Ανάπτυξη των οργάνων ενδοδερμικής προέλευσης

Transcript

1 Αναπτυξιακή βιολογία και ιστολογία Ενότητα 3: Οργανογένεση Ανάπτυξη των οργάνων ενδοδερμικής προέλευσης (J.M.W. Slack, Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης, Aκαδημαϊκές Εκδόσεις 2007/2014 S.F. Gilbert, Developmental Biology, 9 th Ed., Sinauer Associates, Inc, 2010) Δρ. Μαριάννα Χ. Αντωνέλου Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ 1 ABI

2 Εισαγωγή Ενδόδερμα: εσώτερη από τις τρεις βλαστικές στιβάδες εμβρύου προκύπτει από την επιβλάστη κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης Εισβάλει από την αρχική λωρίδα και εκτοπίζει τα κύτταρα της υποβλάστης στην περιφέρεια του βλαστοδέρματος 2

3 Εισαγωγή 3

4 Εισαγωγή Λειτουργίες ενδοδέρματος: κατασκευή επιθηλίων αυλού ΓΣ και καταβολών (αδένες: ήπαρ, πάγκρεας κλπ) και αναπνευστικού σωλήνα (πνεύμονες) επαγωγή σχηματισμού διάφορων μεσοδερμικών οργάνων (νωτοχορδή, καρδιά, αγγεία κλπ) Glucose homeostasis Gas exchange Digestion Nutrient absorption Detoxification Blood clotting Hematopoiesis 4

5 Yποδιαίρεση ΕΝΔΟΔΕΡΜΑΤΟΣ σε μορφολογικά και λειτουργικά διαφοροποιημένες περιοχές ΓΣ: από το φάρυγγα μέχρι την έδρα Διαφοροποιείται κατά μήκος: Οισοφάγος Στομάχι Δωδεκαδάκτυλος Έντερο και αποφύσεις από τις οποίες θα προκύψουν: Θυρεοειδής Θύμος Πνεύμονες Πάγκρεας Ήπαρ Επιθήλια ΓΣ και αποφύσεων: ΕΝΔΟΔΕΡΜΑ Εξωτερικά περιβλήματα οργάνων: λείος μυικός ιστός, συνδετικός ιστός, αιμοφόρα αγγεία σπλαχνικό μεσόδερμα

6 Εισαγωγή 45h chick embryo Σωματοπλευρά: Ο συνδυασμός επιδερμίδας-σωματικού μεσοδέρματος Σπλαχνοπλευρά: Ο συνδυασμός ενδοδέρματος-σπλαχνικού μεσοδέρματος 6

7 Mouse embryos at e7.5, e8.5 and e10.5 days and an adult mouse pancreas. Days after fertilization: Endoderm (yellow) organogenesis. After gastrulation, endoderm is a 1-cell thick sheet of approxim ,000 cells on the outside of the e7.5 embryo. Kαταλαμβάνει τις «ενδοδερμικές περιοχές» κατά μήκος του EO και ΡΚ άξονα primitive gut tube (e8.5) epithelial lining of esophagus, stomach (St), intestines (Int), trachea, lungs (Lu) and a major component of many glands including liver (Li), gall bladder/biliary tree (GB), pancreas, thyroid, thymus (e10.5). The e10.5 embryo and adult islets express beta-galactosidase under control of the Pdx1 gene 7

8 Εισαγωγή Αναπνευστικό και Πεπτικό σύστημα 8

9 Εισαγωγή Diseases affecting endodermal organs : juvenile diabetes, biliary atresia (ατρησία χοληφόρων πόρων) and Crohn s disease (φλεγμονώδης ασθένεια ΓΣ) defective endoderm development congenital gastrointestinal malformations (συγγενείς δυσπλασίες του γαστρεντερικού συστήματος) A better understanding of endoderm development : discovery of molecular diagnostics of birth defects directing stem cell differentiation into pancreas, liver and intestinal tissue 9

10 Εισαγωγή ΕΡΩΤΗΜΑΤΑ Μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην «εγκαθίδρυση» του ΕΝΔΟΔΕΡΜΑΤΟΣ κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης στη διαφοροποίηση συγκεκριμένων οργάνων του πεπτικού συστήματος: (Stainier, 2002; Tam et al., 2003; Yasugi, 1994; Wells and Melton, 1999; Duncan, 2000; Grapin-Botton and Melton, 2000; Yasugi, 2000; Fukuda and Yasugi, 2002) πώς διαχωρίζεται το ενδόδερμα από τις άλλες βλαστικές στιβάδες πως κατανέμεται σε ειδικές περιοχές. (Κimura et al., Developmental Biology 289:283, 2006) how early endoderm cells obtain positional identity along the anterior-posterior (ΕΟ) axis?? 10

11 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά 11

12 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη έμβρυο της όρνιθας αυγά (επιτελείται με παρόμοιο τρόπο σε άλλα ανώτερα σπονδυλωτά) έμβρυο σπίνος ποντικός Πεπτικός σωλήνας εμβρύων όρνιθα ορτύκι Composite photo courtesy of N. Kurpios. 12

13 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Caspar Friedrich Wolff (1769) (embryologist, St. Petersburg): ο ΓΣ σχηματίζεται από την καμπύλωση μιας αρχικά επίπεδης επιφάνειας. Πρώτη πειραματική (μικροσκοπική) απόδειξη ότι το έμβρυο σχηματίζεται από την αρχή μικροσκοπικά, προσχηματισμένα άτομα μέσα στους γαμέτες 13

14 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη ξεκινάει σε δύο ακραίες θέσεις οι οποίες συγκλίνουν και συντήκονται κεντρικά 1. Πρόσθιο αρχέντερο: κύτταρα πλευρικών τμημάτων εμπρόσθιου ενδοδέρματος κινούνται κοιλιακά για να σχηματίζουν το θύλακα του εμπρόσθιου αρχεντερικού ανοίγματος 2. Οπίσθιο ενδόδερμα: οπίσθιο αρχεντερικό άνοιγμα Καθώς συγκλίνουν το ένα προς το άλλο σχηματίζεται το μέσο αρχέντερο 14

15 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Πρόσθιο αρχέντερο (θύλακας) αναδίπλωση του βλαστοδέρματος (εγκόλπωση) στην οποία συμμετέχουν και οι τρεις βλαστικές στιβάδες. 15

16 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Στο οπίσθιο άκρο εμβρύου (ουραία πτυχή βλαστοδέρματος): οπίσθιο αρχεντερικό άνοιγμα Σχηματισμός του οπίσθιου εντέρου (όψιμο στάδιο). (Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33). 16

17 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Το εμπρόσθιο και το οπίσθιο αρχεντερικό άνοιγμα συγκλίνουν και συντήκονται Κλείσιμο του ΓΣ και του σώματος στο έμβρυο της όρνιθας (3 η -4 η ημέρα) Το σπλαχνικό μεσόδερμα εκατέρωθεν της μέσης γραμμής συγκλίνει (εγκάρσιες τομές ανάμεσα στα επίπεδα του μέσου και του οπίσθιου εντέρου κατά την ημέρα 3). 17 (Κατά Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33).

18 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη και συντήκεται σχηματίζοντας το ραχιαίο και κοιλιακό μεσεντέριο που περικλείει το αρχέντερο. (εγκάρσιες τομές ανάμεσα στα επίπεδα του μέσου και του οπίσθιου εντέρου κατά την ημέρα 3). 18 (Κατά Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33).

