Δίκτυο κυτταροκινών στην έναρξη ή/και εξέλιξη της ανοσολογικής συμπεριφοράς: Μελέτη του ρόλου της λεπτίνης σε θρομβωτικά μοντέλα.

Transcript

1 Δίκτυο κυτταροκινών στην έναρξη ή/και εξέλιξη της ανοσολογικής συμπεριφοράς: Μελέτη του ρόλου της λεπτίνης σε θρομβωτικά μοντέλα. The cytokine network in the initiation and/or proliferation of immune response: A study regarding the role of leptin in coagulation ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΤΟΥ ΣΤΑΥΡΟΥ ΡΑΦΑΗΛ ΒΙΟΛΟΓΟΥ Α ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΡΙΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΥΠΟΛΗ 2007

2

3 ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Α ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ Δίκτυο κυτταροκινών στην έναρξη ή/και εξέλιξη της ανοσολογικής συμπεριφοράς: Μελέτη του ρόλου της λεπτίνης σε θρομβωτικά μοντέλα. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΡΙΤΗΣ (Aν. Kαθ. Παθολογίας Επιβλέπων) 2. ΓEΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ (Kαθ. Παθολογίας) 3. ΣΤΑΜΑΤΙΑ ΚΩΤΣΙΟΥ (Aν. Kαθ. Παθολογίας) ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΡΙΤΗΣ (Αναπληρωτής Καθηγητής Επιβλέπων) 2. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ (Καθηγητής) 3. ΣΤΑΜΑΤΙΑ ΚΩΤΣΙΟΥ (Αναπληρώτρια Καθηγήτρια) 4. ΔΗΜΟΣΘΕΝΗΣ ΜΠΟΥΡΟΣ (Καθηγητής) 5. ΕΥΘΥΜΙΟΣ ΣΙΒΡΙΔΗΣ (Καθηγητής) 6. ΙΩΑΝΝΗΣ ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΟΣ (Αναπληρωτής Καθηγητής) 7. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΜΙΜΙΔΗΣ (Επίκουρος Καθηγητής) ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΥΠΟΛΗ 2007

4

5 στον αδελφό μου, Φάνη

6

7 Περιεχόμενα -Πρόλογος 11 -Συντομογραφίες 16 -Περίληψη 18 -Abstract 20 Α. Εισαγωγή Ιστικός παράγοντας (Tissue factor-tf) 1.1 Σύντομη ιστορική αναδρομή του TF στον καταρράκτη της 24 πήξης 1.2 Πρωτεΐνη του TF: η θέση της στον πηκτικό μηχανισμό Δομικές και βιοχημικές ιδιότητες του TF Δομή του γονιδίου του TF Πρωτεΐνη του TF Βασική μεταγραφική έκφραση Επαγόμενη έκφραση του TF Αλληλεπιδράσεις μεταξύ του TF και FVIIα Εντοπισμός του TF: προέλευση και κατανομή Κατανομή Έκφραση του TF στο αγγειακό τοίχωμα Διαλυτός προερχόμενος από το αίμα TF Λεπτίνη 2.1 Σύνθεση, έκκριση και κύριες βιολογικές λειτουργίες Δομή του γονιδίου και της πρωτεΐνης της λεπτίνης Υποδοχείς λεπτίνης και μετάδοση σήματος Το κλασσικό και τα εναλλακτικά μονοπάτια μετάδοσης 41 σήματος μέσω του υποδοχέα της λεπτίνης 2.5 Σύνδεση ενεργειακής ομοιόστασης και ανοσοποιητικού 44 συστήματος μέσω λεπτίνης 7

8 2.6 Δράσεις της λεπτίνης ως προ-φλεγμονώδης κυτταροκίνη 46 Β. Σκοπός 47 Γ. Ασθενείς, υλικά και μέθοδοι Ασθενείς Διαχωρισμός κυττάρων Διεγέρσεις κυττάρων Απομόνωση DNA Απομόνωση πρωτεϊνών Απομόνωση ολικού RNA Σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cdna) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Αλληλούχηση PCR αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR) Ανοσοαποτύπωση (western blot) Ανοσοϊστοχημεία Κυτταρομετρία ροής (FACS) Χρόνος προθρομβίνης Τροποποιημένος χρόνος προθρομβίνης 60 Δ. Αποτελέσματα Εντοπισμός του υποδοχέα της λεπτίνης Διεγέρσεις κυττάρων Η δραστηριότητα του TF στα υπερκείμενα διεγερμένων κυττάρων συμβαδίζει με την παραγωγή TF σε επίπεδο RNA Η πρωτεΐνη του TF αυξάνεται στα διεγερμένα κύτταρα Η ενεργοποίηση του TF μετά από διέγερση με λεπτίνη πραγματοποιείται μέσω της οδού JAK2 6. Κύτταρα ασθενών με μυελοϋπερπλαστικό σύνδρομο (MPD) ως μοντέλο για την αντίσταση στη λεπτίνη

9 7. Ο SOCS-3 υπερεκφράζεται στα κύτταρα ασθενών που πάσχουν από MPD 72 Ε. Συζήτηση 75 Ζ. Συμπεράσματα 81 -Βιβλιογραφία 85 -Παράρτημα 97 -Σύντομο βιογραφικό σημείωμα 103 9

