου χρησιμοποιείται λαβίδα με ενισχυμένα άκρα και αφαιρούνται οι μήνιγγες προσεκτικά, ώστε να μην τραυματιστεί ο εγκέφαλος. Με τη βοήθεια μικρής σπάτουλας, που φέρει καμπυλωμένα άκρα, αφαιρείται ο εγκέφαλος από το κρανίο και τοποθετείται σε τρυβλίο με παγωμένο (2-4 o C) τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΤΕΝΥ-ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)). Στη συνέχεια αποχωρίζεται η παρεγκεφαλίδα με μετωπιαία τομή στα διδύμια και διαχωρίζονται μεταξύ τους τα δύο ημισφαίρια με νυστέρι. Στη συνέχεια μετά από προσεκτική απομάκρυνση των τμημάτων του διεγκεφάλου και κοπή της ψαλίδας αφαιρούνταν οι δύο ιππόκαμποι. 40

48 Wistar Επίμυες 3μηνών Dorsal Νάρκωση με διαιθυλαιθέρα Ventral Εικόνα 8: Απομόνωση του ιπποκάμπου από τον εγκέφαλο επίμυος και παρασκευή τομών από το ραχιαίο (Dorsal) και από τον κοιλιακό πόλο (Ventral), οι οποίες τοποθετούνται σε υδατόλουτρο διεπαφής προς καταγραφή των διεγερτικών μετασυναπτικών δυναμικών. Εγκάρσιες τομές πάχους μm προετοιμάστηκαν από περιοχές που εκτείνονται περισσότερο από 1 και λιγότερο από 3 mm από τον ραχιαίο (διαφραγματικό) και κοιλιακό (κροταφικό) άκρο του ιπποκάμπου (Εικόνα 8) με τη χρήση μικροτόμου Mcllwain, όπως φαίνεται στην Εικόνα 9. Για να διατηρήσουμε την κάθετη γωνία κοπής κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των τομών από τους δύο πόλους, απαιτείται περιστροφή της βάσης της μικροτόμου, πάνω στην οποία έχει τοποθετηθεί ο ιππόκαμπος. Αμέσως μετά το κόψιμο, οι τομές μεταφέρονται και διατηρούνται σε ένα υδατόλουτρο καταγραφής τύπου διεπαφής (υγρήςαέριας φάσης) όπου διαποτίζονται συνεχώς με ΤΕΝΥ και διατηρούνται παρουσία μείγματος αερίου που περιείχε 95% Ο 2 και 5% CO 2 σε σταθερή θερμοκρασία 30,5±0,5 ο C. Οι τομές αφήνονται σε ηρεμία για τουλάχιστον μιάμιση ώρα μετά την προετοιμασία τους στο υδατόλουτρο, ώστε να προσαρμοστούν στο θρεπτικό μέσο, πριν την έναρξη των καταγραφών. Από κάθε ζώο, 1-4 τομές από κάθε πόλο επιλέγονταν για πειραματισμό. 41

49 Εικόνα 9: Μικροτόμος McIlwain που χρησιμοποιείται για την παρασκευή εγκάρσιων τομών ιπποκάμπου πάχους μm. Επιπλέον για τον χαρακτηρισμό των συνάψεων της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα, τεμαχιζόταν όλος ο ιππόκαμπος σε τομές πάχους μm. Πιο συγκεκριμένα ο ιππόκαμπος αποτελεί μία δομή μήκους περίπου 11 χιλιοστομέτρων οπότε κατά τον τεμαχισμό των τομών λαμβάνονταν 20 τομές. Η πρώτη και η τελευταία τομή δεν δίνουν ικανοποιητικά fepsp οπότε δεν συμπεριελήφθησαν στη μελέτη. Για τον τεμαχισμό των ενδιάμεσων τομών απαιτούταν συνεχής επανατοποθέτηση του ιπποκάμπου ως προς τη λεπίδα του μικροτόμου McIlwain, ώστε η γωνία κοπής να είναι πάντα κάθετη. 2.4 Εξωκυττάριες καταγραφές στην περιοχή CA1 τομών ιπποκάμπου Στην περίπτωση που ένας νευρώνας ενεργοποιείται συναπτικά στην περιοχή των απώτερων δενδριτών του, ο νευροδιαβιβαστής που απελευθερώνεται από τις προσυναπτικές απολήξεις, προκαλεί άνοιγμα ιοντικών καναλιών της μετασυναπτικής μεμβράνης των δενδριτών και την είσοδο θετικού ιοντικού ρεύματος στον ενδοκυττάριο χώρο. Έτσι προκαλείται εκπόλωση της μεμβράνης, οπότε το σημείο αυτό καθίσταται πιο θετικό σε σχέση με άλλα σημεία της μεμβράνης. Ταυτόχρονα δημιουργείται ένα πλεόνασμα αρνητικού φορτίου στον εξωκυττάριο χώρο. Στο υπόλοιπο τμήμα του δενδρίτη όμως και έως το σώμα, υπάρχει φυσιολογικά περίσσεια αρνητικού φορτίου στον μετασυναπτικό ενδοκυτταρικό χώρο και αντίστοιχα θετικού στον 42

50 εξωκυτταρικό χώρο αφού τα νευρικά κύτταρα είναι αρνητικά φορτισμένα. Η διαταραχή της ιοντικής ισορροπίας στην περιοχή της συναψης έχει ως συνέπεια τη ροή ενδοκυτταρικών θετικών φορτίων από τη σύναψη προς το σώμα του νευρώνα στον ενδοκυτταρικό χώρο και ταυτόχρονα τη ροή εξωκυτταρικών θετικών φορτίων από το σώμα και τον υπόλοιπο δενδρίτη προς τη σύναψη. Κλείνει λοιπόν ένα ηλεκτρικό κύκλωμα και η όλη μορφολογία του είναι ανάλογη ενός ρευματικού διπόλου με τον αρνητικό πόλο στην περιοχή της σύναψης και τον θετικό στην περιοχή του σώματος όπως φαίνεται και στην Εικόνα 10. Το σημείο εισόδου του ρεύματος στον νευρώνα (απώτεροι δενδρίτες) καλείται καταβόθρα ρεύματος (current sink) ενώ αυτό της εξόδου στον εξωκυττάριο χώρο (σώμα) πηγή ρεύματος (current source). Τα ιοντικά ρεύματα λοιπόν δια μέσου του εξωκυττάριου χώρου ρέουν με κατεύθυνση από τις πηγές στις καταβόθρες δημιουργώντας στιγμιαίες μεταβολές δυναμικού, τα δυναμικά πεδίου. Πιο συγκεκριμένα, στη περιοχή της καταβόθρας καταγράφεται ένα αρνητικό δυναμικό, ενώ στην περιοχή της πηγής ένα θετικό, σχηματίζοντας έτσι ένα ηλεκτροστατικό δίπολο. Η τοπική μεταβολή της ιοντικής ισορροπίας στις συνάψεις ενός νευρώνα δεν αρκεί για να δημιουργήσει αρκετά ισχυρές ρευματικές πηγές και αντίστοιχα μετρήσιμα ηλεκτρικά πεδία. Οι νευρώνες θα πρέπει να έχουν παράλληλη στοίχιση και να ερεθίζονται ομαδικά, ώστε τα διαδοχικά ρευματικά δίπολα να αθροίζονται και χωρικά και χρονικά, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των πυραμιδικών νευρώνων του ιπποκάμπου. Τελικά η άθροιση των εξωκυττάριων δυναμικών από ένα μεγάλο πληθυσμό νευρώνων δημιουργεί σχετικά μεγάλα δυναμικά πεδίου που μπορούν να καταγραφούν. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκαν εξωκυττάριες καταγραφές προκλητών συναπτικών δυναμικών και δυναμικών ενεργείας προερχόμενων από έναν πληθυσμό νευρώνων (δυναμικά πεδίου ή πληθυσμιακά δυναμικά) σε τομές ιπποκάμπου. Πιο συγκεκριμένα, ο ηλεκτρικός ερεθισμός των παράπλευρων ινών του Schaffer, προκαλεί συναπτική εκπόλωση των δενδριτών της ακτινωτής στιβάδας (stratum radiatum). Στο σημείο αυτό που αποτελεί την καταβόθρα ρεύματος, η εκπόλωση θα καταγραφεί εξωκυττάρια ως μία αρνητική απόκλιση του δυναμικού, που αποτελεί το άθροισμα των δενδριτικών εκπολώσεων ενός πληθυσμού νευρώνων και καλείται διεγερτικό μετασυναπτικό δυναμικό πεδίου (fepsp-field excitatory postsynaptic potential). 43

51 Εικόνα 10: Σχηματική επεξήγηση της δημιουργίας διπολικής ρευματικής πηγής στο εσωτερικό του ιπποκάμπου, στην περίπτωση διεγείρουσας σύναψης σε πυραμιδικό νευρώνα. Προκειμένου να κλείσει το κύκλωμα του δημιουργούμενου ρεύματος, αυτό θα πρέπει να διαφύγει από άλλο σημείο του νευρώνα (πηγή ρεύματος). Το σημείο αυτό είναι η περιοχή του σώματος του νευρώνα, που εντοπίζεται στην πυραμιδική στιβάδα (stratum pyramidale), όπου καταγράφεται ως μία θετική απόκλιση του δυναμικού, που αποτελεί κατοπτρικό είδωλο του δυναμικού που καταγράφεται στους δενδρίτες. Όταν η συναπτική εκπόλωση υπερβεί τον ουδό, τότε προκαλείται διέγερση των νευρώνων οπότε και δημιουργούνται δυναμικά ενέργειας στην περιοχή του σώματος (εκφυτικός κώνος), που η άθροιση τους από πληθυσμό νευρώνων αποτελεί μία καταβόθρα ρεύματος και καταγράφεται ως μία αρνητική απόκλιση που επικάθεται στην κυματομορφή του διεγερτικού μετασυναπτικού δυναμικού και καλείται πληθυσμιακό δυναμικό ενέργειας (population spike-ps). Στην ακτινωτή στιβάδα, όπου βρίσκονται οι δενδρίτες, το πληθυσμιακό δυναμικό ενέργειας καταγράφεται ως μία θετική απόκλιση του δυναμικού (μικρότερου μεγέθους συγκριτικά με αυτό που καταγράφεται στο σώμα) όπως φαίνεται στην Εικόνα 11. Τα ηλεκτρόδια ερεθισμού αποτελούνται από δίπολα, μονωμένα σύρματα πλατίνας/ιριδίου διαμέτρου 25μm (World Precision Instruments, USA) και μεταξύ τους 44

52 απόσταση 100μm σχηματίζοντας ένα ζεύγος που χρησιμοποιείται για διπολικό ερεθισμό. Τα άκρα τους που προορίζονται για ερεθισμό παραμένουν ελεύθερα μόνωσης και παράλληλα μεταξύ τους. Το σημείο ερεθισμού για όλες τις μελέτες είναι το μέσον της ακτινωτής στιβάδας των απώτερων δενδριτών των πυραμιδικών κυττάρων της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου, για τον ερεθισμό των παράπλευρων ινών του Schaffer σε απόσταση μm από την στιβάδα των σωμάτων των πυραμιδικών νευρώνων. Το ζεύγος των ηλεκτροδίων βυθίζεται εντός της τομής κατά το ήμισυ του πάχους της. Εικόνα 11: Σχηματική απεικόνιση της περιοχής CA1 του ιπποκάμπου όπου ερεθίζονται οι παράπλευρες ίνες του Schaffer και των θέσεων καταγραφής στην ακτινωτή στιβάδα (Rec1) και στην πυραμιδική στιβάδα (Rec2) όπου παίρνουμε το fepsp και το PS αντίστοιχα. Γραμμές κλίμακας 1mV και 5ms. Τα ηλεκτρόδια καταγραφής αποτελούνται από ίνα άνθρακα διαμέτρου 7μm (Kation Scientific, Minneapolis, USA) και χρησιμοποιούνται για την καταγραφή του βιολογικού σήματος. Να σημειωθεί ότι η απόσταση μεταξύ ηλεκτροδίων ερεθισμού και καταγραφής παραμένει σταθερή περίπου στα 350μm. Για την πρόκληση των βιολογικών απαντήσεων χρησιμοποιούνται ηλεκτρικοί παλμοί διάρκειας 100μs και ρυθμιζόμενης έντασης από 0.2 έως 300 μα για την εκτέλεση των συναρτήσεων εισόδου/εξόδου. Το βιολογικό σήμα που προκύπτει μετά τον ερεθισμό, καταγράφεται από τα ηλεκτρόδια καταγραφής και στη συνέχεια κατευθύνεται σε προενισχυτή (ενίσχυση 100Χ), ακολούθως σε ενισχυτή (ενίσχυση 5Χ) και τέλος σε φίλτρο για την απομάκρυνση μη επιθυμητών συχνοτήτων και τη βελτίωση του λόγου σήμα/θόρυβος. Μετά το φίλτρο το σήμα άγεται προς: α) παλμογράφο για οπτικό έλεγχο της 45

53 καταγραφής, β) ηχεία για ακουστικό έλεγχο και γ) σε ειδικό μετατροπέα του αναλογικού σήματος σε ψηφιακό συνδεδεμένο με υπολογιστή, το CED 1401-plus interface. Τα σήματα ανακτήθηκαν με τον Neurolog ενισχυτή (Digitimer Limited, UK), υπέστησαν φιλτράρισμα στις συχνότητες από 0.5Hz έως 2kHz, ψηφιοποιήθηκαν στα 10kHz και αποθηκεύτηκαν στον σκληρό δίσκο του υπολογιστή με τη χρήση διεπαφής CED 1401-plus και του λογισμικού Signal 5.09 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) για ανάλυση εκτός του χρόνου του πειράματος. Για την πρόσληψη, αποθήκευση και μετέπειτα ανάλυση του βιολογικού σήματος σε ψηφιακή μορφή χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Signal έκδοση Τα είδη των δυναμικών πεδίου που καταγράφονται στις τομές του ιπποκάμπου ειναι τα εξής: Το πληθυσμιακό δυναμικό ενέργειας των προσυναπτικών ινών (fiber volley-fv) που καταγράφεται στην περιοχή των δενδριτών ως μία αρνητική απόκλιση του δυναμικού και οφείλεται στα αθροισμένα δυναμικά ενέργειας των διεγερμένων προσυναπτικών ινών Schaffer, αποτελεί μέτρο προσυναπτικής διέγερσης. Αυξάνεται αναλογικά σε σχέση με την ένταση του ερεθισμού, αφού εντονότερος ερεθισμός προκαλεί τη διέγερση περισσότερων ινών. Υπολογίζεται ως η απόσταση της αρνητικής κορυφής από την οριζόντια ευθεία που ορίζει το επίπεδο του δυναμικού πριν τον ερεθισμό σε mv (Εικόνα 12). Το διεγερτικό μετασυναπτικό δυναμικό πεδίου (Field Excitatory Postsynaptic PotentialfEPSP) που καταγράφεται τόσο στην ακτινωτή στιβάδα των δενδριτών (όπου και δημιουργείται) όσο και στην πυραμιδική στιβάδα (ως ανεστραμμένο είδωλο). Το fepsp αποτελεί ένα βραδύ κύμα διάρκειας 10-40msec (Εικόνα 12), αποτελεί ένδειξη της έντασης της συναπτικής ενεργοποίησης και υπολογίζεται ως η μέγιστη κλίση της ανερχόμενης φάσης του (θετική στην πυραμιδική στιβάδα και αρνητική στην ακτινωτή), κλίση του EPSP (mv/msec). Στα αποτελέσματα η κλίση του fepsp, υπολογισμένη είτε στην πυραμιδική είτε στην ακτινωτή στιβάδα, θα αναφέρεται συμβατικά με θετικό πρόσημο. Το εμβαδόν της κυματομορφής (mv x ms) ορίζεται ως το εμβαδόν που περικλείεται από τη συνολική κυματομορφή του fepsp, αποτελεί μέτρο της συναπτικής διευκόλυνσης κατά την επίδοση των παλμών και της συναπτικής ενεργοποίησης των υποδοχέων NMDA (Collingridge, Randall et al. 1992) και μετριέται ως η περιοχή που οριοθετείται 46

54 από την κυματομορφή του δυναμικού, τη βασική γραμμή και την ορθογώνια γραμμή που διασταυρώνει την κυματομορφή στο τέλος του fv (Εικόνα 12). Το πληθυσμιακό δυναμικό ενέργειας (Population Spike-PS) αποτελεί μία καθυστερημένη σύντομη αλλαγή του δυναμικού σε σχέση με το fepsp, διάρκειας 2-3 msec και καταγράφεται στην πυραμιδική στιβάδα (Εικόνα 12). Αποτελεί μία μέτρηση του αριθμού των συναπτικά διεγειρόμενων νευρώνων αλλά και του συγχρονισμού διέγερσης των νευρώνων αυτών. Το PS υπολογίζεται ως η απόσταση μεταξύ της αρνητικής κορυφής και του μεσοδιαστήματος των δύο θετικών κορυφών, ύψος του PS (mv). Εικόνα 12: Τα είδη των δυναμικών πεδίου που καταγράφονται κατά την επίδοση συζευγμένων παλμών σε διαπαλμικό διάστημα 50ms. Επίσης φαίνεται ο τρόπος με τον οποίο ποσοτικοποιούνται οι παράμετροι. Οι κόκκινες γραμμές δείχνουν τα σημεία που τοποθετούνται οι κέρσορες ώστε να μετρηθεί η κάθε παράμετρος (fv, fepsp, PS και εμβαδόν). Γραμμές κλίμακας 1mV και 5ms. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι συναρτήσεις εισόδου/εξόδου που βασίζονται στη σχέση μεταξύ προσυναπτικής ενεργοποίησης και μετασυναπτικής απόκρισης. Για την κατασκευή αυτών των συναρτήσεων ερεθίζονταν κάθε 30 δευτερόλεπτα οι ίνες του Schaffer με παλμούς αυξανόμενης έντασης ρεύματος και καταγραφόταν στην ακτινωτή στιβάδα τα δυναμικά πεδίου (EPSP, FV). Η προκύπτουσα σχέση αποτελεί τη συνάρτηση συναπτικής αποτελεσματικότητας (Εικόνα 13). Προκύπτει από την τιμή του ρεύματος όπου επιδίδεται ο 47

55 ερεθισμός (Ι) και τη μετασυναπτική εκπόλωση (fepsp). Η γραμμικότητα της συνάρτησης αυτής υποδηλώνει την αναλογία μεταξύ της προσυναπτικής διέγερσης και της δενδριτικής εκπόλωσης Ημιμέγιστο EPSP Εικόνα 13: Παραδείγμα μετασυναπτικών απαντήσεων (fepsp) μετά από επίδοση ρεύματος αυξανόμενης έντασης. Από τις τιμές που συλλέγονται σχεδιάζονται διαγράμματα που δείχνουν τη συνάρτηση μετασυναπτικής αποτελεσματικότητας τόσο στις τομές από ραχιαίο όσο και σε τομές από κοιλιακό ιππόκαμπο. Οι εξής δείκτες περιγράφουν την παραπάνω συνάρτηση: α) Ημιμέγιστο ρεύμα ερεθισμού (I-50 EPSP ), οριζόμενο ως το ρεύμα που αντιστοιχεί στο Ημιμέγιστο fepsp και β) Μέγιστο fepsp. Επίσης η προσυναπτική διέγερση εκφράζεται με τα καταγραφόμενο στην ακτινωτή στιβάδα Fv του οποίου το ύψος είναι ανάλογο της έντασης του ρεύματος ερεθισμού. Από την παραπάνω συνάρτηση υπολογίζεται το ρεύμα στο οποίο αντιστοιχεί το ημιμέγιστο του fepsp, στο οποίο και διεξάγονται όλα τα πειράματα μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης. Πέρα από τις καμπύλες εισόδου-εξόδου χρησιμοποιούνται πρότυπα ερεθισμού για τη βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε η σύζευξη παλμών όπου επιδίδονται δύο παλμοί μέσω ενός ηλεκτροδίου ερεθισμού με μεταβαλλόμενη χρονική απόσταση μεταξύ τους (μεσοπαλμικό διάστημα) και καταγράφεται η απάντηση από την πυραμιδική ή την ακτινωτή στιβάδα (Εικόνα 12). Διερευνάται έτσι το αποτέλεσμα (ενισχυτικό ή κατασταλτικό) που ο πρώτος ερεθισμός επιφέρει στην απάντηση που εκλύεται με τον δεύτερο ερεθισμό, σαν συνάρτηση της μεταξύ τους χρονικής απόστασης. Το ενισχυτικό αποτέλεσμα 48

56 καλείται διευκόλυνση με σύζευξη παλμών, ενώ το κατασταλτικό αποτέλεσμα καλείται ως καταστολή με σύζευξη παλμών ή απλώς καταστολή. Επίσης για τη μελέτη της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας χρησιμοποιήθηκε πρωτόκολλο ερεθισμού με επίδοση δεκάδας παλμών σε διαφορετικές συχνότητες. Κατά την προσπάθεια μας να μελετήσουμε τις ιδιότητες των συνάψεων της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου που εξαρτώνται από την συχνότητα του ερεθίσματος, επιδόθηκαν δέκα παλμοί με διαφορετικό διαπαλμικό διάστημα. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι συχνότητες 0,1, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 και 100Hz. Για την επίτευξη της συχνότητας 0,1 Hz οι παλμοί επιδίδονταν ανά 10 δευτερόλεπτα, για την συχνότητα 1 Hz ανά 1 δευτερόλεπτο, για τα 3 Hz ανά 330 ms και ούτω καθεξής. Τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας το fepsp σε κάθε παλμό που επιδιδόταν και υπολογίζοντας την ποσοστιαία αλλαγή των επακόλουθων παλμών σε σχέση με το πρώτο fepsp Διαλύματα και φαρμακολογικοί παράγοντες Σε όλες τις φάσεις του χειρισμού, ο ιστός διαβρέχονταν από τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΤΕΝΥ) σύστασης (σε mm): 124mM NaCl, 4mM KCl, 2mM MgSO 4, 2mM CaCl 2, 1.25mM NaH 2 PO 4, 26mM NaHCO 3 και 10mM γλυκόζη, κορεσμένο σε αέριο μείγμα 95% Ο 2 και 5% CO 2 και ph=7,4. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι φαρμακολογικοί παράγοντες: i) ο αγωνιστής των β-αδρενεργικών υποδοχέων (β-ar) (±)Isoproterenol (±) bitartrate salt (ISO, 1 μμ), Sigma Aldrich ii) ο ανταγωνιστής των β-αδρενεργικών υποδοχέων (S)-(-)Propranolol hydrochloride (PRO, 10 μμ), Tocris Bioscience iii) ο ανταγωνιστής των υποδοχέων NMDA, 3-((R)-2-Carboxypiperazin-4-yl)-propyl-1- phosphonic acid (CPP, 10μΜ), Tocris Bioscience iv) ο ανταγωνιστής των υποδοχέων GABA B, 3-[[(3,4-Dichlorophenyl)methyl]amino]propyl] diethoxymethyl)phosphinic acid (CGP 52432, 10 μm); v) ο ανταγωνιστής των GABA Α υποδοχέων πικροτοξίνη (picrotoxin (PTX, 10 μm)), Sigma Aldrich 49