19 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Το ραχιαίο μεσεντέριο (συγκρατεί το αρχέντερο/έντερο) παραμένει στο ενήλικο άτομο ενώ το μεγαλύτερο μέρος του κοιλιακού μεσεντερίου χάνεται Μεσεντέριο: the double layer of περιτόναιο (peritoneum) that suspends the jejunum (νήστιδα) and ileum (ειλεό) from the posterior wall of the abdomen (κοιλία/υπογάστριο). (εγκάρσιες τομές ανάμεσα στα επίπεδα του μέσου και του οπίσθιου εντέρου κατά την ημέρα 3). (Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33). 19

20 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Ημέρα 4 η : ολοκλήρωση σχηματισμού ΓΣ εμβρύου Φυσιολογική ανάπτυξη Σε κάθε άκρο ΓΣ υπάρχει επαφή εξωδέρματος-ενδοδέρματος Στοματικό άκρο (ΕΞ: stomodeum, σε επαφή με το ΕΞ του εγκεφάλου. Από τη στοματική περιοχή προκύπτει η αδενική μοίρα της υπόφυσης) και έδρα (ΕΝΔ/ΕΞ anorectal junction, ορθοπρωκτικός σύνδεσμος) At about 22 days in human embryos the stomodeum breaks, creating the oral opening of the digestive tube (επενδύεται από εξωδερμικά κύτταρα) 20

21 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Ημέρα 4 η : ολοκλήρωση σχηματισμού ΓΣ εμβρύου 1. Ασύμμετρη συσπείρωση 2. Σχηματισμός καταβολών διαφόρων οργάνων που αναπτύσσονται από το ΓΣ (ανάπτυξη τοπικού προτύπου οργάνωσης ΓΣ) 21

22 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά 1. Ασύμμετρη συσπείρωση γαστρεντερικού σωλήνα Φυσιολογική ανάπτυξη έντερο εμβρύου όρνιθας, στάδιο E16 Όλα τα άτομα ενός είδους ίδιας ηλικίας εμφανίζουν τον ίδιο αριθμό και μέγεθος συσπειρώσεων του εντερικού σωλήνα Ρύθμιση από μηχανισμό εγκαθίδρυσης ασυμμετρίας άξονα δεξιά-αριστερά Photo courtesy of L. Mahadevan 22

23 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη 2. Σχηματισμός των τμημάτων και καταβολών ΓΣ στο έμβρυο των αμνιωτών (Hildebrand Analysis of Vertebrate Structure. 4th edn. Wiley, figure 12.1). 23

24 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Τυμπανική κοιλότητα μέσου ωτός Ευσταχιανή σάλπιγγα Αμυγδαλές Θύμος Παραθυροειδείς αδένες (Κατά Hildebrand Analysis of Vertebrate Structure. 4th edn. Wiley, figure 12.1). 24

25 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Endoderm folds Pharynx, esophagus, stomach, intestine oral and anal openings respiratory tract forms from foregut associated glands form 25

26 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Η οργάνωση του ΓΣ είναι ίδια σε όλα τα σπονδυλωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Πυλωρικός σφιγκτήρας HCl πεψίνη κυλινδρικό πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο αδενικό επιθήλιο κυλινδρικό (εμβρυικό στάδιο ) με κρύπτες και λάχνες (ώριμο στάδιο) Τοπική διαφοροποίηση ΓΣ (Κυτταρική διαφοροποίηση των τμημάτων του εντερικού σωλήνα στο έμβρυο της όρνιθας).

27 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη HCl πεψίνη Οι διαφορετικοί τύποι επιθηλιακού ιστού προέρχονται από την ίδια στιβάδα ενδοδερμικών κυττάρων. 27

28 Ανοσοχρώση έναντι του μεταγραφικού παράγοντα Cdx2 (έντερο), της βιμεντίνης (μεσέγχυμα) και του μορίου κυτταρικής συνάφειας καδερίνη Ε (επιθήλια) (α) Αρχικά το έντερο είναι ένας απλός σωλήνας από κυλινδρικό επιθήλιο που περιβάλλεται από το μεσέγχυμα (β) Το απλό επιθήλιο μετατρέπεται σε πολύστιβο (γ) Το επιθήλιο του εντέρου οργανώνεται σε κρύπτες και λάχνες. Spence et al. (2011) Developmental Dynamics 240, 501 (άδεια από τον εκδοτικό οίκο John Wiley & 28 Sons Ltd. )

29 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Λεπτό έντερο: δωδεκαδάκτυλο, νηστίδα, ειλεός. βρόγχος προσάρτησης ήπατος και παγκρέατος 29

30 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Ήπαρ: αναπτύσσεται λίγο μετά το σχηματισμό του πρόσθιου αρχεντέρου από μία κοιλιακή απόφυση του τελευταίου. περιοχή πρόσθιου αρχεντέρου περιοχή πρόσθιου αρχεντέρου περιοχή μέσου αρχεντέρου Ανάπτυξη ήπατος στον ποντικό. (ενδόδερμα: κίτρινο, πράσινο: χοληδόχος κύστη) fg, mg, hg: πρόσθιο, μέσο και οπίσθιο αρχέντερο. Zorn, A.M., Liver development (October 31, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/ /stembook , 30

31 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Πάγκρεας: αναπτύσσεται και αυτό από το πρόσθιο αρχέντερο (ραχιαία και κοιλιακή καταβολή (έμβρυο ποντικού) ή από ζεύγος κοιλιακών καταβολών (έμβρυο όρνιθας) ραχιαία καταβολή Με την ανάπτυξη του εμβρύου οι καταβολές συγκλίνουν και σε όψιμα στάδια συντήκονται κοιλιακή καταβολή Suckale et al., Frontiers in Bioscience 13, ,

32 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη Τμήματα ώριμου εντέρου δε σχετίζονται απόλυτα με τα αντίστοιχα του αρχεντέρου (κινούμενα όρια κατά το σχηματισμό ΓΣ) Συμβατικά: Όψιμα στάδια «πρόσθιο» Μέχρι το πάγκρεας και το ήπαρ «μέσο» Μέχρι την ένωση ανάμεσα στο λεπτό και στο παχύ έντερο 32

33 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη ΕΡΩΤΗΜΑΤΑ Πώς γνωρίζει το ενδόδερμα του ΓΣ ότι θα μετασχηματιστεί σε αυτούς τους ιστούς στις συγκεκριμένες θέσεις του? Γιατί δεν συναντάμε ποτέ ένα στόμα σε σύνδεση με το στομάχι? 1. Γενική εξειδίκευση ενδοδέρματος από κλίση συγκέντρωσης ρετινοϊκού οξέος: προκαλεί έκφραση εξειδικευμένων ως προς διάφορες περιοχές μεταγραφικών παραγόντων στο ενδόδερμα 2. Τοπική εξειδίκευση του ενδοδέρματος: Επαγωγικά σήματα (πχ. FGF) από τα μεσεγχυματικά κύτταρα σπλαχνικού μεσοδέρματος 33

34 Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά Φυσιολογική ανάπτυξη 34

35 Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος 35

36 Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος Φυσιολογική ανάπτυξη 1 1. Ο πρώτος πληθυσμός ενδοδερμικών κυττάρων που εισέρχεται στο κατώτερο στρώμα συμβάλλει μόνο στο σχηματισμό του μέσου/οπίσθιου αρχεντέρου 2. Τα επόμενα κύτταρα που εισάγονται συμβάλλουν στο ραχιαίο πρόσθιο αρχέντερο και τελευταία αυτά του κοιλιακού πρόσθιου αρχέντερου. 36

37 Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος Φυσιολογική ανάπτυξη 2 Κατά μήκος του ΕΟ άξονα διατηρούνται οι σχέσεις ανάμεσα στο ενδόδερμα και στα παράγωγά του Εμπρόσθιο ενδόδερμα Πρόσθιο αρχέντερο Μέσο ενδόδερμα Μέσο αρχέντερο Οπίσθιο ενδόδερμα Οπίσθιο αρχέντερο (Κατά Grapin-Botton) Χάρτης πεπρωμένου του ενδοδέρματος της όρνιθας 37