10

11 Πρόλογος 11

12 Πρόλογος Ο ρόλος των κυτταροκινών στη φλεγμονή και η σύνδεση αυτής με τη θρόμβωση είναι ένας τομέας που το Εργαστήριο της 1 ης Πανεπιστημιακής Κλινικής έχει εστιάσει τις έρευνές του εδώ και αρκετό καιρό. Με αποκορύφωμα την πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου για τη σύνδεση του συμπληρώματος με την έκφραση του ιστικού παράγοντα στο αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο, αποφασίσθηκε να ερευνήσουμε περαιτέρω παράγοντες που οδηγούν στην παραγωγή ιστικού παράγοντα. Με την ευκαιρία της συνεργασίας με το εργαστήριο του καθ. Σταύρου Κωνσταντινίδη στα πλαίσια του προγράμματος Eurogendis των υποτροφιών Marie Curie, είχα την ευκαιρία να έρθω σε επαφή στο Goettingen της Γερμανίας με επιστήμονες και κλινικούς ιατρούς και να ανταλλάξουμε πολύτιμες πληροφορίες για τα ερευνητικά μας ενδιαφέροντα. Εκεί είχα την ευκαιρία να δουλέψω σε κυτταρικές σειρές και ανθρώπινα προγονικά (progenitor) κύτταρα, να χρησιμοποιήσω την τεχνολογία παρεμπόδισης RNA (RNA-interference) και το πιο σημαντικό ίσως- να γνωρίσω από κοντά ένα κέντρο αναφοράς σχετικά με την έρευνα γύρω από την πρωτεΐνη λεπτίνη. Η ορμόνη αυτή, πέρα από τη δράση της στον έλεγχο της ενεργειακής ομοιόστασης, έχει και προ-φλεγμονώδη δράση ενώ σχετίζεται με την παχυσαρκία και τη στεφανιαία νόσο. Αντίστοιχα, ο ιστικός παράγοντας βρίσκεται επίσης σε υψηλά επίπεδα στους παχύσαρκους ασθενείς και διαδραματίζει πρωταρχικό ρόλο στα στεφανιαία σύνδρομα. Για αυτούς τους λόγους, αποφασίσαμε να ελεγχθεί ο πιθανός ρόλος της λεπτίνης ως επαγωγέα του ιστικού παράγοντα. Τα πρώτα πιλοτικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν στη Γερμανία και ήταν αρκετά ελπιδοφόρα. Παράλληλα, υπήρχε άμεση συνεργασία με το εργαστήριο στην Αλεξανδρούπολη, όπου ο λέκτορας της Παθολογίας κος Μιχάλης Δούμας επιβεβαίωσε τη δράση της λεπτίνης σε λειτουργικό επίπεδο. Ενθαρρυμένοι από τα πρώτα αποτελέσματα, αποφασίσαμε να προχωρήσουμε τη συνεργασία μας με τον κο Κωνσταντινίδη 12

13 και την κα Schaefer και να ελεγχθεί εις βάθος ο τρόπος δράσης της λεπτίνης στο φαινόμενο αυτό. Από τη βιβλιογραφία ήταν γνωστό ότι στην οδό μεταφοράς σήματος της λεπτίνης εμπλέκεται το μονοπάτι του JAK2. Πραγματοποιώντας λοιπόν πειράματα χημικής αναστολής της οδού αυτής, επιβεβαιώσαμε τη συμβολή της. Παράλληλα δημοσιεύθηκε μια μελέτη που περιέγραφε την ύπαρξη μιας μετάλλαξης στο γονίδιο jak2 σε ασθενείς με μυελοΰπερπλαστικά σύνδρομα και έτσι, με τη βοήθεια του αιματολόγου επικ. καθ. κου Ματθαίου Σπελέτα, χρησιμοποιήσαμε για τα πειράματά μας κύτταρα από αυτούς τους ασθενείς και παρατηρήσαμε ότι σε αυτήν την περίπτωση η λεπτίνη έχει μικρό ή καθόλου αποτέλεσμα. Το γεγονός αυτό μας οδήγησε να ψάξουμε περαιτέρω τη σηματοδότηση της λεπτίνης καθώς επίσης άνοιξε ένα νέο ερευνητικό ορίζοντα με δεδομένο ότι τα κύτταρα αυτών των ασθενών μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν ένα in vivo μοντέλο για τη μελέτη όλων των παραγόντων που χρησιμοποιούν την οδό JAK2. Η συμβολή των παραπάνω συνεργατών και φίλων για την ολοκλήρωση αυτής της μελέτης είναι αδιαμφισβήτητη. Ο κος Κωνσταντινίδης και η κα Schaefer με βοήθησαν καθόλη τη διάρκεια της 8μηνης παραμονής μου στη Γερμανία και εκτός από πολύτιμοι συνεργάτες στάθηκαν κοντά μου για οτιδήποτε χρειάστηκα κάνοντας έτσι τη διαμονή μου ιδανική. Η πολύ καλή σχέση μας αποδεικνύεται και με τη συνέχεια της συνεργασία μας μέχρι και τώρα. Ο κος Δούμας με βοήθησε με τις λειτουργικές εξετάσεις του ιστικού παράγοντα αλλά ταυτόχρονα με πολλή υπομονή συμμετείχε τόσο στη συγγραφή της δημοσίευσης του αγγλικού κειμένου όσο και στην επιθεώρηση της παρούσας δουλειάς. Επίσης και σε όλες τις επιστημονικές μας συναντήσεις η συμβολή του ήταν σπουδαία. Παράλληλα, ο επικ. καθ. κος Κωνσταντίνος Μιμίδης ήταν από τα πρώτα πρόσωπα που συνάντησα στην Αλεξανδρούπολη και η συμβολή του τόσο σε συμβουλευτικό, πρακτικό αλλά και φιλικό επίπεδο παρέμεινε έκτοτε ισχυρή. 13