57 vi) ο ανταγωνιστής των L-τύπου τασεο-ελεγχόμενων καναλιών ασβεστίου (VDCC), Νιμοδιπίνη (nimodipine (NIMO, 20 μm)) Tocris Bioscience vii) ο ανταγωνιστής των D1/D5 ντοπαμινεργικών υποδοχέων (R)-(1)-7-Chloro-8-hydroxy-3- methyl-1-phenyl-2,3,4,5-tetrahydro-1 H-3-benzazepine hydrochloride (SCH 23390, 20 μm) Tocris Bioscience viii) ο μερικός αγωνιστής των D1/D5 ντοπαμινεργικών υποδοχέων Phenyl-2,3,4,5-tetrahydro-(1 H)-3-benzazepine-7,8-diol hydrobromide (SKF 38393, 50 μm και 150 μm) Tocris Bioscience ix) ο ειδικός αγωνιστής των D1 ντοπαμινεργικών υποδοχέων agonist 6-Chloro-2,3,4,5- tetrahydro-1-phenyl-3 (2-propen-1-yl)-1 H-3-benzazepine-7,8-diol hydrobromide (SKF 82958, 10 μm). Σχεδόν όλοι οι παραπάνω φαρμακολογικοί παράγοντες διαλύθηκαν σε νερό, με εξαίρεση την πικροτοξίνη και την νιμοδιπίνη που διαλύθηκαν σε διμέθυλ-σουλφοξείδιο (DMSO), σε συγκέντρωση 1000 φορές πυκνότερη από αυτή στην οποία τελικά χρησιμοποιήθηκαν. Οι φαρμακολογικοί παράγοντες διαλύονταν στην τελική τους συγκέντρωση σε ΤΕΝΥ και διαπότιζαν τις τομές για 25 λεπτά, με εξαίρεση τις πικροτοξίνη και νιμοδιπίνη οι οποίες διαπότιζαν τις τομές για 35 λεπτά. 2.6 Ανοσοαποτύπωση κατά Western Απομόνωση πρωτεϊνών CA1 περιοχής τομών ιπποκάμπου Οι τομές ιπποκάμπου παρασκευάσθηκαν με την χρήση μικροτόμου McIlwain όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στη συνέχεια απομονώθηκε η CA1 περιοχή με τη χρήση νυστεριού. Σε κάθε τομή ιπποκάμπου έγιναν τρεις τομές, στις παράπλευρες ίνες του Schaffer, στο όριο μεταξύ CA1 και υποθέματος και στο επίπεδο της ιπποκάμπειας σχισμής. Η απομόνωση των πρωτεϊνών έγινε είτε κατευθείαν μετά την απομόνωση του ιπποκάμπου είτε έπειτα από παραμονή των τομών για διάρκεια 90 λεπτών στο υδατόλουτρο. Οι απομονωμένες CA1 περιοχές από τομές που προέρχονταν από τον ραχιαίο και τον κοιλιακό πόλο του ιπποκάμπου, ομογενοποιήθηκαν σε 200 μl διαλύματος SDS 1% w/v, στο οποίο προστέθηκαν 4 μl διαλύματος αναστολέων πρωτεασών (Sigma). Ακολούθησε ομογενοποίηση με τη χρήση υπερήχων και στη συνέχεια βρασμός των δειγμάτων για 10 λεπτά στους 95 ο C. Η ποσοτικοποίηση της συνολικής 50

58 πρωτεΐνης των δειγμάτων έγινε με τη χρήση του φασματοφωτομέτρου Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). Από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε ίδια ποσότητα συνολικής πρωτεΐνης (40 μg) για την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου 10% Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου Ο όρος ηλεκτροφόρηση αναφέρεται στο φαινόμενο μετανάστευσης ηλεκτρικά φορτισμένων μορίων υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Διάφορα βιομόρια όπως πρωτεΐνες και DNA είναι φορτισμένα και μετακινούνται εντός πηκτώματος με βάση το φορτίο τους και το μοριακό τους βάρος, είτε προς την άνοδο αν το φορτίο τους είναι θετικό είτε προς την κάθοδο αν είναι αρνητικό. Στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται πήκτωμα πολυακριλαμιδίου το οποίο σχηματίζει τρισδιάστατα πολυμερή δίκτυα μέσω του οποίου διαχωρίζονται οι πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, β- μερκαπταιθανόλη). Πιο συγκεκριμένα το SDS είναι ιοντικό απορρυπαντικό που δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία (1,4 gr SDS ανά gr πρωτεΐνης) και προσδίδει στις πρωτεΐνες αρνητικό φορτίο ανάλογο του μοριακού τους βάρους. Επιπλέον χρησιμοποιούνται αναγωγικοί παράγοντες, όπως η β-μερκαπταιθανόλη, που σπάζουν τους δισουλφιδικούς δεσμούς των πρωτεϊνών. Η πλήρης πρωτεϊνική αποδιάταξη επιτυγχάνεται με θέρμανση των δειγμάτων στους 95 ο C για 5 λεπτά. Το τελικό αποτέλεσμα των παραπάνω διεργασιών είναι να αναλύονται οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες λόγω του αρνητικού τους φορτίου και της αποδιάταξης με βάση μόνο το μοριακό τους βάρος. Στην ανοσοαποτύπωση Western έχουμε την εκλεκτική ανίχνευση μία πρωτεΐνης αντιγόνου με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων που έχουν παρασκευασθεί έναντι αυτής. Αρχικά ηλεκτροφορούμε το δείγμα πρωτεΐνης σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου 10% και μεταφέρουμε με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τις διαχωρισμένες πρωτεΐνες σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (0,45μm). Έπειτα προσθέτουμε διάλυμα άπαχου γάλακτος (10% w/v) PBS-Tween 20 ώστε να καλυφθούν οι μη ειδικές θέσεις δέσμευσης πρωτεΐνών και διάλυμα ειδικού αντισώματος ώστε να ανιχνεύσουμε την πρωτεΐνη-στόχο. Στη συνέχεια η μεμβράνη ξεπλένεται με διάλυμα άπαχου γάλακτος και προστίθεται διάλυμα του δεύτερου αντισώματος το οποίο αναγνωρίζει τη σταθερή περιοχή (Fc) του πρώτου αντισώματος. Επίσης το δεύτερο αντίσωμα είναι συζευγμένο με την 51

59 πρωτεΐνη HRP (Horse-Raddish Peroxidase) μέσω της οποίας γίνεται η ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος μέσω χημειοφωταύγειας. Πιο συγκεκριμένα στη μελέτη μας χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα της εταιρείας Santa- Cruz έναντι του D1 υποδοχέα επίμυ (sc-33660) διαλυμένο σε συγκέντρωση 1:500 σε 10% διάλυμα άπαχου γάλακτος, το οποίο παρασκευάσθηκε σε ποντικό, με το οποίο επωάσαμε την μεμβράνη για 12 ώρες στους 4 ο C. Στη συνέχεια η μεμβράνη ξεπλύθηκε σε διάλυμα PBS-Tween και επωάστηκε για 1 ώρα στους 25 ο C παρουσία δεύτερου αντισώματος έναντι του αντισώματος ποντικού συζευγμένο με HRP. Ακολούθησε η προσθήκη συστήματος χημειοφωταύγειας (Millipore Corporation, Bedford, MA) η οποία ανιχνεύθηκε με τη χρήση Hyperfilm της εταιρείας Fuji και έκθεση για 30 δεύτερα έως 7 λεπτά. Η ανάλυση του μοριακού βάρους των πρωτεϊνών έγινε με τη χρήση σημασμένου δείγματος πρωτεΐνων (prestained ladder) (Biomol GmbH, Hamburg, Germany). Οι μεμβράνες επαναχρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συνολικής ακτίνης των δειγμάτων με τη χρήση πρώτου αντισώματος έναντι αυτής (1: 500, Santa Cruz, sc-47778). Η υπόλοιπη διαδικασία εμφάνισης της χημειοφωταύγειας έγινε όπως προηγουμένως. Τα φιλμ στα οποία έγινε η ανίχνευση της χημειοφωταύγειας σαρώθηκαν σε υπολογιστή και έγινε υπολογισμός της έντασης της κάθε ζώνης πρωτεΐνης με τη βοήθεια του λογισμικού NIH ImageJ v.1.48 (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Σε κάθε περίπτωση τα επίπεδα του υποδοχέα D1 εκφράζονται έπειτα από κανονικοποίηση με τα επίπεδα της ακτίνης του εκάστοτε δείγματος. 2.7 Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (q-pcr) Τα πειράματα έγιναν στη CA1 περιοχή τομών που προετοιμάστηκαν όπως αναφέρεται προηγούμενα. Οι τομές απομονώθηκαν από τρεις επίμυες αμέσως μετά την απομόνωση του ιπποκάμπου από τον εγκέφαλο του πειραματοζώου. Από την CA1 περιοχή απομονώθηκε το ολικό mrna έπειτα από ομογενοποίηση του ιστού παρουσία του αντιδραστηρίου TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Στη συνέχεια 1μgr του ολικού mrna χρησιμοποιήθηκε ώστε να γίνει η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής παρουσία εκκινητών, η αλληλουχία των οποίων αποτελούταν από 18 θυμίνες (Oligo(dT) 18 ), και της αντίστροφης μεταγραφάσης Superscript III (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ορίζει 52

60 η εταιρεία. Για την πραγματοποίηση της αντίδρασης q-pcr χρησιμοποιήθηκαν το αντιδραστήριο SYBR FAST q-pcr Kit (Kapa Biosystems, Wilλεπτάgton, MA) και ο θερμοκυκλωτής StepOne (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Για τον πολυμερισμό του mrna του γονιδίου Drd1 χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές: 5' CTTCTGGAAGATGGCTCCTAAC 3'και 5'CCAAGAGATCTGACACAGCTAAA 3. Ως γονίδιο ελέγχου χρησιμοποιήθηκε η γλυκουρονιδάση β (Gusb) και οι εκκινητές που χρησιμοποίηθηκαν για τον πολυμερισμό του mrna του γονιδίου είναι οι 5' CTTCTGGAAGATGGCTCCTAAC 3 και 5' CCAAGAGATCTGACACAGCTAAA 3. Οι τιμές Ct από τρεις αντιδράσεις αναλύθηκαν με την μέθοδο σχετικής ποσοτικοποίησης 2 ΔCt. Η ποσότητα των mrna του γονιδίου ενδιαφέροντος καθορίστηκε σε σχέση με την ποσότητα των μεταγράφων του γονιδίου της β- γλυκουρονιδάσης. Τα επίπεδα των mrna παρουσιάζονται ως ποσοστά του ραχιαίου ιππόκαμπου σε σχέση με του κοιλιακού. 53

61 3. Αποτελέσματα 3.1. Μελέτη της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας στον ιππόκαμπο του επίμυος Βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα του ιππόκαμπου Για να πραγματοποιηθεί η παρακάτω μελέτη καταγράφηκαν fepsps από εκατόν δέκα εφτά (117) τομές οι οποίες προήλθαν από τους ιπποκάμπους δέκα επίμυων. Ο αριθμός των τομών από τις δεκαοκτώ διαδοχικές θέσεις κατά μήκος του επιμήκους άξονα του ιπποκάμπου και ο αντίστοιχος αριθμός επίμυων δίνεται στον Εικόνα 14. DH VH Πόλος Ραχιαίος Διάμεσος Κοιλιακός Αριθμός θέσης Αριθμός τομών Αριθμός ζώων Εικόνα 14: Διαγραμματική απεικόνιση του ιππόκαμπου και του τρόπου με τον οποίο παρασκευάσθηκαν οι τομές. Όλος ο ιππόκαμπος τεμαχίστηκε σε 20 τομές που χρησιμοποιήθηκαν για τον πειραματικό χειρισμό. Στον πίνακα αναγράφεται ο αρισμός των θέσεων, το τμήμα του ιπποκάμπου στο οποίο εμπίπτει η κάθε τομή και ο αριθμός τομών και ζώων ανά θέση. Το πρότυπο ερεθισμού, που αποτελούταν από 10 παλμούς, επιδόθηκε σε ένταση ρεύματος η οποία είχε ως αποτέλεσμα ένα μόλις υποκατώφλιο fepsp, το οποίο είχε μέση κλίση 0.72±0.33 mv/ms (n=117). Στην 54

62 Εικόνα 15 παρουσιάζονται παραδείγματα από μετασυναπτικές απαντήσεις που παρατηρούνται έπειτα από την επίδοση της δεκάδας παλμών με διαφορετική συχνότητα σε συγκεκριμένες θέσεις κατά τον επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου. Η 55

63 Εικόνα 15 μας παρουσιάζει το διαφορετικό αποτέλεσμα που είχε η επίδοση της δεκάδας παλμών, σε διαφορετικές συχνότητες, στις διαφορετικές θέσεις του ιπποκάμπου κατά μήκος του επιμήκους άξονα του. 56

64 Εικόνα 15: Παραδείγματα μετασυναπτικών απαντήσεων (fepsps) που προκαλούνται από την επίδοση μίας ακολουθίας ερεθισμών με 10 παλμούς που επιδίδεται σε διαφορετικά διαπαλμικά διαστήματα. Εδώ παρατηρούνται τρεις αντιπροσωπευτικές τομές από τις τρεις περιοχές του ιπποκάμπου. Οι καταγραφές προέρχονται από τομές που εντοπίζονται 1, 6 και 9,5 χιλιοστά από το ραχιαίο άκρο του ιπποκάμπου και αντιστοιχούν στον ραχιαίο (DORSAL), διάμεσο (MEDIAL) και κοιλιακό (VENTRAL) τμήμα του ιπποκάμπου. Τα αρχικά fepsps στις τρεις τομές είχαν παρόμοιο πλάτος (~ 1.5 mv). Άξιο αναφοράς είναι το γεγονός ότι η τομή από τον ραχιαίο ιππόκαμπο παρουσιάζει διευκόλυνση στις συχνότητες 1-40 Hz και εμφάνισε καταστολή μόνο στα 100 Hz. Σε πλήρη αντίθεση η τομή από κοιλιακό ιππόκαμπο παρουσιάζει καταστολή σε όλες τις συχνότητες, ενώ οι μετασυναπτικές απαντήσεις από τον διάμεσο ιππόκαμπο ήταν ενδιάμεσες σε σχέση με αυτές που παρατηρήθηκαν στο ραχιαίο και στον κοιλιακό ιππόκαμπο. 57

65 Εικόνα 16: Βραχύχρονες αλλαγές στη συναπτική διαβίβαση που σχεδιάζονται σε τρισδιάστατο διάγραμμα συναρτήσει της συχνότητας ερεθισμού και της θέσης της τομής κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου. Παρουσιάζονται τα διαγράμματα από 6 χαρακτηριστικά fepsp που προκαλούνται κατά την επίδοση της δεκάδας παλμών στα έξι γραφήματα. Για να δειχθούν καλύτερα οι αλλαγές του fepsp στις χαμηλές και στις υψηλές συχνότητες ερεθισμού η πλάγια αριστερή όψη του τρισδίαστατου διαγράμματος και η πλάγια αριστερή όψη παρουσιάζονται σε ξεχωριστές εικόνες. Συγκεκριμένα εδώ βλέπουμε την αριστερή όψη και ενώ η δεξιά όψη 58

66 φαίνεται στην Εικόνα 17. Άξιο σημείωσης είναι το γεγονός ότι οι τομές από τις πιο ραχιαίες θέσεις του ιπποκάμπου παρουσιάζουν διευκόλυνση σε μεγάλο εύρος συχνοτήτων (1-40 Hz) και καθόλη τη διάρκεια επίδοσης της δεκάδας παλμών, ενώ οι τομές από τον πιο κοιλιακό πόλο παρουσιάζουν καταστολή σε όλο το εύρος συχνοτήτων και καθόλη τη διάρκεια επίδοσης της ακολουθίας παλμών. Επίσης αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι οι μετασυναπτικές απαντήσεις αλλάζουν σταδιακά από διευκόλυνση σε καταστολή καθώς προχωρούμε προς τον κοιλιακό πόλο του ιπποκάμπου και όχι απότομα. Σε γενικές γραμμές μπορούμε να πούμε ότι η δεκάδα παλμών που επιδόθηκε σε συχνότητες 1-40 Hz επάγει τη διευκόλυνση των συναπτικών απαντήσεων, η οποία ήταν υψηλότερη στο ραχιαίο τμήμα του ιπποκάμπου και μειώνεται σταδιακά κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα, ώσπου τελικά στις τομές που προέρχονται από πιο κοιλιακές θέσεις μετατρέπεται σε συναπτική καταστολή. Ο ερεθισμός με συχνότητα 0,1 Hz δεν προκάλεσε καμία σημαντική αλλαγή στη συναπτική διαβίβαση, ενώ ο ερεθισμός με συχνότητες 50, 75 και 100 Hz είχε ως αποτέλεσμα συναπτική καταστολή, η οποία αυξάνεται όσο πηγαίνουμε προς τον κοιλιακό πόλο, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 16 και στην Εικόνα 17. Από το παραπάνω γενικό πρότυπο μπορούμε να σημειώσουμε ότι υπάρχει μία απόκλιση, όσον αφορά τη δεύτερη συναπτική απάντηση της δεκάδας, η οποία στις συχνότητες από 5-40 Hz παρουσίαζε διευκόλυνση καθόλο το μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα. Πιο συγκεκριμένα η διευκόλυνση της δεύτερης απάντησης είναι μέγιστη στις τομές από τις πιο ραχιαίες θέσεις και μειώνεται σταδιακά και στατιστικά σημαντικά όσο προχωράμε προς τις πιο κοιλιακές θέσεις (ANOVA για κάθε συχνότητα μεταξύ 5 και 40 Hz, 1.8 F 2.4, P<0.05). Για τις συχνότητες 1 και 3 Hz παρατηρήθηκε στο ραχιαίο τμήμα του ιπποκάμπου μία μικρή συναπτική διευκόλυνση (1.2±1.2% και 3.9±1.4% αντίστοιχα, Mann-Whitney U test για τις θέσεις 2-6, P>0.05), ενώ στις πιο ραχιαίες θέσεις (15-19) παρατηρήθηκε ήπια αλλά σημαντική συναπτική καταστολή (- 5.9±2.0% and -7.4±3.5% για τα 1 και 3 Hz αντίστοιχα, Mann-Whitney U test, P<0.05). Στις υψηλές συχνότητες ερεθισμού των Hz παρατηρήθηκε μία σταδιακή αλλαγή από διευκόλυνση σε καταστολή κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα (ANOVA, F=2.9, P<0.001). Επίσης πρέπει να επισημάνουμε ότι η δεύτερη συναπτική απάντηση αποτελεί τη διευκόλυνση που παρατηρείται έπειτα από τη επίδοση δύο διαδοχικών παλμών (σύζευξη παλμών - paired pulse facilitation-ppf) σε διαπαλμικά διαστήματα 20ms και αντιστοιχεί σε συχνότητες 50 Hz, η οποία έχει βρεθεί και από άλλες μελέτες να είναι μεγαλύτερη στον DH σε σχέση με τον VH (Papatheodoropoulos and Kostopoulos 2000; Papatheodoropoulos 2015; Milior, Castro et al. 2016; Babiec, Jami et al. 2017). Οι επακόλουθες συναπτικές απαντήσεις κατά την επίδοση της δεκάδας (δηλαδή οι παλμοί 3-10) παρουσιάζουν μία σταδιακή μετάβαση από συναπτική 59

67 διευκόλυνση σε καταστολή όσο αυξάνεται η συχνότητα επίδοσης της δεκάδας παλμών και όσο κινούμαστε από τον DH προς τον VH. Εικόνα 17: Βραχύχρονες αλλαγές στη συναπτική διαβίβαση που σχεδιάζονται σε τρισδιάστατο διάγραμμα συναρτήσει της συχνότητας ερεθισμού και της θέσης της τομής κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα του 60

68 ιπποκάμπου. Στην παραπάνω εικόνα παρουσιάζεται η δεξιά πλάγια όψη των τρισδιάστατων διαγραμμάτων της Εικόνα 16 ώστε να γίνει αντιληπτή η καταστολή που παρουσιάζεται στις υψηλές συχνότητες ερεθισμού. Οπότε κατά την επίδοση αυξανόμενου αριθμού παλμών η διευκόλυνση περιορίζεται στον ραχιαίο και στον ενδιάμεσο ιππόκαμπο και για τις συχνότητες Hz. Σε υψηλότερες συχνότητες ακόμα και οι συνάψεις από τομές του DH επέδειξαν σταθερή καταστολή. Αντίθετα οι συνάψεις από τον VH (θέσεις > 15) έδειξαν συνεχή καταστολή σε όλο το φάσμα των συχνοτήτων (Εικόνα 17). Όταν υπολογίσαμε τους μέσους όρους των μετασυναπτικών απαντήσεων 8-10, δηλαδή εκεί όπου οι μετασυναπτικές απαντήσεις είχαν σταθεροποιηθεί (steady-state), και σχεδιάσαμε το διάγραμμα με μεταβλητές στους άξονες τη θέση των τομών και τις συχνότητες επίδοσης της δεκάδας παλμών, παρατηρήσαμε ότι για τις συχνότητες 1-40 Hz υπήρχε σταδιακή μετάβαση από διευκόλυνση στις τομές από DH σε καταστολή στις τομές από VH (ANOVA κατά μήκος όλου του άξονα, 4.5 F 14.8, P<0.001). Πρέπει να σημειώσουμε ότι η διευκόλυνση των μετασυναπτικών απαντήσεων στις συνάψεις των τομών από DH (θέσεις 2-6) και για τις συχνότητες 5-30 Hz παρέμεινε αυξημένη καθόλη τη διάρκεια της δεκάδας παλμών, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 18Α. Στη συχνότητα των 50 Hz οι συνάψεις του DH δεν παρουσίασαν κάποια σημαντική αλλαγή, ενώ οι συνάψεις του VH παρουσίασαν καταστολή (ANOVA κατά μήκος του άξονα, F=3.4, P<0.001). Για τις συχνότητες παλμών από Hz παρουσιάστηκε μια σταδιακά αυξανόμενη καταστολή των συνάψεων κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου (ANOVA κατά μήκος του άξονα, 2.9 F 3.3, P<0.001). Στη συχνότητα των 0,1 Hz δεν υπήρξε κάποια σημαντική διαφορά στις μετασυναπτικές απαντήσεις κατά μήκος του άξονα. Ένα παρόμοιο πρότυπο αλλαγών παρατηρήθηκε όταν από όλες τις μετασυναπτικές απαντήσεις (δηλαδή 2 η -10 η ) υπολογίστηκε ο μέσος όρος και δημιουργήθηκε διάγραμμα με μεταβλητές τη συχνότητα επίδοσης της δεκάδας παλμών και τη θέση των τομών στο ραχιαιοκοιλιακό άξονα (Εικόνα 18Β), όπου η σταδιακή μετάβαση από διευκόλυνση σε καταστολή κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα παρατηρήθηκε ακόμα και στην ελάχιστη συχνότητα των 0,1 Hz. Για να γίνει καλύτερα κατανοητό το αποτέλεσμα της επαναλαμβανόμενης ενεργοποίησης στις συναπτικές απαντήσεις κατά τη διάρκεια της επίδοσης των δέκα παλμών δημιουργήσαμε διαγράμματα για κάθε συχνότητα με μεταβλητές τον αριθμό του παλμού και την θέση της κάθε τομής όπως φαίνεται στην Εικόνα 19. Όπως φαίνεται στις συχνότητες 1-5 Hz η διευκόλυνση των 61