38 Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος Φυσιολογική ανάπτυξη 3 για κάθε συγκεκριμένη δομή ΓΣ τα συμβαλλόμενα τμήματα ΕΝΔ/ΜΕΣ εντοπίζονται σε διαφορετική περιοχή του εμβρύου (διάταξη ίδια) (ημέρα 1,5 Κατά Matsushita) Συγκριτική μελέτη χαρτών πεπρωμένου περιοχών ενδοδέρματος και μεσοδέρματος οι οποίες συγκροτούν από κοινού τα επιμέρους τμήματα του ΓΣ σπλαχνικού 38

39 Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος Φυσιολογική ανάπτυξη Σχετική μετακίνηση των δύο βλαστικών στιβάδων κατά τη διαδικασία κλεισίματος του αρχεντέρου Μια συγκεκριμένη περιοχή ΕΝΔΟΔΕΡΜΑΤΟΣ εφάπτεται με διαφορετικές περιοχές ΜΕΣΟΔΕΡΜΑΤΟΣ κατά την ανάπτυξη του ΓΣ Επαγωγικές αλληλεπιδράσεις ενδοδέρματος-μεσοδέρματος Η εξειδίκευση του ενδοδέρματος μπορεί να μεταβάλλεται καθώς αυτό έρχεται σε επαφή με μεσέγχυμα από διαφορετικές περιοχές του εμβρύου 39

40 Καθορισμός Ενδοδέρματος Πότε??? Εξειδίκευση περιοχών ΓΣ σε πολύ πρώιμα στάδια endoderm appears to be regionally specified even before it forms a tube!!!!! Πώς??? 40

41 Καθορισμός Ενδοδέρματος Καθορισμός του ενδοδέρματος Μεταγραφικοί παράγοντες που ενέχονται σε σχηματισμό ενδοδέρματος (α) καθορίζουν το ενδόδερμα συνολικά, ως βλαστική στιβάδα (β) καθορίζουν το ενδόδερμα ως εξειδικευμένο επιθήλιο ή όργανο και εκφράζονται σε διακριτές περιοχές ενδοδέρματος. αμοιβαία αλληλεξάρτηση μεταξύ τους (πχ. με πειραματική υπερέκφραση ενός ενεργοποίηση υπολοίπων) 41

42 Καθορισμός Ενδοδέρματος Καθορισμός του ενδοδέρματος (α) Μεταγραφικοί παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα ΣΥΝΟΛΙΚΑ, ως βλαστική στιβάδα Το μονοπάτι nodal είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση στο ενδόδερμα (στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του ΓΣ) της έκφρασης Sox17, mixer Πεπρωμένο πρόσθιου ενδοδέρματος: χρειάζεται υψηλότερα επίπεδα nodal signaling σε σχέση με οπίσθιο. 42

43 Καθορισμός του ενδοδέρματος (α) Μεταγραφικοί παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα ΣΥΝΟΛΙΚΑ, ως βλαστική στιβάδα Transcription factor network in endoderm induction Οι παράγοντες FoxΑ περιορίζονται στα ενδοδερμικά κύτταρα οριακά πριν ή κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης και είναι απαραίτητοι για την εξειδίκευση και διαφοροποίηση των ενδοδερμικών δομών. Αnne Grapin-Botton Endoderm specification 43

44 Καθορισμός Ενδοδέρματος Καθορισμός του ενδοδέρματος (α) Μεταγραφικοί παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα ΣΥΝΟΛΙΚΑ, ως βλαστική στιβάδα Eνδόδερμα: από το τμήμα του εμβρύου σταδίου 32 κυττάρων που αντιστοιχεί στα 8 βλαστομερίδια φυτικού πόλου Xenopus Εξώδ. Μεσόδ. Ενδόδ. vegt: ενεργοποιεί (άμεσα ή όχι, πχ. nodal*) έκφραση των: Sox17α Sox17β Mix1 Mixer* GATA1, GATA2, GATA3, GATA4* 44

45 Καθορισμός Ενδοδέρματος Καθορισμός του ενδοδέρματος (α) Μεταγραφικοί παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα ΣΥΝΟΛΙΚΑ, ως βλαστική στιβάδα Εξώδερμα Μεσοενδόδερμα Zebrafish Σηματοδότηση nodal Ελέγχει έκφραση casanova (sox family) και spiel-ohne-grenzen Απώλεια λειτουργίας αυτών των γονιδίων απουσία ενδοδέρματος (Grapin-Botton and Constam, Mechanisms of Development 124:253, 2007) 45

46 Καθορισμός Ενδοδέρματος Καθορισμός του ενδοδέρματος γονίδιο έμβρυο έκφραση Συνέπεια στοχευμένης αδρανοποίησης pax9 ποντικός Φαρυγγικοί θύλακες Απουσία θύμου, παραθυρεοειδούς Nkx2.1 ποντικός Καταβολή θυρεοειδούς και τραχειοοισοφαγικό διάφραγμα pdx1 ποντικός Κεντρικό τμήμα ΓΣ με μελλοντικές καταβολές παγκρέατος cdx2 (β) Μεταγραφικοί παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα ως ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΟ ΕΠΙΘΗΛΙΟ ή ΟΡΓΑΝΟ ποντικός Όρνιθα Οπίσθιο τμήμα ΓΣ Απουσία θυρεοειδούς και πνευμόνων Απουσία παγκρέατος Πρόωρος θάνατος (μετασχηματισμό τύπου επιθηλίου εντέρου σε οισοφάγου- διαφοροποίηση ενδοδέρματος) foxa2 Ενδόδερμα Απώλεια πρόσθιου και μέσου αρχεντέρου Ο ρόλος τους στην τοπική εξειδίκευση αποδεικνύεται από το φαινότυπο των εκμηδενιστικών μεταλλαγμάτων τους 46

47 Καθορισμός Ενδοδέρματος Early endoderm patterning along the A-P axis is critical for fetal gut development Η διαμόρφωση (προτυποποίηση) του ΓΣ κατά μήκος του ΕΟ άξονα σε πρόσθιο- μέσο και οπίσθιο αρχέντερο These domains can be identified by the expression of transcription factors such as Hhex in the foregut Pdx1 in the midgut Cdx in the posterior endoderm Initially regional identity is plastic and when posterior mesoderm is experimentally recombined with early foregut endoderm it can repress liver and pancreas development, and the endoderm adopts an intestinal fate 47

48 Καθορισμός Ενδοδέρματος two major ways to specify the gut tube: (A)a global specification by a retinoic acid gradient that leads to expression of regionally specific transcription factors in the endoderm (activation or repress of particular sets of transcription factor genes) (B) signals from the lateral plate-derived mesenchymal cells help specify the endodermal regions. (Επαγωγικές αλληλεπιδράσεις) σπλαχνικό μεσόδερμα* (*μεσέγχυμα: μετά το κλείσιμο του αρχεντέρου, στιβάδα αδιαφοροποίητου μεσεγχύματος που περικλείει το επιθήλιο ΓΣ) 48

49 Retinoic acid: direct mechanism of cell specification the pharynx can develop only in areas containing little or no RA (studies on chick embryos using beads containing either retinoic acid or inhibitors of its synthesis ) Higher levels of RA specify the Pdxl gene that is essential for the duodenum, pancreas, and liver, as well as the csoxl gene that is expressed in the precursors of the stomach and esophagus Still higher concentrations of RA directly induce the posterior gene CdxA in the intestinal endoderm. This patterning of the axis by retinoic acid may represent one of the oldest developmental patterning mechanisms 49

50 Retinoic acid: direct mechanism of cell specification Δρα κατά κύριο λόγο στο πρόσθιο αρχέντερο (προάγει οπίσθιες δομές?) Στοχευμένη αδρανοποίηση Raldh2 (ένζυμο απαραίτητο για παραγωγή RA) Απουσία πνευμόνων, στομάχου, ραχιαίου παγκρέατος Ανώμαλος σχηματισμός ήπατος 50