14 Από την πρώτη μέρα της παρουσίας μου σε αυτήν την ομάδα ο κύριος Σπελέτας στάθηκε δάσκαλός μου και στο εργαστήριό του στο Νοσοκομείο Παπαγεωργίου ήρθα για πρώτη φορά σε επαφή με τις εργαστηριακές τεχνικές που θα χρησιμοποιούσα εφεξής. Από τότε συνεχίζει να είναι πολύτιμος αρωγός και συνεργάτης. Στην πορεία αυτής της εργασίας, παρουσιάστηκαν αρκετά τεχνικά προβλήματα τα οποία για να λυθούν χρειάστηκε η πολύτιμη βοήθεια της φίλης και συναδέλφου κας Ειρήνης Αποστόλου, του τεχνολόγου κου Θανάση Σταυρόπουλου και του Ερευνητή Γ κου Βαγγέλη Ανδρεάκου από το εργαστήριο του Ερευνητή Α κου Πασχάλη Σιδερά στο Ινστιτούτο Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών και των κων Ιωάννη Τέντε και Ραφαήλ Σανδαλτζόπουλου από το Δ.Π.Θ. Από την πλευρά του κυρίου Σιδερά ειδικότερα υπήρξε μια διαρκής βοήθεια για όλα τα επιστημονικά θέματα που μας απασχολούσαν και η φιλοξενία στα εργαστήριά του ήταν καθοριστική για την πορεία της δουλειάς μου. Επίσης πρέπει να αναφέρω τη συμβολή του καθ. κου Παναγιώτη Πρασσόπουλου και του λέκτορα κου Σάββα Δευτεραίου με την παροχή πρόσβασης στον εξοπλισμό του εργαστηρίου τους. Πέραν της παρουσίας μου στα εργαστήρια του Goettingen, είχα την ευκαιρία να επισκεφθώ και να εργαστώ για μικρό χρονικό διάστημα στο Πανεπιστήμιο της Στοκχόλμης, στο εργαστήριο αναπτυξιακής βιολογίας με επικεφαλής τον καθηγητή κο Χρήστο Σαμακοβλή. Εκεί για πρώτη φορά ήρθα σε επαφή με την τεχνική του RNA-i καθώς επίσης και με τη διαμόλυνση κυτταρικών σειρών. Το κύριο μέρος όμως της εργασίας αυτής πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις του εργαστηρίου της 1 ης Πανεπιστημιακής κλινικής του Δ.Π.Θ. με διευθυντή τον καθηγητή κο Γεώργιο Καρτάλη, το ενδιαφέρον, η συμβολή και η επίβλεψη του οποίου ήταν καθοριστική. Κατά τη διάρκεια της συνολικής παρουσίας μου στην Αλεξανδρούπολη, ήταν πολύ σημαντική η βοήθεια της βιολόγου και τεχνικού 14

15 του εργαστηρίου κας Βικτωρίας Τσιρονίδου καθώς επίσης και του -διδάκτορα πλέον- επίσης βιολόγου και φίλου, κου Σταύρου Γιαγλή οι οποίοι στάθηκαν δίπλα μου και με βοήθησαν με όλες τις τεχνικές του εργαστηρίου και τους ευχαριστώ πολύ για αυτό. Παράλληλα, εξίσου σημαντική ήταν η συνδρομή των ιατρών κας Νικόλ Σπαθάρη και Αναστασίας Μιχελή με την παροχή βιολογικού υλικού και χρήσιμων συμβουλών οποιαδήποτε ώρα της ημέρας τις χρειάστηκα. Επίσης ο κος Βασίλειος Παπαδόπουλος με βοήθησε πολύμε τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων μου. Σημαντική βοήθεια στην επιστημονική μου πορεία έπαιξαν οι dr J. Clarkson, prof. D. Metsengas, prof. C. Grapsong και snr K. Sabanios. Δεν θα έπρεπε να αγνοήσω φυσικά και το ενδιαφέρον που δείχνουν τα νέα μέλη του εργαστηρίου κος Κώστας Καμπάς, κα Τατιάνα Παρασκευοπούλου, κος Σάββας Πετανίδης και ο κος Γιάννης Κουρτζέλης και είμαι σίγουρος ότι θα εκμεταλλευτούν μελλοντικά ακόμα περισσότερο τις ευκαιρίες για περαιτέρω έρευνα που δίνουν τα αποτελέσματα αυτής της δουλειάς. Για την τεράστια υπομονή αλλά και την ηθική της συμπαράσταση ευχαριστώ πολύ τη σύντροφο μου Σωτηρία Κουή, και φυσικά τους γονείς μου Γιώτα Κατσάνου και Στέργιο Ραφαήλ καθώς επίσης και τον αδερφό μου Φάνη και την υπόλοιπη οικογένειά μου. Το σύνολο της παρούσας δουλειάς πραγματοποιήθηκε με την επίβλεψη και τις οδηγίες του αναπληρωτή καθηγητή κου Κωνσταντίνου Ρίτη και είναι σίγουρο ότι κανένα κομμάτι της δεν θα μπορούσε να ολοκληρωθεί χωρίς τη συμβολή του. Του είμαι ευγνώμον γιατί δεν περιορίστηκε μόνο στην επιστημονική καθοδήγηση αλλά φρόντισε να μου παρέχει κάθε ευκαιρία για την ιδανικότερη εξέλιξη μου. απεριόριστες. Οι ευχαριστίες μου προς αυτόν είναι 15

16 Συντομογραφίες aa ACS APS amino acid Acute Coronary Syndrome Anti Phospholipid Syndrome astf Alternatively Spliced Tissue Factor bp CRP CNTF DNA dntp G-CSF INF FACS FITC JAK-2 kda LIF LPS Base pair C-reactive protein Cilliary Neurotrophic Factor Deoxyribonucleic Nucleic Acid DeoNynucleoside TriPhosphate Granulocyte-Colony Stimulating Factor Interferon Flow Analysis Cell System Fluorescein IsothioCyanate Janus Kinase-2 Kilo Dalton Leukaemia Inhibitor Factor LipoPolySaccharide MEK Mitogen Extracellular signal protein Kinase MMM Myelofibrosis with Myeloid Metaplasia MPD mpt NFκB OB Myeloproliferative Disease Modified Prothrombin Time Nuclear Factor kappa beta Leptin (obesity) 16