69 συναπτικών απαντήσεων είναι εμφανής σε όλες τις θέσεις, μέχρι και την 14η (δηλαδή ραχιαίος και ενδιάμεσος ιππόκαμπος). Εικόνα 18: Οι ποσοστιαίες αλλαγές που παρουσιάζονται στο fepsp από τον επιδιδόμενο ερεθισμό όταν σχεδιάζονται σε διάγραμμα με μεταβλητές τη θέση της τομής στον επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου και τη συχνότητα των επιδιδόμενων ερεθισμών. Φαίνεται ο μέσος όρος της ποσοστιαίας αλλαγής των μετασυναπτικών απαντήσεων 8-10 και όλων των μετασυναπτικών απαντήσεων 2-10 στα διαγράμματα της σειράς Α και Β αντίστοιχα. Η αριστερή και η δεξιά πλάγια όψη των διαγραμμάτων παρουσιάζονται ξεχωριστά στα διαγράμματα Α1,Β1 και Α2,Β2 αντίστοιχα. 62

70 Εικόνα 19: Οι συχνοτοεξαρτώμενες ποσοστιαίες αλλαγές της συναπτικής διαβίβασης παρουσιάζονται στα διαγράμματα που καταρτίζονται συναρτήσει της θέσης των τομών κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα και του αριθμού των προκλητών διεγερτικών μετασυναπτικών απαντήσεων, κατά τη διάρκεια της επίδοσης τως δεκάδας παλμών. Οι αλλαγές των fepsp που συνέβησαν στην εκάστοτε συχνότητα παρουσιάζονται σε 10 διαφορετικά τρισδιάστα γραφήματα. Οι μεσοι όροι όλων των συχνοτήτων επίδοσης ερεθισμού παρουσιάζονται στα δύο τελευταία διαγράμματα στο κάτω δεξί τμήμα της εικόνας. Παρατηρούμε ότι η συναπτική διευκόλυνση ξεκινάει από χαμηλή συχνότητα επίδοσης των ερεθισμών (1 Hz), σταδιακά αυξάνει στον ραχιαίο ιππόκαμπο με μέγιστο στα 20 63

71 Hz και σταδιακά μειώνεται όσο κινούμαστε προς τον κοιλιακό ιππόκαμπο και σε υψηλότερες συχνότητες. Επίσης παρατηρούμε ότι, ανεξάρτητα από τη συχνότητα επίδοσης των ερεθισμών, υπάρχει μία σταδιακή αλλαγή στις μετασυναπτικές απαντήσεις από αυξημένη διευκόλυνση στην αρχή της επίδοσης των ερεθισμών στις ραχιαίες συνάψεις του ιπποκάμπου σε αυξημένη καταστολή στις κοιλιακές συνάψεις καθώς εξελίσσεται η δεκάδα των παλμών, ενώ οι συνάψεις του ενδιάμεσου ιππόκαμπου επιδεικνύουν μία ενδιάμεση συμπεριφορά. Στις συνάψεις των θέσεων (δηλαδή στον κοιλιακό ιππόκαμπο) παρουσιάστηκε σταθερά καταστολή των μετασυναπτικών απαντήσεων. Στις συχνότητες των Hz παρατηρήσαμε ότι από τον ενδιάμεσο ιππόκαμπο μέχρι και τον VH (θέσεις 8-18) η διευκόλυνση που παρατηρήθηκε στη 2 η απάντηση, μειωνόταν κατά την επαναλαμβανόμενη ενεργοποίηση των συνάψεων. Στη συχνότητα των 50 Hz οι συνάψεις του DH (θέσεις 2-7) παρουσίασαν διευκόλυνση καθόλη την δεκάδα των παλμών, ενώ οι συνάψεις του ενδιάμεσου ιππόκαμπου (Median/Intermediate Hippocampus-IH) παρουσίασαν διευκόλυνση μόνο στην αρχή της δεκάδας παλμών, δηλαδή στις δυο με τρεις πρώτες συναπτικές απαντήσεις. Σε υψηλότερες συχνότητες, η διευκόλυνση σταδιακά μειωνόταν μετά τις πρώτες δύο μετασυναπτικές απαντήσεις και από τον DH προς τον VH. Μετά τον υπολογισμό των μέσων όρων όλων των απαντήσεων μετά την επίδοση των δεκάδων παλμών σε διάφορες συχνότητες, παρατηρήσαμε ότι η μέγιστη διευκόλυνση συνέβη σε συνάψεις από τον DH ο οποίος εκτείνεται μέχρι και τα 4 mm από το ραχιαίο άκρο του ιπποκάμπου (θέσεις 2-7), καθώς και στην αρχή της επίδοσης της δεκάδας παλμών. Η διευκόλυνση σταδιακά μειωνόταν όταν παρατηρήσαμε τις τομές από τον IH (θέσεις 8-14) και μείωση είχαμε και κατά την επίδοση των επόμενων παλμών της δεκάδας. Επίσης στον VH η διευκόλυνση αντικαταστάθηκε από καταστολή, που αυξάνεται όσο αυξάνεται ο αριθμός του επιδιδόμενου παλμού και μεγιστοποιήθηκε στις πιο ακραίες θέσεις προς τον VH Βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα στο ραχιαίο, ενδιάμεσο και κοιλιακό τμήμα του ιπποκάμπου. Τα παραπάνω δεδομένα μας δείχνουν ότι το τμήμα του ιπποκάμπου που βρίσκεται μεταξύ του DH και του VH, είναι ένα σημείο της δομής όπου παρατηρείται μετάβαση των ιδιοτήτων βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας. Για παράδειγμα οι συνάψεις από τομές των θέσεων 2-6 (DH) και οι συνάψεις των τομών από τις θέσεις (VH) παρουσιάζουν διευκόλυνση και καταστολή των συναπτικών απαντήσεων αντίστοιχα, ενώ οι συνάψεις από τομές των ενδιάμεσων θέσεων παρουσιάζουν διευκόλυνση ή καταστολή ανάλογα με τη συχνότητα με την οποία επιδίδεται η δεκάδα των παλμών και ανάλογα με τον αριθμό του 64

72 παλμού. Κατά συνέπεια αποφασίσαμε να συγκρίνουμε τις συναπτικές απαντήσεις ομαδοποιώντας τις θέσεις σε τρία διακριτά ιπποκάμπεια τμήματα. Πιο συγκεκριμένα το σύνολο του ιπποκάμπου διαχωρίστηκε σε DH που περιλαμβάνει τις θέσεις 2-7, σε ΙΗ με τις θέσεις 8-14 και σε VH με τις θέσεις

73 Εικόνα 20: Οι μετασυναπτικές απαντήσεις που επάγονται από την επίδοση της δεκάδας ερεθισμών στις συνάψεις του ραχιαίου (DH), του ενδιάμεσου (ΜΗ) και του κοιλιακού (VH) ιππόκαμπου σε συνάρτηση με τον αριθμό του ερεθισμού. Τα διαφορετικά διαγράμματα μας δείχνουν την ποσοστιαία αλλαγή των fepsp στις έντεκα διαφορετικές συχνότητες ερεθισμών. Το διάγραμμα στο κάτω δεξί τμήμα της εικόνας δείχνει τις σταθεροποιημένες μετασυναπτικές απαντήσεις (steady-state) από την επίδοση των ερεθισμών 8-10 των τριών τμημάτων του ιπποκάμπου σε συνάρτηση με τις συχνότητες ερεθισμού. Παρατηρούμε ότι η διευκόλυνση επικρατεί στις ραχιαίες συνάψεις σε συχνότητες ερεθισμού 1-50Hz, ενώ στις κοιλιακές συνάψεις επικρατεί το φαινόμενο της καταστολής σε όλες τις συχνότητες ερεθισμού με εξαίρεση μια παροδική διευκόλυνση στις αρχές των ερεθισμών 10-50Hz. Οι συνάψεις του ενδιάμεσου ιππόκαμπου δείχνουν ενδιάμεση συμπεριφορά μεταξύ διευκόλυνσης και καταστολής. Τα δεδομένα για τον ραχιαίο, ενδιάμεσο και κοιλιακό ιππόκαμπο καταγράφηκαν από τις θέσεις 2-7, 8-14, και αντίστοιχα. Ο παραπάνω διαχωρισμός έγινε με βάση τη συνοχή που παρατηρήθηκε στη διευκόλυνση των συναπτικών απαντήσεων των ραχιαίων συνάψεων, με βάση το γεγονός ότι οι απαντήσεις που σταθεροποιούνται κατά το τέλος της δεκάδας παλμών αλλά και ο μέσος όρος των απαντήσεων στο εύρος συχνοτήτων Hz μεταπίπτουν μετά την 14 η θέση σε καταστολή και τέλος με βάση το γεγονός ότι η διευκόλυνση που παρατηρείται κατά τη σύζευξη παλμών μειώνεται απότομα μετά την 14 η θέση κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα (Papatheodoropoulos 2015). Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 20 τα τρία ιπποκάμπεια τμήματα παρουσιάζουν διακριτή συναπτική συμπεριφορά σε όλες τις συχνότητες επίδοσης των παλμών από το 1 Hz έως τα 100 Hz, και συγκεκριμένα το πρότυπο των συναπτικών απαντήσεων αλλάζει σταδιακά από τον DH προς τον VH. Όπως μπορούμε να παρατηρήσουμε και στην Εικόνα 20 οι ραχιαίες συνάψεις παρουσιάζουν διευκόλυνση στις συχνότητες 1-50 Hz. Στις συχνότητες 1-3 Hz η διευκόλυνση αυξάνεται κατά τη διάρκεια της επίδοσης της δεκάδας παλμών (ANOVA, F=3.1 για το 1 Hz και 3.2 για τα 3 Hz, P<0.005), ενώ στις συχνότητες 5-30 Hz η διευκόλυνση είναι σταθερή κατά τη διάρκεια της επίδοσης παλμών (ANOVA, 0.1 F 1.9, P>0.05). Η μέγιστη διευκόλυνση που παρατηρήθηκε στον DH προκλήθηκε κατά την επίδοση παλμών στη συχνότητα των 20 Hz. Επίσης στα 75 και 100 Hz οι συνάψεις του DH παρουσιάζουν παροδικά διευκόλυνση κατά τους δύο πρώτους παλμούς και έπειτα ξεκινά το φαινόμενο της καταστολής των συναπτικών απαντήσεων (ANOVA, 75 Hz, F =32.9 και 100 Hz, 33.2; P<0.001). Αντίθετα στις συνάψεις του VH παρατηρείται καταστολή των συναπτικών απαντήσεων στις συχνότητες Hz, κατά το μεγαλύτερο μέρος της δεκάδας των παλμών με εξαίρεση μία παροδική και ήπια διευκόλυνση στην αρχή των δεκάδων παλμών στις συχνότητες Hz. Η καταστολή αυξάνεται με την πάροδο του ερεθισμού σε όλες τις συχνότητες που είναι μεγαλύτερες των 10 Ηz (ANOVA, 2.9 F 16.0, P<0.005). Οι συναπτικές απαντήσεις στον IH ήταν ενδιάμεσες σε σχέση με τις αντίστοιχες των DH και VH για τις περισσότερες συχνότητες. Η μόνη κοινή συμπεριφορά όλων των συνάψεων καθόλο το μήκος του ιπποκάμπου ήταν η ισχυρή καταστολή 66

74 των απαντήσεων από την επίδοση των παλμών 8-10 στις πολύ υψηλές συχνότητες ( Hz). Ο ερεθισμός με παλμούς συχνότητας 0,1 Hz δεν προκάλεσε καμία σημαντική αλλαγή στη συναπτική διαβίβαση σε οποιοδήποτε τμήμα του ιπποκάμπου. Πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι το γενικό πρότυπο συναπτικής απάντησης στον DH είναι παρόμοιο με αυτό που έχει παρατηρηθεί σε άλλες εργασίες (Dittman, Kreitzer et al. 2000). Εικόνα 21: Παρουσιάζονται οι μέσοι όροι των ποσοστιαίων αλλαγών του fepsp από όλο τον ιππόκαμπο, δηλαδή από όλες τις θέσεις που σχεδιάζονται σε διάγραμμα με μεταβλητές τη συχνότητα ερεθισμού και τον αριθμό του κάθε ερεθίσματος. Η αριστερή και η δεξιά πλάγια όψη του διαγράμματος φαίνονται ξεχωριστά στο τμήμα a, b της εικόνας αντίστοιχα. Παρατηρείται ότι οι συνάψεις του ιπποκάμπου, αν υποθέσουμε ότι παρουσιάζουν την ίδια συμπεριφορά καθόλο το μήκος του, διευκολύνουν τους ερεθισμούς με συχνότητα 10-30Hz και καταστέλλουν τους ερεθισμούς συχνότητας Hz. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται με κίτρινο χρώμα αποτελούν τους μέσους όρους όλων των fepsp από όλες τις θέσεις. Παρατηρείται ότι το δίκτυο του ιπποκάμπου δείχνει διευκόλυνση στις συχνότητες 1-50 Hz με μέγιστο στις συχνότητες Hz και καταστέλει τις συχνότητες Hz. Τέλος όταν όλες οι συνάψεις κατά μήκος του ιπποκάμπου αντιμετωπίζονται ως μία οντότητα, χωρίς διακρίσεις τμημάτων, τότε ο υπολογισμός των μέσων όρων μας δείχνει διευκόλυνση στις συχνότητες 1-40 Hz με μέγιστο στα 20 Hz και για τις συχνότητες μεγαλύτερες από τα 50 Hz παρατηρείται αυξανόμενη καταστολή των συναπτικών απαντήσεων, όπως φαίνεται στην Εικόνα Συζήτηση Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μας δείχνουν ότι οι συνάψεις των παράπλευρων ινών του Schaffer με τα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 περιοχής έχουν πολύ διαφορετικές αποκρίσεις σε δεκάδες ερεθισμάτων με διαφορετική συχνότητα κατά μήκος του 67

75 ραχιαίοκοιλιακου άξονα. Τα κύρια ευρήματα αυτής της μελέτης είναι: i) οι συνάψεις που προέρχονται από τομές του DH παρουσιάζουν διευκόλυνση της συναπτικής διαβίβασης σε μεγάλο εύρος συχνοτικών ερεθισμών (1-50 Hz) με τη μέγιστη διευκόλυνση να παρατηρείται στη συχνότητα των 20 Hz, ενώ σε υψηλότερες συχνότητες ( Hz) παρουσιάζουν αυξανόμενη καταστολή ii) οι συναπτικές απαντήσεις, κατά το τέλος της ακολουθίας των δέκα παλμών όπου σταθεροποιούνται, στις συνάψεις που προέρχονται από τομές του VH παρουσιάζουν καταστολή των συναπτικών απαντήσεων σε όλο το εύρος των συχνοτικών ερεθισμών (1-100 Hz), όμως οι συνάψεις του VH παρουσιάζουν μία παροδική διευκόλυνση στην αρχή της δεκάδας των παλμών στις συχνότητες Hz iii) οι συνάψεις του IH παρουσιάζουν ενδιάμεση συμπεριφορά ως προς τους συχνοτικούς ερεθισμούς οπότε διαφαίνεται ότι η εξειδίκευση του ενδογενούς δικτύου ως προς τη βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα παρουσιάζει βαθμίδωση κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου. Τα αποτελέσματα της παραπάνω μελέτης δείχνουν ότι στις συνάψεις της CA3 περιοχής προς τη CA1, η ροή της πληροφορίας εξαρτάται από τη συχνότητά της και υπόκειται σε φιλτράρισμα ανάλογα με το πόλο του ιπποκάμπου, καθώς οι ιδιότητες των συνάψεων αλλάζουν σταδιακά κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα. Επιπρόσθετα τα αποτελέσματά μας ενισχύουν προηγούμενα δεδομένα που δείχνουν ότι το ενδογενές νευρωνικό δίκτυο διαφοροποιείται στα διαδοχικά τμήματα του ιπποκάμπου κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα. Πιθανές ερμηνείες των αποτελεσμάτων Το φαινόμενο κατά το οποίο προκαλείται μία μετασυναπτική απάντηση έπειτα από ένα προσυναπτικό δυναμικό ενέργειας εξαρτάται από την βασική πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή από την προσυναπτική απόληξη (Dingledine and Somjen 1981). Επίσης η πιθανότητα απελευθέρωσης είναι συνάρτηση της χρονικής δομής των προσυναπτικών δυναμικών ενέργειας (Liaw and Berger 1996; Tsodyks and Markram 1997), οπότε η επαναλαμβανόμενη προσυναπτική δραστηριότητα καθορίζει το πρότυπο της μετασυναπτικής απάντησης. Η συμπεριφορά μίας σύναψης ως προς το αν θα παρουσιάσει διευκόλυνση ή καταστολή, κατά τον επαναλαμβανόμενο ερεθισμό, εξαρτάται από τη βασική πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή, οπότε θεωρητικά τουλάχιστον αναμένεται οι συνάψεις με χαμηλή πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή να παρουσιάζουν διευκόλυνση ενώ συνάψεις με υψηλή πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή να παρουσιάζουν καταστολή (Dobrunz and Stevens 1997; Regehr 2012). 68

76 Προηγούμενες μελέτες (Papatheodoropoulos and Kostopoulos 2000; Maggio and Segal 2009; Papatheodoropoulos 2015; Pofantis, Georgopoulos et al. 2015; Milior, Castro et al. 2016; Moschovos and Papatheodoropoulos 2016) έχουν δείξει ότι οι συνάψεις του DH και του VH έχουν χαμήλη και υψηλή πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή αντίστοιχα (Papatheodoropoulos and Kostopoulos 2000; Papatheodoropoulos 2015). Κατά συνέπεια το διαφορετικό πρότυπο συναπτικών απαντήσεων κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα μπορεί σε κάποιο βαθμό να αποδοθεί στη διαφορά που υφίσταται στην πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή. Όμως η μετασυναπτική απάντηση σε ένα προσυναπτικό επαναλαμβανόμενο ερεθισμό εξαρτάται και από άλλους προσυναπτικούς μηχανισμούς (Liaw and Berger 1996; Dittman, Kreitzer et al. 2000; Kandaswamy, Deng et al. 2010; Deng and Klyachko 2011; Regehr 2012; Rosenbaum, Rubin et al. 2012). Για παράδειγμα έχει δειχθεί ότι η διαβίβαση στις συνάψεις CA3-CA1 κατά τη διάρκεια επαναλαμβανόμενης προσυναπτικής ενεργοποίησης εξαρτάται από δύο αντίρροπες δυνάμεις την πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή και την καταστολή λόγω εξάντλησης των θέσεων απελευθέρωσης του νευροδιαβιβαστή (μοντέλο διευκόλυνσης-καταστολής) (Dittman, Kreitzer et al. 2000). Είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι τα αποτελέσματά μας από τις συναπτικές απαντήσεις έπειτα από επαναλαμβανόμενο ερεθισμό με διαφορετικές συχνότητες στα διαφορετικά τμήματα του ιπποκάμπου, είναι πολύ όμοια με εκείνα που προβλέπονται από το μοντέλο διευκόλυνσηςκαταστολής. Σύμφωνα με το παραπάνω μοντέλο, κατά την ύπαρξη της διευκόλυνσης και της ανάκαμψης από καταστολή, οι συνάψεις της CA1 περιοχής του DH παρουσιάζουν αυξανόμενη πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή και επιταχυνόμενη ανάκαμψη από την καταστολή, σε ερεθίσματα που επιδίδονται με συχνότητα μεταξύ 5 και 20 Hz με τελικό αποτέλεσμα την διευκόλυνση. Επίσης η σταθερή απελευθέρωση νευροδιαβιβαστή είναι μέγιστη στη συχνότητα ερεθισμού των ~12 Hz. Σε σχετικά υψηλές συχνότητες ερεθισμού, δηλαδή πάνω από τα 50 Hz η συναπτική καταστολή επικρατεί εξαιτίας μη επαρκούς ανάκαμψης από την καταστολή. Αντίστοιχα βρήκαμε ότι οι συνάψεις του DH σταθερά παρουσιάζουν διευκόλυνση για τις συχνότητες μέχρι και τα 20 Hz ενώ εμφανίζουν καταστολή σε συχνότητες μεγαλύτερες των 50 Hz. Αντίθετα η συμπεριφορά των συνάψεων του VH μπορεί να περιγραφεί με ακρίβεια από την έλλειψη και των δύο φαινομένων, δηλαδή την διευκόλυνση και την ανάκαμψη από την καταστολή, ενώ οι συναπτικές απαντήσεις από τον IH είναι όμοιες με αυτές που προβλέπονται 69

77 από το μοντέλο διευκόλυνσης-καταστολής, κατά την παρουσία μόνο διευκόλυνσης (Dittman, Kreitzer et al. 2000). Είναι λοιπόν λογικό να υποθέσουμε ότι η σταδιακή μετάβαση από διευκόλυνση στις συνάψεις του DH σε καταστολή στις συνάψεις του VH μπορεί να αποδοθεί στη διαφορετική συμβολή στις συναπτικές απαντήσεις της διευκόλυνσης και της ανάκαμψης από καταστολή κατά μήκος του ραχιαίοκοιλιακού άξονα. Τέλος η έλλειψη σημαντικής αλλαγής των συναπτικών απαντήσεων, στις συνάψεις καθόλο το μήκος του ιπποκάμπου κατά τη επίδοση παλμών σε συχνότητα 0,1 Hz, συνάδει με την έλλειψη της διευκόλυνσης και της ανάκαμψης από καταστολή καθώς σε χαμηλούς ρυθμούς δραστηριότητας η συσσώρευση ασβεστίου στις προσυναπτικές απολήξεις δεν επαρκεί για να κινητοποιήσει τα δύο αυτά φαινόμενα. Επίσης και άλλοι μηχανισμοί μπορούν να συνεισφέρουν στις διαφορές που παρατηρούνται στις συναπτικές ιδιότητες κάτω από ερεθισμούς διαφορετικών συχνοτήτων και κατά τον επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου. Πιο συγκεκριμένα η συναπτική αναστολή μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο σε σχετικά υψηλές συχνότητες ερεθισμού, πάνω από 40 Hz, όπου η καταστολή επικρατεί πάνω στη διευκόλυνση. Αυτό υποστηρίζεται από μία μελέτη όπου δείχνεται ότι κατά την ενεργοποίηση των συνάψεων με συχνότητες Hz παρατηρείται αυξημένη δραστηριότητα συγκεκριμένων ενδονευρώνων της CA1, οι οποίοι ευθύνονται για ισχυρή αναστολή των κορυφαίων δενδριτών των πυραμιδικών κυττάρων (Pouille and Scanziani 2004). Οπότε κάτω από συνθήκες υψίσυχνου ερεθισμού η ισχυρή αναστολή των πυραμιδικών κυττάρων της CA1 μπορεί να επικρατεί της διευκόλυνσης. Η αναστολή των δενδριτών αυξάνεται κατά τους πρώτους 3-4 ερεθισμούς και θεωρητικά εκεί μπορεί να αποδοθεί η αυξανόμενη καταστολή κατά την αύξηση της συχνότητας των ερεθισμών στους VH-IH και στον DH, κατά την επίδοση των συχνοτήτων >40 Hz και Hz αντίστοιχα. Επίσης το γεγονός ότι η καταστολή που εξαρτάται από τη συχνότητα ήταν μεγαλύτερη στον VH σε σχέση με τον DH, μπορεί να υποδεικνύει ότι η δραστηριότητα αυτών των ενδονευρώνων, που ενεργοποιούνται έπειτα από υψίσυχνη ενεργοποίηση, είναι μεγαλύτερη στον VH. Γεγονός το οποίο συμφωνεί με δεδομένα που υποστηρίζουν ότι ο αριθμός των GABAεργικών νευρώνων είναι μεγαλύτερος στην CA1 περιοχή του VH σε σχέση με τον DH (Jinno and Kosaka 2006). 70