51 Signals from mesoderm: 2nd mechanism of cell specification (regulates regional identity of the endoderm) The endoderm and the splanchnic lateral plate mesoderm undergo a complicated set of interactions Overlapping temporal and spatial gradients of : FGF Wnt/ β-catenin BMP secreted from the adjacent splanchnic mesoderm As the digestive tube meets different (regionally specific) mesenchymes, the mesenchyme cells instruct the endoderm to differentiate into esophagus, stomach, small intestine, and colon the signals for generating the different gut tissues appear to be conserved throughout the vertebrate classes 51

52 Περιπλοκότητα αλληλεπιδράσεων 1. Μεσέγχυμα * Ενδόδερμα 1 α. Επαγωγικά σήματα που καθορίζουν τοπική εξειδίκευση ενδοδέρματος (FGF, BMP) 1β. Επιτρεπτικά επαγωγικά σήματα απαιτούνται για αύξηση, μορφογένεση και ωρίμανση ενδοδέρματος (FGF10, εμπλέκεται σε σχηματισμό καταβολών πνευμόνων και του τυφλού του εντέρου- Στοχευμένη αδρανοποίηση σχετίζεται με έλλειψη αυτών των οργάνων και των καταβολών των άκρων) 2. Ενδόδερμα *Μεσέγχυμα (αντίστροφη σηματοδότηση) 3. Συνεχής σχετική μετατόπιση του μεσεγχύματος και του ενδοδέρματος (επιθηλίου) 52

53 Καθορισμός Ενδοδέρματος Foregut development requires repression of Wnt/β-catenin and FGF4 chick and Xenopus studies thymus, pancreas, stomach, and liver Sfrp5 posterior mesoderm repress foregut fate and promote hindgut development intestine during gastrulation and early somite stages, differential Wnt and FGF signaling along the A-P axis patterns the endoderm into foregut, midgut and hindgut progenitor domains that express the transcription factors Hhex, Pdx1 and Cdx respectively Wnt and FGF ligands expressed in a graded fashion in the mesoderm (red) signal to the adjacent endoderm (yellow) to repress foregut identity and promote hindgut fate. Secreted Wnt-antagonists expressed in the anterior endoderm are predicted to repress canonical Wnt/β-catenin activity 53

54 Καθορισμός Ενδοδέρματος Foregut development requires repression of Wnt/β-catenin and FGF4 chick and Xenopus studies ΟΠΙΣΘΙΟ ΣΗΜΑ posterior mesoderm Sfrp5 repress foregut fate and promote hindgut development Wnt proteins suppress genes such as Hhex (παρεμπόδιση σχηματισμού στομάχου, ήπατος, πάγκρεας) Experimentally blocking the activity of the canonical Wnt effector β-catenin in the Xenopus posterior endoderm is sufficient to ectopically activate Hhex expression and result in ectopic liver buds in the intestine Amazingly only hours later in development Wnt and FGF signaling have the opposite 54 effects and promote hepatic development!!!

55 Καθορισμός Ενδοδέρματος Early endoderm patterning along the A-P axis is critical for fetal gut development Early somite stage chick embryo at early stages of endoderm patterning. FGF4 and Wnt3 are expressed in posterior mesoderm Patterned E8.5 gut tube. Gene expression is now restricted to early organ domains along A-P axis. Nkx2.1 (green), Hex 1 (red), Pdx1 (orange) and Cdx2 and Cdx4 (blue). 55

56 Καθορισμός του ενδοδέρματος 1. Ωρίμανση και διαφοροποίηση ενδοδέρματος: απαιτεί δράση επιτρεπτικού επαγωγικού σήματος που παράγεται στο μεσέγχυμα 56

57 Καθορισμός του ενδοδέρματος Ανασυνδυασμός: Μεσέγχυμα + Επιθήλιο ΓΣ (από διαφορετικές περιοχές αναπτυσσόμενου ΓΣ εμβρύου όρνιθας) Ανασυνδυασμένο τμήμα Ανάπτυξη in vitro σε Επαναπρογραμματισμός διαφοροποίησης ενδοδέρματος (ταυτόσημος της θέσης προέλευσης μεσοδέρματος) σε μία ουδέτερη θέση (ΙΣΧΥΕΙ ΓΙΑ ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΗ ΙΣΤΩΝ) Πειράματα ανασυνδυασμού ανάμεσα στο ενδόδερμα και στο μεσέγχυμα του εντέρου του εμβρύου της όρνιθας. 57

58 Καθορισμός του ενδοδέρματος Μεταμόσχευση in ovo : Εμπρόσθιο ενδόδερμα + οπίσθιο μεσόδερμα επαναπρογραμματισμός σε οπίσθιο ενδόδερμα Οπίσθιο ενδόδερμα + εμπρόσθιο μεσόδερμα ΌΧΙ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ εμπρόσθιο ενδόδερμα (περιοχές του μελλοντικού οισοφάγου/στομάχου): δεκτικές στο σχηματισμό εντερικού επιθηλίου μέχρι την ημέρα 4,5. οπίσθιο ενδόδερμα (Μελλοντική περιοχή του εντέρου που εκφράζει cdxa): αποκτά μηαντιστρεπτή δέσμευση ως την ημέρα

59 Καθορισμός Ενδοδέρματος 2. Signals from endoderm to mesoderm (regulate regional identity of the mesoderm) Shh ενδοδέρματος αρχεντέρου: ακτινωτή διαβάθμιση [Shh] στο μεσέγχυμα ελέγχει διαφοροποίηση στιβάδων ώριμου ΓΣ (regional differentiation of the mesoderm into smooth muscle types) lamina propria- ίδιος υμένας Muscularis mucosa- μυοβλεννογόνος Submucosa-Υποβλεννογόνος smooth muscle-λείος μυϊκός ιστός Κυκλοπαμίνη (καταστολέας μονοπατιού Shh): παρεμπόδιση σχηματισμού τοπικού προτύπου μεσεγχύματος (Heath JK. Current Topics in Developmental Biology 90:159, 2010) 59

60 Καθορισμός Ενδοδέρματος Shh is secreted in different concentrations at different sites its targets: the mesoderm surrounding the gut tube. Secretion of Shh by the hindgut endoderm (οπίσθιο αρχέντερο): induces a nested pattern of "posterior" Hox gene expression in the mesoderm The Hox genes are thought to specify the mesoderm so that it can interact with the endodermal tube and specify its regions. Once the boundaries of the transcription factors are established, differentiation can begin. The regional differentiation of the mesoderm (into smooth muscle types) and the regional differentiation of the endoderm (into different functional units such as the stomach, duodenum, small intestine, etc.) are synchronized. 60

61 Καθορισμός Ενδοδέρματος Στόμαχος εμβρύου όρνιθας: προστόμαχος + μυϊκός στόμαχος προστόμαχος μυϊκός στόμαχος (Ε8) πρόλοβος προστόμαχος μυϊκός στόμαχος (Sohal et al., International Journal of Developmental Neuroscience 20:619, 2002) Αδενικό επιθήλιο (όπως στα θηλαστικά) Πλακώδες επιθήλιο (και παχύ μυϊκό 61 τοίχωμα)

62 Καθορισμός Ενδοδέρματος Πειράματα ανασυνδυασμού επιθηλίου-μεσεγχύματος στην όρνιθα μέχρι την ημέρα 9: Επιθήλιο προστομάχου + Μεσέγχυμα μυϊκού στομάχου διαφοροποίηση επιθηλίου προστομάχου σε επιθήλιο μυϊκού στομάχου Επιθήλιο μυϊκού στομάχου + Μεσέγχυμα προστομάχου διαφοροποίηση επιθηλίου μυϊκού στομάχου σε επιθήλιο προστομάχου προστόμαχος μυϊκός στόμαχος Οι δύο περιοχές του στομάχου μπορούν να υποκαταστήσουν η μία την άλλη, διαφοροποιούμενες μέσω επαγωγής από σήματα του μεσεγχύματος 62