17 Obr OSM PA PAI PBMCs PBS PCR PMNs PPP PT Leptin receptor Oncostatin Μ Plasminogen Activator Plasminogen Activator Inhibitor Peripheral Blood Mononuclear Cells Phosphate- Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Polymorphonuclear Cells Platelet Poor Plasma Prothrombin Time rntp Ribosomal Nucleotide Tri- Phosphate RT-PCR SP Real Time PCR Signal Peptide STAT-3 Signal Transducers and Activators of Transcription TF TFPI TNF-a Tissue Factor Tissue Factor Pathway Inhibitor Tumor Necrosis Factor-a SOCS-3 Suppressor Of Cytokine Signalling -3 17

18 Περίληψη Η λεπτίνη είναι μια πλειοτροπική ορμόνη που εμπλέκεται στον έλεγχο της ενεργειακής ισορροπίας, της ομοιόστασης της γλυκόζης και των οδών της φλεγμονής. Ο υποδοχέας της λεπτίνης εκφράζεται στα λευκά αιμοσφαίρια, και η λεπτίνη έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί τη λειτουργική τους ενεργοποίηση οδηγώντας στην παραγωγή κυτταροκινών. Η ανθρώπινη παχυσαρκία συνδέεται με υψηλά επίπεδα λεπτίνης στην περιφέρεια και συσχετίζεται με καρδιαγγειακή θρομβοφιλία. Ο ιστικός παράγοντας (TF) είναι ο εκκινητής του εξωγενούς καταρράκτη της πήξης, ενώ παρουσιάζεται σε υψηλές συγκεντρώσεις σε παχύσαρκα άτομα. Παρακινούμενοι από τις παρατηρήσεις ότι πλήθος φλεγμονωδών παραγόντων μπορούν να προκαλέσουν την έκφραση του TF, εξετάσθηκε ο ρόλος της λεπτίνης ως επαγωγέας του ιστικού παράγοντα σε πολυμορφοπύρηνα (PMN) και μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC). PMN και PBMC από υγιείς δότες και ασθενείς με μυελοΰπερπλαστικά σύνδρομα (MPD), οι οποίοι εμφανίζουν τη μετάλλαξη V617F που οδηγεί σε συνεχή φωσφορυλίωση του JAK2, επωάστηκαν με λεπτίνη και χημικούς αναστολείς της οδού του JAK2 και η έκφραση του TF εξετάστηκε σε λειτουργικό, mrna και πρωτεϊνικό επίπεδο. Ο TF βρέθηκε να υπέρεκφράζεται και στους δύο τύπους κυττάρων όταν διεγέρθηκαν με λεπτίνη, ενώ οι μελέτες χημικής αναστολής αποκάλυψαν ότι τα αποτελέσματα της λεπτίνης στην έκφραση του TF ελέγχονται, τουλάχιστον εν μέρει, από οδούς μετάδοσης σήματος που περιλαμβάνουν τον JAK2 και την κινάση PI-3, αλλά όχι τις κινάσεις MAP. Ομοίως, τα λευκοκύτταρα από ασθενείς με MPD ήταν ανίκανα να αποκριθούν στη λεπτίνη, πιθανώς λόγω της υπερέκφρασης του αναστολέα SOCS3 στα μυελικά κύτταρα των ασθενών με MPD. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια νέα σύνδεση μεταξύ της φλεγμονής και της θρόμβωσης, αποδεικνύοντας ότι η λεπτίνη μπορεί να 18

19 προκαλέσει την ενεργοποίηση του εξωγενή καταρράκτη της πήξης. Επιπλέον, προσφέρουν την πληροφορία ότι τα κύτταρα ασθενών με MPD θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως ένα ανθρώπινο μοντέλο για την περαιτέρω έρευνα σχετικά με την αντίσταση στη λεπτίνη. 19

20 Abstract The cytokine network in the initiation and/or proliferation of immune response: A study regarding the role of leptin in coagulation Background: Leptin is a pleiotropic hormone involved in the regulation of energy balance, glucose homeostasis and inflammation pathways. The leptin receptor is expressed on leucocytes, and leptin has been shown to induce their functional activation and cytokine production. Human obesity is frequently associated with elevated circulating leptin levels and correlated with cardiovascular coagulopathy. Tissue factor (TF) is the primary in vivo initiator of the extrinsic coagulation cascade. Objective: Prompted by findings that different inflammatory mediators can induce expression of TF, we examined the role of leptin as an inducer of tissue factor in polymorphonuclear (PMN) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Patients and Methods PMN and PBMC from healthy donors and Myeloproliferative disease (MPD) patients, carrying the V617F mutation resulting to constant JAK2 phosphorylation, were incubated with leptin and chemical inhibitors and TF expression was determined at functional, mrna and protein levels. Results: TF was found to be over-expressed when both cell types were stimulated with leptin while chemical inhibition studies revealed that the effects of leptin on TF expression are mediated, at least in part, by signal transduction pathways involving JAK2 and PI-3 kinase, but not MAP kinases. Similarly, leucocytes from patients with MPD were unable to respond to 20

21 leptin, probably due to a constant over-expression of SOCS3 in MPD myeloid cells. Conclusion: Our findings indicate a novel link between inflammation and thrombosis by showing that leptin can trigger the extrinsic coagulation cascade. Furthermore, they offer the knowledge that MPD cells could be used as a human model for further investigation of leptin resistance. 21