78 Πιθανές συνέπειες για την επεξεργασία και ροή της πληροφορίας στον ιππόκαμπο Η βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα που εξαρτάται από τη συχνότητα της δραστηριότητας προσδίδει στις συνάψεις την ιδιότητα φίλτρου, αφού μετατρέπουν ακολουθίες προσυναπτικών δυναμικών ενέργειας σε μετασυναπτικές απαντήσεις με κυμαινόμενο πλάτος ανάλογα με την συχνότητα της προσυναπτικής ακολουθίας (Thomson and Deuchars 1994; Markram and Tsodyks 1996; Abbott, Varela et al. 1997; Tsodyks, Pawelzik et al. 1998; Fuhrmann, Segev et al. 2002; Abbott and Regehr 2004; Klyachko and Stevens 2006). Οι βραχύχρονες αλλαγές της συναπτικής αποτελεσματικότητας φαίνεται πως παίζουν θεμελιώδη ρόλο στην επεξεργασία πληροφορίας από τα νευρικά κύτταρα, επηρεάζοντας έτσι τη δυναμική του νευρωνικού δικτύου (Markram and Tsodyks 1996; Abbott, Varela et al. 1997; Tsodyks and Markram 1997; Zador and Dobrunz 1997; Chance, Nelson et al. 1998; Abbott and Regehr 2004; Kandaswamy, Deng et al. 2010; Deng and Klyachko 2011; Cortes, Desroches et al. 2013; Anwar, Li et al. 2017). Μέχρι σήμερα θεωρείται ότι οι διάφορες βραχυπρόθεσμες αλλαγές της δυναμικής των νευρικών δικτύων αποτελεί ένα μηχανισμό για τη γένεση σχεδόν απεριόριστων προτύπων συναπτικής εισόδου (Markram and Tsodyks 1996), προσδίδοντας στις συνάψεις απεριόριστες υπολογιστικές δυνατότητες (Zador and Dobrunz 1997; Tsodyks, Pawelzik et al. 1998; Abbott and Regehr 2004; Merkel and Lindner 2010; Deng and Klyachko 2011). Πολύ σημαντικό είναι και το γεγονός ότι διάφορες συνάψεις σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφαλικού φλοιού παρουσιάζουν πολύ διαφορετικές μεταξύ τους ιδιότητες των συνάψεων (Dittman, Kreitzer et al. 2000; Zucker and Regehr 2002). Συγκεκριμένα συνάψεις που παρουσιάζουν διευκόλυνση των μετασυναπτικών απαντήσεων και έχουν μικρή πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή, μεταδίδουν πληροφορία που προέρχεται από αυξημένη προσυναπτική δραστηριότητα οπότε και δρουν ως φίλτρα υψηλής συχνότητας (high pass filters), ενώ συνάψεις που παρουσιάζουν καταστολή με υψηλή πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή μεταδίδουν πληροφορία που προέρχεται από χαμηλής συχνότητας προσυναπτική δραστηριότητα οπότε και δρουν ως φίλτρα χαμηλών συχνοτήτων (low-pass filters) και τέλος συνάψεις με ενδιάμεση πιθανότητα απελευθέρωσης συμπεριφέρονται ως φίλτρα συγκεκριμένου εύρους συχνοτήτων (band-pass filters) (Abbott and Regehr 2004). Αν αναλογιστούμε τις διαφορετικές ιδιότητες ως προς τη βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα που παρατηρούνται κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου, μπορούμε να θεωρήσουμε ότι η δυναμική των συνάψεων του ιπποκάμπειου δικτύου καλύπτει ένα ευρύ φάσμα 71

79 ιδιοτήτων φίλτρων συχνοτήτων, το οποίο είναι ανισομερώς κατανεμημένο κατά μήκος του άξονα. Πειραματικά και θεωρητικά δεδομένα δείχνουν ότι οι συνάψεις που παρουσιάζουν διευκόλυνση μπορούν να κωδικοποιήσουν πιο αξιόπιστα χρονικές πληροφορίες που εμπεριέχονται σε μακρές ακολουθίες προσυναπτικών δυναμικών ενέργειας (Fuhrmann, Segev et al. 2002; Abbott and Regehr 2004). Αντίθετα οι συνάψεις που παρουσιάζουν καταστολή είναι πιο κατάλληλες για την μετάδοση σημαντικών πληροφοριών που διαρκούν μέχρι τέσσερα δυναμικά ενέργειας από την εκκίνηση της προσυναπτικής δραστηριότητας (Abbott and Regehr 2004). Βρήκαμε ότι οι συνάψεις του DH σταθερά διευκολύνουν τις μετασυναπτικές απαντήσεις σε όλες τις συχνότητες 50 Hz, ενώ οι συνάψεις του VH, που γενικά δείχνουν επικράτηση της καταστολής, μόνο παροδικά διευκολύνουν στην αρχή της ακολουθίας των ερεθισμών, δηλαδή τις δύο πρώτες μετασυναπτικές απαντήσεις, που επιδίδονται σε συχνότητες μεταξύ Hz. Για τους παραπάνω λόγους οι συνάψεις του DH φαίνονται να μπορούν να επεξεργαστούν συνεχή εισροή πληροφοριών, ενώ οι συνάψεις του VH φαίνονται να είναι προσαρμοσμένες στην επεξεργασία πληροφορίας όταν υπάρχει ακόμα και μικρή αλλά απότομη αλλαγή στην προσυναπτική δραστηριότητα. Ακόμα οι συνάψεις του IΗ φαίνονται να έχουν την ικανότητα να ενεργούν σε ένα ενδιάμεσο εύρος επεξεργασίας πληροφορίας. Μία από τις πιο ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις στην παρούσα μελέτη ήταν ότι οι συναπτικές απαντήσεις, που σταθεροποιούνται στο τέλος της ακολουθίας ερεθισμών, παρουσιάζουν διευκόλυνση στον DH και στον IH σε ερεθισμούς συχνότητας 3-40 Hz με μέγιστη διευκόλυνση στα 20 Hz. Ο ιππόκαμπος εμφανίζει αρκετές ταλαντώσεις του νευρικού του κυκλώματος, που σχετίζονται με τη συμπεριφορά, σε συγκεκριμένα εύρη συχνοτήτων όπως είναι ο θήτα ρυθμός (4-10 Hz), ο βήτα ρυθμός (10-30 Hz) και ο γάμμα ρυθμός ( Hz) (Lopes da Silva, Witter et al. 1990; Buzsaki and Draguhn 2004; O'Keefe 2007; Colgin 2016). Οπότε η συναπτική διευκόλυνση στην παρούσα μελέτη έλαβε χώρα σε εύρος συχνοτήτων που εκτείνεται από τον θήτα ρυθμό και παρουσιάζει μέγιστο στο βήτα ρυθμό. Το γεγονός ότι οι συνάψεις μεταξύ CA3-CA1 παρουσιάζουν διευκόλυνση στις συχνότητες Hz μπορεί να υποδηλώνει ότι η μετάδοση της δραστηριότητας κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα, αλλά και σε ένα μεγάλο μέρος του επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου, μπορεί να ευνοείται όταν η δραστηριότητα του δικτύου βρίσκεται στο εύρος συχνοτήτων του βήτα ρυθμού. Επιπλέον επειδή 72

80 η CA1 περιοχή αποτελεί την έξοδο του ιπποκάμπου προς τις παραϊπποκάμπειες περιοχές, το εύρος συχνοτήτων του βήτα ρυθμού μπορεί να χρησιμεύει για τη βέλτιστη εξάπλωση της νευρωνικής δραστηριότητας από τον ιππόκαμπο προς άλλες εγκεφαλικές περιοχές. Πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι η έξοδος πληροφορίας από τον ιππόκαμπο μεταδίδεται από την περιοχή CA1 προς συγκεκριμένες περιοχές του νεοφλοιού και κάτω από το φλοιό, κυρίως σε συχνότητες Hz με μέγιστη μετάδοση στα 20 Hz. Είναι ενδιαφέρον και το γεγονός ότι η απότομη μείωση της διευκόλυνσης σε συχνότητες ερεθισμού >40 Hz που παρατηρήσαμε, ομοιάζει με την απότομη μείωση της διάδοσης της δραστηριότητας εκτός του ιπποκάμπου στα 40 Hz (Moreno, Morris et al. 2016). Επιπρόσθετα σημαντική διευκόλυνση παρατηρήθηκε και στη συχνότητα ερεθισμών των 5 Hz υποδεικνύοντας ότι η δραστηριότητα στο εύρος του θήτα ρυθμού συνεισφέρει σημαντικά στη μετάδοση της πληροφορίας στον εγκάρσιο άξονα του ιπποκάμπου αλλά και στον επιμήκη έως το τμήμα του IH. Όντως η ταλάντωση σε θήτα ρυθμό χρησιμοποιείται για την μετάδοση της δραστηριότητας κατά μήκος του επιμήκη άξονα (Gloveli, Dugladze et al. 2005) και από τον DH προς τον VH (Lubenov and Siapas 2009). Επίσης η συχνότητα εμφάνισης του θήτα ρυθμού είναι υψηλότερη στον DH σε σχέση με τον VH (Royer, Sirota et al. 2010; Hinman, Penley et al. 2011). Τέλος επειδή αποτελεσματικό φιλτράρισμα της ροής πληροφορίας φαίνεται πως συμβαίνει στον DH και στον IH αλλά όχι στον VH, η έξοδος πληροφορίας από τον ιππόκαμπο μπορεί να κατευθύνεται επιλεκτικά από τον DH και τον IH προς άλλες εγκεφαλικές περιοχές, κυρίως σε εύρος συχνοτήτων βήτα ρυθμού. Συνέπειες της διευκόλυνσης των ραχιαίων συνάψεων του ιπποκάμπου Ένα από τα χαρακτηριστικά του χρονικού φιλτραρίσματος είναι η ανίχνευση των δυναμικών ενέργειας που δημιουργούνται και μεταδίδονται σε ακολουθίες (Abbott and Regehr 2004). Οι συνάψεις που ενεργοποιούνται με αλληλουχία προσυναπτικών δυναμικών και έχουν μικρή πιθανότητα οι διαδοχικές αποκρίσεις τους να παρουσιάσουν διευκόλυνση, έχουν την ικανότητα να ανιχνεύουν και να αποκρίνονται αποτελεσματικά σε μικρές ριπές προσυναπτικών δυναμικών ενέργειας (Lisman 1997), τα οποία αποτελούν και το κύριο τρόπο νευρωνικής δραστηριότητας στα πυραμιδικά κύτταρα του ιππόκαμπου (Ranck 1973). Με μείωση του αριθμού των ενεργών εισόδων που είναι απαραίτητες για την πυροδότηση ενός δυναμικού ενέργειας σε ένα πυραμιδικό κύτταρο, η προσυναπτική ενεργοποίηση με ριπές δυναμικών ενέργειας μπορούν αξιόπιστα να επάγουν την πυροδότηση δυναμικών ενεργείας στο μετασυναπτικό κύτταρο, και με αυτό τον τρόπο μπορούν να παίξουν πολύ σημαντικό ρόλο στην 73

81 επαγωγή την μακρόχρονης συναπτικής πλαστικότητας (Lisman 1997). Για παράδειγμα ριπές προσυναπτικών ερεθισμών με πρότυπο θήτα ρυθμού (δηλαδή 5 Hz) μειώνουν το κατώφλιο ερεθισμών που είναι απαραίτητο για την επαγωγή μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης (Long Term Potentiation-LTP) (Larson and Lynch 1986; Rose and Dunwiddie 1986). Όταν οι προσυναπτικές ίνες ερεθίζονται με ηλεκτρικούς παλμούς στο πρότυπο του θήτα ρυθμού στον DH, αλλά όχι στον VH, παρατηρείται ότι οι συνάψεις συμπεριφέρονται με διευκόλυνση των μετασυναπτικών απαντήσεων και αύξηση στη παραγωγή δυναμικών ενέργειας (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016) και αυτού του τύπου η δραστηριότητα των προσυναπτικών κυττάρων μπορεί να επάγει LTP πολύ αποτελεσματικά στις συνάψεις του DH (Babiec, Jami et al. 2017). Η αυξημένη συναπτική διευκόλυνση και η πυροδότηση μετασυναπτικών δυναμικών ενέργειας λόγω της προσυναπτικής ενεργοποίησης με ριπές δυναμικών ενέργειας φαίνεται πως αποτελεί σημαντικό μέρος του μηχανισμού μέσω του οποίου οι συνάψεις του DH επιδεικνύουν χαμηλότερο κατώφλιο για την επαγωγή LTP, σε σχέση με τις συνάψεις του VH (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Κατά συνέπεια η συναπτική διευκόλυνση που οφείλεται σε προσυναπτική ενεργοποίηση με ριπές ερεθισμών, πέρα του ότι σημαντικά βοηθά την επαγωγή LTP, μπορεί να παρέχει στον DH αυξημένη ικανότητα σχηματισμού μνημονικών ιχνών των εμπειριών που έχει βιώσει ο οργανισμός. Συνέπειες της καταστολής των κοιλιακών συνάψεων του ιπποκάμπου Οι συνάψεις που έχουν την ικανότητα χρονικής ρύθμισης της διαβίβασής τους είναι ζωτικής σημασίας για την γένεση αυθόρμητης συγχρονισμένης νευρικής δραστηριότητας σε φλοιϊκές δομές (Tsodyks, Uziel et al. 2000). Πολύ σημαντικό είναι το γεγονός ότι οι συνάψεις που παρουσιάζουν καταστολή των μετασυναπτικών απαντήσεων τους, όπως αυτές του VH, αυξάνουν σημαντικά την ευαισθησία τους στις μικρές αλλαγές που μπορούν να συμβούν κατά τις εισόδους προσυναπτικής ενεργοποίησης (Abbott, Varela et al. 1997; Abbott and Regehr 2004). Το παραπάνω φαινόμενο μπορεί να είναι ιδιαίτερα σχετικό για την γένεση της δικτυακής δραστηριότητας των οξύαιχμων κυμμάτων-ριπιδισμών (sharp wave-ripples-swrs), που αποτελεί μία ενδογενή δραστηριότητα του ιπποκάμπου που παίζει σημαντικό ρόλο στην παγίωση της μνήμης (Buzsaki 2015). Η γένεση των SWRs απαιτεί μικρές αλλαγές στη διεγερσιμότητα του τοπικού νευρικού δικτύου (Mizunuma, Norimoto et al. 2014) και θεωρείται ότι ξεκινούν από τη δραστηριότητα των πιο διεγέρσιμων κυττάρων του ιπποκάμπου (Buzsaki 2015), η οποία εκκινεί από μικρές αλλαγές στις εισόδους από τα προσυναπτικά κύτταρα (Gunn, 74

82 Cox et al. 2017). Κατά συνέπεια το τοπικό νευρωνικό δίκτυο του VH, λόγω της αυξημένης ευαισθησίας των κατασταλτικών συνάψεων του, μπορεί να είναι το σημείο που ευνοεί την εκκίνηση των SWRs. Επίσης έχει παρατηρηθεί ότι τα SWRs σε in vitro μελέτες είναι πιο πιθανό να δημιουργηθούν στον VH και όχι τόσο πιθανό στον DH (Wu, Shen et al. 2002; Kouvaros and Papatheodoropoulos 2017). Τέλος οι συνάψεις που παρουσιάζουν καταστολή των μετασυναπτικών απαντήσεων στον VH μπορεί να παίζουν προστατευτικό ρόλο έναντι της υπερδιεγερσιμότητας. O VH είναι το τμήμα του ιπποκάμπου με τη μεγαλύτερη διεγερσιμότητα όπως φαίνεται και από το γεγονός ότι είναι πιο επιρρεπής σε επιληπτική δραστηριότητα (Papatheodoropoulos 2018). Επειδή η αυξημένη διεγερσιμότητα αποτελεί βασική ιδιότητα του VH που είναι απαραίτητη για την επιτέλεση φυσιολογικών λειτουργιών, πρέπει να υπάρχει κάποιος ενδογενής μηχανισμός που να εξισορροπεί την τάση του VH για υπερδιεγερσιμότητα. Πειραματικά και θεωρητικά δεδομένα δείχνουν ότι η συναπτική καταστολή οδηγεί σε άμεσο κορεσμό της μετασυναπτικής απάντησης και οι μετέπειτα πυροδοτήσεις των συνάψεων είναι μειωμένες σε περίπτωση ισχυρού ερεθισμού (Chance, Nelson et al. 1998; Kandaswamy, Deng et al. 2010), ώστε να αποτρέπεται η απότομη συναπτική ενίσχυση (Kandaswamy, Deng et al. 2010; Deng and Klyachko 2011) που θα μπορούσε διαφορετικά να οδηγήσει το νευρωνικό δίκτυο σε κατάσταση υπερδιεγερσιμότητας. Οπότε οι συνάψεις του VH που συμπεριφέρονται με καταστολή στις ακολουθίες μετασυναπτικών απαντήσεων μπορεί να συνεισφέρουν σημαντικά, μαζί με άλλους μηχανισμούς, ώστε να εξισορροπούν την ενδογενή τάση αυτού του τμήματος του ιπποκάμπου προς υπερδιέγερση και επιληπτική δραστηριότητα Συμπεράσματα Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούμε να συμπεράνουμε ότι i) η δυναμική της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας παρουσιάζει διαφορές κατά μήκος του επιμήκους άξονα του ιπποκάμπου, γεγονός το οποίο αποκαλύπτει μία ακόμα παράμετρο ως προς την επεξεργασία της πληροφορίας και επεκτείνει την θεωρία της διαφοροποίησης του ενδογενούς δικτύου του ιπποκάμπου ii) η εξειδίκευση της δυναμικής της συναπτικής πλαστικότητας είναι σταδιακή κατά μήκος του επιμήκους άξονα του ιπποκάμπου, επιτρέποντας την πραγματοποίηση μίας μεγάλης ποικιλίας συναπτικών υπολογισμών στο νευρικό δίκτυο του ιπποκάμπου iii) τα συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας μπορεί να 75

83 εμπλέκονται σημαντικά στη διαφοροποίηση των λειτουργιών κατά μήκος του ιπποκάμπου. Πιο συγκεκριμένα θεωρούμε ότι η σταδιακή αλλαγή των συναπτικών ιδιοτήτων κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του ιπποκάμπου, του παρέχουν διάφορες ικανότητες, όπως η αυξημένη δυνατότητα του DH να υπόκειται σε μακρόχρονες συναπτικές τροποποιήσεις και η αυξημένη ικανότητα του VH να εκκινήσει συγχρονισμένη αυθόρμητη δραστηριότητα. Τελικά προτείνουμε ότι η ροή πληροφορίας στην νευρική οδό CA3-CA1 και πιθανότατα προς εξωιπποκάμπειες δομές ευνοείται, όταν η νευρική δραστηριότητα εκτείνεται σε συχνότητες από το θήτα έως τον βήτα ρυθμό. 3.2 LTP και β-αδρενεργικοί υποδοχείς Η βασική συναπτική διαβίβαση είναι παρόμοια μεταξύ ραχιαίου (DH) και κοιλιακού (VH) πόλου του ιπποκάμπου, γεγονός το οποίο έχει αποδειχθεί από το εργαστήριο μας σε παρελθοντικές μελέτες, αλλά και από άλλες ερευνητικές ομάδες (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016; Milior, Castro et al. 2016). Πιο συγκεκριμένα το ημιμέγιστο και το μέγιστο fepsp στον DH ήταν 1.67±0.06 και 3.58±0.13 mv/ms αντίστοιχα (n=168/79) και στον VH ήταν 1.53±0.06 και 3.20±0.12 mv/ms αντίστοιχα (n=137/79), (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ του DH και του VH, P>0.05) Η ενεργοποίηση των β-ar μειώνει το κατώφλιο επαγωγής LTP στον VH Η επαγωγή της μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης (long term potentiation-ltp) μέσω πρωτοκόλλου που βασίζεται στο θήτα ρυθμό (theta burst stimulation-tbs) παρουσιάζει διαφορετικό κατώφλιο επαγωγής μεταξύ του DH και του VH. Πιο συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι το κατώφλιο αξιόπιστης επαγωγής LTP στον DH είναι το πρωτόκολλο 2bursts, το οποίο αποτελείται από δύο τετράδες παλμών με συχνότητα 100Hz και επίδοση των δύο τετράδων σε διάστημα 200 ms (δηλαδή συχνότητα 5Hz). Στον VH έχει βρεθεί ότι το πρωτόκολλο που μπορεί να επάγει αξιόπιστα LTP είναι τα 5 bursts, δηλαδή επίδοση 5 τετράδων παλμών με τα διαπλαμικό διάστημα 200ms (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Για να μπορέσουμε να εξετάσουμε το αποτέλεσμα της ενεργοποίσησης των β- αδρενεργικών υποδοχέων (β adrenergic receptors-β-ar) κατά την επαγωγή του LTP, χρησιμοποιήσαμε το πρωτόκολλο των 2bursts στους DH και VH. Αρχικά έγινε επαγωγή LTP σε συνθήκες ελέγχου, δηλαδή παρουσία μόνο τεχνητού εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΤΕΝΥ). Με το 76

84 πρωτόκολλο των 2bursts είχαμε σταθερή επαγωγή LTP στον DH (13.4±2.8%, n=14/7, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.005) αλλά όχι στον VH(-1.7±2.0%, n=6/4), όπως ήταν αναμενόμενο (Εικόνα 22, 2-Bursts). Όμως όταν υπήρχε ενεργοποίηση των β-ar, μέσω προσθήκης στο ΤΕΝΥ του αγωνιστή ισοπροτερενόλη (ISO) σε συγκέντρωση 1μΜ, με το πρωτόκολλο των 2bursts παρατηρήθηκε σταθερή επαγωγή LTP στον VH (12.3±3.8%, n=12/6, Wilcoxon test και paired t- test, P<0.01; Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ καταστάσεων ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (ISO), P<0.05; Εικόνα 22A, γράφημα στα δεξιά) γεγονός το οποίο συμφωνεί με παρατηρήσεις άλλων ερευνητικών ομάδων (Katsuki, Izumi et al. 1997). 77