63 Καθορισμός Ενδοδέρματος Οι παράγοντες ΒΜΡ του μεσεγχύματος του προστομάχου δρουν επαγωγικά στην ανάπτυξη αδενικού επιθηλίου αδενικό (Yasugi and Fukuda, Zoological Science 17:1, 2000) noggin ΒΜΡ πλακώδες + ΒΜΡ διαφοροποίηση σε αδενικού τύπου επιθήλιο Νkx2.3 Shh * (ενδόδερμα) ΒΜΡ (μεσέγχυμα) 63

64 Οι επικράτειες έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες σημαντικούς για την ανάπτυξη του ΓΣ στις στιβάδες του ενδοδέρματος και του μεσοδέρματος του πρώιμου εντέρου της όρνιθας. (Κατά Roberts). Η ανάπτυξη των προτύπων έκφρασης αυτών των γονιδίων καθοδηγείται από το σύστημα εγκαθίδρυσης προτύπου κατά μήκος του ΕΟ άξονα κατά την πρώιμη 64 ανάπτυξη εμβρύου

65 Καθορισμός Ενδοδέρματος ΜΤΓΦ παράγοντες Τοπική έκφραση Περιοχή ελέγχου πχ. Hoxd13 Μεσόδερμα Ρυθμίζουν μέσω επαγωγής το τοπικό πρότυπο ενδοδέρματος Έκτοπη έκφραση Hoxd13 στο μεσέγχυμα του μέσου (vs. nl οπίσθιου) αρχεντέρου το αντίστοιχο επιθήλιο του μέσου αρχεντέρου δεν διαφοροποιείται ως επιθήλιο λεπτού αλλά ως επιθήλιο παχέος εντέρου 65

66 Καθορισμός Ενδοδέρματος Κάποιοι παράγοντες εκφράζονται και σε πιο πρώιμα στάδια ανάπτυξης cdxa εκφράζεται στο οπίσθιο τμήμα αρχικής λωρίδας εμβρύου όρνιθας (στάδιο 3 έως στάδιο 10 = περίοδος πρώιμης έκφρασης γονιδίου) Το γονίδιο εκφράζεται πολύ αργότερα εκ νέου, σε όψιμα στάδια ανάπτυξης στο οπίσθιο ενδόδερμα 66

67 Καθορισμός Ενδοδέρματος Aρκετοί από αυτούς τους παράγοντες εκφράζονται και σε πιο όψιμα στάδια ανάπτυξης ΓΣ (τελική διαφοροποίηση ΓΣ) Γονίδιο Πρώιμο στάδιο Όψιμο στάδιο pdx1 Σχηματισμός παγκρέατος Εκφράζεται ειδικά σε κύτταρα β, ελέγχει έκφραση insulin Nkx2.1 Σχηματισμός θυρεοειδούς Ρυθμίζει έκφραση θυρεοειδικών γονιδίων thyroglobulin, thyroperoxidase 67

68 Καθορισμός Ενδοδέρματος Σύστημα ΕΟ προτύπου πρώιμης ανάπτυξης: εξαρτάται από ένα σήμα επαγωγής «οπίσθιων δομών» που παράγεται κατά την γαστριδίωση (FGFs, Wnts, retinoic acid) Στόχοι «οπίσθιου» σήματος: οικογένεια cdx Ενεργοποίηση Hox (ΜΕΣ) 68

69 Σχηματισμός του ήπατος 69

70 Σχηματισμός του ήπατος The largest internal organ Essential metabolic, exocrine and endocrine functions. Ηepatocytes (70% of the mass of the adult organ) and biliary epithelial cells are derived from the embryonic endoderm (stromal cells, stellate cells, kuppfer cells and blood vessels, are of mesodermal origin ) production of bile metabolism of dietary compounds Detoxification regulation of glucose levels through glycogen storage control of blood homeostasis (secretion of clotting factors and serum proteins such as albumin) 70

71 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος Από μία κοιλιακή καταβολή του πρόσθιου αρχεντέρου το οποίο αναπτύσσεται σε μέγεθος μέσα στο κοιλιακό μεσέγχυμα (καλείται ενδιάμεσο διάφραγμα, septum transversum, στα έμβρυα των θηλαστικών) 71

72 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος Πρώιμη καταβολή ήπατος στο έμβρυο του ποντικού Ηπατοβλάστες - (Hex) Eνδόδερμα - (Foxa2) Πυρήνες Το κοιλιακό εκκόλπωμα του πρόσθιου αρχεντέρου αναπτύσσεται μέσα στο κοιλιακό μεσέγχυμα (ενδιάμεσο διάφραγμα) 72

73 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος Embryological experiments in animal models: liver development occurs through a progressive series of reciprocal interactions between the embryonic endoderm and nearby mesoderm Hepatogenesis: regulated by genes and molecular pathways Recently, application of this knowledge has enabled researchers to produce hepatic-like tissue from embryonic stem (ES) cells in vitro, which may ultimately lead to therapeutically useful tissue for transplantation 73

74 Σχηματισμός του ήπατος Ημέρα e9.0: Πρώτη μορφολογική ένδειξη εμβρυικού ήπατος Ηπατικό εκκόλπωμα επιθηλίου πρόσθιου αρχεντέρου (κοιλιακό) γειτονικά στην αναπτυσσόμενη καρδιά At e9.5: the hepatic endoderm cells, known as hepatoblasts invade the adjacent septum transversum mesenchyme (STM) to form the liver bud The STM contributes fibroblasts and stellate cells of the liver. Between e10 15: the liver bud undergoes a period of accelerated growth as it is vascularized and colonized by hematopoietic cells to become the major fetal hematopoietic organ 74

75 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος Επαγωγικό σήμα σχηματισμού ήπατος: 1. Παράγοντες FGF (FGF1, FGF2) από το παρακείμενο καρδιογενικό μεσόδερμα 2. Παράγοντες ΒΜΡ από το παρακείμενο κοιλιακό μεσέγχυμα (ενδιάμεσο διάφραγμα) 3. Άγνωστα μόρια που παράγονται από τα αιμοφόρα αγγεία Zong Υ and Stanger BZ, Developmental Biology 1(5), DOI: /wdev.47

76 ενδόδερμα ενδόδερμα FGF διατήρηση έκφρασης Shh στο ενδόδερμα (απουσία Shh κοιλιακό πάγκρεας) 76

77 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΤΕΚΜΗΡΙΑ (-)Καταστολή μονοπατιού FGF παρεμπόδιση επαγωγής ήπατος (+)Απομονωμένο ηπατικό ενδόδερμα + FGF In vitro επαγωγή σχηματισμού ήπατος Πειράματα ανασυνδυασμού: Μεσέγχυμα από έμβρυο: Χωρίς BMP4 (στοχευμένη αδρανοποίηση bmp4) Χωρίς αιμοφόρα αγγεία ΜΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΗΠΑΤΙΚΟΥ ΕΝΔΟΔΕΡΜΑΤΟΣ Zong Υ and Stanger BZ, Developmental Biology 1(5), 2012 DOI: /wdev.47 77

78 Σχηματισμός του ήπατος 1. Παράγοντες FGF από το παρακείμενο καρδιογενικό μεσόδερμα Different concentrations of FGF are critical for segregating different foregut organ lineages (from a common progenitor cell population): high, intermediate and low levels of FGF signaling promoting lung, liver and ventral pancreas respectively It is still unclear whether it is the proximity, or the length of time that the endoderm is in contact with the cardiac mesoderm that controls the FGF dose. This process may be regulated in part by the homeobox gene Hhex, which regulates the proliferation of foregut endoderm cells and causes the epithelium to move in relation to the FGFsecreting cardiac mesoderm during development the heart endothelial cells have a developmental function in addition to their circulatory roles: they induce the formation of the liver bud by secreting FGFs.