22

23 Εισαγωγή 23

24 Α. Eισαγωγή 1. Ιστικός παράγοντας (Tissue Factor TF) 1.1 Σύντομη ιστορική αναδρομή του ρόλου του TF στον «καταρράκτη» της πήξης. Ο TF, επίσης γνωστός και ως θρομβοπλαστίνη ή CD142, είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη μήκους 47kDa και είναι ο κύριος in vivo εκκινητής της πήξης [1]. Η πρώτη τεκμηριωμένη επιστημονική υπόθεση για τον πρωταγωνιστικό ρόλο του TF δημοσιεύεται το 1905 από τον Morawitz [2], όπου αναφέρεται ότι εκχυλίσματα ιστών με μεγάλη περιεκτικότητα σε νουκλεοπρωτεΐνες (λευκοκύτταρα, σπερματοκύτταρα) έχουν ζυμοπλαστική ιδιότητα και είναι ικανά να μετατρέψουν την προθρομβίνη σε θρομβίνη και ακολούθως το ινωδογόνο σε ινική, με τελικό επακόλουθο την πήξη του αίματος. Αν και για τα επόμενα 30 χρόνια διατυπώθηκαν διάφορες άλλες επιστημονικές απόψεις, η υπόθεση του Morawitz ήταν αυτή που άντεχε στο χρόνο. Έως το 1962, 12 ξεχωριστοί παράγοντες έχουν περιγραφεί οι οποίοι έχουν σχέση με την πήξη του αίματος, αλλά δεν υπήρχε σαφής θεωρία που να τους συσχετίζει μεταξύ τους. Το 1964 περιγράφεται η θεωρία του καταρράκτη ή ενδογενές σύστημα (intrinsic system), χωρίς όμως να είναι σαφής η θέση του TF μέσα σε αυτό. Μόλις το 1972 αναφέρεται ότι «η φύση του ιστικού παράγοντα είναι ακόμη άγνωστη αλλά υπάρχουν ενδείξεις ότι με τη παρουσία του παράγοντα VII ενεργοποιεί ενζυματικά τον παράγοντα X» [2]. Έτσι τα συστατικά και ο ρόλος του εξωγενούς συστήματος παρέμεναν ακόμη άγνωστα. Αν και είχε διατυπωθεί ότι οι παράγοντες X και IX αποτελούν τον συνδετικό κρίκο ενδο- και εξωγενούς συστήματος [3] και το υπεύθυνο γονίδιο που κωδικοποιεί τον TF είχε απομονωθεί [4], η ακριβής in vivo βιολογική 24

25 σημασία του ιστικού παράγοντα ήταν αμφισβητούμενη και χρειάστηκε να περάσουν 90 χρόνια ερευνητικών προσπαθειών και αμφισβητήσεων για να διατυπωθεί με σιγουριά ότι ο TF μέσω του εξωγενούς συστήματος αποτελεί τον πρωταγωνιστή της πήξης και σχεδόν το αποκλειστικό πυροδοτικό μόριο της διαδικασίας αυτής. Έτσι σήμερα, ελάχιστες αμφιβολίες υπάρχουν ότι το σύστημα σύνδεσης TF με τον FVII και οι επακόλουθες αντιδράσεις παίζουν τον ρόλο της «prima ballerina» στη έναρξη της πήξης κατά τη διαδικασία της αιμόστασης [4]. 1.2 Πρωτεΐνη TF Η θέση της στον πηκτικό μηχανισμό Η έναρξη της πήξης του αίματος λαμβάνει χώρα όταν ο TF εκτίθεται σε ίχνη ενεργοποιημένου παράγοντα VII (FVIIa) που ήδη κυκλοφορεί στο αίμα [5] (Εικ. 1). Αυτό μπορεί να εμφανιστεί σαν συνέπεια ενδοθηλιακής ενεργοποίησης, συστηματικής φλεγμονής (πχ. ενδοτοξιναιμία, σηψαιμία) ή τοπικής προθρομβωτικής ενεργοποίησης των κυττάρων που εκφράζουν TF στο αγγειακό δίκτυο. Ο παραγόμενος εξωγενής παράγοντας Xase, δηλαδή το σύμπλοκο FVIIa TF, ενεργοποιεί τους εξαρτώμενους από τη βιταμίνη Κ ζυμογόνους παράγοντες ΙΧ (FIX) και Χ (FX). Οι μικρές ποσότητες του ενεργοποιημένου FXa παράγουν μικροποσότητες (pmol) θρομβίνης από προθρομβίνη, η οποία με τη σειρά της Εικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση της πρόσδεσης του ιστικού παράγοντα (μπλε) με τον FVII (μωβ), τον ρόλο του ασβεστίου (κίτρινο) και των αναστολέων (πράσινο). ενεργοποιεί τα αιμοπετάλια, με συνέπεια την έκθεση ανιονικών φωσφολιπιδίων στην επιφάνειά τους, και μετατρέπει τους προσυμπαράγοντες FV και FVIII, σε ενεργοποιημένο παράγοντα V (Va) και ενεργοποιημένο παράγοντα VIII (VIIIa), αντίστοιχα (Εικ. 2). Ο 25

26 ενεργοποιημένος παράγοντας VIII συνδέεται με τον ενεργοποιημένο παράγοντα IXa σε επιφάνεια φωσφολιπιδίων (προερχόμενη, παραδείγματος χάριν, από αιμοπετάλια ή μικροσωματίδια) για να διαμορφώσουν το σύμπλοκο του εγγενή παράγοντα Xase. Αυτό το σύμπλοκο ενεργοποιεί τον FX σε ένα πολύ υψηλότερο ποσοστό από ότι το σύμπλοκο FVIIa TF. Kατόπιν, ο ενεργοποιημένος FXα διαμορφώνει σε συνδυασμό με ενεργοποιημένο παράγοντα Va (τον αρχικό ενεργοποιητή της προθρομβίνης) το σύμπλοκο προθρομβινάσης στην μεμβρανική επιφάνεια [1]. Η σε μεγαλύτερη πλέον ποσότητα προκύπτουσα θρομβίνη ενεργοποιεί περαιτέρω την πήξη μέσω ενίσχυσης της παραγωγής της αλλά και με την ενισχυμένη ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙ, ολοκληρώνοντας έτσι την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, του παράγοντα V και του παράγοντα VIII. Αυτή η μαζική παραγωγή θρομβίνης τελικά οδηγεί στον αδιάλυτο θρόμβο ινικής μέσω διάσπασης του ινωδογόνου σε ινώδες όπου καθοριστικό ρ όλο παίζει ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΧΙΙΙ [1]. Όλο το σύστημα της πήξης μετά την ενεργοποίησή του ελέγχεται από ανασταλτικούς μηχανισμούς γνωστούς και ως φυσικούς αντιπηκτικούς ενεργοποιητές. Αυτοί ανήκουν σε μια από τις παρακάτω κατηγορίες: -τις αντιθρομβίνες -τις πρωτεΐνες C και τον συμπαράγοντα αυτής S -τον αναστολέα της οδού του ιστικού παράγοντα (Tissue Factor Pathway Inhibitor-TFPI) Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση της πυροδότησης της εξωγενούς οδού της πήξης. Πρόσδεση του παράγοντα X στο σύμπλοκο του ενεργοποιημένου παράγοντα VIIa με τον ιστικό παράγοντα. 26