85 Εικόνα 22: Η τροποποίηση της επαγωγής LTP λόγω της ενεργοποίησης των β-ar από τρεις τύπους πρωτοκόλλων που βασίζονται στον θήτα ρυθμό (TBS): 2bursts (A), 5bursts (B) και 30bursts (C) στον DH (γραφήματα στα αριστερά της εικόνας) και στον VH (γραφήματα στα δεξιά της εικόνας). Το πρωτόκολλο επαγωγής LTP επιδόθηκε στο χρόνο που δείχνεται από το βέλος. Οι φαρμακολογικοί παράγοντες προστέθηκαν στο ΤΕΝΥ που διαποτίζει τις τομές για 25 λεπτά, όπως φαίνεται από την γκρι οριζόντια γραμμή και σταματούσε 5 λεπτά μετά την επίδοση του ερεθισμού. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των fepsp δίδονται στην κορυφή του κάθε διαγράμματος, τα οποία ελήφθησαν 5 λεπτά πριν (γκρι) και 60 ή 120 λεπτά μετά την επίδοση του ερεθισμού (μαύρο). Γραμμές κλίμακας 1mV και 2ms σε όλα τα διαγράμματα. Η ενεργοποίηση των β-ar από την ISO (ISO 1μΜ) κατά την επίδοση των 2bursts ή των 5bursts διευκολύνει την επαγωγή LTP στον VH, χωρίς να έχει κάποιο αποτέλεσμα στον DH. Ο ανταγωνιστής των β-ar προπρανολόλη (PRO, 10 μμ) αποτρέπει τη σταθεροποίηση της LTP όταν επάγεται από το πρωτόκολλο των 5bursts και μειώνει το πλάτος της επαγώμενης LTP από το πρωτόκολλο των 30bursts μόνο στον VH. Επίσης η ISO αυξάνει το πλάτος της επαγώμενης LTP στον DH και στον VH όταν επιδίδονται 30bursts. Παρατηρούμε ότι το πλάτος του επαγώμενου LTP στον VH με το πρωτόκολλο των 2bursts παρουσία της ISO είναι παρόμοιο με το πλάτος του επαγώμενου LTP στον DH σε κατάσταση ελέγχου (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ των περιγραφέντων πειραματικών καταστάσεων, P>0.05). Για να εκτιμήσουμε τον ρόλο που παίζει η ενεργοποίηση των β-ar από την ενδογενή νοραδρεναλίνη, κατά την επαγωγή LTP στον DH, διαποτίσαμε τομές από DH με ΤΕΝΥ που περιείχε τον ανταγωνιστή των β-ar προπρανολόλη (PRO) σε συγκέντρωση 10μΜ. Παρατηρήσαμε ότι το πλάτος του LTP που επάγεται από τα 2bursts παραμένει σχετικά αμετάβλητο (8.0±1.4%, n=8/4) σε σχέση με την κατάσταση ελέγχου (Mann- Whitney U test και paired t-test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (PRO), P>0.1) Η ενδογενής ενεργοποίηση των β-ar συνεισφέρει στην σταθεροποίηση της LTP μόνο στον VH Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως το πρωτόκολλο των 5bursts είναι μόλις επαρκές για την επαγωγή και σταθεροποίηση του LTP στον VH, ενώ για τον DH είναι παραπάνω από επαρκές (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Το επόμενο ερώτημα που τέθηκε είναι αν οι β-ar, πέρα από την ρύθμιση του κατώφλιου επαγωγής LTP στον VH, εμπλέκονται και στην σταθεροποίηση του LTP. Αρχικά βρήκαμε ότι τα 5bursts μπορούν να επάγουν LTP στον DH (30.9±4.3% και 28.1±4.3% στα 60 και στα 120 λεπτά μετά την επίδοση των παλμών, n=8/5, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.05) μεγαλύτερου πλάτους σε σχέση με τον VH (13.3±3.6% και 15.3±5.5% στα 60 και στα 120 λεπτά μετά την επίδοση των παλμών, n=9/6, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.01 στα 60 λεπτά και P<0.05 στα 120 λεπτά) (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ των DH και VH στα 60 λεπτά και 120 λεπτά, P<0.05) όπως φαίνεται στην Εικόνα 22Β. 78

86 Στη συνέχεια διερωτηθήκαμε αν η ενδογενής νοραδρεναλίνη, που βρίσκεται στον εξωκυττάριο χώρο, καθώς και αυτή που εκκρίνεται, μπορεί να συνεισφέρει στην σταθεροποίηση και διατήρηση της LTP. Με δεδομένο ότι η επαγωγή της LTP μέσω του πρωτοκόλλου των 5bursts διήρκησε για τουλάχιστον 2 ώρες, εφαρμόσαμε τον ανταγωνιστή των β-ar προπρανολόλη για 25 λεπτά πριν και κατά την επίδοση του πρωτοκόλλου. Παρατηρήσαμε ότι η απενεργοποίηση των β-ar απέτρεψε την σταθεροποίηση της LTP μόνο στο VH, καθώς το μέγεθος του fepsp 120 λεπτά μετά την επίδοση των 5bursts επέστρεψε στα αρχικά του επίπεδα όπως φαίνεται στην Εικόνα 22Β (4.7±1.5% στα 60 λεπτά και -1.7±4.3% στα 120 λεπτά (n=7/3, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.05 στα 60 λεπτά και P>0.05 στα 120 λεπτά; Mann-Whitney U test και independent t- μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (PRO) P<0.05 στα 60 και 120 λεπτά). Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση των β-ar από την ενδογενή νοραδρεναλίνη που εκκρίνεται ή υπάρχει στο μεσοκυττάριο χώρο κατά την επίδοση των 5bursts συνεισφέρει σημαντικά στη σταθεροποίηση της LTP στον VH. Ο DH, σε αντίθεση με τον VH, παρουσία του ανταγωνιστή των β-ar δεν παρουσίασε καμία διαφορά ως προς την επαγωγή της LTP, ούτε ως προς τη διατήρηση της. Πιο συγκεκριμένα η αύξηση του fepsp μετά την επίδοση των 5bursts στις τομές από ραχιαίο ιππόκαμπο ήταν 22.5±5.6% στα 60 λεπτά και 20.5±5.5% στα 120 λεπτά (Wilcoxon test και paired t-test, P<0.01 στα 60 λεπτά και P<0.05 στα 120 λεπτά; Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (PRO) σε όλα τα χρονικά σημεία αναφοράς P>0.05)Εικόνα 22Β. Επιπρόσθετα η ενεργοποίηση των β-ar, από την παρουσία ISO κατά την επίδοση των 5bursts, δεν ενίσχυσε την επαγωγή LTP στον DH (21.0±2.3% και 24.5±3.2% στα 60 λεπτά και 120 λεπτά μετά την επίδοση των παλμών, n=5/3, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.05) και το πλάτος της LTP ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε κατά την κατάσταση ελέγχου (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (ISO) στα 60 λεπτά και 120 λεπτά, P>0.05) Εικόνα 22Β. Το παραπάνω αποτέλεσμα παρατηρήθηκε και σε άλλη ερευνητική εργασία (Katsuki, Izumi et al. 1997). Αντίστοιχα στον VH δεν είχαμε κάποια στατιστικά σημαντική ενίσχυση της επαγόμενης LTP από το πρωτόκολλο των 5bursts ούτε στα 60 λεπτά (αλλαγή του fepsp από 13.3±3.6% σε 79

87 20.5±5.0%) ούτε στα 120 λεπτά (αλλαγή του fepsp από 15.3±5.5% σε 18.7±4.6%). Όμως παρατηρήσαμε μία σημαντική αύξηση της μετατετανικής ενίσχυσης στα 20 λεπτά (αλλαγή του fepsp από 9.2±4.0% σε 24.6±5.0% (n=12/6, Mann-Whitney U test και independent t-test, P<0.05), πιθανότατα λόγω της αύξηση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας που προκαλεί η ενεργοποίηση των β-ar Το πλάτος της επαγόμενης LTP από ισχυρό πρωτόκολλο TBS αυξάνεται από την ενεργοποίηση των β-ar στον VH και στον DH, όμως κατά τον αποκλεισμό των β-ar το πλάτος μειώνεται μόνο στον VH. Τα προηγούμενα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η επαγωγή LTP με πρωτόκολλο που βασίζεται στο θήτα ρυθμό ελάχιστης ή ενδιάμεσης ισχύος, από θέμα αριθμού παλμών, διευκολύνεται, όταν ενεργοποιούνται οι β-ar μόνο στο VH και όχι στο DH. Έχοντας αυτό ως δεδομένο, η επόμενη ερώτηση ήταν αν συμβαίνει παρόμοια αλλαγή κατά την επαγωγή LTP όταν αυτή προκληθεί από ένα ισχυρό πρωτόκολλο με μεγάλο αριθμό παλμών, πιο συγκεκριμένα από το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ (Ten Burst Train) το οποίο αποτελείται από τρία τρένα με δέκα τετράδες όπου η κάθε ακολουθία παλμών επιδίδεται ανά 30 δευτερόλεπτα. Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο έχει δειχθεί ότι επάγει LTP εξίσου στον DH και στον VH (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Οπότε εφαρμόσαμε το παραπάνω πρωτόκολλο σε συνθήκες ελέγχου και τα αποτελέσματα ως προς την επαγωγή LTP ήταν όντως παρόμοια μεταξύ DH (43.0 ±6.5%, n=11/6, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.005) και VH (32.0±2.8%, n=10/7, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.01; Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ του DH και του VH, P>0.1) (Εικόνα 22C). Το παραπάνω πρωτόκολλο εφαρμόστηκε και σε συνθήκες ενεργοποίησης των β-ar μέσω της προσθήκης του αγωνιστή τους ISO. Το μέγεθος του επαγόμενου LTP στον DH (68.2±4.4%, n=14/6, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.01) ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερο από αυτό που επάγεται στον VH (51.8±5.6%, n=8/4, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.005) (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ του DH και του VH, P<0.05) Εικόνα 22C. Κατά τον αποκλεισμό των β-ar μέσω της PRO και την επίδοση των 3TBT το μέγεθος του LTP ήταν σημαντικά μειωμένο στον VH (19.1±3.0%, n=7/4, Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα 80

88 (PRO), P<0.05), σε αντίθεση με τον DH ο οποίος δεν παρουσίασε κάποια σημαντική μείωση (32.4±3.5%, n=13/7, Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (PRO), P>0.1). Κατά συνέπεια η επαγωγή LTP ήταν υψηλότερη στον DH σε σχέση με τον VH σε συνθήκες αποκλεισμού των β-ar (Mann-Whitney U test μεταξύ DH και VH, P<0.05) Εικόνα 22C Η ενεργοποίηση των β-ar διευκολύνει την επαγωγή LTP που εξαρτάται από VDCC μόνο στον VH. Το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ, σε αντίθεση με αυτά των 2bursts και 5bursts, είναι αρκετά ισχυρό ώστε να επάγει LTP ανεξάρτητο του υποδοχέα NMDA, μέσω της ενεργοποίησης των τασεοελεγχόμενων διαύλων ασβεστίου τύπου L (L-type voltage-dependent calcium channel- VDCC) μόνο στον DH και όχι στον VH (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Επίσης η ενεργοποίηση των β-ar μπορεί να αυξήσει την LTP που εξαρτάται από VDCC (Gray and Johnston 1987; Qian, Patriarchi et al. 2017). Σκεπτόμενοι τα παραπάνω γεγονότα αναρωτηθήκαμε αν η ενεργοποίηση των β-ar μπορεί να διευκολύνει την LTP που εξαρτάται από VDCC με διαφορετικό τρόπο στους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Α Β Εικόνα 23: Η ενεργοποίηση των β-ar διευκολύνει την επαγωγή LTP που εξαρτάται από τα VDCC στον VH αλλά όχι στον DH. Οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν στο fepsp έπειτα από την επίδοση του πρωτοκόλλου 3TBT υπό την επίδραση διάφορων φαρμακολογικών παραγόντων φαίνονται στην παραπάνω εικόνα για τον DH (A) και τον VH (B). Τα δεδομένα των καταστάσεων ελέγχου είναι ίδια με την Εικόνα 22 για να είναι εφικτή η σύγκριση των διαφόρων καταστάσεων. Αντιπροσωπευτικές καταγραφές δίνονται στο πάνω μέρος των διαγραμμάτων χρονοεξέλιξης και καταγράφηκαν 5 λεπτά πριν (γκρι) και 60 λεπτά (μαύρο) έπειτα από την επίδοση του 81

89 πρωτοκόλου 3ΤΒΤ. Οι φαρμακολογικοί παράγοντες διαπότισαν τις τομές είτε για 25 λεπτά (CPP, ISO) είτε για 30 λεπτά (nimodipine, NIMO), όπως υποδεικνύει η γκρι γραμμή. Κατά τον αποκλεισμό των υποδοχέων NMDA από το CPP 10μΜ είχαμε επαγωγή LTP στον DH αλλά όχι στον VH. Όμως έπειτα από την ενεργοποίηση των β-ar (ISO 1μΜ) και παρουσία του CPP παρατηρήσαμε επαγωγή LTP στον VH, χωρίς να παρατηρείται αύξηση της επαγόμενης LTP στον DH. Η επαγόμενη LTP που είναι ανεξάρτητη των υποδοχέων NMDA, εξαλείφθηκε σε συνθήκες αποκλεισμού των L-type VDCC από τον παράγοντα νιμοδιπίνη. Αρχικά επιβεβαιώσαμε ότι η εφαρμογή του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ υπό τον αποκλεισμό των υποδοχέων NMDA, από τον φαρμακολογικό παράγοντα CPP (10μΜ), μπορούσε να επάγει σημαντική ενίσχυση του fepsp στον DH (17.1±4.1%, n=10/3, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.001, Εικόνα 23Α) αλλά όχι στον VH (1.7±3.2%, n=10/5, Wilcoxon test και paired t-test, P>0.5, Fig. 3B), (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ των DH και VH, P<0.005). Στη συνέχεια εφαρμόσαμε το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ σε συνθήκες ενεργοποίησης των β-ar και αποκλεισμού των υποδοχέων NMDA, δηλαδή παρουσία των φαρμακολογικών παραγόντων ISO και CPP αντίστοιχα. Παρατηρήσαμε ότι παρουσία ISO δεν είχαμε κάποια σημαντική αύξηση της επαγόμενης LTP που εξαρτάται από VDCC στον DH (19.9±6.1%, n=7/2, Mann- Whitney U test και paired t-test μεταξύ των CPP και CPP με ISO καταστάσεων, P>0.1, Εικόνα 23Α). Σε αντίθεση με τον DH, στον VH παρατηρήθηκε επαγωγή LTP παρουσία ISO και CPP (16.6±4.3%, n=5/2, Wilcoxon test, P<0.05, Εικόνα 23Β), όμοια με την επαγωγή που παρατηρείται στον DH (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ των DH και VH, P>0.05). Για να επιβεβαιώσουμε ότι η επαγόμενη LTP στον VH εξαρτάται από τους VDCC, εφαρμόσαμε το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ παρουσία ISO, CPP και νιμοδιπίνης (20 μm) που αποτελεί ανταγωνιστή των VDCC. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 23Β, κάτω από αυτές τις συνθήκες δεν επάγεται LTP (2.7±2.7%, n=8/2, Wilcoxon test και paired t-test, P>0.05). Κατά συνέπεια η ενεργοποίηση των β-ar είναι απαραίτητη προϋπόθεση ώστε να επαχθεί LTP που εξαρτάται από τους VDCC όταν είναι αποκλεισμένοι οι υποδοχείς NMDA, μόνο στο VH και όχι στον DH Οι β-ar ελέγχουν την τονική συναπτική διαβίβαση περισσότερο στον DH σε σχέση με τον VH Παρατηρήσαμε ότι η ενεργοποίηση των β-ar, με την προσθήκη ISO, αυξάνει σημαντικά τα βασικά επίπεδα συναπτικής διαβίβασης στον DH (κατά 10.5±1.4%, n=34/16, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.001), γεγονός που συμφωνεί και με άλλες μελέτες (Gereau and Conn 1994; Ji, Cao et al. 2008). Η προσθήκη ISO επίσης αύξησε το fepsp και στον VH (κατά 3.3±1.0%, 82

90 n=38/17, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.05), αλλά σε μικρότερο ποσοστό σε σχέση με τον DH (independent t-test και Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ DH και VH, P<0.005). Ο αποκλεισμός των β-ar από την PRO δεν είχε σημαντικό αποτέλεσμα στο fepsp του DH (2.9±0.9%, n=34/15, Wilcoxon test και paired t-test, P>0.05) ούτε του VH (1.2±1.4%, n=14/7, Wilcoxon test και paired t-test, P>0.1) Η ενεργοποίηση των β-ar αυξάνει σημαντικά τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα κατά την επίδοση του TBΤ πρωτοκόλλου στον VH αλλά όχι στον DH Οι ερεθισμοί που έχουν πρότυπο θήτα ρυθμού, δηλαδή συχνότητα 5-10 Hz επάγουν αύξηση της συναπτικής εκπόλωσης μέσω μηχανισμού που οφείλεται στους προσυναπτικούς υποδοχείς GABA B, οι οποίοι μειώνουν τη μετασυναπτική αναστολή (Davies, Davies et al. 1990; Mott and Lewis 1991) και τελικά οδηγούν σε αύξηση των συναπτικών απαντήσεων και της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας (Nathan and Lambert 1991; Davies and Collingridge 1996; Thomas, Watabe et al. 1998; Winder, Martin et al. 1999; Papatheodoropoulos 2015; Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016; Babiec, Jami et al. 2017; Liu, Cui et al. 2017), οπότε και διευκολύνεται η ενεργοποίηση του υποδοχέα NMDA και η επαγωγή της LTP (Davies, Starkey et al. 1991; Larson and Munkácsy 2015; Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016; Babiec, Jami et al. 2017; Liu, Cui et al. 2017). Πρόσφατα δεδομένα μάλιστα υποδεικνύουν ότι ο παραπάνω μηχανισμός εμπλέκεται σημαντικά στο φαινόμενο κατά το οποίο ο VH έχει υψηλότερο κατώφλιο επαγωγής LTP σε σχέση με τον DH, καθώς οι ερεθισμοί με πρότυπο θήτα ρυθμού αποτυγχάνουν να αυξήσουν επαρκώς τις συναπτικές απαντήσεις και τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα στον VH (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016; Babiec, Jami et al. 2017). Οι β-ar αυξάνουν την μετασυναπτική διεγερσιμότητα, ιδιαίτερα μετά από ερεθισμό με πρότυπο θήτα ρυθμού (Thomas, Moody et al. 1996; Winder, Martin et al. 1999; Brown, Blitzer et al. 2000; Liu, Cui et al. 2017), σε συνδυασμό με το γεγονός ότι οι β-ar φαίνεται να εκφράζονται περισσότερο στον VH σε σχέση με τον DH (Rainbow, Parsons et al. 1984), οδηγηθήκαμε στην υπόθεση ότι η μεγαλύτερη απόκριση του VH στην επαγωγή LTP κατά την ενεργοποίηση των β-ar, μπορεί να σχετίζεται με υψηλότερη αύξηση της νευρωνικής διεγερσιμότητας στον VH κατά την επίδοση του TBT. Για να ελέγξουμε αν ισχύει η υπόθεσή μας μετρήσαμε την επίδραση της ενεργοποίησης των β-ar κατά τις συναπτικές αποκρίσεις από την επίδοση των τετράδων παλμών. Πιο συγκεκριμένα μετρήθηκε το εμβαδό της επιφάνειας που 83

91 περικλείεται από την κυματομορφή που διαμορφώνεται από την επίδοση της κάθε τετράδας παλμών και την ευθεία που διέρχεται από το σημείο 0, καθώς και η μετασυναπτική διεγερσιμότητα μέσω της άθροισης των μέτρησεων των πληθυσμιακών δυναμικών (population spike-ps) κατά την επίδοση της κάθε τετράδας παλμών. Εικόνα 24: Τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης των β-ar από την ISO στις νευρωνικές απαντήσεις που προκλήθηκαν από την επίδοση του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ στον DH (αριστερό τμήμα) και στον VH (δεξί τμήμα). Στο διάγραμμα φαίνονται τα fepsp των τετράδων παλμών που εκφράζουν τη συναπτική δραστηριότητα. Οι τιμές υπολογίστηκαν και εκφράστηκαν ως ποσοστό της πρώτης τετράδας. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν τις στατιστικά σημαντικά διαφορές μεταξύ της κατάστασης ελέγχου και της ISO *P<0.05 και **P<0.005 (Mann Whitney U test και independent t-test). Φαίνονται αντιπροσωπευτικές απαντήσεις της 1ης (γκρι) και της 14ης (μαύρο) τετράδας παλμών. Γραμμές κλίμακας 0.5mV και 5ms. Στις συνθήκες ελέγχου παρατηρείται μεγαλύτερη διευκόλυνση των συναπτικών απαντήσεων στον DH σε σχέση με τον VH. Επίσης η ISO ενισχύει κάποιες από τις μετασυναπτικές απαντήσεις του DH, χωρίς να επηρεάζει σημαντικά τον VH. Παρατηρήσαμε ότι το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ επάγει μεγαλύτερη διευκόλυνση των fepsp στον DH κατά την επίδοση των τετράδων παλμών, σε σχέση με τον VH (Mann-Whitney U test και independent t-test για την 3 η - 10 η τετράδα παλμών σε κάθε ακολουθία, μεταξύ DH, n=29/18, και VH, n=26/17; P<0.05, Εικόνα 24). Η ενεργοποίηση των β-ar από την ISO κατά την επίδοση του 3ΤΒΤ στον DH είχε ως αποτέλεσμα την σημαντική αύξηση της διευκόλυνσης του fepsp της δεύτερης τετράδας στην πρώτη ακολουθία τετράδων και των πέντε πρώτων τετράδων κατά την επίδοση των επόμενων δύο τρένων (Wilcoxon test και paired t-test για κάθε 84

92 τετράδα, μεταξύ καταστάσεων ελέγχου και ISO, P<0.05, Εικόνα 24). Στον VH αντίθετα, κατά την προσθήκη της ISO δεν είχαμε καμία σημαντική αλλαγή στην ενίσχυση των fepsp όλων των τετράδων (n=35/15), (Wilcoxon και paired t-test για κάθε τετράδα, μεταξύ καταστάσεων ελέγχου και ISO, P>0.1). Επίσης πρέπει να σημειωθεί ότι το μέγεθος της πρώτης τετράδας ήταν σχεδόν ίδιο μεταξύ DH(55.3±4.9 mv*ms) και VH (53.9±4.3 mv*ms). Εικόνα 25: Τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης των β-ar από την ISO στις νευρωνικές απαντήσεις που προκλήθηκαν από την επίδοση του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ στον DH (αριστερό τμήμα) και στον VH (δεξί τμήμα). Στο διάγραμμα φαίνονται τα PS των τετράδων παλμών που εκφράζουν τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα. Οι τιμές υπολογίστηκαν ως το σύνολο των τεσσάρων PS στην κάθε τετράδα και εκφράστηκαν ως ποσοστιαία μεταβολή σε σχέση με την πρώτη τετράδα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν τις στατιστικά σημαντικά διαφορές μεταξύ της κατάστασης ελέγχου και της ISO *P<0.05 και **P<0.005 (Mann Whitney U test και independent t-test). Φαίνονται αντιπροσωπευτικές απαντήσεις της 1ης, 2ης και της 5ης τετράδας παλμών. Γραμμές κλίμακας 1mV και 5ms. Στις συνθήκες ελέγχου παρατηρείται μεγάλη διευκόλυνση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας στον DH, αλλά όχι στον VH. Επίσης η ISO ενισχύει δραματικά τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα στον VH, ενώ ο DH παραμένει αμετάβλητος. Για την μελέτη της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας, μετρήσαμε τα πληθυσμιακά δυναμικά που δημιουργούνται κατά την επίδοση της κάθε τετράδας του ΤΒΤ και τα αθροίσαμε τόσο στην κατάσταση ελέγχου, όσο και υπό την παρουσία ISO στο DH και στο VH. Αυτό το 85