79 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος Παράγοντες FGF: πρώιμη τοπική εξειδίκευση ενδοδέρματος στο στάδιο αρχικής λωρίδας (διαφοροποίηση οπίσθιου τμήματος) Παράγοντες FGF1,2: επαγωγή σχηματισμού ηπατικού εκκολπώματος από το πρόσθιο αρχέντερο σε πιο όψιμο στάδιο ανάπτυξης Το ίδιο σήμα είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί σε διαφορετικά επαγωγικά φαινόμενα κατά την ανάπτυξη (FGF10: εμπλέκεται σε σχηματισμό πνευμόνων και τυφλού εντέρου) 79

80 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος Κοιλιακή καταβολή Signals from the axial mesoderm (candidates included FGF4 and Wnt ligands) repress hepatic fate in the dorsal (ραχιαίο) endoderm. Πρόσθιο τμήμα εμβρύου ποντικού e8.25 (2 4 somite stage) The developing head is shown in grey. Foregut endoderm isolated after the 5 7 somite stage will express liver genes such as albumin, indicating that hepatic fate is specified. 80

81 Σχηματισμός του ήπατος Καθορισμός του ενδοδέρματος The expression of liver-specific genes (eg. a-fetoprotein, albumin) can occur in any region of the gut tube that is exposed to cardiogenic mesoderm. However, this induction can occur only if the notochord is removed. If the notochord is placed by the portion of the endoderm normally induced by the cardiogenic mesoderm to become liver, the endoderm will not form liver (hepatic) tissue. the developing heart appears to induce the liver to form, while the presence of the notochord inhibits liver formation 81

82 Σχηματισμός του ήπατος 3. Άγνωστα μόρια που παράγονται από τα αιμοφόρα αγγεία Blood vessel endothelial cells are also critical. If endothelial cells are not present in the area around the hepatic region of the gut tube, the liver buds fail to form. This induction occurs even before the endothelial cells have formed tubes, so it does not have anything to do with getting nutrients or oxygen into the region. Στοχευμένη αδρανοποίηση Flk1 που κωδικοποιεί τον υποδοχέα του VEGF Δεν αναπτύσσεται φυσιολογικά το ηπατικό ενδόδερμα αν απουσιάζουν αγγεία από το μεσέγχυμα 82

83 Σχηματισμός του ήπατος But in order to respond to the FGF signal, the endoderm has to become competent. This competence is given to the foregut endoderm by the forkhead transcription factors. Forkhead transcription factors Foxal and Foxa2 are required to open the chromatin surrounding the liver-specific genes. These proteins displace nucleosomes from the regulatory regions surrounding these genes and are required before the FGF signal is given Mouse embryos lacking Foxal expression in their endoderm fail to produce a liver bud or to express liver-specific enzymes. 83

84 Σχηματισμός του ήπατος Αφού σχηματιστεί η καταβολή του ήπατος: Καθορισμός του ενδοδέρματος Η μετέπειτα αύξησή του προϋποθέτει τη δράση πολλών παραγόντων, ανάμεσα στους οποίους και αυτούς του μονοπατιού Wnt. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΤΕΚΜΗΡΙΑ Υπερέκφραση β-κατενίνης σε ήπαρ εμβρύου όρνιθας προαγωγή αύξησης οργάνου Υπερέκφραση καταστολέων μονοπατιού Wnt περιορισμός της αύξησης του οργάνου MAP kinase pathway regulates hepatic gene expression PI3 kinase pathway promotes hepatic growth HNF4a (forkhead transcription factor) is essential for the morphological and biochemical 84 differentiation of the hepatic bud into liver tissue

85 Σχηματισμός του ήπατος Κοιλιακό μεσέγχυμα (ενδιάμεσο διάφραγμα) A possible model for the mechanism of early hepatic specification (Konoshita and Miyajima BBA (Biochimica et Biophysica Acta) - Molecular Cell Research 1592:303, 2002) Generation of the hepatic primordium from the foregut endoderm requires at least two different signals, i.e., BMP and FGF family proteins. These proteins are produced by mesenchymal cells in septum transversum and cardiac organ, respectively. Although intracellular signaling mechanisms are yet unclear, several lines of evidence indicated that GATA and HNF3 transcription factors play critical roles in inducing liverspecific or enriched proteins including albumin and HNF4. 85

86 Σχηματισμός του παγκρέατος 86

87 Πάγκρεας Έντονο ενδιαφέρον για λόγους υγείας cancer 87

88 Πάγκρεας Εξωκρινή κύτταρα (διατεταγμένα σε κυψελίδες, acini) Σύνθεση πεπτικών ενζύμων δίκτυο αγωγών δωδεκαδάκτυλο ΚΑΙ ΟΙ ΔΥΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΕΝΔΟΔΕΡΜΑ Ενδοκρινή κύτταρα (διατεταγμένα σε νησίδες Langerhans, Islet) Σύνθεση ορμονών αίμα Stimulus-Secretion Coupling in the Pancreatic Beta-Cell, Juhl K. and Hutton J. From: Immunology of Type 1 Diabetes, Eisenbarth GS Ed, Sprinder, 2004, ISBN: , 2 nd Edition 88

89 Πάγκρεας Eξωκρινής μοίρα Δομή του ιστού του παγκρέατος που παράγει ένζυμα. Μία κυψελίδα συνιστά μία εκκριτική μονάδα. Στις άκρες των εξωκρινών κυττάρων διακρίνονται άφθονα κοκκία ζυμογόνου (προ-ένζυμα). (Β) Φωτομικρογραφία κυψελιδωτού ιστού παγκρέατος (x200) Marieb E.N & Hoehn K, (2005), Human Anatomy & Physiology 89 Seventh Edition, Pearson Benjamin Cummings, San Francisco, USA

90 Πάγκρεας Eνδοκρινής μοίρα (10% στο έμβρυο, 1-2% στο ενήλικο άτομο) Νησίδες Langerhans: Σύνθεση ορμονών αίμα 90 National Institutes of Health (NIH), Department of Health and Human Services (DHHS), (2009), 7. Stem Cells and Diabetes

91 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας ΕΝΔΟΔΕΡΜΑ Επιθηλιακά κύτταρα ΠΑΓΚΡΕΑΤΙΚΟ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑ Σπλήνας Αιμοφόρα αγγεία και παγκρεατικός συνδετικός ιστός 91

92 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Η ανάπτυξη των παγκρεατικών καταβολών στο ανθρώπινο έμβρυο Το πάγκρεας αναπτύσσεται από μία ραχιαία (μεγάλη) και μία κοιλιακή (μικρότερη) καταβολή του δωδεκαδακτύλου (ζεύγος κοιλιακών στην όρνιθα) Οι καταβολές επεκτείνονται, συγκλίνουν. Larsen Human Embryology. Churchill Livingstone, fig

93 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας..και συντήκονται Κάθε αρχική καταβολή φέρει έναν αγωγό ραχιαία Παγκρεατικοί αγωγοί: Κοιλιακή καταβολή: κύριος παγκρεατικός αγωγός Ραχιαία καταβολή: βοηθητικός παγκρεατικός αγωγός κοιλιακή Στον άνθρωπο, μόνο ο κοιλιακός αγωγός χρησιμοποιείται για να μεταφέρει τα πεπτικά ένζυμα στο έντερο, ενώ σε άλλα είδη (πχ. σκύλος) χρησιμοποιούνται τόσο ο ραχιαίος όσο και ο κοιλιακός αγωγός. 93 Larsen Human Embryology. Churchill Livingstone, fig. 9.6