27 Η διάλυση των θρόμβων (ινωδόλυση) ελέγχεται από το ινωδολυτικό σύστημα. Αυτό το σύστημα ενεργοποιείται από τους ενεργοποιητές του πλασμινογόνου (Plasminogen Activators-PA), διαλύει την ινική ενώ ταυτόχρονα ελέγχει και τον πολυμερισμό της. Ο αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activators Inhibitor-PAI) παράγεται από μαστοκύτταρα, ενδοθηλιακά και βασεόφιλα κύτταρα και εμποδίζει την ενεργοποίηση αυτού του συστήματος. Αν και η καθιερωμένη βιολογική λειτουργία του TF είναι να δρα ως ο αρχικός in vivo εκκινητής του καταρράκτη της πήξης του αίματος, πρόσφατες έρευνες περιγράφουν ότι ο TF εμπλέκεται σε διάφορα άλλα παθοφυσιολογικά γεγονότα. Αυτό καταδεικνύεται εντυπωσιακά από την παρατήρηση ότι knockout διαγονιδιακά TF ποντίκια πεθαίνουν μεταξύ της όγδοης και δέκατης ημέρας του εμβρύου ως συνέπεια της ελαττωματικής αγγειακής ακεραιότητας και νεοαγγειογένεσης. Πρόσθετες πιθανές λειτουργίες του TF περιλαμβάνουν την προαγωγή της νεοπλασματικής αγγειογένεσης, την ανάπτυξη αγγείων, την επούλωση πληγών, τη μετάδοση ενδοκυτταρικών σημάτων και τη φλεγμονή [1]. 1.3 Δομικές και βιοχημικές ιδιότητες του ιστικού παράγοντα Δομή γονιδίου του TF Η δομή του ανθρώπινου cdna του ιστικού παράγοντα περιγράφηκε το 1987 από τέσσερις διαφορετικές ομάδες [6-9]. Το βασικό μεταγράφημα του mrna είναι 2.3 KB [6] ενώ η εναλλακτική μεταγραφή του γονιδίου μπορεί να παράγει μικρότερα μεταγραφήματα [7-9]. Δύο έτη αργότερα, περιγράφηκε η πλήρης ακολουθία των γονιδίων του ανθρώπινου TF και αποδείχθηκε ότι κωδικοποιείται από το γονίδιο (f3) το οποίο έχει μήκος 12.4 Kb και η διάρθρωσή του αποτελείται από έξι εξόνια και πέντε ιντρόνια [10](Εικόνα 3). Το γονίδιο του TF βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1, στην θέση 27

28 1p22-23 [11-12]. Η περιοχή του υποκινητή του f3 περιέχει δύο περιοχές πρόσδεσης του ενεργοποιητή μεταγραφικών παραγόντων-1 (AP-1), μια περιοχή πρόσδεσης κb (NFkB γ-rel/p65), τρεις περιοχές πρόσδεσης egr-1 και πέντε Sp1 περιοχές (Sp I-V ) [12]. Πρόσφατα ανακαλύφθηκε μια περιοχή πρόσδεσης του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων που επικαλύπτει την περιοχή κb [13]. Μια νησίδα CpG εκτείνεται στο πρώτο μέρος της μη - μεταγραφούμενης περιοχής του υποκινητή του TF [10]. Η μεθυλίωση αυτής της περιοχής μπορεί να αποτρέψει την έκφραση του γονιδίου TF σε ορισμένους τύπους κυττάρων, όπως τα λεμφοκύτταρα Β και Τ. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η επαγωγή έκφρασης του TF ελέγχεται από μια μεγάλη ποικιλία γενετικών και επιγενετικών επιδράσεων. Εικόνα 3. Δομή του γονιδίου του ιστικού παράγοντα (TF) και της εναλλακτικής μορφής του (astf) Η πρωτεΐνη του TF Το ανθρώπινο γονίδιο TF μεταφράζεται σε μια πολυπεπτιδική αλυσίδα 295 αμινοξέων (εικόνα 4). Η ώριμη μορφή της πρωτεΐνης του TF αποτελείται από 263 αμινοξέα και οργανώνεται σε μια υδρόφιλη εξωκυτταρική περιοχή 219 αμινοξέων, μια υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή 23 αμινοξέων και μια βραχεία κυτταροπλασματική ουρά 21 αμινοξέων [6,7]. Η εξωκυτταρική περιοχή αποτελείται από δυο τμήματα ομόλογα με την ινονεκτίνη τύπου III 28