93 πείραμα έγινε σε ένταση ερεθισμού που προκαλούσε ημιμέγιστο PS σε DH (2.3±0.1 mv, n=11/6) και σε VH τομές (2.5±0.1 mv, n=10/6); οι μέγιστες τιμές για το PS είναι 4.4±0.8 mv και 5.1±0.7 mv στον DH και στον VH αντίστοιχα (Mann-Whitney U test, P>0.05). Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις από το εργαστήριο μας (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016), βρήκαμε ότι κατά την επίδοση του 3ΤΒΤ επαγόταν μία σημαντική αύξηση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας σε όλες τις τετράδες παλμών που έπονται της πρώτης στον DH (Wilcoxon test και paired t-test μεταξύ της πρώτης τετράδας και καθένα από τους επόμενους παλμούς, P<0.05, Εικόνα 25). Το συνολικό πλάτος του PS σε κάθε επόμενη της πρώτης τετράδας στον DH αυξήθηκε από % (n=14/5). Αντίθετα στον VH η εφαρμογή του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ προκάλεσε παροδική διευκόλυνση του PS μόνο κατά την έναρξη της δεύτερης και τρίτης ακολουθίας παλμών και συγκεκριμένα στις 3 πρώτες τετράδες παλμών (n=18/5) Εικόνα 25. Σημαντικό είναι επίσης το γεγονός ότι οι τομές από VH με την επίδοση των 2bursts δεν εμφάνισαν σημαντική αλλαγή (σε ποσοστό 0.53±9.0) και κατά την επίδοση των 5bursts είχαμε καταστολή της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας (σε ποσοστό 23.5±5.1%). Όμως το πρότυπο της δημιουργίας πληθυσμιακών δυναμικών ενέργειας αλλάζει σημαντικά στον VH (n=10/5) σε σχέση με τον DH (n=8/5) μετά από ενεργοποίηση των β-ar. Συγκεκριμένα η ISO προκαλεί σημαντική ενίσχυση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας στον VH σε όλες τις τετράδες του ΤΒΤ που έπονται της πρώτης (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (ISO) για κάθε τετράδα παλμών, P<0.05) μετατρέποντας την καταστολή του PS σε διευκόλυνση που μεγιστοποιείται κατά την πάροδο της επίδοσης των τρένων των παλμών. Πιο συγκεκριμένα υπό την παρουσία της ISO το συνολικό πλάτος του PS που παρατηρήθηκε στη 2 η και στην 5 η τετράδα παλμών ήταν αντίστοιχα 42.0±9.6% και 27.0±8.2% μεγαλύτερο σε σχέση με την πρώτη τετράδα που επιδόθηκε, όπως φαίνεται στην Εικόνα 25. Να σημειώσουμε ότι αναφερόμαστε στην 2 η και στην 5 η τετράδα παλμών γιατί αντιστοιχούν στο πρωτόκολλο των 2bursts και 5bursts, κατά τα οποία ο VH δεν επάγει LTP αποτελεσματικά σε κατάσταση ελέγχου. Αντίθετα η ISO δεν προκάλεσε καμία σημαντική αλλαγή στη διευκόλυνση του PS σε καμία από τις τετράδες κατά την επίδοση του ΤΒΤ στον DH (Mann-Whitney U test και independent t-test κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (ISO) για κάθε τετράδα παλμών, P>0.05). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η παρουσία της ISO 86

94 αύξησε την βασική νευρωνική διεγερσιμότητα στον DH και στον VH σε παρόμοια ποσοστά. Εικόνα 26: Τα αποτελέσματα από τον αποκλεισμό των β-ar μέσω του ανταγωνιστή τους προπρανολόλη (PRO) στον DH (αριστερό τμήμα) και στον VH (δεξί τμήμα) στις συναπτικές απαντήσεις κατά την επίδοση των ριπών (Α) και στη μετασυναπτική παραγωγή δυναμικών ενέργειας (Β) κατά την επίδοση του 3ΤΒΤ. Οι τιμές υπολογίστηκαν και εφράζονται ως ποσοστιαία μεταβολή του εμβαδου (Α) ή του συνόλου του PS στις ριπές (Β). Φαίνονται αντιπροσωπευτικές απαντήσεις της 1ης (γκρι) και της 14ης (μαύρο) τετράδας παλμών στο fepsp (Α) και 87

95 απαντήσεις της 1ης, 2ης και της 5ης τετράδας παλμών στο PS. Γραμμές κλίμακας 0.5mV και 5ms (A) και 1mV και 5ms (Β). Ο αποκλεισμός των β-ar δεν αλλάζει σημαντικά τις συναπτικές απαντήσεις, ούτε την μετασυναπτική διεγερσιμότητα τόσο στον DH όσο και στον VH. Δηλαδή παρατηρήσαμε ότι η ISO αυξάνει σημαντικά το πλάτος του δημιουργούμενου PS στον DH κατά 18.9±3.0% (Wilcoxon test και paired t-test, P<0.005), δεδομένο το οποίο συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες για την δράση των β-ar (Fowler and O'Donnell 1988; Pedarzani and Storm 1996). Και στον VH παρατηρήθηκε ένα παρόμοιο ποσοστό αύξησης του PS (κατά 24.4±4.7%, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.01) (Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ DH και VH, P>0.1). Τα παραπάνω αποτελέσματα μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ενεργοποιούνται διαφορετικοί μηχανισμοί, που εξαρτώνται από τους β-ar, οι οποίοι οδηγούν στην αύξηση της βασικής νευρωνικής διεγερσιμότητας και της διεγερσιμότητας που σχετίζεται με την επίδοση του ΤΒΤ. Βασιζόμενοι στην παρατήρηση ότι ο αποκλεισμός των β-ar από την PRO, είχε ως αποτέλεσμα την μείωση του πλάτους του επαγόμενου LTP στον VH, διερωτηθήκαμε αν η ενεργοποίηση των β-ar από την ενδογενή νοραδρεναλίνη επηρεάζει τις συναπτικές απαντήσεις κατά την επίδοση των τετράδων παλμών καθώς και την μετασυναπτική διεγερσιμότητα. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 26, η προσθήκη της PRO δεν επηρεάζει ούτε το fepsp ούτε το PS κατά την επίδοση των τετράδων παλμών στο DH (n=7/2) και στο VH (n=7/2), (Mann-Whitney U test και independent t-test, μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (PRO) και μεταξύ των DH και VH, P>0.1), γεγονός το οποίο υποδεικνύει ότι η συνεισφορά από την ενεργοποίηση των β-ar μέσω ενδογενούς νοραδρεναλίνης στο επαγόμενο LTP ενεργοποιεί μηχανισμούς διαφορετικούς από τις αλλαγές στις συναπτικές απαντήσεις και την μετασυναπτική διεγερσιμότητα κατά την επίδοση των τετράδων Η αύξηση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας που επάγεται από την ενεργοποίηση των β-ar κατά την επίδοση του ΤΒΤ είναι ανεξάρτητη της GABAεργικής αναστολής Οι β-ar μπορούν να αυξήσουν τη μετασυναπτική GABAεργική αναστολή πέρα από τη δράση τους στη γλουταματεργική διαβίβαση (Waterhouse, Moises et al. 1982; Llano and Gerschenfeld 1993; Sessler, Liu et al. 1995; Croce, Astier et al. 2003), αυξάνοντας την πιθανότητα επαγωγής LTP (Wigstrom and Gustafsson 1983). Το παραπάνω γεγονός είναι σχετικό με τη μελέτη μας, καθώς η GABAεργική αναστολή είναι μεγαλύτερη στον DH σε σχέση με τον VH (Papatheodoropoulos, Asprodini et al. 2002; Georgopoulos, Petrides et al. 2008). 88

96 Εικόνα 27: Τα αποτελέσματα από την ενεργοποίηση των β-ar μέσω της ISO στο fepsp (Α, συναπτική διευκόλυνση) και στο PS (Β, μετασυναπτική διεγερσιμότητα) των ριπών στον DH (αριστερό τμήμα) και στον VH (δεξί τμήμα) κατά την επίδοση του 3ΤΒΤ σε συνθήκες άρσης της GABAεργικής αναστολής από την PTX (10μM) και το CGP52432 (CGP, 10μM). Οι τιμές υπολογίστηκαν και εφράζονται ως ποσοστιαία μεταβολή του εμβαδου (Α) ή του συνόλου του PS στις ριπές (Β). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν τις στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της κατάστασης ελέγχου και της κατάστασης παρουσίας φαρμακολογικών παραγόντων *P<0.05 και **P<0.005 (Mann Whitney U test και independent t-test). Φαίνονται αντιπροσωπευτικές απαντήσεις της 1ης (γκρι) και της 14ης (μαύρο) τετράδας παλμών στο fepsp (Α) και απαντήσεις της 1ης, 2ης και της 5ης τετράδας παλμών στο PS Γραμμές κλίμακας 0.5mV και 5ms (A) και 1mV και 5ms (Β). Η διευκόλυνση του fepsp και του PS στις τομές με 89

97 άρση της αναστολής είναι σημαντικά μειωμένες σε σχέση με αυτές που παρατηρήθηκαν σε κατάσταση ελέγχου (σύγκριση δεδομένων PTX+CGP με δεδομένα από συνθήκες ελέγχου στην Εικόνα 24 και στην Εικόνα 25). Η προσθήκη ISO δεν επηρεάζει τις συναπτικές απαντήσεις των ριπών σε κανένα πόλο του ιπποκάμπου. Όμως η προσθήκη ISO αυξάνει σημαντικά τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα μόνο στον VH, όπως συμβαίνει κατά την κατάσταση όπου οι τομές έχουν κανονική αναστολή (σύγκριση των Β γραφημάτων στην Εικόνα 25). Επίσης στον VH η ISO αναστρέφει την καταστολή των PS κατά τις πρώτες πέντε ριπές σε διευκόλυνση και προκαλεί μία σημαντική αύξηση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας κατά τις τελευταίες 10 ριπές. Αύξηση της αναστολής κατά την ενεργοποίηση των β-ar μπορεί να μειώνει το ενισχυτικό αποτέλεσμα των β-ar στις διεγερτικές μετασυναπτικές απαντήσεις περισσότερο στον DH σε σχέση με τον VH. Για τους παραπάνω λόγους θέλαμε να εξετάσουμε αν το αποτέλεσμα της ISO στις συναπτικές απαντήσεις και στη μετασυναπτική διεγερσιμότητα κατά την επίδοση των τετράδων παλμών, εξακολουθεί να είναι παρόμοιο σε κατάσταση κατά την οποία δεν υφίσταται GABAεργική αναστολή. Ο αποκλεισμός των GABA A και GABA B υποδοχεών μέσω της PTX και του CGP52432 αντίστοιχα, είχε ως αποτέλεσμα μία σημαντική μείωση της διευκόλυνσης των περισσότερων fepsp κατά την επίδοση των τετράδων παλμών στον DH (n=6/3) αλλά όχι στον VH (n=7/3), (σύγκριση διαγραμμάτων A στην Εικόνα 24 και στην Εικόνα 27). Πιο συγκεκριμένα η διευκόλυνση όλων των τετράδων μέχρι και την 24 η, με εξαίρεση την 11 η και την 21 η, ήταν σημαντικά χαμηλότερη στις τομές από DH χωρίς αναστολή, σε σχέση με αυτές στην κατάσταση ελέγχου (Mann-Whitney U test και independent t-test, P<0.05), ενώ στον VH η διευκόλυνση ήταν μειωμένη μόνο στη 2 η και στην 3 η τετράδα (Mann-Whitney U test και independent t-test, P<0.05). Από παλαιότερες μελέτες έχει δειχθεί ότι η διευκόλυνση του εμβαδού του fepsp, που επάγεται από ερεθισμό στο πρότυπο του θήτα ρυθμού, οφείλεται στη συμμετοχή των υποδοχέων GABA B και GABA A μέσω μηχανισμό που έχει ως αποτέλεσμα την άρση της αναστολής των μετασυναπτικών νευρώνων (Nathan, Jensen et al. 1990; Davies and Collingridge 1996; Papatheodoropoulos 2015; Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Κατά συνέπεια η εξάλειψη της GABAεργικής αναστολής είναι αναμενόμενο πως θα περιορίζει σημαντικά την αποτελεσματικότητα αυτού του μηχανισμού. Αυτός ο μηχανισμός, που αναιρεί την αναστολή, έχει αποδειχθεί πως επιδρά περισσότερο στην ηλεκτροφυσιολογική συμπεριφορά του DH σε σχέση με τον VH (Papatheodoropoulos 2015). Επίσης φαίνεται πως συνεισφέρει σημαντικά στη μεγάλη διαφορά κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα στη διευκόλυνση του fepsp κατά την επίδοση τετράδων παλμών (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Όπως ήταν αναμενόμενο ο φαρμακολογικός αποκλεισμός της GABAεργικής αναστολής επηρεάζει 90

98 περισσότερο τον DH κατά την επίδοση των τετράδων παλμών, σε σχέση με τον VH. Αξίζει να σημειωθεί ότι το εμβαδόν των πρώτων fepsp στα TBS ήταν παρόμοια μεταξύ των τομών που βρίσκονταν σε κατάσταση ελέγχου και αυτών που δεν είχαν αναστολή τόσο στον DH (55.3±4.9 vs 65.5±10.1 mv*ms) και όσο και στον VH (53.9±4.3 vs 47.8±7.2 mv*ms), (Mann-Whitney U test και independent t-test, P>0.1). Όσον αφορά την μετασυναπτική διεγερσιμότητα, η άρση της αναστολής προκάλεσε μία δραματική μείωση της διευκόλυνσης του PS κατά την επίδοση των τετράδων στον DH (n=6/3). Συγκεκριμένα παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της διευκόλυνσης στις τετράδες 2-8, και (Mann-Whitney U test και independent t-test, P<0.05). Αντίθετα δεν παρουσιάστηκε καμία διαφορά ως προς τη διευκόλυνση των τετράδων του PS στις τομές χωρίς αναστολή στον VH (n=7/3), (Mann-Whitney U test και independent t-test, P>0.1). Το παραπάνω αποτέλεσμα της μείωσης της διευκόλυνσης στο PS των τετράδων παλμών του DH μπορεί μερικώς να αποδοθεί στην αύξηση του πλάτους του συνολικού PS της πρώτης τετράδας στις τομές χωρίς αναστολή (6.24±1.08 mv) σε σχέση με τις τομές σε κατάσταση ελέγχου (3.95±0.52 mv), παρόλο που αυτή η αύξηση δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική (Mann- Whitney U test και independent t-test, P>0.05). Ομοίως και στον VH το συνολικό πλάτος του PS της πρώτης τετράδας ήταν παρόμοιο μεταξύ κανονικών τομών (5.26±0.38 mv) και τομών χωρίς GABAεργική αναστολή (4.55±1.12 mv; Mann-Whitney U test και independent t-test, P>0.05). Η προσθήκη ISO σε τομές DH, που δεν είχαν αναστολή, δεν προκάλεσε αύξηση της διευκόλυνσης του fepsp κατά την επίδοση των τετράδων παλμών (Mann-Whitney U test και independent t-test, n=7/3, P>0.1; Εικόνα 27A, αριστερό γράφημα), αντίθετο αποτέλεσμα σε σχέση με αυτό που παρατηρήθηκε στην κατάσταση ελέγχου. Ομοίως στον VH μετά την προσθήκη ISO σε τομές με άρση της GABAεργικής αναστολής δεν παρατηρήθηκε κάποια αλλαγή των fepsp κατά την επίδοση των τετράδων παλμών Mann-Whitney U test και independent t-test, n=9/3, P>0.1; Εικόνα 27A, δεξί γράφημα). Επιπρόσθετα η προσθήκη ISO δεν άλλαξε την διευκόλυνση του PS σε τομές DH χωρίς GABAεργική αναστολή (Mann-Whitney U test και independent t-test, n=7/3, P>0.1; Εικόνα 27Β, αριστερό γράφημα), όπως συμβαίνει και απουσία ISO. Όμως η παρουσία ISO σε τομές VH χωρίς αναστολή αύξησε σημαντικά τη διευκόλυνση του PS κατά την επίδοση των 2-5,11-13, τετράδων (Mann-Whitney U test και independent t-test, n=9/3, P<0.05), (Εικόνα 27Β, δεξί γράφημα). 91

99 Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η GABAεργική αναστολή παίζει κάποιο ρόλο στην αύξηση της διευκόλυνσης στο fepsp που οφείλεται στην ενεργοποίηση των β-ar κατά την επίδοση τετράδων παλμών στον DH, αλλά δεν εμπλέκεται στη δράση των β-ar που αυξάνει σημαντικά τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα στονvh Η ενεργοποίηση των β-ar διευκολύνει την επαγωγή LTP από υψηλής συχνότητας ερεθισμό (HFS) στον VH αλλά όχι στον DH Τα πειράματα που έχουν περιγραφεί μέχρι τώρα μας έδειξαν ότι η ενεργοποίηση των β- AR διευκολύνει την επαγωγή και την σταθεροποίηση της LTP στον VH μέσω ερεθισμών, που βασίζονται στο πρότυπο του θήτα ρυθμού (2bursts,5bursts), οι οποίοι σε κατάσταση ελέγχου θεωρούνται υποκατώφλιοι για την επαγωγή LTP. Επίσης σε πρωτόκολλα έντονης ενεργοποίησης (3TBT) αυξάνεται η επαγώμενη LTP και στους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Η μειωμένη ικανότητα των συνάψεων της CA1 περιοχής του VH για επαγωγή LTP είχε αρχικά δειχθεί με τη χρήση ενός κλασσικού πρωτοκόλλου επαγωγής που βασίζεται στην επίδοση 100 παλμών με συχνότητα 100 Hz και χαρακτηρίζεται ως υψίσυχνος ερεθισμός (high-frequency stimulation-hfs) (Papatheodoropoulos and Kostopoulos 2000). Το επόμενο βήμα στη μελέτη μας ήταν να διευκρινίσουμε αν η ενεργοποίηση των β-ar μπορεί να οδηγήσει στην επαγωγή LTP υπό συνθήκες υψίσυχνου ερεθισμού. Χρησιμοποιήσαμε μία ακολουθία παλμών σε συχνότητα 100 Hz, το οποίο αποτελείται από 120 παλμούς έτσι ώστε αριθμητικά οι παλμοί να είναι ίδιοι με αυτούς που επιδίδονται κατά το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ. Παρατηρήσαμε ότι ο HFS ερεθισμός των παράπλευρων ινών του Schaffer είχε ως αποτέλεσμα την αξιόπιστη επαγωγή LTP, όπως και σε προηγούμενες μελέτες (Papatheodoropoulos and Kostopoulos 2000; Maruki, Izaki et al. 2001; Milior, Castro et al. 2016), στον DH (20.1±5.8%, n=7/5, Wilcoxon t-test και paired t-test, P<0.05) αλλά όχι στις συνάψεις του VH (-2.5±4.8%, n=5/3, Wilcoxon t-test και paired t-test, P>0.5, Εικόνα 28). Επίσης βρήκαμε ότι το μέγεθος της επαγόμενης LTP από HFS στον DH υπό την παρουσία της ISO (31.2±6.6%, n=8/4, paired t-test και Wilcoxon t-test, P<0.05) ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε συνθήκες ελέγχου (Mann-Whitney U test και independent t-test, P>0.05) (Εικόνα 28A). Στις συνάψεις του VH, όμως η επίδοση του HFS κατά την ενεργοποίηση των β-ar υπό την προσθήκη ISO είχε ως αποτέλεσμα την αξιόπιστη επαγωγή LTP (26±8.2%, n=6/3, Wilcoxon t-test και paired t-test, 92

100 P<0.05; Mann-Whitney U test και independent t-test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (ISO), P<0.05), (Εικόνα 28B). Εικόνα 28: Τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης των β-ar στην LTP που επάγεται από HFS στον DH (A) και στον VH (B). Το πρωτόκολλο HFS επιδόθηκε στο χρονικό σημείο που υποδεικνύεται από το βέλος και αποτελούταν από 120 παλμούς με συχνότητα 100Hz. Η ISO τοποθετήθηκε στο υδατόλουτρο για 25 λεπτά (δείχνεται από το γκρι οριζόντιο βέλος). Γραμμές κλίμακας 1mV και 5ms. Αντιπροσωπευτικές καταγραφές των fepsp, που δίνονται στην κορυφή κάθε διαγράμματος, καταγράφηκαν 5 λεπτά πριν (γκρι γραμμή) και 60 λεπτά έπειτα (μαύρη γραμμή) την επίδοση του HFS. Σε κανονικό ΤΕΝΥ η επίδοση HFS επάγει σταθερά LTP στον DH, αλλά όχι στον VH. Όμως η ενεργοποίηση των β-ar από την προσθήκη ISO διευκολύνει την επαγωγή LTP στον VH, χωρίς να επηρεάζει σημαντικά την LTP του DH. Το μέγεθος της επαγόμενης LTP παρουσία ISO δεν διέφερε μεταξύ DH και VH (Mann- Whitney U test και independent t-test, P>0.05). Τα παραπάνω αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των β-ar μειώνει το κατώφλιο επαγωγής LTP στον VH ακόμα και όταν επιδίδεται υψίσυχνος ερεθισμός Η έκφραση της LTP δεν περιλαμβάνει αλλαγές στη διευκόλυνση που παρατηρείται κατά τη σύζευξη παλμών (PPF) Το γεγονός ότι η ISO αυξάνει τη βασική συναπτική διαβίβαση, δηλαδή το fepsp, περισσότερο στο DH σε σχέση με τον VH υποδεικνύει ότι οι β-ar μπορεί να δρουν στο προσυναπτικό επίπεδο ελέγχοντας την πιθανότητα απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή διαφορετικά στους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Επίσης έχει δειχθεί από άλλες μελέτες ότι η επαγωγή της LTP που διευκολύνεται ή επάγεται από την ενεργοποίηση των β-ar εμπλέκει προσυναπτικούς μηχανισμούς (Huang and Kandel 1996; Wojtowicz, Fidzinski et al. 2010). Για τους παραπάνω λόγους θέλαμε να διερευνήσουμε αν η επαγόμενη LTP που διευκολύνεται 93