94 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Ποντικός Ε9,5: ραχιαία καταβολή, κοιλιακή 2 ημέρες αργότερα Ενδοκρινή κύτταρα: παρόντα στις πρώιμες καταβολές-παράγουν περισσότερες από μία ορμόνες (σε αντίθεση με τα ώριμα ενδοκρινή κύτταρα, άρα δεν αποτελούν προγόνους τους) Έμβρυα ποντικού σταδίου E9.5 και E10.5 Χρώση για το γονίδιο Pdx, το οποίο εκφράζεται στις περιοχές του εμβρυικού ΓΣ από τις οποίες αναπτύσσεται το πάγκρεας Ε14,5-Ε18,5: ταχεία αύξηση καταβολών, αριθμού ενδοκρινών κυττάρων και διαφοροποίηση εξωκρινών κυττάρων 94

95 Aνάπτυξη του παγκρέατος στον ποντικό Στάδια E9.5- E12.5: πρωτογενής μετάβαση (εξειδίκευση παγκρεατικών προγονικών κυττάρων, παρουσία πρώτων ενδοκρινών κυττάρων, αρχή μορφογένεσης διακλαδωτού επιθηλίου) Στάδια E12.5 και μετά: δευτερογενής μετάβαση: μαζική εξειδίκευση και ανάπτυξη ενδοκρινούς παγκρέατος, μορφογένεση αγωγών, διαφοροποίηση εξωκρινούς σειράς) Collombat et al., Mechanisms of Development (7):501, 2006

96 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Το τμήμα του ενδοδέρματος με πεπρωμένο για ραχιαίο και κοιλιακό πάγκρεας διαμορφώνεται και εξειδικεύεται υπό την επίδραση εκκρινόμενων μορίων και σηματοδοτικών μονοπατιών που παρέχονται από γειτονικά κύτταρα και ιστούς. The pancreatic program is the default state for this domain of endoderm (προκαθορισμένο πεπρωμένο) 96

97 Ραχιαία καταβολή: εμφανίζεται σε περιοχή ενδοδέρματος αρχεντέρου που γειτνιάζει με νωτοχορδή Κοιλιακή καταβολή: εμφανίζεται σε περιοχή ενδοδέρματος αρχεντέρου που γειτνιάζει με το ήπαρ 97

98 Κοιλιακή καταβολή Απουσία FGF, BMP Zaret KS, Nature Reviews Genetics 3, (2002) Ventral foregut endoderm is multipotent (can develop into various tissues) as a result of : 1) the expression of transcription factors in the endoderm (Foxa proteins 2) signals that affect the endoderm, including bone morphogenetic proteins (BMPs) from the adjacent cells of STM* During tissue specification, FGF signals from the cardiogenic mesoderm, perhaps in conjunction with BMP signals from the STM, initiate the liver gene programme in proximal endoderm, as well as blocking that for pancreas. Ventral endoderm cells sufficiently distal to the cardiogenic mesoderm escape the latter inhibitory effect and initiate the pancreatic gene programme. (*)septum transversum mesenchyme: κοιλιακό μεσέγχυμα (ενδιάμεσο διάφραγμα) 98

99 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Κοιλιακή καταβολή Απουσία FGF, BMP Πώς απομακρύνεται η κοιλιακή καταβολή από το καρδιογενικό μεσόδερμα???? Κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη μετακινείται το κοιλιακό πρόσθιο αρχέντερο έτσι ώστε η περιοχή που θα σχηματίζει το κοιλιακό πάγκρεας να μην εκτίθεται σε παράγοντες FGF hex-/- απουσία κοιλιακού παγκρέατος όχι επειδή είναι κύριος μεταγραφικός ρυθμιστής παγκρέατος αλλά λόγω απουσίας αύξησης και μετακίνησης κοιλιακού πρόσθιου αρχεντέρου μακρυά από το σύστημα FGF/καρδιά 99

100 Κοιλιακή καταβολή Απουσία FGF, BMP Ventral foregut explants were found to initiate liver gene expression, if exposed to cardiogenic mesoderm or FGF, or initiate pancreatic gene expression in the absence of such effectors. The pancreatic program is the default state for this domain of endoderm Zaret KS, Nature Reviews Genetics 3, (2002) 100

101 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Κοιλιακό (V) παγκρεατικό ενδόδερμα (γειτνιάζει με ήπαρ) Απουσία σηματοδότησης FGF, BMP Ραχιαίο (D) παγκρεατικό ενδόδερμα Επιτρεπτική σηματοδότηση ρετινοϊκού οξέος (RA) και FGF/ACTIVIN από το παραξονικό μεσόδερμα και τη νωτοχορδή (Mastracci TL and Sussel L. WIREs Dev Biol 2011 doi: /wdev.44) ο ρόλος της νωτοχορδής είναι επιτρεπτικός κι όχι καθοδηγητικός (δεν προκαλεί επαγωγή σε πιο οπίσθιες θέσεις). 101

102 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Ραχιαίο (D) παγκρεατικό ενδόδερμα Νωτοχορδή: ενεργοποιεί την ανάπτυξη του παγκρέατος καταστέλλοντας την έκφραση του shh στο ενδόδερμα. Η shh εκφράζεται σε όλο το ενδόδερμα του ΓΣ εκτός από την περιοχή που θα σχηματίσει το πάγκρεας. Αυτό συμβαίνει γιατί η νωτοχορδή σε αυτό το σημείο της επαφής με το αρχέντερο εκκρίνει Fgf2 και activin οι οποίες καταστέλουν την έκφραση του shh. Aν (με διάφορους πειραματικούς χειρισμούς) εκφραστεί το γονίδιο shh σε αυτήν την περιοχή, τότε δημιουργείται εντερικό επιθήλιο κι όχι παγκρεατικό. 102

103 Σχηματισμός του παγκρέατος this particular region of the digestive tube has the ability to become either pancreas or liver. Τwo sets of conditions: Επαφή με καρδιά (+) αλλά με νωτοχορδή (-) επαγωγή ήπατος Επαφή με νωτοχορδή (+) αλλά με καρδιά (-) επαγωγή παγκρέατος Η επαγωγή του παγκρέατος είναι η αντιδιαμετρική όψη του σχηματισμού του ήπατος Κοιλιακή καταβολή παγκρέατος : αναπτύσσεται λόγω απουσίας σηματοδότησης FGF Ραχιαία καταβολή παγκρέατος: επάγεται από σηματοδότηση FGF Και οι 2 καταβολές: προαπαιτούν καταστολή έκφρασης shh 103

104 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Η απουσία πρωτεΐνης Shh σε αυτό το σημείο του ΓΣ τον κάνει επιδεκτικό σε σήματα που έρχονται από το ενδοθήλιο των κύριων αιμοφόρων αγγείων. ραχιαία κοιλιακή Mouse embryo Η ανάπτυξη των παγκρεατικών καταβολών ξεκινάει από αυτά ακριβώς τα σημεία της επαφής του ενδοδέρματος του πρόσθιου αρχεντέρου με το ενδοθήλιο της αορτής και της λεκιθικής φλέβας, σημεία του αρχεντέρου στα οποία εκφράζονται (επάγονται) οι μεταγραφικοί παράγοντες Pdx1 και Ptf1. Απομάκρυνση αιμοφόρων αγγείων από αυτήν την περιοχή καταστολή έκφρασης Pdx1 και Ptf1 δεν σχηματίζονται παγκρεατικές καταβολές Σχηματισμός περισσότερων αγγείων σε αυτήν την περιοχή περισσότερο εκτεταμένη περιοχή του ενδοδέρματος του γαστρεντερικού σωλήνα σχηματίζει παγκρεατικούς ιστούς. 104 (Gilbert SF, Developmental Biology 9 th Ed, Sinauer Associates, Inc. 2010)

105 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας ραχιαία 2 κοιλιακές καταβολές Στο έμβρυο της όρνιθας στο οποίο υπάρχουν και οι δύο λεκιθικές φλέβες, στα σημεία της επαφής τους με το πρόσθιο αρχέντερο σχηματίζονται δύο κοιλιακές παγκρεατικές καταβολές. Chick embryo 105 (Gilbert SF, Developmental Biology 9 th Ed, Sinauer Associates, Inc. 2010)