29 (fibronectin class ΙΙΙ), τα οποία ενώνονται από μια διατμηματική περιοχή αρθρώσεων. Με βάση τη δομική ομολογία του υποδοχέα της ιντερφερόνης α, ο TF είναι ταξινομημένος ως υποδοχέας κυτταροκινών τύπου ΙΙ. Ο προσδετικός παράγοντας VII και FVIIa δεσμεύεται στην εξωκυτταρική περιοχή [14-18]. Εικόνα 4. Σχηματική αναπαράσταση της πρωτεΐνης του ιστικού παράγοντα και της θέσης του στην κυτταρική μεμβράνη (γκρι). 1.4 Βασική μεταγραφική έκφραση Ο ιστικός παράγοντας εκφράζεται συστηματικά σε κύτταρα όπως οι ινοβλάστες, τα κύτταρα λείων μυϊκών ινών και τα επιθηλιακά κύτταρα [19, 20]. Οι Sp1 περιοχές θεωρούνται ρυθμιστικά στοιχεία αρμόδια για τη βασική δραστηριότητα του υποκινητή [21] ενώ οι τρεις Sp1 περιοχές που αντιστοιχούν στα Sp1III, Sp1IV και Sp1V του ανθρώπινου υποκινητή του TF είναι συντηρημένες στις ακολουθίες DNA του ανθρώπου, του ποντικού, του αρουραίου και του χοίρου [12]. Η Sp1 είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη που υποκινεί την έναρξη της μεταγραφής σε ευκαρυωτικά κύτταρα με τη βοήθεια του σχηματισμού ενός λειτουργικού συμπλόκου που περιλαμβάνει RNA πολυμεράση ΙΙ, πρωτεΐνες ενεργοποιητών και το DNA του στόχου. Οι πολλαπλές περιοχές συνδέσεων Sp1 δρουν συνεργιστικά και απαιτούνται 29

30 τουλάχιστον δύο από αυτές για τη βασική μεταγραφή [12]. Διάφορα μέλη της οικογένειας SP έχουν προσδιοριστεί, συμπεριλαμβανομένων των Sp1, Sp2, Sp3 και Sp4. Οι Sp1, Sp3 και Sp4 δεσμεύουν την ίδια περιοχή σύνδεσης στο DNA. Οι Sp1 και Sp3 εκφράζονται συνεχώς, όμως σε ποικίλα επίπεδα στους διάφορους ιστούς και κύτταρα ενώ η Sp3 γενικά λειτουργεί ως ανταγωνιστικός αναστολέας της προκληθείσας έκφρασης από την Sp1 και έχει αποδειχθεί ότι περιορίζει την επαγωγή του TF μέσω Sp1 σε κύτταρα ανθρώπινου ενδομήτριου [22]. Κατά συνέπεια, η αναλογία Sp1/Sp3 σε κάθε κύτταρο μπορεί να καθορίσει το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου TF. 1.5 Επαγόμενη έκφραση του TF Εκτενείς μελέτες σε κυτταροκαλλιέργες έχουν πραγματοποιηθεί ώστε να προσδιοριστεί η ρύθμιση του ανθρώπινου γονιδίου TF. Ο ανθρώπινος υποκινητής του TF περιλαμβάνει δύο περιοχές που εμπλέκονται στην επαγόμενη γονιδιακή έκφραση. Η πρώτη περιοχή ονομάζεται LPS-responsive στοιχείο και εκτείνεται από τη θέση έως και περιλαμβάνει τα AP-1, κb, και τον πυρηνικό παράγοντα (NF) στα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα [12,13,23]. Σε διαφορετικές μελέτες σε κυτταροκαλλιέργες, έχει αποδειχθεί ότι η LPS περιοχή του υποκινητή μεσολαβεί για την επαγωγή του TF σε απάντηση στο LPS, τους φορβολικούς εστέρες και ερεθίσματα που προάγουν τη φλεγμονή(προ-φλεγμονώδη) όπως η ιντερλευκίνη- 1 και ο TNF-α [23-25]. Η δεύτερη περιοχή εκτείνεται από τις θέσεις -109 έως -59 και περιλαμβάνει τρεις egr-1-δεσμευτικές περιοχές. Αυτή η περιοχή ρυθμίζει τη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου TF σε απάντηση στον ορό, τον VEGF, τους φορβολικούς εστέρες, τις οξειδωμένες λιποπρωτεΐνες, και το LPS [26-29]. Άλλοι παράγοντες που επάγουν την παραγωγή TF είναι η ιντερφερόνη, η πρωτεΐνη CRP, η IL-6 και η αναφυλατοξίνη του συμπληρώματος C5a [30]. Γενικά, απαιτείται μια συνεργιστική ενεργοποίηση διάφορων μεταγραφικών παραγόντων για την επαγόμενη έκφραση του TF, αλλά ταυτόχρονα οι 30

31 μεταγραφικοί παράγοντες αντιδρούν με τον υποκινητή του ΤF με τρόπο ανταγωνιστικό και συγκεκριμένο για κάθε είδος κυττάρου. 1.6 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ του TF και FVIIa Ο FVIIa από μόνος του είναι μια πολύ ασθενής πρωτεάση σερίνης, παρόλα αυτά, η δέσμευση στον συμπαράγοντα TF ενισχύει την καταλυτική του δραστηριότητα περισσότερο από ένα εκατομμύριο φορές. Ο TF ενώνει τον FVIIa στη μεμβράνη και το σύμπλοκο TF FVIIa είναι εξαρτώμενο από μια αρνητικά φορτισμένη φωσφολιπιδιακή επιφάνεια [π.χ. φωσφατιδυλοσερίνη (phosphatidylserine -CP)] για να εκφράσει τη μέγιστη δραστηριότητα [31-33] (Εικ. 5). Τα εξαρτώμενα από τη βιταμίνη Κ ζυμογόνα FVII, FIX, FX, και η πρωτεΐνη C είναι ιδιαίτερα ομόλογες πρωτεΐνες, που περιέχουν όλες γ- καρβοξυλογλουτανεμικό οξύ (Gla) στο αμινοτελικό άκρο και ακολουθούν δύο EGF-like περιοχές (EGF1 και EGF2) καθώς και μια περιοχή σερίνης πρωτεάσης Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση της πρόσδεσης του ιστικού παράγοντα με τον FVII. στο καρβοξυτελικό άκρο [34]. Η ενεργοποίηση αυτών των ζυμογόνων οδηγεί σε μόρια που αποτελούνται από μια αμινοτελική ελαφριά αλυσίδα και μια καρβοξυτελική βαριά αλυσίδα που συνδέεται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Η εύκαμπτη ελαφριά αλυσίδα περιέχει τις περιοχές Gla, EGF1 και EGF2, ενώ η βαριά αλυσίδα περιέχει την περιοχή πρωτεασών σερίνης [35-42]. Η εύκαμπτη ελαφριά αλυσίδα του FVIIa τυλίγεται γύρω από τον άκαμπτο διαλυτό TF κατά τέτοιο τρόπο ώστε και οι τέσσερις λειτουργικές 31