101 έπειτα από την ενεργοποίηση των β-ar εμπεριέχει και προσυναπτικούς μηχανισμούς. Η διερεύνηση έγινε μέσω της μέτρησης της διευκόλυνσης κατά τη σύζευξη παλμών (paired pulse facilitation-ppf), η οποία αποτελεί μία μορφή βραχύχρονης αύξησης της συναπτικής αποτελεσματικότητας που αποδίδεται σε προσυναπτικούς μηχανισμούς (Zucker and Regehr 2002) και χρησιμοποιείται ώστε διερευνηθούν μηχανισμοί που έχουν ως αποτέλεσμα την επαγωγή LTP (Schulz, Cook et al. 1995). Η επαγωγή της LTP μπορεί να αποδοθεί μερικώς σε αυξημένη πιθανότητα της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστή από τις προσυναπτικές νευρικές απολήξεις (Bekkers and Stevens 1990; Schulz 1997), ένα φαινόμενο το οποίο είναι αντιστρόφως ανάλογο με το μέγεθος της PPF (Dobrunz and Stevens 1997) και θεωρητικά αναμένεται ότι αλλαγή στην PPF που σχετίζεται με την LTP υποδεικνύει την ύπαρξη προσυναπτικού μηχανισμού κατά την επαγωγή της LTP (Schulz 1997). Εικόνα 29: Η διευκόλυνση επαγωγής της LTP από την ενεργοποίηση των β-ar δεν σχετίζεται με αλλαγές στην PPF. Η PPF μετρήθηκε πριν την επαγωγή της LTP και 60 λεπτά μετά στα τέσσερα διαφορετικά πρωτόκολλα επαγωγής (δηλαδή 2bursts, 5bursts, 30bursts και HFS) κάτω από συνθήκες ελέγχου και υπό την παρουσία της ISO. Η αλλαγή της PPF εκφράζεται ως ποσοστιαία μεταβολή του λόγου EPSP2/EPSP1. Παραδείγματα των fepsps δίνονται στην κορυφή των διαγραμμάτων. Γραμμές κλίμακας: 1mV, 10ms. Το πλάτος του πρώτου fepsp σε κάθε περίπτωση σημειώνεται με διακεκομένη γραμμή για λόγους σύγκρισης. Η έκφραση της LTP δεν σχετίζεται με καμία σημαντική αλλαγή στο PPF είτε υπό συνθήκες ελέγχου είτε σε συνθήκες ενεργοποίησης των β-ar σε κανέναν από τους δύο πόλους. Αρχικά μετρήσαμε και συγκρίναμε την PPF μεταξύ DH και VH υπό φυσιολογικές συνθήκες (δηλαδή παρουσία μόνο TENY) και παρατηρήσαμε ότι η PPF στον DH (1.41±0.02, n=71/30) είναι μεγαλύτερη σε σχέση με τον VH (1.20±0.02%, n=60/33), (Mann-Whitney U test και independent t-test, P<0.001). Η ενεργοποίηση των β-ar από την παρουσία ISO προκάλεσε μία μικρή αλλά σημαντική μείωση στην PPF στον DH (-3.66±1.12%, n=29/13, Wilcoxon test και paired t-test, P<0.05) αλλά όχι στον VH (-1.07±0.66%, n=37/16, Wilcoxon test και paired t- 94

102 test, P>0.05), και η διαφορά στην PPF μεταξύ DH (1.42±0.03) και VH (1.17±0.02) παρέμεινε σημαντικά μεγαλύτερη (Mann-Whitney U test και independent t-test, P<0.001). Επίσης βρήκαμε, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (Manabe, Wyllie et al. 1993; Schulz, Cook et al. 1995; Asztely, Xiao et al. 1996), ότι η επαγωγή LTP είτε με την επίδοση TBT ή με HFS σε κανονικές συνθήκες δεν προκάλεσε καμία σημαντική αλλαγή στην PPF σε κάποιον από τους δύο πόλους του ιπποκάμπου (σύγκριση της PPF πριν και μετά την επαγωγή LTP από οποιοδήποτε πρωτόκολλο, Wilcoxon test και paired t-test, P>0.05), (Εικόνα 29). Ομοίως η PPF δεν άλλαξε σημαντικά μετά την επαγωγή LTP από τα διάφορα πρωτόκολλα επαγωγής υπό την παρουσία της ISO και στους δύο πόλους του ιπποκάμπου (Wilcoxon test και paired t-test, P>0.05, Εικόνα 29). Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα διαφαίνεται ότι οι μηχανισμοί επαγωγής της LTP, είτε σε κανονικές συνθήκες είτε σε συνθήκες ενεργοποίησης των β-ar, δεν συμπεριλαμβάνουν κάποιο προσυναπτικό μηχανισμό. Τελικά, τα κύρια ευρήματα της παρούσας μελέτης είναι τα εξής: 1) η ενεργοποίηση των β-ar από την ISO μειώνει το κατώφλιο επαγωγής της LTP και αυξάνει τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα μόνο στον VH αλλά όχι στον DH 2) η ενεργοποίηση των β-ar από την ενδογενή νοραδρεναλίνη συνεισφέρει στη σταθεροποίηση και στο μέγεθος της LTP που επάγεται από ερεθισμούς βασιζόμενους στον θήτα ρυθμό μόνο στον VH αλλά όχι στον DH χωρίς να τροποποιεί την μετασυναπτική διεγερσιμότητα 3) η ενεργοποίηση των β-ar από την ISO μεγαλώνει το μέγεθος της επαγώμενης LTP στον VH και στον DH αλλά διευκολύνει το ανεξάρτητο από υποδοχείς NMDA LTP μόνο στον VH 4) ενεργοποίηση των β-ar από την ISO κατά την επίδοση του πρωτοκόλλου HFS διευκολύνει την επαγωγή LTP μόνο στον VH και όχι στον DH. Τα παραπάνω αποτελέσματα μας δείχνουν ότι οι μηχανισμοί που συνεισφέρουν στην επαγωγή LTP και εξαρτώνται από τους β-ar επηρεάζουν περισσότερο τον VH σε σχέση με τον DH. Επίσης η ενεργοποίηση των β-ar από την ISO διευκολύνει την επαγωγή LTP από ένα ευρύ φάσμα προτύπων ερεθισμού στον VH, ενώ στον DH μόνο κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες ερεθισμού. Τέλος η επαγωγή LTP στον VH υπό συνθήκες ενεργοποίησης των β-ar έχει πολλαπλούς μηχανισμούς που επηρεάζονται, σε αντίθεση με τον DH Πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων οι β-ar διευκολύνουν την επαγωγή LTP Το πλάτος της επαγόμενης LTP συσχετίζεται θετικά με το ποσό της μετασυναπτικής εκπόλωσης (Golding, Staff et al. 2002). Η επαναλαμβανόμενη παραγωγή δυναμικών ενέργειας 95

103 στον μετασυναπτικό νευρώνα αποτελεί μία σημαντική πηγή μετασυναπτικής εκπόλωσης (Stuart and Sakmann 1994; Magee and Johnston 1997) που μπορεί να βοηθήσει σημαντικά στην επαγωγή της LTP μέσω διευκόλυνσης της ενεργοποίησης των υποδοχέων NMDA (Magee and Johnston 1997; Thomas, Watabe et al. 1998). Οι ερεθισμοί που βασίζονται στον θήτα ρυθμό μπορούν σταθερά να αυξήσουν σημαντικά την παραγωγή δυναμικών ενέργειας (Thomas, Watabe et al. 1998). Επίσης το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ αυξάνει έντονα τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα και προκαλεί σχετικά εύκολα την επαγωγή LTP στον DH αλλά όχι στον VH (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Ομοίως ο συνεχής ερεθισμός με πρωτόκολλο που αποτελείται από παλμούς που επιδίδονται σε συχνότητα 5 Hz αυξάνει έντονα τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα επάγει σταθερά LTP στον DH (Thomas, Watabe et al. 1998; Tsanov and Manahan-Vaughan 2009; Babiec, Jami et al. 2017) αλλά όχι στον VH (Babiec, Jami et al. 2017). Η ενεργοποίηση των μετασυναπτικών β-ar μπορεί να προκαλέσει σημαντική αύξηση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας, ιδιαίτερα στη δραστηριότητα που προκαλείται από την επίδοση ερεθισμού που βασίζεται στο θήτα ρυθμό (Winder, Martin et al. 1999; Brown, Blitzer et al. 2000; Liu, Cui et al. 2017), μέσω της αναστολής των υπερπολωτικών καναλιών καλίου που εντοπίζονται στους δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων (Hoffman and Johnston 1999; Faber, Delaney et al. 2008; Liu, Cui et al. 2017). Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η δράση των δενδριτικών καναλιών καλίου στα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 περιοχής είναι υπεύθυνη για τη μειωμένη ικανότητα του VH να επάγει LTP έπειτα από συνεχή ερεθισμό με συχνότητα 5 Hz καθώς αποτρέπεται η επαρκής ενεργοποίηση των υποδοχέων NMDA (Babiec, Jami et al. 2017). Στη συγκεκριμένη μελέτη αποδεικνύεται ότι η ενεργοποίηση των β-ar αυξάνει τη νευρωνική διεγερσιμότητα μόνο στον VH. Επίσης λαμβάνοντας υπόψιν το γεγονός ότι ο VH έχει αυξημένη νοραδρενεργική νεύρωση (Gage, Thompson et al. 1978; Loy, Koziell et al. 1980; Oleskevich, Descarries et al. 1989; Hortnagl, Berger et al. 1991), αυξημένα επίπεδα έκφρασης των β-ar (Rainbow, Parsons et al. 1984) και αυξημένη δράση των υπερπολωτικών καναλιών καλίου (Babiec, Jami et al. 2017), υποθέσαμε ότι οι β-ar τροποποιούν την ικανότητα επαγωγής LTP στον VH αυξάνοντας σημαντικά της μετασυναπτική διεγερσιμότητα σε συνθήκες έντονης αδρενεργικής ενεργοποίησης. Όμως ο παραπάνω μηχανισμός δεν μπορεί να είναι ο μόνος ο οποίος τροποποιεί την επαγωγή της LTP στον VH, καθώς η ενεργοποίηση των β-ar από την ενδογενή νοραδρεναλίνη, που συνεισφέρει στην επαγωγή LTP, δεν φαίνεται να προκαλεί 96

104 αύξηση διεγερσιμότητας. Όντως έχει αποδειχθεί ότι οι β-ar μπορούν να ενισχύσουν την επαγωγή LTP μέσω τροποποίησης των NMDA και AMPA υποδοχέων (Raman, Tong et al. 1996; Vanhoose and Winder 2003; Skeberdis, Chevaleyre et al. 2006; Tenorio, Connor et al. 2010). Παρόλα τα παραπάνω, η τροποποίηση των νευρωνικής διεγερσιμότητας μπορεί να θεωρηθεί ως ένας μηχανισμός με πολλαπλά σηματοδοτικά αποτελέσματα. Για παράδειγμα η αυξημένη διεγερσιμότητα, περά από την διευκόλυνση ενεργοποίησης του υποδοχέα NMDA, μπορεί να διευκολύνει και την ενεργοποίηση καναλίων ασβεστίου VDCC, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του ενδοκυττάριου σήματος ασβεστίου, το οποίο με τη σειρά του οδηγεί σε αυξημένη και σταθερή συναπτική ενίσχυση. Όντως στην παρούσα μελέτη φαίνεται ότι η ενεργοποίηση των VDCC μπορεί να συνεισφέρει στην ενίσχυση της επαγωγής της LTP από τους β-ar στον VH και όχι στον DH. Οι παρατηρήσεις από την παραπάνω μελέτη μας αποδεικνύουν ότι οι διεργασίες που σχετίζονται με τους β-ar για την επαγωγή LTP είναι πιο ευαίσθητοι στον VH σε σχέση με τον DH. Υποθέτουμε ότι σε συνθήκες μέτριας συναπτικής ενεργοποίησης, που έχουν ως αποτέλεσμα την επαγωγή LTP μόνο μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα NMDA (πρωτόκολλα 2bursts και 5bursts), έχουμε αποτελεσματική ενεργοποίηση των β-ar από την ενδογενή νοραδρεναλίνη, οπότε η περαιτέρω εξωγενής ενεργοποίηση μέσω ISO, δεν προσδίδει κάτι περαιτέρω στο μηχανισμό επαγωγής LTP είτε στο πλάτος της επαγόμενης LTP. Αυτό μπορεί να εξηγεί τον λόγο για τον οποίο η ISO δεν αύξησε το πλάτος της LTP μετά από 1 και 2 ώρες έπειτα από την επίδοση του πρωτοκόλλου των 5bursts. Παρόλα αυτά η ISO ενίσχυσε τη βραχύχρονη συναπτική ενίσχυση (δηλαδή που διαρκεί λιγότερο από μία ώρα) η οποία επάγεται από την επίδοση 5bursts. Αυτό μπορεί να αποδοθεί σε παροδική ενεργοποίηση κάποιων διεργασιών που βρίσκονται υπό τον έλεγχο των β-ar, όπως η ενεργοποίηση της κινάσης ERK της οικογένειας των ΜΑΡ κινασών (Roberson, English et al. 1999; Winder, Martin et al. 1999) που γίνεται γρήγορα και παροδικά (διαρκεί χρονικά λιγότερο από μία ώρα) (Winder, Martin et al. 1999) και σε αυτήν αποδίδεται μερικώς το φαινόμενο της μετατετανικής ενίσχυσης (Tancredi, D'Antuono et al. 2000). 97

105 Εικόνα 30: Συνολική εικόνα όπου φαίνεται ο ρόλος των β-ar στην επαγωγή της LTP στον DH και στον VH. Η διακεκομμένη γραμμή δείχνει την κλίση του fepsp σε κατάσταση ελέγχου και οι αστερίσκοι δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ καταστάσεων ελέγχου και καταστάσεων φαρμακολογικού χειρισμού με P<0.05 (Mann Whitney U test και independent t-test). Η συλλογή δεδομένων έγινε 60 λεπτά μετά την επαγωγή της LTP εκτός του πρωτοκόλλου 5bursts όπου τα δεδομένα συλλέχθησαν 120 λεπτά έπειτα από την επαγωγή της LTP. Η ενεργοποίηση των β-ar στον VH έχει ως αποτέλεσμα τη διευκόλυνση της επαγωγής της LTP σε όλα τα πρότυπα ερεθισμού. Στον DH όμως η ISO διευκολύνει το πλάτος της επαγόμενης LTP μόνο όταν αυτή επάγεται με ισχυρό ερεθισμό (3ΤΒΤ). Επιπρόσθετα η ενδογενής νοραδρεναλίνη συνεισφέρει μόνο στην LTP του VH. Ακόμα η ISO διευκολύνει την επαγωγή LTP μέσω των L-VDCC μόνο στον VH. Σημαντικό είναι επίσης το γεγονός ότι η επαγόμενη LTP παρουσία της ISO, με εξαίρεση τα 3ΤΒΤ, είναι παρόμοια μεταξύ DH και VH. Λαμβάνοντας υπόψιν ότι το πλάτος της LTP που επάγεται σε συνθήκες ελέγχου είναι υψηλότερο στον DH σε σχέση με τον VH, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι β-ar δρουν ως "διακόπτες" που ελέγχουν την επαγωγή της LTP στον VH κάτω από συνθήκες αυξημένης αδρενεργικής δραστηριότητας. Κάτω από συνθήκες έντονης συναπτικής δραστηριότητας (όπως το 3ΤΒΤ) η ενεργοποίηση των β-ar συμμετέχει στην συστράτευση επιπρόσθετων μηχανισμών, όπως η ενεργοποίηση των VDCC, αυξάνοντας το πλάτος της επαγόμενης LTP, όπως διαπιστώσαμε στον VH. Η έντονη συναπτική δραστηριότητα και/ή μετασυναπτική παραγωγή δυναμικών ενέργειας μπορούν να ενεργοποιήσουν τα VDCC στους νευρώνες της CA1 περιοχής του ιπποκάμπου (Magee and Johnston 1995), καθώς και η ενεργοποίηση των β-ar (Gray and Johnston 1987; Qian, Patriarchi et al. 2017) ενισχύει τη δράση τους. Παρουσιάζει ενδιαφέρον το γεγονός ότι η διαφορά στην επαγόμενη LTP μεταξύ της κανονικής κατάστασης και της ISO (19.8%) με την επίδοση των 3ΤΒΤ στον VH είναι παρόμοια με το μέγεθος της επαγόμενης LTP κατά την ενεργοποίηση μόνο των VDCC με το ίδιο πρωτόκολλο (16.6%, βλέπε Εικόνα 30). Επίσης το ποσοστό μείωσης της επαγόμενης LTP με 3ΤΒΤ κατά τον αποκλεισμό των β-ar από την PRO (12.9%) είναι παρόμοιο με το μέγεθος της LTP που εξαρτάται αποκλειστικά από ενεργοποίηση των υποδοχέων NMDA και που επάγεται από το πρωτόκολλο 5bursts (13.3%). Λαμβάνοντας υπόψιν την επίδραση του αποκλεισμού των β-ar ή την ενεργοποίηση τους στις συναπτικές 98

106 απαντήσεις που επάγονται από ερεθισμούς στο πρότυπο του θήτα ρυθμού, μπορούμε να εικάσουμε ότι σε συνθήκες μέτριας συναπτικής δραστηριότητας, η έντονη ενεργοποίηση των β- AR διευκολύνει την επαγωγή LTP που εξαρτάται από τον υποδοχέα NMDA μέσω της σημαντικής αύξησης της νευρωνικής διεγερσιμότητας. Με την επαγωγή μέτριας συναπτικής δραστηριότητας, η ενεργοποίηση των β-ar, καθώς και των γεγονότων που αυτοί ελέγχουν, λαμβάνει χώρα από την ενδογενή νοραδρεναλίνη και τελικά οδηγεί σε τροποποίηση της δράσης των NMDA και AMPA υποδοχέων. Η ενδογενής νοραδρεναλίνη μπορεί να απελευθερώνεται είτε κατά την επίδοση του ΤΒΤ είτε να είναι παρούσα εκ των προτέρων στον εξωκυττάριο χώρο. Όπως φαίνεται η ενδογενής νοραδρεναλίνη στον εξωκυττάριο χώρο είναι περισσότερη στον VH σε σχέση με τον DH (Hortnagl, Berger et al. 1991). Σε συνθήκες έντονης συναπτικής δραστηριότητας, πολλαπλοί μηχανισμοί συμμετέχουν στην αυξημένη επαγωγή της LTP όπως αύξηση μετασυναπτικής δραστηριότητας, τροποποίηση δράσης NMDA και AMPA υποδοχέων και ενεργοποίηση των VDCC. Η πολλαπλότητα των εμπλεκόμενων μηχανισμών κατά την εξαρτώμενη από β-ar επαγωγή LTP στον VH, υποδεικνύεται και από την διευκόλυνση της επαγωγής LTP μέσω επίδοσης HFS, λαμβάνοντας υπόψιν ότι το ΤΒΤ και το HFS ενεργοποιούν διαφορετικούς ενδοκυττάριους μηχανισμούς (English and Sweatt 1996; Thomas, Moody et al. 1996). Ο DH, σε αντίθεση με τον VH, φαίνεται πως έχει πολύ περιορισμένους μηχανισμούς που να επηρεάζονται από την ενεργοποίηση των β- AR, διαμέσου των οποίων να μπορεί να αυξήσει την επαγόμενη LTP και οι οποίοι απαιτούν έντονη ενεργοποίηση των β-ar καθώς και έντονη συναπτική δραστηριότητα ώστε να οδηγήσουν σε επαγωγή και σταθεροποίηση της μακρόχρονης συναπτικής ενδυνάμωσης Λειτουργικές συνέπειες της τροποποίησης της επαγωγής της LTP από τους β-ar για τον VH και τον DH Η νοραδρεναλίνη εκκρίνεται στον ιππόκαμπο σε καταστάσεις συγκινησιακής διέγερσης και κατά την εξερεύνηση νέων χώρων (Ihalainen, Riekkinen et al. 1999; Kocsis, Li et al. 2007) ώστε να διευκολύνει την τροποποίηση των συνάψεων (Hu, Real et al. 2007; O'Dell, Connor et al. 2015) και να δημιουργήσει μνήμες των συγκινησιακά φορτισμένων γεγονότων (Cahill and McGaugh 1996; Kukolja, Klingmuller et al. 2011). Μέχρι σήμερα υπάρχουν αρκετές αποδείξεις που μας δείχνουν ότι ο VH αποτελεί το τμήμα του ιπποκάμπου που εμπλέκεται περισσότερο στην επεξεργασία συγκινησιακά φορτισμένων πληροφοριών (Gray and McNaughton 2003; 99

107 Goosens 2011; Bannerman, Sprengel et al. 2014; Koelsch, Jacobs et al. 2015), καθώς δέχεται μεγαλύτερη νοραδρενεργική εννεύρωση, σε σχέση με τον DH (Gage, Thompson et al. 1978; Loy, Koziell et al. 1980; Oleskevich, Descarries et al. 1989; Hortnagl, Berger et al. 1991). Αναλογιζόμενοι το θεμελιώδη ρόλο που παίζει η LTP στις διεργασίες της μνήμης και της μάθησης (Eichenbaum 1996; Martin and Morris 2002), καθώς και το γεγονός ότι ο VH παρουσιάζει μεγαλύτερη απόκριση κατά την επαγωγή LTP σε συνθήκες ενεργοποίησης των β- AR, μπορούμε να οδηγηθούμε στο συμπέρασμα ότι αυτή η ενεργοποίηση αποτελεί ένα ενδογενή μηχανισμό μέσω του οποίου ενεργοποιείται ο VH κατά τον εντοπισμό και την συγκράτηση συγκεκριμένων γεγονότων που εμπεριέχουν συγκινησιακή φόρτιση. Βεβαίως δεν μπορούμε να μη λάβουμε υπόψη μας και τον DH για την επεξεργασία πληροφοριών, ο οποίος παρουσιάζει διευκόλυνση επαγωγής LTP κάτω από συνθήκες έντονης αδρενεργικής ενεργοποίησης και έντονης συναπτικής δραστηριότητας, γεγονός το οποίο υποδηλώνει ότι ο DH συμμετέχει σε μνημονικές διεργασίες γεγονότων γενικού περιεχομένου σε καταστάσεις αυξημένης επαγρύπνησης (Sara and Bouret 2012; Hagena, Hansen et al. 2016) Συμπεράσματα Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν για πρώτη φορά ότι η ενεργοποίηση των β-ar κατά τη διάρκεια επίδοσης ερεθισμών σε πρότυπα που σχετίζονται με τη νευρωνική δραστηριότητα, επιλεκτικά μειώνει το κατώφλιο για την επαγωγή και τη σταθεροποίηση της LTP που εξαρτάται από την ενεργοποίηση του υποδοχέα NMDA στον VH και όχι στον DH. Κατά συνέπεια οι β-ar είναι πολύ πιθανόν ότι δρουν ως διακόπτες που διεγείρουν τη συναπτική πλαστικότητα στον VH σε συνθήκες ήπιας αύξησης της συναπτικής δραστηριότητας που σχετίζεται με γεγονότα που έχουν συγκινησιακή φόρτιση. Επίσης σταδιακά αυξανόμενη συναπτική δραστηριότητα συνδυασμένη με σχετικά έντονη ενεργοποίηση των β-ar, η οποία ομοιάζει με την ενεργοποίηση του αδρενεργικού συστήματος όταν ο οργανισμός βρίσκεται σε κατάσταση συγκινησιακής εγρήγορσης κατά την εξερεύνηση του χώρου, οδηγεί σε αύξηση της συνολικής επαγόμενης LTP στον VH. Αντίθετα στον DH αύξηση στο μέγεθος της επαγόμενης LTP μπορεί να επιτευχθεί μόνο μέσω συνδυασμού ισχυρής συναπτικής δραστηριότητας και έντονης ενεργοποίησης των β-ar. Πολλαπλοί μηχανισμοί φαίνονται ότι διέπουν την τροποποίηση του LTP από τους β-ar στον VH. Ήπια ενεργοποίηση των β-ar δεν προϋποθέτει αύξηση της 100