106 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Ρετινοϊκό οξύ Απαραίτητο σε πρώιμο στάδιο για σχηματισμό παγκρεατικών καταβολών Καταστολέας RA (BMS453): παρεμποδίζει σχηματισμό καταβολών Προσθήκη εξωγενούς RA: προάγει ανάπτυξη ενδοκρινούς μοίρας 106

107 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Αύξηση και διαφοροποίηση παγκρεατικών καταβολών: από το παγκρεατικό μεσέγχυμα Islet-1, FGF10 1. Επιτρεπτική επαγωγική επίδραση 2. Επηρεάζουν αναλογίες κυτταρικών τύπων που αναπτύσσονται κατά τη διαφοροποίηση ενδοδέρματος (πχ. αριθμό ή διαφοροποίηση ενδοκρινών κυττάρων) Ανάπτυξη ενδοκρινούς μοίρας παγκρέατος: ευνοείται από ένα άγνωστο σήμα που παράγεται από τα αιμοφόρα αγγεία Πειράματα ανασυνδυασμού Παγκρεατικές καταβολές + αιμοφόρα αγγεία αύξηση % ενδοκρινών κυττάρων 107

108 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Εξωκρινή και ενδοκρινή κύτταρα: έχουν τον ίδιο κυτταρικό πρόγονο The growth of the pancreas takes place at the tips of the endodermal buds. Here, the cells are multipotent, giving rise to endocrine cells, exocrine cells, and duct cells. However, after a particular time, these multipotent cells lose the ability to produce endocrine cell types. 108

109 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Pdx1: κύριος ΜΓΦΡ παράγοντας για το πάγκρεας εκφράζεται στο τμήμα ΓΣ από το οποίο μελλοντικά θα προκύψουν οι παγκρ. καταβολές Αρχικά εκφράζεται σε ολόκληρη την καταβολή, μετά στα κύτταρα β (ινσουλίνη*) απαραίτητος για σχηματισμό όλων των κυτταρικών τύπων παγκρέατος (Pdxl- expressing cells: give rise to all three types of pancreatic tissue (exocrine, endocrine, and duct cells, παγκρ. αγωγοί) ***(έκτοπη έκφρασή του σε άλλη περιοχή αναπτυσσόμενου ΓΣ δεν επάγει σχηματισμό παγκρέατος) Pdxl can respecify developing liver tissue into pancreas. Critical factor in distinguishing the liver from the pancreatic mode of development. 109

110 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Pdx1 FUNCTIONS budding from the gut epithelium represses the expression of genes that are characteristic of other regions of the digestive tube maintains the repression of shh initiates (but does not complete) islet cell differentiation is necessary (but not sufficient) for insulin gene expression 110

111 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Εξωκρινή και ενδοκρινή κύτταρα: έχουν τον ίδιο κυτταρικό πρόγονο Ptf1a εκφράζεται σε παγκρεατικές καταβολές και τα επίπεδά του ρυθμίζουν την αναλογία των κυττάρων σε κάθε σειρά. Εξωκρινή κύτταρα: έχουν υψηλότερα επίπεδα Ptf1a (* γονιδίων που ενέχονται σε εξωκρινή δράση). PTF p48(-): απουσία κοιλιακής καταβολής Ελάχιστη ανάπτυξη ραχιαίας, χωρίς εξωκρινείς ιστούς 111

112 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Sox9 Απαραίτητος για αύξηση παγκρεατικών καταβολών Διατηρεί έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν υποδοχείς του σήματος FGF10 που παράγεται στο μεσέγχυμα 112

113 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Νeurogenin 3: ο κύριος παράγοντας που προάγει διαφοροποίηση ενδοκρινούς σειράς Εκφράζεται σε μερικά διάσπαρτα κύτταρα των παγκρεατικών καταβολών Οι πρόδρομοι των ενδοκρινών κυττάρων που εκφράζουν ngn3 καταστέλλουν την ανάπτυξη των παρακείμενων κυττάρων μέσω πλευρικής αναστολής που βασίζεται στο σύστημα Delta-Notch Ενδοκρινή κύτταρα νησίδων: εκκρίνουν VEGF για να προσελκύσουν αιμοφόρα αγγεία τα οποία στη συνέχεια περιβάλουν τη νησίδα. 113

114 Η ανάπτυξη του παγκρέατος όπως αποκαλύπτεται μετά από ανοσοχρώση έναντι μορίων που εκφράζονται σε διάφορα στάδια χοληδόχου κύστης (α) Ε10: οι καταβολές του παγκρέατος εκφράζουν έντονα τον μεταγραφικό παράγοντα Pdx1 (πρωτογενή ενδοκρινή κύτταρα με γλυκαγόνη σε ραχιαία καταβολή-αργότερα και σε κοιλιακή ) (β) Ε15,5: τα πρόδρομα κύτταρα των οριστικών ενδοκρινών κυττάρων εκφράζουν Ngn3, παγκρεατικό επιθήλιο καδερίνη Ε (γ) Ε17,5: ξεκινά ο σχηματισμός των νησίδων. Ανοσοχρώση για ινσουλίνη/β-κύτταρα και τα γλυκαγόνη/α-κύτταρα δ) Στις ώριμες νησίδες τα κύτταρα β αποτελούν την πλειοψηφία και εκφράζουν ινσουλίνη. Γλυκαγόνη σε α-κύτταρα 114

115 Σχηματισμός του παγκρέατος Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Pax4, Pax6: απαραίτητοι για σχηματισμό ενδοκρινών κυττάρων Στοχευμένη αδρανοποίηση Pax4: έλλειψη κυττάρων β και δ Στοχευμένη αδρανοποίηση Pax6: έλλειψη κυττάρων α Nkx6.1, Nkx2.2: απαραίτητοι για ανάπτυξη κυττάρων β σε πιο όψιμα στάδια ανάπτυξης MafA: απαραίτητος για την ωρίμανση των κυττάρων β Arx: σχηματισμός κυττάρων α. Στοχευμένη αδρανοποίηση: έλλειψη α και παράλληλα αύξηση κυττάρων β και δ 115

116 Σύνοψη 1. Το ενδόδερμα συνιστά την εσώτερη από τις 3 βλαστικές στοιβάδες που σχηματίζονται κατά τη γαστριδίωση 2. Από το ενδόδερμα προκύπτει το επιθήλιο του ΓΣ και οι αποφύσεις από τις οποίες σχηματίζονται το ήπαρ, το πάγκρεας και το αναπνευστικό σύστημα 3. Η οργάνωση του ΓΣ είναι ίδια σε όλα τα σπονδυλωτά (φάρυγγας, οισοφάγος, στόμαχος, ήπαρ, πάγκρεας, λεπτό και παχύ έντερο) 4. Το ενδόδερμα και το μεσέγχυμα των επιμέρους τμημάτων του ΓΣ αναπτύσσονται από διαφορετικά τμήματα του εμβρύου 5. Στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του ΓΣ απαιτείται σηματοδότηση nodal για την έκφραση γονιδίων όπως τα Sox17 και mixer στο ενδόδερμα 6. Η τοπική εξειδίκευση στο ΓΣ βασίζεται σε επαγωγικά σήματα που παράγονται στο μεσέγχυμα. 7. Ο σχηματισμός ήπατος προϋποθέτει σηματοδότηση FGF από το καρδιακό μεσέγχυμα 8. Η καταστολή της έκφρασης του shh στο ενδόδερμα είναι απαραίτητη για το σχηματισμό των παγκρεατικών καταβολών ενώ το μονοπάτι FGF απαιτείται για την αύξησή τους 9. Ο παράγοντας Pdx1 απαιτείται για την ανάπτυξη όλων των τύπων παγκρεατικών κυττάρων. Τα εξωκρινή κύτταρα έχουν υψηλότερα επίπεδα PTF1. O παράγοντας neurogenin 3 είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη των ενδοκρινών κυττάρων. 116