32 περιοχές του FVIIa, καθώς επίσης και οι δύο FNIII περιοχές του εξωκυτταρικού μέρους του TF, να συμβάλλουν στην αλληλεπίδραση. Με δεδομένο ότι τα TF FVIIa υποστρώματα FVII, FIX, και FX μοιράζονται κοινή δομική ομολογία, είναι πιθανό να δεσμεύονται με παρόμοιο τρόπο επάνω στο σύμπλοκο TF FVIIa [43,44]. 1.7 Εντοπισμός του TF: προέλευση και κατανομή Κατανομή Αν και ο TF εκφράζεται υπό προϋποθέσεις σε αγγειακά κύτταρα που έρχονται σε επαφή με το αίμα, εντούτοις εκφράζεται συστηματικά και σε εξωαγγειακές περιοχές και ιδιαίτερα σε πλούσια αγγειωμένα όργανα όπως ο πλακούντας, ο εγκέφαλος, η καρδιά, οι νεφροί, και οι πνεύμονες [19,20]. Επίσης, αρκετοί από τους κυτταρικούς τύπους που περιβάλλουν τα τοιχώματα των αγγείων, όπως ινοβλάστες και κύτταρα των λείων μυϊκών ινών, κερατινοκύτταρα από το δέρμα, αστρογλοιοκύτταρα του εγκεφάλου, και μυοκύτταρα της καρδιάς, εκφράζουν TF [19,20]. Αυτή η κυτταρο-ειδική συγκεκριμένη έκφραση του TF διαμορφώνει έναν προστατευτικό «φάκελο» που προάγει τη θρόμβωση γύρω από το αγγειακό σύστημα έτοιμο να ενεργοποιήσει το σύστημα πήξης όταν η ακεραιότητα του αγγειακού συστήματος διαταράσσεται. Κατά συνέπεια, τα ρευστά στοιχεία του αίματος μπορούν να εκτεθούν στον TF όταν διαταράσσεται η ακεραιότητα του ενδοθηλίου, ή όταν ο TF εκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων μονοκυττάρων. Εντούτοις, όπως θα αναφερθεί αργότερα, έχει γίνει εμφανές τα τελευταία χρόνια ότι στο αίμα ακόμα και σε υγιείς ανθρώπους μπορεί να περιέχεται TF σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις [45]. Η παθολογική έκφραση του TF εμφανίζεται σε αφρώδη μακροφάγα και σε αθηρωματικές βλάβες, σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα, σε ενεργοποιημένα μονοκύτταρα ασθενών με σήψη από Gram-αρνητικά 32

33 μικρόβια καθώς και περιστασιακά στα αγγειακά κύτταρα των λείων μυϊκών ινών και τα μεσεγχυματικού τύπου κύτταρα [20, 46-48] Έκφραση του TF στο αγγειακό τοίχωμα Εκτενείς ανοσοϊστολογικές εξετάσεις ανθρώπινων ιστών έχουν αποτύχει να ανιχνεύσουν TF στο αγγειακό ενδοθήλιο φυσιολ ογικών ιστών [48,49] και πολλοί ερευνητές πιστεύουν ότι στα ενδοθηλιακά κύτταρα φυσιολογικών και αρτηριοσκληρυντικών ιστών τα αγγεία ήταν αρνητικά στην παρουσία του TF [19,20,47,50]. Εντούτοις, ορισμένες παθολογικές καταστάσεις, όπως ο διηθητικός καρκίνος του μαστού, αναφέρεται ότι προκαλούν την έκφραση του TF στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, κάνοντας την επιφάνειά τους θρομβογόνο [51]. Επίσης, σε ζωικά μοντέλα, έχει παρατηρηθεί η έκφραση επαγόμενου TF σε ενδοθηλιακά κύτταρα in vivo, αλλά τα αποτελέσματα είναι αμφισβητούμενα. Με τη χρησιμοποίηση διπλού ανοσοφθορισμού για χρώση του TF και του παράγοντα von Willebrand, οι Drake και συνεργάτες [52] ανακοίνωσαν την επαγωγή της έκφρασης TF μέσω LPS από τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε σπληνικά τριχοειδή αγγεία σε σηπτικούς μπαμπουίνους, αλλά όχι σε πνευμονικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον η in vivo έγχυση ενδοτοξίνης έχει αναφερθεί ότι οδηγεί σε ανάλογη της δόσης αύξηση της ενδοθηλιακής προθρομβωτικής δραστηριότητας στα κουνέλια [53] και την έκφραση mrna και πρωτεΐνης του TF στα ενδοθηλιακά ηπατικά κύτταρα πιθήκων [54]. Αντίθετα, διπλή χρώση για τον TF και τον παράγοντα von Willebrand απέτυχε να καταδείξει την έκφραση TF σε ενδοθηλιακά κύτταρα σπληνικών τριχοειδών προερχόμενα από σηπτικά κουνέλια [54]. Μια πιθανή εξήγηση για τον παρατηρηθέντα TF στο ενδοθήλιο in vivo μπορεί να είναι ότι προέρχεται από μικροσωματίδια μονοκυτταρικής προέλευσης πλούσια σε TF που δεσμεύονται από την P-selectin σε ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι in vitro μελέτες, εντούτοις, καταδεικνύουν ότι ενδοθηλιακά κύτταρα σε 33