108 μετασυναπτικής διεγερσιμότητας και μπορεί να προκαλεί κατευθείαν ρύθμιση των γλουταματεργικών υποδοχέων. Έντονη ενεργοποίηση των β-ar διευκολύνει την επαγωγή LTP στον VH αυξάνοντας τη μετασυναπτική διεγερσιμότητα και ενεργοποιώντας πέρα από τους υποδοχείς NMDA και τους L-VDCC. Αντίθετα ο DH φέρει μηχανισμούς που δεν απαιτούν αλλαγές στη διεγερσιμότητα οπότε και καταλήγει στην αύξηση της LTP μέσω έντονης ενεργοποίησης του υποδοχέα NMDA. Η πιο αποτελεσματική τροποποίηση της LTP στον VH σε σχέση με τον DH έπειτα από ενεργοποίηση των β-ar μπορεί να έχει σκοπό τη διαφορική εμπλοκή των δύο πόλων του ιπποκάμπου σε συμπεριφορές που σχετίζονται σε διάφορους βαθμούς ενεργοποίησης του αδρενεργικού συστήματος. Επιπρόσθετα το γεγονός ότι ο VH είναι πιο στενά συνδεδεμένος με τη λειτουργία της συγκίνησης και λαμβάνοντας υπόψιν και τον σημαντικό ρόλο που παίζουν οι β-ar στη συγκινησιακή επαγρύπνηση, τα παρόντα αποτελέσματα παρέχουν ένα πρώτο στοιχείο για τους μηχανισμούς που διέπουν τη συμμετοχή του VH στη δημιουργία συναισθημάτων LTP και υποδοχείς ντοπαμίνης Ο σκοπός της παρούσας συγκριτικής μελέτης είναι τριπλός. Πρώτον προσπαθεί να προσδιορίσει την πιθανή συνεισφορά της ενεργοποίησης των ενδογενών ντοπαμινεργικών υποδοχέων D1/D5 κατά την επαγωγή της LTP στον DH και στον VH. Δεύτερον να προσδιορίσει αν η ενεργοποίηση των D1/D5 υποδοχέων από εξωγενή αγωνιστή επιδρά διαφορετικά στην επαγωγή LTP στον DH και στον VH και τρίτον να προσδιορίσει ποσοτικά και να συγκρίνει την έκφραση των D1/D5 υποδοχέων στην CA1 περιοχή του ιπποκάμπου μεταξύ DH και VH. Οι αποκρίσεις σε κανονικές συνθήκες ή σε συνθήκες ελέγχου προκλήθηκαν μέσω ερεθισμού έντασης που είχε ως αποτέλεσμα το ημιμέγιστο fepsp, το οποίο ήταν παρόμοιο μεταξύ DH (1,71±0,07 mv/ms, n=99/39) και VH (1,54±0,08 mv/ms, n=81/32) Η ενεργοποίηση των υποδοχέων D1/D5 από την ενδογενή ντοπαμίνη συνεισφέρει εξίσου στην επαγωγή της LTP στον VH και στον DH Η ντοπαμίνη μπορεί να απελευθερώνεται ενδογενώς σε κανονικές τομές από DH (Frey, Schroeder et al. 1990) συνεισφέροντας στο μέγεθος της επαγόμενης LTP (Otmakhova and Lisman 1996). Μέχρι σήμερα δεν έχει υπάρξει κάποια συγκριτική μελέτη της επίδρασης της ενεργοποίησης των D1/D5 υποδοχέων στην επαγόμενη LTP μεταξύ DH και VH. Για να 101

109 πραγματοποιηθεί η συγκεκριμένη συγκριτική μελέτη θεωρήσαμε σκόπιμο να χρησιμοποιήσουμε ένα πρωτόκολλο επαγωγής LTP, το οποίο να προκαλεί παρόμοια αύξηση της συναπτικής ενδυνάμωσης και στους δύο πόλους του ιπποκάμπου σε συνθήκες ελέγχου (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Οπότε χρησιμοποιήσαμε ένα έντονο πρωτόκολλο το οποίο βασίζεται στο πρότυπο του θήτα ρυθμού και αποτελείται από 10 τετράδες παλμών (burst) με συχνότητα 100 Hz που επιδίδονται ανά 200 ms (δηλαδή σε συχνότητα 5Hz). Το παραπάνω πρωτόκολλο εφαρμόζεται τρεις φορές με χρονικό διάστημα 30 δευτερολέπτων μεταξύ κάθε εφαρμογής και ονομάζεται 3ΤΒΤ (Ten Burst Trains). Εικόνα 31: Τα αποτελέσματα του ανταγωνιστή των υποδοχέων D1/D5 στην επαγωγή LTP στον DH (a) και στον VH (b). Η επαγωγή LTP έγινε με την επίδοση του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ τη χρονική στιγμή 0 (κάθετο βέλος). Οι φαρμακολογικοί παράγοντες διαπότιζαν τις τομές για 25 λεπτά (SCH 23390) ή για 35 λεπτά (νιμοδιπίνη, NIMO). Καταγραφές αντιπροσωπευτικών fepsp δίνονται στην κορυφή της εικόνας και ελήφθησαν 5 λεπτά πριν (γκρι γραμμή) και 60 λεπτά μετά (μαύρη γραμμή) την επίδοση του 3ΤΒΤ, κάτω από διάφορες φαρμακολογικές καταστάσεις. Γραμμές κλίμακας 1mV, 2ms. Ο αποκλεισμός των D1/D5 υποδοχέων από τον ανταγωνιστή τους SCH (20μΜ) μειώνει σημαντικά το πλάτος της επαγόμενης LTP και στους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι οι L-VDCCs συνεισφέρουν στην επαγωγή της LTP κάτω από συνθήκες αποκλεισμού των D1/D5 υποδοχέων μόνο στον DH. Μετά την εφαρμογή του παραπάνω πρωτοκόλλου σε συνθήκες ελέγχου είχαμε σημαντική επαγωγή LTP στον DH (43.9±3.5%, n=24/15, paired t test και Wilcoxon test, p<0.001) και στον VH (38.9±3.6%, n=20/11 paired t test and Wilcoxon test, p<0.001,εικόνα 31), (independent t test και Mann-Whitney U test μεταξύ DH και VH, p>0.05). Για να εκτιμήσουμε το ρόλο της ενδογενώς εκκρινόμενης ντοπαμίνης στην επαγωγή LTP, εφαρμόσαμε το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ σε τομές που προήλθαν από τον DH και τον VH παρουσία του 102

110 ανταγωνιστή των D1/D5 υποδοχέων SCH (20μM). Παρατηρήσαμε ότι ο αποκλεισμός των D1/D5 υποδοχέων είχε ως αποτέλεσμα την σημαντική μείωση της επαγόμενης LTP και στους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Πιο συγκεκριμένα το μέγεθος της LTP μετά τον αποκλεισμό των D1/D5 υποδοχέων στον VH ήταν σημαντικά μικρότερο (12.68%±3.3%, n=8/3, paired t test και Wilcoxon test, p<0.001) σε σχέση με τον DH (25.4%±3.3%, n57/3, paired t test και Wilcoxon test, p<0.01), (independent t test και Mann-Whitney U test μεταξύ DH και VH, p<0.05; Εικόνα 31Εικόνα 32, Εικόνα 33 Εικόνα 34). Η επίδοση 3ΤΒΤ μπορεί να επάγει LTP στον DH, αλλά όχι στον VH, το οποίο οφείλεται κατά το μεγαλύτερο μέρος στην ενεργοποίηση του υποδοχέα NMDA και κατά ένα μικρότερο μέρος στην ενεργοποίηση των L-VDCC (Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Κατά συνέπεια η αυξημένη LTP που παρατηρείται στον DH κατά τον αποκλεισμό των D1/D5 υποδοχέων, σε σχέση με τον VH, μπορεί να αποδοθεί στην ενεργοποίηση των L-VDCC, οι οποίοι θεωρητικά τουλάχιστον αναμένεται να μην επηρεάζονται από τον παραπάνω φαρμακολογικό χειρισμό. Στη συνέχεια εφαρμόσαμε το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ σε τομές από DH και VH παρουσία του ανταγωνιστή των D1/D5 υποδοχέων SCH (20μM) και παρουσία του ανταγωνιστή των L-VDCC νιμοδιπίνη (20μM), ώστε να καθορίσουμε τη συνεισφορά της ενδογενούς ντοπαμίνης στην LTP που εξαρτάται αποκλειστικά από τον υποδοχέα NMDA. Βρήκαμε ότι η LTP που επαγόταν κάτω από τις προαναφερθείσες συνθήκες δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ DH και VH (10.6%±2.3% και 18.1%±3.7%, αντίστοιχα, independent t test και Mann-Whitney U test, p>0.05, Εικόνα 31Εικόνα 32, Εικόνα 33 Εικόνα 34). Όπως φαίνεται η ενεργοποίηση των D1/D5 υποδοχέων από την ντοπαμίνη που απελευθερώνεται ενδογενώς κατά τη διάρκεια της επίδοσης του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ διευκολύνει την ενεργοποίηση των υποδοχέων NMDA και την εξαρτώμενη από αυτή επαγωγή της LTP παρόμοια στους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Η υψηλότερη επαγωγή LTP στον DH σε σχέση με τον VH κατά τον αποκλεισμό των D1/D5 υποδοχέων μπορεί να αποδοθεί στην ενεργοποίηση των L-VDCC που υφίσταται μόνο στον DH υπό φυσιολογικές συνθήκες. Ο ανταγωνιστής των D1/D5 υποδοχέων SCH δεν επηρεάζει το fepsp, δηλαδή τη βασική συναπτική διαβίβαση, στον VH (1.20±0.13 mv/ms and 1.23±0.13 mv/ ms κάτω από φυσιολογικές συνθήκες και υπό συνθήκες παρουσίας φαρμακολογικού παράγοντα (SCH23390) αντίστοιχα, paired t test και Wilcoxon test, p>0.05). 103

111 3.3.2 Εξωγενής ενεργοποίηση των υποδοχεών D1/D5 ενισχύει την επαγωγή LTP μόνο στον VH και όχι στον DH Στη συνέχεια προσπαθήσαμε να καθορίσουμε αν το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης των D1/D5 υποδοχέων από εξωγενείς αγωνιστές είναι παρόμοιο στους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Αρχικά χρησιμοποιήσαμε τον μερικό αγωνιστή των D1/D5 υποδοχέων SKF σε ήπια (50 μμ) και σε υψηλή (150 μμ) συγκέντρωση, οι οποίες τροποποιούν την επαγωγή LTP στη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου (Swanson-Park, Coussens et al. 1999; Navakkode, Sajikumar et al. 2007; Stramiello and Wagner 2010). Εικόνα 32: Τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης των D1/D5 υποδοχέων από αγωνιστές τους στην επαγωγή LTP στον DH (a) και στον VH (b). Οι φαρμακολογικοί παράγοντες προστέθηκαν στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό του υδατόλουτρου είτε για 25 λεπτά (SKF 82958, SKF 38393, και CPP) είτε για 35 min (NIMO). Παραδείγαμτα καταγραφών των fepsp καταγράφηκαν 5 λεπτά πριν (γκρι γραμμή) και 60 λεπτά μετά την επίδοση του ΤΒΤ (μαύρη γραμμή) κάτω από διάφορους φαρμακολογικούς χειρισμούς, των οποίων τα σύμβολα δίνονται στην κορυφή των διαγραμμάτων. Γραμμές κλίμακας: 1 mv, 2 ms. Το πλάτος της επαγόμενης LTP αυξήθηκε από τον ειδικό αγωνιστή των D1 υποδοχέων SKF (10 μm) στον VH αλλά όχι στον DH. Όμως ο αγωνιστής των D1/D5 υποδοχέων SKF (50 και 150 μm) δεν είχε κάποιο αποτέλεσμα στο πλάτος της επαγόμενης LTP σε κάποιον από τους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Σε αυτή την εικόνα τα δεδομένα από τις δύο συγκεντρώσεις του SKF συμπεριλήφθηκαν σε μία ομάδα. Παρατηρήσαμε ότι καμία συγκέντρωση δεν επηρέασε την επαγόμενη LTP (Εικόνα 32, Εικόνα 33 Εικόνα 34) σε κάποιον από τους πόλους του ιππόκαμπου. Πιο συγκεκριμένα η αύξηση του fepsp στα 60 λεπτά έπειτα από την επίδοση του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ παρουσία 50 μμ SKF ήταν 39.80%±10.0% στον DH (n=10/6, paired t test και Wilcoxon test, p<0.01) και 39.4%±10.8% στον VH (n=8/5, paired t test και Wilcoxon test, p<0.05), (σύγκριση της LTP μεταξύ κατάστασης ελέγχου και φαρμακολογικού παράγοντα (SKF 38393) σε DH και VH 104

112 independent t test και Mann-Whitney U test, p>0.05). Ομοίως η LTP που επάγεται κατά την παρουσία 150 μμ SKF στον DH (54.4%±8.0%, n=13/8, Wilcoxon test και paired-t test p<0.001) και στον VH (33.1%±7.0%, n=16/9, paired-t test και Wilcoxon test, p<0.001) παρέμειναν στα ίδια επίπεδα με την φυσιολογική κατάσταση (independent t test και Mann- Whitney U test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και φαρμακολογικού παράγοντα (SKF 38393) σε DH και VH, p>0.05). Εικόνα 33: Διάγραμμα διασποράς που παρουσιάζει την ποσοστιαία μεταβολή των fepsp 60 λεπτά μετά την επαγωγή της LTP μέσω επίδοσης των 3ΤΒΤ στους διάφορους φαρμακολογικούς χειρισμούς. Το κάθε σημείο αντιστοιχεί σε τιμές που καταγράφηκαν από μία τομή. Το επόμενο βήμα ήταν η εξέταση του αποτελέσματος που έχει ο ειδικός αγωνιστής των D1 υποδοχέων SKF Η LTP που επάγεται παρουσία 10 μμ SKF ήταν στον DH 43.7%±4.9% (n=8/3, paired t test και Wilcoxon test, p<0.05) και στον VH 48.7±3.0 (n=8/4, paired t test και Wilcoxon test, p<0.05) (Εικόνα 32). Επίσης το μέγεθος της επαγόμενης LTP παρουσία 10μΜ SKF αυξήθηκε σημαντικά στον VH σε σχέση με αυτό που επάγεται υπό φυσιολογικές συνθήκες, φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε στον DH (independent t test και Mann-Whitney U test μεταξύ κατάστασης ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (SKF 82958), p<0.05 στον VH και p>0.05 στον DH). Για να εξετάσουμε αν η αύξηση στο 105

113 μέγεθος της επαγόμενης LTP που προέκυψε από την εφαρμογή του SKF οφείλεται στην διευκόλυνση της LTP που εξαρτάται από τον υποδοχέα NMDA ή οφείλεται στην ενεργοποίηση των L-VDCC, επιδόθηκε το πρωτόκολλο 3ΤΒΤ σε τομές παρουσία του αγωνιστή των D1 υποδοχέων SKF σε συγκέντρωση 10 μμ και του ανταγωνιστή των υποδοχέων NMDA, CPP σε συγκέντρωση 10 μμ. Εικόνα 34: Συνολικά δεδομένα για τη σύγκριση της δράσης των D1/D5 υποδοχέων στην επαγωγή LTP στον DH και στον VH κάτω από συνθήκες διάφορων φαρμακολογικών χειρισμών. Οι οριζόντιες γραμμές και οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Οι συνεχείς γραμμές αναφέρονται σε συγκρίσεις των τομών, που προέρχονται από τον ίδιο πόλο, μεταξύ τους, ενώ οι διακεκκομένες γραμμές αναφέρονται σε συγκρίσεις μεταξύ των τομών από διαφορετικούς πόλους. Η στατιστική δοκιμασία one-way AVOVA χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων φαρμακολογικών χειρισμών στον DH (F=10.645, p<0.001) και στον VH (F=8.823, p<0.001). Τα αποτελέσματα από πρόσθετες στατιστικές δοκιμασίες (παραμετρικές και μη) περιγράφονται στο κείμενο. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε αυτή την εικόνα φαίνονται οι στατιστικά σημαντικές διαφορές (σε επίπεδο σημαντικότητας p<0.05) μεταξύ σχετικών πειραματικών συνθηκών σε DH και VH. Επίσης δεν φαίνονται στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ μη σημαντικών ποσοστών fepsp (παραδείγματος χάριν τα ποσοστά των συνθηκών SKF CPP+nimodipine στον DH και SKF CPP, CPP στον VH). Ο αριθμός τομών/ζώων που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε φαρμακολογικό χειρισμό που δίδονται στην εικόνα με τη σειρά που παρουσιάζονται είναι: 24/15, 7/3, 6/2, 10/6, 13/8, 8/3, 9/3, 6/2, 16/6 στον DH και 20/11, 8/3, 6/2, 8/5, 16/9, 8/4, 6/3, 9/5 στον VH. Παρατηρήσαμε ότι κάτω από αυτές τις συνθήκες σε τομές από VH δεν ήταν εφικτή η επαγωγή LTP (το fepsp άλλαξε κατά -1.5%±3.7%, n=6/3; paired t test και Wilcoxon test, 106

114 p>0.05) όπως συμβαίνει και σε συνθήκες αποκλεισμού μόνο του υποδοχέα NMDA (0.0%±3.0%, n=9/5; paired t test και Wilcoxon test, p>0.05). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η εξωγενής ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων από το SKF διευκολύνει την επαγωγή της LTP που εξαρτάται από τον υποδοχέα NMDA στον VH. Σε τομές που προέρχονται από τον DH η επίδοση του πρωτοκόλλου 3ΤΒΤ παρουσία SKF και CPP επάγει σταθερά LTP (12.9%±3.2%, n=9/4 (paired t test και Wilcoxon test, p<0.05), η οποία όμως είναι σημαντικά χαμηλότερη σε σχέση με την LTP που επάγεται σε φυσιολογικές συνθήκες (independent t test και Mann-Whitney U test, p<0.001), αλλά παρόμοια σε μέγεθος με αυτή που επάγεται κατά τον αποκλεισμό των υποδοχέων NMDA μόνο (14.4%±2.9%, n=16/6, paired t test και Wilcoxon test, p<0.005; independent t test και Mann-Whitney U test μεταξύ των καταστάσεων παρουσία φαρμακολογικών παραγόντων (SKF CPP και CPP, p>0.05), (Εικόνα 32 Εικόνα 34). Η LTP που επάγεται κατά τον αποκλεισμό των υποδοχέων NMDA, εξαλείφεται τελείως μετά από την προσθήκη CPP και νιμοδιπίνης, που αποτελεί ανταγωνιστή των L-VDCC (-0.3%±2.3%, n=6/2, paired t test and Wilcoxon test, p>0.05), γεγονός το οποίο αποδεικνύει ότι οφείλεται στην ενεργοποίηση των L-VDCC κατά την επίδοση των 3ΤΒΤ (Morgan and Teyler 2001; Kouvaros and Papatheodoropoulos 2016). Η προσθήκη του SKF δεν επηρέασε σημαντικά τη βασική συναπτική διαβίβαση (fepsp) ούτε στο DH (1.73±0.16 mv/ms και 1.79±0.16 mv/ms σε κατάσταση ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (SKF 38393) αντίστοιχα, paired t test και Wilcoxon test, p>0.05) ούτε στον VH (1.68±0.15 mv/ms και 1.73±0.14 mv/ms σε κατάσταση ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (SKF 38393) αντίστοιχα, paired t test και Wilcoxon test, p>0.05). Επίσης η προσθήκη SKF δεν επηρέασε το fepsp στον VH (1.34±0.20 mv/ms και 1.34±0.20 mv/ms σε κατάσταση ελέγχου και παρουσία φαρμακολογικού παράγοντα (SKF 82958) αντίστοιχα, paired t test και Wilcoxon test, p>0.05), όμως προκάλεσε μία μικρή αλλά στατιστικά σημαντική διαφορά στο fepsp του DH (από 1.33±0.16 mv/ms σε 1.47±0.18 mv/ms, paired t test και Wilcoxon test, p<0.05) Η έκφραση του D1 υποδοχέα σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης είναι υψηλότερη στον VH σε σχέση με τον DH Αρχικά ποσοτικοποιήσαμε την έκφραση του Drd1 γονιδίου, το οποίο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή του D1 υποδοχέα, στις απομονωμένες CA1 περιοχές ιπποκάμπου των δύο ιπποκάμπειων πόλων. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα του mrna του D1 υποδοχέα είναι αρκετές φορές υψηλότερα στον VH (7.36±0.16, n=3/3) σε σχέση με τον DH (1.0±0.83, n=3/3), (independent t 107

115 test και Mann-Whitney U test, p<0.05; Εικόνα 35a). Στη συνέχεια μελετήσαμε στο επίπεδο της πρωτεΐνης την έκφραση του D1 υποδοχέα σε δύο διαφορετικά χρονικά σημεία, συγκεκριμένα σε τομές από τις οποίες η απομόνωση της πρωτεΐνης έγινε αμέσως μετά την απομόνωση του ιπποκάμπου (τομές naïve) και έπειτα από παραμονή των τομών στο υδατόλουτρο για 1,5-2 ώρες (τομές in vitro), έτσι ώστε να εξετάσουμε αν η παραμονή στο υδατόλουτρο στις τομές που επάγεται LTP παρουσιάζουν κάποια διαφορά στα επίπεδα έκφρασης του D1 υποδοχέα. Εικόνα 35: Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του ντοπαμινεργικού υποδοχέα D1 στο επίπεδο του mrna (a) και της πρωτεΐνης (b) στον DH και στον VH. (a)η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (q-pcr) μας έδειξε ότι η έκφρασση του D1 υποδοχέα στο επίπεδο του mrna είναι περίπου 3 φορές περισσότερη στον VH σε σχέση με τον DH (independent t test και Mann-Whitney U test, p<0.05). Το παραπάνω πείραμα έγινε σε δώδεκα τομές από ραχιαίο και δώδεκα τομές από τον κοιλιακό ιππόκαμπο που προήλθαν από τρεις επίμυες. (b) Η ανοσοαποτύπωση κατά Western έγινε σε ιστό από τομές που ελήφθησαν αμέσως μετά την απομόνωση του ιπποκάμπου από τον εγκέφαλο των επίμυων (naive) και σε τομές που διατηρήθηκαν στο υδατόλουτρο για λεπτά (in vitro) ώστε ο χρόνος να είναι όμοιος με το χρόνο κατά τον οποίο μετράται η επαγωγή και διατήρηση της LTP. Από τις τομές του ιπποκάμπου απομονώθηκε μόνο η CA1 περιοχή έπειτα από τομές με χειρουργική λεπίδα, ώστε να απομακρυνθούν οι υπόλοιπες περιοχές. Η ανοσοαποτύπωση κατά Western διεξήχθη σε 46 τομές που απομονώθηκαν από 6 επίμυες. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη ελέγχου για την ισοφόρτωση των δειγμάτων. Η πρωτεΐνη του D1 υποδοχέα κανονικοποιήθηκε προς την ακτίνη. Η έκφραση του D1 υποδοχέα βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη στον VH σε σχέση με τον DH είτε στις τομές που απομονώθηκε η πρωτεΐνη τους άμεσα είτε στις τομές που διατηρήθηκαν στο υδατόλουτρο (ANOVA F=17.49, independent t test και Mann-Whitney U test, p<0.0005). Μεταξύ των τομών που διατηρήθηκαν στο υδατόλουτρο και αυτών που απομονώθηκαν άμεσα έπειτα την αφαίρεση του ιπποκάμπου δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά σε κανένα τμήμα του ιπποκάμπου. Βρήκαμε ότι η έκφραση του D1 υποδοχέα ήταν σημαντικά υψηλότερη στον VH (1.90±0.08 και 1.88±0.08, n=22/6) σε σχέση με τον DH (1.40±0.09 and 1.23±0.04, n=24/6), (ANOVA, F=17.49, independent t test και Mann-Whitney U test, p<0.0005), (Εικόνα 35b). Μεταξύ των τομών που έγινε απομόνωση αμέσως μετά την παρασκευή τους και των τομών που παρέμειναν στο υδατόλουτρο για περίπου 2 ώρες δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα επίπεδα 108